CN1055726C

CN1055726C - 有复制能力的重组体病毒的制备方法

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Publication number: CN1055726C
Application number: CN92115173A
Authority: CN
Inventors: M·范伯格; R·安迪诺; C·L·威克斯-莱维; P·A·赖利
Original assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research; American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC; Whitehead Institute for Biomedical Research
Priority date: 1991-12-06
Filing date: 1992-12-04
Publication date: 2000-08-23
Anticipated expiration: 2007-12-04
Also published as: CA2123804A1; JPH07502403A; PT672157E; WO1993011251A1; NO942075L; HU9401689D0; IL104003A0; FI942623A0; DE69232122D1; AU674134B2; FI942623A; TW403784B; EP0672157B1; NO942075D0; KR950700421A; DK0672157T3; KR100272419B1; NZ246276A; DE69232122T2; MX9206981A

Abstract

有复制能力的重组体病毒，特别是有复制能力的重组体脊髓灰质炎病毒及其用途，这些病毒包括：(1)一种编码一种外源多肽的外源核酸序列和(2)一种编码一种病毒或细胞蛋白酶的人工蛋白水解分裂位点的核酸序列，该蛋白酶蛋白水解处理(分裂)由亲本病毒所产生的前体蛋白质。该重组体前体分裂或通常组成蛋白质的列阵并释放出外源多肽。有复制能力的重组体病毒用作对抗细菌、病毒、真菌和酵母菌感染、寄生虫疾病、癌和变应性病的疫苗。

Description

有复制能力的重组体病毒的制备方法

目前，有许多类型向来是使个体对疾病免疫的疫苗。尽管这些可获得的疫苗通常是安全的，并且至少在某种程度上对诱导免疫应答是有效的，但它们都具有局限性。此外，对某些疾病还没有任何疫苗。开发目前可获得疫苗的取代物以及新疫苗以免受目前还没有疫苗可获得的疾病的损害是减少由许多疾病引起的发病率和死亡率的重要步骤。

本发明涉及有复制能力的重组体病毒，这些病毒包括编码外源多肽或蛋白质的外源核酸序列，该多肽或蛋白质是以随后被病毒和/或细胞酶蛋白水解处理的重组体多蛋白前体的组分所表达。从而，释放出编码外源多肽。该有复制能力的病毒可以是动物(非人体)病毒(例如，脊椎动物或哺乳类动物病毒)、人体病毒、或植物病毒。本发明还涉及有复制能力的重组体病毒，特别是脊髓灰质炎病毒，其中该重组体基因组包括编码被表达的外源多肽或多个多肽的外源核酸序列(或多个序列)和一个或多个编码相应数目人工蛋白水解分裂位点的核酸序列，并且表达这些编码多肽以及诱导产生对被传入的哺乳动物中的这些多肽的特殊抗体。适当选择的有复制能力的病毒可用于将外源蛋白质传送至已被传入这些病毒的个体。如脊椎动物，特别是哺乳动物，更特定的是人体。在植物病毒的场合，例如，有复制能力的植物病毒可被插入种籽或在其另一生长阶段的植物中，其要求是能表达和处理编码外原多肽。例如，可以使用这种外源多肽防护植物免遭疾病或免受传染侵袭。这些植物可通过口服消耗用以传送疫苗。

本发明有复制能力重组体病毒包括广泛种类的病毒，如细小核糖核酸病毒(例如，肠病毒、脊髓灰质炎病毒、足和口疾病病毒(FMDV)、鼻病毒、艾柯病毒、肝炎A病毒)、Togaviruses(例如，Sindbis病毒和风疹病毒)、以及Flaviviruses(例如，黄热病毒)。病毒的类型部分地由被表达的目标外源抗原(多个抗原)、通过其将生成的重组体病毒给药的方法、和所需的免疫应答特征决定。

特别是，本发明涉及有复制能力的重组体脊髓灰质炎病毒，这些病毒与亲本病毒的区别在于，它们以这样的方式被修饰过，使它们不会致病并含有外源核酸序列和一个或多个人工蛋白水解分裂位点，以致在病毒感染过程中，它们稳定地将编码外源产物表达为重组体多蛋白前体的组分。该前体被蛋白水解分裂，释放出正常的脊髓灰质炎病毒蛋白质和编码外源蛋白质。此外，该有复制能力的重组体病毒可含有多聚接头序列(EcoR 1，Not 1，BssH 2，和Xho 1)以便于容易地将所需外部核酸序列插入。它们也可含有聚氨基酸链，如多聚甘氨酸链，它通常是与插入的序列相邻以便增强区域的结构灵活性并可能提高蛋白水解处理的效率。

本发明还涉及一种制备重组体病毒的新方法，在该方法中，将外源核酸序列插入病毒基因组中。在本发明的方法中，利用了病毒生活周期的基本方面，从而该重组体病毒产生其正常的蛋白质组分并复制，在感染的细胞中产生显著量的由外源核酸序列(多个序列)编码的氨基酸序列(外源蛋白质)。在本方法中，亲本病毒，该病毒的基因组将由病毒或细胞酶蛋白水解处理的多蛋白前体编码得到一种或多种成熟的蛋白质，被如下所修饰：将编码所生成的多肽的一种外源核酸序列和编码蛋白水解处理(分裂)在病毒生活周期中由亲本病毒产生的前体多蛋白的病毒或细胞蛋白酶的一个人工蛋白水解分裂位点或多个位点的一个核酸序列，或多个序列引入病毒基因组中，产生重组体病毒。这些序列可以在任何位置被引入病毒基因组，只要其存在不会使病毒复制所需的病毒序列破裂。例如，可以在任何将多蛋白处理以产生两种天然蛋白质的天然位点(即在任何天然多蛋白正常蛋白水解分裂的位点)插入二种序列。在外源核酸序列被插在编码一种蛋白质的病毒序列的末端那些情况下，仅需要一种蛋白水解处理序列。如果一种以上编码所产生的多肽的外源核酸序列被引入病毒基因组中，则可能需要额外的蛋白水解分裂位点-编码核酸序列。例如，如果在病毒基因组范围内(在内部)引入两种或两种以上多肽-编码核酸序列并且编码蛋白质分裂，产生两种或两种以上单独的蛋白质是合乎要求的。则也必须引入足够数量编码分裂位点的核酸序列。例如，如果两种外源核酸序列，各自编码所产生的一种蛋白质，在病毒基因组范围内被引入并且两种单独的(各个)蛋白质是合乎要求的，则需要三或四个编码蛋白水解分裂位点的核酸序列(即，如果两种蛋白质被病毒基因组中存在的两种核酸序列所编码而不插入核酸序列，则是三个，如果两种核酸序列被插入的核酸序列所分离，必须除去该序列的编码产物以“分离”两种编码蛋白质，则是四个)。在该序列被插入病毒基因组范围中(不是在末端)的那些情况下，需要两个蛋白水解处理序列以使外源核酸序列的二端被释放；这些序列可以相同或不同。

在本发明的一个具体实施方案中，以这样的方式将两个序列引入在编码病毒蛋白质的病毒序列的5′端的第一或单一起始密码子和第二密码子之间的亲本病毒基因组中，使在重组体基因组中的次序为：亲本病毒的5′未转译区-亲本病毒的单一起始密码子-编码所表达产物的外源核酸序列-编码人工蛋白水解分裂位点的核酸序列-亲本病毒的第二密码子-亲本核酸序列的剩余物。在另一具体实施方案中，将编码外源多肽的外源核酸序列结合在病毒基因组范围内，在生成的重组体病毒基因组中序列的次序为：亲本病毒的5′未转译区-亲本病毒的单一起始密码子-亲本病毒转译区的开始密码子(多个密码子)-编码人工蛋白水解分裂位点的核酸序列-外源核酸序列-编码人工蛋白水解分解位点的核酸序列-亲本病毒基因组的剩余物。该编码蛋白水解分裂位点可以相同或不同。

在本发明的一个具体实施方案中，其中制得一种重组体脊髓灰质炎病毒(它表达一种外源核酸序列或多种序列)，将编码所表达蛋白质(例如一种抗原)的核酸序列、和编码一种脊髓灰质炎病毒3C蛋白酶的人工识别序列、或几种序列引入亲本脊髓灰质炎病毒的基因组中。在另一个具体实施方案中，将编码一种脊髓灰质炎病毒2A蛋白酶的人工识别序列(几种序列)的一种核酸序列或几种序列与一种或多种编码所表达的蛋白质的核酸序列一起引入病毒基因组中。在DNA病毒的场合，基因组将被处理成其DNA形式。在RNA病毒的场合，基因组被处理成其cDNA形式。这两种形式都被认为是亲本病毒的基因组。在该具体实施方案中，将编码一种外源多肽的外源核酸序列结合入脊髓灰质炎病毒的末端，生成的重组体脊髓灰质炎病毒基因组构成如下：亲本脊髓灰质炎病毒的5′未转译区-脊髓灰质炎病毒单一的起始密码子-外源核酸序列-人工脊髓灰质炎病毒3C或2A蛋白酶识别部位-脊髓灰质炎病毒基因组的第二密码子-脊髓灰质炎病毒基因组的剩余物。在将编码一种外源多肽的外源核酸序列结合在亲本脊髓灰质炎病毒基因组范围内的位点上(即内部位点)的具体实施方案中，生成的重组体脊髓灰质炎病毒基因组如下：亲本脊髓灰质炎病毒的5′未转译区-脊髓灰质炎病毒单一的起始密码子-脊髓灰质炎蛋白质编码区-编码人工3C蛋白酶识别部位或2A蛋白酶识别部位的核酸序列-外源核酸序列-编码人工3C蛋白酶识别部位或2A蛋白酶识别部位的核酸序列-脊髓灰质炎病毒的剩余物。如上所述，在一种以上蛋白质或多肽被表达的那些场合，一种以上的外源核酸序列，与适当效目的人工蛋白水解分裂位点一起，被包括在重组体有复制能力的脊髓灰质炎病毒中(即编码各个被表达的蛋白质或多肽的核酸序列)。

当转译修饰的脊髓灰质炎病毒时，制得大于正常的前体，但被亲本脊髓灰质炎病毒中存在的3C和/或2A蛋白酶恰当地分裂成脊髓灰质炎病毒蛋白质组分的通常列阵。3C和/或2A蛋白酶也准确地识别并分裂人工识别(蛋白水解分裂)部位，释放被外源核酸序列编码的外源多肽。如本文所述，本发明的重组体脊髓灰质炎病毒表达可探测量的编码外源蛋白质。亲本病毒继续复制并且也产生天然蛋白质。

由重组体脊髓灰质炎病毒所举例说明的，本发明的有复制能力的重组体病毒可用作抗细菌、病毒、真菌(例如，酵母)感染，寄生虫疾病，癌或变应性病的疫苗。它们也可用来传送避孕药(例如精液抗原)。是或者包括本文所述有复制能力的重组体病毒的疫苗和避孕药组合物也是本发明的主题。

当需要引入粘膜免疫性以予防感染时，本发明的重组体脊髓灰质炎疫苗特别有利。例如，有效的引入粘膜免疫性有利于预防或减轻HIV、轮状病毒、呼吸合胞体病毒(RSV)、肝炎A病毒、脊髓灰质炎病毒、乳头状瘤病毒、麻疹病毒和流感病毒的感染。该重组体病毒也可用于诱导抗如Vibrio cholerae和产肠毒素的大肠杆菌引起的那些细菌疾病的免疫性。此外，该重组体脊髓灰质炎病毒通过将一种以上外源核酸序列(即两种或多种核酸序列，各个序列编码不同的抗原)引入亲本脊髓灰质炎病毒的基因组中，可用以提供对由一种以上生物体感染的防护。另一方面，二种或二种以上各自表达不同抗原的重组体脊髓灰质炎病毒的混合物或组合物可用以使个体对一种以上生物体或传染体免疫。通过利用分子生物学出现的工具开发改进的或新的疫苗，由Task Force在Child Survival上所公开的对“理想的疫苗”的推导，作为可能有希望实现的一种“在出生时一次给药将提供对多种疾病的防治”的疫苗。

重组体病毒也可用以在组织培养物中产生外源多肽，该多肽可从所产生的细胞或病毒中析出或分离。它们也可用以在脊髓灰质炎细胞哺乳动物细胞，包括人体细胞、和植物细胞中产生外源多肽。

图1是本发明重组体脊髓灰质炎病毒的示意图解，其中示出了使外源核酸序列插入脊髓灰质炎病毒基因组的一个末端并表达外源多肽的脊髓灰质炎病毒基因组(SEQ ID # 24和25)的修饰。也示出了当其分裂为天然脊髓灰质炎病毒多蛋白(PO)前体和外源蛋白质插入物时，病毒3C蛋白酶水解处理图样。

图2是本发明重组体脊髓灰质炎病毒的示意图解，其中示出了导致表达外源多肽的将外源核酸序列插在脊髓灰质炎病毒基因组的一个末端和在其范围之内。也示出了与插入序列相邻的多聚甘氨酸链，使区域的结构灵活性增强。

图3是噬斑分析结果的照片，示出了亲本脊髓灰质炎病毒的重组体脊髓灰质炎病毒的表型。在所示的噬斑分析中，HeLa细胞感染了携带：轮状病毒VP4蛋白质(B、C和D)所产生的抗原决定基、或来自成熟霍乱毒性亚单位B(CTB)(E)的完全编码序列的亲本脊髓灰质炎病毒(A)和重组体脊髓灰质炎病毒。

图4展示了试验结果，这些结果显示了携带Vibrio霍乱B毒性亚单位或轮状病毒VP4序列的重组体脊髓灰质炎病毒的表达和处理。

图4A是使用由感染亲本脊髓灰质炎病毒(行1)或实施例2所述的霍乱毒性B-脊髓灰质炎病毒重组体病毒(行2)的HeLa细胞提取物制得的Western印迹照片。结果表明，B亚单位得到表达并恰当地被处理在重组体脊髓灰质炎病毒的范围内(箭头所示)。

