KR20240031219A - 바이러스 기반 유전자 치료용 프로모터 - Google Patents

바이러스 기반 유전자 치료용 프로모터 Download PDF

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KR20240031219A
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데렉 웰스비
핑우 장
어밋 파텔
티안룬 루
도날드 제이 잭
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더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
더 존스 홉킨스 유니버시티
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Abstract

본원에서는 특히 다수의 이종 핵산을 발현할 수 있는 프로모터를 갖는 바이러스와 핵산을 포함하는 조성물이 제공된다. 조성물은 뉴런에서 이종 핵산을 전달하고 발현하는 데 특히 유용하다. 신경계, 신경 조직, 및 뉴런과 관련하여, 본원에 열거된 조성물은 망막 신경퇴행성 질환의 치료에 효과적인 것으로 고려된다.

Description

바이러스 기반 유전자 치료용 프로모터
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2021년 4월 14일자로 출원된 미국 임시 출원 제63/174,679호의 이익을 주장하며, 이는 모든 목적을 위해 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
ASCII 파일로 제출된 "서열목록", 표, 또는 컴퓨터 프로그램 목록 부록에 대한 참조
파일 048537-652001WO_SequenceListing_ST25.txt에 기록된 서열 목록은 2022년 4월 14일자에 12,288 바이트의 기기 포맷 IBM-PC, MS 윈도우 작동 시스템으로 작성되었고, 본원에 참조로 포함된다.
연방정부의 후원 연구 및 개발 하에 수행된 발명에 대한 권리에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원이 수여한 1R01EY029342 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 발명에 대해 소정의 권리를 가지고 있다.
바이러스 전달 비히클에 패키징될 수 있는 유전 정보의 양의 제한된 용량은 유전자 치료법 개발에서의 장애물이다. 특히, 유전자 치료에서 일반적으로 사용되는 아데노-관련 바이러스는 약 4.7 킬로베이스의 제한된 카고 크기(패키징 용량)를 갖고, 약 4.4 킬로베이스의 페이로드를 전달할 수 있다. 양방향 프로모터는 단일 프로모터를 사용하는 다중 유전자의 발현을 위한 매력적인 솔루션이지만, 당업계에 알려진 양방향 프로모터는 뉴런에서 잘 기능하지 않는다. 추가로, 다수의 프로모터가 어느 수준의 양방향 활성을 갖지만, 실제로는 소수만이 두 방향으로의 완전 유전자 발현을 허용한다. 이의 원인은 완전히 밝혀지지 않았다. 2개의 전이유전자 프로모터가 존재하는 상황에서, 프로모터는 흔히 서로 간섭될 수 있다(예를 들어, 문헌[Curtin et al., Gene Therapy 15:384-390, 2008]; 문헌[Core et al., Science 322:1845-1848, 2008]). 대부분의 이러한 프로모터의 경우, RNA 폴리머라아제 II(RNA Pol II)는 신장 중 정지/중단되어, 극도로 낮은 수준의 유전자 발현을 유도한다.
따라서, 다중 유전자를 전달할 수 있는 양방향 프로모터에 대한 필요성이 남아 있다. 특히, 뉴런에서 기능하는 양방향 프로모터는 질환, 예를 들어 신경퇴행성 망막 질환의 치료를 위한 치료용 물질의 발현을 가능하게 할 수 있다.
본원에는 특히 당업계의 이러한 문제와 다른 문제에 대한 솔루션이 개시된다.
본 개시내용은 2개의 전사체의 작은 크기와 강력한 발현에 최적화된 프로모터를 포함하는 발현 작제물을 제공한다. 프로모터는 뉴런 세포에서 유전자를 효과적으로 발현하는 것이 입증되었다.
일 양태에서, i) 서열 번호 10 또는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 프로모터; ii) 프로모터의 3' 말단에 부착된 제1 이종 핵산 서열; 및 iii) 프로모터의 5' 말단에 부착된 제2 이종 핵산 서열을 포함하는 게놈을 갖는 바이러스가 제공된다.
다른 양태에서, i) 서열 번호 10 또는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 프로모터; ii) 프로모터의 3' 말단에 부착된 제1 이종 핵산 서열; 및 iii) 프로모터의 5' 말단에 부착된 제2 이종 핵산 서열을 포함하는 핵산이 제공된다.
다른 양태에서, 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 핵산을 포함하는 발현 벡터가 제공된다.
일 양태에서, 세포를 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 바이러스와 접촉시키는 단계, 및 세포가 제1 이종 핵산 서열과 제2 이종 핵산 서열을 발현하도록 하는 단계를 포함하는, 제1 이종 핵산 서열과 제2 이종 핵산 서열의 발현 방법이 제공된다.
일 양태에서, 세포를 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 핵산 또는 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 발현 벡터와 접촉시키는 단계, 및 세포가 제1 이종 핵산 서열과 제2 이종 핵산 서열을 발현하도록 하는 단계를 포함하는, 제1 이종 핵산 서열과 제2 이종 핵산 서열의 발현 방법이 제공된다.
다른 양태에서, 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 바이러스, 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 핵산, 또는 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 발현 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.
다른 양태에서, 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 유효량의 바이러스, 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 핵산, 또는 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 발현 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료 방법이 제공된다.
도 1. 프로모터 10 또는 대조군 CAG/CMV 프로모터를 이용하여 EGFP 및 mScarlet을 발현하는 작제물로 형질주입된 HEK 293T 세포의 대표 이미지. 형질주입 24시간 후 세포를 10x 배율로 이미지화하였다.
도 2a 및 도 2b. 다양한 프로모터 작제물로 형질주입된 HEK 293T 세포로부터의 형광 신호. HEK 293T 세포를 형질주입 24시간 후에 이미지화하였다. 세포 카운트와 형광 강도가 도시되어 있다. 형광 강도는 세포 수와 형광 강도에 대한 자동화된 알고리즘에 의해 정량화되었다(n=4). 도 2a: Scarlet 발현 형광 강도(상부 패널) 및 Scarlet을 발현하는 세포 수(하부 패널). 도 2b: GFP 발현 형광 강도(상부 패널) 및 GFP를 발현하는 세포 수(하부 패널).
도 3. 프로모터 10 작제물(좌측)과 인간 H1 프로모터 참조 작제물(우측)로 형질주입된 mRGC의 대표 이미지. 이미지는 형질주입 24시간 후 20x 배율로 촬영되었다. "EGFP"는 녹색 파장의 방출을 나타내고, "mScarlet"은 적색 파장의 방출을 나타낸다. "병합" 패널은 모든 관찰된 프로모터 10-형질주입된 세포가 두 파장 모두에서 발광하였음을 보여준다.
도 4a 및 도 4b. 다양한 후보 양방향 프로모터 작제물로 형질주입된 mRGC의 정량적 데이터. 세포를 형질주입 48시간 후 이미지화하고, 세포 수와 형광 강도에 대한 자동화된 알고리즘에 의해 정량화하였다(n=4). 도 4a: Scarlet 발현; 도 4b: GFP 발현.
도 5a 및 도 5b. 인간 프로모터 10(서열 번호 10)과 비교하여 마우스 프로모터 10 및 인간 프로모터 10의 절단된 버전의 활성을 나타내는 정량적 데이터. 도 5a: GFP 발현; 도 5b: m-Scarlet 발현.
도 6. 인간(서열 번호 10) 및 마우스 프로모터(서열 번호 25) 뉴클레오티드 서열의 정렬. 컨센서스 서열(서열 번호 27)이 제공된다. 서열 번호 27에서 사용된 "N"은 해당 위치에 뉴클레오티드가 존재하지 않거나 마우스 또는 인간 서열의 상응하는 위치에 도시된 뉴클레오티드임을 나타낸다. 그렇지 않으면 뉴클레오티드 명칭은 WIPO 표준, ST.26 (2021), 부록 1, 섹션 1에 상응한다.
도 7a 및 도 7b. RFLP 유전자 편집 어세이에서 Cas12 단백질의 비교. 인간 프로모터 10의 일 측에서 Cas 12 단백질을 발현하는 플라스미드는, 인간 프로모터 10의 일 측에서 Dlk 및 Lzk를 표적으로 하는 가이드 RNA를 함유하는 단일 gRNA 어레이를 발현하는 플라스미드와 조합되었다. 도 7a: Dlk 유전자 편집; 도 7b: Lzk 유전자 편집.
도 8a 및 도 8b. 2개-플라스미드 시스템(도 7a 및 7b)으로 얻은 Dlk 및 Lzk 유전자 편집과, 인간 프로모터 10의 일 측에서의 Cas12a 및 다른 측에서의 gRNA 어레이의 발현을 구동하기 위한 단일 플라스미드로 얻은 유전자 편집의 비교. 도 8a: Dlk 유전자 편집; 도 8b: Lzk 유전자 편집
도 9a 및 도 9b. 프로모터 10(TMEM 측)- INTRON-SpyCas9-P2A-EGFP-sNRP 종결자로 형질주입된 HEK 293T 세포의 대표 이미지. GFP의 발현이 검출되었다. 평가된 인트론은 MATLAT1, BRSK2, MAT2A, CCDC115, MDN1, CUEDC2(도 9a) 및 SV40, ZDHHC2, SLC35F2, SNF286A, 미지의 명칭의 유전자로부터의 인트론, MVM No. CBA 및 UQCRFS1(도 9b)을 포함한다. 이미지는 형질주입 72시간 후 10x 배율로 촬영되었다.
도 10. 프로모터 10(TMEM 측)- INTRON-SpyCas9-P2A-EGFP-sNRP 종결자로 형질주입된 HEK 293T 세포의 정량적 데이터. 이미지는 형질주입 24시간 후 촬영되었다.
도 11. 일시적으로 형질주입된 N2a 세포에서 프로모터 10(레인 4 내지 5 및 8 내지 9) 또는 프로모터 10의 역(서열 번호 26)(레인 6 내지 7)에 의해 구동된 Dlk 좌위의 Cas12a 매개 유전자 편집의 제한 효소 파괴 어세이. 인슐레이터 서열에 의한 향상을 입증하였다(레인 8 내지 9).
도 12. 일시적으로 형질주입된 N2a 세포에서 프로모터 10(레인 4 내지 5 및 8 내지 9) 또는 프로모터 10의 역(서열 번호 26)(레인 6 내지 7)에 의해 구동된 Lzk 좌위의 Cas12a 매개 유전자 편집의 제한 효소 파괴 어세이. 인슐레이터 서열에 의한 향상을 입증하였다(레인 8 내지 9).
도 13. 항-헤마글루티닌(HA) 면역형광 염색에 의해 측정된 일시적으로 형질주입된 293 세포에서 HA-태깅된 enAsCas12a 발현의 대표 이미지. Cpf1(enAsCas12a)은 프로모터 10의 양 측에서 발현되었다. LT Cpf1 작제물은 프로모터의 TMEM208 측과 Cpf1을 발현한다. TL Cpf1 작제물은 프로모터의 LRRC29 측과 Cpf1을 발현한다.
도 14. 양방향 프로모터와 EGFP 및 mScarlet을 인코딩하는 AAV 벡터로 형질도입된 마우스 망막 신경절 세포(mRGC)의 대표 이미지. 도면은 AAV-EGFP-Pro10-mScarlet을 유리체강내 주사한 14일 후 망막 플랫마운트를 보여준다. 이미지는 두 전이유전자의 강력한 양방향 발현을 보여준다. 이미지의 평면(축삭으로 입증됨)은 두 전이유전자의 망막 신경절 세포 발현을 입증하는 신경절 세포 층/망막 신경 섬유 층(GCL/RNFL)이다.
본원에서 특히 유전자 치료에 사용된 바이러스 벡터에서 2개의 RNA 전사체의 발현을 구동하는 양방향 프로모터가 제공된다. 양방향 프로모터는 CRISPR 성분, 단백질, 예컨대 치료용 단백질, RNA, 예컨대 gRNA 및 억제성 RNA의 전달에 특히 유용한 것으로 고려된다. 비제한적으로, 유용한 양방향 프로모터는 서열 번호 10, 이의 절단물, 이의 단편, 및 이의 변이체를 포함하는 프로모터를 포함한다. 일 예에서, 유용한 양방향 프로모터는 서열 번호 21, 이의 절단물, 이의 단편, 및 이의 변이체를 포함하는 프로모터를 포함한다.
본 발명의 다양한 실시형태 및 양태가 본원에 도시되고 기재되지만, 상기 실시형태 및 양태가 단지 예로서 제공된다는 점이 당업자에게 명백할 것이다. 당업자는 본 발명에서 벗어나지 않으면서 다수의 변동, 변경 및 치환을 고려할 것이다. 본원에 기재된 발명의 실시형태에 대한 다양한 대안들이 발명을 실시하는 데 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
본원에 사용된 섹션 제목은 단지 구조적 목적을 위한 것이며, 기재된 주제를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 특허, 특허 출원, 기사, 문헌, 매뉴얼 및 논문을 비제한적으로 포함하는 출원에 인용된 모든 문헌 또는 문헌의 일부는 임의의 목적으로 이의 전문이 본원에 명시적으로 참조로 포함된다.
본원에서 사용된 약어는 화학 분야 및 생물학 분야 내에서 통상의 의미를 갖는다. 본원에 제시된 화학 구조 및 화학식은 화학 분야에 알려진 표준 화학 원자가 규칙에 따라 구성된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 용어 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어 문헌[Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)]; 문헌[Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989)]을 참조한다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법, 장치 및 물질이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 하기 정의는 본원에서 빈번하게 사용되는 특정 용어에 대한 이해를 용이하게 하기 위해 제공되는 것이며, 본 발명의 범주를 제한하도록 의미하지 않는다.
"핵산"은 뉴클레오티드(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드) 및 이의 단일 가닥, 이중 가닥 또는 다중 가닥 형태의 중합체, 또는 이의 보체; 또는 뉴클레오시드(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오시드 또는 리보뉴클레오시드)를 지칭한다. 실시형태에서, "핵산"은 뉴클레오시드를 포함하지 않는다. 용어 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고" 등은 보통의 통상적인 의미에서 선형의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 용어 "뉴클레오시드"는 보통의 통상적인 의미에서 핵염기 및 오탄당(리보오스 또는 데옥시리보오스)을 포함하는 글리코실아민을 지칭한다. 뉴클레오시드의 비제한적인 예는 시티딘, 우리딘, 아데노신, 구아노신, 티미딘 및 이노신을 포함한다. 용어 "뉴클레오티드"는 보통의 통상적인 의미에서 폴리뉴클레오티드의 단일 단위, 즉 단량체를 지칭한다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 이의 변형된 버전일 수 있다. 본원에서 고려된 폴리뉴클레오티드의 예는 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA 및 RNA의 혼합물을 갖는 혼성 분자를 포함한다. 본원에서 고려된 핵산, 예를 들어 폴리뉴클레오티드의 예는 임의의 유형의 RNA, 예로 mRNA, siRNA, miRNA 및 가이드 RNA 및 임의의 유형의 DNA, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 및 미니서클 DNA, 및 이의 임의의 단편을 포함한다. 폴리뉴클레오티드의 맥락에서 용어 "이중체"는 보통의 통상적인 의미에서 이중 가닥을 지칭한다. 핵산은 선형 또는 분지형일 수 있다. 예를 들어, 핵산은 뉴클레오티드의 선형 사슬일 수 있거나, 핵산은 예를 들어 뉴클레오티드의 하나 이상의 아암(arm) 또는 분지를 포함하도록 분지형일 수 있다. 선택적으로, 분지형 핵산은 반복적으로 분지되어 덴드리머 등과 같은 고차원 구조를 형성한다.
본원에서 사용될 수 있는 것과 같은, 용어 "핵산", "핵산 분자", "핵산 올리고머", "올리고뉴클레오티드", "핵산 서열", "핵산 단편" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용되며, 비제한적으로, 다양한 길이를 가질 수 있는 함께 공유 결합된 뉴클레오티드의 중합체 형태, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 변형을 포함한다. 상이한 폴리뉴클레오티드는 상이한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 알려지거나 알려지지 않은 다양한 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예는 유전자, 유전자 단편, 엑손, 인트론, 유전자간 DNA(이염색질 DNA를 포함하나 이에 제한되지 않음), 메신저 RNA(mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보좀 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 서열의 단리된 DNA, 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 본원에 제공된 핵산은 벡터의 일부일 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 핵산은 세포 내로 형질도입될 수 있는 아데노-관련 바이러스 벡터의 일부일 수 있다. 본 개시내용의 방법에 유용한 폴리뉴클레오티드는 자연 핵산 서열 및 이의 변이체, 인공 핵산 서열, 또는 이러한 서열의 조합을 포함할 수 있다.
예를 들어, 포스포티오에이트 골격을 갖는 핵산을 포함하는 핵산은 하나 이상의 반응성 모이어티를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된, 용어 반응성 모이어티는 공유 결합, 비-공유 결합 또는 다른 상호작용을 통해 또 다른 분자, 예를 들어 핵산 또는 폴리펩티드와 반응할 수 있는 임의의 기를 포함한다. 예로서, 핵산은 공유, 비공유 또는 다른 상호작용을 통해 단백질 또는 폴리펩티드 상의 아미노산과 반응하는 아미노산 반응성 모이어티를 포함할 수 있다.
또한, 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 기준 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는, 합성적, 자연 발생 및 비-자연 발생의 알려진 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 결합을 포함하는 핵산을 포함한다. 상기 유사체의 예는 비제한적으로 예를 들어 포스포르아미데이트, 포스포로디아미데이트, 포스포로티오에이트(포스페이트에서 산소를 대체하는 이중 결합 황을 갖는 포스포티오에이트로도 알려짐), 포스포로디티오에이트, 포스포노카르복실산, 포스포노카르복실레이트, 포스포노아세트산, 포스포노포름산, 메틸 포스포네이트, 붕소 포스포네이트, 또는 O-메틸포스포로아미다이트 결합(문헌[Eckstein, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, Oxford University Press] 참조)을 포함하는 포스포디에스테르 유도체뿐만 아니라 뉴클레오티드 염기, 예컨대 5-메틸 시티딘 또는 슈도우리딘에 대한 변형; 및 펩티드 핵산 골격 및 결합을 포함한다. 다른 유사체 핵산은 미국 특허 US 5,235,033호 및 US 5,034,506호, 및 문헌[Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, CARBOHYDRATE MODIFICATIONS IN ANTISENSE RESEARCH, Sanghui & Cook, eds.]에 기재된 것을 포함하여, 양성 골격, 비이온성 골격, 변형된 당 및 비-리보오스 골격을 갖는 핵산(예를 들어, 당업계에 알려진 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고 또는 잠김 핵산(LNA))을 포함한다. 하나 이상의 카르보시클릭 당을 함유하는 핵산도 핵산의 하나의 정의 내에 포함된다. 리보오스-포스페이트 골격의 변형은 다양한 이유로, 예를 들어 생리적인 환경에서 또는 바이오칩 상의 프로브로서 이러한 분자의 안정성 및 반감기를 증가시키도록 수행될 수 있다. 자연 발생 핵산과 유사체의 혼합물이 제조될 수 있으며; 대안적으로, 상이한 핵산 유사체의 혼합물 및 자연 발생 핵산과 유사체의 혼합물이 제조될 수 있다. 실시형태에서, DNA 내의 뉴클레오티드간 결합은 포스포디에스테르, 포스포디에스테르 유도체 또는 이 둘의 조합이다.
