JPH03502886A - 非核染色体形質転換 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （４８）キメラ・ヌクレオチド配列と適合し得るレプリカーゼ、ウィルス・コー ト蛋白質およびウィルス伝染性因子の暗号化配列を含ませるべく安定した形で形 質転換された、請求項３７記載の生産細胞。

（４９）ウィルス・ヌクレオチド配列との実質的配列相同性を有し、複製可能で 生物学的に封じ込められている第一ヌクレオチド配列、およびウィルス・プロモ ーターに隣接し、宿主において転写可能な暗号化配列である第二ヌクレオチド配 列を含むキメラ・ヌクレオチド配列を有する宿主。

（５０）ウィルス・ヌクレオチド配列が原核生物ウィルス・ヌクレオチド配列で ある、請求項４９記載の宿主。

（５１）ウィルス・ヌクレオチド配列が真核生物ウィルス・ヌクレオチド配列で ある、請求項４９記載の宿主。

（５２）ウィルス・ヌクレオチド配列が植物ウィルス・ヌクレオチド配列である 、請求項４９記載の宿主。

（５３）キメラ・ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡから成る 群から選ばれる、請求項４９記載の宿主。

（５４）ウィルス・ヌクレオチド配列が生物学的機能性ウィルス・コート蛋白質 暗号化配列を欠いている、請求項４９記載の宿主。

（５５）ウィルス・ヌクレオチド配列が、さらに生物学的機能性ウィルス伝染性 因子暗号化配列を欠いている、請求項５４記載の宿主。

（５６）ウィルス・プロモーターがウィルス・コート蛋白質プロモーターである 、請求項５４記載の宿主。

（５７）キメラ・ヌクレオチド配列の複製に有用なレプリカーゼの暗号化配列を 含ませるべく安定した形で形質転換された、請求項４９記載の宿主。

（５８）キメラ・ヌクレオチド配列の複製に有用なレプリカーゼの暗号化配列を 含ませるべく安定した形で形質転換された、請求項５４記載の宿主。

（５９）宿主における生成物の製造方法であって、（ａ）ウィルス・ヌクレオチ ド配列との実質的配列相同性を有し、複製可能で生物学的に封じ込められている 第一ヌクレオチド配列、およびウィルス・プロモーターに隣接し、宿主において 転写可能な生成物の暗号化配列である第二ヌクレオチド配列を含むキメラ・ヌク レオチド配列を含むウィルスにより宿主を感染させ、（ｂ）感染した宿主を生長 させることにより宿主に前記生成物を生産させることを含む方法。

（６０）トランスジェニック生産生物またはその一部における生成物の製造方法 であって、前記生物は、（１）ウィルス・レプリカーゼ、（ｉｉ）ウィルス・コ ート蛋白質、（山）ウィルス伝染性因子または（ｉｖ）これらの組み合わせに関 する１つまたはそれ以上の暗号化配列を含むものであり、（ａ）ウィルス・ヌク レオチド配列との実質的配列相同性を有し、複製可能で生物学的に封じ込められ ている第一ヌクレオチド配列、およびウィルス・プロモーターに隣接し、宿主に おいて転写可能な生成物の暗号化配列である第二ヌクレオチド配列を含むキメラ ・ヌクレオチド配列を含む感染性ウィルスにより前記生物の１個またはそれ以上 の細胞を感染させ、（ｂ）前記トランスジェニック生物を生長させることにより 、トランスジェニック生物に前記生成物を生産させることを含む方法。

（６１）ウィルス・ヌクレオチド配列が原核生物ウィルス・ヌクレオチド配列で ある、請求項５９または６０記載の方法。

（６２）ウィルス・ヌクレオチド配列が真核生物ウィルス・ヌクレオチド配列で ある、請求項５９または６０記載の方法。

（６３）ウィルス・ヌクレオチド配列が植物ウィルス・ヌクレオチド配列である 、請求項５９または６０記載の方法。

（６４）キメラ・ヌクレオチド配列が、Ｄ　Ｎ　Ａ％ＲＮ　ＡおよびｃＤＮＡか ら成る群から選ばれる、請求項５９または６０記載の方法。

（６５）ウィルス・ヌクレオチド配列が生物学的機能性ウィルス・コート蛋白質 暗号化配列を欠いている、請求項５９記載の方法。

（６６）ウィルス・ヌクレオチド配列が、さらに生物学的機能性ウィルス伝染性 因子暗号化配列を欠いている、請求項６５記載の方法。

（６７）ウィルス・ヌクレオチド配列が、さらに生物学的機能性ウィルス伝染性 因子暗号化配列を欠いている、請求項６０記載の方法。

（６８）ウィルス・プロモーターがウィルス・コート蛋白質プロモーターである 、請求項６０記載の方法。

（６９）生成物が、生体高分子、ホルモンおよび酵素から成る群から選ばれたも のである、請求項５９記載の方法により製造された生成物。

（７０）生体高分子が、メラニンおよびシクロデキストリンから成る群から選ば れたものである、請求項６９記載の生成物。

（７１）酵素が、チロシナーゼ、シクロデキストリン・グルコノトランスフェラ ーゼおよびヒト組織プラスミノゲン活性化因子から成る群から選ばれたものであ る、請求項６９記載の生成物。

（７２）ウィルス・プロモーターがウィルス・コート蛋白質プロモーターである 、請求項６６記載の方法。

（７３）宿主が、キメラ・ヌクレオチド配列の複製に有用なレプリカーゼの暗号 化配列を含ませるべく安定した形で形質転換された、請求項５９記載の方法。

（７４）生成物が、生体高分子、ホルモンおよび酵素から成る群から選ばれたも のである、請求項７３記載の方法により製造された生成物。

（７５）生体高分子が、メラニンおよびシクロデキストリンから成る群から選ば れたものである、請求項７４記載の生成物。

（７６）酵素が、チロシナーゼ、シクロデキストリン・グルコノトランスフェラ ーゼおよびヒト組織プラスミノゲン活性化因子から成る群から選ばれたものであ る、請求項７４記載の生成物。

（７７）感染性ウィルスのキメラ・ヌクレオチド配列に対する宿主であり、キメ ラ・ヌクレオチド配列と適合し得るウィルス・レブリカーゼの暗号化配列を含む 細胞を含む、トランスジェニック生物またはその一部分であって、前記ウィルス は、ウィルス・ヌクレオチド配列との実質的配列相同性を有し、複製可能で生物 学的に封じ込められている第一ヌクレオチド配列、およびウィルス・プロモータ ーに隣接し、トランスジェニック生物において転写可能な暗号化配列である第二 ヌクレオチド配列を含むキメラ・ヌクレオチド配列を含むものであり、キメラ・ ヌクレオチド配列によりコードされる１つまにはそれ以上の特性を発現し得るト ランスジェニック生物。

（７８）ウィルス・ヌクレオチド配列が原核生物ウィルス・ヌクレオチド配列で ある、請求項７７記載のトランスジェニック生物。

（７９）ウィルス・ヌクレオチド配列が真核生物ウィルス・ヌクレオチド配列で ある、請求項７７記載のトランスジェニック生物。

（８０）ウィルス・ヌクレオチド配列が植物ウィルス・ヌクレオチド配列である 、請求項７７記載のトランスジェニック生物。

（８１）キメラ・ヌクレオチド配列が、Ｄ　Ｎ　Ａ、　ＲＮ　Ａおよびｃ　Ｄ　 Ｎ　Ａから成る群から選ばれる、請求項７７記載のトランスジェニック生物。

（８２）ウィルス・ヌクレオチド配列が、さらに生物学的機能性ウィルス伝染性 因子暗号化配列を欠いている、請求項７７記載のトランスジェニック生物。

（８３）ウィルス・プロモーターがウィルス・コート蛋白質プロモーターである 、請求項７７記載のトランスジェニック生物。

明　　　　細　　　　書 発明の名称 非核染色体形質転換 発明の背景 この発明は、非感染性であるが（この明細書ではまた、「生物学的に封じ込めら れている（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　　ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）Ｊと称す）、自 己複製し、宿主の非核染色体形質転換能力があるウィルス・ベクターに関するも のである。これらのウィルス・ベクターは、ウィルス・プロモーターと隣接した 異種暗号化配列を含み得る。さらに、この発明は、伝染性のウィルス・ベクター を含むウィルスに関するものである。宿主をこの発明のウィルスにより感染させ る。この発明は、さらにウィルスまたはその一部分を生産し得る生産細胞を提供 する。

ウィルスは、それらの単純な組織および複製機構を明確な特徴とする独特の種類 の感染源である。事実、完全ウィルス粒子またはピリオンは、蛋白質コートによ り包囲され、また例えばアルファ・ウィルスの場合のように追加的膜エンベロー プにより包囲されている場合もある、主に自律的複製能力がある遺伝物質（Ｄ　 Ｎ　ＡまたはＲＮＡ）のブロックとみなされ得る。このコートはウィルスを環境 から保護し、ある宿主細胞から別の宿主細胞への伝染用ビヒクルとして働く。

細胞とは異なり、ウィルスは、コート内にそれらの複製に必要とされる生合成酵 素および他の機構を殆どまたは全く含まないため、一定の大きさで生長、次いで 分裂はしない。反対に、ウィルスは、それらの個別成分の合成、次いで組立によ り細胞中で増殖する。すなわち、ウィルス核酸は、そのコートから脱皮後、それ が特にウィルス再生に必要とされる蛋白質合成を行う適当な細胞機構と接触をも つ。次いで、ウィルス核酸は、それ自体ウィルスおよび細胞酵素の両方の使用に より複製される。ウィルス・コートの成分が形成され、核酸およびコート成分は 最後に組立られる。ウィルスによっては、複製がピリオンに存在する酵素により 開始される場合もある。

ウィルスは、さらに３つの主な種類、すなわち動物ウィルス、植物ウィルスおよ び細菌ウィルスに分類される。各種類の中で、各ウィルスはある種の細胞にのみ 感染し得る。動物および細菌ウィルスの場合、宿主範囲は、ピリオンのコートお よび細胞表面の特異的レセプターの両方の特性に依存する、細胞への結合特異性 により決定される。トランスフェクションが行なわれたとき、すなわち感染が裸 のウィルス核酸により行なわれたとき、その導入はウィルス特異的レセプターに 依存しなくなるため、これらの制限は無くなる。

与えられたウィルスはＤＮＡまたはＲＮＡを含み得、１本鎖または２本鎖のいず れかであり得る。ピリオンにおける核酸部分は、約１％〜約５０％の範囲で変化 する。１ピリオン当たりの遺伝情報量は、！１１本当たり約３〜３００ｋｂの範 囲で変化する。２本鎖ＤＮＡ含有ウィルスの例には、Ｂ型肝炎ウィルス、パボバ ウイルス類、例えばポリオーマおよびパピローマ、アデノウィルス、ポックスウ ィルス類、例えばワクシニア、カウリモウイルス類、例えばカリフラワー・モザ イクウィルス（ＣａＭＶ）、シュウトモナス・ファージＰＭＳ　２、ヘルペスウ ィルス、バシルス・スブチリン・ファージＳＰ８並びにＴバクテリオファージが あるが、これらに限定される訳ではない。１本鎖Ｄ　Ｎ　Ａである代表的ウィル スには、パルボウイルス並びにバクテリオファージφＸ１７４、ｆｌおよびＭ１ ３がある。

レオウィルス、蚕の細胞質多面体ウィルス、稲萎縮ウィルスおよび損傷腫ようウ ィルスは、２本鎖ＲＮＡウィルスの例である。１本鎖ＲＮＡウィルスには、タバ コ・モザイクウィルス（ＴＭｖ）、カブ黄斑モザイクウィルス（ＴＹＭＶ）、ピ コルナウィルス、ミクソウィルス、パラミクソウィルスおよびラブドウィルスが ある。１本鎖ＲＮＡウィルスにおけるＲＮＡは、プラス（＋）またはマイナス（ −）ｌのいずれかであり得る。ウィルスに関する総括的情報については、グリア ラン、Ｄ等、「プラント・モレキュラー・バイオロジー」、ブラッキー、ロンド ン、１２６−１４６頁（１９８４年）、ダルベツコ、Ｒ等、「パイロロジー」、 ハーバ−・アンド・ロー、フィラデルフィア（１９８０年）、ホワイト、Ａ等、 「ブリンンプルズ・オブ・バイオケミストリー」、第６版、マクグロウーヒル、 ニューヨーク、８８２−９００頁（１９７８年）参照。

植物ウィルスを分類する一手段として、ゲノム組織に基づく方法がある。多くの 植物ウィルスはＲＮ　Ａゲノムを有するが、遺伝情報の組織は群間で異なる。大 部分のモノパルタイ）・植物ＲＮＡウィルスのゲノムは、（±）一方向の１本鎖 分子である。このタイプのゲノムを有するウィルスには、少なくとも１１の主要 群が存在する。このタイプのウィルスの一例はＴＭＶである。植物ＲＮ　Ａウィ ルスの少なくとも６つの主要群はビパルタイトゲノムを有する。これらにおいて 、ゲノムは、普通、別個の粒子に包膜された２つの相異なる（±）一方向１本＠ ＲＮＡ分子で構成されている。両ＲＮＡは、感染力に必要とされる。ササゲ・モ ザイクウィルス（ＣＰ　ＭＷ）は、ビバルタイト植物ウィルスの一例である。少 なくとも６つの主要タイプの植物ウィルスを含む、第３の主要タイプは、３つの （＋）一方向」重鎖ＲＮＡ分子を有し、すなわちトリパルタイト性である。各鎖 は別々に包膜され、３つとも全て感染力に必要とされる。トリパルタイト植物ウ ィルスの一例は、アルファルファ・モザイクウィルス（ＡＭ　Ｖ　）である。多 くの植物ウィルスはまた、合成された結果、特異的遺伝子産物を増幅する、さら に小さいサブゲノム＋ｎＲＮＡを有する。１本鎖Ｄ　Ｎ　Ａゲノムを有する植物 ウィルスの一群は、ジェミニウイルス、例えばカッサバ潜伏ウィルスおよびとう もろこし条斑ウィルスである。

多くの種類の生物の形質転換に利用される技術がこれまでに開発されている。こ れらの技術により形質転換され得る宿主には、細菌、酵母、真菌、動物細胞およ び植物細胞または組織がある。形質転換は、自己複製し、所望の宿主と適合し得 るベクターを用いることにより達成される。ベクターは、一般にプラスミドまた はウィルスのいずれかに基づくものである。外来ＤＮＡをベクターに挿入し、次 いでこれを用いて適当な宿主を形質転換する。次に、選別またはスクリーニング により形質転換された宿主を同定する。これらの宿主の形質転換に関するさらに 詳しい情報については、マニアチス、Ｔ。

等、「モレキュラー・クローニング」、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ ラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−（１９８２年）、ｒＤＮＡ・クロー ニングロ、グローバー、Ｄ、Ｍ、編、ＴＲＬプレス、オックスフォード（１９８ ５年）、グリアラン、Ｄ等、前出、および「メソッズ・イン・エンザイモロジー Ｊ、６８．１００．１０１．１１８および１５２−１５５巻（１９７９，１９８ ３，１９８３，１９８６および１９８７年）参照。

適当な宿主の形質転換に有用であることが示されたウィルスには、バクテリオフ ァージ、動物ウィルス、例えばアデノウィルス２型およびワクシニアウィルス、 並びに植物ウィルス、例えばＣａＭＶおよびブロムモザイクウィルス（ＢＭＶ） がある。バクテリオファージ・ベクターの使用の一例は、アメリカ合衆国特許第 ４５０８８２６号に示されている。アメリカ合衆国特許第４５９３００２号は、 適当な宿主の形質転換におけるアデノウィルス２型およびバクテリオファージの 使用を示している。ワクシニアウィルスの使用は、アメリカ合衆国特許第４６０ ３１１２号に示されている。植物ウィルスを用いた植物の形質転換は、ＥＰ　Ａ 　６７５５３　（ＴＭＶ）、ＥＰ　Ａ１９４８０９（ＢＭＶ）およびブリッラン 、Ｎ３等、「メソッズ・イン・エンザイモロジー」、＋１８−１６５９（１９８ ６年）（ＣａＭＶ）に記載されている。

ウィルスがＤ　Ｎ　Ａウィルスである場合、ウィルス自体に対して構築が為され 得る。別法として、外来ＤＮＡを有する所望のウィルスベクターの構築を容易に するために、ウィルスをまず細菌プラスミドにクローン化し得る。次いで、ウィ ルスをプラスミドから取り出し得る。ウィルスがＤＮＡウィルスである場合、細 菌の複製開始点をウィルスＤＮＡに結合させることができ、次いで細菌により複 製させる。このＤＮＡの転写および翻訳により、ウィルスＤ　Ｎ　Ａを包膜する コート蛋白質が生成される。ウィルスがＲＮＡウィルスである場合、ウィルスを 一般にｃＤＮＡとしてクローン化し、プラスミドに挿入する。次いで、プラスミ ドを用いて構築の全部を行う。次に、プラスミドのウィルス配列を転写し、ウィ ルス遺伝子を翻訳してウィルスＤＮＡを包膜するコート蛋白質（複数もあり得る ）を生成することにより、ＲＮＡウィルスを製造する。

チロシナーゼは、チロシンを含むモノフェノール類のオルト水酸化および０−ジ フェノール類の０−キノン類への酸化を触媒する銅含有モノオキンゲナーゼであ る。メゾン、Ｈ，Ｓ、、「アニュアル・しかかる反応には、チロシンのジヒドロ キシフェニルアラニン（ドーパ）への変換およびドーパのドーパキノンへの変換 が含まれる。これらの反応の後、メラニンの自然形成が行なわれ得る。チロシナ ーゼは自然界に広く存在し、メラニン色素の形成に関与する。レルヘ、Ｋ１、メ ト・イオンズ・パイオル・シスト、１３．１４３（１９８１年）。

チロシナーゼは、は乳類供給源から特異的に見出されるフェノールオキシダーゼ である。他のフェノールオキシダーゼまたはポリフェノールオキシダーゼは、植 物または真菌供給源から見出され得る。

フェノールオキシダーゼは、フェノール化合物［例、３．４−ジヒドロキンフェ ニルアラニン（ドーノリ］の酸化を触媒してメラニンを生成させる［フィーラー 、Ｍ、Ｈ，等、「キャナディアン・ジャーナル・に定義されたフェノールオキシ ダーゼは、ボラチェック等により記載された［「ジャーナル・オブ・バクテリオ ロジー」、±５０．１２１２（１９８２年）］、クリプトコツカス・ネオホルマ ンス菌類に見出されるものである。別の明確に定義されたフェノールオキシダー ゼは、リッキ、Ｔ、Ｍ、等により記載された［「モレキュラー・アンド・ジェネ ラル・ジェネティックス」、１■±、７（１９８５年）］ドロソフィリア・フェ ノールオキシダーゼである。

シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼは、澱粉のシクロデキストリ ンへの変換を触媒する酵素である。シクロデキストリンは、甘味物質としての用 途、アラビアゴムの代用物としての用途並びに医薬、食物および化粧品における 他の用途を含む幾つかの用途を有する。

発明の要旨 この発明は、生物学的に封じ込められ、自己複製し、宿主の非核染色体形質転換 能力を有するウィルス・ベクターに関するものである。これらのウィルスベクタ ーは、ウィルス・プロモーターに隣接した異種暗号化配列を含み得る。さらに、 この発明は、伝染性、すなつち感染性ウィルス・ベクターを含むウィルスに関す るものである。

この発明はまた、ウィルスまたはその一部分を生産し得る生産細胞に関するもの である。この発明のウィルスにより宿主細胞を感染させる。感染宿主を生長させ ることによる所望の生成物の製造方法もまた、この発明の範囲内に含まれる。

発明の詳細な記載 この発明は、（ａ）非感染性であるが自己複製し、宿主の非核染色体形質転換能 力があるウィルス・ベクター、（ｂ）ウィルス・プロモーターに隣接した異種暗 号化配列を含むウィルス・ベクター、（ｃ）感染性ウィルス・ベクターを含むウ ィルス、（ｄ）ウィルスまたはその一部分を生産し得る生産細胞、（ｅ）この発 明のウィルスにより感染した宿主、および（ｆ）感染宿主を生長させることによ る所望の生成物の製造方法を包含する。

以下、請求の範囲を含む明細書を明確かつ徹底的に理解するために、語に与えら れた範囲を含め、定義を行う。

隣（近）接（した）　（ａｄ　ｊａｃｅｎｔ）・定義された配列に５゛または３ °が隣（近）接しているヌクレオチド配列における位置。

動物組織：生物体または培養における動物の組織。この語は、総体動物、動物細 胞、動物器官、プロトプラスト、細胞培養または構造的および機能的単位に組織 された動物細胞の群を全て包含するもに相補的なＲＮ　Ａ分子が細胞に存在する ことによる、ｍ　ＲＮ　Ａの蛋白質への翻訳速度制御に基づいた遺伝子調節のタ イプ。