图4B是来自感染亲本脊髓灰质炎病毒(行1)或霍乱毒性B(CTB)-脊髓灰质炎重组体病毒(行5)(实施例2)并且使用识别脊髓灰质炎病毒结构蛋白质的免抗体探测的相同HeLe细胞的提取物照片。结果表明，在脊髓灰质炎病毒重组体中制得比正常的更大的P1多蛋白前体，但接着是恰当的蛋白水解处理，产生脊髓灰质炎病毒蛋白质产物的常规补足物，以及释放由CTB核苷酸序列产生的外源CTB蛋白质。行2-4包括携带由轮状病毒VP4蛋白质得到的抗原决定基(长度为21-104氨基酸)的重组体脊髓灰质炎病毒。

图5示出了为分析重组体病毒粒子的结构和组成所进行的SDS-PAGE分析结果。这两种病毒(亲本和重组体)的迁移图样实际上是不能区分的，这提示了重组体病毒的病毒颗粒具有正常的结构和蛋白质组成。表明了脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白质的一致共同性。

图6示出了为测定重组体脊髓灰质炎诱导接种疫苗的宿主中的免疫应答的活性而进行的Western印迹分析与对比值和模拟注射比较的结果。

本发明涉及重组的有复制能力的病毒，这些病毒包括一种编码一种在病毒生活周期中所产生的外源多蛋白的外源核酸序列，以及一种编码一种分裂亲本病毒所产生的前体多蛋白的病毒或细胞蛋白酶的人工蛋白水解分裂位点的核酸序列。这两种类型的序列可在亲本病毒基因组的任何位置存在，只要其存在不致分裂病毒复制所需的病毒序列。

本发明基于申请人的论证，可将一种编码一种外源多肽的外源核酸序列在病毒生活周期中产生的病毒基因组的末端或在病毒基因组范围内的位置(即在内部位点)，作为一种前体多蛋白结合入病毒基因组中，该前体多蛋白被分裂亲本病毒所正常产生的前体多蛋白的病毒或细胞蛋白酶所分裂(亲本病毒即是其中引入外源核酸序列的病毒)。在一个具体实施方案中，将一种编码一种外源多肽的外源核酸序列结合进病毒基因组的末端，在生成的重组体病毒基因组中序列的次序是：亲本病毒的5′未转译区-亲本病毒单一起始密码子-外源核酸序列-编码一种人工蛋白水解分裂位点的核酸序列-亲本病毒的第二密码子-亲本病毒基因组的剩余物。病毒基因组的5′未转译区的重组体基因组部分，当在亲本病毒中存在时，可以是全部或部分5′未转译区。在另一具体实施方案中，将一种编码一种外源多肽的外源核酸序列结合在病毒基因组范围内，在生成的重组体病毒基因组中序列的次序是：亲本病毒的5′未转译区-亲本病毒的单一起始密码子-亲本病毒转译区的开始密码子-编码一种人工蛋白水解分裂位点的核酸序列-外源核酸序列-编码一种人工蛋白水解分裂位点的核酸序列-亲本病毒基因组的剩余物。

编码外源多肽在正常病毒蛋白质转译范围内被表达为重组体或融合前体多肽的组分(该组分包括外源多肽、一个人工蛋白水解识别部位或多个位点和病毒多蛋白)。重组体前体多肽被病毒或细胞蛋白酶蛋白水解处理，该蛋白酶将亲本病毒前体多蛋白处理，导致由病毒蛋白质释放游离的外源蛋白质。修饰成包括外源序列的病毒称之为亲本病毒，该病毒可以是天然病毒(既可是致病的或较佳为非致病的)、减毒的病毒、疫苗菌株或重组体病毒。本文所用的术语多肽包括蛋白质或其部分(肽)、二种或二种以上蛋白质或肽的融合及一种蛋白质和一种肽的融合。

在一特定的具体实施方案中，申请人已制得有复制能力的重组体脊髓灰质炎病毒，该病毒包括结合入脊髓灰质炎病毒基因组的末端或脊髓灰质炎病毒基因组范围内的位点的一种编码一种所表达的外源蛋白质的外源核酸序列，和一种编码一种脊髓灰质炎病毒3C蛋白酶和/或2A蛋白酶的人工蛋白水解分裂位点的核酸序列。它们已证明，外源蛋白质被表达并通过蛋白水解处理由脊髓灰质炎病毒中分离。该生成的有复制能力的重组体脊髓灰质炎病毒与亲本病毒不同之处在于它们包括编码一种外源多肽或多种多肽以及一种或多种人工蛋白水解分裂位点的外源核酸序列，并且表达病毒感染期间的外源产物。该亲本脊髓灰质炎病毒可以是天然的或广泛类型的脊髓灰质炎病毒、减毒的病毒、疫苗菌株或重组体或基因工程的脊髓灰质炎病毒(在该场合下，改变或突变的序列不能编码本文所述对本发明的脊髓灰质炎病毒的目的有用的外源蛋白质)。

在本发明的一个具体实施方案中，编码外源多肽的外源核酸序列和编码人工蛋白水解分裂位点的核酸序列位于脊髓灰质炎病毒基因组的一个末端，在脊髓灰质炎病毒基因组的单一起始密码子和第二密码子之间，以使重组体基因组中序列的次序如下：脊髓灰质炎病毒基因组的5′未转译区-脊髓灰质炎病毒单一起始(第一)密码子-外生核酸序列-人工蛋白酶识别部位-脊髓灰质炎病毒基因组的第二密码子-脊髓灰质炎病毒基因组的剩余物。因而，重组体脊髓灰质炎病毒基因组的表达产生包括外源蛋白质、人工蛋白水解分裂位点和脊髓灰质炎病毒多蛋白的重组体或融合多蛋白前体。申请人已指出，重组体多蛋白先质通过包含人工蛋白水解分裂位点的蛋白酶的蛋白水解处理，导致产生正常的脊髓灰质炎病毒蛋白质组分并释放外源蛋白质。结果也发生病毒复制，但在脊髓灰质炎病毒粒子中不包括外源蛋白质。

本发明的两种重组体脊髓灰质炎病毒，被描绘于图1和图2(pMOV 1.3)中，其中外源核酸和编码一种人工蛋白水解分裂位点的核酸序列结合在脊髓灰质炎病毒基因组的末端。该重组体脊髓灰质炎病毒基因组包括核酸序列(紧接单一起始密码子的3′)，该序列编码五个氨基酸残基出现在脊髓灰质炎病毒的Mahoney 1型菌株的氨基末端。这些序列的存在并非必要，但其存在可以影响表达的效能。如图1所描绘的，该重组体脊髓灰质炎病毒基因组也可包括与插入的(外源)序列相邻的多聚甘氨酸链。

如由脊髓灰质炎病毒基因组所例证的，编码所表达的蛋白质或多肽的外源核酸序列可被引入病毒基因组范围中。如图2所示，在脊髓灰质炎病毒基因组范围内有一系列额外的位置，在这些位置上可放置编码外源多肽的外源核酸序列和编码人工蛋白水解分裂位点的核酸序列，产生表达编码产物的有复制能力的重组体脊髓灰质炎病毒。这些脊髓灰质炎病毒基因组范围内的位点包括Vp1编码区和2A编码区的接点、2A编码区和2B编码的接点以及2C编码区和3A编码区的接点。多聚接头/蛋白水解处理的主题已被插在这些位点并且生成的重组体脊髓灰质炎病毒已表明是有复制能力的。使用本文所述的方法和已知的方法，可将一种外源核酸序列或多种序列引入这些位点。将多聚接头/蛋白水解主题插在Vpg编码区和3C编码区的接点处可消除病毒复制。

为促使处理病毒多蛋白内部范围内的外源序列，在插入的两端必须包括适当的蛋白水解处理信号。从而，脊髓灰质炎病毒基因组内序列的次序如下，其中编码外源多肽的外源核酸序列和编码人工蛋白水解分裂位点的核酸序列插在例如Vp1编码区和2A编码区的接点处：脊髓灰质炎病毒基因组的5′未转译区-脊髓灰质炎单一起始密码子-Vp0编码区-Vp3编码区-Vp1编码区-编码人工3C蛋白酶识别部位或2A蛋白酶识别部位的核酸序列-编码人工3C蛋白酶识别部位或2A蛋白酶识别部位的核酸序列-脊髓灰质炎病毒基因组的剩余物。

测定在脊髓灰质炎病毒基因组中有多个位点，在这些位点上可以进行插入外源核酸序列以产生有复制能力的重组体脊髓灰质炎病毒，在广义上意味着在设计和制备例如可用作疫苗和蛋白质制品的重组体病毒中有相当大的灵活性和可能的变化。可将一种或多种编码一种被表达的和蛋白水解处理的外源蛋白质或多肽的外源核酸序列引入本文所述病毒基因组中(在一个末端或在范围内)的一个或多个位点。此外，可以识别能够进行插入而不会使病毒的复制活性消失的其他位点。有可能，某些外源核酸序列，当它们结合在病毒基因组的特定位点时将有更好的耐药力或更有效地被表达和/或蛋白水解处理。如以脊髓灰质炎病毒举例说明的，可以利用本文所述的方法和从而制得的重组体病毒评价这一点是否正确。

可将另外的特色结合设计有复制能力的重组体病毒，如多聚接头序列(例如，EcoR 1、Not 1、BssH 2、和Xho 1)以使得易于将所需的外部序列插入重组体载体中。还有，邻位插入的序列可以插入变异体，如多聚甘氨酸链，以增强区域的结构灵活性并有可能提高蛋白水解处理的效率。

一种以上编码一种所产生的外源蛋白质或多肽的核酸序列可以被包括在有复制能力的重组体病毒中，从而产生相应数目的蛋白质或多肽。两种或更多的核酸序列可以各自编码不同产物或可以编码相同产物(例如，当需要增强的蛋白质或多肽制剂时)。此外，对于脊髓灰质炎病毒，蛋白水解分裂位点可以是3C分裂位点、2A分裂位点或两者都是。

尽管本发明通过制备重组体脊髓灰质炎病毒得到了举例说明，但任何在其中发生病毒前体蛋白质的蛋白水解处理的病毒可以被修饰，以产生表达一种外源蛋白质并将其适当处理的重组体病毒。例如，可以用与重组体脊髓灰质炎病毒所述的类似方法制备和使用重组体细小核糖核酸病毒(例如，肠病毒、脊髓灰质炎病毒、FMDV、鼻病毒、艾柯病毒、肝炎A病毒)和重组体Flaviviruses(例如，黄热病毒)。

本发明制备表达和蛋白水解处理一种外源蛋白质的有复制能力的重组体病毒的方法如下：利用已知的基因工程技术(Sambrook，J.et al.，Molecular Choning：A Laboratory Manual(2d ed.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)修饰在其生活周期中(指亲本病毒)产生被病毒或细胞蛋白酶水解处理的蛋白质前体的病毒，将至少两种类型核酸序列引入病毒基因组中：一种编码一种被重组体病毒表达和处理的外源蛋白质或多肽的外源核酸序列(一种由引入类型病毒以外来源得到的核酸序列)和一种编码一种将处理表达的重组体蛋白质以释放病毒和外源蛋白质的病毒和/或细胞蛋白酶的人工识别部位的核酸序列。一种补充类型的核酸序列，如多聚甘氨酸链，可以被插入邻接外源核酸序列处，以增强区域的结构灵活性并有可能提高效率。

实施例1中描述了脊髓灰质炎病毒载体cDNA克隆的构成，本发明的例证。用这一方法可以引入一种或多种各自包括编码一种外源产物的一种外原核酸序列或多种序列的“单元”，一种或多种人工蛋白水解识别部位以及任选地，额外的核酸序列，如多聚甘氨酸链。例如，可在病毒基因组的5′末端引入一种单元，该单元包括一种编码一种对所需免疫应答的外源蛋白质抗原和一种蛋白水解处理的人工识别部位的核酸序列。另一方面，可以将包括编码一种以上蛋白质或多肽和适当数目蛋白水解分裂位点的核酸序列的两种或多种这些“单元”或一种“单元”(例如，导致表达和释放两种或多种不同蛋白质抗原或一种蛋白质抗原的两种复制品)引入病毒基因组中。编码所表达的蛋白质或多肽的核酸序列可以在串联的“单元”中(即，没有任何插入的序列)或被未编码所表达的蛋白质或多肽的核酸所分离。可以将一种或多种单元引入病毒基因组中的相同或全部位点。得到的重组体多蛋白前体将包括一种或多种外源蛋白质或肽以及一种或多种蛋白水解分裂位点。重组体多蛋白前体的处理导致释放外源产物。

可使用重组体病毒，如本文所述的重组体脊髓灰质炎病毒，以诱导对个体中抗原的免疫应答，从而，提供了对由其中产生抗原的外源病原体(细菌、病毒、真菌、寄生虫)的攻击或感染的防护。从而，它们可用作疫苗以提供对这些病原体的防护。如实施例2所述，已构成的重组体脊髓灰质炎病毒包含有编码来自轮状病毒VP4蛋白质的抗原决定基的核酸序列。还是如实施例2所述，已构成的重组体脊髓灰质炎病毒包含有来自霍乱毒素亚单位B的完全编码区。还制得了包括编码流感A病毒抗原或Vibrio霍乱的霍乱弧菌伞毛蛋白的核酸序列的重组体脊髓灰质炎病毒。这些重组体和亲本脊髓灰质炎病毒的表型示于图3。在HeLa细胞中表达了含有来自霍乱毒素亚单位的完全编码区的重组体脊髓灰质炎病毒并且鉴定了其表达和处理。结果表明，B亚单位在重组体病毒的范围内被表达并被适当地处理(4A)。结果还表明，在重组体脊髓灰质炎病毒中制得比正常的要大的P1多蛋白，但发生适当的蛋白水解处理，生成脊髓灰质炎病毒蛋白质产物的正常组分和游离霍乱毒素B亚单位序列(图4B)。在HeLa细胞中也表达了含有由轮状病毒VP4蛋白质得到的抗原决定基(长度为21-104的氨基酸)的重组体脊髓灰质炎病毒。图4B的行2-4含有携载这些抗原决定基的重组体脊髓灰质炎病毒。