핵산은 비특이적 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된, 용어 "비특이적 서열"은 임의의 다른 핵산 서열에 상보적이거나 단지 부분적으로만 상보적인 것으로 설계되지 않은 일련의 잔기를 함유하는 핵산 서열을 지칭한다. 예로서, 비특이적 핵산 서열은 세포 또는 유기체와 접촉할 때 억제성 핵산으로 기능하지 않는 핵산 잔기의 서열이다.
폴리뉴클레오티드는 일반적으로 4개의 뉴클레오티드 염기의 특정 서열로 구성된다: 아데닌(A); 시토신(C); 구아닌(G); 및 티민(T)(폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우, 티민(T)의 경우 우라실(U)). 따라서, 용어 "폴리뉴클레오티드 서열"은 폴리뉴클레오티드 분자의 알파벳 표기이며; 대안적으로, 용어는 폴리뉴클레오티드 분자 그 자체에 적용될 수 있다. 이러한 알파벳 표기는 중앙처리장치를 갖는 컴퓨터의 데이터베이스에 입력될 수 있으며, 기능적 게놈학 및 상동성 검색과 같은 생물정보학 적용에 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 선택적으로 하나 이상의 비-표준 뉴클레오티드(들), 뉴클레오티드 유사체(들) 및/또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "보체"는 상보적 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 서열과 염기쌍을 형성할 수 있는 뉴클레오티드(예를 들어, RNA 또는 DNA) 또는 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 본원에 기재되고 당업계에 보편적으로 알려진 바와 같이, 아데노신의 상보적(매칭되는) 뉴클레오티드는 티미딘이고, 구아노신의 상보적(매칭되는) 뉴클레오티드는 시토신이다. 따라서, 보체는 제2 핵산 서열의 상응하는 상보적 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성하는 뉴클레오티드의 서열을 포함할 수 있다. 보체의 뉴클레오티드는 제2 핵산 서열의 뉴클레오티드와 일부 또는 전부 매칭될 수 있다. 보체의 뉴클레오티드가 제2 핵산 서열의 각 뉴클레오티드와 전부 매칭되는 경우, 보체는 제2 핵산 서열의 각 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성한다. 보체의 뉴클레오티드가 제2 핵산 서열의 뉴클레오티드와 일부 매칭되는 경우, 보체의 뉴클레오티드의 단지 일부만이 제2 핵산 서열의 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성한다. 상보적 서열의 예는 코딩 및 비-코딩 서열을 포함하며, 여기서 비-코딩 서열은 코딩 서열에 상보적인 뉴클레오티드를 함유하여 코딩 서열의 보체를 형성한다. 상보적 서열의 추가의 예는 센스 및 안티센스 서열이며, 여기서 센스 서열은 안티센스 서열에 상보적인 뉴클레오티드를 함유하여 안티센스 서열의 보체를 형성한다.
본원에서 기재된 것과 같이, 서열의 상보성은 단지 핵산의 일부가 염기쌍 형성에 따라 매칭하는 경우 부분적이거나, 모든 핵산이 염기쌍 형성에 따라 매칭하는 경우 전체적일 수 있다. 따라서, 서로 상보적인 2개의 서열은 동일한 뉴클레오티드의 특정 백분율(즉, 명시된 영역에 걸쳐 약 60% 동일성, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성)을 가질 수 있다.
용어 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 인코딩된 아미노산뿐만 아니라 나중에 변형된 이들 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조, 즉 수소, 카르복실 기, 아미노 기 및 R 기에 결합되는 α 탄소를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다. 용어 "비-자연 발생 아미노산" 및 "비-천연 아미노산"은 자연에서 발견되지 않는, 아미노산 유사체, 합성 아미노산 및 아미노산 모방체를 지칭한다.
아미노산은 일반적으로 알려진 세 문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명위원회에서 권장하는 한 문자 기호로 본원에서 언급될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 공통적으로 허용된 단일-문자 코드에 의해 언급될 수 있다.
용어 "폴리펩티드," "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하고, 여기서 중합체는 아미노산으로 이루어지지 않은 모이어티에 콘쥬게이션될 수 있다. 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학적 모방체인 아미노산 중합체뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체 및 비자연 발생 아미노산 중합체에도 적용된다. "융합 단백질"은 단일 모이어티로서 재조합적으로 발현되는 둘 이상의 별도의 단백질 서열을 인코딩하는 키메라 단백질을 지칭한다.
아미노산 또는 뉴클레오티드 염기 "위치"는 N-말단(또는 5'-말단)에 대한 이의 위치를 기준으로 기준 서열에서 각각의 아미노산(또는 뉴클레오티드 염기)을 순차적으로 식별하는 번호로 표시된다. 최적의 정렬을 결정할 때 고려되어야 하는 결실, 삽입, 절단, 융합 등으로 인해, 일반적으로 N-말단에서부터 간단히 계수하여 결정된 시험 서열에서의 아미노산 잔기 번호는 기준 서열에서 이의 상응하는 위치의 번호와 반드시 동일하지는 않을 것이다. 예를 들어, 변이체가 정렬된 기준 서열과 비교하여 결실을 갖는 경우, 결실 부위에서 기준 서열의 위치에 상응하는 변이체의 아미노산은 존재하지 않을 것이다. 정렬된 기준 서열에 삽입이 존재하는 경우, 해당 삽입은 기준 서열에서 넘버링된 아미노산 위치에 상응하지 않을 것이다. 절단 또는 융합의 경우, 상응하는 서열의 임의의 아미노산에 상응하지 않는 기준 서열 또는 정렬된 서열에서 아미노산 스트레치가 존재할 수 있다.
제시된 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 넘버링의 맥락에서 사용될 때 "~를 참조하여 넘버링된" 또는 "~에 상응하는"이라는 용어는 제시된 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 기준 서열과 비교할 때 지정된 기준 서열 잔기의 넘버링을 나타낸다. 단백질의 아미노산 잔기는 제시된 잔기와 동일한 단백질 내의 필수 구조적 위치를 차지하는 경우, 제시된 잔기에 "상응한다". 당업자는 상이한 넘버링 시스템을 갖는 다른 단백질에서 단백질(예를 들어, Cas9)의 특정 위치에 상응하는 잔기의 아이덴티티 및 위치를 즉시 인식할 것이다. 예를 들어, 단백질(예를 들어, Cas9)과 단순 서열 정렬을 수행함으로써, 단백질의 특정 위치에 상응하는 잔기의 아이덴티티 및 위치가 단백질에 정렬되는 다른 단백질 서열에서 확인된다. 예를 들어, 선택된 단백질의 선택된 잔기는, 선택된 잔기가 위치 138의 글루탐산과 동일한 필수 공간적 또는 기타 구조적 관계를 차지할 때 위치 138의 글루탐산과 상응한다. 일부 실시형태에서, 선택된 단백질이 단백질과 최대 상동성을 위해 정렬되는 경우, 글루탐산 138과 정렬되는 정렬된 선택된 단백질의 위치는 글루탐산 138에 상응한다. 일차 서열 정렬 대신에, 예를 들어 선택된 단백질의 구조가 위치 138에서 글루탐산과 최대 상응성을 위해 정렬되고 전체 구조가 비교되는 3차원 구조적 정렬이 또한 사용될 수 있다. 이 경우, 구조 모델에서 글루탐산 138과 동일한 필수 위치를 차지하는 아미노산은 글루탐산 138 잔기에 상응하는 것이다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산과 핵산 서열에 모두 적용된다. 특정 핵산 서열에 관하여, "보존적으로 변형된 변이체"는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 나타낸다. 유전자 코드의 축퇴성 때문에, 많은 핵산 서열이 임의의 제시된 단백질을 인코딩할 것이다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 인코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정된 모든 위치에서, 인코딩된 폴리펩티드를 변경시키지 않고도, 그 코돈을 기재된 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이 중 하나의 종류인 "침묵 변이"이다. 폴리펩티드를 인코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기재한다. 당업자라면 핵산의 각 코돈(일반적으로 메티오닌의 유일한 코돈인 AUG 및 일반적으로 트립토판의 유일한 코돈인 TGG를 제외함)이 기능적으로 일치하는 분자를 수득하도록 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 각 침묵 변이는 각 기재된 서열에 내포된다.
아미노산 서열에 관하여, 당업자는 인코딩된 서열의 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산을 변경, 부가 또는 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 부가가 변경으로 인해 아미노산이 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환된 "보존적으로 변형된 변이체"임을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 개시내용의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자에 추가되며, 이를 배제하지 않는다.
하기 8개의 그룹 각각은 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:
1) 알라닌(A), 글리신(G);
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 리신(K);
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C), 메티오닌(M)
(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins (1984)] 참조).
뉴클레오티드 서열은 달리 제시되지 않는 한 WIPO 표준, ST.26(2021), 부록 1, 섹션 1에 따라 제시된다.
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 용어 "동일한" 또는 백분율 "동일성"은 하기 기재되는 디폴트 매개변수를 이용한 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하거나, 수동 정렬 및 육안 검사(예를 들어, NCBI 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 등 참조)를 통해 측정 시, 동일하거나, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 백분율(즉, 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 대응율에 대해 비교 및 정렬될 때, 명시된 영역에 걸쳐 약 60% 동일성, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성)을 갖는 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 나타낸다. 따라서, 이러한 서열은 "실질적으로 동일한" 것으로 언급된다. 이러한 정의는 또한 시험 서열의 보체를 나타내거나, 이에 적용될 수 있다. 이러한 정의는 결실 및/또는 부가를 갖는 서열뿐 아니라, 치환을 갖는 서열도 포함한다. 하기 기재된 것과 같이, 바람직한 알고리즘은 갭 등을 설명할 수 있다. 바람직하게는, 동일성은 적어도 약 25개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역, 또는 보다 바람직하게는 50 내지 100개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역에 걸쳐 존재한다.
"서열 동일성 백분율"은 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되며, 여기서 비교 윈도우의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부는 2개의 서열의 최적의 정렬을 위한 기준 서열(이는 부가 또는 결실을 포함하지 않음)에 비해 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은, 일치하는 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 둘 모두의 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하여, 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 비교 윈도우에서의 위치의 총 수로 나누고, 이 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
본원에서 사용된 "비교 윈도우"는 예를 들어 2개 서열이 최적으로 정렬된 후 인접한 위치의 동일한 수의 기준 서열과 서열이 비교될 수 있는 전장 서열, 또는 20 내지 600개, 약 50 내지 약 200개 또는 약 100 내지 약 150개의 아미노산 또는 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 인접한 위치의 수 중 어느 하나의 세그먼트에 대한 참조를 포함한다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은 예를 들어 문헌[Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 방법에 대한 검색, 3가지 알고리즘의 컴퓨터화된 구현(위스콘신주 매디슨 575 Science Dr. 소재의 Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 수동 정렬과 육안 검사에 의해(예를 들어, 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(1995 supplement)] 참조) 실시될 수 있다.
백분율 서열 동일성과 서열 유사성의 결정에 적합한 알고리즘의 예는 각각 문헌[Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402], 및 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 기재되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 국립 바이오테크놀로지 정보 센터(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 입수가능하다. 이러한 알고리즘은 먼저 쿼리 서열에서 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 높은 점수 서열 쌍(HSP)을 확인하는 것을 수반하며, 이는 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 정렬될 때 일부 양성 임계값 점수 T와 매칭되거나 이를 충족시킨다. T는 이웃 단어 점수 임계값(문헌[Altschul et al.], 상기 문헌)으로 언급된다. 이들 초기 이웃 단어 히트는 이들을 함유하는 더 긴 HSP를 찾도록 검색을 개시하는 시드로서 작용한다. 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 단어 히트는 각 서열을 따라 양 방향으로 확장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열의 경우, 매개변수 M(매칭된 잔기 쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N(미스매칭된 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 < 0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 누적 정렬 점수가 최대 달성된 값에서 양 X만큼 감소하거나; 하나 이상의 음수 스코어링 잔여 정렬의 누적으로 인해, 누적 점수가 0 이하가 되거나; 두 서열의 끝에 도달한 경우, 각 방향의 단어 히트 확장이 중단된다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 기본값으로서 단어 길이(W) 11, 기대값 (E) 10, M = 5, N = -4 및 두 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 기본값으로서 단어 길이 3, 및 기대값(E) 10, BLOSUM62 스코어링 매트릭스(문헌[Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915] 참조) 정렬(B) 50, 기대값(E) 10, M = 5, N = -4 및 두 가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 간의 유사성의 통계적 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 하나의 척도는 최소 합계 확률(P(N))이며, 이는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매칭이 우연히 발생할 확률을 나타낸다. 예를 들어, 테스트 핵산과 기준 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일한 표시는 하기에 기재된 것과 같이, 제1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대해 생성된 항체와 면역학적으로 교차반응하는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 일반적으로 예를 들어 2개 펩티드가 보존적 치환만으로 달라지는 경우 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일한 다른 표시는 2개의 분자 또는 이들의 보체가 하기에 기재된 것과 같이 엄격한 조건 하에 서로 혼성화하는 것이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일한 또 다른 표시는 동일한 프라이머를 사용하여 서열을 증폭할 수 있는 것이다.
용어 "RNA-가이드(RNA-guided) DNA 엔도뉴클레아제" 등은 보통의 통상적인 의미에서 DNA 폴리뉴클레오티드 사슬 내 포스포디에스테르 결합을 절단하는 효소를 지칭하고, 여기서 포스포디에스테르 결합의 인지는 개별 RNA 서열(예를 들어, 단일 가이드 RNA)에 의해 촉진된다.
용어 "가이드 RNA", "gRNA", "단일 가이드 RNA" 및 "sgRNA"는 상호교환적으로 사용되고, crRNA 서열 및 선택적으로 tracrRNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 실시형태에서, gRNA는 crRNA 서열 및 tracrRNA 서열을 포함한다. 실시형태에서, gRNA는 tracrRNA 서열을 포함하지 않는다. crRNA 서열은 가이드 서열(즉, "가이드" 또는 "스페이서") 및 tracr 메이트 서열(즉, 직접 반복부(들))을 포함한다. 용어 "가이드 서열"은 표적 부위를 지정하는 서열을 지칭한다. 일반적으로, tracr 메이트 서열은 하기 중 하나 이상을 촉진하도록 tracrRNA 서열과 충분히 상보적인 임의의 서열을 포함한다: (1) 상응하는 tracr 서열을 함유하는 세포에서 tracr 메이트 서열에 의해 플랭킹된 가이드 서열의 절제; 및 (2) 표적 서열에서 복합체(예를 들어, CRISPR 복합체)의 형성으로서, 여기서 복합체(예를 들어, CRISPR 복합체)는 tracr 서열에 혼성화된 tracr 메이트 서열을 포함한다.
실시형태에서, gRNA는 단일 가닥 리보핵산이다. 양태에서, gRNA는 길이가 약 10 내지 약 200개의 핵산 잔기이다. 양태에서, gRNA는 길이가 약 50 내지 약 150개의 핵산 잔기이다. 양태에서, gRNA는 길이가 약 80 내지 약 140개의 핵산 잔기이다. 양태에서, gRNA는 길이가 약 90 내지 약 130개의 핵산 잔기이다. 양태에서, gRNA는 길이가 약 100 내지 약 120개의 핵산 잔기이다.
일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하고, 표적 서열과 혼성화하기에 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 충분히 상보성인 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 간의 상보성 정도는 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬할 때, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 최적의 정렬은 서열 정렬을 위한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있으며, 이의 비제한적인 예는 Smith-Waterman 알고리즘, Needleman-Wunsch 알고리즘, Burrows-Wheeler 변형(예를 들어, Burrows Wheeler Aligner) 기반 알고리즘, ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign(Novocraft Technologies, ELAND(Illumina, 캘리포니아주 샌디에고 소재)), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 이용가능), 및 Maq(maq.sourceforge.net에서 이용가능)를 포함한다. 실시형태에서, 가이드 서열은 길이가 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 이상의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 가이드 서열은 길이가 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12개 이하의 뉴클레오티드 미만이다. CRISPR 복합체의 표적 서열에 대한 서열 특이적 결합을 지시하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 어세이에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험될 가이드 서열을 포함하여 CRISPR 복합체를 형성하기에 충분한 CRISPR 시스템의 구성요소는 예컨대 CRISPR 서열의 구성요소를 인코딩하는 벡터로 형질주입한 후 본원에 기재된 Surveyor 어세이와 같은 표적 서열 내 우선적 절단의 평가에 의해 상응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포에 제공될 수 있다. 유사하게, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 절단은 표적 서열, 시험될 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체의 구성요소를 제공하고, 시험 가이드 서열 및 대조군 가이드 서열 반응 사이의 표적 서열에서의 절단 속도 또는 결합을 비교함으로써 시험관에서 평가될 수 있다. 다른 어세이가 가능하며, 당업자는 이를 고려할 것이다.
용어 "클래스 II CRISPR 엔도뉴클레아제"는 Cas9와 유사한 엔도뉴클레아제 활성을 갖고, 클래스 II CRISPR 시스템에 참여하는 엔도뉴클레아제를 지칭한다. 예의 클래스 II CRISPR 시스템은 화농연쇄상구균(Streptococcus pyogenes) SF370의 유형 II CRISPR 좌위이며, 이는 4개의 유전자 Cas9, Cas1, Cas2, 및 Csn1의 클러스터뿐만 아니라 2개의 비-코딩 RNA 요소, tracrRNA 및 비반복 서열의 짧은 스트레치(스페이서, 각각 약 30 bp)에 의해 간격을 둔 반복 서열의 특징적인 정렬(직접적인 반복)을 함유한다. Cpf1 효소는 추정 유형 V CRISPR-Cas 시스템에 속한다. 유형 II 및 유형 V 시스템 모두는 CRISPR-Cas 시스템의 클래스 II에 포함된다. C2c1("클래스 2 후보 1") 효소는 클래스 II형 V-B 효소이다. C2c2("클래스 2 후보 2") 효소는 클래스 II형 VI-A 효소이다. C2c3("클래스 2 후보 3") 효소는 클래스 II형 V-C 효소이다. 비제한적인 예시적인 CRISPR 관련 단백질은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2,Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4,Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3,Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, C2c1, C2c3, Cas12a, Cas12b,Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, 및 Cas13을 포함한다.
따라서, 본원에서 언급된 "CRISPR 관련 단백질 9", "Cas9", "Csn1" 또는 "Cas9 단백질"은 Cas9 엔도뉴클레아제 효소 활성을 (예를 들어, Cas9와 비교할 때 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 내에서) 유지하는 임의의 재조합 또는 자연-발생 형태의 Cas9 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체 또는 상동체를 포함한다. 일부 양태에서, 변이체 또는 상동체는 자연 발생 Cas9 단백질과 비교하여, 전체 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 50개, 100개, 150개 또는 200개의 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, Cas9 단백질은 UniProt 기준 번호 Q99ZW2로 식별된 단백질 또는 이에 대해 실질적인 동일성을 갖는 변이체 또는 상동체와 실질적으로 동일하다. Cas9는 당업계에 "닉카아제"로도 알려진 단백질을 지칭한다. 실시형태에서, Cas9는 CRISPR(클러스터형 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복체) 핵산 서열에 결합하는 RNA 가이드 DNA 엔도뉴클레아제 효소이다.