生物学的に封じ込められている：ライしレス核酸は、生物学的ｉａ能性コート蛋 白質を発現することができないため、宿主に自然感染し機能を発揮する能力。例 えば、ウィルス・コート蛋白質の生物学的機能は、ウィルス核酸の包膜である。

非生物学的機能性コート蛋白質は、ウィルス核酸を包膜し得ない。生物学的機能 性蛋白質暗号化配列を欠くヌクレオチド配列は、蛋白質を生成しないか、または 予期される機能を発揮しない蛋白質を生成する。蛋白質の全暗号化配列を除いた 場合、蛋白質は生成されない。蛋白質の暗号化配列の重要な部分を除いた場合、 生成される蛋白質は、全蛋白質が機能するようには機能しない。例えば点突然変 異により蛋白質の暗号化配列を突然変異させた場合、この蛋白質は、正常蛋白質 が機能するようには機能し得ない。例えば、生物学的機能性コート蛋白質暗号化 配列を欠くヌクレオチド配列は、ウィルス核酸を包膜し得るコート蛋白質をコー ドしないヌクレオチド配列である。この語は、コート蛋白質配列の完全欠失を含 むものとする。

れたヌクレオチド配列。この配列は、Ｄ　Ｎ　ＡまたはＲＮＡを含み得る。

暗号化配列：転写および翻訳された結果、細胞ポリペプチドを形成させるデオキ シリボヌクレオチド配列、または翻訳された結果、細胞ポリペプチドを形成させ るリボヌクレオチド配列。

適合可能（し得る）ニジステムの他の成分と共に機能する能力。宿主と適合し得 るベクターは、その宿主において複製可能なベクターである。ウィルス・ヌクレ オチド配列と適合し得るコート蛋白質は、ウィルス配列を包膜し得る蛋白質であ る。

を含むウィルスにより感染され得る細胞、組織または生物体。この語は、原核生 物および真核生物の細胞、器官、組織または生物体、例えば細菌、酵母、真菌、 動物細胞および植物組織を包含するものイルス核酸が複製され、ウィルス蛋白質 が合成され、新しいウィルス粒子が組立られる。伝染性および感染性の語は、こ の明細書では互換的に使用される。この明細書で使用されている非感染性の語は 、自然的生物学的手段により非感染性であることを意味する。

植物細胞：原形質体および細胞壁から成る、植物の構造的および生理学的単位。

植物器官、植物の明確で視覚的に分化した部分、例えば根、茎、葉または胚芽。

植物組織：植物または培養における植物の組織。この語は、総体植物、植物細胞 、植物器官、原形質体、細胞培養または構造的および機能的単位に組織された植 物細胞群を全て包含するものとする。

生産細胞；ベクターまたはウィルス・ベクターの複製能力はあるが、ウィルスに とって必ずしも宿主ではない細胞、組織または生物体。この語は、原核生物およ び真核生物の細胞、器官、組織または生物体、例えば細菌、酵母、真菌、動物細 胞および植物組織を包含するものとする。

プロモーター：暗号化配列の転写開始に必要とされる、暗号化配列に隣接した５ ゛−側面に位置する、非暗号化配列。

原形質体　細胞培養まには総体植物への再生能力を有する、細胞壁が無い単離さ れた植物細胞。

実質的配列相同性：実質的に互いに機能均等であるヌクレオチド配列を示す。実 質的配列相同性を有する前記配列間のヌクレオチドの差異は、それらの配列によ りコードされる遺伝子産物またはＲＮＡの機能にささいな影響しか及ぼさない。

転写：ＤＮＡ配列の相補的コピーとしてＲＮ　ＡポリメラーゼによるＲ　Ｎ　Ａ 分子の生成。

るように修飾されたウィルスの核酸配列を含むベクター。これは、暗号化配列の 少なくとも一部を除去するか、または暗号化配列を突然変異させることにより達 成され得る。ウィルスが１種を越えるウィルス伝染性因子をコードする場合、ウ ィルスの核酸配列はまた、修飾の結果、非生物学的機能性となる。

ウィルス：蛋白質に包膜された核酸で構成される感染源。ウィルスは、前述のモ ノ−、ジー、トリーまｆ二はマルチ−深裂ウィルスであり得る。

この発明では、ウィルスは伝染性であるが、ウィルス核酸は感染性ではないよう に修飾されたウィルスにより、宿主、例えば原核生物体または真核生物体、細胞 または組織を感染させる。天然突然変異ウィルスはまた、伝染性ではあるが、非 感染性のウィルス核酸を有するというこれらの同じ特性を有する。ウィルス核酸 の非感染性は、前述の通り、生物学的非機能性ウィルス・コート蛋白質（カプシ ド蛋白質）および他のウィルス伝染性因子があればそれらを生成させるべく核酸 を修飾することにより達成される。

この発明は幾つかの利点を有しており、そのうちの一つは、標的生物体の形質転 換および再生が必要ではないことである。別の利点は、標的生物体のゲノムに所 望の暗号化配列を組み込ませるベクターを開発する必要が無いことである。現存 の生物体は、生殖細胞を操作する必要も無く、新しい暗号化配列により改編され 得る。またこの発明は、所望の生物体、組織、器官または細胞に暗号化配列を適 用するという選択の自由を与える。

この発明のキメラ遺伝子およびベクターは、当業界でよく知られている技術を用 いて構築される。適当な技術は、マニアチス、Ｔ。

等、「モレキュラー・クローニング」、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ ラトリ−、ニューヨーク（１９８２年）、「メソツズ・イン・エンザイモロジー 」、６８．１００．１０１，１１８お上び１５２−１５５巻、アカデミツク・プ レス、ニューヨーク（＋９７９．１９８３．１９８３．１９８６および１９８７ 年）、並びにｒＤＮＡクローニング」、■、■、■巻、グローバー、Ｄ、Ｍ、編 、ＩＲＬプレス、オックスフォード（１９８５および１９８７年）に記載されて いる。培地組成物は、ミラー、Ｊ　、Ｈ，、「エクスベリメンツ・イン・モレキ ュラー・ジェネティックスＪ１　コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ −、ニューヨーク（１９７２年）並びに先に確認した参考文献に記載されている 。ＤＮＡ操作および酵素処理は、製造会社の勧める手順に従い行なわれる。

この発明の重要な特徴は、適合し得る宿主における複製能力はあるが、それら自 体で宿主を感染させることはできないヌクレオチド配列の製造である。ヌクレオ チド配列は、ウィルス・ヌクレオチド配列との実質的配列相同性を有する。ウィ ルス・ヌクレオチド配列は、原核生物または真核生物ウィルス・ヌクレオチド配 列であり得る。適当なウィルス・ヌクレオチド配列には、細菌、酵母、真菌、動 物および植物を感染させるウィルスの配列が含まれる。適当なウィルスの部分的 列挙については前述している。ヌクレオチド配列は、ＲＮ　Ａ　、　Ｄ　Ｎ　Ａ 　Ｓｅ　Ｄ　Ｎ　Ａまたは化学合成ＲＮ　ＡもしくはＤＮＡであり得る。

この発明の特徴のいずれかを達成する第一段階は、修飾ウィルスにより非生物学 的機能性蛋白質を生成させるべく、公知慣用技術によりウィルス・ヌクレオチド 配列内でカプシド蛋白質および伝染性因子をコードするヌクレオチド配列を修飾 することである。従って、カプシド蛋白質ヌクレオチド配列および伝染性因子ヌ クレオチド配列が同定されるウィルスは、この発明における使用に適当であり得 る。核酸の配列決定後に、他のウィルスも使用され得る。

この必要条件を満たす、従って適当なウィルスの中には、アルファウィルス、例 えば東部ウマ脳炎ウィルス（Ｅ　Ｅ　Ｅ　Ｖ　）、西部ウマ脳炎ウィルス（ＷＥ ＥＶ）、ベネズエラ・ウマ脳炎ウィルス（Ｖ　Ｅ　Ｖ　）、シンドビスウイルス 、セムリキ森林熱ウィルス（ＳＦＶ）およびロスリバー・ウィルス（ＲＲＶ）、 リノウイルス、例えばヒト・リノウイルス２（ＲＲＶ２）およびヒト・ソノウィ ルス８９型（ＲＲＶ８９）、ポリオウィルス、例えばポリオウィルス２（ＰＶ２ ）およびポリオウィルス３（ＰＶ３）、サルウィルス４０（ＳＶ４０）、タバコ ・モザイクウィルス群由来のウィルス、例えばタバコ・モザイクウィルス（ＴＭ Ｖ）、ササゲ・モザイクウィルス（ＣＭ　Ｖ　）、アルファルファ・モザイクウ ィルス（Ａｎ＋Ｖ）、キュウリ緑斑モザイクウィルス・スイカ株（ＣＧ　Ｍ　Ｍ 　Ｖ　−Ｗ　）およびカラス麦モザイクウィルス（ＯＭＶ）およびブロム・モザ イクウィルス群由来のウィルス、例えばブロム・モザイクウィルス（ＢＭ■）、 ソラマメ・モットルウイルスおよびササゲ退緑モットルウイルスが含まれる。追 加として適当なウィルスには、稲えそウィルス（ＲＮＶ）、アデノウィルス２型 およびジェミニウイルス、例えばトマト・ゴールテン・モザイクウィルス（ＴＧ Ｍ■）、カッサバ潜伏ウィルスおよびとうもろこし条斑ウィルスがある。これら の群の適当なウィルスの各々に関する特徴を下記に示す。

アルファウィルス アルファウィルスは、トガビリデ科のウィルス属である。この属の構成員の殆ど 全ては蚊により伝染し、ヒトまたは動物の病気の原因となり得る。アルファウィ ルスの幾つかは、３つの血清学的に定義された複合体に群別される。複合体特異 抗原はウィルスのＥ１蛋白質と会合し、種特異抗原はウィルスのＥ２蛋白質と会 合する。

セムリキ森林熱ウィルス複合体には、ベバルウイルス、チクングニャ出血熱ウィ ルス、ゲタウィルス、マヤロ熱ウィルス、オニオニオン熱ウィルス、ロスリバー ・ウィルス、サギャマ・ウィルス、セムリキ森林熱ウィルスおよびウナウイルス が含まれる。ベネズエラ・ウマ脳炎ウィルス複合体には、カバッソウ・ウィルス 、エバーグレーズ・ウィルス、ムカンボウイルス、ピクスナ・ウィルスおよびベ ネズエラ・ウマ脳炎ウィルスが含まれる。西部ウマ脳炎ウィルス複合体には、ア ウラウイルス、フォート・モーガン・ウィルス、ハイランズＪウィルス、キジラ ガハ・ウィルス、シンドビス・ウィルス、西部ウマ脳炎ウィルスおよびワタロア ウィルスが含まれる。

アルファウィルスは、約１１７０３以下のヌクレオチドのプラス鎖４２５〜４９ ８ｍＲＮＡと複合した単一種類のカプシド蛋白質１８０コピーから成る正二十面 体のヌクレオカプシドを含む。組立前のヌクレオカプシドが、ＥｌおよびＣ２と 呼ばれる２種のウィルスコード化完全膜糖蛋白質を含む脂質エンベロープにより 包囲されたとき、アルファウィルスは完成する。細胞質で組み立てられたカプシ ドが原形質膜を通って発達すると、エンベロープが得られる。このエンベロープ は、宿主細胞から誘導された脂質２層で構成される。

４２５〜４９８ｍＲＮＡは、非構造蛋白質および構造蛋白質へ同時翻訳的に開裂 される糖蛋白質をコードする。ＲＮＡゲノムの３゜３分の１は、カプシド蛋白質 並びにＣ３、Ｃ２、Ｋ６およびＥｌ糖蛋白質をコードする２６５ｍＲＮＡにより 構成される。カプシド蛋白質は同時翻訳的にＣ３蛋白質から開裂される。カプシ ド蛋白質のＣ０ＯＨ末端における）Ｔｉｓ、　ＡｓｐおよびＳｅｒのアミノ酸３ つ組は、開裂に関与するセリン・プロテアーゼを含むという仮説が設けられてい る。バーン、Ｃ，Ｓ、等、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカ デミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニーニスエイ」、１１．４６４８頁 （１９８５年）。同時翻訳的開裂はまた、Ｃ２およびに６蛋白質間でも行なわれ る。すなわち、２種の蛋白質、開裂前にＣ３およびＣ２で構成されるＰＥ２並び にに６およびＥｌを含むＥｌ蛋白質が形成される。これらの蛋白質は、宿主細胞 の小胞体に同時翻訳的に挿入され、グリコジル化され、ゴルジ装置によりそれら が発芽に使用され得る原形質膜へ輸送される。ピリオン成熟の時点で、Ｃ３およ びＥ２蛋白質は分離する。ＥｌおよびＥ２蛋白質は、脂質エンベロープに取り込 まれる。

カプシド蛋白質の塩基性アミノ末端の半分は、ゲノムＲＮＡとカプシドの相互作 用を安定化させるか（ガロフ、Ｈｏ等、前出）、またはゲノムＲＮＡとの相互作 用により包膜を開始させること［ストラウスＥ、Ｇ、等、「トガバイランーズ・ アンド・フレイビバイラシーズ」、Ｓ　シュレジンガーおよびＭ、シュレジンガ ー編、プレナム・プレス、ニューヨーク、３５−９０頁（１９８０年）］が示唆 された。

これらの示唆は、組立開始点が、非包膜ゲノムＲＮＡまたはカプシド蛋白質のア ミノ末端に位置することを示す。Ｒ３およびに６は、各々ＰＥ２およびＥｌの小 胞体への挿入用シグナル配列として機能することが示された。ガロフ、Ｒ９等、 前出、デルガルノ、Ｌｌ等、「パイロロジー」、１２０−１１７０（１９８３年 ）。

アルファウィルスの温度感受性突然変異体による試験は、構造蛋白質の開裂が失 敗すると、成熟ピリオンの形成も失敗に終わることを示した。リンドキスト、Ｂ 、Ｈ，等、「パイロロジー」、凪、１０頁（１９８６年）は、ンンドビスウイル スの温度感受性突然変異体ｔｓ２０の特性検定を行った。温度感受性は、ヌクレ オチド９５０２におけるＡ−Ｕ変化により生じる。ｔ、損傷は、非許容温度でＰ Ｅ２のＲ２およびＲ３への開裂および子孫ピリオンの最終的成熟をもたらす。バ ーン、Ｃ，Ｓ、等（前出）は、非許容温度で前駆体ポリ蛋白質の開裂を妨げる、 カプシド蛋白質における３種の温度感受性突然変異を報告した。開裂が不首尾に 終わると、カブンド形成は行なわれず、エンベロープ蛋白質もごく僅かとなる。

シンドビスウイルスの欠損干渉ＲＮＡ（ＤＩ粒子）は、同族標準ウィルスの複製 を特異的に干渉するヘルパー依存性欠失突然変異体で来遺伝子を挿入する機能性 ベクターであることが見出された。リーバイス、Ｒ９、「プロシーディンゲス・ オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー・ ニス・エイ」、盈↓、４８１１頁（１９８７年）。

ＤＩゲノムの少なくとも１６８９個の内部ヌクレオチドを外来配列と置き換え、 複製および包膜されるＲ　Ｎ　Ａを得ることは可能であることが見出された。Ｄ Ｉゲノムの欠失は、生物学的活性を破壊しない。このシステムの不利点は、ＤＩ 粒子が見かけ上無作為な内部ＲＮ　Ａ配列のランダム転位およびサイズ変更を行 うことである。モンロー、Ｓ、Ｓ、等、「ジャーナル・オブ・パイロロジーｊ、 ４９．８６５頁（１９８４年）。内部配列に挿入された遺伝子の発現は、予想　 　−されるほど高くはない。リーバイス、Ｒ１等（前出）は、挿入遺伝子の複製 は優れているが、翻訳は低レベルであることを見出した。これは、翻訳部位に関 する総体ウィルス粒子との競争の結果であり、モして／または幾つかの継代を通 じた転位による遺伝子の分裂の結果であり得る。

アルファウィルス感染細胞には２種類のｍＲＮＡが存在する。すなわち、天然ピ リオンにパッケージされ、非構造蛋白質に関するメツセージとして機能する４２ ５ｍＲＮＡ領域、および構造ポリペプチドをコードする２６５ｍＲＮＡである。

２６５ｍＲＮＡは、４２５ｍＲＮＡの３゛末端３基と相同性である。それは１３ ０にポリ蛋白質に翻訳され、そして同時翻訳的に開裂され、カプシド蛋白質並び にグリコジル化膜蛋白質、ＥｌおよびＲ２にプロセッシングされる。

チャンク等は、東部ウマ脳炎（ＥＥＥ）株８２Ｖ−２１３７ノ２６Ｓ　　ｍＲＮ Ａをクローン化および分析し九［「ジャーナル・オブ・ジェネラル・パイロロジ ー」、ｉ盈、２１２９頁（１９８７年）］。２２６ｍＲＮＡ領域は、カプシド蛋 白質、Ｒ３、Ｒ２，６におよびＥｌをコードする。カプシド蛋白質のアミノ末端 は、カプシドとｍＲＮＡの相互作用を安定化させるか、またはゲノムＲＮＡと相 互作用して包膜を開始させると考えられる。

ＰＥ２と称する非開裂Ｅ３およびＲ２蛋白質は、蛋白質合成中に宿主小胞体に挿 入される。ＰＥ２は、形態形成中ウィルス・ヌクレオカプシドと相互作用する少 なくとも５種のアルファウィルスとの共通領域を有すると考えられる。

６に蛋白質は、膜を通したＥｌ蛋白質の輸送に関与するシグナル配列として機能 すると考えられる。Ｅｌ蛋白質は、ウィルス融合およびＥｌ蛋白質のウィルス・ エンベロープへの固定を仲介すると考ライノウィルスは、ピコルナビリデ科のウ ィルス属である。ライノウィルスは酸に不安定であるため、約６未満のｐＨて急 速に不活化される。ライノウィルスは、一般には乳類の上部呼吸系に感染する。

ヒト・ライノウィルスは風邪の主要病原体であり、多くの血清型ろ（知られてい る。ライ、・′ウィルスは様々なヒト細胞培養において生長し得、約３３℃の最 適生長ｌＡ変を有する。ライノウィルスの大部分の株は、室温またはそれ以下の 温度で安定し、ており、凍結ｈｌ　ｊｊＪえ得る。ライノウィルスは、くえん酸 、ヨ・−ドチンキまたはフェノール、／アルコール混合物により不活化され得る 。

ヒト・ライノウィルス２（ＨＲＶ２）の完全ヌクレオチド配列の配列決定が為さ れた。ゲノムは、５′末端から６１１ヌクレオチドの位置で始まり、ポリ（Ａ） 域から４２ヌクレオチドの位置で終わる６４５０ヌクレオヂドの長いオーブン・ リーディング・７１ノームを有する７１０２ヌクレオチドにより構成される。３ 種のカプシド蛋白質およびそれらの開裂部位は既に同定されている。

ライノウィルスＲＮＡは１本鎖および正方向である。ＲＮ　Ａはキャップされて いないが、５′末端で、ピリオン−蛋白質ゲノム結合した（ｖｐｇ）小ウィルス コード化蛋白質に連結されている。翻訳の結果、蛋白質加水分解的開裂で破壊さ れることにより個々のウィルス蛋白質を生成する単一ポリ蛋白質が得られると思 われる。

正二十面体ウィルス・カプシドは、４種のウィルス蛋白質ＶＰ　１゜ＶＦ６、Ｖ 　Ｐ　３およびＶＦ６の各々６０コピーを含み、ＲＮＡゲノムを包囲する。メダ ッパ、Ｋ　０４等、「パイロロジー」、±」い２５９頁（１９７］年）。

長いオーブン・リーディング・フレームに先行する６１０ヌクレオチドの分析は 、幾つかの短いオーブン・リーディング・フレームを示す。しかしながら、ＨＲ Ｖ２、ＨＲＶｌ　４および３種の血清型のポリオウィルス全部において２つの配 列しか相同性を示さないため、翻訳された蛋白質に機能を割り当てることはでき ない。これら２一つの配列は、ウィルスの生活周期において重大であり得る。そ れらは、ＨＲＶ２における４３６から始まる１６塩基の範囲、およびＨＲＶ２に おける５３１から始まる２３塩基の範囲である。非構造蛋白質における残りの配 列からこれらの配列を切断または除去すると、成熟ピリオンを組立てる努力に対 する予測し得ない効果が生じ得る。