实施例3描述了本文所述制得的重组体脊髓灰质炎病毒的免疫遗传学评定。通过肌肉内注射使表达人体脊髓灰质炎病毒受体的突变家鼠感染在Mahoney或萨宾(Sabin)基载体范围内表达完全霍乱毒素B亚单位(CTB)的重组体脊髓灰质炎病毒。将对比家鼠模拟感染抑或感染表达Vibrio霍乱伞毛蛋白的重组体病毒。Western印迹分析表明(图6)，用Mahoney基CTB-重组体脊髓灰质炎病毒免疫的家鼠明显地含有与CTB单体和五聚物反应的IgG抗体。而对比家鼠，正如所预期的，缺少这种特殊的抗体。此外，用萨宾基CTB-重组体脊髓灰质炎病毒免疫的家鼠在这一场合下，未产生CTB特殊抗体反应。这一原因尚不清楚，但可能涉及到重组体脊髓灰质炎的复制特性以及可能通过提高重组体病毒疫苗的剂量得到解决。

可以用类似于对霍乱毒素亚单位B和轮状病毒VP4蛋白质所述的方法制得含有编码其他对所需免疫反应的抗原的核酸序列的重组体脊髓灰质炎病毒。该重组体脊髓灰质炎病毒特别可用于预防可能需要诱导粘膜免疫性以预防感染的疾病(或减轻它们产生的严重程度)。例如，重组体脊髓灰质炎病毒病毒可能特别用于提供防护或减轻由HIV、轮状病毒、RSV、肝炎A病毒和流感病毒感染的严重程度。

人体粘膜表面覆盖大于400m²并且代表免疫系统和环境之间的最大接触面积。和粘膜表面相联的全部淋巴细胞数超过所有结合其他淋巴组织的这些细胞数，这些细胞负担合成至少60％每天产生的全部免疫球蛋白(Childers，N.K et al.，Annu.Rev.Microbiol.43：503-536(1989))。在分泌物中，如没有局部抗原暴露中的眼泪、唾液、乳汁，存在特殊的IgA抗体，导致普通粘膜免疫系统的概念。据信在内脏相联的淋巴网状组织(GALT)中被激活的免疫细胞后代被迁移至，并且保护，远处的粘膜表面。不顾粘膜免疫系统的范围和重要性，有关在粘膜表面上细胞和体液免疫的决定因素是较少为人所知的。响应淋巴细胞的较难得到，以及将优良特征抗原传送至可重现的目标位置的困难限制了对这些排出物的实验评价。重组体脊髓灰质炎病毒可以以可重现的方式传送优良特性的抗原，并可以改善某些实验障碍。目前，一系列相当重要的病毒和细菌疾病不能为接种疫苗所预防。这些疾病包括由轮状病毒、RSV感染造成的呼吸疾病、以及由V.霍乱或产肠毒素的大肠杆菌诱发的胃肠炎所引起的疾病。在被这些病原自然感染后，产生粘膜免疫性，使得对再感染具有显著或完全的抗性。本发明的重组体脊髓灰质炎病毒病毒可以用以将有关的防护抗原传送至粘膜免疫系统，从而提供了一种新的疫苗对策。

脊髓灰质炎病毒疫苗已被广泛地使用并且非常安全和有效。所用的脊髓灰质炎病毒的生物活性分子克隆包括脊髓灰质炎病毒1型(Mahoney菌株)(Racaniello，V.et al.，Proc.Natl.AcadSci.，U.S.A.78：4887-4891(1981))和脊髓灰质炎病毒1、2和3型萨宾疫苗菌株(Omata，T.et al.，Grene 32：1-10(1984)；Toyoda，H.et al.，J.Mol.Bio.174：561-585(1984))。也可以制成不大可能回复到毒性形式的脊髓灰质炎病毒的衍生物，或可以通过核苷酸序列的插入、缺失、和/或修饰的定向诱变位点由毒性形式制成无毒性。

重组体脊髓灰质炎病毒疫苗可能是目前所用的口服脊髓灰质炎病毒疫苗的有用的取代物，该口服疫苗需要混合三种不同的减毒菌株(PV1、PV2和PV3)，这些菌株各自具有可变值的抗原效力并有回复到野生型病原形式的小风险。PV1被认为是最安全和最佳的抗原组分，而PV3公知具有回复到病原型式最高出现率的缺点。肠道病毒：脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、艾柯病毒、以及NewerEnteroviruses。Melnick，J.L.In：Virology(2d ed.)，D.N.Fields，D.M.Knipe et al.(ed.)Raven Press Ltd，NY1990，pp.549-604；Nkowane，B.M.et al.，Vaccine-Associated Paralytic Poliomyelitis United States：1973-1984JAMA，257：1335-1340(1987)；Melniok，J.L.Population Genetics Applied to LivePcliovirus Vaccine，Am.J.Pub.Health 52：472-438(1962)。一种以插入PV2和PV3的PV1为基的重组体脊髓灰质炎病毒可能表明是比现有可获得的更为安全的疫苗。此外，用以PV1为基的重组体脊髓灰质炎病毒，通过提供含有来自所有三种脊髓灰质炎病毒血清类型抗原因子的最大限度减毒的，抗原有效的重组体病毒，有可能对全部脊髓灰质炎病毒病毒菌株达到有效的免疫性。

将重组体脊髓灰质炎病毒作为疫苗使用的特殊优点是：它一般是稳定的，并且随脊髓灰质炎病毒基因组因其复制可从细胞到细胞传播，则可再现地携带插入的信息。结果，对有限制的若干剂量的重组体脊髓灰质炎病毒而言，免疫应是有效的。此外，由于引入的抗原在感染的细胞内得以表达，则细胞和体液两者的免疫性将受激。虽然外源的核酸序列被重组体脊髓灰质炎病毒病毒携带并在复制运行期间表达出来，但外源的蛋白不包括在成熟的病毒颗粒中。因此，重组体脊髓灰质炎病毒病毒的病毒体结构和载体范围不以外源蛋白而变。许多重要的变量限制了现有疫苗的效能，特别是用在发展中国家，其中某些是实际的或经济属性的结果，另些则具有生物学的基础。用麻疹疫苗免疫是生物学障碍的良好实例，本发明用来克服这个障碍。麻疹在发展中国家造成每年死亡两百万个儿童。见Bloom，B.R.，Nature，342：115-120(1989)。有效疫苗的存在可防止麻疹病毒感染，而母系衍生并可中和疫苗的抗体的存在则难以使它包含在儿童中的效能。见Murphy，B.R.和R.M.Chanock，In：Viroogy(2d ed.)，B.N.Fields等人.(ed)，Raven Press，NY，pp.469-502(1990)；Perblud，S.R和S.L.Katz，Vaccines，S.A.Plotkin和E.A.Mortimer，W.B.Saunders Publishing，Philadelphia(1988)。在发展中国家，麻疹感染的流行病学实况是使许多儿童在有效接种之前便生了此病。携带由麻疹病毒衍生的抗原的重组体脊髓灰质炎病毒则能有助于克服这个障碍。脊髓灰质炎病毒在出生后便可很快给用，它的效能不因存在母系衍生的抗体而明显损失。脊髓灰质炎-麻疹重组体病毒可在感染的细胞内表达麻疹抗原，允许产生免疫响应。然而，由于麻疹抗原不包括在重组体病毒颗粒中，疫苗载体的复制应不受连累。

本发明的疫苗还能应用在其他领域。例如，腹泻病能造成每年死亡5百万至1千万人。见医疗研究所，新疫苗部的著作，Establishing Priorties，国家科学院出版，华盛顿，D.D.(1985)。轮状病毒在婴幼儿中是严重腹泻的单一的最重要的病因学病原，可确信它每年造成近百万人的死亡。见Kapikian，A.Z.和R.M.Chanok，In：Virology(3d ed.)，B.N.Field等人(Ed.)，Raven Press，NY，pp.1353-1404(1990)。在确定轮状病毒感染对宿主的免疫响应方面已作出显著进步的同时，疫苗的效果仍受病毒遗传学的复杂性和现行疫苗株衰退而影响效能的限制。与之类似，霍乱病毒(V.Chlerae)抗原被描绘成很可能是保护性免疫响应的目标。然而抗霍乱的候选疫苗或受不希望有的副作用限制，或受不适当的免疫性限制。携带来自轮状病毒和霍乱病毒的免疫原的，非病原的保护性决定因素的重组体脊髓灰质炎病毒则对评估候选疫苗作了保证。

感染病原所致的呼吸病每年造成死亡一千万人(用RSV代表初级病毒病原体)。见McIntosh，K.和R.M.Chanock，In：Virology，(2d ed.)，B.N.Field等人(Ed.)，RavenPress，N.Y.，pp.1045-1074(1990)。致力于研究RSV疫苗至今未果，但在鉴别保护性抗原方面已作出明显进展。对RSV疫苗的要求是它必须有效，必须诱导粘膜免疫，而且在出生后很快给用，还要能避免母系衍生抗体的中和作用。重组体RSV-脊髓灰质炎病毒能潜在地满足所有这些要求。

预防B型肝炎病毒疾病也是本发明制备疫苗的目的。

B型肝炎病毒属于叫做Hepadnaviridae的病毒族，该病毒含小环状DNA片段，它局部是单链的。传染性病毒也含有DNA聚合酶，它使DNA基因组完全成双链的。B型肝炎病毒(HBV)的复制作业包括形成RNA中间物。

B型肝炎病毒散布于全世界。对于该病毒，人类象是它们的主要储存库，即使在某些非人类的初级动物种内也发现这种病毒的表面抗原。据统计在美国每十万人有22个肝炎病例，可以想象这个统计低估了十倍之多。这些病例中的45％归因于B型肝炎。因此可以估计出，在美国有1-1.25百万人感染慢性B型肝炎。

传播B肝病毒最有效的途径是肠外方式引入。病毒已在受感染者的其它身体分泌物中被发现。但病毒传播的其它模式尚未很好地确认。

HBV还与病毒的慢性感染者发展成初级肝细胞癌有关。这种病在非洲、中国、东南亚，阿提斯加和格陵兰沿岸最流行。肝细胞癌和顽固的HBV感染常常伴随着在相同纬度的地区散布。

本发明的另一个目的是预防由Bordetella百日咳造成的疾病。这种细菌是百日咳或哮喘咳的病原体，它是一种严重的有可能致命的呼吸道感染疾病。目前使用的百日咳疫苗含有B，百日咳的化学不活泼的健全细胞。非细胞的百日咳疫苗业已取得进展，它是基于B，百日咳培养基利用化学和物理分凝所得的物质。

此外，将多种单一特定的百日咳抗原进行纯化制备多种疫苗，然后合并成一种疫苗，此方法已有资料公开(EP申请484621)。这种疫苗中含有的抗原之一是69千道尔顿(69KD)的外部膜蛋白(Shahin，R.D.等人，美国微生物学会第89次年会文摘，p51，1989)，按照本发明可以制备这种抗原。

预防和治疗疱疹造成的疾病(Herpetoviridae)也是本发明的又一目的。疱疹病毒是大的DNA病毒，它可建立潜伏感染，即可在宿主的活体内存留，静止期以后，这种病毒通过如免疫抑制或放散那样的刺激而活跃起来。

1型疱疹单病毒是口腔病变如“冷溃疡”的病原体。2型疱疹单病毒是生殖疱疹的病原体，它进一步牵连到宫颈癌。这些疱疹病毒目前在人群中蔓延，尚未有抗止病毒的疫苗注册。

在研制抗疱疹病毒的过程中，疫苗利用了糖蛋白，它们由于病毒的进入而基本进入细胞。特别感兴趣的糖蛋白是记作gD的疱疹单型1和2。编码gD-1和gD-2的基因的DNA序列在US 4818694和4891315中有述。按照本发明也可制备这两种糖蛋白。还令人感兴趣的是记作gB疱疹单型1和2。编码gB-1和gB-2基因的DNA序列在资料中有述，见Stuve，L.L.等人，Virology，61：326-335(1987)和Bzik，D.J.等人，Virology，155：322-333(1986)。这两种糖蛋白也按本发明的方法制备。

轮状病毒所致的疾病是本发明的又一目标。轮状病毒现已由WHO确认是婴儿肠胃炎的主要成因，很早就以制备合适的疫苗将这种疾病置于人类控制之下(Bull.W.H.O.61：251-254，1983)。轮状病毒基因组由双链RNA的十一个片段构成。这些基因编码至少6个病毒的生成，它们在完整的病毒颗粒内以双骨架排列而存在。这些蛋白中的三个是外部骨架的糖蛋白。

在研制这种疫苗方面，所采用的一种方法是利用重组体DNA技术制备几个轮状病毒的外部骨架糖蛋白。这些糖蛋白之一被记作VP7。编码VP7基因的DNA序列见资料：Both，G.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：3091-3095(1983)。这种糖蛋白可按本发明的方法制备。

编码外源生物的肽或蛋白质的任何DNA序列(当它被表达时产生抗这种生物的，或抗被抗原造成的病况或失调的保护性免疫)可被认为是用于本发明目的的外源核酸。编码一个或多个外源多肽的核酸序列(例如抗原或决定基)可包含在本发明的疫苗中。如果多于一种的外源抗原或决定基被外源核酸序列编码，则它们是一种单一病原体的抗原或决定基，或者是来自多于一个病原体(不同的病原体)的抗原或决定基。在优选实施方案中，这种生物是病原体的微生物。例如，这种外源决定基可在作为疾病或失调病原体的细菌、寄生物、病毒或真菌上被发现。此外，变态反应源、精子和癌细胞的决定基均可被使用。这些细菌、寄生物、病毒或真菌包括在下面所列的，但非限制性的举例中。

有复制能力的重组体病毒可用作疫苗抗广泛范围的病原体。例如，可由下列任何生物中获取DNA或RNA，并用来制备重组体病毒。寄生物：疟原虫.