본원에서 언급된 "Cfp1" 또는 "Cfp1 단백질"은 Cfp1(CxxC 핑거 단백질 1) 엔도뉴클레아제 효소 활성을 (예를 들어, Cfp1에 비해 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 내에서) 유지하는 임의의 재조합 또는 자연-발생 형태의 Cfp1 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체 또는 상동체를 포함한다. 일부 양태에서, 변이체 또는 상동체는 자연 발생 Cfp1 단백질과 비교하여, 전체 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 50개, 100개, 150개 또는 200개의 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, Cfp1 단백질은 UniProt 기준 번호 Q9P0U4로 식별된 단백질 또는 이에 대해 실질적인 동일성을 갖는 변이체 또는 상동체와 실질적으로 동일하다.
용어 "뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 효소" 등은 보통의 통상적인 의미에서, DNA 폴리뉴클레오티드 내에서 특정 포스포디에스테르 결합을 표적하는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제(예를 들어, 자연 발생 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제의 돌연변이된 형태)를 지칭하며, 여기서 포스포디에스테르 결합의 인지는 개별 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, RNA 서열(예를 들어, 단일 가이드 RNA(sgRNA))에 의해 촉진되지만, 상당한 정도로 표적 포스포디에스테르 결합을 절단할 수는 없다(예를 들어, 생리적 조건 하에서 포스포디에스테르 결합의 측정가능한 절단이 없다). 따라서, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, sgRNA)와 복합체화될 때 DNA-결합 능력(예를 들어, 표적 서열에 대한 특이적 결합)을 보유하나, 유의미한 엔도뉴클레아제 활성(예를 들어, 임의의 검출가능한 양의 엔도뉴클레아제 활성)이 부족하다. 양태에서, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 효소는 CRISPR-관련 단백질이다. 양태에서, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 효소는 dCas9, dCpfl, ddCpf1, Cas-phi, 뉴클레아제-결핍 Cas9 변이체, 뉴클레아제-결핍 클래스 II CRISPR 엔도뉴클레아제, 아연 핑거 도메인, 전사 활성자-유사 효과기(TALE), 류신 지퍼 도메인, 윙드 헬릭스 도메인, 헬릭스-턴-헬릭스 모티프, 헬릭스-루프-헬릭스 도메인, HMB-박스 도메인, Wor3 도메인, OB-폴드 도메인, 면역글로불린 도메인, 또는 B3 도메인이다. 양태에서, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 효소는 아연 핑거 도메인, 류신 지퍼 도메인, 윙드 헬릭스 도메인, 헬릭스-턴-헬릭스 모티프, 헬릭스-루프-헬릭스 도메인, HMB-박스 도메인, Wor3 도메인, OB-폴드 도메인, 면역글로불린 도메인, 또는 B3 도메인이다.
실시형태에서, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 효소는 dCas9이다. 본원에서 언급된 용어 "dCas9" 또는 "dCas9 단백질"은 엔도뉴클라아제 활성을 위한 두 촉매적 부위가 결함이 있거나 활성이 결핍된 Cas9 단백질이다. 양태에서, dCas9 단백질은 화농연쇄상구균(S. pyogenes) Cas9의 D10A 및 H840A에 상응하는 위치에서 돌연변이를 갖는다. 양태에서, dCas9 단백질은 야생형 Cas9의 엔도뉴클라아제 촉매 부위(RuvC 및 HNH) 둘 모두에서 점 돌연변이로 인해 엔도뉴클레아제 활성이 결핍된다. 점 돌연변이는 D10A 및 H840A일 수 있다. 양태에서, dCas9는 실질적으로 검출가능한 엔도뉴클레아제(예를 들어, 엔도데옥시리보뉴클레아제) 활성을 갖지 않는다.
실시형태에서, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 효소는 "ddCpf1" 또는 "ddCas12a"이다. 용어 "DNAse-사멸 Cpf1" 또는 "ddCpf1"은 돌연변이된 액시다미노코커스 종(Acidaminococcus sp.) Cpf1(AsCpf1)로서, Cpf1 DNAse 활성의 비활성화를 일으키는 것을 의미한다. 양태에서, ddCpf1은 AsCpf1의 RuvC 도메인에서 E993A 돌연변이를 포함한다. 양태에서, ddCpf1은 실질적으로 검출가능한 엔도뉴클레아제(예를 들어, 엔도데옥시리보뉴클레아제) 활성을 갖지 않는다.
용어 "RNA-가이드 RNA 뉴클레아제" 또는 "RNA-가이드 RNase" 등은 보통의 통상적인 의미에서 RNA 폴리뉴클레오티드 내 특정 포스포디에스테르 결합을 표적하는 RNA-가이드 뉴클레아제를 지칭하고, 여기서 포스포디에스테르 결합의 인지는 개별 폴리뉴클레오티드서열(예를 들어, RNA 서열(예를 들어, 단일 가이드 RNA(sgRNA), 가이드 RNA(gRNA))에 의해 촉진된다. 일반적으로, RNA 가이드 RNase는 단일 가닥 RNA를 표적으로 한다. 양태에서, RNA-가이드 RNase는 Cas13(예를 들어, Cas13a, Cas13b)이다.
본원에서 언급된 "Cas13a" 또는 "Cas13a 단백질"은 Cas13a 엔도뉴클레아제 효소 활성을 (예를 들어, Cas13a와 비교할 때 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 내에서) 유지하는 CRISPR-관련 엔도리보뉴클레아제 C2c2, C2c2, 또는 이의 변이체 또는 상동체로도 알려진 임의의 재조합 또는 자연-발생 형태의 Cas13a(CRISPR-관련 엔도리보뉴클레아제 Cas13a) 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부 양태에서, 변이체 또는 상동체는 자연 발생 Cas13a 단백질과 비교하여, 전체 서열 또는 서열의 일부 (예를 들어, 50개, 100개, 150개 또는 200개의 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, Cas13a 단백질은 UniProt 기준 번호 C7NBY4로 식별된 단백질, 또는 이에 대해 실질적인 동일성을 갖는 변이체 또는 상동체와 실질적으로 동일하다.
본원에서 언급된 "Cas13b" 또는 "Cas13b 단백질"은 Cas13b 뉴클레아제 효소 활성을 (예를 들어, Cas13b와 비교할 때 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 내에서) 유지하는 임의의 재조합 또는 자연-발생 형태의 Cas13b(CRISPR-관련 RNA-가이드 리보뉴클레아제 Cas13b) 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체 또는 상동체를 포함한다. 일부 양태에서, 변이체 또는 상동체는 자연 발생 Cas13b 단백질과 비교하여, 전체 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 50개, 100개, 150개 또는 200개의 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, Cas13b 단백질은 UniProt 기준 번호 A0A8G0P913으로 식별된 단백질, 또는 이에 대해 실질적인 동일성을 갖는 변이체 또는 상동체와 실질적으로 동일하다.
본원에 제공된 용어 "Krueppel 연관 박스 도메인" 또는 "KRAB 도메인"은 대략 400개의 인간 아연 핑거 단백질-기반 전사 인자에서 존재하는 전사 억제 도메인의 카테고리를 지칭한다. KRAB 도메인은 일반적으로 약 45 내지 약 75개의 아미노산 잔기를 포함한다. 기능 및 용도를 포함하여 KRAB 도메인에 대한 설명은 예를 들어 문헌[Ecco, G., Imbeault, M., Trono, D., KRAB zinc finger proteins, Development 144, 2017]; 문헌[Lambert et al. The human transcription factors, Cell 172, 2018]; 문헌[Gilbert et al., Cell (2013)]; 및 문헌[Gilbert et al., Cell (2014)]에서 확인할 수 있다. 양태에서, KRAB 도메인은 Kox 1의 KRAB 도메인이다.
본원에 제공된 용어 "VP64" 또는 "VP64 단백질"은 VP64 단백질 활성을 (예를 들어, VP64 단백질에 비해 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 내에서) 유지하는, 알파 트랜스-유도 단백질, 알파-TIF, 또는 이의 변이체 또는 상동체로도 알려진 임의의 재조합 또는 자연-발생 형태의 Tegument 단백질 VP16(VP64)을 포함한다. 양태에서, 변이체 또는 상동체는 자연 발생 VP64 단백질 폴리펩티드와 비교하여, 전체 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 50개, 100개, 150개 또는 200개의 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, VP64 단백질은 UniProt 기준 번호 P06492로 식별된 단백질, 또는 이의 변이체, 상동체 또는 기능적 단편이다.
본원에 제공된 용어 "Rta" 또는 "Rta단백질"은 Rta 단백질 활성을 (예를 들어, Rta 단백질에 비해 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 내에서) 유지하는, R 트랜스활성화제, 전초기 단백질 Rta, 또는 이의 변이체 또는 상동체로도 알려진 임의의 재조합 또는 자연-발생 형태의 복제 및 전사 활성자(Rta)를 포함한다. 양태에서, 변이체 또는 상동체는 자연 발생 Rta 단백질 폴리펩티드와 비교하여, 전체 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 50개, 100개, 150개 또는 200개의 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, Rta 단백질은 UniProt 기준 번호 P03209로 식별된 단백질, 또는 이의 변이체, 상동체 또는 기능적 단편이다.
본원에 제공된 용어 "p65" 또는 "p65 단백질"은 p65 단백질 활성을 (예를 들어, p65 단백질에 비해 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 내에서) 유지하는, 핵 인자 NF-카파-B p65 서브유닛, 또는 이의 변이체 또는 상동체로도 알려진 임의의 재조합 또는 자연-발생 형태의 전사 인자 p65(p65)를 포함한다. 양태에서, 변이체 또는 상동체는 자연 발생 p65 단백질 폴리펩티드와 비교하여, 전체 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 50개, 100개, 150개 또는 200개의 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, p65 단백질은 UniProt 기준 번호 Q04206로 식별된 단백질, 또는 이의 변이체, 상동체 또는 기능적 단편이다.
본원에 제공된 용어 "DNA 메틸트랜스퍼라아제"는 메틸 기의 DNA로의 전달을 촉매화하는 효소를 지칭한다. DNA 메틸트랜스퍼라아제의 비제한적인 예는 Dnmt1, Dnmt3A, 및 Dnmt3B를 포함한다. 양태에서, DNA 메틸트랜스퍼라아제는 포유동물 DNA 메틸트랜스퍼라아제이다. 양태에서, DNA 메틸트랜스퍼라아제는 인간 DNA 메틸트랜스퍼라아제이다. 양태에서, DNA 메틸트랜스퍼라아제는 마우스 DNA 메틸트랜스퍼라아제이다. 양태에서, DNA 메틸트랜스퍼라아제는 박테리아 시토신 메틸트랜스퍼라아제 및/또는 박테리아 비-시토신 메틸트랜스퍼라아제이다. 특정 DNA 메틸트랜스퍼라아제에 따라, DNA의 상이한 영역이 메틸화된다. 예를 들어, Dnmt3A는 일반적으로 메틸화를 위해 CpG 디뉴클레오티드를 표적으로 한다. DNA 메틸화를 통해, DNA 메틸트랜스퍼라아제는 DNA 서열을 변경하지 않으면서 DNA 세그먼트의 활성(예를 들어, 유전자 발현)을 변경할 수 있다. 양태에서, DNA 메틸화는 유전자 전사의 억제 및/또는 메틸화 민감 전사 인자 또는 CTCF의 조정을 초래한다. 본원에 기재된 것과 같이, 융합 단백질은 하나 이상(예를 들어, 2개)의 DNA 메틸트랜스퍼라아제를 포함할 수 있다. DNA 메틸트랜스퍼라아제가 융합 단백질의 일부로서 포함되는 경우, DNA 메틸트랜스퍼라아제는 "DNA 메틸트랜스퍼라아제 도메인"으로서 지칭될 수 있다.
본원에 언급된 "Dnmt3A", "Dnmt3a", "DNA (시토신-5)-메틸트랜스퍼라아제 3A" 또는 "DNA 메틸트랜스퍼라아제 3a" 단백질은 Dnmt3A 효소 활성을 (예를 들어, Dnmt3A에 비해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 내에서) 유지하는 임의의 재조합 또는 자연-발생 형태의 Dnmt3A 효소 또는 이의 변이체 또는 상동체를 포함한다. 양태에서, 변이체 또는 상동체는 자연 발생 Dnmt3A 단백질과 비교하여, 전체 서열 또는 서열 일부(예를 들어, 50개, 100개, 150개 또는 200개의 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 양태에서, Dnmt3A 단백질은 UniProt 기준 번호 Q9Y6K1로 식별된 단백질 또는 이에 대해 실질적 동일성을 갖는 변이체 또는 상동체와 실질적으로 동일하다.
"이중 류신 지퍼 키나아제", "DLK" 또는 "DLK 단백질"은 미토겐-활성화된 단백질 키나아제 키나아제 키나아제(MAP3K) 혼합 계통 키나아제 패밀리 구성원 및 ser/thr 키나아제 슈퍼패밀리의 구성원이다. DLK는 신경 세포 사멸 신호전달을 포함한 신경 키나아제 신호전달 경로에서 역할을 한다. DLK는 N-말단 도메인, 촉매 도메인, 2개의 류신 지퍼를 포함하는 류신 지퍼 도메인, 및 C-말단 도메인을 포함한다. 인간 DLK는 세포유전학적으로 염색체 영역 12q13.13에 국소화되어 있는 미토겐-활성화된 단백질 키나아제 키나아제 키나아제 12 유전자(MAP3K12)에 의해 인코딩된다. "인간 DLK"는 스플라이스 변이체를 포함하여 인간 MAP3K12 유전자에 의해 인코딩된 임의의 대립형질 형태를 지칭한다. 양태에서, DLK 단백질은 UniProt 기준 번호 Q12852에서 식별된 단백질, 예를 들어 UniProtKB Q12852에 지정된 이소폼 1 및 이소폼 2와 실질적으로 동일하다. "DLK"는 인간 및 비인간 DLK 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 마우스 또는 래트 DLK 서열과 같은 포유동물 DLK 서열을 지칭할 수 있다.
"류신 지퍼 키나아제", "LZK", 또는 "LZK 단백질"은 신경 세포 사멸을 포함한 신경 신호전달 경로에서도 역할을 하는 DLK와 구조적으로 관련된 MAP3K 패밀리 구성원이다. LZK는 N-말단 도메인, 촉매 도메인("키나아제 도메인"), 2개의 류신 지퍼를 포함하는 류신 지퍼 도메인, 및 C-말단 도메인을 포함한다. 인간 LZK는 세포유전학적으로 염색체 영역 3q27.2에 국소화되어 있는 미토겐-활성화된 단백질 키나아제 키나아제 키나아제 13 유전자(MAP3K13)에 의해 인코딩된다. "인간 LZK"는 스플라이스 변이체를 포함하여 인간 MAP3K13 유전자에 의해 인코딩된 임의의 대립형질 형태를 지칭한다. 예시적인 인간 LZK 폴리펩티드 서열은 UniProtKB 엔트리 O43283에서 이용가능하다. 이소폼 1(O42283-1)은 표준 이소폼으로서 UniProt 항목에서 지정된다. "LZK"는 인간 및 비인간 LZK 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 마우스 및 래트 DLK 서열과 같은 포유동물 LZK 서열을 지칭할 수 있다. 양태에서, LZK 단백질은 UniProt 기준 번호 O43283에서 식별된 단백질과 실질적으로 동일하다.
DLK 또는 LZK에 대한 용어 "우성 음성"은 우성 음성 DLK 단백질 변이체(dnDLK) 또는 LZK의 우성 음성 형태(dnLZK), 예를 들어 내인성 야생형 DLK가 발현되는 신경에서 발현될 때 신경보호성인 LZK의 류신 지퍼 도메인 또는 이의 변이체를 지칭한다. 특정 메커니즘에 구속되지 않으면서, dnDLK는 DLK 동종이량체화를 억제할 수 있고, 우성 음성 LZK는 DLK-LZK 이종이량체화를 억제할 수 있다.
본원에서 언급된 "SARM1" 또는 "SARM1 단백질"은 SARM1 활성을 (예를 들어, SARM1에 비해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 내에서) 유지하는, NAD(+) 히드롤라아제 SARM1, 또는 NADase SARM1, 또는 이의 변이체 또는 상동체로도 알려진 임의의 재조합 또는 자연-발생 형태의 SARM1을 포함한다. 양태에서, 변이체 또는 상동체는 자연 발생 SARM1 단백질과 비교하여, 전체 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 50개, 100개, 150개 또는 200개의 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 양태에서, SARM1 단백질은 UniProt 기준 번호 Q6SZW1로 식별된 단백질 또는 이에 대해 실질적 동일성을 갖는 변이체 또는 상동체와 실질적으로 동일하다. SARM1에 관한 용어 "우성 음성"은 신경보호성인 우성 음성 SARM1(dnSARM1) 또는 이의 변이체를 지칭한다. 과학적 이론에 얽매이지 않으면서, 우성 음성 SARM1은 야생형 SARM1과 비기능적 복합체를 형성하여, 야생형 SARM1의 축삭 퇴화 활성을 억제하거나 하향조절할 수 있다.
본원에서 언급된 "NMNAT1" 또는 "NMNAT1 단백질"은 NMNAT1 활성을 (예를 들어, NMNAT1에 비해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 내에서) 유지하는, 니코틴아미드/니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐릴트랜스퍼라아제 1, 니코틴아미드-뉴클레오티드 아데닐릴트랜스퍼라아제 1, 또는 이의 변이체 또는 상동체로도 알려진 임의의 재조합 또는 자연-발생 형태의 NMNAT1을 포함한다. 양태에서, 변이체 또는 상동체는 자연 발생 NMNAT1 단백질과 비교하여, 전체 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 50개, 100개, 150개 또는 200개의 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 양태에서, NMNAT1 단백질은 UniProt 기준 번호 Q9HAN9로 식별된 단백질 또는 이에 대해 실질적 동일성을 갖는 변이체 또는 상동체와 실질적으로 동일하다. 세포질 NMNAT는 3가지 인간 NMNAT 파라로그 중 하나이다. 세포질 NMNAT는 뇌에 풍부할 수 있으며, 신경 세포 사멸을 억제할 수 있다(문헌[Tang, B.L. Why is NMNAT Protective against Neuronal Cell Death and Axon Degeneration, but Inhibitory of Axon Regeneration? Cells 2019, 8, 267. https://doi.org/10.3390/cells8030267]).
용어 "항체"는 항원에 특이적으로 결합하고 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이의 기능적 단편에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 지칭한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론, 및 뮤 불변 영역 유전자뿐만 아니라, 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되고, 결과적으로 각각 면역글로불린 부류 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 한정한다.