ＨＲＶ２のカプシド蛋白質：　ＶＦ６、ＶＦ６、ＶＦ６およびｖｐｌは、各々ヌ クレオチド６１１．８１８．１６０１および２３１１から始まる。ＶＰＩおよび Ｐ２Ａ間の開裂点は、ヌクレオチド３２５５付近であると考えられる。スカーノ 、Ｔ３等、「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ」、」じし２１１１頁（１９８ ５年）。

ヒト・ライノウィルス８９型（ＨＲＶ８９）は、ＨＲＶ２と非常に類似している 。それは、２１６４コドンから成る単一の大オープン・リーディング・フレーム を有する７１５２ヌクレオチドのゲノムを含む。翻訳は、ヌクレオチド６１９で 始まり、ポリ（Ａ）域前の４２ヌクレオチドで終わる。カブンド構造蛋白質、Ｖ Ｆ６、ＶＦ６、Ｖ　Ｐ　３およびＶＰｉは剋初に翻訳される。ＶＦ６の翻訳は６ １９より始まる。開裂部位は、 ＶＰ４／ＶＰ２　　８２５　　　　測定された〜’Ｐ２／ＶＰ３　　　ｌ６２７ 　　　測定されたｖＰ３／ＶＰＩ　　　２３４０　　　測定サレタＶ　Ｐ　１　 ／　Ｐ　２−　Ａ　　３２３５　　　推定的に存する。デュエヘラー、Ｍｌ等、 「ブロン−ディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシ ーズ・オブ・ザ・ユボリオウイルスはヒトにおける小児麻ひの病原体であり、３ 群の腸内ウィルスのうちの１群である。腸内ウィルスは、ピコルナビリデ科（こ れもライフウィルス科）の−属である。殆どの腸内ウィルスは、主と１．ては乳 類胃腸管において複製するが、他の組織も続いて感染され得る。多くの胎内ウィ ルスは、ヒトまたはサル腎細胞の一次培養および幾つかのセルライン（例、ヒー ラ、ベロ、Ｗｌ−３８）において伸長１．得る。腸内ウィルスの不活化は、加熱 （約５０℃）、ホルムアルデヒド（３％）、塩酸（０，ＩＮ）または塩素（約０ ．３−０゜５　ｐｐｍ遊靜残留Ｃｌ２）により達成され得る。

ポリオウィルスＰＶ２（Ｓａｂ）およびＰＶ３（Ｓａｂ）の完全ヌクレオチド１ 列が測定された。それみは、各々長さ７４３９および７４３４ヌクレオチドであ る。５°末端から７００を越えるヌクレオチドが伸びている一本の長いオープン ・リーディング・フレームが存在する。ポリオウィルス翻訳により、加水分解的 プロセッシングにより開裂される単一のポリ蛋白質が生成される。比相、Ｎ１等 、「ネイチャー」、ｌ１工、５４７頁（１９８１年）。

非翻訳領域におけるこれらの相同配列は、ウィルス複製における本質的役割、例 えば、 １、ウィルス特異的ＲＮＡ合成、 ２、ウィルス特異的蛋白質合成、および３、パッケージング を果たすと推測される。豊田、Ｈｌ等、「ジャーナル・才ブ・モレキュラー・バ イオロジー」、±Ｌ↓、５６１頁（１９８４年）。

ポリオウィルスの血清型の構造は、高度の配列相同性を有する。

それらの暗号化配列は、同じ順序で同じ蛋白質をコードする。従って、構造蛋白 質の遺伝子も同様に位置している。ＰＶＩ、ＰＶ２およびＰＶ３において、ポリ 蛋白質は、７５０ヌクレオチド付近で翻訳を開始する。４種の構造蛋白質ＶＰ４ 、ＶＦ６、ＶＦ６およびＶＰｌは、各々約７４５．９６０．１７９０および２４ ９５において始まり、ＶＰＩは約３４１０で終わる。それらは、停止／開始コド ンによるのではなく、蛋白質加水分解的開裂によりインビボ分離する。

サルウィルス４０ サルウィルス４０（ＳＶ４０）はポリオーマウィルス属のウィルスであり、最初 アカゲザルの腎細胞から単離された。このウィルスはそれらの細胞において一般 に潜伏形態で見出される。サルウィルス４０は、通常その天然宿主においては非 病原性である。

サルウィルス４０ピリオンは、３種の構造蛋白質ＶＰＩ、ＶＰ２およびＶＦ６の 組立により構築される。ジラード、Ｍｌ等、「バイオケミカル・アンド・バイオ フィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ」、ｕｌ　９７頁（１９７０年） 、プライブス、Ｃ，Ｌ、等、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・ア カデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・エイＪ、７１，３０ ２頁（１９７４年）、およびローゼンブラット、Ｓ６等、「プロシーディンゲス ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー ・ニス・エイ」、Ｌｌ、２７４７頁（１９７６年）。３つの対応するウィルス遺 伝子は、部分的重複方法により組織される。

それらは、ゲノムの後期遺伝子部分を構成する。シーズ、Ｊｌ、「モレキュラー ・バイオロジー・オブ・チューマー・バイラシーズ」、第２編、２部、７９９− ８３１頁（１９８０年）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コ ールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク。カプシド蛋白質ＶＰ２およびＶ Ｆ６は、各々ヌクレオチド５４５〜１６０１および８９９〜１６０１によりコー ドされ、両方共同じフレームで読み取られる。従って、ＶＦ６はＶＦ６のサブセ ットである。カプシド蛋白質ＶＰＩは、ヌクレオチド１４８８−２５７４により コードされる。従って、ＶＦ６−ＶＰ３オープン・リーディング・フレームの最 後は、１１３ヌクレオチドによるＶＰｌと重複するが、別のフレームにおいて読 み取られる。シーズ、Ｊ３、前出、サイコブスキー、Ｃ４等、「ジャーナル・オ ブ・パイロタバコモザイクウィルス群 タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）は、トバモウイルスの模式構成員である。Ｔ ＭＶピリオンは管状フィラメントであり、螺旋の回転間に挿入された１本鎖ＲＮ Ａを有する単一右回り螺旋に並んだコート蛋白質サブユニットを含む。ＴＭＶは タバコおよび他の植物に感染する。ＴＭＶは機械的に伝染し、土壌または乾燥葉 組織において１年またはそれ以上の間感染力を保ち得る。

ＴＭＶピリオンは、ＰＨが′３未満または８より大きい環境に置くか、またはホ ルムアルデヒドもしくはヨウ素により不活化され得る。

ＴＭＶの調製物は、（Ｎ　Ｈ４）　ｔ　Ｓ　Ｏ４沈澱、次いで分画遠心分離によ り植物組織から入手され得る。

Ｔ　Ｍ　Ｖ　Ｉ重鎖ＲＮ　Ａゲノムは長さ約６４００のヌクレオチドであり、５ ′末端はキャップされているがポリ−アデニル化はされていない。ゲノムＲＮＡ は、分子量約１３００００（１３０Ｋ）の蛋白質および分子量約１８００００（ １８０Ｋ）のリード・スルーにより生成され乙別の蛋白質のｍＲＮＡとして機能 し得る。しかしながら、それはコート蛋白質の合成用メツセンジャーとしては機 能し得ない。

他の遺伝子は、モノシストロンの３゛−共末端（ｃｏｔｅｒｍｉｎａｌ）サブゲ ノムｍ　ＲＮ　Ａの形成により感染中に発現され、一つとして１．７．５にコー ト蛋白質をコードするもの（ＬＭＣ）およびもう一つとして３０に蛋白質をコー ドするもの（■、）が含まれる。３０に蛋白質は感染した原形質体において検出 され（「パイロロジー」、±１１．７１頁（１９８４年））、感染植物における ウィルスの細胞から細胞への輸送に関与する（デオム、Ｃ，Ｍ、等、「サイエン ス」、２３Ｌ　３８９頁（１９８７年））。２種の大きな蛋白質の機能は未知で ある。

ＴＭＶに感染した植物組織において、ゲノムに対応する２本鎖ＲＮＡ、■、およ びＬＭＣＲＮＡを含む、幾つかの２本鎖ＲＮＡ分子が検出された。恐らくこれら のＲＮ　Ａ分子は、ゲノム複製および／またはｍＲＮＡ合成−異なる機構により 行なわれると思われるプロセスにおける中間体であると考えられる。

ＴＭＶ組立は見たところ植物細胞の細胞質で行なわれるが、ｃｔＤＮＡの写しが 精製ＴＭＶピリオンで検出されたため、ＴＭＶ組立の中には葉緑体で行なわれ得 るものもあることが示された。ＴＭＶ組立の開始は、コート蛋白質の環状アグリ ゲート（「ディスク」）（各ディスクは１７サブユニツトの２層から成る）と、 ＲＮＡにおける特有の内部核形成部位、すなわち一般株のＴＭＶにおいて３°末 端から約９００ヌクレオチドのヘアピン領域との間の相互作用により行なわれる 。この部位を有するサブゲノムＲＮＡを含めたＲＮＡは全て、ピリオンにパッケ ージされ得る。ディスクは、ＲＮＡとの相互作用時に見かけ上螺旋形態をとり、 次に組立（伸長）は両方向に進行する（ただし、核形成部位から３°−５°方向 の方がかなり速く伸びる）。

トバモウイルスの別の一員、キュウリ緑斑モザイクウィルス・スイカ株（ＣＧ　 Ｍ　Ｍ　Ｖ　−Ｗ　）は、キュウリウィルスと関連性を示す。ノル、Ｙｏ等、「 パイロロジー」、±５，５７７頁（１９７１年）。ＣＧＭＭＶ−Ｗのコート蛋白 質は、ＴＭＶおよびＣＧＭＭＶの両方のＲＮＡと相互作用することにより、ウィ ルス粒子をインビトロで組み立てる。グリス等、「パイロロジー」、Ｌ且、２１ ４頁（１９７６）。

トバモウイルス群の幾つかの株は、最初の組立の位置に基づいて２つのサブグル ープに分けられる。福田、Ｍ９等、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナ ル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニーニスエイ」、７Ｌ４２ ３１頁（１９８１年）。プルガレ（ｖｕｌｇａｒｅ）、ＯＭおよびトマト株を含 むサブグループ■は、ＲＮＡゲノムの３°末端から約８００−１０００ヌクレオ チドおよびコート蛋白質シストロンの外側に組立開始点を有する。ルブリエール 、Ｇ１等、「ブロン−ディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・ サイエンシーズ・オブ・ザ・ニーニスエイ」、１１９１３頁（１９７７年）、お よび福田、Ｍｌ等、「バイロロジー」、１０１．４９３頁（１９８０年）。ＣＧ ＭＭｖ−Ｖｉ’およびコーンビー（ｃｏｒｎｐｅａ）株（Ｃｃ）を含むサブグル ープ■は、ＲＮＡゲノムの３″末端から約３００−５００ヌクレオチドおよびコ ート蛋白質シストロン内に組立開始点を有する。福田、Ｍ等、前出。ＣＧＭＭＶ −Ｗのコート蛋白質シストロンは、３°末端からヌクレオチド１７ロー６６１に 位置する。３゛非コード領域は１７５ヌクレオチド長である。組立開始点は、コ ート蛋白質シストロン内に位置する。メジ、Ｔ１等、「パイロロジー」、里、５ ２頁（１９８３年）。

ブロムモザイクウィルス群 ブロムモザイクウィルス（Ｂ　Ｍ　Ｖ　）は、通例ブロモウィルスとして称され るトリパルタイト１本鎖ＲＮＡ含有植物ウィルス群の一員である。ブロモウィル ス群の各構成員は、狭い範囲の植物に感染する。

ブロモウィルスの機械的伝染は容易に行なわれ、甲虫により伝染する構成員もあ る。ＢＭＶに加えて、他のブロモウィルスには、ソラマメ・モットルウイルスお よびササゲ萎黄モットルウイルスも含まれる。

代表的には、ブロモウィルス・ピリオンは、直径約２６ｘｊＩの正二十面体であ り、一種類のコート蛋白質を含む。ブロモウィルス・ゲノムは線形正方向の１本 鎖ＲＮＡの３分子を宵し、またコート蛋白質ｍＲＮＡは包膜されている。ＲＮＡ は各々、キャップされた５′末端および３“末端にｔＲＮＡ様構造（チロシンを 受は入れる）を有する。

ウィルス組立は細胞質で行なわれる。アルキスト等の記載［［ジャー１年）］に 従い、ＢＭＶの完全なヌクレオチド配列を同定および特性検定した。

イネ壊そウィルス イネ壊そウィルスは、ジャガイモ・ウィルス７群またはボチウィルスの一員であ る。イネ壊そピリオンは、１タイプのコート蛋白質（分子量約３２０００〜約３ ６０００）および１分子の線形正方向１本鎖ＲＮＡを含む屈曲性フィラメントで ある。イネ壊そウィルスは、ポリミキサ・グラミニス（植物、藻類および真菌に 見出される真核生物細胞内寄生体）により伝染する。

アデノウィルス アデノウィルス２型は、アデノウィルス科またはアデノウィルス群の一員である 。この科のウィルスは、は乳類または鳥類に感染する非外被正十二面体線形の２ 本鎖ＤＮＡ含有ウィルスである。

アデノウィルス・ピリオンは、Ｄ　Ｎ　Ａゲノムが塩基性（アルギニンに富む） ウィルスポリペプチド■と密接に会合しているコアを封入する正十二面体カブノ ドにより構成される。このカプシドは、２５２のカブツマ−１すなわち２４０の ヘキラン（各々６つの他のカブツマ−により囲まれているカブツマ−）および１ ２のベントン（各頂点に１つ、各々５つの「ペリベントナル（ｐｅｒｉｐｅｎｔ ｏｎａｌ）Ｊヘキランにより囲まれている）により構成される。各ベントンは、 １個（は乳類アデノウィルスの場合）または２個（殆どのトリアデノウィルスの 場合）の糖蛋白質線維（ウィルスポリペプチド■）を随伴したベントン塩基（ウ ィルスポリペプチド■から成る）により構成される。これらの線維は赤血球凝集 素として作用し得、宿主細胞表面レセプターへのピリオンの結合部位である。ヘ キランは、各々３分子のウィルスポリペプチド■により構成される。それらは正 十二面体を構成する。様々な他の少量のウィルスポリペプチドはピリオンで生成 される。

アデノウィルスｄｓＤＮＡゲノムは、６鎖の５°末端で疎水性「末端蛋白質」、 ＴＰ（分子量約５５０００）に共有結合している。ＤＮＡは、種々のアデノウィ ルスにおいて異なる長さの逆方向末端反復を有する。検査され１こ大部分のアデ ノウィルスでは、５゛末端残基はｄＣＭＰである。

その反復周期中、ピリオンは線維を介して特異細胞表面レセプターに結合し、エ ンドサイト−シスまには原形質膜の直接貫通により細胞に入る。カプシド蛋白質 の大部分は細胞質で除去される。ピリオンのコアは核に入り、そこで脱外皮が完 了してピリオン・ポリペプチドを殆ど含まないウィルスＤ　Ｎ　Ａが放出される 。次いで、ウィルス遺伝子の発現が始まる。ウィルスｄｓＤＮＡは、両鏡に遺伝 情報を含む。初期遺伝子（領域Ｅ　１ａＳＥ　１ｂＳＥ２ａＳＥ３、Ｅ４）は、 ウィルスＤＮＡ複製開始前に発現される。後期遺伝子（領域Ｌｌ、Ｌ２、Ｌ３、 Ｌ４およびＬ５）は、Ｄ　Ｎ　Ａ合成開始後にのみ発現される。中間遺伝子（領 域Ｅ２ｂおよびＩＶａｔ）は、Ｄ　Ｎ　Ａ合成の存在下または非存在下に発現さ れる。領域Ｅｌａは、他の初期遺伝子の発現の調節に関与する蛋白質をコードし 、また形質転換に関与する。

ＲＮ、Ａの写しは（ｍ７Ｇ　５ｐｐｐ５Ｎにより）キャップされ、細胞質に移さ れて翻訳が行なわれる前に核でポリアデニル化される。

ウィルスＤＮＡ複製は、末端蛋白質、ＴＰ、並びにウィルス暗号化Ｄ　Ｎ　Ａポ リメラーゼおよび他のウィルスおよび宿主蛋白質を必要とする。ＴＰは８０に前 駆体、１）ＴＰとして合成され、これは形成期複製ＤＮＡ鎖に共有結合する。ｐ ＴＰは開裂して、ピリオン組立における成熟５５Ｋ　　ＴＰ後期部分になる。恐 らくこの段階で、ｐＴＰはｄｃＴＰ分子と反応し、ｄｃＭＰ残基に共存結合し、 その３″ＯＨはＤ　Ｎ　Ａ合成開始のプライマーとして作用すると考えられる。

ウィルス構造蛋白質の合成を導く後期遺伝子発現は、細胞蛋白質合成の停止によ り達成され、ウィルス組立は、結果的に１細胞当たり１０５以下のピリオンを製 造させ得る。

ジェミニウイルス ジェミニウイルスは、特有な組織のピリオンを有する小さい１本鎖ＤＮＡ含有植 物ウィルスの一群である。各ピリオンは、単一タイプの蛋白質（分子量約２．７ −３．４ｘ　１０’）から成る、一対の等長粒子（不完全正二十面体）により構 成される。各ジェミニウイルス・ピリオンは、１分子の環状正方向１本鎖ＤＮＡ を含む。ジェミニウイルスの中には（すなわち、カッサバ潜伏ウィルスおよびイ ンゲン・ゴールテン・モザイクウィルス）、ゲノムが、似た大きさではあるがヌ クレオチド配列の点では異なる２本鎖ＤＮＡ分子を含む二深裂であると思われる ものもある。しかしながら、他のジェミニウイルス（すなわち、ヨコバイ伝染性 ウィルス、例えばクロリス線紋（ｓｔｒｉａｔｅ）モザイクウィルス）は、１タ イプの１重鎖ＤＮＡＬかもたない。ジエミニウイルスの複製は、ウィルス粒子の 大きな集合体が蓄積している植物細胞核において行なわれる。

適当なウィルスのヌクレオチド配列は、コート蛋白質暗号化配列を修飾すること によりウィルス核酸から誘導され得る。この修飾は、ウィルス・コート蛋白質の 少なくとも一部分の暗号化配列の除去であり得る。別法として、ヌクレオチド配 列は、それがウィルス・コート蛋白質暗号化配列の少なくとも一部分を欠くよう に合成され得る。ウィルスにより製造され得るコート蛋白質が御坊ウイルス核酸 を包膜し得ないように、充分な量の暗号化配列を除去する。さらに、コート蛋白 質暗号化配列は、生成されるコート蛋白質がウィルス核酸を包膜し得ないように 突然変異により修飾され得る。どの場合でも、非生物学的機能性蛋白質が生成さ れる。場合によっては、遺伝子の一部分は良好なプロモーター活性に必要であり 得る。その場合、全遺伝子を欠失すべきではない。他の植物に容易に伝染し得る ためには、ヌクレオチド配列は、さらに後述する通り、適合し得るコート蛋白質 で包膜されなければならない。さらにウィルス核酸を修飾することにより、ウィ ルス伝染性因子の暗号化配列を改編することができる。これらの因子の暗号化配 列の改編により、ヌクレオチド配列は、確実に他の媒介動物、例えば昆虫により 伝染され得なくなる。

ウィルス核酸を適当な生産細胞においてクローン化することによりヌクレオチド 配列を製造する。ウィルス核酸がＤＮＡである場合、それは常套技法を用いて直 接適当な宿主にクローン化され得る。−技法として、生産細胞と適合し得る複製 開始点をウィルスＤＮＡに結合する方法がある。ウィルス核酸がＲＮＡである場 合、まずよく知られ１こ方法によりウィルス・ゲノムの完全長ＤＮＡコピーを製 造する。例えば、逆転写酵素を用いてウィルスＲＮ　ＡをＤ　Ｎ　Ａに転写する ことによりサブゲノムＤ　Ｎ　Ａ片を製造し、Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼを用いて ２本鎖ＤＮＡを作成する。次いで、ＤＮＡを適当なベクターにクローン化し、生 産細胞にクローン化する。ＤＮＡ片を地図に表し、適当な配列で組み合わせるこ とにより、ウィルスＲＮＡゲノムの完全長ＤＮＡコピーを製造する。ウィルス・ コート蛋白質およびウィルス伝染性因子の暗号化配列を同定および改編する。生 成したヌクレオチド配列は自己複製するが、宿主自体を感染し得ない。

ウィルス・ヌクレオチド配列の残りからウィルス・コート蛋白質の暗号化配列お よびウィルス伝染性因子の暗号化配列を分離またはこれらの蛋白質のヌクレオチ ド配列を改編して非生物学的機能性蛋白質を製造する方法は全てこの発明に適し ている。