艾美球虫属spp.

血吸虫spp.

锥虫spp.

巴贝虫spp.

利士曼虫spp.

似隐孢菌spp.(Cryptosporidia)

弓形体虫spp.

肺囊虫spp.细菌：霍乱弧菌

脓链球菌

脑脊膜炎双球菌

淋病双球菌

白喉柯南氏菌

破伤风梯状芽胞杆菌

粘膜炎布兰汉氏菌

百日咳博德特氏菌

嗜血杆菌spp.(如流感)

衣原体spp.

大肠埃氏菌共生亚种病毒：人体免疫缺乏病毒，I型

人体免疫缺乏病毒II型

猿猴免疫缺乏病毒，

人体T淋巴热病毒，I和II型

呼吸合胞体病毒

A型肝炎病毒

B型肝炎病毒

C型肝炎病毒

非A非B型肝炎病毒

I型疱疹单体病毒

II型疱疹单体病毒

细胞巨化病毒

流感病毒

副流感病毒

脊髓灰质炎病毒

轮状病毒

日冕形病毒属

风疹病毒

麻疹病毒

流行性腮腺炎病毒

水痘病毒

爱-巴二氏病毒

腺病毒属

乳头状瘤病毒属

黄热病毒

狂犬病毒真菌：念球菌疹spp.(尤其是白体)

隐球菌spp.(尤其是新型细球菌)

芽生菌spp.(皮炎的)

组织胞浆菌spp.(尤其是capsulatum)

球孢子菌spp.(尤其是immitis)

类球孢子菌spp.(尤其是brasiliensis)

曲霉属spp.

适于构成疫苗的潜在有用的抗原可以下列各种判据来鉴别，例如在中和病原体感染性中内抗原的拖累(Norrby，E.，1985，Summary，In：Vaccines 85，Larnet，R.A.，R.M.Chanock以及F.Brown(eds).，Cold Spring Harbor Laboratry，ColdSpring Harbor，NY，pp 388-389)、抗原的类型或组别特异性、以病员的抗血清或免疫细胞识别、和/或以抗血清或免疫细胞对抗原的保护性作用证明。此外，编码的决定基最好在编码时或在同病原体的不同分离体中间应显示很小程度或不显示抗原的改变。

已知的含抗原决定因素的肽或蛋白可被结合进重组体病毒。如果未知特定的抗原，应进行免疫活性序列的识别和特征化。实现此目的的一种方法是通过将产生的单克隆抗体用于病原体表面或用于病原体的其它分子。能被抗体识别的肽序列是限定的决定基。作为选择，接合在载体分子上的少量合成肽可在完整的分子上对结合剂相应于肽的位点的单克隆抗体进行实验(例如见Wilson等人，Cell 37：767(1984))，为鉴别和特征化抗原决定因素的本领域公知采用的其它方法，也在本发明的范围之内。

在本发明的疫苗构成中，外源蛋白也可包括外源生物的决定基。当外源多肽在脊椎动物宿主内被表达时，它引出免疫响应，保护宿主抵抗由含该决定基造成的病况或失调。例如，在本发明的这种实施方案中，可使用下列物的决定基或蛋白的外源蛋白：蛇毒、蜂毒、激素、精子(避孕用)，诱发变态反应性抗原，或任何免疫响应所要求的抗原。在另一实施方案中，特殊肿瘤的抗原可被表达作重组体外源蛋白，以便诱发抗癌的保护性免疫响应。

编码被本发明重组体病毒所表达的外源蛋白的基因序列可用本领域公知技术分离，它非限制地包括：由微生物基因DNA纯化、利用重组体DNA的方法(Maniatis等人，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，1982，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)，或者利用化学合成。

当把它们用作疫苗时，可用公知方法将本发明的重组体病毒投药于个体。它们一般被投药的途径与常规(现有可得的)疫苗的投药途径相同，和/或通过使感兴趣病原体发生感染所用的途径。例如，重组体脊髓灰质炎病毒疫苗可口服给药，而另外的疫苗如重组体麻疹或重组体黄热病属疫苗则可皮下给药。它们可以以疫苗组合物的形式给药，除含有有复制能力的重组体病毒之外，该组合物含有生理学许用的载体。该组合物还可含有免疫激励剂或佐剂，香味剂或稳定剂。

本发明的重组体病毒，尤其是重组体脊髓灰质炎病毒也可被用作一种体系，用以在宿主细胞内产生外源多蛋白，诸如在哺乳动物尤其是人的细胞或其它类型细胞内(例如被修饰成有脊髓灰质炎病毒受体的哺乳动物细胞)产生外源多蛋白。然后用公知的方法将外源蛋白从产生它的细胞中分离出来。

在两种应用中(即免疫或组织培养基的制备)，引入病毒的外源核酸序列可从下列的一个源中获取：天然产生它的源，用基因工程方法或化学合成制备的源。引入病毒的外源核酸序列可编码完整的，所需免疫响应所抗的抗原，或抗原决定基或抗原部份。插入病毒基因组的核酸序列的大小未显现出受限制。可以测定外源核酸序列的最大尺寸，例如用前述的分析其对病毒的复制作用来测定。编码至少150个附加氨基酸(即450个核甙酸)的外源核酸序列已被插进脊髓灰质炎病毒基因组，并且没有明显的病毒复制效能的损失。预料插入的序列对宿主而言存在免疫体系，抗原结构则由初始序列和结构型态两者限定。

植物病毒也可用作亲代病毒，如前所述向其中引入外源核酸序列。例如，可使用带DNA基因组的植物病毒(如菜花花叶病毒)或带RNA基因组的植物病毒(如烟叶病毒，萝卜黄叶病毒)。可将其通过引入将在植物内表达的编码外源多肽(如抗昆虫或疾病的毒素)的外源核酸序列(或序列组)来修饰。所得有复制能力的重组体植物病毒随后被引入植物(例如引入种子或在植物生长的其它阶段引入)，在其内产生外源多肽。例如，编码毒素(例如蝎子或蜘蛛毒素)的外源核酸序列可以这样引入，使其在植物内表达，从而保护它不受靠其为生的昆虫的损害。此外，在其内表达外源核酸序列的植物也可当做被编码蛋白或多肽的来源而口服给药。

与此类似，亲代病毒可以是动物病毒，它被修饰成包括有待在动物内表达的外源核酸序列(例如保护动物或令其抗病原体免疫或提供生长增益因子)。

下列实施例将说明本发明，但毫无意图以任何形式限制本发明。

实施例实施例1.构成脊髓灰质炎病毒载体的cDNA克隆

分子克隆的全部操作都遵循标准重组体DNA方法学(Ausubel，F.M.等人，Current Protocois In Molecular Biology，GreenePublishing-Wiley Interscience，Neco York，1937)。所用的脊髓灰质炎病毒的生物活性分子克隆包括1型脊髓灰质炎病毒(Mahoney菌株)(Racaniello，V.等人，Proc.Natl.AcadSci.，U.S.A.78：4887-4891(1981))和1、2及3型脊髓灰质炎病毒的Sabin疫苗菌株(Omata，T.等人，Gene 32：1-10(1984)；Toyoda，H.等人，J.Mol.Bio.174：561-585(1984))。这些分子克隆已通过在病毒基因的5′末端插入T7RNA聚合酶启动子而被修饰，以便促进通过感染性脊髓灰质炎病毒RNA的T7RNA聚合酶的体外转录。(见Ausubel，F.M.等人，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Pablishing-Wiley Interscience，N.Y.(1987))。脊髓灰质炎病毒基因组已进一步被修饰成包括一种含有多个限制性酶识别部位的编码内合成多聚接头(即EcoRI和XhoI)。在脊髓灰质炎病毒基因组内插入的序列包括在其3′边缘的编码脊髓灰质炎病毒病毒3C蛋白酶(AXXQG)识别和分裂部位的这些序列(Palmenbery，A.C.，Ann.Rev.Microbic.44：603-623(1990))。可利用公知的以重叠扩展形式将聚合酶链反应(PCR)变型的方法来进行这些修饰(Horton，R.M.等人，Biotechniques 8：528-535(1990))。可用以下1型脊髓灰质炎病毒的实施例来说明。

简言之，使用1和2，以及3和4(见表)低聚核甙酸进行两个独立的PCR反应，以使分别放大1-740和740-1540位置的脊髓灰质炎病毒基因组的部份。

表1.用于放大的引物低聚核甙酸号数序列1- 5′-TAC GGT CGA CCT AAT TAC GAC TCA CTA

TAG G-3′(SEQ ID #1)2- 5′-TTG AAA CAA AGC CTC CCT CGA GGG GAA

TTC CTG AGC ACC CAT TAT G-3′(SEQ ID

#2)3- 5′-CCC TCG AGG GAG GCT TTG TTT CAA GGT

GCT CAG GTT TCA-3′(SEQ ID #3)4- 5′-ATT ATC TGG TGC GGG AAC ACA AAG

GC-3′(SEQ ID #4)5- 5′-TCA GGA ATT CAC ACC TCA AAA TAT T-3′

(SEQ ID #5)6- 5′-TCA GCT CGA GGG ATT TGC CAT ACT

AAT-3′(SEQ ID #6)

含有待插入片段的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳纯化，而第二PCR放大则用1和4号低聚核甙酸引物进行。由这种放大而得的1582碱基对(bp)DNA片段表示42核甙酸插入物(携带新的限制性酶位点和编码蛋白酶水解加工信号的片段)和序列1-740，以及740-1540。(42核甙酸插入物插在碱基740和741之间)。这个片段可用SaI1-Aat2消化，以凝胶电泳纯化并捆扎到SaI1-Aat2消化的脊髓灰质炎病毒克隆的pSR-XpA上(前面已述的含全长脊髓灰质炎病毒cDNA克隆的质粒(Andino，R.等人，Cell 63：369-380(1990))。所得质粒(称作pMV2.2)通过用ClaI消化使之线性化，并且通过常规程序用T7聚合酶进行病毒RNA的体外合成(Ausubel，F.M.等人，CurrentProtocols In Molecular Biology，Greene Publishing-WileyInterscience，New York，1987)。

通过将体外合成的脊髓灰质炎病毒RNA转染进HeLa S3细胞，以回收有复制能力的脊髓灰质炎病毒，如资料所述(Lnthman，H.等人，Nucl.Acids Res.11：1295-1308(1983))。通过标准技术并参考复制能力、结构组成和核甙酸序列进行回收病毒的特征化(Ausubel，F.M.等人，Current Protocols InMoleculor Biology，Greene Publishing-Wiley Interscience，New York，1987)。

由各种病毒和细菌病原体衍生的外源基因序列已在这些重组体脊髓灰质炎病毒内表达。通过下文中完整的霍乱毒素B亚单位的实施例说明所用的一般对策。含有下列序列的低聚核甙酸(挑选允许编码内插入脊髓灰质炎病毒载体的)被用来放大质粒pJM 17内含有的整个霍乱毒素B亚单位编码区(Pearson，D.N.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.79：2978-2980(1982))：

5′-TCA GGA ATT CAC ACC TCA AAA TAT T-3′(SEQ ID #5)

5′-TCA GCT CGA GGG ATT TGC CAT ACT AAT-3′(SEQ ID #6)在表中这些是列出的5和6号引物。

所得的312bp DNA用EcoRI和XhoI消失(通过PCR引物引入的位点)，并捆扎在EcoRI和XhoI分裂的pMV 2.2上。所得质位记作pPCH-52，并将继RNA转染获得的病毒记作PCH52。类似的方法可用来插入由霍乱弧菌(tcpA)的毒素共调节毛发的质粒克隆衍生的序列(Sun，D.等人，Infect.Immun.59：114-118(1991))，轮状病毒VP4基因(Gorziglla，M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A、87：7155-7159(1990))和插入流感A病毒凝血基因(Wiley，D.C.等人，Ann.Rev.Biochem.56：365-394(1987))。对tcpA，核酸序列插入在蛋白质的相应的氨基酸的羧基终端(157-199)。对流感A病毒，核酸序列插入在相应的氨基酸134-284。通过Western印迹分析可进行：重组体脊髓灰质炎病毒的免疫学特征化以记录合适的表达，脊髓灰质炎病毒构成和插入序列的加工(Ausubel，F.M.等人.，Current Protocols In MolecularBiology，Greene Publishing-Wiley Interscience，New York，1987)。天然病毒体组成和结构的保留可以被证实，方法是通过被感染细胞有新陈代谢标记的溶胞产物(35S)进行常规蔗糖梯度(15-30％)离心沉淀。然后用标准的SDS-PAGE分析法分析梯度馏份(Ausubel，F.M，等人，Current Protocols InMolecular Biology，Greene Publishing-Wiley Interscince，New York，1987)。实例2.携带霍乱弧菌B毒素亚单位的重组体脊髓灰质炎病毒的构成

及评估

重组体脊髓灰质炎病毒被构成为或是含有来自霍乱毒素亚单位B的整个编码区(103个氨基酸)，或是含有轮状病毒VP4壳体蛋白的几个部份(21-104氨基酸长度)。编码亚单位B或VP4肽的DNA片段可被放大，并且其尾端通过包括以克隆为目的的合适的限制性位点来修饰。由毒素A亚单位的分离物中表达的霍乱B亚单位是无毒性的，但提供了一种抗原刺激物以提高保护性免疫响应。DNA片段被插入脊髓灰质炎病毒载体cDNA克隆，并且RNA由所得质粒被转录。霍乱毒素亚单位B和轮状病毒VP4重组体cDNA克隆分别被转染进HeLa细胞。于37℃培养3天后得到了重组体脊髓灰质炎病毒斑(见图2)。图2显示了亲体和重组体脊髓灰质炎病毒斑的形貌。由经野生型脊髓灰质炎病毒(第1行)感染或是经霍乱毒素B-脊髓灰质炎病毒重组体病毒(第2行)感染的HeLa细胞制备的萃取用SDS-PAGE凝胶进行电泳并进行Western印迹分析。对于完整的霍乱毒素(A和B亚单位)用免抗原有效物研究Western印迹。正如所见到的，表达了B亚单位，并在重组体脊髓灰质炎病毒的范围内进行了适宜的加工(箭头所示)。