예시적인 면역글로불린(항체) 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 폴리펩티드 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경"쇄(약 25 kDa) 및 하나의 "중"쇄(약 50 내지 70 kDa)를 갖는다. 각 사슬의 N-말단은 주로 항원 인식을 책임지는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 용어 "가변 중쇄", "VH" 또는 "VH"는 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 지칭하며; 용어 "가변 경쇄", "VL" 또는 "VL"은 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab를 포함하는 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 지칭한다.
항체 기능성 단편의 예는 비제한적으로 완전 항체 분자, 항체 단편, 예컨대 Fv, 단쇄 Fv(scFv), 상보성 결정 영역(CDR), VL(경쇄 가변 영역), VH(중쇄 가변 영역), Fab, F(ab)2' 및 이들의 임의의 조합 또는 표적 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 펩티드의 임의의 다른 기능성 부분을 포함한다(예를 들어, 문헌[Fundamental Immunology(Paul ed., 4th ed. 2001)] 참조). 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 다양한 항체 단편은 다양한 방법, 예를 들어 펩신과 같은 효소를 사용한 온전한 항체의 소화; 또는 새로운 합성에 의해 수득될 수 있다. 항체 단편은 흔히 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론을 사용하여 새로운 방식으로 합성된다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 항체는 전장 항체의 변형에 의해 생성된 항체 단편, 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 새롭게 합성된 것(예를 들어, 단쇄 Fv) 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 식별된 것을 포함한다(예를 들어, 문헌[McCafferty et al., (1990) Nature 348:552] 참조). 용어 "항체"는 또한 2가 또는 이중특이적 분자, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 2가 및 이중특이적 분자는 예를 들어 문헌[Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148:1547], 문헌[Pack and Pluckthun (1992) Biochemistry 31:1579], 문헌[Hollinger et al.(1993), PNAS. USA 90:6444, Gruber et al. (1994) J Immunol. 152:5368], 문헌[Zhu et al. (1997) Protein Sci. 6:781], 문헌[Hu et al. (1996) Cancer Res. 56:3055], 문헌[Adams et al. (1993) Cancer Res. 53:4026], 및 문헌[McCartney, et al. (1995) Protein Eng. 8:301]에 기재되어 있다.
나노바디와 같은 단쇄 항체는 이중특이적 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다. 나노바디는 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌[Morrison C., Nat Rev Drug Dis 18: 485-487, 2019; Pedersen D.V., et al., Mol Immunol 124:200-210, 2020]에 기재되어 있다.
단백질 또는 펩티드를 언급할 때, 항체에 "특이적으로(또는 선택적으로) 결합한다" 또는 "특이적으로(또는 선택적으로) 면역반응성인"이라는 구절은 종종 단백질 및 다른 생물제제의 이종 집단에서 단백질의 존재를 결정하는 결합 반응을 나타낸다. 따라서, 지정된 면역어세이 조건 하에, 명시된 항체는 배경보다 적어도 2배, 보다 일반적으로 배경보다 10배 내지 100배 더 많이 특정 단백질에 결합한다. 이러한 조건 하에 항체에 대한 특이적 결합은 특정 단백질에 대한 특이성에 대해 선택되는 항체를 필요로 한다. 예를 들어, 다중클론 항체는 선택된 항원에 특이적으로 면역반응하고, 다른 단백질과는 면역반응하지 않는 항체의 하위집합만을 획득하도록 선별될 수 있다. 이러한 선별은 다른 분자와 교차-반응하는 항체를 차감함으로써 달성될 수 있다. 다양한 면역어세이 포맷이 특정 단백질과 특이적으로 면역반응하는 항체를 선별하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역어세이는 단백질과 특이적으로 면역반응하는 항체를 선별하는 데 일상적으로 사용된다(예를 들어, 특이적 면역반응성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 면역어세이 포맷과 조건의 설명에 관한 문헌[Harlow & Lane, Using Antibodies, Laboratory Manual (1998)] 참조).
핵산은 다른 핵산 서열(예를 들어, 프로모터)과 기능적 관계에 놓이는 경우 "작동가능하게 연결"된다. 광범위하게 말해, 프로모터(예를 들어, 프로모터10 등) 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우, 코딩 서열(예를 들어, 제1 이종 핵산 서열, 제2 이종 핵산 서열)에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 리보좀 결합 부위는 번역을 촉진하도록 위치하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결됨은 연결되는 뉴클레오티드 서열이 일반적으로 연속적이라는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 일반적으로 프로모터로부터 수 킬로베이스만큼 이격될 때 기능하며, 인트론 서열은 가변 길이일 수 있기 때문에, 일부 폴리뉴클레오티드 요소는 작동가능하게 연결될 수 있지만 직접적으로 플랭킹되지 않고, 심지어 상이한 대립유전자 또는 염색체로부터 트랜스 기능을 할 수 있다. 연결은 편리한 부위에서 결찰에 의해 달성될 수 있다. 상기 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커는 종래의 관행에 따라 사용된다. 본원에 기재된 프로모터에 관하여, 프로모터는 프로모터가 서열(들)의 전사를 제어(증가)하기 위해 코딩 서열(들)과 관련된 위치 및/또는 배향에 있을 때 프로모터에 대해 5' 및/또는 프로모터에 대해 3'의 코딩 서열(예를 들어, 제1 이종 핵산 서열 및 제2 이종 핵산 서열)에 작동가능하게 연결한다(또는 동등하게는 "작동가능하게 위치한다"). 코딩 서열(들)(예를 들어, 제1 이종 핵산 서열 및 제2 이종 핵산 서열)은, 예시를 위해 비제한적으로, 독립적으로 DNA, mRNA, 가이드 RNA, 및 억제성 RNA(예를 들어, snRNA, miRNA, siRNA, shRNA)로부터 선택될 수 있다.
용어 "유전자"는 단백질 생성에 관여한 DNA의 세그먼트를 의미하며; 이는 코딩 영역의 앞뒤 영역(리더 및 트레일러)뿐만 아니라 개별 코딩 세그먼트(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함한다. 리더, 트레일러를 비롯한 인트론은 유전자의 전사 및 번역 동안 필요한 조절 요소를 포함한다. 또한, "단백질 유전자 산물"은 특정 유전자로부터 발현된 단백질이다.
용어 "플라스미드", "벡터" 또는 "발현 벡터"는 유전자 및/또는 유전자 발현에 필요한 조절 요소를 인코딩하는 핵산 분자를 지칭한다. 플라스미드로부터 유전자의 발현은 시스 또는 트랜스로 일어날 수 있다. 유전자가 시스로 발현되는 경우, 유전자 및 조절 요소는 동일한 플라스미드에 의해 인코딩된다. 트랜스로의 발현은 유전자 및 조절 요소가 개별 플라스미드에 의해 인코딩되는 경우를 말한다.
폴리뉴클레오티드(예를 들어, 핵산 서열 또는 올리고뉴클레오티드) 또는 펩티드(예를 들어, 아미노산 서열 또는 단백질)의 맥락에서 용어 "변이체" 또는 "유도체"는 기준 서열과 일부 서열 유사성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 펩티드 서열을 지칭할 수 있다. 일부 예에서, 변이체 또는 유도체는 이의 기준 서열에 대해 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성(또는 유사성 또는 상동성과 동등하게 사용됨)을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 펩티드 서열의 맥락에서 용어 "기능적 유도체" 또는 "기능적 변이체"는 활성을 실질적인 수준, 예를 들어 기준 서열의 활성의 적어도 30% 이상으로 유지하는 임의의 변이체 또는 유도체를 지칭할 수 있다.
예를 들어, 바이러스, 세포, 핵산, 단백질, 또는 벡터와 관련하여 사용된 경우, 용어 "재조합"은 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변경된 것, 또는 세포가 이와 같이 변경된 세포 유래인 것을 나타낸다. 예를 들어, 재조합 바이러스는 재조합 핵산 기술을 사용하여 핵산의 일부를 조합함으로써 생성된다. 예를 들어, 재조합 바이러스는 하나 이상의 바이러스 유전자를 이종 유전자로 대체함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 재조합 바이러스는 바이러스 프로모터를 이종 프로모터(예를 들어, 이종 프로모터(예를 들어, 프로모터 10 등))로 대체함으로써 생성될 수 있다. 따라서, 실시형태에서, 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 바이러스는 재조합 바이러스이다. 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 천연(비(non)-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 아니면 비정상적으로 발현되고, 과소 발현되거나 전부 발현되지 않는 천연 유전자를 발현한다. 따라서, 실시형태에서, 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 세포(예를 들어, 뉴런, RGC, 광수용체 세포, RPE 세포 등)는 재조합 세포이다. 형질전환 세포와 식물은 일반적으로 재조합 방법의 결과로서 이종 유전자 또는 코딩 서열을 발현하는 것이다.
용어 "이종"은 핵산의 일부와 관련하여 사용될 때 핵산이 자연에서 서로에 대한 동일한 관계로 발견되지 않는 둘 이상의 하위서열을 포함함을 나타낸다. 예를 들어, 일반적으로 새로운 기능성 핵산, 예를 들어 하나의 공급원으로부터의 프로모터 및 다른 공급원으로부터의 코딩 영역을 만들기 위해 배열된 관련되지 않은 유전자로부터의 둘 이상의 서열을 갖는 핵산은 재조합적으로 생성된다. 유사하게, 이종 단백질은 단백질이 자연에서 서로 동일한 관계로 발견되지 않는 둘 이상의 하위서열을 포함한다는 것을 나타낸다(예를 들어, 융합 단백질). 핵산 서열과 관련하여 사용된 경우, "이종"은 핵산 서열이 하나 이상의 개별 핵산 서열(예를 들어, 프로모터(예를 들어, 프로모터10))과 사실상 동일한 관계로 발견되지 않음을 나타내며, 여기서 핵산 서열과 하나 이상의 개별 핵산 서열은 더 긴 핵산 서열 내 하위서열이다. 예를 들어, 일반적으로 새로운 기능성 핵산, 예를 들어 하나의 공급원으로부터의 프로모터 및 다른 공급원으로부터의 코딩 영역을 만들기 위해 배열된 관련되지 않은 유전자로부터의 둘 이상의 하위서열을 갖는 더 긴 서열은 재조합적으로 생성된다. 유사하게, 이종 펩티드 서열은 펩티드 서열이 개별 펩티드 서열과 사실상 동일한 관계로 발견되지 않음을 나타내며, 여기서 펩티드 서열과 개별 펩티드 서열은 더 긴 펩티드(예를 들어, 융합 단백질) 내의 하위서열이다. 또한 핵산 또는 폴리펩티드는 유전적 변경 없이 세포에서의 발현 수준에 비해 이들이 세포에서 자연적으로 발생하는 핵산 또는 폴리펩티드의 변형된 버전이거나, 세포에 대한 유전적 조작이 발현의 변경, 예를 들어 과발현을 유도하는 경우, 세포에 "이종"인 것으로도 간주된다.
용어 "외인성"은 제시된 세포, 유기체, 또는 바이러스의 외부에서 유래하는 분자 또는 물질(예를 들어, 화합물, 핵산 또는 단백질)을 지칭한다. 반대로, 용어 "내인성"은 제시된 세포, 유기체, 또는 바이러스의 내부에서 유래하거나, 내부에 유래하는 분자 또는 물질을 지칭한다. 실시형태에서, 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 프로모터(예를 들어, 프로모터 10)는 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 바이러스(예를 들어, AAV 등)에 대해 외인성이다. 실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열 및 제2 이종 핵산 서열은 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 바이러스(예를 들어, AAV 등)에 대해 외인성이다.
핵산 또는 단백질에 적용될 때 "단리된"이라는 용어는 핵산 또는 단백질에 자연 상태와 관련이 있는 다른 세포 구성요소가 본질적으로 존재하지 않음을 나타낸다. 이는 예를 들어 균질한 상태일 수 있으며, 건조 또는 수용액에 있을 수 있다. 순도 및 균질도는 일반적으로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기법을 사용하여 결정된다. 제제에 존재하는 주된 종인 핵산은 실질적으로 정제된다.
용어 "형질주입", "형질도입", "형질주입시키는" 또는 "형질도입하는"은 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 핵산 분자 또는 단백질을 세포에 도입하는 과정으로 정의된다. 비-바이러스 또는 바이러스 기반의 방법을 사용하여 핵산은 세포에 도입된다. 핵산 분자는 완전한 단백질 또는 이의 기능적 부분을 인코딩하는 유전자 서열일 수 있다. 비-바이러스 형질주입 방법은 핵산 분자를 세포에 도입하기 위한 전달 시스템으로서 바이러스 DNA 또는 바이러스 입자를 사용하지 않는 임의의 적절한 형질주입 방법을 포함한다. 예시적인 비-바이러스 형질주입 방법은 칼슘 포스페이트 형질주입, 리포좀 형질주입, 뉴클레오펙션, 소노포레이션(sonoporation), 열 충격을 통한 형질주입, 마그네티펙션(magnetifection) 및 전기천공을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 당업계에 잘 알려진 표준 절차에 따라 전기천공을 사용하여 세포에 도입된다. 바이러스 기반의 형질주입 방법의 경우, 임의의 유용한 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노-관련 바이러스 벡터)가 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 바이러스 벡터의 예는 비제한적으로 레트로바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함한다. 실시형태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 당업계에 잘 알려진 표준 절차에 따라 AAV 벡터를 사용하여 세포에 도입된다. 용어 "형질주입" 또는 "형질도입"은 또한 외부 환경으로부터 세포에 단백질을 도입하는 것을 지칭한다. 실시형태에서, 단백질의 형질도입 또는 형질주입은 관심 단백질에 대한 세포막을 통과할 수 있는 펩티드 또는 단백질의 부착에 의존한다. 예를 들어, 문헌[Ford et al. (2001) Gene Therapy 8:1-4] 및문헌[Prochiantz (2007) Nat. Methods 4:119-20]을 참조한다.
"형질도입하다" 또는 "형질도입"은 이의 보통의 통상적 의미에 따라 사용되며, 하나 이상의 외래 핵산(즉, DNA가 세포에서 자연적으로 발견되지 않음)이 세포에 도입되는 과정을 의미한다. 일반적으로, 형질도입은 세포에 바이러스 또는 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터)의 도입에 의해 발생한다. 예를 들어, 양방향 프로모터를 포함하는 AAV 벡터가 세포에 형질도입될 수 있다.
유전자와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 단어 "발현" 또는 "발현된"은 그 유전자의 전사 및/또는 번역 산물을 의미한다. 세포에서 DNA 분자의 발현 수준은 세포 내에 존재하는 상응하는 mRNA의 양 또는 세포에 의해 생산된 해당 DNA에 의해 인코딩된 단백질의 양을 기초로 하여 결정될 수 있다. 비-코딩 핵산 분자(예를 들어, siRNA)의 발현 수준은 당업계에 잘 알려진 표준 PCR 또는 노던 블롯 방법에 의해 검출될 수 있다. 문헌[Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 18.1-18.88]을 참조한다.
"표지" 또는 "검출가능한 모이어티"는 분광분석, 광화학, 생화학, 면역화학, 화학 또는 다른 물리적 수단에 의해 검출할 수 있는 조성물이다. 예를 들어, 유용한 표지는 32P, 형광성 염료, 전자-조밀 시약, 효소(예를 들어, ELISA에서 일반적으로 사용됨), 비오틴, 디곡시게닌 또는 합텐 및 단백질 또는 예를 들어 표적 펩티드와 특이적으로 반응하는 펩티드 또는 항체 내로 방사능 표지를 도입함으로써 검출가능하게 만들 수 있는 다른 물질을 포함한다. 표지에 항체를 콘쥬게이션하기 위한 당업계에 알려진 임의의 적절한 방법은 예를 들어 문헌[Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego]에 기재된 방법을 사용하여 이용될 수 있다.
"접촉"은 이의 보통의 통상적 의미에 따라 사용되며, 둘 이상의 별개의 종(예를 들어, 생체분자 또는 세포를 포함하는 화학적 화합물)이 반응, 상호작용 또는 물리적으로 접촉하도록 충분히 근접하게 만드는 과정을 지칭한다. 그러나, 생성되는 반응 생성물은 첨가된 시약들 사이의 반응으로부터 또는 반응 혼합물에서 생성될 수 있는 하나 이상의 첨가된 시약으로부터의 중간체로부터 직접 생성될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "접촉하는"은 2가지 종이 반응, 상호작용 또는 물리적으로 접촉하도록 허용하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 2가지 종은 예를 들어 본원에 기재된 바이러스 및 뉴런일 수 있다. 실시형태에서, 접촉은 예를 들어 본원에 기재된 바이러스가 물리적으로 세포(예를 들어, 뉴런)를 접촉하도록 하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 접촉은 예를 들어 본원에 기재된 핵산이 물리적으로 세포(예를 들어, 뉴런)를 접촉하도록 하는 것을 포함한다.
"대조군" 또는 "표준 대조군"은 시험 샘플, 측정치 또는 값과의 비교를 위해, 기준치, 통상적으로 알려진 기준치의 역할을 하는 샘플, 측정치 또는 값을 지칭한다. 예를 들어, 시험 샘플은 제시된 질환(예를 들어, 암)을 갖는 것으로 의심되는 환자로부터 얻어질 수 있고, 알려진 정상(비-질환) 개체(예를 들어, 표준 대조군 대상체)와 비교될 수 있다. 표준 대조군은 제시된 질환을 갖지 않는 유사한 개체(예를 들어, 표준 대조군 대상체)의 집단(즉, 표준 대조군 집단), 예를 들어 유사한 의학적 배경, 동일한 연령, 체중 등을 가진 건강한 개체로부터 수집된 평균 측정치 또는 값을 나타낼 수도 있다. 표준 대조군 값은 동일한 개체로부터, 예를 들어 질환 발병 전 환자로부터 조기에 얻은 샘플로부터 얻을 수도 있다. 예를 들어, 대조군은 약학 데이터(예를 들어, 반감기) 또는 치료적 측정(예를 들어, 부작용의 비교)을 기반으로 치료 이득을 비교하기 위해 고안될 수 있다. 대조군은 또한 데이터의 유의성을 결정하는 데 유용하다. 예를 들어, 주어진 매개변수에 대한 값이 대조군에서 광범위하게 가변적인 경우, 테스트 샘플에서 변동은 유의한 것으로서 고려되지 않을 것이다. 당업자는 임의의 수의 매개변수(예를 들어, RNA 수준, 단백질 수준, 특정 세포 유형, 특정 체액, 특정 조직 등)의 평가를 위해 표준 대조군이 설계될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
당업자는 표준 대조군이 제시된 상황에서 가장 적절하고, 표준 대조군 값의 비교를 기반으로 데이터를 분석할 수 있음을 이해할 것이다. 표준 대조군은 데이터의 유의성(예를 들어, 통계학적 유의성)을 결정하기 위해서도 가치가 있다. 예를 들어, 제시된 매개변수에 대한 값이 표준 대조군에서 광범위하게 변동적이면, 시험 샘플의 변동은 유의한 것으로 고려되지 않을 것이다.