アルファウィルスの場合、ＥｌおよびＥ２糖蛋白質は、ウィルスの伝染性におい て一つの役割を演じ得る「ガラフ、Ｈｌ等、「ネイチャー、、１里、２３６頁（ １９８０年）コ。これらの糖蛋白質は、コート蛋白質を包囲する液体エンベロー プに取り込まれる。ＥｌおよびＥ２糖蛋白質をコードするヌクレオチド配列は、 アルファウィルスＲＮＡにおけるコート蛋白質の暗号化配列に隣接している。従 って、ＥｌおよびＥ２糖蛋白質暗号化配列は、公知常套技術によりコート蛋白質 暗号化配列と共に除去され得る。

この発明の第二の特徴は、第一ヌクレオチド配列および第二ヌクレオチド配列か ら成るキメラヌクレオチド配列である。第一配列は、前に記載した通り、自己複 製し得、非伝染性であり、ウィルス・ヌクレオチド配列と実質的配列相同性を有 する。第二配列は宿主において転写され得る。第二配列は、好ましくはウィルス ・プロモーターの隣に位置するが、同じく生物活性を有する融合蛋白質が製造さ れ得る。いかなるウィルス・プロモーターでも利用され得るが、ウィルス・コー ト蛋白質遺伝子のプロモーターを使用するのが好ましく、その暗号化配列の少な くとも一部分は欠失されている。コート蛋白質暗号化配列が改編されてはいるが 欠失されていないそれらの場合において、ウィルス・プロモーターは常套技術に より第二配列に結合され得るか、または第二配列は、融合蛋白質が生成されるよ うにコート蛋白質暗号化配列中またはその隣に挿入され得る。転写される第二配 列は、アンチセンス機構により表現型特性の発現を調節し得るＲ　Ｎ　Ａとして 転写され得る。別法として、キメラ・ヌクレオチド配列の第二配列は、宿主、例 えば植物組織において転写および翻訳されることにより表現型特性を生じ得る。

第二ヌクレオチド配列はまた、１種より多い表現型特性の発現をコードし得る。

キメラ・ヌクレオチド配列は、第二ヌクレオチド配列がウィルス・プロモーター に対して適当な配向となるように常套技術を用いて構築される。

植物細胞における有用な表現型特性には、除草剤に対する改善された耐性、極端 な暑熱または寒冷、渇水、塩分または浸透圧に対する改善された耐性、害虫（昆 虫、線虫またはしゅ形類）または疾病（真菌、細菌またはウィルス）に対する改 善された耐性、酵素または二次代謝物の生成、雄性または雌性繁殖不能性、わい 生性、早熟性、改善された収率、活力、雑種強勢、栄養特質、芳香性またはプロ セッシング特性などが含まれるが、これらに限定される訳ではない。他の例とし ては、重要な蛋白質または他の商業用製品、例えばリパーゼ、メラニン、色素、 抗生物質などの生成がある。別の有用な表現型特性は、分解または阻害酵素、例 えば麦芽製造大麦における根の発達の抑制または阻止に利用されるものの生成で ある。また表現型特性は、その生成がバイオリアクターにおいて望まれる二次中 間代謝物であり得る。

動物細胞の場合、有用な表現型特性には、培養における生長能力、培養での生長 時における基質結合特性の削除、高い免疫応答、不適当な免疫応答、例えば自己 免疫反応の最小限化、さらに有効な代謝、赤身肉の製造を目的とする脂肪および 脂質代謝の増加、欠失酵素の置き換え並びに飼料のさらに良好な利用が含まれる が、これらに限定される訳ではない。植物細胞と同様に、動物細胞に関する有用 な表現型特性の他の例としては、重要な蛋白質または他の商業用製品、例えばリ パーゼ、メラニン、色素、抗生物質、組織プラスミノテン活性化因子（ＴＰＡ） 、ヒト成長ホルモンなどの生成、またはその生成がバイオリアクターにおいて望 まれる二次中間代謝物がある。

キメラ・ヌクレオチド配列の例としては、ＴＭＶと実質的配列相同性を有する第 一ヌクレオチド配列およびチロシナーゼの暗号化配列である第二ヌクレオチド配 列を含むものがある。第二の例では、ウィルスは、カラス麦モザイクウィルス（ ＯＭＶ）またはイネ壊そウィルス（ＲＮＶ）である。ＯＭＶおよびＲＮＶは、大 麦およびトウモロコンを含む（これらに限定されない）殆どの種類の単子葉植物 に感染し得る。第三の例では、第二ヌクレオチド配列は、シクロデキストリン・ グルカノトランスフェラーゼの暗号化配列である。ジャガイモ・ウィルスＹ（Ｐ ＶＹ）またはジャガイモ・ウィルスＸ（ＰＶＸ）は第四の例で使用される。第五 の例では、キメラヌクレオチド配列は、ジェミニ・トマト・ゴールテン・モザイ クウィルス（ＴＧＭＶ）と実質的配列相同性を有する第一ヌクレオチド配列、お よびヒト組織プラスミノテン活性剤（ｔ−ＰＡ）をコードする第二ヌクレオチド 配列を含む。ｔ−ＰＡは、プラスミド１）ｔ−ＰＡｔｒｐｌ　２、ＡＴＣＣ番号 ４０４０４（アメリカ合衆国特許第４７６６０７５号）から単離さこる。ＴＧＭ Ｖは、タバコ、トマト、インゲン、大豆、テンサイ、カッサバ、綿、トウモロコ ン、カラス麦および小麦を含む広範な種類の双子葉植物および単子葉植物の両方 に感染し得る。多くの他の例はこの明細書に示されている。

第二ヌクレオチド配列は、上記で製造された第一ヌクレオチド配列に、ウィルス ・プロモーターと隣接する形で挿入され得る。遺伝子欠失の結果として、この配 列ではウィルス・コート蛋白質遺伝子のプロモーターの位置は既知であるため、 第二ヌクレオチド配列はこのプロモーターの隣に配置され得る。別法として、ま ず適当なウィルス・プロモーターは第二ヌクレオチド配列に結合され得、次いで この構築物は、第一ヌクレオチド配列中またはその隣に挿入され得る。さらに、 第二ヌクレオチド配列は改編されたコート蛋白質暗号化配列中およびその隣に挿 入され得る。

キメラ・ヌクレオチド配列またはキメラ・ヌクレオチド配列の相補的コピーの２ 本鎖ＤＮＡを生産細胞にクローン化する。ウィルス核酸がＲＮ　Ａ分子である場 合、まずキメラ・ヌクレオチド配列を、生産細胞と適合し得るプロモーターに結 合する。次いで、キメラ・ヌクレオチド配列を、生産細胞と適合し得る適当なベ クターにクローン化する。この方法では、キメラ・ヌクレオチド配列のＲＮ　Ａ コピーのみが生産細胞において製造される。例えば、生産細胞がエシェリヒア・ コリである場合、ｌａｃプロモーターが利用され得る。生産細胞が植物細胞の場 合、ＣａＭＶプロモーターが使用され得る。生物活性のためにウィルスＲＮ　Ａ をキャップしなければならない場合、生産細胞は、真核生物細胞、例えば酵母、 植物または動物細胞である。次いで、キメラ・ヌクレオチド配列は、生産細胞と 適合し得る適当なベクターにクローン化され得る。別法として、キメラ・ヌクレ オチド配列を、ベクターにおいて生産細胞と適合し得るプロモーターの隣に挿入 する。ウィルス核酸がＤＮＡ分子である場合、それは、生産細胞と適合し得る複 製開始点にそれを結合することにより直接生産細胞にクローン化され得る。この 方法では、キメラ・ヌクレオチド配列のＤＮＡコピーは、生産細胞において製造 される。

アルファウィルスの場合で、ＥｌおよびＥ２糖蛋白質およびコート蛋白質が除か れた場合、さらに大きな外来蛋白質暗号化配列を挿入することにより、キメラ・ ヌクレオチド配列が形成され得る。ＥｌおよびＥ２糖蛋白質は、それら自体のプ ロモーターをもたないため、コート蛋白質、Ｅｌ糖蛋白質およびＥ２糖蛋白質の 隣接暗号化配列の代わりに挿入された外来暗号化配列についてはコート蛋白質プ ロモーターが使用される。

別法として、コート蛋白質、Ｅｌ糖蛋白質およびＥ２糖蛋白質の隣接暗号化配列 の代わりに複数の外来暗号化配列が挿入され得る。

しかしながら、この場合、各外来暗号化配列は、それ自体の適当なウィルス・プ ロモーターを必要とする。しかしながら、そのプロモーターがヌクレオチド配列 で保存された場合、コート蛋白質プロモーターは、−外来暗号化配列に対して使 用され得る。

プロモーターは、ＲＮ　ＡポリマーとＤ　Ｎ　Ａの結合およびＲＮ　Ａ合成の開 始を指示するＤＮＡ配列である。強いプロモーターおよび弱いプロモーターが存 在する。強いプロモーターには、Ｉａｃｕｖ　５、ｔｒｐ。

ｔａｃＳｔｒｐ　−１ａｃｕｖ５、λｐ３、ｏｍｐＦおよびｂｌａがある。エシ ェリヒア・コリにおける外来遺伝子の発現に有用なプロモーターは、調節された 強力なプロモーターである。バクテリオファージλのλｐ１プロモーターは、強 力で充分調節されたプロモーターである。ヘッノペス、Ｊ　、Ｍ、等、「モレキ ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス」、±１盈、＋９７（１９７８ 年）、パーナート、Ｈ，Ｍ、等、「ジーン」、−５−１５９（１９７９年）、ル モー、Ｅ、Ｐ、等、「ジーン」、±５．８１（１９８１年）。

温度感受性λリプレッサー、例えばλｃｌｔｓ８５７をコードする遺伝子をクロ ーニング・ベクターに導入することができる。パーナート等、前出。低温（３１ ’Ｃ）では、Ｐ＋プロモーターは、ｃＩ遺伝子産物により抑制状聾で維持される 。温度を上昇させると、リプレッサーの活性は破壊される。次いで、Ｐ＋プロモ ーターは大量のｍＲＮＡ、）合成を指示する。こうして、エシェリヒア・コリ生 産細胞は、ベクター内でコードされる生成物を生産する前に所望の濃度に生長し 得る。同様に、温度感受性プロモーターは、培養の温度を調節することにより所 望の時点で活性化され得る。

条件付きで非常に高いコピー数を達成し得るプラスミドを組み立てるのが有利で あり得る。例えば、Ｉａｃまたはｔａｃプロモーターを含むｐＡＳ２プラスミド は、４２℃で非常に高いコピー数を達成する。

次いで、ＭＳ２プラスミドに存在するｌａｃリプレッサーをイソプロピル−β− Ｄ−チオガラクトシドで不活化することにより、ｍＲＮＡ合成を行わせる。

キメラ・ヌクレオチド配列を作成する場合のさらに別の方法は、複数のヌクレオ チド配列を製造する（すなわち、多重深裂ウィルス・ベクター構築に必要なヌク レオチド配列を製造する）方法である。

この場合、各ヌクレオチド配列はそれ自体の組立開始点を必要とする。各ヌクレ オチド配列はキメラであり得るか（すなわち、各ヌクレオチド配列は、そこに挿 入された外来暗号化配列を有する）、まｋはヌクレオチド配列の一つのみがキメ ラであり得る。

マルチパルタイトウィルスが、核酸の一方の鎖にそのコート蛋白質の暗号化配列 および異なる鎖に伝染性因子の暗号化配列を有することが見出された場合、２つ のキメラ・ヌクレオチド鎖はこの発明に従い作成される。−外来暗号化配列を、 核酸の一方の鎖においてコート蛋白質遺伝子の代わりに挿入しくまたは改編され たコート蛋白質遺伝子の隣に挿入し）、別の外来暗号化配列を、核酸の他方の鎖 において伝染性因子遺伝子の代わりに挿入（まには改編された伝染性因子遺伝子 の隣に挿入）する。

別法として、モノパルタイトウィルスのヌクレオチド配列に外来暗号化配列を挿 入すると、２つのヌクレオチド配列（すなわち、ビパルタイトウイルス・ベクタ ーの作成に必要な核酸）が作成され得る。元のヌクレオチド配列の幾つかの暗号 化配列の複製および翻訳とは独立して外来暗号化配列の複製および翻訳を保持す ることが望ましい場合、これは有利な状況である。各ヌクレオチド配列は、それ 自体の組立開始点をもたなければならない。

この発明の第三の特徴は、ウィルスまたはウィルス粒子である。

ウィルスは、包成された前述のキメラ・ヌクレオチド配列により構成される。次 いで、この生成物は適当な宿主に感染し得るが、キメラ・ヌクレオチド配列は、 追加的ウィルスまたはウィルス粒子の生産機構を欠くため、それ以上は感染し得 ない。しかしながら、キメラ・ヌクレオチド配列は宿主において複製することが できる。キメラ・ヌクレオチド配列は、宿主内で転写および／または翻訳されて 所望の生成物を製造する。

大部分のウィルスは、正二十面体カプシド、球形カプシドまたはかん状カプシド により包成されている。植物ウィルス、例えばタバコ・モザイクウィルスは通例 がん状カプシドにより包成されているが、アルファウィルスは正二十面体カプシ ドにより包成されている。

正二十面体カプシドおよび球形カプシドは、がん状カプシドよりも幾何学的に不 自然であるため、包成され得る核酸の量に関してさらに制限されている。反対に 、がん状カプシドは伸張し得る１こめ、ヨーロッパ特許出願０２７８６６７で説 明されている通り、いかなる量の核酸でも包成することができる。

この発明の一実施態様では、キメラ・ヌクレオチド配列は異種カプシドにより包 成されている。がん状カプシドは、幾何学的に不自然な正二十面体カプシドまた は球形カプシドよりも長いキメラ・ヌクレオチド配列を包成１．得るため、はぼ 通例、この実施態様ではかん状カプシドを利用する。がん状カプシドを使用する と、大きな外来蛋白質暗号化配列を組み込むことによりキメラ・ヌクレオチド配 列を形成することができる。複数の外来暗号化配列がキメラ・ヌクレオチド配列 に存在する場合、上記かん状カプシドは非常に有利である。

この発明の別の特徴は、前記キメラ・ヌクレオチド配列を含むベクターである。

キメラ・ヌクレオチド配列は、生産細胞プロモーターま１こは生産細胞と適合し 得る複製開始点から成る群から選ばれるヌクレオチド配列に隣接している。この ベクターを用いて生産細胞を形質転換すると、次に前記細胞はキメラ・ヌクレオ チド配列を大量に生産する。生産細胞は、ベクターと適合し得る細胞であればよ い。生産細胞は、原核生物または真核生物の細胞であり得る。しかしながら、活 性を示すためにウィルスＲＮＡ（キメラ・ヌクレオチド配列）をキャップしなけ ればならない場合、生産細胞、例えば真核生物生産細胞は、ウィルスＲＮＡをキ ャップし得るものでなくてはならない。生産細胞は、キメラ・ヌクレオチド配列 を含むベクターのみを含み得る。この場合、生産細胞はキメラ・ヌクレオチド配 列を生産するだけであり、次いでそれをインビトロ包膜することにより感染性ウ ィルスを製造しなければならない。この包成は、常套技術に従い適合し得るウィ ルス・コート蛋白質をキメラ・ヌクレオチド配列に加えることにより達成される 。このシナリオでは、ウィルス・コート蛋白質は第二生産細胞で生産される。生 産細胞と適合し得るプロモーターの隣に適合し得るウィルス・コート蛋白質の暗 号化配列を含む第二ベクターを利用することにより、第二生産細胞を形質転換す る。次に、第二生産細胞は、ウィルス・コート蛋白質を大量に生産する。

上記で説明した通り、第二生産細胞により生産され１こウィルス・コート蛋白質 は、ウィルス・ヌクレオチド配列と相同または異種であり得る。ウィルス・コー ト蛋白質は、キメラ・ヌクレオチド配列と適合し得、キメラ・ヌクレオチド配列 を完全に包膜するのに充分な大きさを有するものでなくてはならない。

別法として、さらに第一生産細胞は、生産細胞と適合し得るプロモーターの隣に 適合し得るウィルス・コート蛋白質の暗号化配列を有する第二ベクターを含む。

また、ウィルス・コート蛋白質のこの暗号化配列は、ウィルス・ヌクレオチド配 列と相同または異種であり得る。この場合、次に生産細胞は、コート蛋白質およ びキメラ・ヌクレオチド配列を生産する。次いで、このキメラ・ヌクレオチド配 列はウィルス・コート蛋白質により包膜され、伝染性ウィルスが生産される。第 二ベクターは、キメラ・ヌクレオチド配列の製造において欠失されたウィルス・ コート蛋白質の暗号化配列、または相同もしくは異種ウィルス・コート蛋白質暗 号化配列を、生産細胞と適合し得るプロモーターの制御下、適当なベクターに挿 入することによる常套技術に従い製造される。

異なるベクターを利用して異なる生産細胞または同じ生産細胞を形質転換する、 多数の代替方法が存在する。大部分のウィルスについて、伝染性因子のみがピリ オンの感染性に不可欠であるのか否か、または伝染性因子は単にカプシドへの付 属物として機能し、従ってピリオン感染性は高められるが、ピリオンに存在しな い場合には感染を阻止しないか否かは未知である。この発明の目的（すなわち、 ウィルス・ベクターの非感染性を確保すること）の場合、伝染性因子単独でウィ ルス・ベクターは感染性にされ得るため、キメラ・ヌクレオチド配列を含むベク ターは、カプシド蛋白質のヌクレオチド配列も伝染性因子のヌクレオチド配列も 含まないと仮定された。

しかしながら、キメラ・ヌクレオチド配列を含むこのベクターは、プロモーター および複製開始点を含まねばならず、好ましくは組立開始点を含む。上記で述べ た通り、このベクターを利用して生産細胞を形質転換する。複製開始点は、生産 細胞と適合可能でなくてはならない。

他の必要なベクター（複数も可）は、主として興味の対象のウィルスにより異な り得る。カプシド蛋白質のウィルス・ヌクレオチド配列が、伝染性因子のヌクレ オチド配列に隣接し、これらの配列が同一のプロモーターを共有している場合（ アルファウィルスによく見られる）、第二ベクターは、カプシド蛋白質の配列、 伝染性因子の配列およびプロモーターを含む。組立開始点が第一ベクターに組み 込まれていない場合、この第二ベクターは所望により組立開始点を含み得る。こ のベクターを利用して生産細胞を形質転換するとき、組立開始点はその生産細胞 と適合可能でなくてはならない。

別法として、第二ベクターは、カプシド蛋白質のヌクレオチド配列およびプロモ ーターを含み得、第三ベクターは、伝染性因子のヌクレオチド配列およびプロモ ーターを含み得る。さらに第二または第三のいずれかのベクターは組立開始点を 含んでおり、これはベクターにより形質転換される生産細胞と適合可能でなくて はならない。

いずれかの代替的実施態様の場合、各ベクターはそれ自体の生産細胞の形質転換 に利用され得るか、ま１こはベクターは全て１つの生産細胞で利用され得る。ま た、各ベクターに随伴するプロモーターは全て、ベクターが利用される生産細胞 と適合可能でなくてはならない。

既に述べた通り、原核生物生産細胞は、コート蛋白質暗号化配列またはウィルス の感染性に必要な他の暗号化配列を存するベクターを含むように形質転換され得 る。別法として、原核生物生産細胞または真核生物生産細胞は、コート蛋白質お よび伝染性因子（必要ならば）の暗号化配列が細胞のゲノムに安定して組み込ま れるように形質転換される。幾つかの慣用的技術を利用することによりこの実施 態様は達成され得る。例えば、適当な暗号化配列は、例えばシェール、Ｊｌ等、 「バイオ／テクノロジー」、土、１７５（１９８３年）、フィラッティ、Ｊｌ等 、「バイオ／テクノロジー」、ｉ、７２６（１９８７年）、エベレット、Ｎ、Ｐ 、等、「バイオ／テクノロジー」、互、１２０１（ｊ９８７年）、ブ７Ｅ−Ｃ， ｒバイオ／テクノロジー」、１１８１５（１９８７年）、ヒンチー、Ｍ、Ａ　、 等、「バイオ／テクノロジロジー」、１１８巻（前出）の記載に従い、アグロバ クテリウムによる形質転換により植物細胞に挿入され得る。また、アグロバクテ リウムは、アグロ感染と称する方法による双子葉および単子葉の両植物へのウィ ルスの導入に利用されている。この技術は、グリムズレイ、Ｎ１等、「プロシー ディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ ・ザ・ニー・ニス・エイ」、１盈、３２８２（１９８６年）、エルマー、Ｊ、Ｓ 、等、「プラント・モレキュラー・バイオロジー」、±１．２２５（１９８８年 ）、グリムズレイ、Ｎ５等、「ネイチャー」、主１ｉ、１７７（１９８７年）お よびハエス、Ｒ，Ｊ　、等、「ネイチャー」、１１↓、１８０（１９８８年）に より記載されている。