用亲本脊髓灰质炎病毒(图3B，第1行)或用霍乱毒素B-脊髓灰质炎重组体病毒(图3B，第5行)，将感染的同样的HeLa细胞的萃取物用免抗体进行探测识别脊髓灰质炎病毒结构蛋白。正如所见，在重组体脊髓灰质炎病毒内制造了比正常较大的P1多蛋白，这是因为存在外源多肽所致。合适的蛋白水解加工随后产生脊髓灰质炎病毒蛋白产物的正常补体，以及放出外源霍乱毒素序列。重组体脊髓灰质炎病毒的免疫特征化以Western印迹分析来进行(Ausubel，F.M.等入，Current Protocols in Molecular Bilolgy，GreenePublishing-Wiley Interscience，New York，1987)。以常规密度梯度离心沉淀和Western印迹分析来证实天然病毒体结构的保留(Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing-Wiley Interscience，New York，1987)。实施例3.重组体脊髓灰质炎病毒免疫力评估

研究初始免疫力的核型采用表达人类脊髓灰质炎病毒受体的转移基因的鼠体(Ren等，Cell 63：353-362，1990；由Vincent Racaniello博士友好提供)。向转移基因的鼠体肌内注射重组体脊髓灰质炎病毒(50μl的2×10⁸pfu/ml原种)令其感染，该病毒在Mahoney范围或Sabin为基的载体(分别记作MoSB和MsSB)内表达整个的霍乱毒素B亚单位(CTB)。对照的鼠体假感染，或用表达霍乱弧菌伞毛蛋白(TcpA)(MoPi)的重组体病毒感染。在以30天隔开的两个时刻对鼠体进行感染43天后，对接种的鼠体用在不完整的Freund佐剂内的10μg纯化CTB(Calbiochem)作腹膜内注射。五天后，将鼠体放血，并检验其血清中IgG抗体与纯化CTB反应的出现情况。随后以Western印迹分析测定与CTB反应的抗体。在一个10％聚丙烯酰胺凝胶的单独的宽通道内，使CTB(5ng)经受SDS-PAGE分离作用，并将其转移到硝化纤维上。由被免疫的动物取血清(1∶100稀释)装入多沟槽仪器的单独通道中(Mini-Protean II型，多重滤网，BioRad)。使用亲合性纯化的与过氧化物酶连接的免体抗鼠IgG，按标准方法(ECL，Amersham)检测结合的抗体。

这项分析的结果列于图6。用CTB-重组体脊髓灰质炎病毒免疫的五只鼠体取五份血清(MoSB(3-7通道))，血清清楚地含有与CTB单体和五聚物反应的IgG抗体。由假感染(1和2通道)或无关对比物(MoPi，12-14通道)的血清中，不出所料，缺少这种特殊抗体。此外，用Sabin为基的重组体的表达CTB的脊髓灰质炎病毒免疫的鼠体，并不显示CTB-特定抗体的反应性(MsSB，8-11通道)。这些初步结果揭示了许多结论。首先，用重组体脊髓灰质炎病毒的免疫，或是能直接产生，或是专门引出免疫动物内的适宜的抗体响应。类似地用纯化CTB免疫的对比鼠体血清中，则缺少CTB-特定抗体，并且CTB-反应抗体的IgG同模标本似乎表明：接种已诱导了记忆响应。对此虽然原因不明，但可涉及重组体脊髓灰质炎病毒的有关复制特性，并且通过加大重组体病毒疫苗的剂量是可分辨的。野生型和重组体Sabin的脊髓灰质炎病毒二者的复制比其野生型Mahoney逆向部份要稍好些。进而言之，这些试验中所用的转移基因鼠体并不支持脊髓灰质炎病毒Sabin疫苗的有效复制。因此，有限的活体外复制可以通过Sabin为基的重组体防止有效免疫的产生。实施例4.重组体病毒安全性评定

与实验重组体脊髓灰质炎病毒的免疫性力相平行，进行初步研究以评定该病毒的安全性。为此目的，基因转移的鼠体接受脑内接种，或用亲代Mahomey(病原体的)，或用Sabin(减弱的)菌株，或者用表达CTB的其重组体衍生物，接种物用量要等值(5×10⁶pfu)。虽然所有用Mahoney菌株接种的鼠体均被麻痹，但用重组体注入的鼠体却没有一个经受麻痹。这个结果揭示，在脊髓灰质炎病毒基因组内插入CTB序列后，所得重组体病毒的致病力衰减而不是增大。对这种现象的进一步研究正在进行。实施例5.另外的有复制能力的脊髓灰质炎病毒的构成

图2所示意代表的重组体脊髓灰质炎病毒的类似的方式构成，使用本文所述的方法和物质(见实施例1和2)，以及本领域的识别方法。为了对在位点而不是在重组体脊髓灰质炎病毒多蛋白的5′表达外源编码序列的潜能进行检查，在病毒基因组内许多另外的位置引入多聚接头/蛋白水解的加工特色。这些位点包括VP1和2A(pMoV2.1和pMoV2.2)之间的接点，2A和2B(pMoV2.5)的接点，2C和3A(PMoV3.1)的接点，以及Vpg和3C(PMoV3.3)的接点。为了促进在病毒多蛋白内部外源序列的加工，在插入物的两端包纳了合适的蛋白水解的加工信号。以此方式引入时，插入物的三个新位点允许稳定地携带所要求的插入物的有复制能力的重组体病毒产生，所得病毒在图2中示出，记作PMoV2.1，PMoV2.2，PMoV2.5和PMoV3.1的都是有复制能力型；事实上，在接近野生型斑形貌学和复制动力学处显示。病毒复制的取消中所造成仅有的重组体修饰位于Vpg和3C的接点处的插入序列。在病毒基因组内至少四个可能的位置上插入外源抗原序列的能力允许了重组脊髓灰质炎病毒疫苗衍生物中的灵活度。

如图2所示，构成包括3C分裂位点的载体和包括2A分裂位点的载体。利用脊髓灰质炎病毒3C蛋白酶来释放自多蛋白前体的外源序列的形体包括Q-G加二位点。类似的重组体病毒(它可传播脊髓灰质炎病毒2A蛋白酶以便对重组多蛋白前体的合适的加工起作用)包括被Y-G对和环绕的氨基酸提供的特征化2A加工位点。图2中病毒PMoV2.1和PMoV2.2 代表了这个2A为基的载体，并如上所述，在近野生型生长处显示。构成的脊髓灰质炎病毒载体(图2)含有比图1所示重组体脊髓灰质炎病毒中存在的要更多的扩展性多聚接头序列(EcoR 1.Not 1，EssH 2和Xho 1)，以促使所要求的外源核酸序列易于插入重组体载体。此外，还能成功地衍生变体，该变体包括邻近插入序列的一种多甘氨酸链，以便增强该区域的结构灵活度，并潜在地加大蛋白酶加工的效能。总之，这些载体增进了基本对策的多方适应性，提供了多种多样的替代方法以利于疫苗载体的产生。

外源核酸序列或序列群(各自编码被表达的蛋白或多肽)；核酸序列或序列群[各自编码蛋白水解分裂位点(如3C蛋白水解位点或2A蛋白水解位点)]可在任何这些位点处被引入亲本脊髓灰质炎病毒基因组，使用公知方法或本文所述方法皆可。如上所述可评定所得重组体脊髓灰质炎病毒产生编码的蛋白或多肽的能力。也可评定重组体脊髓灰质炎病毒的免疫力及其安全性。(见实施例3和4)。实施例6.构成重组体脊髓灰质炎病毒的对策

上述实施例1-5利用了插入含限制酶识别位点的编码内的合成多聚接头的脊髓灰质炎病毒基因组。本实施例6叙述了构成重组体脊髓灰质炎病毒结构的对策，该病毒不要求在外生基因插入位点周围引入外源限制酶或改变侧接的脊髓灰质炎病毒基因组。本实施例6进行叙述具有多蛋白开放读码的编码中插入外源核酸序列的对策。下面实施例7-9叙述了本发明重组脊髓灰质炎病毒内插入专门的外源核酸序列，以便形成表达外源多肽的载体。

本实施例6利用了Racaniello和Baltimcre体系，该体系允许脊髓灰质炎病毒的基因操作(Racaniello，V.R.和Baltimore，D.，Science，214：916-919，1981)。含全长度脊髓灰质基因RNA的cDNA复制品的质粒，被发现随着在培养基中转染进入合适的宿住细胞后产生感染病毒，这个体系已用来研究许多方面，如脊髓灰质炎病毒的复制，基因稳定性，以及疫苗菌株的衰减。

特别是所用的脊髓灰质炎病毒载体是由质粒PLED3.2衍生的。质粒PLED3.2是由质体pBR322构成的，其中插入了Sabin 3型脊髓灰质炎病毒基因组的全长度cDNA复制品。而Sabin3型病毒通常是用在口服脊髓灰质疫苗中的一种衰减培养后的菌株。脊髓灰质炎病毒cDNA在噬菌体T7RNA聚合酶启动子之后被克隆。这种启动子的存在可允许用T7RNA聚合酶进行体外转录，以生成全长度的RNA转录本，该转录本可在转染进入组织培养细胞后产生脊髓灰质炎病毒。质粒PLED3.2的样品用美国型培养物收集器沉淀(12301 Parklawn Drive，Pockville，Maryland20852，U.S.A，1991年8月20日)，样品注册登记号为ATCC75062。

将外源核酸序列插入具有脊髓灰质炎病毒多蛋白开放读码的码中的对策包括使用重叠扩展聚合酶链反应(PCR)(Horton，R.M.，等人，Gene，77：61-68(1989))。这种方法允许在无需引入限制性位点的情况下融合基因序列。该外源基因被连接到具有多蛋白开放读码的码中而不需变更侧脊髓灰质炎病毒序列。

这一对策包括两个PCR周期：第一周期将重叠的侧接序列引入到待克隆化的基因上；第二周期使用两个PCR片段作为模板DNA并导致用重叠序列作为媒介的准确的融合。

表达克隆是使用重叠扩展PCR将一个外源基因融合到脊髓灰质炎病毒多蛋白编码区域的起始处(碱基743)而构成。此外，编码灰质3C蛋白酶识别部位的序列插入3′至外源基因。用于下述实施例中的特定引物列于表2。

表2

将外源基因克隆进pLED3.2的引物引物定向序列(5′-3′) pLED3.2位置A 意义 CAGGATTTCAGTGTCACAATGGA (725-745)

GAACATCACATCAGGATTTCTAG

GACC(SEQ ID #7)B 反意义 TACTTGAGCTCCTTGAAACAAAG (757-746)

CAATGTATACCCAA(SEQ ID

#8)C 意义 ATCTTCGACGCGTTGCGCTC (270-289)

(SEQ ID #9)D 反意义 TGTGACACTGAAATCCTG(SEQ (742-725)

ID #10)E 意义 GCTTTGTTTCAAGGAGCTCAAGT (746-764)

ATCATCCCAA(SEQ ID #11)F 反意义 TCTTCCTAGGTAGTGGTAAT (1258-1239)

(SEQ ID #12)G 意义 GACAGGATTTCAGTGTCACAATG (723-745)

GGGCAGAATCTTTCCACCAGCAA

T(SEQ ID #13)H 反意义 TTGTGGAATTCCACTGCATGGCC

TGAGGATGAGTGTTTCTC(SEQ

ID #14)I 意义 GACAGGATTTCAGTGTCACAATG (723-745)

CAGTGGAATTCCACAACCTTCCA

CCA(SEQ ID #15)

表2(续)

将外源基因克隆进pLED 3.2的引物引物定向序列(5′-3′) pLED3.2位置J 反意义 CTGTGGAAGCGCCTTAATTAAGT

TAACGCGGCCGCCCATTGTGACA

CTGAAATC(SEQ ID #16)K 意义 ATGGGCGGCCGCGTTAACTTAAT

TAAGGCGCTTCCACAGGGAGCTC

AAGTATCATCC(SEQ ID

#17)L 意义 TCACCTTCGTGGTAACCGCCAAC (2871-2894)

T(SEQ ID #18)M 反意义 CTGTGGAAGCG CCTTAATTAAGT

TAACGCGGCCGCCATATGTGGTC

AAACCTT(SEQ ID #19)N 意义 TATGGCGGCCGCGTTAACTTAAT

TAAGGCGCTTCCACAGGGCTTGG

GCATCAGAATAA(SEQ ID

#20)O 反意义 ATCGTGCTGGTCACCATGCTG (3929-3909)

(SEQ ID #21)P 意义 CAGGATTTCAGTGTCACAATGTA (725-745)

CGGAATAGAATATACC(SEQ

ID #22)Q 反意义 GCTCCTTGAAACAAAGCTACTCT (750-746)

GTAATAGAACGCTG(SEQ ID

#23)

第一周期PCR反应包含近似2ng模板DNA，100pmol每种引物，200μmol每种dNTP，10mM KCl，10mM Tris-盐酸盐，pH8.3，3.75mM MgCl₂和5单位Ampli Taq DNA聚合酶，Stoffel片段(Perkin-Elmer/Cetus，Norwalk，CT)。反应在用40ml轻矿物油覆盖的100μl容积中发生。PCR循环条件是：95℃2分钟，冰点2分钟，继而95℃1分钟，50℃1分钟，72℃2分钟，进行30次循环。所得的PCR片段使用Promega公司的Magic PCR药盒(Promega，Madison，WI)或通过琼脂糖凝胶电泳提纯(Sambrook，J.，等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(2 nd Ed.，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，NY(1989))。