"생물학적 샘플" 또는 "샘플"은 대상체 또는 환자로부터 획득하거나 유도된 물질을 지칭한다. 생물학적 샘플은 조직학적 목적으로 채취된 조직 절편, 예컨대 생검 및 부검 샘플, 및 냉동 절편을 포함한다. 이러한 샘플은 체액, 예컨대 혈액 및 혈액 분획 또는 생성물(예를 들어, 혈청, 혈장, 혈소판, 적혈구 세포 등), 객담, 조직, 배양된 세포(예를 들어, 초대 배양물, 외이식편 및 형질전환된 세포), 대변, 소변, 활액, 관절 조직, 활액 조직, 활막세포, 섬유모세포-유사 활막세포, 대식구-유사 활막세포, 면역 세포, 조혈 세포, 섬유모세포, 대식구, T 세포 등을 포함한다. 생물학적 샘플은 일반적으로 진핵생물 유기체, 예컨대 영장류, 예를 들어 침팬지 또는 인간과 같은 포유류; 소; 개; 고양이; 설치류, 예를 들어 기니피그, 래트, 마우스; 토끼; 또는 조류; 파충류; 또는 어류로부터 획득된다.
본원에서 사용된 "세포"는 이의 게놈 DNA를 보존하거나 복제하기에 충분한 물질대사 또는 다른 기능을 수행하는 세포를 지칭한다. 세포는 예를 들어 온전한 막의 존재, 특정 염료에 의한 염색, 자손을 생산하는 능력, 또는 생식세포의 경우에 생존가능한 자손을 생산하도록 제2 생식세포와 조합하는 능력을 포함하는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 식별될 수 있다. 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포를 포함할 수 있다. 원핵 세포는 세균을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 진핵 세포는 비제한적으로 효모 세포, 및 식물 및 동물, 예를 들어 포유류, 곤충(예를 들어, 스포도프테라속(Spodoptera)) 및 인간 세포에서 유래된 세포를 포함한다. 실시형태에서, 세포는 인간 세포이다. 실시형태에서, 세포는 신경절 세포이다. 실시형태에서, 세포는 신경 세포이다. 세포는 자연적으로 비-부착성이거나, 예를 들어 트립신처리에 의해 표면에 부착되지 않도록 처리될 때 유용할 수 있다.
용어 "망막 신경절 세포" 또는 "RGC"는 눈의 망막의 내부 표면(신경절 세포 층) 근처에 위치한 뉴런 유형을 지칭한다. RGC는 양극성 세포와 무축삭 세포라는 두 가지 중간 뉴런 유형을 통해 광수용체로부터 정보를 받고, 정보를 뇌 영역으로 전달한다. RGC는 크기와 시각적 자극에 대한 반응 측면에서 매우 다양하지만 모두 뇌까지 확장되는 긴 축삭을 갖는다. RGC 손실은 녹내장을 포함하는 다수의 시신경병증의 특징이다.
용어 "광수용체 세포"는 망막에서 발견된 일종의 신경상피 세포를 지칭한다. 광수용체 세포는 광자를 흡수하여 세포막 전위에서 변화를 유발하여 감각 반응을 자극한다. 막대 광수용체 세포는 빛에 민감하며, 어두운 조명 조건 하에서 작동한다. 원뿔 광수용체 세포는 주변 및 밝은 조명 조건 하에서 기능하고, 빛 강도의 변화에 신속하게 반응하며, 색각과 높은 시력을 담당한다. 불량한 광수용체 발달, 기능 또는 생존은 색소성 망막염 및 황반 변성을 포함하는 망막 질환의 특징이다.
용어 "망막 색소 상피 세포" 또는 "RPE 세포"는 망막 외부의 색소 층을 형성하는 세포를 지칭한다. 색소 층은 Bruch의 막(맥락막 내부 경계)과 광수용체 사이에 위치한다. RPE는 망막에 영양분을 공급하는 중간체로서, 망막 발달, 빛 흡수, 성장 인자 분비, 및 눈의 면역 반응 매개를 포함하는 다수의 기능을 보조한다. RPE의 기능 장애는 색소성 망막염, 당뇨병성 망막증, 웨스트 나일 바이러스, 및 황반 변성을 포함하는 시력 상실 또는 실명을 초래할 수 있다.
용어 "바이러스" 또는 "바이러스 입자"는 바이러스 게놈(예를 들어, DNA, RNA, 단일 가닥, 이중 가닥)을 갖는 비리온을 지칭한다. 실시형태에서, 바이러스는 바이러스 캡시드 및 관련 단백질, 일부 경우에(예를 들어, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스), 지질 및 선택적으로 숙주막의 성분을 포함하는 엔벨로프, 및/또는 바이러스 단백질을 포함한다.
"폭스바이러스"는 숙주의 세포질에서 복제되는 척추동물 및 무척추동물을 감염시킬 수 있는 폭스비리다에(Poxviridae) 과의 구성원을 지칭한다. 실시형태에서, 폭스바이러스 비리온은 직경이 약 200 nm이고, 길이가 약 300 nm인 크기를 가지며, 일반적으로 130 내지 375 킬로베이스의 단일, 선형, DNA 이중 가닥 세그먼트에 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 폭스바이러스는 백시니아 바이러스이다.
용어 "단순 헤르페스 바이러스" 또는 "HSV"는 헤르페스비리다에(Herpesviridae) 과의 구성원을 지칭한다. 단순 헤르페스 바이러스 1 및 2(HSV-1 및 HSV-2)는 대다수의 인간에서 바이러스 감염을 일으키는 바이러스 세트인 인간 헤르페스비리다에 과의 두 구성원이다. 헤르페스비리다에는 모두 공통 구조를 공유하고, 지질 이중층 막에 둘러싸여 있는 정이십면체 캡시드 내에 싸여진 100 내지 200개의 유전자를 인코딩하는 상대적으로 큰 이중 가닥, 선형 DNA 게놈으로 구성되어 있는 DNA 바이러스의 대규모 과(family)이다. 종양용해성 헤르페스 바이러스는 상이한 유형의 HSV에서 유래될 수 있다. 양태에서, 종양용해성 헤르페스 바이러스는 HSV-1이다. 양태에서, 종양용해성 헤르페스 바이러스는 HSV-2이다.
아데노바이러스는 뉴클레오캡시드와 이중 가닥 선형 DNA 게놈으로 구성된 중간 크기(90 내지 100 nm), 외피가 없는(네이키드), 정이십면체 바이러스이다. 아데노바이러스는 숙주의 복제 기구를 사용하여 포유동물 세포의 핵에서 복제된다. 용어 "아데노바이러스"는 비제한적으로 인간, 소, 양, 말, 개, 돼지, 쥐 및 유인원 아데노바이러스 아속을 포함하는 아데노비리디아에(Adenoviridiae) 속의 임의의 바이러스를 지칭한다.
본원에서 사용된, 용어 "렌티바이러스"는 복합 레트로바이러스의 그룹(또는 속)을 지칭한다. 렌티바이러스는 RNA 게놈을 갖고, 숙주 세포 게놈에 통합되기 전에 RNA를 DNA로 전환하는 역전사효소를 포함한다. 렌티바이러스는 비제한적으로 하기를 포함한다: HIV(HIV 1형, 및 HIV 2형을 포함하는 인간 면역결핍 바이러스); 비스나-매디 바이러스(VMV) 바이러스; 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV); 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역결핍 바이러스(BIV); 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV).
용어 "복제하다"는 이의 통상의 일반적 의미에 따라 사용되며, 자손을 생산하기 위한 세포 또는 바이러스의 능력을 지칭한다. 당업자는 복제라는 용어가 DNA와 관련하여 사용될 때 하나의 원래의 DNA 분자로부터 두 개의 동일한 DNA 복제물을 생성하는 생물학적 과정을 지칭한다는 것을 즉시 이해할 것이다. 따라서, 용어 "복제"는 자손 세포의 계대 및 재감염을 포함한다. 바이러스의 맥락에서, 용어 "복제"는 숙주 세포에서 복제(바이러스 게놈을 복제하고, 상기 게놈을 바이러스 입자로 패키징함)한 후, 후속적으로 숙주 세포로부터 자손 바이러스를 방출하여 숙주 세포의 용해를 초래하는 바이러스의 능력을 포함한다.
용어 "플라크 형성 단위"는 바이러스학에서의 이의 통상의 일반적 의미에 따라 사용되며, 바이러스 입자의 부피당 형성될 수 있는 세포 단층의 플라크의 양을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 단위는 감응성 세포의 단층을 감염시킬 때 형성될 수 있는 플라크의 수를 기준으로 한다. 예를 들어, 실시형태에서, 1,000 PFU/μl는 바이러스 입자를 포함하는 1 μl의 용액이 세포 단층에 1000개의 감염성 플라크를 생성하기에 충분한 바이러스 입자를 함유함을 나타낸다. 실시형태에서, 플라크 형성 단위는 "PFU"로 약칭된다.
용어 "감염 다중도" 또는 "MOI"는 바이러스학에서 이의 통상의 일반적 의미에 따라 사용되며, 제시된 면적 또는 부피에서 표적(예를 들어, 세포)에 대한 감염원(예를 들어, 아데노-관련 바이러스)의 비를 지칭한다. 실시형태에서, 면적 또는 부피는 균질한 것으로 가정된다.
용어 "질환" 또는 "병태"는 본원에 제공된 화합물 또는 방법으로 치료될 수 있는 환자 또는 대상체의 상태 또는 건강 상태를 나타낸다. 질환은 신경퇴행성 질환일 수 있다. 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 녹내장(개방각 및 협각/폐쇄각 녹내장, 원발성 및 속발성 녹내장, 정상 안압 및 고-IOP 녹내장 포함), 건성(비삼출성) 및 습성(삼출성, 신생혈관) AMD를 포함한 연령 관련 황반 변성(AMD), 맥락막 신생혈관(CNV), 맥락막 신생혈관막(CNVM), 낭포 황반 부종(CME), 망막전막(ERM) 및 황반 천공, 근시 관련 맥락막 신생혈관, 혈관성 및 혈관 무늬병증(angioid and vascular streak), 망막 박리, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 황반 부종(DME), 망막 색소 상피의 위축성 및 비대성 병변, 망막 정맥 폐쇄, 맥락막 망막 정맥 폐쇄, 황반부종, 신정맥 폐쇄와 관련된 황반 부종, 색소성 망막염 및 기타 유전성 망막 변성(예를 들어, 스타가르트병), 미숙아 망막병증, 독성 시신경병증(예를 들어, 메탄올, 에탐부톨)을 포함한 기타 시신경병증, 비동맥염성 허혈성 시신경병증, 동맥염성 허혈성 시신경병증/거대세포 동맥염, 외상성 시신경병증(외상성 뇌 손상 포함), 특발성 두개내 고혈압 /가성뇌종양, 염증성 시신경병증(예를 들어, 시신경염), 압박성 시신경병증(예를 들어, 뇌하수체 선종), 침윤성 시신경병증(예를 들어, 유육종증, 림프종), 자가면역 시신경병증, 지질 축적 질환(예를 들어, 테이삭스병), 영양 시신경병증, 레버 유전성 시신경병증, 우성 시신경 위축, 프리드리히 실조증, 방사선 유발 시신경병증, 의인성 시신경병증, 우주 비행 관련 신경안증후군(SANS), 눈의 염증 장애, 예를 들어 포도막염, 공막염, 백내장, 굴절 이상, 예를 들어 근시, 원시, 난시 또는 원추각막, 신경영양성 각막병증, 각막 변성증 및 각막 재신경 분포 촉진 및 당뇨병성 각막병증이다.
실시형태에서, 질환은 신경퇴행성 비-안과적 장애이다. 본원에 제공된 조성물(예를 들어, 바이러스 및 핵산)을 사용하여 치료될 수 있는 신경퇴행성 비-안과적 장애는 비제한적으로 근위축성 측삭 경화증(ALS), 알츠하이머병, 파킨슨병, 외상성 뇌 손상, 파킨슨병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 말초 신경병증, 허혈, 뇌졸중, 두개내 출혈, 뇌출혈, 중금속, 산업용 용제, 약물 및 화학요법제로 이루어진 군으로부터 선택된 독성 화합물에 대한 노출로 인한 신경 손상, 신체적, 기계적 또는 화학적 외상 삼차신경통으로 인한 신경계에 대한 손상, 설인두 신경통, 벨 마비, 중증 근무력증, 근이영양증, 진행성 근위축, 원발성 측삭 경화증(PLS), 척수성 근위축, 유전성 근위축, 무척추 디스크 증후군, 경추증, 신경총 장애, 흉곽출구 파괴 증후군, 포르피린증, 가성연수 마비, 진행성 연수 마비, 다계통 위축, 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 루이소체 치매, 전두측두엽 치매, 탈수초성 질환, 길랭-바레 증후군, 다발성 경화증, 샤르코-마리-투스병, 프리온 질병, 크로이츠펠트-야콥병, 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커 증후군(GSS), 치명적인 가족성 불면증(FFI), 소 해면상 뇌병증, 픽병, 간질, AIDS 치매 복합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 우성 음성 폴리펩티드는 헤르페스바이러스 재활성화를 방지하기 위해 이용된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 우성 음성 폴리펩티드는 이상 신경 세포 재생을 방지하기 위해 이용된다. 일부 실시형태에서, 장애는 화학요법-유도 말초 신경병증(CIPN), 예를 들어 화학요법제에 대한 노출로 인한 신경 손상이다. 일부 실시형태에서, 질환은 청력 상실 장애, 예를 들어 연령-관련 청력 상실, 화학요법-유도 청력 상실, 유전성 청력 상실, 아미노글리코시드-유도 청력 상실, 트라우마-유도 청력 상실, 및 소음-유도 청력 상실이다.
물질 또는 질환(예를 들어, 녹내장)과 관련된 물질 활성 또는 기능의 맥락에서 용어 "관련된" 또는 "와 관련된"은 질환이 (전체적으로 또는 부분적으로) 물질 또는 물질 활성 또는 기능에 의해 유발되거나 질환의 증상이 (전체적으로 또는 부분적으로) 물질 또는 물질 활성 또는 기능에 의해 유발된다.
본원에서 사용된 용어 "비정상"은 정상과 다른 것을 나타낸다. 효소적 활성을 설명하는 데 사용될 때, 비정상은 정상 대조군 또는 정상적인 질환에 걸리지 않은 대조군 샘플의 평균보다 크거나 작은 활성을 지칭한다. 비정상 활성은 질환을 생성하는 활성의 양을 지칭할 수 있으며, 여기서 비정상 활성을 (예를 들어, 본원에 기재된 방법을 사용하여) 정상 또는 질환에 걸리지 않은 관련 양으로 되돌리면, 질환 또는 하나 이상의 질환 증상이 감소된다.
"환자" 또는 "이를 필요로 하는 대상체"는 본원에 제공된 바와 같은 조성물 또는 약학 조성물의 투여에 의해 치료될 수 있는 질환(예를 들어, 녹내장 등) 또는 병태를 앓고 있거나 이에 취약한 살아있는 유기체를 지칭한다. 비제한적인 예는 인간, 다른 포유류, 소, 래트, 마우스, 개, 원숭이, 염소, 양, 젖소, 사슴 및 다른 비-포유동물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 환자는 인간이다.
본원에서 사용된, 병태, 질환 또는 장애 또는 병태, 질환 또는 장애와 관련된 증상을 "치료하는 것" 또는 "이의 치료"는 임상 결과를 포함하여 유익하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근 방식을 지칭한다. 유익하거나 원하는 임상 결과는 비제한적으로 전체적이든 또는 부분적이든, 하나의 증상 또는 병태의 완화 또는 경감, 병태, 장애 또는 질환의 정도의 감소, 병태, 장애 또는 질환의 상태의 안정화, 병태, 장애 또는 질환의 발병의 예방, 병태, 장애 또는 질환의 확산의 예방, 병태, 장애 또는 질환 진행의 지연 또는 둔화, 병태, 장애 또는 질환 발병의 지연 또는 둔화, 병태, 장애 또는 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 차도를 포함할 수 있다. "치료하는"은 치료의 부재 하에서 예측된 것 이외에 대상체의 생존을 연장하는 것을 의미할 수도 있다. "치료하는"은 일부 경우에 병태, 장애 또는 질환의 진행을 영구적으로 중단시키는 것을 수반함에도 불구하고, 병태, 장애 또는 질환의 진행을 억제하는 것, 병태, 장애 또는 질환의 진행을 일시적으로 지연시키는 것을 의미할 수도 있다. 본원에서 사용된 용어 "치료", "치료하다", 또는 "치료하는"은 프로테아제의 발현을 특징으로 하는 질환 또는 병태의 증상 또는 프로테아제의 발현을 특징으로 하는 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상의 효과를 감소하는 방법을 지칭한다. 따라서, 개시된 방법에서, 치료는 확립된 질환, 병태, 또는 질환 또는 병태의 증상의 중증도에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 감소를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 질환의 치료 방법은 대조군에 비해 대상체에서 질환의 하나 이상의 증상이 10% 감소한 경우 치료로 간주된다. 따라서, 감소는 천연 또는 대조군 수준에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 10% 내지 100%의 임의의 백분율 감소일 수 있다. 치료는 반드시 질환, 병태, 또는 질환 또는 병태의 증상의 완치 또는 완전한 제거를 지칭하는 것은 아닌 것으로 이해된다. 추가로, 본원에서 사용된, 감소, 저하 또는 억제에 대한 언급은 대조군 수준에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 변경을 포함하며, 상기 용어는 완전한 제거를 포함할 수 있지만, 반드시 포함하지는 않는다.
본원에서 사용된 "치료하는" 및 "치료"는 예방적 치료를 포함한다. 치료 방법은 활성제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 투여 단계는 단일 투여로 유도될 수 있거나, 일련의 투여를 포함할 수 있다. 치료 기간의 길이는 병태의 중증도, 환자의 연령, 활성제의 농도, 치료에 사용되는 조성물의 활성 또는 이의 조합과 같은 다양한 인자에 따라 달라진다. 또한, 치료 또는 예방을 위해 사용되는 약제의 유효 투여량은 특정 치료 또는 예방 치료 계획의 과정에 걸쳐 증가 또는 감소될 수 있다고 인식될 것이다. 투여량의 변경은 당업계에 알려진 표준 진단 어세이에 따라 유도될 수 있으며, 이에 의해 명백해질 수 있다. 일부 예에서, 만성 투여가 필요할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 환자를 치료하기에 충분한 양으로 및 지속기간 동안 대상체에게 투여된다. 실시형태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 예방적인 치료가 아니다.
예방적 사용을 위해, 본원에 기재된 치료적 유효량의 조성물은 초기 발병 전 또는 도중(예를 들어, 암의 초기 징후 및 증상 시) 대상체에게 투여된다. 치료는 질환의 진단 또는 발병 후 치료적 유효량의 본원에 기재된 약제를 대상체에게 투여하는 것을 수반한다.