別法として、エレクトロポレーション、塩化カルシウムまたはポリエチレングリ コール介在形質転換、リポソーム融合マイクロインジェクンヨンまたはマイクロ プロジェクティル・ボンバードを含む直接遺伝子導入により、適当な暗号化配列 を真核生物細胞に挿入することができる。これらの技術は、フロム、Ｍ、Ｅ、、 ［メソッズ・イン・エンサイモロジー」、呈、３０７（１９８７年）、シリト、 ７３１（１９８５年）、ネグルチン、Ｒ１等、「プラント・モレキュラー・バイ オロジー」、盈、３６３（１９８７年）、ライヒ、Ｔ、Ｊ、等、「バイオ／テク ノロジー」、土、１００１（１９８６年）、フレイン、８年）により記載されて いる。

形質転換された生産細胞は、安定したベクター中または安定した状態でゲノムに 組み込まれたコート蛋白質および／または伝染性因子暗号化配列（複数も可）を 含む。次いで、キメラ・ヌクレオチド配列を含むベクターを前述の生産細胞に導 入する。

一旦キメラ・ヌクレオチド配列が複製され、カプシド蛋白質および伝染性因子が 適当な生産細胞により生産されると、無傷のピリオンはインビトロで組み立てら れ得る。複製されたキメラ・ヌクレオチド配列は、公知慣用技術に従いカプシド 蛋白質により包膜される。

第三ベクターを用いてカプシド蛋白質とは別に伝染性因子の生産を誘発するとき 、伝染性因子を別々にピリオン組立に加えることができる。別法として、単一の 第二ベクターを用いてカプシド蛋白質および伝染性因子の両方を生産させた場合 （普通アルファウィルスに見られる）、キメラ・ヌクレオチド配列の色層後にイ ンビトロ・ピリオン組立は完了する。

この発明のさらに別の特徴は、ウィルス感染しに宿主である。宿主への導入後、 その宿主は、自己複製し得るが、追加的に伝染性ウィルスまたはウィルス粒子を 生産し得ないキメラ・ヌクレオチド配列を含む。この宿主は慣用技術によりウィ ルス感染され得る。適当な技術には、葉の表皮摩耗、溶液中ての浸食、高速水噴 霧および他の宿主損傷並びにキメラ・ヌクレオチド配列単独または包膜されたウ ィルスを含む水による宿主種子の吸水があるが、これらに限定されない。キメラ ・ヌクレオチド配列は感染源を生産し得ないが、例えぼ宿主が植物または動物で ある場合、それは自己複製可能であり、宿主全体に拡散し得る。

キメラ・ヌクレオチド配列を植物宿主に導入させる別の方法は、グリムズレイ、 Ｎ１等、「ネイチャー」、盈２５Ｓ　＋７７（１９８７年）により記載された、 アグロ感染またはアグロバクテリウム介在形質転換（アグロ感染と呼ばれること もある）として知られている技術である。この技術は、それらのＤＮＡの一部分 （Ｔ−ＤＮＡ）を宿主細胞に導入することにより植物をコロニー化し、そこで核 Ｄ　Ｎ　Ａに組み込まれるアグロバクテリウムの一般的特徴を利用している。Ｔ −ＤＮＡは２５塩基対長の境界配列により画定され、これらの境界配列間のＤＮ Ａは全て同様に植物細胞に導入される。Ｔ−ＤＮＡ境界配列間のキメラ・ウィル ス・ヌクレオチド配列の挿入により、キメラ配列の植物細胞への導入が行なわれ 、そこでキメラ配列は複製され、次いで植物全体に拡散する。アグロ感染は、ジ ャガイモやせいもピロイド（ＰＳＴＶＸガードナー、Ｒ，Ｃ等、「プラント・モ レキュラー・バイオロジー」、も　２２１（１９８６年））、カリフラワー・モ ザイクウィルス（ＣａＭＶ）（グリムズレイ、Ｎ等、！プロノーディングス・オ ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・才ブ・サイエンソーズ・オブ・ザ・ニー・ニ ス・エイ」、盈ユ、３２８２（１９８６年））、トウモロコシ条斑ウィルス（グ リムズレイ、Ｎ１等、「ネイチャー」、ギタリア条斑ウィルス（ドンラン、Ｊｌ 等、「パイロゴロジー」、１６″ＬＳ　２４８（１，９８８年））、小麦萎縮ウ ィルス（ハエス、Ｒ，Ｊ、等、「ジャーナル・オブ・ジェネラル・パイロロジー Ｊ、６９，８９１（１９８８年））およびトマト・ゴールテン・モザイクウィル ス（ＴＧＭｖ）（エルマー、Ｊ、Ｓ、等、「プラント・モレキュラー・バイオロ ジた。従って、感受性植物のアグロ感染は、上記ウィルスのいずれかのヌクレオ チド配列に基づい１こキメラ・ヌクレオチド配列を含むピリオンにより達成され 得る。

幾つかのウィルス産物は、ウィルス核酸の生産および拡散を確保するのに有用で ある。−因子は、ウィルス核酸の複製に関与するレプリカーゼである。存在し得 る第二の因子をこの明細書では輸送蛋白質と呼ぶ。この蛋白質（複数も可）は、 感染細胞から隣接細胞へのウィルス核酸の移動、すなわち生産または宿主細胞、 組織または生物体全体へのウィルス核酸の拡散に関与する。ウィルス・ベクター の適当な複製および拡散を確保するため、この発明の追加実施態様には、ウィル ス・レプリカーゼ、ウィルス輸送蛋白質または両方の暗号化配列による宿主また は生産細胞、組織または生物体の安定した形質転換が含まれる。コート蛋白質遺 伝子に関して上述した要領で、生産細胞または宿主のゲノムへの安定した組み込 みを含む形質転換が行なわれる。

この発明の追加実施態様では、ウィルスの宿主範囲が拡大されているため、異種 外来遺伝子を含むウィルス構築物、すなわちキメラ核酸は、多くの異なる宿主に おいて使用され得る。宿主（または生産細胞−この明細書では同意義であるため ）を、ウィルス構築物による宿主感染を可能にするのに有用なウィルス原料の一 部分を含ませるべく形質転換することにより、ウィルスの宿主範囲は拡大される 。動物または細菌宿主の場合、ウィルスにより認識される宿主細胞レセプターの 暗号化配列（複数も可）を含ませるべく宿主を形質転換する。別法として、ウィ ルスは、宿主の認識または結合蛋白質の暗号化配列を含むように製造され得る。

植物宿主の場合、ウィルス・レプリカーゼ遺伝子または輸送蛋白質遺伝子を含む ように宿主を形質転換する。別法として、ウィルスは、宿主において機能し得る 輸送蛋白質の暗号化配列を含むように製造され得る。さらに、再生された植物の 全細胞が感染し得るように、ウィルス核酸またはその一部分を含ませるべく宿主 植物の原形質体を形質転換することが可能である。この形質転換は、前述の技術 のいずれかにより行なわれる。

この発明のさらに別の特徴は、特徴のある生成物、例えばアンチセンスＲＮ　、 Ａ、リボザイム、蛋白質、酵素または複合生体分子（ここらに限定されない）の 製造方法である。それらの生成物は前述のものを含む。キメラ・ヌクレオチド配 列の第二ヌクレオチド配列は、所望の生成物の生産を導く転写可能配列を含む。

この方法は、ウィルス、例えば前述のウィルスによる適当な宿主の感染、感染宿 主を生長させることによる所望の生成物の製造および必要ならば所望の生成物の 単離を含む。感染宿主の生長は慣用技術に従い行なわれ、生産された生成物の単 離も同様である。

−例では、例えばストレプトミセス・アンチビオチフスから単離されたチロシナ ーゼ暗号化配列を、コート蛋白質暗号化配列が除去されたＴ　Ｍ　Ｖ　、カラス 麦モザイクウィルス（ＯＭＶ）またはイネ壊そウィルス（ＲＮＶ）由来のヌクレ オチド配列のウィルス・コート蛋白質のプロモーターの隣に挿入する。生成した キメラ・ヌクレオチド配列を用いて前記に従いウィルスを製造する。タバコまた は発芽中の大麦を適当なウィルスにより感染させる。キメラ・ヌクレオチド配列 は、植物組織で自己複製して酵素チロシナーゼを生産する。別法として、チロシ ナーゼ暗号化配列を、他の適当に修飾され１こウィルス核酸に挿入する。生成し たウィルスを用いて適当な宿主を感染させ、チロシナーゼを製造する。この酵素 の活性はメラニンの生成を誘導する。例えば、ヒゴーバー、Ｍ９等、「バイオケ ミストリー」、２４．６０３８（１９８５年）参照。

第二の例では、シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ暗号化配列、 例えばバシルス（がん菌）エスピー、ナンバー１７−１（アメリカ合衆国特許第 ４Ｊ３５９７７号参照）から単離された配列を、コート蛋白質暗号化配列が除去 されたＯＭＶ、ＲＮＶ、ＰＶＹまたはＰＶＸ由来のヌクレオチド配列のウィルス ・コート蛋白質のプロモーターの隣に挿入する。生成したキメラ・ヌクレオチド 配列を用いて前記要領でウィルスを製造する。トウモロコシまたはジャガイモを 適当なウィルスにより感染させる。キメラ・ヌクレオチド配列は、植物組織にお いて自己複製し、酵素シクロデキストリン・グルコトランスフェラーゼを生産す る。この酵素の活性は、調味料としてまたは薬剤デリバリ−に有用なシクロデキ ストリンの生産を誘導する。

以下、実施例によりこの発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例では、酵 素反応は、特記しない限り、製造者が推奨する方法に従い行なわれた。ベクター 構築および形質転換には、特記しない限り、標準技術、例えばマニアチス、Ｔ４ 等（前出）、「メソッズ・イン・エンザイモロジー」、６８．１００．１０１． １１８．１５２−１５５巻（前出）、および「ＤＮＡクローニング」、■、■、 ■巻（前出）が使用された。

実施例１ コート蛋白質遺伝子の代わりにチロシナーゼ遺伝子を含むキメラＴＭＶ　　ＤＮ Ａの製造。

Ｓ　ａｃｌ／　Ｐ　Ｖ　Ｕ　ＩＩ切断を用いて、ｐＩ　Ｊ　７０２ストレプトマ イセス・プラスミド（市販されている）から］、２ｋｂチロシナーゼ遺伝子を誘 導した。それを、大きさが２　、９　ｋｂであるストラタジーン・ブルースクリ プト・ベクター（ＫＳ）のＳ　ａｃｔ／　ＥｃｏＲＶ部位に挿入した。

生成したプラスミドをｐＢＧ　１１０（４，１ｋｂ）として維持した。チロシナ ーゼ遺伝子を、５ａｃｌ／Ｈｉｎｄｌｌｌ切断によりｐＢＧｌｌｏから除去し、 ｐｕｃｌ　９（２，７ｋｂ）に挿入することにより、ｐＢＧ１１５（３゜９　ｋ ｂ）を得た。チロシナーゼ遺伝子を、ＥｃｏＲ１／Ｈｉｎｄｌｌｌ切断によりｐ ＢＧＩ＋５から除去し、ストラタジーン・ブルースクリプト・べ’）’）　　（ ＫＳ＋；２．９ｋｂ］：挿入すルコとにより、ｐＢ０１２０（４゜１　ｋｂ）を 得た。チロシナーゼ遺伝子を、Ｘ　ｈｏｌ／　Ｓ　ｍａｌ切断によりｐＩ３Ｇ１ ２０から除去し、Ｘｈｏｌリンカ−をＳｍａｌ末端に加えた。Ｘｈｏｌ末端を宵 するこのチロシナーゼ遺伝子を、ストラタジーン・ブルースクリプト・ベクター （Ｋ　Ｓ　＋　：　２　、９　ｋｂ）のＸｈｏ１部位に挿入することにより、ｐ ＢＧ　＋　３０（４，１ｋｂ）を得た。ボ１ルリンヵー領域に残されｆこ望まし くないＰｓｔ１部位が存在するにめ、非暗号化塩基の幾つかおよびポリ−リンカ −領域を除去することによりｐＢＧＩ３ｏを修飾した。Ｈ１ｎｄｌＩＩ／　Ｓ　 ａｃｌ消化を用いてこれを行うことにより、ｐＢＧＩ３０からチロシナーゼを放 出させ、次いで１．２ｋｂフラグメントをＥＸＯ目Ｉて処理すること？こより、 Ｈｉｎｄｌｌ１３’末端から約２゜Ｏ塩基を消化し几。Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼ によりプラント末端とした後、Ｘｈｏｌリンカ−を加え、１．ｏｋｂフラグメン トをストラタノーン・ブルースクリプト・ベクター（Ｋ　Ｓ　＋　；　２　、９ 　ｋｂ）に挿入することにより、ｐＢＧＩ３２を得た。１　、０　ｋｂチロシナ ーゼ遺伝子をｐｓ０３　（６、３ｋｂ）ｊ：挿入した。これは、ＴＭＶプラスミ ド、ｐｓ　３−２８（Ｗ、Ｏ，ドーランから入手可能、ユニバージティー・才ブ ・カリフォルニア、リバーサイド）の３　、６　ｋｂサブクローンであり、ｐｕ ｃｌ９において、プラスミドｐＢＧ２１およびｐＢＧ２２を与える（チロシナー ゼ遺伝子の方向により異なる、各々７　、３　ｋｂ）。プラスミド５３−２８（ １１，１ｋｂ）は、その位置にＸｈｏ１部位で除去されたコート蛋白質遺伝子を 有していたＴＭＶのクローンである。ドーラン、Ｗ、００等、「ファイドパソロ ジー」、−二」−１７８３（１９８８年）。ｐＢＧ２１および１）ＢＧ２２のＮ 　ｃｏｌ／　Ｅ　ｃｏＲＶ切断により、チロシナーゼ遺伝子を含む２．４ｋｂフ ラグメントが放出された。このフラグメントは、除去されたｐｓ３−２８におけ るｌ　、　４　ｋｂ断片に取って替わった。生成したプラスミド、ｐＢＧ２３お よびｐＢＧ２４（チロシナーゼ遺伝子の方向により異なる、各々＋２．］ｋｂ） は最終的なりＮＡ構築物であり、これらを用いて感染性ＲＮＡを作成し、これを りバコ植物に導入することにより、チロシナーゼのｍ　ＲＮ　Ａを導入した。こ のｍＲＮＡは、ノーザン・プロット方法を用いて検出され得る。

実施例２ コート蛋白質遺伝子の代わりにＧｔＪＳ遺伝子を含むキメラＴＭＶＤＮＡの製造 。

ＥｃｏＲＩ／Ｎｃｏｌ切断を用いてｐＲＡＪ　２７５（４，５ｋｂ、クローンチ ク・ラボラトリーズ）から］、８ｋｂＧＵＳ遺伝子を誘導した。フレノウ・フラ グメントを用いて付着末端を平滑にした。Ｘｈｏｌリンカ−を加え、フラグメン トを大きさ２　、９　ｋｂのストラタジーン・ブルースクリプト・ベクター（Ｋ Ｓ＋）に挿入した。生成したプラスミドをｐＢｏ　１５０（４，７ｋｂ）として 維持した。実施例１の技術を用いて、Ｘｈｏｌリンカ−を有するこのＧＵＳ遺伝 子をｐＢｏ３に移すことにより、ｐＢ０２５およびｐＢｏ２６（ＧＬ！Ｓ遺伝子 の方向により異なる、各々８　、１　ｋｂ）が得られた。ｐＢｏ２５およびｐＢ ｏ２６の５ａｉｌ／Ｎｃｏ１切断により、ＧｔＪＳ遺伝子を含む３　、８　ｋｂ フラグメントが放出された。これらのフラグメントは、除去され１こｐＳ３−２ ８における２　、　０　ｋｂ断片に取って替わった。生成したプラスミド、ｐＢ ｏ２７およびｐＢｏ２８（ＧＵＳ遺伝子の方向により異なる、各々１２．９ｋｂ ）は最終的ＤＮＡ構築物であり、これらを用いて感染性ＲＮＡを作成し、これを タバコ植物に導入することによりＧＵＳ遺伝子のｍＲＮＡを導入した。このｍＲ ＮＡは、ノーザン・プロット方法を用いて検出され得る。またＧＵＳ酵素の活性 も検出可能である。

実施例３ ＴＭＶコート蛋白質遺伝子の代わりにＧＵＳ／コート蛋白質遺伝子を含むキメラ ＴＭＶ　ＤＮＡの製造。

上記実施例２に記載された、ｐＢＧ　Ｉ　５０（４，７ｋｂｋ）からの１．８ｋ ｂＧ　Ｕ　Ｓ遺伝子をこの構築に使用した。ｐ３５−５のＰｓｔｌ／Ｎｃｏｌ切 断により、ＴＭＶコート蛋白質遺伝子の３゛末端分および５゛末端分を含む０　 、７　ｋｂフラグメントが放出された。プラスミドｐ３５−５（１１，３ｋｂ） は、除去されたコート蛋白質遺伝子の大部分を有しｔコＴ　Ｍ　Ｖのクローンで あり、コート蛋白質遺伝子の内部分が除去されている部位にＸｈｏ１部位を含む 。ドーラン、Ｗ、０１等、「ファイドパソロジー」、１薗、７８３（１９８８年 ）。この０　、７　ｋｂフラグメントを、除去されたｐＢｏ３における０　、　 ５　ｋｂ断片と置き換えることにより、ｐＢｏ２９（６，５ｋｂ）が得られた。

１．８ｋｂＧＵｓ遺伝子をｐＢｏ２９のＸｈｏ１部位に挿入することにより、ｐ Ｂｏ３１およびｐ１３Ｇ３２（ＧＵＳ／コート蛋白質融合遺伝子の方向により異 なる、各々８　、３　ｋｂ）が得られた。ｐＢｏ３１およびｐＢｏ３２の５ａｌ ｔ／Ｎｃｏｌ切断により、ＧＵＳ／コート蛋白質融合遺伝子を含む４　、０　ｋ ｂフラグメントが放出された。これらのフラグメントは、除去されたｐｓ３−２ ８における２　、　０　ｋｂ断片に取って代わった。生成したプラスミド、ｐＢ ｏ３３およびｐＢｏ３４（ＧＵｓ／コート蛋白質融合遺伝子の方向により異なる 、各々１３　、１　ｋｂ）は最終的Ｄ　Ｎ　Ａ構築物であり、これらを用いて感 染性ＲＮＡを作成した。ｐＢｏ３３、ｐＢｏ３４およびｐＳ３−２８（対照とし て）をＲＮＡに転写し、これを用いて、植物にＲＮＡ、研摩剤およびリボヌクレ アーゼ阻害剤を擦り付けることによりタバコ植物を感染させる。有効な感染を示 す植物に斑点が記される。感染した植物組織を浸軟し、蛍光を調べる。ｐＳ３− ２８により感染した組織は蛍光を発しなかったが、ｐＢｏ３３ま几はｐＢｏ３４ により感染した組織は蛍光を発した。

実施例４ 非伝染性ＴＭＶヌクレオチド配列の製造。

ドーラン、Ｗ、Ｏ，等、「プロシーディンゲス・オプ・ザ・ナショナル・アカデ ミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・エイ」、旺、１８３２（ １９８６年）による記載に従い、ＴＭＶゲノムの完全長ＤＮＡコピーを製造し、 ＰＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位に挿入する。ウィルス・コート蛋白質遺伝子を、３ ０に蛋白質遺伝子に隣接するＴＭＶゲノムの５７１１位に導入する。ＴＭＶゲノ ムのＤＮＡコピーを含むベクターを適当な制限酵素およびエキソヌクレアーゼで 消化することにより、コート蛋白質暗号化配列を欠失する。例えば、Ｃ１ａＩお よびＮＳｌ工による部分消化、次いで再ライゲーションしてウィルスの３′−テ イルを再結合することにより、コート蛋白質暗号化配列を除去する。別法として 、ベクターをウイルス核酸の３゛末端で切断する。コート蛋白質暗号化配列の出 発コドンまでＢａ１３１またはエキソヌクレアーゼ■消化によりウィルスＤＮＡ を除去する。次いで、ウィルス３゛−テイルの配列を含む合成りＮＡ配列を残り の５′末端にライゲーションする。ＴＭＶ　ＲＮＡを単離し、それを用いてタバ コ植物を感染させることにより、ウィルス・コート蛋白質の暗号化配列の欠失を 確認する。単離されたＴＭＶ　ＲＮＡは、自然条件下で非感染性、すなわち生物 学的に封じ込められていることが見出された。