侧接碱基743的pLED 3.2区域也在第一周期PCR反应中放大，提供了形成融合的第二模板DNA。附加的重叠序列不加到这些片段上；这就允许这些片段被用于构成许多不同的融合，而每种融合包含不同的外源基因。用于该区域上游(5′)到碱基743的引物是引物C和D(参看表2)。用于该区域下游(3′)到基体743的引物是引物E和F(参看表2)。这些反应的模板是用XbaI线性化的pLED3.2。PCR反应如上所述而进行。这些反应分别产生pLED3.2 5′和3′区域的472碱基对和524碱基对的片段。所得的PCR片段用0.8％低熔点琼脂糖(Sea Plaque，FMC(Rockland，ME))提纯，然后用作后续反应的模板。

第二周期的PCR反应包括将上述两部份PCR片段混合，并在外部引物存在的情况下进行放大，以产生最终的融合产物。在实施例7-11所述的构成中，外源基因在分别的PCR反应中与5′或3′片段融合。然后将该融合产物使用存在于该质粒中的独特的限制性位点克隆进pLED3.2。

第二周期的PCR反应包含μl每种模板，100pmol每种引物，200μmol每种dNTP，10mM KCl，10mM Tris-盐酸盐，pH8.3，3.75mM MgCl₂和5单位Ampli Taq DNA聚合酶，Stoffel片段(Perkin-Elmer/Cetus)。反应在用40μl轻矿物油覆盖的100μl容积中发生。第二周期反应的PCR循环条件为：94℃5分钟，72℃10分钟，继而94℃1分钟，50℃1分钟，72℃2分钟，进行30次循环。融合的片段在0.8％低熔点琼脂糖上分离，用适宜的限制性内切酶消化并亚克隆进行pLED3.2。实施例7构成携带B型肝炎表面抗原的重组体脊髓灰质炎病毒

将如同实施6所述的由质粒pLED3.2所衍生成的脊髓灰质炎病毒载体用于构成表达B型肝炎病毒的表面(S)抗原的S基因编码的病毒载体。已发现该S抗原对B型肝炎病毒是保护性的。该S抗原是一种226氨基酸长度的一种蛋白质。在本实例中，B型肝炎的S基因是由人类病毒的亚型ayw，特别是由克隆化基因的DNA衍生的。由亚型ayw衍生的B型肝炎的S基因是长度上为675碱基对(Galiber，F.，等人，Nature，281：646-650(1979))。

引物A和B(参看表2)被用于第一周期的PCR，以放大该S基因并将重叠的pLED3.2序列掺入该PCR产物中。在这两个引物中的划线序列对应于pLED3.2中的序列，同时剩余的序列相应于S基因。在引物A中，该S基因序列对应于B型肝炎基因组中碱基对157处S抗原的起始密码子。反义引物B编码S抗原加灰质3C蛋白酶识别部位的羧基末端。这些引物用作对克隆化B型肝炎DNA的模板，以产生717碱基对的PCR片段。第一周期PCR循环条件不同于实施6所述的条件并如下述：94℃2分钟，冰点2分钟，继而94℃1分钟，26℃1分钟，70℃2分钟，进行10次循环，94℃1分钟，45℃1分钟，70℃2分钟，进行20次循环。

第二PCR反应使用如上所述的PCR片段，以便在pLED3.2侧接区域和该S基因之间产生融合。两个PCR反应或是用5′LED侧接区域或是用3′LED侧接区域加S基因PCR片段作为模板而进行。用于5′融合的意义引物是引物C，它在pLED3.2侧接区域的5′端处引发。反意义引物B在S基因的3′端处引发。对于3′融合，意义引物是S基因意义引物(A)，以及3′LED3.2反意义引物(F)。所得的PCR片段对于5′和3′融合分别是1175和1222碱基对。然后用琼脂糖凝胶电泳提纯融合的片段。

然后用限制性内切酶清化由第二周期PCR反应得到的融合片段，最终构成含S基因的脊髓灰质炎病毒的载体，LED3.2-S基因的融合体用MluI和BstXI(S基因中的单一的位点)消化。而3′LED3.2-S基因的融合体用AvrII和BsttXI消化。质粒pLED3.2在碱基对278处用MluI消化，并在碱基对1249处用AvrII消化，以去除971碱基对的片段。接在用0.8％琼脂糖凝胶电泳提纯之后，将所得的消化物混合并使用标准方法(Sambrook等人，supra)结扎在一起以形成pLED3.2/HBV。这一具有全段长的灰质-融合构成物的DNA序列是使用一套应用生物系统(Applied Biosystems)(Foster City，CA)370A DNA定序机予以确认。

接着进行转录和转染反应。由T7启动子产生的RNA转录本被转染进Vero细胞中以产生感染的脊髓灰质炎病毒。对于这些实验而言，为产生RNA转录本，通过用PvuI消化该质粒制备近似为5μgpLED 3.2/HBV。PvuI的消化导致两个片段，含有T7启动子的较大片段，继而是含有S基因融合体的全段长的灰质基因组。此消化反应用酚萃取并用乙醇沉淀。沉淀的DNA重新悬浮于20μl水中。全段RNA转录本使用T7RNA聚合酶在体外通过PvuI消化的DNA合成(Moss，E.G.等人，J.Virol.，63：1884-1890(1989))。转录产物用琼脂糖凝胶电泳分析。

将汇合的25cm²Vero细胞单层使用DEAE-转染规定由转录本转染(Van der Werf，S.，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，83：2330-2334(1986))。将近似为25μg RNA与DEAE-葡聚糖(0.5mg/ml)混合，然后复盖到Vero细胞上。接在室温培养30分钟之后，去除接种物并洗涤细胞。加入新修饰的Earle呋喃葡烯糖-5-半乳糖苷维持液并在33.5℃培养细胞。接在培养5天之后，观察到总的细胞致病作用(单层中细胞的溶胞作用)，并由培养基中收获重组体脊髓灰质炎病毒。

由构成物pLED3.2/HBV产生的含重组体脊髓灰质炎病毒的病毒原种通过在Vero细胞上的噬斑分析而被滴定。此外，由重组体病毒中萃取RNA，并使用Gene Amp热稳定的rTth逆转录酶RNAPCR药盒(Perkin-Elmer/Cetus)通过逆转录作用和PCR进行分析。结果证明，S基因通过培养基中的通道稳定地保持在重组体pLED3.2/HBV病毒中。

可用多种方法分析来自脊髓灰质炎病毒中的S抗原的表达。已有标准步骤的这些方法包括：免疫过氧化酶染色感染细胞，病毒和外部蛋白质的免疫沉淀，Westen印迹和点印迹(Coligan，J.E.，等人，eds.，Current Protocols in Immunology，John Wiley andSons(1992))。

免疫过氧化酶染色定用于检测病毒感染的Vero细胞中的蛋白质。用病毒感染Vero细胞并在各个感染后的时刻用乙醇或甲醇固定。被固定的细胞单层用抗脊髓灰质炎病毒蛋白质或S抗原的抗血清培养。洗涤平皿，然后用接合到辣根过氧化酶(HRP)上的第二抗体(例如山羊的抗家兔免疫球蛋白(G)培养。再次洗涤平皿然后加入HRP基质，3.3′-二氨基联苯胺四氢氯化物(Sigma，St.Louis，MO)。表达与抗体交叉反应的蛋白质的细胞被染色。

将Vero细胞单层用重组体病毒感染，细胞的溶胞产物可通过对存在的病毒编码的蛋白质作免疫沉淀或Western印迹法而确定。对于免疫沉淀而言，用抗脊髓灰质炎病毒或外生蛋白质的抗血清培养细胞的溶胞产物。然后将蛋白质A琼脂糖Sepharose(Sigma，St.Louis，MO)加入该混合物并进一步培养。将此琼脂糖(Sepharose)珠粒离心处理，洗涤并用SDS离解缓冲液洗脱。沉淀的蛋白质可通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析。对于Western印迹法，用SDS-PAGE分离该细胞溶胞产物，将其转移到硝化纤维素中，并用抗血清培养到关注的蛋白质上。洗涤印迹，用接合到HRP上的第二抗体(例如山羊的抗家兔免疫球蛋白G)培养。再次洗涤印迹，然后加入HRP基质，4-氯-1-萘酚(Bio-Rad，Richmond，CA)加过氧化氢，以鉴定交叉反应的蛋白质。

在本实施例7和以下的实施例中，上述实施例3所述的使用转移基因的小鼠的方法也可用于测定脊髓灰质炎病毒和外源多肽重组体的免疫原性。实施例8 构成携带B型肝炎前-S区域基因的重组体脊髓灰质炎病

毒

B型肝炎病毒的被膜含有3种全部在B型肝炎基因组的S基因区域内编码的蛋白质。每种抗原都在S基因区域的开放读码中通过不同的起始位点编码。主要的蛋白质是S抗原，它在是226氨基酸长度。其它两种蛋白质是中等的和大的蛋白质，它们分别由前-S1和前-S2基因编码(Tiollais，P.等人，Nature，317：489-495(1985))。据信在可进而含有S抗原的菌苗中含有前-S1和/或前-S2抗原可以提高B型肝炎菌苗的效能。

构成含前-S1或前-S2基因的脊髓灰质炎病毒载体的对策与实施例7中有关S基因的叙述相类似。设计引物以放大每种基因并在该基因的每个末端引入脊髓灰质炎病毒病毒的侧接序列。各引物如表2所述，PCR反应和循环条件如上述。

引物G和H用于放大来自B型肝炎DNA的前-S1区域。引物G将脊髓灰质炎病毒的序列(表2中划线部份)在前-S1基因的5′末端引入，用前-S1序列在B型肝炎基因组中的碱基2580处开始。反意义引物H被置于来自碱基3152-6的基因组(前-S1和前-S2二者共用)的前-S区域，并在碱基1处包括一个EcoRI位点。用引物G和H对克隆的B型肝炎基因DNA的PCR放大产生338碱基对的片段。达种片段与5′LED3.2片段(来自实施例6所述的引物C和D)一起，在第2的PCR反应中作为模板DNA。用引物C和H的放大产生了有770碱基对的融合的5′LED3.2-前-S1片段。为了构成前-S1基因的3′末端，使用PCR片段3′LED3.2/前-S2(参看下一段)，这是因为这一区域在两种前-S构成物中是相同的。5′LED3.2-前-S1片段用MluI和EcoRI消化。3′LED3.2-前-S2片段则用EcoRI和AvrII消化。所得的片段用琼脂糖凝胶电泳提纯，并捆扎进已被MluII和AvrII消化的pLED3.2中，所得的构成物被定名为pLED3.2/前-S1。

按在实例7的各步骤之后，这一全长度的灰质-融合构成物的DNA序列使用应用生物系统Applied Bicsystems 370A DNA定序机测定。

接着进行转录和转染反应。由T7启动于产生的RNA转录本被转染进Vero细胞，以产生感染的脊髓灰质炎病毒。为进行这些实验，通过用PvuI消化该质粒而制备近似5ug的pLED3.2/前-Si以产生RNA转录本。PvuI的消化生成两种片段，即含有T7启动子的较大片段，继而是含-S1基因融合体的全段灰质基因组。将该消化反应物用酚萃取并用乙醇沉淀。将沉淀的DNA重新悬浮于20μl水中。全段长的RNA转录本在体外使用J7RNA聚合酶由PvuI消化的DNA合成。转录产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。

将汇合的25cm² Vero细胞单层使用DEAE-转染规定由转录本转染。将近似为25μg的RNA与DEAE-葡聚糖(0.5mg/ml)混合，然后覆盖到Vero细胞上。在室温下培养30分钟后，去除接种物并洗涤细胞。加入新修饰的Earle呋喃葡烯糖-5-半乳糖苷维持液，并在33.5℃培养细胞。培养该培养基直至观察到全部的细胞致病作用，并由该培养基中收获重组体脊髓灰质炎病毒病毒

含有构成物pLED3.2/前-S1产生的重组体脊髓灰质炎病毒的病毒原种通过在Vero细胞上的噬斑分析而被滴定。此外，由重组体病毒中萃取RNA，并使用GeneAmp热稳定的rTth逆转录酶RNAPCR药盒(Perkin-Elmer/Cetus)通过逆转录和PCR进行分析。结果证明，前-S1基因通过培养基中的通道稳定地保持在重组体pLED3.2/前-S1病毒中。

可用多种方法分析来自脊髓灰质炎病毒载体的前-S1抗原的表达。这些方法包括：被感染细胞的免疫过氧化酶染色，病毒和外部蛋白质的免疫沉淀，Western印迹和点印迹。

对前-S2的表达克隆使用引物I作为意义引物，使用引物B作为反意义引物(参看表2)。这些引物导致全部的前-S2基因放大，并在5′和3′的末端处引入LED3.2序列。PCR反应产生867碱基对片段。提纯之后，这一片段被作为模板与或是5′LED3.2或是3′LED3.2片段一起用于第二周期PCR反应，导致形成定名为5′LED3.2/前-S2和3′LED3.2/前-S2的融合产物。用于第二周期PCR的引物，对于5′融合是C和B，而对于3′融合是I和F。将5′LED3.2/前-S2片段用MluI和XbaI消化，将3′LED3.2/前-S2片段用XbaI和AvrII消化。所得片段用琼脂糖凝胶电泳提纯，并捆扎进已用MluI和AvrII消化的pLED3.2中。所得的构成物定名为pLED3.2/前-S2。

接在实施例7的各步骤之后，该全部长度的灰质-融合构成物的DNA序列使用一套应用生物系统370A DNA定序机测定。

接着，进行转录和转染各反应。由T7启动子产生的RNA转录本被转染进Vero细胞，以产生感染的脊髓灰质炎病毒。为进行这些试验，通过用PvuI消化此质粒制备近似5μg pLED3.2/前-S2，以产生RNA转录本。PvuI的消化生成两种片段，即含有T7启动子的较大片段，继而是含前-S2基因融合物的全长度的灰质基因组。用苯酚萃取该消化的反应物并用乙醇沉淀。将沉淀的DNA重新悬浮于20μl水中。使用T7RNA聚合酶在体外由PvuI消化的DNA中合成全段RNA转录本。转录产物通过琼脂糖凝胶电泳法进行分析。