본원에서 용어 "용량"과 "투여량"은 상호교환적으로 사용된다. 용량은 각 투여에서 개체에게 제공된 활성 성분의 양을 지칭한다. 용량은 제시된 치료의 정상 용량 범위, 투여 빈도; 개체의 크기 및 내성; 병태의 중증도; 부작용의 위험; 및 투여 경로를 포함하는 다수의 인자에 따라 달라질 것이다. 당업자는 용량이 상기 인자에 따라 또는 치료 진행에 따라 변경될 수 있음을 인식할 것이다. 용어 "투여 형태"는 약학적 또는 약학 조성물의 특정 형태를 지칭하고, 이는 투여 경로에 따라 달라진다. 예를 들어, 투여 형태는 네뷸라이저용 액체 형태, 예를 들어 흡입제, 예를 들어 경구 전달용 정제 또는 액제, 또는 예를 들어, 주사용 식염수 형태일 수 있다.
본원에서 사용된 "치료적 유효 용량 또는 치료적 유효량"은 투여되는 효과(예를 들어, 질환의 치료 또는 예방)를 유도하는 용량을 의미한다. 정확한 용량 및 제제는 치료 목적에 따라 달라지며, 알려진 기술(예를 들어, 문헌[Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992)]; 문헌[Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)]; 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor (2003)], 및 문헌[Pickar, Dosage Calculations (1999)] 참조)을 사용하여 당업자에 의해 확인될 것이다. 예를 들어, 제시된 매개변수에 대해, 치료적 유효량은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90% 또는 적어도 100%의 증가 또는 감소를 나타낼 것이다. 치료적 효능은 또한 "배" 증가 또는 감소로서 표현될 수 있다. 예를 들어, 치료적 유효량은 표준 대조군과 비교하여 적어도 1.2배, 1.5배, 2배, 5배 이상의 효과를 가질 수 있다. 치료적 유효 용량 또는 치료적 유효량은 질환의 하나 이상의 증상을 완화할 수 있다. 치료적 유효 용량 또는 치료적 유효량은 투여되는 효과가 질환 발병 위험에 있는 사람을 치료하는 경우, 질환의 발병 또는 질환의 하나 이상의 증상을 예방 또는 지연시킬 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "투여하는"은 이의 통상의 일반적인 의미에 따라 사용되며, 이는 대상체에 대한, 경구 투여, 좌제, 국소 접촉, 정맥내, 비경구, 복강내, 근육내, 병변내, 척수강내, 비강내 또는 피하 투여로서의 투여, 또는 서방형 장치, 예를 들어 소형-삼투압 펌프의 이식을 포함한다. 투여는 비경구 및 경점막(예를 들어, 구강, 설하, 구개, 치은, 비강, 질, 직장 또는 경피)을 포함하는 임의의 경로에 의한 것이다. 비경구 투여는 예를 들어 정맥내, 근육내, 동맥내, 피부내, 피하, 복강내, 심실내 및 두개내를 포함한다. 다른 전달 방식은 비제한적으로 리포좀 제제, 정맥내 주입, 경피 패치 등의 사용을 포함한다. 실시형태에서, 투여는 언급된 활성제 이외의 임의의 활성제의 투여를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 프로모터 10 발현 작제물 및 조성물은 감각 뉴런과 같은 뉴런 세포에 투여된다. 일부 실시형태에서, 프로모터 10 발현 조성물은 망막 세포, 예를 들어 RGC, 광수용체 세포, RPE 세포, 또는 안구 뉴런, 예컨대 양극성 세포, 무축삭 세포 또는 수평 세포에 투여된다. 일부 실시형태에서, 투여는 안내 전달, 예를 들어 유리체강내 주사에 의해 이루어진다.
"병용투여"는 본원에 기재된 조성물이 하나 이상의 추가 치료, 예를 들어 암 치료, 예컨대 화학 치료, 호르몬 치료, 방사선 치료 또는 면역치료의 투여와 동시에, 직전에 또는 직후에 투여되는 것을 의미한다. 본 발명의 화합물은 환자에게 단독으로 투여될 수 있거나 투여될 수 있다. 병용투여는 화합물을 개별적으로 또는 (하나 초과의 화합물과) 병용하여 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것을 포함하는 것으로 여겨진다. 따라서, 제제는 또한 목적하는 경우 (예를 들어, 대사 분해를 감소시키기 위해) 다른 활성 물질과 병용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 국소 경로에 의해 경피적으로 전달될 수 있으며, 도포제 스틱, 용액, 현탁액, 에멀젼, 겔, 크림, 연고, 페이스트, 젤리, 페인트, 분말 및 에어로졸로서 제제화될 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "약학적으로 허용가능한"은 "생리학적으로 허용가능한" 및 "약물학적으로 허용가능한"과 동의어로 사용된다. 약학 조성물은 일반적으로 완충을 위한 약제 및 저장 시 보존을 위한 약제를 포함할 것이고, 투여 경로에 따라, 적절한 전달을 위한 완충제 및 담체를 포함할 수 있다.
"약학적으로 허용가능한 부형제" 및 "약학적으로 허용가능한 담체"는 환자에서 유의한 유해 독물학적 효과를 유발하지 않으면서, 대상체에 대한 활성제의 투여 및 대상체에 의한 흡수를 보조하고, 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 물질을 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 부형제의 비제한적인 예는 물, NaCl, 생리 식염수 용액, 락테이트화 링거, 통상의 수크로오스, 통상의 포도당, 결합제, 충진제, 붕해제, 활택제, 코팅제, 감미제, 향미제, 염 용액(예컨대, 링거 용액), 알코올, 오일, 젤라틴, 탄수화물, 예컨대 락토오스, 아밀로오스 또는 전분, 지방산 에스테르, 히드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리딘 및 착색제 등을 포함한다. 이러한 제제는 멸균될 수 있으며, 목적하는 경우, 보조제, 예컨대 활택제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충액, 착색제 및/또는 발명의 화합물과 유해하게 반응하지 않는 방향족 물질 등과 혼합될 수 있다. 당업자는 다른 약학적 부형제가 본 발명에 유용하다는 것을 인식할 것이다.
약학 제제는 선택적으로 유닛 투여량 형태이다. 상기 형태에서, 제제는 적절한 양의 활성 성분을 함유하는 단위 용량으로 세분된다.
바이러스 조성물
특히, 본원에서 세포에서 핵산 서열(예를 들어, 제1 이종 핵산 서열, 제2 이종 핵산 서열)을 발현하기에 유용한 바이러스 조성물이 제공된다. 바이러스 발현 시스템은 바이러스 게놈(예를 들어, 바이러스 벡터)에 패키징될 수 있는 뉴클레오티드의 용량에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스(Ad)는 약 8.5 킬로베이스의 용량을 갖고, 아데노-관련 바이러스(AAV)는 약 4.7 킬로베이스의 용량을 갖고, 렌티바이러스는 약 8.5 킬로베이스의 용량을 갖는다. 본 출원인은 바이러스 게놈 용량의 한계에도 불구하고 바이러스에서 둘 이상의 이종 핵산 서열의 발현을 허용하는 프로모터를 확인하였다. 따라서, 제2 프로모터에 대한 필요성이 회피된다. 예를 들어, 본원에 제공된 프로모터는 반대 방향(예를 들어, 이중 가닥 DNA의 한 가닥으로부터의 센스 방향 및 이중 가닥 DNA의 제2 가닥으로부터의 안티센스 방향)으로 2개의 개별 전사체의 생성을 허용한다. 따라서, 프로모터는 작동가능하게 연결된 2개의 핵산 서열의 동시 발현을 허용한다.
본원에서 사용된 "프로모터"는 작동가능하게 연결된 경우 핵산 세그먼트(예를 들어, 예로서 오픈 리딩 프레임을 갖는 전이유전자)의 전사를 유도할 수 있는 전사 조절 서열이다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10, 21, 25 또는 26에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 25의 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 26의 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
본원에 제공된 프로모터는 양방향 프로모터로 기능할 수 있다. 본원에서 사용된 "양방향 프로모터"는 DNA의 상보적 가닥에 위치하는 두 유전자 사이의 유전자간 영역에 위치한 전사 조절 서열이다. 양방향 프로모터는 두 유전자의 전사를 반대 방향으로 유도한다. 예를 들어, 양방향 프로모터는 센스 및 안티센스 배향으로 두 유전자의 전사를 부여할 수 있다. 따라서, 실시형태에서, 프로모터는 양방향 프로모터이다.
본원에서 사용된, "이종 핵산 서열"은 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 프로모터에 자연적으로 작동가능하게 연결되지 않은 핵산 서열을 지칭한다. 따라서, 본원에 제공된 이종 핵산 서열은 본원에 제공된 프로모터(예를 들어, 프로모터10 등)와 동일한 관계에서 천연적으로 발견되지 않는다. 본원에 제공된 이종 핵산 서열은 치료제 또는 검출가능한 약제를 인코딩하는 서열을 포함한다. 본원에 제공된 바이러스는 바이러스 게놈(예를 들어, 바이러스 벡터)에서 바이러스 2A 요소 또는 약한 IRES 요소를 사용하는 것이, 바람직하지 않거나 실행가능하지 않은 경우 유용할 수 있다. 따라서, 실시형태에서, 본원에 제공된 바이러스는 바이러스 2A 요소 또는 IRES 요소를 포함하지 않는다. 실시형태에서, 본원에 제공된 바이러스는 바이러스 2A 요소를 포함하지 않는다. 실시형태에서, 바이러스는 IRES 요소를 포함하지 않는다.
일 양태에서, i) 서열 번호 10 또는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 프로모터; ii) 프로모터의 3' 말단에 부착된 제1 이종 핵산 서열; 및 iii) 프로모터의 5' 말단에 부착된 제2 이종 핵산 서열을 포함하는 게놈을 갖는 바이러스가 제공된다. 실시형태에서, 프로모터는 바이러스에 대해 외인성이다. 예를 들어, 본원에 제공된 프로모터는 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 바이러스로부터 유래하지 않는다.
"부착하다" 또는 "부착"은 별도의 핵산 서열에 대한 핵산 서열의 직접적 또는 간접적 공유 부착을 지칭한다. 예를 들어, 핵산 서열(예를 들어, 프로모터)은 개재 서열 없이 개별 핵산 서열(예를 들어, 제1 또는 제2 이종 핵산 서열)에 직접 부착될 수 있다. 대안적으로, 핵산 서열(예를 들어, 프로모터)은 하나 이상의 개재 핵산 서열(예를 들어, 링커 서열, 인트론, 인슐레이터 서열 등)을 통해 핵산 서열(예를 들어, 제1 또는 제2 이종 핵산 서열)을 분리하기 위해 간접적으로 부착될 수 있다. 따라서, 프로모터의 3' 말단에 대한 제1 이종 핵산 서열의 부착은 개재 서열이 없는 직접적 부착일 수 있다. 대안적으로, 프로모터의 3' 말단에 대한 제1 이종 핵산 서열의 부착은 프로모터에 제1 이종 핵산 서열을 연결하는 하나 이상의 개재 서열(예를 들어, 인트론)과의 간접적 부착일 수 있다.
본원에 제공된 프로모터는 제1 이종 핵산 서열에 의해 인코딩된 제1 치료제 또는 검출가능한 약제의 발현, 및 제2 이종 핵산의 역 보체에 의해 인코딩된 제2 치료제 또는 검출가능한 약제의 발현을 허용한다. 예를 들어, 단일 가닥(ss) 게놈의 복제는 한 가닥으로부터의 제1 치료제 또는 검출가능한 약제의 발현, 및 보체 가닥에서의 제2 치료제 또는 검출가능한 약제의 발현을 허용한다. 다른 예에서, 이중 가닥(ds) 게놈은 한 가닥으로부터의 제1 치료제 또는 검출가능한 약제의 발현, 및 보체 가닥에서의 제2 치료제 또는 검출가능한 약제의 발현을 허용한다.
본원에서 사용된 "치료제"는 대상체에게 투여될 때 의도된 예방 효과 또는 의도된 치료 효과를 갖게 될 약제(예를 들어, 본원에 기재된 화합물 또는 조성물)를 지칭한다. 의도된 예방적 효과는 손상, 질환, 병리 또는 병태의 발병(또는 재발)을 예방 또는 지연시키는 것, 또는 손상, 질환, 병리 또는 병태, 또는 이의 증상의 발병(또는 재발)의 가능성을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 의도된 치료 효과는 치료의 객관적 또는 주관적 매개변수, 예컨대 경감; 차도; 증상의 감소 또는 부상, 병리 또는 병태를 환자가 더 견딜 수 있게 만드는 것; 악화 또는 쇠약 속도의 지연; 악화의 최종 지점을 덜 약화시키는 것; 또는 환자의 신체적 또는 정신적 웰빙을 개선하는 것을 포함하여, 부상, 질환, 병리 또는 병태, 또는 이의 증상의 치료 또는 완화를 포함할 수 있다. 의도된 예방 또는 치료 효과는 질환 또는 질환의 증상과 관련된 분자(예를 들어, 유전자, 단백질)의 활성 또는 기능을 조절함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 치료제는 질환과 관련된 유전자의 변이체를 변경할 수 있다. 치료제는 질환과 관련된 단백질의 활성을 감소시킬 수 있다. 다른 예에서, 치료제는 질환 또는 질환의 증상과 관련된 분자의 수준을 변경할 수 있다. 예를 들어, 치료제는 질환과 관련된 유전자의 발현을 억제할 수 있다. "핵산에 의해 인코딩된" 생성물(예를 들어, 제1 또는 제2 치료제)은 폴리펩티드(예를 들어, Cas9 등) 또는 핵산(예를 들어, gRNA 등)일 수 있다.
본원에서 사용된 "검출가능한 약제"는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적 또는 기타 물리적 수단에 의해 검출가능한 조성물을 지칭한다. 검출가능한 약제는 단백질일 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 약제는 형광 또는 발광 단백질일 수 있다. 형광 단백질은 mCherry, Emerald, 녹색 형광 단백질(GFP), 및 향상된 GFP(EGFP)를 포함한다. 형광 단백질은 적색, 청색, 황색, 청록색, 및 사파이어 형광 단백질, 및 암초 산호 형광 단백질을 포함한다. 발광 단백질은 루시퍼라아제, 에쿼린 및 이의 유도체를 포함한다.
실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제1 치료제 또는 제1 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제2 치료제 또는 제2 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이거나, 제1 이종 핵산 서열은 제2 치료제 또는 제2 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제1 치료제 또는 제1 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다. 실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제1 치료제 또는 제1 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제2 치료제 또는 제2 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다. 실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제2 치료제 또는 제2 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제1 치료제 또는 제1 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다.
실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제1 치료제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제2 치료제를 인코딩하는 서열의 역 보체이거나, 제1 이종 핵산 서열은 제2 치료제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제1 치료제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다. 실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제1 치료제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제2 치료제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다. 실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제2 치료제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제1 치료제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다.
실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제1 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제2 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이거나, 제1 이종 핵산 서열은 제2 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제1 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다. 실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제1 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제2 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다. 실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제2 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제1 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다.
실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 치료제 또는 검출가능한 약제를 인코딩한다. 실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 치료제를 인코딩한다. 실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 검출가능한 약제를 인코딩한다. 실시형태에서, 제2 이종 핵산 서열은 치료제 또는 검출가능한 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다. 실시형태에서, 제2 이종 핵산 서열은 치료제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다. 실시형태에서, 제2 이종 핵산 서열은 검출가능한 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다.
실시형태에서, 제1 치료제 및 제2 치료제는 독립적으로 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, RNA-가이드 RNA 뉴클레아제, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 가이드 RNA(gRNA), 치료용 단백질, 검출가능한 단백질, 또는 항체이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, RNA-가이드 RNA 뉴클레아제, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 가이드 RNA(gRNA), 치료용 단백질, 검출가능한 단백질, 또는 항체이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 RNA-가이드 RNA 뉴클레아제이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 가이드 RNA(gRNA)이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 치료용 단백질이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 검출가능한 단백질이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 항체이다. 실시형태에서, 제2 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, RNA-가이드 RNA 뉴클레아제, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 가이드 RNA(gRNA), 치료용 단백질, 검출가능한 단백질, 또는 항체이다. 실시형태에서, 제2 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이다. 실시형태에서, 제2 치료제는 RNA-가이드 RNA 뉴클레아제이다. 실시형태에서, 제2 치료제는 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이다. 실시형태에서, 제2 치료제는 가이드 RNA(gRNA)이다. 실시형태에서, 제2 치료제는 치료용 단백질이다. 실시형태에서, 제2 치료제는 검출가능한 단백질이다. 실시형태에서, 제2 치료제는 항체이다.
본 출원인은 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 프로모터(예를 들어, 양방향 프로모터)가 CRISPR 시스템(예를 들어, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, gRNA 등)을 전달하는 데 사용될 수 있음을 입증하였다. 예를 들어, 본원에 제공된 프로모터(예를 들어, 양방향 프로모터)는 Cas12a 또는 Cas9를 한 방향으로(예를 들어, DNA 안티센스 가닥) 발현할 수 있는 한편, 하나 이상의 가이드 RNA는 다른 방향으로(예를 들어, DNA 센스 가닥) 발현된다. 당업계에 알려진 단방향 프로모터에 비해, 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 프로모터는 CRISPR 시스템 구성요소(예를 들어, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, gRNA 등)의 증가된 발현 수준을 입증한다. 예를 들어, CRISPR 시스템의 구성요소가 단방향 프로모터에서 발현되어 단일 전사체를 생성하는 경우, 특정 Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9, Cas12a 등)는 이들 고유의 mRNA 전사체를 절단하여 발현 수준을 낮출 수 있다. 대조적으로, 본원에 제공된 프로모터 시스템은 2개의 개별 mRNA를 생성하여, 전사체 절단의 잠재적인 문제를 회피할 수 있다.
나아가, 본원에 제공된 프로모터는 당업계에 알려진 양방향 프로모터에 비해 개선된다. 예를 들어, 일 말단(예를 들어, 센스 방향)으로부터 Pol II 발현 및 다른 말단(예를 들어, 안티센스 방향)으로부터 Pol III 발현을 이용하는 인간 HI 프로모터(예를 들어, 미국 특허출원공개 US20160074535 A1호에 기재됨)와 같은 양방향 프로모터는 발현 시스템(예를 들어, 바이러스)의 발현 능력을 하나의 단백질과 하나의 상대적으로 짧은 gRNA로 제한한다. 과학적 이론에 얽매이지 않으면서, Pol III 프로모터는 일반적으로 짧은 전사체의 발현에 적합하여, Pol III 프로모터가 다중 gRNA를 효과적으로 발현하는 것을 방지한다(예를 들어, 다중화된 유전자 편집의 경우). 대조적으로, 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 프로모터는 양 말단에서 Pol II 발현을 이용하여, 두 단백질 또는 한 단백질 및 복수의 gRNA의 발현을 허용한다. 추가로, 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 프로모터는 뉴런(예를 들어, 망막 뉴런)에서 이종 핵산 서열의 높은 발현 수준이 가능하다. 당업계에 알려진 다른 양방향 프로모터(예를 들어, CAG 프로모터)는 뉴런에서 유전자 발현이 가능하지만; 본원에 제공된 프로모터는 이들 프로모터 길이의 1/8이면서 유사한 발현 수준을 나타낸다.