実施例５ 非伝染性ＯＭＶヌクレオチド配列の製造。

ドーラン、Ｗ、Ｏ，等（１９８６年、前出）の記載に従い、ＯＭＶゲノムの完全 長ＤＮＡコピーを製造する。ＯＭ■ゲノムのＤＮＡコピーを含むベクターを、適 当な制限酵素または適当なエキソヌクレアーゼ、例えばに実施例４記載のもので 消化することにより、コート蛋白質暗号化配列を欠失する。ＯＭＶＲＮＡを単離 し、それを用いて発芽中の大麦植物を感染させることにより、ウィルス・コート 蛋白質の暗号化配列の欠失を確認する。単離されたＯＭＶ　ＲＮＡは、自然条件 下で生物学的に封じ込められていることが判る。

実施例６ 非伝染性ＲＮ　Ｖヌクレオチド配列の製造。

ドーラン、ＷＯｌ等（１９８６年、前出）の記載に従い、ＲＮ　Ｖゲノムの完全 長ＤＮＡコピーを製造する。ＲＮＶゲノムのＤＮＡコピーを含むベクターを、適 当な制限酵素または適当なエキソヌクレアーゼ、例えばに実施例４記載のもので 消化することにより、コート蛋白質暗号化配列を欠失させる。ＲＮＶ　ＲＮＡを 分離し、それを用いて発芽中の大麦植物を感染させることにより、ウィルス・コ ート蛋白質の暗号化配列の欠失を確認する。分離されたＲ　Ｎ　Ｖ　ＲＮＡは、 自然条件下で非感染性であることが判る。

実施例７ 非伝染性ＰＶＹまたはＰＶＸヌクレオチド配列の製造。

ドーラン、Ｗ、０９等（１９８６年、前出）の記載に従い、ｐｖｙまたはＰＶｘ ゲノムの完全長ＤＮＡコピーを製造する。ＰＶＹまたはＰＶＸゲノムのＤ　Ｎ　 Ａコピーを含むベクターを、適当な制限酵素または適当なエキソヌクレアーゼ、 例えばに実施例４記載のもので消化することにより、コート蛋白質暗号化配列を 欠失させる。ＰＶＹまたはＰＶＸ　　ＲＮＡを分離し、それを用いてジャガイモ 植物を感染させることにより、ウィルス・コート蛋白質の暗号化配列の欠失を確 認する。分離されたＰＶＹまたはＰＶＸ　　ＲＮＡは、自然条件下で生物学的に 封じ込められていることが判る。

実施例８ チロシナーゼ暗号化配列を含むキメラ・ヌクレオチド配列の製造。

ＢｃｌＩによる消化、次いで出発コドンまでの５゛−エキソヌクレアーゼ消化に より、チロシナーゼ暗号化配列をストレプトコッカス・アンチビオチフスから単 離する。別法として、制限部位を、部位指向性オリゴヌクレオチド突然変異誘発 によりチロシナーゼ暗号化配列の出発コドンの隣で工学処理する。適当な制限酵 素で消化すると、チロシナーゼ暗号化配列か得られる。チロシナーゼ暗号化配列 を含むフラグメントを単離し、実施例４．５および６て製造され１ニベクターに おいてウィルス・コート蛋白質遺伝子のプロモーターの隣でクローン化する。

実施例９ チロンナーゼ含有ウィルスの製造。

ドーラン、Ｗ、０等（１８６、前出）に記載された技術に従い、ラムダＰＲプロ モーターを実施例８のキメラ・ヌクレオチド配列に結合する。生成したベクター を用いて、この場合生産細胞であるエシェリヒア・コリを形質転換する。

実施例４．５または６で単離されたウィルス・コート蛋白質暗号化配列を、ベク ターｐＢＲ３２２におけるｌａｃプロモーターの隣に挿入することにより第二ベ クターを製造する。このベクターを用いて、対応する適合可能なキメラ・ヌクレ オチド配列を含むベクターを有する生産細胞を形質転換する。生産細胞を生長さ せ、生成したウィルスを分離する。別法として、第二ベクターを用いて、コート 蛋白質を生産するエシェリヒア・コリの第二味を形質転換する。次いで、コート 蛋白質およびウィルスベクターを合わせることにより、ウイルスを形成する。

実施例１０ メラニンの製造。

実施例９で単離されたウィルスを用いて、タバコ植物（ＴＭＶに基づくウィルス ）または発芽中の大麦植物（ＯＭＶまたはＲＮＶに基づくウィルス）を感染させ る。感染した植物を通常生長条件下で生長させる。これらの植物はチロシナーゼ を生成し、これが植物組織に存在する成分と反応して中間体を生成し、これらが 植物組織内または植物組織の溶解後にメラニンに変換される。メラニンは、慣用 技術により単離される。

実施例１１ ベータ・シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ暗号化配列を含むキ メラ・ヌクレオチド配列の製造。

後記方法により、ベータ・シクロデキストリン・グルコトランスフェラーゼ暗号 化配列を、親アルカリ性バンルス（かん菌）・エスピー株ナンバー３８−２から 単離する。

株ナンバー３８−２の染色体ＤＮＡ［花本、Ｔ１等、「アグリカルチエラル・ア ンド・バイオロジカル・ケミストリー］、５１．２０１９（１９８７年）］をＳ ａｕｇＡＩにより部分開裂し、フラグメントをＢａｍＨＩ消化ｐＢＲ３２２にお いてライゲーションする。プラスミドｐｃｓ１１５を担う形質転換体は、生産株 のゲノムからの３．２ｋｂＤ　Ｎ　Ａフラグメントを含み、ＣＧＴ活性を有する 。この形質転換体により生産されたＣＧＴは、オフテルロ二−二重拡散試験によ りチンバー３８−２ＣＧＴのと完全融合する一本線の沈降を生じる。

フラグメントのヌクレオチド配列は、ｐｔＪｃ１９を用いるジデオキシ鎖終結反 応［サンガー、Ｆｌ等、［プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ ミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・エイ」、７４，５４６３ （１９７７年）］およびエキソヌクレアーゼ欠失方法［ヘニコフ、Ｓ６、「ジー ン」、２８．３５１（１９８４年）コにより見出される。フラグメントのヌクレ オチド配列は、ＣＧＴ遺伝子に対応する単一オーブン・リーディング・フレーム を示す。６６ｋＤａｌの分子質量を有する蛋白質は、１７５８ｂｐのこのオーブ ン・リーディング・フレームから翻訳され得る。詳細なヌクレオチド配列につい ては、花本、Ｔｏ等（前出）参照。

ＣＧＴの細胞外形態のＮ−末端アミノ酸配列は、ペプチド・シーケンサ−により 見出される。ＮＨｘ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅ ｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｖａ ｌ−１１ｅは、ＤＮＡ配列から導かれたもの（残基１−１７）と同一である。こ の結果は、２７アミノ酸残基（残基−２７〜−Ｉ）が、ＣＧＴ分泌中に除かれる シグナル・ペプチドを表すことを示している。ＤＮＡ配列から計算された成熟Ｃ ＧＴの分子量は６３３１８である。

シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼのアミノ酸配列の一部分に基 づいてプローブを製造し、これを用いてこの酵素の暗号化配列を単離する。別法 として、ベータ・シクロデキストリン・グルコトランスフェラーゼ暗号化配列を 、逆転写後に単離する。

この暗号化配列を含むフラグメントを単離し、実施例５．６または７で製造され たベクターにおけるウィルス・コート蛋白質遺伝子のプロモーターの隣にクロー ン化する。

実施例１２ シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ暗号化配列を含むウィルスの 製造。

ドーラン、Ｗ、Ｏ，等（１９８６年、前出）記載の技術に従い、ラムダＰＲプロ モーターを、実施例８のキメラ・ヌクレオチド配列に結合する。生成したベクタ ーを用いて、この場合生産細胞であるエシェリヒア・コリを形質転換する。

実施例５．６または７で単離されたウィルス・コート蛋白質暗号化配列を、ベク ターｐＢＲ３２２におけるｌａｃプロモーターの隣に挿入することにより、第二 ベクターを製造する。このベクターを用いて、対応する適合可能なキメラ・ヌク レオチド配列を含むベクターを存する生産細胞を形質転換する。生産細胞を生長 させ、生産されたウィルスを分離する。

実施例１３ シクロデキストリンの製造。

実施例１２で単離されたウィルスを用いて、トウモロコシ植物（ＯＭＶまたはＲ Ｎ　Ｖに基づくウィルス）またはジャガイモ植物（ＰＶＹまたはＰｖＸに基づく ウィルス）を感染させる。感染した植物を通常の生長条件下で生育する。これら の植物は、植物組織において澱粉のシクロデキストリンへの変換を触媒するシク ロデキストリン・グルコトランスフェラーゼを生産する。シクロデキストリンを 慣用的技術により分離する。

実施例１４ ＴＭＶおよびクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼのキメラ・ヌ クレオチド配列の製造。

実施例４の記載に従い、非伝染性ＴＭＶヌクレオチド配列（ｐＴＭｖｓ３−２８ ）を製造する。次いで、先に除去されたコート蛋白質遺伝子（Ｓ３−ＣＡＴ−２ ８）の代わりにクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ） 遺伝子を含むキメラ・ヌクレオチド配列を製造する。

ＣＡＴ遺伝子を５ａｌＩによりｐｃＭｌ（ファルマシア）から除去し、ＸｈｏＴ により開裂された実施例４からのヌクレオチド配列にライゲーションする。この 構築物はｐＴＭＶＳ３−ＣＡＴ−２８を生産し、そこから突然変異体ｃｐ　Ｓ　 ３−ＣＡＴ’　−２８が転写される。サグルスキー、Ｒ，Ｊ　等、「ジーン・ア ナル、チクノル、」、粟、８９（１９８５年）による記載に従った配列決定法に より、正確な配列および配向を確認する。

次いで、ＰＭプロモーターＥアールキスト、Ｐ９等、「モレキュラー・アンド・ セルラー・バイオロジー」、土、２８７６（１９８４年）コおよびエシェリヒア ・コリのＲＮＡポリメラーゼ［ドーラン、Ｗ。

０、等１．「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナンヨナル・アカデミ−・オブ・ サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・エイｊ、８３、＋８３２（１９８６年 ）コを用いて、このキメラ・ヌクレオチド配列を転写することにより、感染性キ メラＲＮＡを製造する。冷１％ピロ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９，０＋１％ベ ントナイトおよび１％セライト中で葉を押し潰し、迅速に接種することにより、 感染性を検定する。別法として、感染性は、同緩衝液中フェノール抽出ＲＮキメ ラＲＮ　Ａは、タバコ葉において効果的に複製することが判る。

ＲＮＡは植物から植物へと連続的に伸長し得るか、またはフェノール抽出後に貯 蔵され得る。しかしながら、ピリオンは感染した植物においては生産されない。

キメラＲＮ　Ａは、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼとして 明確に同定され得る５ＤＳ−ＰＡＧＥ中でのバンドを生じる。しかしながら、機 能的酵素活性は、アセチルＣｏＡによりＩ４０−クロラムフェニコールをアセチ ル化した植物抽出物において検出され得る。

実施例Ｉ５ クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼを含むウィルスの製造。

ドーラン、Ｗ、０１等、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ ミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・エイ」、８３，１８３２ （１９８６年）により記載された技術に従い、ラムダＰＲプロモーターを、実施 例工４のキメラ・ヌクレオチド配列に結合する。生成したベクターを用いて、生 産細胞、エシェリヒア・コリを形質転換する。

ウィルス・コート蛋白質暗号化配列（実施例４で単離）を、ベクターｐＢＲ３２ ２におけるｌａｃプロモーターの隣に挿入することにより、第二ベクターを製造 する。このベクターを用いて、キメラ・ヌクレオチド配列を含む第一ベクターを 有するエシェリヒア・コリ生産細胞を形質転換する。生産細胞を生長させ、生産 されたウィルスを分離する。別法として、第二ベクターを用いて、コート蛋白質 を生産するエシェリヒア・コリの第二株を形質転換する。次いで、コート蛋白質 およびウィルスベクターを合わせることにより、ウィルスを形成する。

実施例１６ クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼの製造。

実施例Ｉ５で分離されたウィルスを用いて、タバコ植物を感染させる。感染しｆ コ植物を通常の生長条件下で生育する。これらの植物は、酵素クロラムフェニコ ール・アセチルトランスフェラーゼを生産する。この酵素は、慣用的技術を用い て植物から分離される。

実施例１７ 非感染性東部ウマ脳炎ウィルス・ヌクレオチド配列の製造。

チャンク、Ｇ−Ｊ、Ｊ、等、「ジャーナル・オブ・ジェネラル・パイロロジー」 、ｉ且、２１２９（１９８７年）による記載に従い、東部ウマ脳炎ウィルス（Ｅ ＥＥＶ）ゲノムの完全長ｃＤＮＡコピーを製造し、ｐＵｃ１８のＰｓｔＩ部位に 挿入する。ウィルス・コート蛋白質およびその隣のＥｌおよびＥ２糖蛋白質伝染 性因子の配列を、２６Ｓ　　ＲＮＡ領域に対応する領域に並べる。ＥＥＥＶゲノ ムのｃＤＮＡコピーを含むベクターを適当な制限酵素およびエキソヌクレアーゼ で消化することにより、コート蛋白質並びにＥｌおよびＥ２蛋白質の暗号化配列 （構造蛋白質暗号化配列）を欠失させる。

例えば、Ｍｂｏｌで部分消化することにより構造蛋白質暗号化配列を除去し、次 いで再ライゲーションして構造遺伝子の活性部分を除去する。別法として、ベク ターをウィルス構造遺伝子の３゛末端で切断する。続いて、構造蛋白質配列の出 発コドンまでＢａ１３１またはミクロコツカスＳｌヌクレアーゼで消化すること によりウィルスＤＮＡを除去する。次いで、ウィルス３°−テイルの配列を含む ＤＮＡ配列を残りの５゛−末端にライゲーションする。ＥＥＥＶ　　ＲＮＡを分 離し、それを用いてウマ細胞培養を感染させることにより、構造蛋白質の暗号化 配列の欠失を確認する。分離されたＥＥＥＶＲＮＡは、自然条件下では非感染性 であることが判る。

別法として、コート蛋白質の暗号化配列のみを欠失させ、ＥｌおよびＥ２糖蛋白 質の配列を、ＥＥＥＶゲノムのｃＤＮＡコピーを含ムヘクターに残す。この場合 、Ｍ　ｂｏ　Ｉで部分消化することによりコート蛋白質暗号化配列を除去し、次 いで再ライゲーションしてウィルスの３゛−ティルを再結合する。これにより、 コート蛋白質遺伝子の活性部分が除去される。

コート蛋白質配列のみを除去する第二の別法は、ウィルス・コート蛋白質遺伝子 の３゛−末端においてベクターを切断する方法である。コート蛋白質配列の出発 コドンまでＢａ１３１またはミクロコツカスＳ１ヌクレアーゼで消化することに より、ウィルスＤＮＡを除去する。次いで、３′−テイルの配列を含む合成りＮ Ａ配列を残りの５゛−末端にライゲーションする。

Ｅ　Ｅ　Ｅ　Ｖ　ＲＮ　Ａを分離し、それを用いてウマ細胞培養を感染させるこ とにより、コート蛋白質の暗号化配列の欠失を確認する。分離されたＥＥＥＶ　 ＲＮＡは、自然条件下では非感染性であることが判る。

実施例１８ 非伝染性シンドビス・ウィルス・ヌクレオチド配列の製造。

リンドキスト、Ｂ、Ｈ，等、「パイロロジー」、１５１．１０（１９８６年）に よる記載に従い、シンドビス・ウィルス・ゲノムの完全長ｃＤＮＡコピーを製造 し、ｐＢＲ３２２から誘導されたプラスミドの５ＩＩｌａ■部位に挿入する。ウ ィルス・コート蛋白質並びに隣接するＥｌおよびＥ２糖蛋白質伝染性因子の配列 を、２６Ｓ　　ＲＮＡ領域に対応する領域に並べる。シンドビス・ウィルス・ゲ ノムのｃＤＮＡコピーを含むベクターを適当な制限酵素およびエキソヌクレアー ゼで消化することにより、構造蛋白質の暗号化配列を欠失させる。

例えば、ＢｉｎＩにより部分消化し、次いで再ライゲーションして構造蛋白質暗 号化配列を除去することにより、構造遺伝子の活性部分を除去する。別法として 、ベクターをウィルス核酸の３′末端で切断する。構造蛋白質配列の出発コドン までＢａ１３１またはミクロコツカスＳ１ヌクレアーゼで消化することによりウ ィルスＤＮＡを除去する。次いで、ウィルス３゛−テイルの配列を含む合成りＮ Ａ配列を残りの５゛−末端にライゲーションする。シンドビスＲＮＡを単離し、 それを用いてトリ細胞培養を感染させることにより、構造蛋白質暗号化配列の欠 失を確認する。分離されたンンドビスＲＮＡは、自然条件下で非感染性であるこ とが判る。

別法として、コート蛋白質の暗号化配列のみを欠失させ、ＥｌおよびＥ２糖蛋白 質の配列を、ンンドビス・ゲノムのｃＤＮＡコピーを含むベクターに残す。この 場合、Ａｆｌｌｌで部分消化することによりコート蛋白質暗号化配列を除去し、 次いで再ライゲーションしてウィルスの３゛−テイルを再結合する。

コート蛋白質配列のみを除去する第二の別法は、ウィルス核酸の３″−末端にお いてベクターを切断する方法である。コート蛋白質配列の出発コドン（全部の構 造蛋白質の配列の場合と同じ出発コドン）までＢａ１３１またはミクロコツカス Ｓｌヌクレアーゼで消化することにより、ウィルスＤＮＡを除去する。次いで、 ３°−テイルの配列を含む合成りＮＡ配列を残りの５°−末端にライゲーション する。

シンドビスＲＮ　Ａを分離し、それを用いてトリ細胞培養を感染させることによ り、コート蛋白質の暗号化配列の欠失を確認する。分離されたシンドビスＲＮ　 Ａは、自然条件下で非感染性であることが判る。

実施例１９ 非伝染性西部ウマ脳炎ウィルス・ヌクレオチド配列の製造。

バーン、Ｃ，Ｓ、等、「ブロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ −・オブ・サイエンンーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・エイ」、８５．５９９７（ １９８８年）による記載に従い、西部ウマ脳炎ウィルス（ＷＥＥＶ）ゲノムの完 全長ｃＤＮＡコピーを製造する。

ウィルス・コート蛋白質並びにその隣のＥｌおよびＥ２糖蛋白質伝染性因子の配 列を、２６Ｓ　　ＲＮＡ領域に対応する領域に並べる。

Ｗ　Ｅ　Ｅ　Ｖゲノムのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａコピーを含むベクターを適当な制限酵素 およびエキソヌクレアーゼで消化することにより、コート蛋白質並びにＥｌおよ びＥ２蛋白質の暗号化配列（構造蛋白質暗号化配列）を欠失させる。

例えば、ＮａｃＩにより部分消化し、次いで再ライゲーションして構造蛋白質暗 号化配列を除去することにより、構造蛋白質配列の活性部分を除去する。別法と して、ベクターを構造蛋白質ＤＮＡ配列の３′末端で切断する。構造蛋白質配列 の出発コドンまでＢａ１３１またはミクロコツカスＳｌヌクレアーゼで消化する ことにより、ウィルスＤＮＡを除去する。次いで、ウィルス３゛−テイルのＤＮ Ａ配列を含むＤＮＡ配列を残りの５°−末端にライゲーションする。

Ｗ　Ｅ　Ｅ　Ｖ　　ＲＳ　Ａを分離し、それを用いてベロ細胞培養を感染させる ことにより、構造蛋白質の暗号化配列の欠失を確認する。分離さｎｌ；＼ＶＥＥ Ｖ　　ＲＮＡは、自然条件下では非感染性であることが判る。

別法として、コート蛋白質の暗号化配列のみを欠失させ、ＥｌおよびＥ２糖蛋白 質の配列を、ＷＥＥＶゲノムのｃＤＮＡコピーを含むベクターに残す。この場合 、Ｈｇ１ＡＩで部分消化することによりコート蛋白質暗号化配列を除去し、次い で再ライゲーションしてウィルスの３゛−テイルを再結合する。

コート蛋白質配列のみを除去する第二の別法は、ウィルス・コート蛋白質配列の ３”−末端においてベクターを切断する方法である。

コート蛋白質配列の活性部分までＢａ１３１またはミクロコツカスＳｌヌクレア ーゼで消化することにより、ウィルスＤＮＡを除去する。

次いで、３゛−テイルの配列を含む合成り　Ｎ　Ａ配列を、残りの５”−末端に ライゲーションする。

ＷＥＥＶ　　ＲＮＡを分離し、それを用いてベロ細胞培養を感染させることによ り、コート蛋白質の暗号化配列の欠失を確認する。分離されｆ二ｗＥＥｖ　　Ｒ ＮＡは、自然条件下では非感染性、すなわち生物学的に封じ込められていること が判る。