将汇合的25cm²Vero细胞单层使用DEAE-转染规定由转录本转染。将近似25μg的RNA与DEAE-葡聚糖(0.5mg/ml)混合，然后覆盖到Vero细胞上。在室温下培养30分钟后，去除接种物并洗涤细胞。加入刚新修饰的Earle呋喃葡烯糖-5-半乳糖苷维持液，并在33.5℃培养细胞。培养该培养基直至观察到全部的细胞致病作用，并由该培养基中收获重组体脊髓灰质炎病毒。

含有由构成物pLED 3.2/前-S1产生的重组体脊髓灰质炎病毒的病毒原种通过在Vero细胞上的噬斑分析而被滴定。此外，由重组体病毒中萃取RNA，并使用GeneAmp热稳定的rTth逆转录酶RNAPCR药盒(Perkin-Elmer/Cetus)通过逆转录和PCR进行分析。结果证明，前-S2基因通过培养基中的通道稳定地保持在重组体pLED3.2/前-S2病毒中。

可用多种方法分析来自脊髓灰质炎病毒载体的前-S2抗原的表达。这些方法包括：免疫过氧化酶染色被感染细胞，病毒和外部蛋白质的免疫沉淀，Western印迹和点印迹。

对于前-S1和前S2，都使用免疫过氧化酶染色法检测被病毒感染的Vero细胞中的蛋白质。Vero细胞被用病毒感染并在各个感染后的时刻用乙醇或甲醇固定。该被固定的细胞单层作为许可的情况使用或是抗脊髓灰质炎病毒或是抗前-S1抗原或前-S2抗原的抗血清培养。洗涤平皿，然后用接合到HRP上的第二抗体(例如山羊的抗家兔免疫球蛋白G培养。再洗涤平皿，然后加入HRP培养基，3，3′-二氨基联苯胺四氢氯化物(Sigma，St.Louis，MO)。表达与抗体交叉反应的蛋白质的细胞被染色。

用重组体病毒感染Vero细胞单层。细胞的溶胞产物可通过对存在的病毒编码蛋白通过免疫沉淀或Western印迹法来测定。对于免疫沉淀法而言，细胞的溶胞产物用抗脊髓灰质炎病毒或抗外生蛋白质的抗血清培养。然后将蛋白质A琼脂糖(Sigma，St.Louis，MO)加入该混合物并进一步培养。离心处理琼脂糖珠粒，洗涤并用SDS离解缓冲液洗脱。沉淀的蛋白质可通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。对于Western印迹法，细胞的溶胞产物通过SDS-PAGE分离，转移到硝化纤维素中并用抗血清培养到感兴趣的蛋白质上。洗涤印迹，用接合到HRP上的第二抗体(例如山羊的抗家兔免疫球蛋白G)培养。再次洗涤印迹，然后加入HRP基质，4-氯-1-萘酚(Bio-Rad，Richmond，CA)加过氧化氢，以辨别交叉反应的蛋白质。实施例9构成携带轮状病毒VP7基因的重组体脊髓灰质炎病毒

命名为pLED3.2/VP7的表达克隆是这样构成的，其中编码为轮状病毒VP7抗原的基因插入脊髓灰质炎病毒的基因组中。该克隆含有VP7的全段基因，它在段长中近似为1千碱基。该克隆使用重叠扩展PCR和在脊髓灰质炎病毒开放读码(基743)起始处插入的基因而构成。用于第一周期PCR的引物是P和Q(表2)。模板DNA是含有全段轮状病毒VP7基因的质粒克隆。由这种放大得到的PCR产物在段长中有1012碱基对。第一周期反应的PCR循环条件不同于实施例6所述的标准条件，如下述：94℃2分钟，冰点2分钟，继而94℃1分钟，26℃1分钟，70℃2分钟，进行10次循环，94℃1分钟，45℃1分钟，70℃2分钟，进行20次循环。

第二周期的PCR反应如上述方式进行。第一周期PCR的片段与或是5′LED 3.2或是3′LED3.2混合，并且对于5′融合用引物C和D放大，或对于3′融合用P和F放大。所得的融合产物对于5′融合用MluI和BgII消化。或对于3′融合用Bg，III和AvrII消化。然后将这些消化产物亚克隆进pLED 3.2，以形成pLED3.2/VP7。

这一全段长的灰质融合构成物的DNA序列是使用一套应用生物系统(Foster City，CA)370A DNA定序机测定。

接着进行转录和转染反应。由T7启动子产生的RNA转录本被转染进Vero细胞产生感染的脊髓灰质炎病毒。对这些实验，通过用PvuI消化此质粒制备近似5μg的pLED3.2/VP7，用于生成RNA转录本。PvuI的消化导致两种片段，含有T7启动子的较大片段，继而是含VP7基因融合的全段长灰质基因组。该消化反应物用酚萃取并用乙醇沉淀。将沉淀的DNA重新悬浮于20μl水中。全段RNA转录本在体外使用T7RNA聚合酶(Moss，E.G.等人，J.Virol.，63：1884-1890(1989))。由PvuI消化的DNA合成。转录产物用琼脂糖凝胶电泳法分析。

汇合的25cm²Vero细胞单层使用DEAE-转录程序由转录本转染(Van der Werf，S.，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A..83：2330-2334(1936))。将近似为25μg的RNA与DEAE-葡聚糖(0.5mg/ml)混合，然后覆盖到Vero细胞上。室温培养30分钟后，去除接种物并洗涤细胞。加入新修饰的Earle呋喃葡烯糖-5-半乳糖苷维持液，并在33.5℃培养细胞。培养该培养物直至观察到全部的细胞致病作用，并由培养基中收获重组体脊髓灰质炎病毒。

含有从构成物pLED3.2/PV7产生的重组体脊髓灰质炎病毒的病毒原种通过在Vero细胞上的噬斑分析而被滴定。此外，由重组体病毒中萃取RNA，并使用GeneAmp热稳定的rTth逆转录酶RNAPCR药盒(Perkin-Elmer Cetus)通过逆转录和PCR进行分析。结果证明，该VP7基因通过培养基中的通道被稳定地保持在重组体pLED3.2 PV7病毒中。

可用多种方法分析来自脊髓灰质炎病毒载体的VP7的表达。作为标准步骤的这些方法包括：免疫过氧化酶染色被感染细胞，病毒和外部蛋白质的免疫沉淀，Western印迹和点印迹(Coligan，J.E.，等人，eds.，Current Protocols in Immunology，John Wiley andSons(1002))。

使用免疫过氧化酶染色测定法检测病毒感染的Vero细胞中的蛋白质。Vero细胞被病毒感染并在各次感染后的时刻用乙醇或甲醇固定。该被固定的细胞单层用抗脊髓灰质炎病毒的或抗VP7的抗血清培养。洗涤平皿，然后用接合到辣根过氧化酶(HRP)上的第二抗体(例如山羊的抗家兔免疫球蛋白G)培养。再次洗涤平皿，然后加入HRP培养基质，3，3′-二氨基联苯胺的四氢氯化物(Sigma，St.Louis，MO)。表达与抗体交叉反应的蛋白质的细胞被染色。

用重组体病毒感染Vero细胞单层。细胞的溶胞产物可通过对存在病毒编码的蛋白进行免疫沉淀或Western印迹法确定。对于免疫沉淀法而言，细胞的溶胞产物用抗脊髓灰质炎病毒或抗外生蛋白质的抗血清培养。然后将蛋白质A琼脂糖Sepharose(Sigma，St.Louis，MO)加入该混合物并进一步培养。离心处理该琼脂糖珠粒，洗涤并用SDS离解缓冲液洗脱。沉淀的蛋白质可通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。对于Western印迹法，细胞的溶胞产物通过SDS-PAGE分离，转移至硝化纤维素中并用抗血清培养到感兴趣蛋白质上。洗涤印迹，用接合到HRP上的第二抗体(例如山羊的抗家兔免疫球蛋白G)培养。再次洗涤印迹，然后加入HRP基质，4-氯-1-萘酚(Bio-Rad，Richmond，CA)加过氧化氢，以确认交叉反应的蛋白质。实施例10构成脊髓灰质炎病毒多聚接头的密码盒载体

外源基因也可通过构成与同性质于实施例1-5所述的两个脊髓灰质炎病毒克隆载体而插入脊髓灰质炎病毒病毒的基因组中，其中每个载体掺入到特征的限制性内切酶的克隆位点而每个位点又各自在脊髓灰质炎病毒基因组内的不同位置。这种多聚头密码盒载体的研究法提供了比实施例6的方法更简单的克隆步骤，尽管后者限制加入在原外源多肽中未发现的附加氨基酸。

第一载体(载体1)含有在读码中的多聚接头的密码盒，而此读码中在紧接碱基743处的起始密码子之后，具有脊髓灰质炎多蛋白的码。然后引入下列的限制性位点：NotI，HpaI和PacI。紧跟着这些的是编码灰质3C蛋白酶的识别位点的序列。然后通过添加或删去1-2个额外碱基，以保持遍及这个区域的正确的开放读码。

在构成这些载体的过程中使用重叠扩展PCR以引入限制性位点。为构成载体1，引物J和K(表2)被合成以在碱基743处引入多聚接头密码盒。第一周期的PCR反应使用pLED3.2作为模板DNA，对于5′区域使用引物C和J，而对于3′区域使用引物K和F。该放大的片段期望的大小对于5′和3′区域分别是512和551碱基对。这些片段直接由PCR反应使用以供采用引物C和F的第二周期PCR作为模板。所得的片段在段长中有1016碱基对，并含有多聚接头序列和在中部的片段中含有3C蛋白酶识别位点。将该片段提纯，用MluI和AvrII消化，并亚克隆进入已由同一限制性内切酶消化的pLED3.2中。

在病毒复制过程中，脊髓灰质炎病毒的多蛋白的蛋白水解处理以多级阶段的方式发生。起始的蛋白水解分裂由2A蛋白酶产生，导致生成定名为P1和P2-P3的蛋白质而其中的每个蛋白质又进一步被3C蛋白酶裂解则产生了各自的病毒蛋白质。在多蛋白的蛋白水解过程中，部份分裂产物已显示出具有来自最终分裂产物的独特机能(Harris，K.S.等人，Semin.Virol.，1：323-333(1990))。外源基因在编码机能前体的区域插入多蛋白将不会产生可存活的病毒。设计第二密码盒载体以便在P1和P2之间的接头处(基3377)处引入限制性位点。

被引入的限制性位点是NotI，HpaI和PacI。对于这些限制性位点，对这些限制性位点有一个2A蛋白酶识别位点5′；而对这些位点3C蛋白酶识别位点被引入3′。第一周期PCR反应使用pLED3.2作为模板DNA，对于5′区域用引物L和M，而对于3′区域用引物N和O(表2)。

对放大的片段的期望大小对于5′和3′分别是563和592碱基对(bp)。这些片段可被直接由该PCR反应使用于采用引物L和O的第二周期PCR作为模板所得的片段在段长中有1096bp，并且含有2A蛋白酶识别位点，多聚接头序列和中部的3C蛋白酶识别位点。然后用BstEII消化该片段并亚克隆进用同种酶消化的pLED3.2中。

密码盒载体，被用作对外源基因的表达载体。使用已存在的可相容的限制性位点，或通过经PCR添加这些限制性位点到基因的末端，将外源基因克隆进密码盒的载体。在后一情况中，外源基因通过PCR使用相应于该基因5′和3′末端的引物而放大。当这些引物被合成时，一个限制性位点被加到意义引物的5′末端。在标准PCR反应中放大该基因后，所得的PCR片段将具有由两个限制性位点侧接的基因。此载体和PCR片段均用两种限制性内切酶消化，然后捆扎在一起，生成感兴趣的表达克隆。

应当注明的是，可以这样设计引物，使得它们对应于感兴趣的外源基因的任何区域，使得部份基因能被掺入载体。从而用HpaI消化该载体产生钝头末端的片段。因而外源基因的钝头片段可以克隆进载体。实施例11构成携带B.百日咳的69KD外部膜蛋白的重组体脊髓灰质炎病毒

将实施例10的脊髓灰质炎病毒密码盒载体用于表达B.百日咳的69kD外部膜蛋白。将该成熟的蛋白在近似1.8kD的基因区域内编码。这一区域或开放读码的较短区域可通过PCR使用定序的特定引物被放大。设计该引物以使在意义引物的5′末端含有NotI位点，在反意义引物的5′末端含有PacI位点。还必须调整该引物，使得开放读码和脊髓灰质炎病毒的3C蛋白酶识别位点在码中。经PCR放大后，所得的片段通过琼脂糖凝胶电泳法或用Magic PCR药盒(Promega)提纯。用NotI和PacI清化，并捆扎进用同种酶限制的载体。所得质粒命名为pLED3.2/69kD。这一全长的灰质-融合构成物使用一套应用生物系统(Foster City，CA)370A DNA定序机检测。

接着进行转录和转染反应。由T7启动子产生的RNA转录本被转染进Vero细胞产生感染的脊髓灰质炎病毒。为进行这些实验，通过用PvuI消化此质粒制备近似5μg pLED3.2/69kD以产生RNA转录本。PvuI的消化生成两个片段，即合有T7启动子的较大片段，继而是含有69kD基因融合的全长度的灰质基因组。消化的反应物用酚萃取并用乙醇沉淀。将沉淀的DNA重新悬浮于20μl水中。全长度的RNA转录本在体外使用T7RNA聚合酶从PvuI消化的DNA中合成(Moss，E.G.等人，J.Virol.，63：1884-1890(1989))。转录产物由琼脂糖凝胶电泳法进行分析。