실시형태에서, 제1 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이고 제2 치료제는 gRNA이거나, 제1 치료제는 gRNA이고 제2 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이고 제2 치료제는 gRNA이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 gRNA이고 제2 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이다. 실시형태에서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 Cas9, Cas12a(Cpf1), 클래스 II CRISPR 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체이다. 실시형태에서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 Cas9 또는 이의 변이체이다. 실시형태에서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 Cas12a(Cpf1) 또는 이의 변이체, 예를 들어 enAsCas12a(문헌[Kleinstiver, et al, 2019, Nat Biotechnol. 37(3):276-282])이다. 실시형태에서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 클래스 II CRISPR 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체이다.
실시형태에서, 제1 치료제는 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이고 제2 치료제는 gRNA이거나, 제1 치료제는 gRNA이고 제2 치료제는 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이고 제2 치료제는 gRNA이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 gRNA이고 제2 치료제는 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이다. 실시형태에서, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 dCas9, dCpfl 또는 ddCpf1이다. 실시형태에서, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 dCas9이다. 실시형태에서, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 dCpfl이다. 실시형태에서, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 ddCpf1이다.
뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 하나 이상의 전사 활성자 또는 억제자에 융합되어 하나 이상의 표적 유전자의 발현 수준을 조절할 수 있다. 따라서, 실시형태에서, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 전사 활성자 또는 전사 억제자에 융합된다. 용어 "전사 억제자"는 유전자 또는 유전자 세트의 유전자 전사를 감소시키는 단백질을 지칭한다. 용어 "전사 활성자"는 유전자 또는 유전자 세트의 유전자 전사를 증가시키는 단백질을 지칭한다. 실시형태에서, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 전사 억제자에 융합된다. 실시형태에서, 전사 억제자는 KRAB 도메인 또는 DNMT 도메인이다. 실시형태에서, 전사 억제자는 KRAB 도메인이다. 실시형태에서, 전사 억제자는 DNMT 도메인이다. 실시형태에서, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 전사 활성자에 융합된다. 실시형태에서, 전사 활성자는 VP64, p65, Rta, 또는 이의 둘 이상의 조합이다. 실시형태에서, 전사 활성자는 VP64이다. 실시형태에서, 전사 활성자는 p65이다. 실시형태에서, 전사 활성자는 Rta이다.
실시형태에서, 제1 치료제는 RNA-가이드 RNA 뉴클레아제이고 제2 치료제는 gRNA이거나, 제1 치료제는 gRNA이고 제2 치료제는 RNA-가이드 RNA 뉴클레아제이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 RNA-가이드 RNA 뉴클레아제이고 제2 치료제는 gRNA이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 gRNA이고 제2 치료제는 RNA-가이드 RNA 뉴클레아제이다. 실시형태에서, RNA-가이드 RNA 뉴클레아제는 Cas13이다.
실시형태에서, gRNA는 복수의 gRNA를 포함한다. 예를 들어, gRNA는 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 gRNA를 포함할 수 있으며, 각각의 gRNA는 상이한 표적 서열을 갖는다.
본원에 제공된 바이러스의 경우, 실시형태에서, 제1 검출가능 약제 및 제2 검출가능 약제는 독립적으로, 검출가능한 단백질이다. 실시형태에서, 제1 검출가능 약제는 검출가능한 단백질이다. 실시형태에서, 제2 검출가능 약제는 검출가능한 단백질이다. 실시형태에서, 검출가능한 단백질은 GFP, eGFP, Scarlet, 또는 루시퍼라아제이다. 실시형태에서, 검출가능한 단백질은 eGFP이다. 실시형태에서, 검출가능한 단백질은 Scarlet이다. 실시형태에서, 검출가능한 단백질은 루시퍼라아제이다.
본 출원인은 본원에 제공된 바이러스 조성물이 신경 세포 사멸을 억제하는 치료제를 발현하기 위해 사용될 수 있음을 추가로 발견하였다. 예를 들어, 치료제는 뉴런(예를 들어, RGC)의 생존을 개선하는 펩티드를 포함할 수 있다. 치료제는 우성 음성 SARM1, 우성 음성 DLK, 및 우성 음성 LZK 펩티드를 포함할 수 있다. 우성 음성 DLK 및 우성 음성 LZK 및 이의 생성 방법은 국제공개 WO 2020/168111호; 및 문헌[Xu, Z et al. "The MLK family mediates c-Jun N-terminal kinase activation in neuronal apoptosis." Molecular and cellular biology vol. 21,14 (2001): 4713-24. doi:10.1128/MCB.21.14.4713-4724.2001]에 상세히 기재된 것이며, 이는 모든 목적을 위해 이의 전문이 본원에 포함된다.
실시형태에서, 제1 치료제는 우성 음성 SARM1이고 제2 치료제는 우성 음성 DLK이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 우성 음성 DLK이고 제2 치료제는 우성 음성 SARM1이다. 우성 음성 SARM1 및 이의 생성 방법은 국제공개 WO 2019079572호; 및 문헌[Geisler, Stefanie et al., Gene therapy targeting SARM1 blocks pathological axon degeneration in mice. The Journal of Experimental Medicine vol. 216,2 (2019): 294-303. doi:10.1084/jem.20181040]]에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 이의 전문이 본원에 포함된다.
실시형태에서, 제1 치료제는 세포질 NMNAT1 또는 이의 단편이고 제2 치료제는 우성 음성 SARM1이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 우성 음성 SARM1이고 제2 치료제는 세포질 NMNAT1 또는 이의 단편이다. 실시형태에서, 세포질 NMNAT1은 핵 국소화 신호에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. NMNAT1 및 이의 생성 방법은 당업계에 알려져 있고, 문헌[Babetto et al., 2010, "PTargeting NMNAT1 to axons and synapses transforms its neuroprotective potency in vivo" J Neurosci 30(40):13291-304)]; 및 문헌[Berger, et al. Subcellular Compartmentation and Differential Catalytic properties of Three Human Nicotinamide Mononuclease Adenyltransferase Isoforms. J Biol Chem 280(43), 36334-36341, 2005.]에 상세히 기재되어 있고, 이는 모든 목적을 위해 이의 전문이 본원에 포함된다. 핵 국소화 신호 및 이의 생성 방법에서의 돌연변이를 포함하는 NMNAT1은 문헌[Sasaki et al, Stimulation of Nicotinamide Adenine Dinucleotide Biosynthetic Pathways Delays Axonal Degeneration after Axotomy. J. Neurosci 26:8484-8491, 2006.]에 상세히 기재되어 있고, 이는 모든 목적을 위해 이의 전문이 본원에 포함된다.
실시형태에서, 제1 치료제는 세포질 NMNAT1 또는 이의 단편이고 제2 치료제는 우성 음성 LZK이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 우성 음성 LZK이고 제2 치료제는 세포질 NMNAT1 또는 이의 단편이다.
실시형태에서, 제1 치료제는 NMNAT2이고 제2 치료제는 우성 음성 DLK이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 우성 음성 DLK이고 제2 치료제는 NMNAT2이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 우성 음성 DLK이고 제2 치료제는 NMNAT2 또는 세포하 표적화 도메인의 결실을 포함하는 NMNAT2 펩티드이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 NMNAT2 또는 세포하 표적화 도메인의 결실을 포함하는 NMNAT2 펩티드이고 제2 치료제는 우성 음성 DLK이다.
실시형태에서, 제1 치료제는 NMNAT2이고 제2 치료제는 우성 음성 LZK이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 우성 음성 LZK이고 제2 치료제는 NMNAT2이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 우성 음성 LZK이고 제2 치료제는 NMNAT2 또는 세포하 표적화 도메인의 결실을 포함하는 NMNAT2 펩티드이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 NMNAT2 또는 세포하 표적화 도메인의 결실을 포함하는 NMNAT2 펩티드이고 제2 치료제는 우성 음성 LZK이다.
실시형태에서, 제1 치료제는 우성 음성 DLK 또는 우성 음성 LZK이고 제2 치료제는 오스테오폰틴이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 오스테오폰틴이고 제2 치료제는 우성 음성 DLK 또는 우성 음성 LZK이다. 예를 들어, 문헌[Chen et al., 2011, Osteopontin reduced hypoxia-ischemia neonatal brain injury by suppression of apoptosis in a rat pup model. Stroke 42(3):764-769)]을 참조하고, 이는 모든 목적을 위해 이의 전문이 본원에 포함된다.
실시형태에서, 제1 치료제는 우성 음성 DLK 또는 우성 음성 LZK이고 제2 치료제는 글루카곤-유사 펩티드-1 또는 뇌 유래 신경영양 인자이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 우성 음성 DLK이고 제2 치료제는 글루카곤-유사 펩티드-1이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 글루카곤-유사 펩티드-1이고 제2 치료제는 우성 음성 DLK이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 우성 음성 LZK이고 제2 치료제는 글루카곤-유사 펩티드-1이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 글루카곤-유사 펩티드-1이고 제2 치료제는 우성 음성 LZK이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 우성 음성 DLK이고 제2 치료제는 뇌 유래 신경영양 인자이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 뇌 유래 신경영양 인자이고 제2 치료제는 우성 음성 DLK이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 우성 음성 LZK이고 제2 치료제는 뇌 유래 신경영양 인자이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 뇌 유래 신경영양 인자이고 제2 치료제는 우성 음성 LZK이다. 글루카곤-유사 펩티드-1 및 이의 생성 방법은 문헌[Holscher, C. Potential Role of Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) in Neuroprotection. CNS Drugs 26, 871-882 (2012).]; 문헌[Velmurugan et al., Neuroprotective actions of Glucagon-like peptide-1 in differentiated human neuroprogenitor cells. J. Neurochem. 123(6):919-931 (2012).]; 및 국제공개 WO 2009039964A2호에 기재되어 있고, 이는 모든 목적을 위해 이의 전문이 본원에 포함된다. 뇌 유래 신경영양 인자 및 이의 생성 방법은 문헌[Osborne, A. et al. Neuroprotection of retinal ganglion cells by a novel gene therapy construct that achieves sustained enhancement of brain-derived neurotrophic factor/tropomyosin-related kinase receptor-B signaling. Cell Death Dis 9, 1007 (2018). Https://doi.org/10.1038/s41419-018-1041-8.]에 기재되어 있고, 이는 모든 목적을 위해 이의 전문이 본원에 포함된다.
치료용 dnDLK 또는 dnDLK/LZK로 발현될 수 있는 치료제의 추가 예는 슬로우 월러리안 변성 폴리펩티드(Wlds), 우성 음성 Rho-키나아제, 또는 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP), 예컨대 MMP-3 또는 MMP-1을 포함한다. Wlds, Rho-키나아제, 및 MMP는 문헌[Conforti P., et al. Faulty neuronal determination and cell polarization are reverted by modulating HD early phenotypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 Jan 23;115(4).]; 문헌[Amano M, Chihara K, Nakamura N, Kaneko T, Matsuura Y, Kaibuchi K. The COOH terminus of Rho-kinase negatively regulates Rho-kinase activity. J Biol Chem 1999; 274: 32418-24.]; 문헌[O'Callaghan J, Crosbie DE, Cassidy PS, Sherwood JM, , , Humphries MM, Reina-Torres E, Wallace D, Kiang AS, Campbell M, Stamer WD, Overby DR, O'Brien C, Tam LCS, Humphries P. Therapeutic potential of AAV-mediated MMP-3 secretion from corneal endothelium in treating glaucoma. Hum Mol Genet. 2017 Apr 1;26(7):1230-1246. doi: 10.1093/hmg/ddx028. PMID: 28158775; PMCID: PMC5390678.]; 및 문헌[, Buie LK, Spiga MG. Inducible scAAV2.GRE.MMP1 lowers IOP long-term in a large animal model for steroid-induced glaucoma gene therapy. Gene Ther. 2016;23:438-49. Https://doi.org/10.1038/gt.2016.14]에 기재되어 있고, 이는 모든 목적을 위해 이의 전문이 본원에 포함된다.
신경보호가 가능한 치료제의 추가적인 예는 SCG10/STMN2, BCL-XL, 또는 TRKB; 아쿠아포린, CNTF, BDNF, GDNF, NGF, 보체 억제제, GLP-1R 또는 GLP-1, CDKN2B-AS1, GLDN, CHL1, QPCT, TBX20, DGKG, TIMP2, EGR1, EOMES, JUNB, IGFBP2, OSTF1, FGF1, SEMA5A, ESRRG, KBTBD11, RAMP1, ETL4, PRKCQ, CTXN3, NDNF, MAN1A, SDK2, PRPH, SDK1, 또는 IFI27을 포함한다.
실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열(예를 들어, dnDLK 또는 dnDLK/LZK를 인코딩하는)은 신경 보호를 향상시키기 위해 유전자에 의해 인코딩된 생성물의 활성, 또는 유전자의 발현을 억제하는 치료제를 인코딩하는 제2 이종 핵산 서열과 발현된다. 실시형태에서, 치료제는 핵산, 예를 들어 억제될 유전자를 표적으로 하는 안티센스 RNA 또는 shRNA이다. 실시형태에서, 치료제는 MEKK4, MLK2/MAP3K10, PUMA/BBC3, SARM1, ROCK1, ROCK2, TAOK1, TAOK2, TAOK3, TNIK, MAP4K4, MINK1, GSK-3β, GSK-3α, MAP2K7/MKK7, MAP2K4/MKK4, PERK, CHOP, HSP90, SNRK, JNK1(MAPK8), JNK2(MAPK9), JNK3(MAPK10), JUN, ATF2, MEF2A, SOX11, MST1/STK4, MST2/STK3, END1, 또는 END2를 표적으로 한다.
실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 160 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 170 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 180 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 190 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 200 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 210 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 220 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 230 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 240 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 250 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 260 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 270 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 280 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 290 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다.
실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 290개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 280개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 270개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 260개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 240개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 230개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 220개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 210개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 200개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 190개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 180개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 170개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 160개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 또는 300개의 뉴클레오티드이다.
실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 200 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 205 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 210 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 215 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 220 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 225 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 230 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 235 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 240 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 245 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다.
실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 200 내지 약 245개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 200 내지 약 240개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 205 내지 약 235개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 205 내지 약 230개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 205 내지 약 225개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 205 내지 약 220개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 205 내지 약 215개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 205 내지 약 210개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245 또는 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 205개 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 205개 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 235개 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 235개 뉴클레오티드이다.
본원에 기재된 방법에서 사용된 프로모터는 하기에 그리고 실시예에 기재된 것과 같은 양방향 프로모터 활성을 갖는다. 실시형태에서, 본원에 개시된 것과 같이 사용된 프로모터(예를 들어, 양방향 프로모터)는 서열 번호 10(인간 프로모터 10), 서열 번호 25(마우스 프로모터 10) 또는 서열 번호 27(컨센서스 프로모터 10)에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 가지며, 이들 각각은 "프로모터 10 기준 서열"로 지칭될 수 있다. 실시형태에서, 본원에 개시된 것과 같이 사용된 프로모터(예를 들어, 양방향 프로모터)는 서열 번호 21에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 실시예 4에 나타난 것과 같이, 프로모터 10은 TMEM208 측에서 절단될 수 있고, 양방향 프로모터 활성을 유지할 수 있다. LRRC29 측의 짧은 절단물, 일반적으로 약 67개 미만의 염기가 활성을 유지할 수도 있다. 실시형태에서, 프로모터의 양 말단(예를 들어, 3' 말단 또는 5' 말단)에서의 절단물은 독립적으로 그리고 비제한적으로 1 내지 10개의 염기쌍, 10 내지 20개의 염기쌍, 15 내지 25개의 염기쌍, 20 내지 35개의 염기쌍, 25 내지 40개의 염기쌍, 30 내지 40개의 염기쌍, 35 내지 45개의 염기쌍, 40 내지 50개의 염기쌍, 45 내지 50개의 염기쌍 그 이상일 수 있다. 따라서, 서열 번호 10, 서열 번호 25 또는 서열 번호 27의 단편은 양방향 프로모터로서 사용될 수 있다. 또한, 프로모터 활성은 기준 서열에 비해 특정 정도의 서열 변이를 허용할 수 있고, 비제한적으로 짧은 결실 또는 삽입(예를 들어, 10개 미만의 염기, 또는 20개 미만의 염기)을 포함하는 기준 서열 또는 기준 서열의 단편의 변이는 양방향 프로모터로서 사용될 수 있다.
추가로, 전사 인자 결합 부위에 대한 공통 서열을 식별하기 위해 JASPER 데이터베이스를 사용하여 인간 프로모터 10 서열(서열 번호 10)을 평가하였다. 서열 번호 10의 서열 넘버링을 참조로, 하기 서열을 식별하였다. Broad 단일 세포 포털 E2f4에 따라, TFAP2C, PRDM9, EGR1, STAT3, THAP11, ZKSCAN5, FL2, ELK4, 및 STAT5b는 마우스 성체 RGC에서 발현된다(문헌[Tran et al, Neuron 104:1039-1055 E12, 2019] 참조). 임의의 특정 이론 또는 메커니즘에 의해 얽매이지 않으면서, 하나 이상의 도메인은 본 발명의 작제물이 발현되는 마우스 및 인간 세포에서 TF 결합 부위로서 기능할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 독립적으로 선택된 하나 이상의 이들 서열은 본원에 기재된 프로모터10 변이체 및 단편에 보유될 수 있다.
[표 1]
프로모터 단편, 절단물 또는 변이체는 프로모터가 2개의 전이유전자(예를 들어, EGFP 및 Scarlet)의 발현을 구동하고, 서열 번호 10을 사용하여 생성된 형광 강도에 비해 각각의 전이유전자의 형광 강도의 적어도 50%를 생성하는 경우, 특정 세포 유형에서 양방향 프로모터 활성을 갖는다. 실시형태에서, 단편, 절단물 또는 변이체는 서열 번호 10을 사용하여 생성되는 각각의 전이유전자의 형광 강도의 적어도 75%, 또는 적어도 100%를 생성하는 경우 양방향 프로모터 활성을 갖는다. 실시형태에서, 어세이는 프로모터의 TMEM208 말단에서 mScarlet(또는 상응하는 단편 또는 변이체)을 위치시키고, 프로모터의 LRRC29 말단에서 EGFP(또는 상응하는 단편 또는 변이체)를 위치시키는 것으로 수행된다.
실시형태에서, 한 DNA 가닥에서 제1 전이유전자의 5' 종점(예를 들어, 5' 말단) 및 (다른 DNA 가닥(예를 들어, 상보 가닥)에 인코딩된) 다른 전이유전자의 5' 종점(예를 들어, 5' 말단)의 보체는 100 내지 300개의 뉴클레오티드, 흔히 125 내지 300개의 뉴클레오티드, 흔히 150 내지 300개의 뉴클레오티드, 흔히 175 내지 300개의 뉴클레오티드, 흔히 175 내지 240개의 뉴클레오티드, 때때로 180 내지 235개의 뉴클레오티드의 거리로 분리된다.
실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10에 비해 전장 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 적어도 20, 30 또는 40개의 연속 염기를 포함하는 부분)에 걸쳐 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10에 비해 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성을 갖는다. 활성은 예를 들어 qPCR, 웨스턴 블롯 등 또는 생물학 분야에 알려진 임의의 다른 방법에 의해 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종 핵산 서열의 발현 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 발현 수준은 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종 핵산 서열에 의해 인코딩된 치료제 또는 검출가능한 약제의 기능 또는 활성을 검출함으로써 측정될 수 있다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 81% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 82% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 83% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 84% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다.