実施例２０ チロシナーゼ暗号化配列を含むキメラヌクレオチド配列の製造。

チロシナーゼ暗号化配列を実施例８の記載に従い単離し、実施例Ｉ７．１８およ び１９で製造されたベクターにおけるウィルス・コート蛋白質遺伝子のプロモー ターの隣にクローン化する。

実施例２１ チロシナーゼを含むウィルスの製造。

慣用的技術に従い、プロモーターを実施例２０のキメラ・ヌクレオチド配列に結 合する。生成したベクターを用いて、この場合酵母である生産細胞を形質転換す る。

実施例１７．１８および１９で単離された、ウィルス構造蛋白質暗号化配列を、 ベクターｐＡＨ５［アンメラー、Ｇ等、「メソツズ・イン・エンザイモロジー」 、１０１，１９２（１９８３年）］におけるＡＤＣＩプロモーターの隣に挿入す ることにより、第二ベクターを製造する。このベクターを用いて、適合可能なキ メラ・ヌクレオチド配列を含むベクターを有する生産細胞を形質転換する。生産 細胞を生長させ、生産されたウィルスを単離する。別法として、第二ベクターを 用いることにより、構造蛋白質を生産する第二株の酵母を形質転換する。次いで 、構造蛋白質およびウィルスベクターを合わせることにより、ウィルスを形成す る。

実施例２２ メラニンのインビトロ製造。

キメラ・ヌクレオチド配列およびコート蛋白質の組み合わせにより作成され、実 施例２１で単離されたウィルスを用いることにより、ウマ細胞培養（ＥＥＥＶお よびＷＥＥＶに基づくウィルス）またはトリ細胞培養（シンドビス・ウィルスに 基づくウィルス）を感染させる。

感染した細胞培養を通常の細胞培養生長条件下で生長させる。これらの細胞はチ ロシナーゼを生産し、これが細胞に存在する成分と反応して中間体を生成し、次 いでこれがメラニンに変換される。慣用的技術によりメラニンを単離する。

実施例２３ メラニンのインビボ製造。

キメラ・ヌクレオチド配列および構造蛋白質（コート蛋白質、Ｅｌ糖蛋白質およ びＥ２糖蛋白質）の組み合わせにより作成され、実施例２１で単離されたウィル スを用いることにより、ウマ（ＥＥＥＶおよびＷＥＥＶに基づくウィルス）また はニワトリ（シンドビス・ウィルスに基づくウィルス）を感染させる。感染した 動物を通常条件下（すなわち、食物摂取、運動、睡眠など）で維持する。これら の動物はチロシナーゼを生産し、これが動物に存在する成分と反応して中間体を 生成し、次いでこれがメラニンに変換される。メラニンは慣用的技術により分離 される。

実施例２４ ヒト組織プラスミノテン活性化因子（ｔ−ＰＡ）暗号化配列を含むキメラ・ヌク レオチド配列の製造。

ヒト組織プラスミノテン活性化因子の暗号化配列を、プラスミドｐｊ−ＰＡｔｒ ｐｌ　２、ＡＴＣＣ第４０４０４号（アメリカ合衆国特許第４７６６０７５号） から単離し、実施例１７．１８またはＩ９で製造されたベクターにおけるウィル ス・コート蛋白質遺伝子のプロモーターの隣にクローン化する。

実施例２５ ヒトｔ−ＦＡ暗号化配列を含むウィルスの製造。

実施例２１記載の方法に従い、ヒトｔ−ＦＡ暗号化配列を含むウィルスを製造す る。

実施例２６ ヒトｔ−ＦＡのインビトロ製造。

キメラ・ヌクレオチド配列およびコート蛋白質の組み合わせにより作成され、実 施例２５で単離されたウィルスを用いることにより、ウマ細胞培養（ＥＥＥＶお よびＷＥＥＶに基づくウィルス）またはトリ細胞培養（シンドビス・ウィルスに 基づくウィルス）を感染させる。

感染した細胞培養を通常の細胞培養条件下で生長させる。これらの細胞はヒトｔ −ＰＡを生産する。これは慣用的技術により分離される。

実施例２７ ヒトｔ−ＰＡのインビボ製造。

キメラ・ヌクレオチド配列および構造蛋白質（コート蛋白質、Ｅ■糖蛋白質およ びＥ２糖蛋白質）の組み合わせにより作成され、実施例２５で分離されたウィル スを用いることにより、ウマ（ＥＥＥ■およびＷＥＥＶに基づくウィルス）また はニワトリ（シンドビス・ウィルスに基づくウィルス）を感染させる。感染した 動物を通常条件下（すなわち、食物摂取、運動、睡眠など）で維持する。これら の動物は、慣用的技術により分離されるヒトｔ−ＰＡを生産する。

実施例２８ 非感染性ヒト・ライノウィルス２ヌクレオチド配列の製造。

ヒト・ライノウィルス２（ＨＲＶ２）ゲノムの完全長ｃＤＮＡコピーを製造し、 スカーノ、Ｔ等、「ヌクレイツク・アンッズ・リサーチ」、１３，２１１１（１ ９８５年）による記載に従い、プラスミドｐＵＣ９のｐｓｔ１部位に挿入する。

ウィルス・コート蛋白質ＶＰＩのヌクレオチド配列を、ゲノムの２６４４位に導 入する。ＨＲＶ２ゲノムのＤＮＡコピーを含むベクターを適当な制限酵素および エキソヌクレアーゼで消化することにより、コート蛋白質暗号化配列を欠失させ る。

例えば、適当な制限エンドヌクレアーゼで部分消化することによりコート蛋白質 暗号化配列を除去し、次いで再ライゲーションして、コート蛋白質配列の活性部 分を除去する。別法として、ベクターをウィルス・コート蛋白質遺伝子の３°末 端で切断する。コート蛋白質配列の出発コドン（プロモーター）までＢａ１３１ またはミクロコツカスＳｌヌクレアーゼで消化することにより、ウィルスＤＮＡ を除去する。次いで、ウィルス３′−テイルの配列を含む合成りＮＡ配列を残り の５”−末端にライゲーションする。Ｉ−ＩＲＶ２　　ＲＮＡを単離し、それを 用いてヒト細胞培養を感染させることにより、コート蛋白質の暗号化配列の欠失 を確認する。単離されたＨＲＶ２　　ＲＮＡは、自然条件下で非感染性であるこ とが判る。

実施例２９ チロシナーゼ暗号化配列を含むキメラヌクレオチド配列の製造。

実施例８の記載に従いチロシナーゼ暗号化配列を単離し、実施例２８で製造され Ｌベクターにおけるウィルス・コート蛋白質遺伝子のプロモーターの隣にクロー ン化する。

実施例３０ チロシナーゼ含有ウィルスの製造。

実施例２１の記載に従い、実施例２８および２９で製造された出発原料を用いて チロシナーゼ暗号化配列を含むＨＲＶ２に基づくウィルスを製造する。

実施例３１ メラニンの製造。

実施例３０で単離されたウィルスを用いて、ヒト細胞培養を感染させる。感染し た細胞はチロシナーゼを生産し、これがヒト細胞に存在する成分と反応して中間 体を生成し、次いでこれらは細胞においてメラニンに変換される。メラニンは、 慣用的技術により単離される。

実施例３２ ヒトｔ−ｐＡ暗号化配列を含むキメラヌクレオチド配列の製造。

実施例２４の記載に従いヒトｔ−ＰＡの暗号化配列を単離し、実施例２８で製造 されたベクターにおけるウィルス・コート蛋白質遺伝子のプロモーターの隣にク ローン化する。

実施例３３ ヒトｔ−ＦＡ暗号化配列を含むウィルスの製造。

実施例３０の方法に従い、ヒトｔ−ＰＡ暗号化配列を含むウィルスを製造する。

実施例３４ ヒトｔ−ＰＡの製造。

実施例３３で単離されたウィルスを用いることにより、ヒト細胞培養を感染させ る。感染しん細胞を通常の生長条件下で生育する。

これらの細胞は、慣用的技術により単離されるヒトｔ−ＰＡを生産する。

実施例３５ 非感染性ポリオウィルス２型ヌクレオチド配列の製造。

ポリオウィルス２型（ＰＶ２）ゲノムの完全長ｃＤＮＡコピーを製造し、豊田、 Ｈ等、［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ口ドｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ ｌ１１部位に挿入する。ウィルス・コート蛋白質ＶＰＩのヌクレオチド配列を、 ゲノムの２４９９位に導入する。

ＰＶ２ゲノムのＤＮＡコピーを含むベクターを適当な制限酵素およびエキソヌク レアーゼで消化することにより、コート蛋白質暗号化配列を欠失させる。プロテ アーゼ消化配列を無傷で残すことか重要である。

例えば、適当な制限エンドヌクレアーゼで部分消化し、次いで再ライゲーション してウィルスの３”−テイルを再結合することにより、コート蛋白質暗号化配列 の一部を除去する。ＰＶ２　　ＲＮＡを単離し、それを用いて撹はん培養したヒ ーラ　Ｓ３細胞を感染させることにより、コート蛋白質の暗号化配列の欠失を確 認する。単離されたＰＶ２　　ＲＮＡは、自然条件下で非感染性、すなわち生物 学的に封じ込められていることが判る。

実施例３６ チロシナーゼ暗号化配列を含むキメラヌクレオチド配列の製造。

実施例８の記載に従いチロシナーゼ暗号化配列を単離し、実施例３５で製造され ｆこベクターにおけるウィルス・コート蛋白質遺伝子のプロモーターの隣にクロ ーン化する。

実施例３７ チロシナーゼ含有ウィルスの製造。

実施例２１の記載に従い、実施例３５および３６で製造された出発原料を用いて チロシナーゼ暗号化配列を含むＰＶ２に基づくウィルスを製造する。

実施例３８ メラニンの製造。

実施例３７で単離されたウィルスを用いて、撹はん培養したヒーラＳ３細胞を感 染させる。感染した細胞はチロシナーゼを生産し、これが細胞に存在する成分と 反応して中間体を生成し、次いでこれらは細胞においてメラニンに変換される。

メラニンは、慣用的技術により単離される。

実施例３９ ヒトｔ−ＦＡ暗号化配列を含むキメラヌクレオチド配列の製造。

実施例２４の記載に従いヒトｔ−ＰＡの暗号化配列を単離し、実施例３５で製造 されたベクターにおけるウィルス・コート蛋白質遺伝子のプロモーターの隣にク ローン化する。

実施例４０ ヒ）ｔ−ＦＡ暗号化配列を含むウィルスの製造。

実施例３７の方法に従い、ヒ）ｔ−ＦＡ暗号化配列を含むウィルスを製造する。

実施例４１ ヒトｔ−ＦＡの製造。

実施例４０のウィルスを用いることにより、撹はん培養したヒーラＳ３細胞を感 染させる。感染しに細胞を通常の生長条件下で生育する。これらの細胞は、慣用 的技術により単離されるヒトｔ−ｐＡを生産する。

実施例４２ 非感染性サルウィルス４０ヌクレオチド配列の製造。

サルウィルス４０（ＳＶ４０）ゲノムの完全長ｃＤＮＡコピーを製造し、ワイチ ョプスキー、Ｃ１等、「ジャーナル・オブ・パイロロジー」、旦、３８６２（１ ９８７年）による記載に従いプラスミドｐＣＷ１８のＡｃｃ１部位に挿入する。

ウィルス・コート蛋白質ＶＰ１のヌクレオチド配列を、ゲノムの１４８８位およ び２５７４位間に導入する。ＳＶ４０ゲノムのＤＮＡコピーを含むベクターを、 適当な制限酵素およびエキソヌクレアーゼで消化することにより、コート蛋白質 暗号化配列を欠失させる。

例えば、ＢａｍＨＩヌクレアーゼで部分消化することにより、ＶＰ１コート蛋白 質暗号化配列を除去し、次いでＥｃｏＲＪで処理し、フレノウ酵素で充填し、再 び環状にする。Ｓ　Ｖ　４０　ＲＮ　Ａを単離し、それを用いてサル細胞培養を 感染させることにより、コート蛋白質ＶＰＩの暗号化配列の欠失を確認する。単 離されたＳ　Ｖ　４０　ＲＮ　Ａは、自然条件下で非感染性、すなわち生物学的 に封じ込められていることが判る。

実施例４３ チロシナーゼ暗号化配列を含むキメラヌクレオチド配列の製造。

実施例８の記載に従いチロシナーゼ暗号化配列を単離し、実施例４２で製造され たベクターにおけるウィルス・コート蛋白質遺伝子のプロモーターの隣にクロー ン化する。

実施例４４ チロシナーゼ含有ウィルスの製造。

実施例２１の記載に従い、チロシナーゼ暗号化配列を含み、５ｖ４０に基づくウ ィルスを製造する。実施例４３のキメラ・ヌクレオチド配列および実施例４２て 単離されたコート蛋白質暗号化配列を利用する。

実施例４５ メラニンの製造。

実施例４４で単離されたウィルスを用いて、サル細胞培養を感染させる。感染し た細胞はチロシナーゼを生産し、これが細胞に存在する成分と反応して中間体を 生成し、次いでこれらは細胞においてメラニンに変換される。メラニンは、慣用 的技術により単離される。

実施例４６ ヒトｔ−ＰＡ暗号化配列を含むキメラヌクレオチド配列の製造。

実施例２４の記載に従いシクロデキストリン・グルコトランスフェラーゼの暗号 化配列を単離し、実施例４２で製造されたベクターにおけるウィルス・コート蛋 白質遺伝子のプロモーターの隣にクローン化する。

実施例４７ ヒ）ｔ−ＰＡ暗号化配列を含むウィルスの製造。

実施例４４の方法に従い、ヒトｔ−ＰＡ暗号化配列を含むウィルスを製造する。

実施例４８ ヒトｔ−ＦＡの製造。

実施例４７のウィルスを用いることにより、サル細胞培養を感染させる。感染し た細胞を通常の生長条件下で生育する。これらの細胞は、慣用的技術により単離 されるヒトｔ−ＰＡを生産する。

実施例４９ カプシド蛋白質遺伝子によるニコチアナ・トバクムの形質転換。

タバコ・モザイクウィルス（ＴＭＶ）のカプシド蛋白質は、５７１２および６１ ９０間のヌクレオチド配列によりコード化される。ＲＮＡゲノムの３′−未翻訳 領域はヌクレオチド６３９５に伸びる。

ヌクレオチド５７０１−６３９５を含み、カプシド蛋白質を暗号化するンストロ ンの２本鎖（ｄｓ）相補的ＤＮＡ、（ｃＤＮＡ）は、逆転写酵素を用いてＴＭＶ −ＲＮＡから生成される。この転写酵素は、ウィルスＲＮＡの３°末端のオリゴ ヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチド・プライマーを含み、ＢａｍＨ １部位を含む。

ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ・フラグメントを用いて、第２ＤＮＡ鎖を合成す る。ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡのＨｉｎｄｌｌｌ−ＢａｍＨＩフラグメントを、プラスミド ｐｔｔ　Ｃ９［ビエイラ、Ｊ９等、「ジーンＪ１　限、２５９（１９８２年）］ にクローン化する。生成したプラスミドをヌクレオチド５７０７のＡ］ａｌｌＩ ニゲ−レット、Ｐ等、「プロン−ディンゲス・オブ・ザ・ナンヨナル・アカデミ −・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・エイ１．７９．５８１８（ １９８２年）：およびＢａｒａＨＩで消化することにより、カプシド蛋白質の配 列を除去する。このフラグメントをベクターｐＭＯＮ２３７にライゲーションす る。

ｐＭＯＮ２３７は、ｐＭＯＮ２００の誘導体である［ホルシュ、ＲｏＢｌ等、「 サイエンス」、ス主ヱ、＋２２９（１９８５年）］。このベクターは、３°末端 に１９ＳＣａＭＶプロモーター、ポリリンカー配列およびツバリン・シンテーゼ （ＮＯ８）の配列を含む。ライゲーションは、プラントにされたＸｂａＩ部位お よびＢａａ＋Ｈ１部位で行なわれる。カプシド蛋白質暗号化配列は、ＸｂａＩお よびＢａｍＨＩで消化することによりプラスミドから除去され、適当なプラスミ ドへの導入により５°末端のＢｇｌ１１部位および３゛末端のＥｃｏＲ１部位が 与えられる。

Ｂｇｌｌｌ　−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよび Ｎ０Ｓ３°未翻訳領域間におＩＪる発現カセット・ベクターｐＭＯＮ３１６に導 入する［ロノヤーズ、Ｓ、Ｇ、等、１バイオテクノロジー・イン・プラント・サ イエンス・レレバンス・トウ・アグリカルチャー・イン・ザ・ナインティーン・ エイティーズ」、Ｍ、ツァイトリン、Ｐ、ディ、Ａ、示−レンダー編、アカデミ ツク・プレス、ニューヨーク、２１９頁（１９８６年）］。生成したキメラ遺伝 子は、ＣａＭＶからの３５ＳプロモーターおよびＮ　ＯＳ遺伝子からのポリアデ ニル化ングナルを含む。生成したプラスミドを、アームをもたないｐＴｉ　ＢＧ Ｓ３−５Ｅプラスミドを荷するアグロバクテリウム・ツメファシェンス株ＧＶ３ １１１に組み込む［フラレイ、Ｒ，Ｔ、等、「バ形質転換されたアグロバクテリ ウム・ツメファシェンスを抗生物質耐性に関して選択する。選択されたコロニー を用いて、ニコチアナ・トバクムの葉の円盤状組織を形質転換し、次いでこれら を総体植物中で再生させる［ホルンユ、ＲＢ６等、前出、アベル、ｐ、ｐ。

等、「サイエンス」、里、７３８（１９８６年）コ。

ＴＭＶカプシド蛋白質の配列により形質転換され几アグロバクテリウム・ツメフ ァシェンスを生産細胞として使用する。同様に、ＴＭＶカプシド蛋白質の配列に より形質転換されたタバコ細胞を、カプシド蛋白質単量体または多量体製造用の 生産細胞として使用する。

カプシド蛋白質数および生産のタイミングは、当業界でよく知られた方法により 制御され得る（マニアチス、Ｔ９等、前出）。温度感受性リプレッサーおよび強 力なプロモーターを適切に選択すると、所望された場合のみ高いコピー数のプラ スミドおよび高い翻訳速度が達成される。

実施例５０ 包膜されたウィルス粒子の製造。

実施例４９で得られた形質転換タバコ細胞の原形質体（プロトプラスト）を、１ ２−３０ナノモルＭｇＣＩｔを含む０．５Ｍマンニトール溶液に再懸濁する。５ 分間４５℃の熱ショックを与える。これらの原形質体を、１管当たり０　、３　 ｘＱの懸濁原形質体の量で、遠心分離管における形質転換用アリコートに分配す る。次の１０分の間に、次のものを加える。ＴＭＶゲノムをコードするｃＤＮＡ を含むが、カプシド蛋白質の遺伝子を失い、キメラ遺伝子構築物を含む、実施例 １で得られたプラスミド、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液（分子 量６０００．４０％（ｗ／ｖ）、０．１モルＣａ（ＮＯｓ）ｔおよび０．４モル ・マンニトール含有、ＫＯＨによりｐＨ８−９）（２０％ＰＥＧの最終濃度とす る）。アリコートを３０分間時折静かに振り混ぜながらインキュベーションし、 次いで原形質体をベトリ皿（６Ｃｘ直径の皿１枚当たり元の原形質体懸濁液０　 、３　ｘＱ）に載せ、培養する。慣用的技術を用いて包膜されたウィルス粒子を 原形質体から分離する。

別法として、実施例４９で製造された形質転換植物を、ウィルス核酸、例えば実 施例３のキメラヌクレオチド配列により感染させる。

核酸を複製し、核酸を包膜するコート蛋白質を生成させる。慣用的技術を用いて 包膜されたウィルス粒子を分離する。

実施例５ル プリカーゼ遺伝子によるニコチアナ・トバクムの形質転換。

タバコ・モザイクウィルスの２つのレプリカーゼ・サブユニットを、７０および ４９１９間のヌクレオチド配列によりコードする。

１３０−ｋＤ蛋白質のヌクレオチド配列はアンバーコドンにおいて終止し、抑圧 されることにより＋８Ｏ−ｋＤ蛋白質を生じ得る。逆転写酵素を用いることによ り、ヌクレオチド７０〜４９１９を含み、レブリカーゼをコードするシストロン の２本鎖（ｄｓ）相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をＴＭＶ　　ＲＮＡから生成する。