将汇合的25cm²细胞单层使用DEAE-转染程序用转录本转染(Van der Werf，S.，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，83：2330-2334(1986))。将近似为25μg的RNA与DEAE-葡聚糖(0.5mg/ml)混合，然后覆盖到Vero细胞上。室温培养30分钟后，去除接种物并洗涤细胞。加入新修饰的Earle呋喃葡烯糖-5-半乳糖苷维持液，并在33.5℃培养细胞，培养该培养基直至观察到全部的细胞致病作用，并由培养基中收获重组体脊髓灰质炎病毒。

含有从构成物pLED3.2/69kD中产生的重组体脊髓灰质炎病毒的病毒原种通过在Vero细胞上的噬斑分析而被滴定。此外，由重组体病毒中萃取RNA，并使用GeneAmp热稳定的rTth逆转录酶RNA PCR药盒(Perkin-Elmer/Cetus)通过逆转录和PCR进行分析。结果证明，该69kD基因通过培养基中的通道被稳定地保持在重组体pLED3.2/69kD的病毒中。

可用多种方法分析来自脊髓灰质炎病毒载体的69kD外部膜蛋白的表达。作为标准步骤的这些方法包括：免疫过氧化酶染色被感染细胞，病毒和外部蛋白的免疫沉淀，Western印迹和点印迹(Coligan，J.E.，等人，eds.，Current Protocols in Immunology，JohnWiley and Sons(1992))。

使用免疫过氧化酶染色测定法检测病毒感染的Vero细胞中的蛋白质。Vero细胞被病毒感染并在感染后的各个时刻用乙醇或甲醇固定。被固定的细胞单层用抗脊髓灰质炎病毒的或抗69kD外部膜蛋白的抗血清培养。洗涤平皿，然后用接合到辣根过氧化酶(HRP)上的第二抗体(例如山羊的抗家兔免疫球蛋白G)培养。再次洗涤平皿，然后加入HRP基质，3，3′-二氨基联苯胺的四氢氯化物(Sigma，St.Louis，MO)。表达与抗体交叉反应的蛋白质的细胞被染色。

用重组体病毒感染Vero细胞单层。细胞的溶胞产物可通过对存在有病毒编码的蛋白进行免疫沉淀或Western印迹法测定。对于免疫沉淀法而言，细胞的溶胞产物用抗脊髓灰质炎病毒或抗外生蛋白质的抗血清培养。然后将蛋白质A琼脂糖Sepharose(Sigma，St.Louis，MO)加入该混合物并进一步培养。离心处理该琼脂糖珠粒，洗涤并用SDS离解缓冲液洗脱。沉淀的蛋白质可通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。对于Western印迹法，细胞的溶胞产物通过SDS-PAGE分离，转移至硝化纤维素中并用对感兴趣蛋白质的抗血清培养。洗涤印迹.用接合到HRP上的第二抗体(例如山羊的抗家兔免疫球蛋白G)培养。再次洗涤印迹，然后加入HRP基质，4-氯-1-萘酚(Bio-Rad，Richmond，CA)加过氧化氢，以鉴别交叉反应的蛋白质。实施例12携带疱疹单糖蛋白D基因的重组体细胞的脊髓灰质炎病

毒的构成

采用实施例10中的脊髓灰质炎病毒基因盒载体表达疱疹单病毒的D糖蛋白。该蛋白质用一约为1.2kb的基因来编码。这一开放读码区或较短区域可通过带有序列特定引物的PCR放大。这些引物被设计成在意义引物的5′端上含有一NotI位点，在反意义引物的5′端上含有一PacI位点。这些引物也必须调整，以使该开放读码和脊髓灰质炎病毒3C蛋白酶识别部位落在编码以内。在通过PCR放大以后，产生的片段通过琼脂凝胶电泳或用Magic公司的PCR药盒(Promega)进行纯化。用NotI和PacI消化，并被捆扎入用相同的酶限制的载体。所产生的质粒被称为pLED3.2/gD。使用一种Applied Biosystems(Foster City，CA)370A DNA定序仪测定整个长度脊髓灰质炎病毒融合结构的DNA序列。

随后，进行转录和转染反应。由T7启动子产生的RNA转录子被转染入Vero细胞，以产生传染性的脊髓灰质炎病毒。为了进行这些实验，通过用PvuI消化质粒，制得约5μg pLED3.2/gD以产生RNA转录本。PvuI的消化产生两个片段，较大片段含有T7启动子，随后是含有gD基因融合物的整个长度的脊髓灰质炎病毒基因组。消化反应用苯酚萃取并用乙醇沉淀。将沉淀下来的DNA再悬浮于20μl水中。采用T7RNA聚合酶，可在试管中经PvuI消化处理的DNA中合成整个长度的RNA转录本(Moss，E.G.et al.，J.Virol.，63：1884-1890(1989))。通过琼脂凝胶电泳法分析转录产物。

使用DEAE转染程序将汇合的25cm²Vero细胞的单细胞层转染转录本(Van der Werf，S.，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，83：2330-2334(1986))。将约25μgRNA与DEAE葡聚糖(0.5mg/ml)混合，然后敷盖在Vero细胞上。在室温下培养30分钟后，移出接种物并清洗这些细胞。加入新配制的改性Earle′s醛糖内酯营养介质，并于33.5℃培养这些细胞。将该培养物培养直至能观察到全部细胞致病作用，并由培养介质中收获重组体脊髓灰质炎病毒。

通过在Vero细胞上的噬斑分析滴定含有由pLED3.2/gD结构产生的重组体脊髓灰质炎病毒的病毒原种。此外，由重组体病毒中萃取RNA并通过使用GeneAmp热稳定rTth逆转录酶RNA PCR药盒(Perkin-Elmer/Cetus)的逆转录和PCR分析。结果表明，gD基因稳定地保持在通过培养的重组体pLED 3.2/gD病毒中。

可采用多种方法以分析来自脊髓灰质炎病毒载体的gD的表达。这些标准操作步骤的方法包括感染细胞的免疫过氧化酶染色、病毒蛋白质和外源蛋白质免疫沉淀、Western印迹分析和点印迹分析(Coligan，J.E.，et al.，eds.，Current Protocols inImmunology，John Wiley and Sons(1992).)。

用一种免疫过氧化酶染色分析以检测病毒感染的Vero细胞中的蛋白质。使Vero细胞感染病毒并在感染后不同时刻用乙醇或甲醇固定。用对脊髓灰质炎病毒或gD的抗血清培养固定细胞的单细胞层。洗涤平皿，然后用接合Horse Radish Peroxidase(HRP)的一种副抗体(如山羊抗兔IgG)培养。再次洗涤平皿，然后加入一种HRP基质，3，3′-二氨基联苯胺四氢氯化物(Sigma，St.Louis，MO)。然后将表达与抗体交叉反应的蛋白质的细胞染色。

使Vero细胞的单细胞层感染重组体病毒。通过免疫沉淀或Westen印迹分析对细胞的溶胞产物检测病毒编码蛋白质的存在。对免疫沉淀，细胞的溶胞产物用脊髓灰质炎病毒或外源蛋白质的抗血清培养。而后向该混合物中加入蛋白质A琼脂糖(Sigma，St.Louis，MO)并进一步培养。该琼脂糖液滴经离心分离，洗涤并用SDS离解缓冲液洗脱。沉淀的蛋白质可通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析。对于Western印迹分析，细胞溶胞产物用SDS-PAGE分离后转移入硝化纤维素中并用有关蛋白质的抗血清培养。洗涤印迹，用结合HRP的一种副抗体(如山羊抗免IgG)培养。再次洗涤印迹，然后加入一种HRP基质，4-氯-1-萘酚(Bio-Rad，Richmond，CA)和过氧化氢，以确定交叉反应蛋白质。

仅采用常规的实验方法，现有技术的普通技术人员将会认识到，或能确定本文所述的特定具体实施方案的许多等效物。这些等效物被以下权利要求所包括。

Claims

1.一种制备有复制能力的重组体病毒的方法，该方法包括下述步骤：

a)提供一种能在其自然生活周期内产生一种多蛋白前体的病毒，该前体被蛋白水解处理；

b)将下述(1)和(2)引入(a)的病毒基因组中：

(1)一种编码一种所表达的多肽的外源核酸序列；

(2)一种编码一种蛋白酶的人工蛋白水解分裂位点的核酸序列，该蛋白酶水解处理由(a)所提供的病毒产生的一种蛋白质前体，

其中，(b)(1)和(b)(2)在一定位置上插入(a)的病毒基因组中，使得病毒复制所需的一种病毒序列不致破裂。

2.权利要求1的方法，其中(a)所提供的病毒选自细小核糖核酸病毒、Togaviruses和Flaviviruses。

3.权利要求2的方法，其中细小核糖核酸病毒是一种脊髓灰质炎病毒。

4.权利要求3的方法，其中在有复制能力的重组体脊髓灰质炎病毒中，(b)(1)的核酸序列编码一种多肽抗原，该抗原选自肝炎BS抗原、肝炎B pre-S1抗原、肝炎B pre-S2抗原、B.Pertussis69kD外膜蛋白质、疱疹单糖蛋白D和轮状病毒VP7抗原以及它们的结合体。

5.一种制备有复制能力的重组体病毒的方法，该方法包括下述步骤：

a)提供一种能在其自然生活周期内产生一种多肽前体的病毒，该前体被蛋白水解处理；

b)向(a)中的病毒基因组引入

(1)一种编码一种所表达的多肽的外源核酸序列；

(2)一种编码一种蛋白酶人工蛋白水解分裂位点的核酸序列，该蛋白酶蛋白水解处理(a)提供的病毒所产生的一种蛋白质前体，其中，(b)(1)的外源核酸序列和(b)(2)的编码人工蛋白水解分裂位点的核酸序列以下述次序存在于重组体基因组中：病毒基因组的5′未转译区-病毒的唯一起始密码子-(b)(1)的外源核酸序列-(b)(2)的编码一种人工蛋白水解分裂位点的核酸序列-病毒的第二密码子-病毒基因组的剩余部分。

6.权利要求5的方法，其中(a)中所提供的病毒选自细小核糖核酸病毒、Togaviruses和Flaviviruse。

7.权利要求6的方法，其中细小核糖核酸病毒是一种脊髓灰质炎病毒。

8.权利要求7的方法，其中，(b)(1)的核酸序列编码一种多肽抗原，该抗原选自肝炎BS抗原、肝炎B pre-S1抗原、肝炎B pre-S2抗原、B.Pertussis 69kD外膜蛋白质、疱疹单糖蛋白D和轮状病毒VP7抗原以及它们的结合体。

9.权利要求7的方法，其中编码一种人工蛋白水解分裂位点的核酸序列，编码一种脊髓灰质炎病毒3C蛋白酶的人工蛋白水解分裂位点或一种脊髓灰质炎病毒2A蛋白酶的人工蛋白水解分点。

10.权利要求9的方法，其中脊髓灰质炎病毒是一种萨宾脊髓灰质炎病毒或Mahoney脊髓灰质炎病毒。

11.一种制备有复制能力的重组体脊髓灰质炎病毒的方法，该方法包含下述步骤：

a)提供一种亲本脊髓灰质炎病毒；

b)向(a)的亲本脊髓灰质炎病毒基因组中引入

(1)一种编码一种所表达的多肽的外源核酸序列；以及

(2)一种编码一种蛋白酶人工蛋白水解分裂位点的核酸序列，该蛋白酶蛋白水解处理(a)提供的亲本脊髓灰质炎病毒所产生的一种多蛋白质前体，

其中，(b)(1)的外源核酸序列和(b)(2)的一种编码一种脊髓灰质炎病毒3C蛋白酶或脊髓灰质炎病毒2A蛋白酶的人工蛋白水解分裂位点的核酸序列以下述次序存在于重组体脊髓灰质炎病毒基因组中：亲本脊髓灰质炎病毒基因组的5′未转译区-唯一的脊髓灰质炎病毒起始密码子-(b)(1)的外源核酸序列-(b)(2)的编码人工蛋白水解分裂位点的核酸序列-亲本脊髓灰质炎病毒基因组的第二密码子-亲本脊髓灰质炎病毒基因组的剩余部分。

12.权利要求11的方法，其中，(b)(1)的核酸序列编码一种多肽抗原，该抗原选自肝炎BS抗原、肝炎B pre-S1抗原、肝炎B pre-S2抗原、B.Pertussis 68kD外膜蛋白质、疱疹单糖蛋白D和轮状病毒VP7抗原以及它们的结合体。

13.一种制备有复制能力的重组体脊髓灰质炎病毒的方法，该方法包含下述步骤：

a)提供一种亲本脊髓灰质炎病毒；

b)向(a)的亲本脊髓灰质炎病毒基因组中引入

(1)一种编码所表达的一种多肽的外源核酸序列；

(2)编码一种蛋白酶的人工蛋白水解分裂位点的核酸序列，该蛋白酶蛋白水解处理(a)中的亲本脊髓灰质炎病毒所产生的一种多蛋白前体，

其中，(b)(1)的外源核酸序列单元和(b)(2)的编码人工蛋白水解分裂位点的核酸序列位于该脊髓灰质炎病毒基因组范围内的一个位置，该位置选自1)VP1和2A之间的接头；2)2A和2B之间的接头；3)2C和3A之间的接头。

14.权利要求13的方法，其中，(b)(1)的核酸序列编码一种多肽抗原，该抗原选自肝炎BS抗原、肝炎B pre-S1抗原、肝炎B pre-S2抗原、B.Pertussis 69kD外膜蛋白质、疱疹单糖蛋白D和轮状病毒VP7抗原以及它们的结合体。

15.权利要求14的方法，其中，编码一种人工蛋白水解分裂位点的(b)(2)的核酸序列编码脊髓灰质炎病毒3C蛋白酶的人工蛋白水解分裂位点或脊髓灰质炎病毒2A蛋白酶的人工蛋白水解分裂位点。