転写酵素は、ウィルスＲＮＡの３°末端のオリゴヌクレオチド配列に相補的なオ リゴヌクレオチド・ブライマーを含み、Ｂａａ＋ＨＩ部位を含む。Ｄ　Ｎ　Ａポ リメラーゼのフレノウ・フラグメントを用いて、第二のＤＮＡ鎖を合成する。ｃ ＤＮＡのＨ１ｎｄｌ　ｌＩ−Ｂ　ａｍＨＩフラグメントをプラスミドｐＵＣ９に クローン化する［ビエラ、Ｊ５等、「ジーン」、１旦、２５９（１９８２年）］ 。生成したプラスミドを、ヌクレオチド４９１９のＡｌａｌｌｌｒゲーレット、 Ｐｌ等、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナンヨナル・アカデミ−・オブ・サ イエンンーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・エイ」、Ｌユ、５８１８（１９８２年） ］およびＢａｍＨＩで消化することにより、カプシド蛋白質配列を除去する。

このフラグメントをベクターｐＭ　ＯＮ　２３７にライゲーションする。ｐＭＯ Ｎ２３７はｐＭＯＮ２００［ホルシュ、Ｒ，Ｂ、等、「サイエンス」、圀λ７， １２２９（１９８５年）］の誘導体である。このベクターは、３“末端に１９Ｓ ＣａＭＶプロモーター、ポリリンカー配列およびツバリン・シンターゼ（ＮＯＳ ）の配列を含む。ライゲーションは、プラントにされたＸｂａＩ部位およびＢａ ｍＨＩ部位で行なわれる。カプンド蛋白質暗号化配列は、Ｘ　ｂａ　ＩおよびＢ ａｍＨＩで消化することによりプラスミドから除去され、適当なプラスミドへの 導入により５゛末端のＢｇｌ１１部位および３°末端のＥｃｏＲＩ部位が与えら れる。Ｂｇｌｌｌ　−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター およびＮＯ３３’未翻訳領域間における発現カセット・ベクタ１）ＭＯＮ　３１ ６　＋、：導入すル［ロジャーズ、Ｓ、Ｇ、等、「バイオテクノロジー・イン・ プラント・サイエンス：レレバンス・トウ・アグリカルチャー・イン・ザ・ナイ ンティーン・エイティーズ」、Ｍ、ツァイトリン、Ｐ、ディ、Ａ、ホーレンダ− 編、アカデミツク・プレス、ニューヨーク、２１９頁（１９８６年）］。生成し たキメラ遺伝子は、ＣａＭＶからの３５ＳプロモーターおよびＮ　ＯＳ遺伝子か らのポリアデニル化ノグナルを含む。生成し１こプラスミドを、アームをもたな いｐＴｉ　ＢＧＳ３−ＳＥプラスミドを有するアグロバクテリウム・ツメファン エンス株ＧＶ３１１１に組み込む［フラレイ、Ｒ，Ｔ。

等、「バイオ・テクノロジー」、３，６２９頁（１９８５年）］。共組込みプラ スミドは、ＬＩＨ領域間の組換えによるものである。形質転換されたアグロバク テリウム・ツメファシェンスを抗生物質耐性に関して選択する。選択されたコロ ニーを用いて、ニコチアナ・トバクムの葉の円盤状組織を形質転換し、次いでこ れらを総体植物中で再生させる［ホルンユ、Ｒ，Ｂ、等、前出、アベル、Ｐ、Ｐ 、等、「サイエンス」、２３２．７３８（１９８６年）］。形質転換された宿主 は、生産細胞またはＴＭＶに基づくウィルス感染用宿主として使用され得る。安 定した状態で組み込まれたレプリカーゼは、ウィルス核酸の複製を高める機能を 有する。

実施例５２ 輸送蛋白質によるタバコ細胞の形質転換。

ヌクレオチド４９０３〜５７０９のＴＭＶのヌクレオチド配列は、ウィルスの細 胞間移動の容易化に関与する３Ｏ−ｋＤ蛋白質をコードする。実施例４９の方法 により作成された共組込みプラスミドを宵するアグロバクテリウムにより、ニコ チアナ・トバクムの葉の円盤状組繊細胞を形質転換する。こうして形質転換され たニコチアナ・トバクム細胞を、色層された欠損ウィルス粒子用宿主細胞として 使用する。

この発明についてその実施態様と関連させながら記載しんが、さらに修飾が可能 であることは明らかである。この出願は、概してこの発明の原理に従い、この発 明が関係する技術分野内でよく知られた習慣的な実践範囲内に含まれる程度の本 開示からの逸脱を含むこの発明の変形、用途まには適用性を全て包含するものと する。

国際調査報告 １００ｍｍ１＾−ｅ”ａｍ・−１−−・ＰＣＴ／υ５８９１００６９３国際調査 報告　　　ＵＳ　１１９００６９３

Claims (83)

【特許請求の範囲】
1. （１）複製可能であり、生物学的に封じ込められているウイルス・ヌクレオチド 配列との実質的配列相同性を有するヌクレオチド配列。
2. （２）ウイルス・ヌクレオチド配列が原核生物ウイルス・ヌクレオチド配列であ る、請求項１記載のヌクレオチド配列。
3. （３）ウイルス・ヌクレオチド配列が真核生物ウイルス・ヌクレオチド配列であ る、請求項１記載のヌクレオチド配列。
4. （４）ウイルス・ヌクレオチド配列が植物ウイルス・ヌクレオチド配列である、 請求項１記載のヌクレオチド配列。
5. （５）ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡから成る群から選ば れる、請求項１記載のヌクレオチド配列。
6. （６）ウイルス・ヌクレオチド配列が生物学的機能性ウイルス・コート蛋白質暗 号化配列を欠いている、請求項１記載のヌクレオチド配列。
7. （７）ウイルス・ヌクレオチド配列が、さらに生物学的機能性ウイルス伝染性因 子暗号化配列を欠いている、請求項６記載のヌクレオチド配列。
8. （８）複製可能であり生物学的に封じ込められているウイルス・ヌクレオチド配 列との実質的配列相同性を有する第一ヌクレオチド配列、およびウイルス・プロ モーターに隣接し、宿主において転写可能な暗号化配列である第二ヌクレオチド 配列を含む、キメラ・ヌクレオチド配列。
9. （９）ウイルス・ヌクレオチド配列が原核生物ウイルス・ヌクレオチド配列であ る、請求項８記載のキメラ・ヌクレオチド配列。
10. （１０）ウイルス・ヌクレオチド配列が真核生物ウイルス・ヌクレオチド配列で ある、請求項８記載のキメラ・ヌクレオチド配列。
11. （１１）ウイルス・ヌクレオチド配列が植物ウイルス・ヌクレオチド配列である 、請求項８記載のキメラ・ヌクレオチド配列。
12. （１２）キメラ・ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡから成る 群から選ばれる、請求項８記載のキメラ・ヌクレオチド配列。
13. （１３）ウイルス・ヌクレオチド配列が生物学的機能性ウイルス・コート蛋白質 暗号化配列を欠いている、請求項８記載のキメラ・ヌクレオチド配列。
14. （１４）ウイルス・ヌクレオチド配列が、さらに生物学的機能性ウイルス伝染性 因子暗号化配列を欠いている、請求項１３記載のキメラヌクレオチド配列。
15. （１５）ウイルス・プロモーターがウイルス・コート蛋白質プロモーターである 、請求項１３記載のキメラ・ヌクレオチド配列。
16. （１６）ウイルス・ヌクレオチド配列との実質的配列相同性を有し、複製可能で 生物学的に封じ込められている第一ヌクレオチド配列、およびウイルス・プロモ ーターに隣接し、宿主において転写可能な暗号化配列である第二ヌクレオチド配 列を有するキメラ・ヌクレオチド配列を含むウイルス。
17. （１７）ウイルス・ヌクレオチド配列が原核生物ウイルス・ヌクレオチド配列で ある、請求項１６記載のウイルス。
18. （１８）ウイルス・ヌクレオチド配列が真核生物ウイルス・ヌクレオチド配列で ある、請求項１６記載のウイルス。
19. （１９）ウイルス・ヌクレオチド配列が植物ウイルス・ヌクレオチド配列である 、請求項１６記載のウイルス。
20. （２０）キメラ・ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡから成る 群から選ばれる、請求項１６記載のウイルス。
21. （２１）ウイルス・ヌクレオチド配列が生物学的機能性ウイルス・コート蛋白質 暗号化配列を欠いている、請求項１６記載のウイルス。
22. （２２）ウイルス・ヌクレオチド配列が、さらに生物学的機能性ウイルス伝染性 因子暗号化配列を欠いている、請求項２１記載のウイルス。
23. （２３）ウイルス・プロモーターがウイルス・コート蛋白質プロモーターである 、請求項２１記載のウイルス。
24. （２４）生産細胞プロモーターおよび前記生産細胞と適合し得る複製開始点から 成る群から選ばれたヌクレオチド配列の隣にキメラ・ヌクレオチド配列を含むベ クターであって、前記キメラ・ヌクレオチド配列が、複製可能で生物学的に封じ 込められているウイルス・ヌクレオチド配列との実質的配列相同性を有する第一 ヌクレオチド配列、およびウイルス・プロモーターと隣接し、宿主において転写 可能な暗号化配列である第二ヌクレオチド配列を含むものであるベクター。
25. （２５）ウイルス・ヌクレオチド配列が原核生物ウイルス・ヌクレオチド配列で ある、請求項２４記載のベクター。
26. （２６）ウイルス・ヌクレオチド配列が真核生物ウイルス・ヌクレオチド配列で ある、請求項２４記載のベクター。
27. （２７）ウイルス・ヌクレオチド配列が植物ウイルス・ヌクレオチド配列である 、請求項２４記載のベクター。
28. （２８）キメラ・ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡから成る 群から選ばれる、請求項２４記載のベクター。
29. （２９）ウイルス・ヌクレオチド配列が生物学的機能性ウイルス・コート蛋白質 暗号化配列を欠いている、請求項２４記載のベクター。
30. （３０）ウイルス・ヌクレオチド配列が、さらに生物学的機能性ウイルス伝染性 因子暗号化配列を欠いている、請求項２９記載のベクター。
31. （３１）ウイルス・プロモーターがウイルス・コート蛋白質プロモーターである 、請求項２９記載のベクター。
32. （３２）生産細胞プロモーターおよび前記生産細胞と適合し得る複製開始点から 成る群から選ばれたヌクレオチド配列の隣にキメラ・ヌクレオチド配列を含むベ クターを有する生産細胞であって、前記キメラ・ヌクレオチド配列が、複製可能 で生物学的に封じ込められているウイルス・ヌクレオチド配列との実質的配列相 同性を有する第一ヌクレオチド配列、およびウイルス・プロモーターと隣接し、 宿主において転写可能な暗号化配列である第二ヌクレオチド配列を含むものであ る生産細胞。
33. （３３）ウイルス・ヌクレオチド配列が原核生物ウイルス・ヌクレオチド配列で ある、請求項３２記載の生産細胞。
34. （３４）ウイルス・ヌクレオチド配列が真核生物ウイルス・ヌクレオチド配列で ある、請求項３２記載の生産細胞。
35. （３５）ウイルス・ヌクレオチド配列が植物ウイルス・ヌクレオチド配列である 、請求項３２記載の生産細胞。
36. （３６）キメラ・ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡから成る 群から選ばれる、請求項３２記載の生産細胞。
37. （３７）ウイルス・ヌクレオチド配列が生物学的機能性ウイルス・コート蛋白質 暗号化配列を欠いている、請求項３２記載の生産細胞。
38. （３８）ウイルス・ヌクレオチド配列が、さらに生物学的機能性ウイルス伝染性 因子暗号化配列を欠いている、請求項３７記載の生産細胞。
39. （３９）ウイルス・プロモーターがウイルス・コート蛋白質プロモーターである 、請求項３７記載の生産細胞。
40. （４０）さらに、生産細胞プロモーターの隣にウイルス・コート蛋白質暗号化配 列を含む第二ベクターを有し、前記ウイルス・コート蛋白質が第一ヌクレオチド 配列と適合可能であり、生物学的機能性である、請求項３２、３７または３９記 載の生産細胞。
41. （４１）キメラ・ヌクレオチド配列の複製に有用なウイルス・レプリカーゼの暗 号化配列を含ませるべく安定した形で形質転換された、請求項３２、３７または ４０記載の生産細胞。
42. （４２）キメラ・ヌクレオチド配列と適合可能なウイルス・コート蛋白質の暗号 化配列を含ませるべく安定した形で形質転換された、請求項３２または３７記載 の生産細胞。
43. （４３）さらに、キメラ・ヌクレオチド配列の複製に有用なウイルス・レプリカ ーゼの暗号化配列を含ませるべく安定した形で形質転換された、請求項４２記載 の生産細胞。
44. （４４）さらに、キメラ・ヌクレオチド配列と適合可能なウイルス伝染性因子の 暗号化配列を含ませるべく安定した形で形質転換された、請求項３２または３７ 記載の生産細胞。
45. （４５）さらに、キメラ・ヌクレオチド配列の複製に有用なレプリカーゼの暗号 化配列を含ませるべく安定した形で形質転換された、請求項４４記載の生産細胞 。
46. （４６）キメラ・ヌクレオチド配列と適合し得るウイルス・コート蛋白質および ウイルス伝染性因子の暗号化配列を含ませるべく安定した形で形質転換された、 請求項３２または３７記載の生産細胞。
47. （４７）キメラ・ヌクレオチド配列と適合し得るレプリカーゼ、ウイルス・コー ト蛋白質およびウイルス伝染性因子の暗号化配列を含ませるべく安定した形で形 質転換された、請求項３２または３７記載の生産細胞。
48. （４８）キメラ・ヌクレオチド配列と適合し得るレプリカーゼ、ウイルス・コー ト蛋白質およびウイルス伝染性因子の暗号化配列を含ませるべく安定した形で形 質転換された、請求項３７記載の生産細胞。
49. （４９）ウイルス・ヌクレオチド配列との実質的配列相同性を有し、複製可能で 生物学的に封じ込められている第一ヌクレオチド配列、およびウイルス・プロモ ーターに隣接し、宿主において転写可能な暗号化配列である第二ヌクレオチド配 列を含むキメラ・ヌクレオチド配列を有する宿主。
50. （５０）ウイルス・ヌクレオチド配列が原核生物ウイルス・ヌクレオチド配列で ある、請求項４９記載の宿主。
51. （５１）ウイルス・ヌクレオチド配列が真核生物ウイルス・ヌクレオチド配列で ある、請求項４９記載の宿主。
52. （５２）ウイルス・ヌクレオチド配列が植物ウイルス・ヌクレオチド配列である 、請求項４９記載の宿主。
53. （５３）キメラ・ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡから成る 群から選ばれる、請求項４９記載の宿主。
54. （５４）ウイルス・ヌクレオチド配列が生物学的機能性ウイルス・コート蛋白質 暗号化配列を欠いている、請求項４９記載の宿主。
55. （５５）ウイルス・ヌクレオチド配列が、さらに生物学的機能性ウイルス伝染性 因子暗号化配列を欠いている、請求項５４記載の宿主。
56. （５６）ウイルス・プロモーターがウイルス・コート蛋白質プロモーターである 、請求項５４記載の宿主。
57. （５７）キメラ・ヌクレオチド配列の複製に有用なレプリカーゼの暗号化配列を 含ませるべく安定した形で形質転換された、請求項４９記載の宿主。
58. （５８）キメラ・ヌクレオチド配列の複製に有用なレプリカーゼの暗号化配列を 含ませるべく安定した形で形質転換された、請求項５４記載の宿主。
59. （５９）宿主における生成物の製造方法であって、（ａ）ウイルス・ヌクレオチ ド配列との実質的配列相同性を有し、複製可能で生物学的に封じ込められている 第一ヌクレオチド配列、およびウイルス・プロモーターに隣接し、宿主において 転写可能な生成物の暗号化配列である第二ヌクレオチド配列を含むキメラ・ヌク レオチド配列を含むウイルスにより宿主を感染させ、（ｂ）感染した宿主を生長 させることにより宿主に前記生成物を生産させることを含む方法。
60. （６０）トランスジェニック生産生物またはその一部における生成物の製造方法 であって、前記生物は、（ｉ）ウイルス・レプリカーゼ、（ｉｉ）ウイルス・コ ート蛋白質、（ｉｉｉ）ウイルス伝染性因子または（ｉｖ）これらの組み合わせ に関する１つまたはそれ以上の暗号化配列を含むものであり、（ａ）ウイルス・ ヌクレオチド配列との実質的配列相同性を有し、複製可能で生物学的に封じ込め られている第一ヌクレオチド配列、およびウイルス・プロモーターに隣接し、宿 主において転写可能な生成物の暗号化配列である第二ヌクレオチド配列を含むキ メラ・ヌクレオチド配列を含む感染性ウイルスにより前記生物の１個またはそれ 以上の細胞を感染させ、（ｂ）前記トランスジェニック生物を生長させることに より、トランスジェニック生物に前記生成物を生産させることを含む方法。
61. （６１）ウイルス・ヌクレオチド配列が原核生物ウイルス・ヌクレオチド配列で ある、請求項５９または６０記載の方法。
62. （６２）ウイルス・ヌクレオチド配列が真核生物ウイルス・ヌクレオチド配列で ある、請求項５９または６０記載の方法。
63. （６３）ウイルス・ヌクレオチド配列が植物ウイルス・ヌクレオチド配列である 、請求項５９または６０記載の方法。
64. （６４）キメラ・ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡから成る 群から選ばれる、請求項５９または６０記載の方法。
65. （６５）ウイルス・ヌクレオチド配列が生物学的機能性ウイルス・コート蛋白質 暗号化配列を欠いている、請求項５９記載の方法。
66. （６６）ウイルス・ヌクレオチド配列が、さらに生物学的機能性ウイルス伝染性 因子暗号化配列を欠いている、請求項６５記載の方法。
67. （６７）ウイルス ヌクレオチド配列が、さらに生物学的機能性ウイルス伝染性因子暗号化配列を欠 いている、請求項６０記載の方法。
68. （６８）ウイルス・プロモーターがウイルス・コート蛋白質プロモーターである 、請求項６０記載の方法。
69. （６９）生成物が、生体高分子、ホルモンおよび酵素から成る群から選ばれたも のである、請求項５９記載の方法により製造された生成物。
70. （７０）生体高分子が、メラニンおよびシクロデキストリンから成る群がら選ば れたものである、請求項６９記載の生成物。
71. （７１）酵素が、チロシナーゼ、シクロデキストリン・グルコノトランスフェラ ーゼおよびヒト組織プラスミノゲン活性化因子から成る群がら選ばれたものであ る、請求項６９記載の生成物。
72. （７２）ウイルス・プロモーターがウイルス・コート蛋白質プロモーターである 、請求項６６記載の方法。
73. （７３）宿主が、キメラ・ヌクレオチド配列の複製に有用なレプリカーゼの暗号 化配列を含ませるべく安定した形で形質転換された、請求項５９記載の方法。
74. （７４）生成物が、生体高分子、ホルモンおよび酵素から成る群から選ばれたも のである、請求項７３記載の方法により製造された生成物。
75. （７５）生体高分子が、メラニンおよびシクロデキストリンから成る群がら選ば れたものである、請求項７４記載の生成物。
76. （７６）酵素が、チロシナーゼ、シクロデキストリン・グルコノトランスフェラ ーゼおよびヒト組織プラスミノゲン活性化因子から成る群がら選ばれたものであ る、請求項７４記載の生成物。
77. （７７）感染性ウイルスのキメラ・ヌクレオチド配列に対する宿主であり、キメ ラ・ヌクレオチド配列と適合し得るウイルス・レプリカーゼの暗号化配列を含む 細胞を含む、トランスジェニック生物またはその一部分であって、前記ウイルス は、ウイルス・ヌクレオチド配列との実質的配列相同性を有し、複製可能で生物 学的に封じ込められている第一ヌクレオチド配列、およびウイルス・プロモータ ーに隣接し、トランスジェニック生物において転写可能な暗号化配列である第二 ヌクレオチド配列を含むキメラ・ヌクレオチド配列を含むものであり、キメラ・ ヌクレオチド配列によりコードされる１つまたはそれ以上の特性を発現し得るト ランスジェニック生物。
78. （７８）ウイルス・ヌクレオチド配列が原核生物ウイルス・ヌクレオチド配列で ある、請求項７７記載のトランスジェニック生物。
79. （７９）ウイルス・ヌクレオチド配列が真核生物ウイルス・ヌクレオチド配列で ある、請求項７７記載のトランスジェニック生物。
80. （８０）ウイルス・ヌクレオチド配列が植物ウイルス・ヌクレオチド配列である 、請求項７７記載のトランスジェニック生物。
81. （８１）キメラ・ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡから成る 群から選ばれる、請求項７７記載のトランスジェニック生物。
82. （８２）ウイルス・ヌクレオチド配列が、さらに生物学的機能性ウイルス伝染性 因子暗号化配列を欠いている、請求項７７記載のトランスジェニック生物。
83. （８３）ウイルス・プロモーターがウイルス・コート蛋白質プロモーターである 、請求項７７記載のトランスジェニック生物。