실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 80% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 81% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 82% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 83% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 84% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 85% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 86% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 87% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 88% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 89% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 90% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 91% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 92% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 93% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 94% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 95% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 96% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 97% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 98% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 99% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열을 포함한다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열이다.
실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 가지며, 여기서 서열은 서열 번호 10이 아니다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열을 포함하지 않는다.
실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21에 비해 전장 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 적어도 20, 30 또는 40개의 연속 염기를 포함하는 부분)에 걸쳐 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21에 비해 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 81% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 82% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 83% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 84% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다.
실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 80% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 81% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 82% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 83% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 84% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 85% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 86% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 87% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 88% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 89% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 90% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 91% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 92% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 93% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 94% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 95% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 96% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 97% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 98% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 바이러스는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 99% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열을 포함한다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열이다.
실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 단편 또는 부분을 포함한다. 실시형태에서, 프로모터는 프로모터 10 서열(서열 번호 10)의 LLRC29 측의 뉴클레오티드 서열 또는 마우스 프로모터 10 동원체 서열(서열 번호 25)의 LLRC29 측의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 출원인은 바이러스 게놈에 하나 이상의 인트론 서열을 포함하는 것이 제1 및/또는 서열 이종 핵산 서열에 의해 인코딩된 치료제 및/또는 검출가능한 약제의 발현을 증가시킬 수 있음을 발견하였다. 용어 "인트론"은 이의 통상의 일반적인 의미에 따라 사용되며, 비-코딩 핵산 서열을 지칭한다. 일반적으로, 자연에서 발견된 경우, 인트론은 유전자 내 영역에 위치한다. 인트론은 DNA 서열 또는 상응하는 RNA 전사체일 수 있다. 사실상, 인트론은 일반적으로 전사 후 및 번역 전 수행되는 RNA 스플라이싱을 통해 RNA 처리 경로 중 제거된다. 본 발명에서, 인트론(예를 들어, 인트론성 서열)은 바이러스 게놈 내 위치에 융합된다. 인트론은 제1 이종 핵산 서열 또는 제2 핵산 서열에 부착될 수 있다. 인트론은 프로모터의 5' 말단 또는 3' 말단에 부착될 수 있다.
실시형태에서, 인트론은 본원에 제공된 바이러스에 대해 이종성이다. 실시형태에서, 바이러스 게놈은 하나 이상의 인트론을 포함한다. 예를 들어, 본원에 제공된 게놈은 1, 2, 3, 4개 이상의 인트론을 포함할 수 있다. 실시형태에서, 인트론은 프로모터를 제1 이종 핵산 서열에 연결시키거나, 프로모터를 제2 이종 핵산 서열에 연결시킨다. 실시형태에서, 인트론은 제1 이종 핵산 서열에 프로모터를 연결한다. 따라서, 본 경우에, 인트론은 프로모터의 3' 말단에 부착된다. 실시형태에서, 인트론은 제2 이종 핵산 서열에 프로모터를 연결한다. 본 경우에, 인트론은 프로모터의 5' 말단에 부착된다.
실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 비해 전장 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 적어도 20, 30 또는 40개의 연속 염기를 포함하는 부분)에 걸쳐 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 81% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 82% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 83% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 84% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 81% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 82% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 83% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 84% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 86% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 87% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 88% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 89% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 91% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 92% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 93% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 94% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22의 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22의 서열이다.
실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 비해 전장 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 적어도 20, 30 또는 40개의 연속 염기를 포함하는 부분)에 걸쳐 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 81% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 82% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 83% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 84% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 81% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 82% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 83% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 84% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 86% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 87% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 88% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 89% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 91% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 92% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 93% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 94% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23의 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23의 서열이다.
본 출원인은 바이러스 게놈에 하나 이상의 인슐레이터 서열을 포함하는 것이 본원에 제공된 하나 이상의 치료제 및/또는 검출가능한 약제의 발현을 증가시킬 수 있음을 추가로 발견하였다. "인슐레이터" 또는 "인슐레이터 서열"은 제1 이종 핵산 서열 및/또는 제2 이종 핵산 서열의 5' 말단 또는 3' 말단을 플랭킹하는 짧은(예를 들어, 2개의 뉴클레오티드 내지 20개의 뉴클레오티드 길이) 핵산 서열을 지칭한다. 따라서, 인슐레이터는 제1 및/또는 서열 이종 핵산 서열 및 인접 서열 사이에 짧은 연결 요소를 제공한다. 실시형태에서, 게놈은 하나 이상의 인슐레이터 서열을 포함한다.
실시형태에서, 인슐레이터 서열은 제1 이종 핵산 서열 또는 제2 이종 핵산 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 부착되어 있다. 실시형태에서, 인슐레이터 서열은 제1 이종 핵산 서열의 5' 말단에 부착되어 있다. 실시형태에서, 인슐레이터 서열은 제2 이종 핵산 서열의 5' 말단에 부착되어 있다. 실시형태에서, 인슐레이터 서열은 제1 이종 핵산 서열의 3' 말단에 부착되어 있다. 실시형태에서, 인슐레이터 서열은 제2 이종 핵산 서열의 3' 말단에 부착되어 있다.
본 출원인은 gRNA를 인코딩하는 서열 사이에 하나 이상의 인슐레이터 서열을 포함하는 것이 gRNA의 발현을 증가시킨다는 것을 발견하였다. 따라서, 인슐레이터 서열은 gRNA를 인코딩하는 복수의 이종 핵산 서열을 연결할 수 있다. 실시형태에서, 인슐레이터 서열은 제1 gRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열과 제2 gRNA를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 연결한다. 실시형태에서, 인슐레이터 서열은 복수의 gRNA를 인코딩하는 제1, 제2, 제3, 제4 이상의 핵산 서열을 연결한다. 인슐레이터 서열은 복수의 핵산 서열을 연결할 수 있으며, 여기서 서열은 gRNA를 인코딩하는 서열의 역 보체이다. 실시형태에서, 인슐레이터는 제1 gRNA를 인코딩하는 서열의 역 보체와 제2 gRNA를 인코딩하는 서열의 역 보체를 연결한다. 실시형태에서, 인슐레이터 서열은 제1, 제2, 제3, 제4 이상의 서열을 연결하며, 여기서 서열은 복수의 gRNA를 인코딩하는 서열의 역 보체이다.
실시형태에서, 인슐레이터 서열은 서열 번호 24의 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인슐레이터 서열은 서열 번호 24의 서열이다.
실시형태에서, 본원에 제공된 바이러스는 단순 헤르페스 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 알파바이러스, 장내바이러스, 유두종바이러스, 또는 폴리오바이러스이다. 실시형태에서, 바이러스는 단순 헤르페스 바이러스이다. 실시형태에서, 바이러스는 아데노-관련 바이러스(AAV)이다. 실시형태에서, 바이러스는 렌티바이러스이다. 실시형태에서, 바이러스는 아데노바이러스이다. 실시형태에서, 바이러스는 백시니아 바이러스이다. 실시형태에서, 바이러스는 폭스바이러스이다. 실시형태에서, 바이러스는 알파바이러스 폴리오바이러스이다. 실시형태에서, 바이러스는 엔테로바이러스이다. 실시형태에서, 바이러스는 유두종바이러스이다. 실시형태에서, 바이러스는 폴리오바이러스이다.
아데노-관련 바이러스(AAV)는 단일 가닥 DNA 게놈을 포함하여 대략 20 nm의 작은 바이러스이다. AAV는 역말단 반복체(ITR)를 포함하여 약 4.7 킬로베이스의 카고 용량을 갖는다. "역말단 반복체" 또는 "ITR"은 이의 당업계에서의 일반적인 의미에 따라 사용되며, 단일 가닥 핵산 서열과 그 사이에 개재 서열을 갖는 핵산 서열의 역 보체가 이어지는 것을 지칭한다. IRT의 핵산 서열의 역 보체와 핵산 서열 사이의 뉴클레오티드의 개재 서열은 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 개재 서열은 본원에 제공된 제1 이종 핵산 서열 및 제2 이종 핵산 서열과 본원에 제공된 프로모터를 포함할 수 있다. AAV 게놈은, 일반적으로 DNA 복제를 위한 자가-프라이밍 구조 역할을 할 수 있는 ITR에 의해 플랭킹된다. AAV는 단일 가닥 DNA 게놈을 포함한다. 숙주 세포로 진입 시, AAV 게놈의 제2 가닥이 합성될 수 있어 유전자 전사가 허용될 수 있다.
실시형태에서, AAV 바이러스는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함하는 게놈을 갖는다. 실시형태에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-11, AAV-12, AAV113, AAVrh.74, AAV2.7m8, AAV.ANC80, Anc80L65 및 이의 유도체, 및 AAVDJ, 및 이의 조합으로부터 선택될 수 있다. 자연 발생 AAV 혈청형의 변이체를 포함하여 예시적인 AAV 혈청형의 광범위한 목록이 미국 특허 제10,662,425호에 제공되고, 이는 모든 목적을 위해 이의 전문이 본원에 포함된다. 실시형태에서, AAV 벡터는 DNA를 비리온으로 복제하고 패키징하기 위해 cis에서 필요한 AAV를 포함하는 서열(예를 들어, 기능적 ITR)을 포함한다. 실시형태에서, AAV 벡터는 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 AAV WT 유전자 중 하나 이상을 갖지만, 기능성 플랭킹 ITR 서열을 보유한다.
실시형태에서, AAV(예를 들어, AAV 비리온 또는 AAV 입자)는 AAV 캡시드 단백질 및 AAV 벡터를 포함한다. 일부 경우에, AAV는 혼성 또는 키메라 AAV이며, 예를 들어 AAV 입자는 캡시드 혈청형(예를 들어, AAV5, AAV6, 또는 AAV8 캡시드를 갖는 AAV2 ITR)과 비교하여 이종 혈청형인 ITR을 포함할 수 있다. AAV ITR은 특정 적용에 적합한 임의의 혈청형일 수 있다.
본원에 제공된 바이러스의 경우, 실시형태에서, 게놈은 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA 또는 단일 가닥 RNA 또는 이중 가닥 RNA를 포함한다. 실시형태에서, 게놈은 단일 가닥 DNA를 포함한다. 실시형태에서, 게놈은 이중 가닥 DNA를 포함한다. 실시형태에서, 게놈은 단일 가닥 RNA를 포함한다. 실시형태에서, 게놈은 이중 가닥 RNA를 포함한다. 실시형태에서, 바이러스는 재조합 바이러스이다.
핵산
특히, 본원에서는 본원에 제공된 프로모터 및 둘 이상의 이종 핵산 서열을 포함하는 핵산이 제공된다. 일 양태에서, i) 서열 번호 10 또는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 프로모터; ii) 프로모터의 3' 말단에 부착된 제1 이종 핵산 서열; 및 iii) 프로모터의 5' 말단에 부착된 제2 이종 핵산 서열을 포함하는 핵산이 제공된다.
실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제1 치료제 또는 제1 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제2 치료제 또는 제2 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이거나, 제1 이종 핵산 서열은 제2 치료제 또는 제2 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제1 치료제 또는 제1 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다. 실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제1 치료제 또는 제1 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제2 치료제 또는 제2 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다. 실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제2 치료제 또는 제2 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제1 치료제 또는 제1 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다.
실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제1 치료제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제2 치료제를 인코딩하는 서열의 역 보체이거나, 제1 이종 핵산 서열은 제2 치료제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제1 치료제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다. 실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제1 치료제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제2 치료제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다. 실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제2 치료제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제1 치료제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다.
실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제1 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제2 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이거나, 제1 이종 핵산 서열은 제2 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제1 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다. 실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제1 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제2 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다. 실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제2 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제1 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다.
실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 치료제 또는 검출가능한 약제를 인코딩한다. 실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 치료제를 인코딩한다. 실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 검출가능한 약제를 인코딩한다. 실시형태에서, 제2 이종 핵산 서열은 치료제 또는 검출가능한 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다. 실시형태에서, 제2 이종 핵산 서열은 치료제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다. 실시형태에서, 제2 이종 핵산 서열은 검출가능한 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다.
실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제1 치료제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제2 치료제를 인코딩하는 서열의 역 보체이거나, 제1 이종 핵산 서열은 제2 치료제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제1 치료제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다. 실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제1 치료제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제2 치료제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다. 실시형태에서, 제1 이종 핵산 서열은 제2 치료제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제1 치료제를 인코딩하는 서열의 역 보체이다.
실시형태에서, 제1 치료제 및 제2 치료제는 독립적으로 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, RNA-가이드 RNA 뉴클레아제, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 가이드 RNA(gRNA), 치료용 단백질, 검출가능한 단백질, 또는 항체이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, RNA-가이드 RNA 뉴클레아제, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 가이드 RNA(gRNA), 치료용 단백질, 검출가능한 단백질, 또는 항체이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 RNA-가이드 RNA 뉴클레아제이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 가이드 RNA(gRNA)이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 치료용 단백질이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 검출가능한 단백질이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 항체이다. 실시형태에서, 제2 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, RNA-가이드 RNA 뉴클레아제, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 가이드 RNA(gRNA), 치료용 단백질, 검출가능한 단백질, 또는 항체이다. 실시형태에서, 제2 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, RNA-가이드 RNA 뉴클레아제, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 가이드 RNA(gRNA), 치료용 단백질, 검출가능한 단백질, 또는 항체이다. 실시형태에서, 제2 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이다. 실시형태에서, 제2 치료제는 RNA-가이드 RNA 뉴클레아제이다. 실시형태에서, 제2 치료제는 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이다. 실시형태에서, 제2 치료제는 가이드 RNA(gRNA)이다. 실시형태에서, 제2 치료제는 치료용 단백질이다. 실시형태에서, 제2 치료제는 검출가능한 단백질이다. 실시형태에서, 제2 치료제는 항체이다.
실시형태에서, 제1 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이고 제2 치료제는 gRNA이거나, 제1 치료제는 gRNA이고 제2 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이고 제2 치료제는 gRNA이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 gRNA이고 제2 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이다.
실시형태에서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 Cas9, Cas12a, 클래스 II CRISPR 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체이다. 실시형태에서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 Cas9 또는 이의 변이체이다. 실시형태에서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 Cas12a 또는 이의 변이체이다. 실시형태에서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 클래스 II CRISPR 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체이다.
실시형태에서, 제1 치료제는 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이고 제2 치료제는 gRNA이거나, 제1 치료제는 gRNA이고 제2 치료제는 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이고 제2 치료제는 gRNA이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 gRNA이고 제2 치료제는 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이다.
실시형태에서, 제1 치료제는 RNA-가이드 RNA 뉴클레아제이고 제2 치료제는 gRNA이거나, 제1 치료제는 gRNA이고 제2 치료제는 RNA-가이드 RNA 뉴클레아제이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 RNA-가이드 RNA 뉴클레아제이고 제2 치료제는 gRNA이다. 실시형태에서, 제1 치료제는 gRNA이고 제2 치료제는 RNA-가이드 RNA 뉴클레아제이다.
실시형태에서, gRNA는 복수의 gRNA를 포함한다. 예를 들어, gRNA는 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 gRNA를 포함할 수 있으며, 각각의 gRNA는 상이한 표적 서열을 갖는다.
실시형태에서, 검출가능한 단백질은 EGFR, Scarlet, 또는 루시퍼라아제이다. 실시형태에서, 검출가능한 단백질은 EGFR이다. 실시형태에서, 검출가능한 단백질은 Scarlet이다. 실시형태에서, 검출가능한 단백질은 루시퍼라아제이다.
본원에 제공된 핵산의 경우, 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 300개 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 160 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 170 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 180 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 190 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 200 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 210 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 220 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 230 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 240 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 250 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 260 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 270 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 280 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 290 내지 약 300개의 뉴클레오티드이다.
실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 290개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 280개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 270개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 260개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 240개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 230개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 220개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 210개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 200개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 190개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 180개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 170개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 160개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 또는 300개의 뉴클레오티드이다.
본원에 제공된 핵산의 경우, 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 205 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 210 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 215 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 220 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 225 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 230 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 235 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 240 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 245 내지 약 250개의 뉴클레오티드이다.
실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 200 내지 약 245개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 200 내지 약 240개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 205 내지 약 235개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 205 내지 약 230개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 205 내지 약 225개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 205 내지 약 220개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 205 내지 약 215개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 205 내지 약 210개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245 또는 250개의 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 205개 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 205개 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 약 235개 뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 프로모터는 길이가 235개 뉴클레오티드이다.
실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10에 비해 전장 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 적어도 20, 30 또는 40개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 부분)에 걸쳐 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10에 비해 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 81% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 82% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 83% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 84% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 80% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 81% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 82% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 83% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 84% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 85% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 86% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 87% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 88% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 89% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 90% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 91% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 92% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 93% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 94% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 95% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 96% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 97% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 98% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열에 대해 약 99% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열을 포함한다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열이다.
실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 가지며, 여기서 서열은 서열 번호 10이 아니다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열을 포함하지 않는다.
실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21에 비해 전장 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 적어도 20, 30 또는 40개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 부분)에 걸쳐 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21에 비해 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성을 갖는다. 활성은 예를 들어 qPCR, 웨스턴 블롯 등 또는 생물학 분야에 알려진 임의의 다른 방법에 의해 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종 핵산 서열의 발현 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 발현 수준은 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종 핵산 서열에 의해 인코딩된 치료제 또는 검출가능한 약제의 기능 또는 활성을 검출함으로써 측정될 수 있다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 81% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 82% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 83% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 84% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 80% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 81% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 82% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 83% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 84% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 85% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 86% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 87% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 88% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 89% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 90% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 91% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 92% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 93% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 94% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 95% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 96% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 97% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 98% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열에 대해 약 99% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열을 포함한다. 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열이다.
실시형태에서, 핵산은 하나 이상의 인트론을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 프로모터를 제1 이종 핵산 서열에 연결하거나, 프로모터를 제2 이종 핵산 서열에 연결한다. 실시형태에서, 인트론은 제1 이종 핵산 서열에 프로모터를 연결한다. 실시형태에서, 인트론은 제2 이종 핵산 서열에 프로모터를 연결한다.
실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 비해 전장 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 적어도 20, 30 또는 40개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 부분)에 걸쳐 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 81% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 82% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 83% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 84% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 81% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 82% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 83% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 84% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 86% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 87% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 88% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 89% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 91% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 92% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 93% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 94% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22에 대해 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22의 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 22의 서열이다.
실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 비해 전장 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 적어도 20, 30 또는 40개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 부분)에 걸쳐 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 81% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 82% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 83% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 84% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 81% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 82% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 83% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 84% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 86% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 87% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 88% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 89% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 91% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 92% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 93% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 94% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23에 대해 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23의 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 23의 서열이다.
실시형태에서, 인슐레이터 서열은 제1 이종 핵산 서열 또는 제2 이종 핵산 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 부착되어 있다. 실시형태에서, 인슐레이터 서열은 제1 이종 핵산 서열의 5' 말단에 부착되어 있다. 실시형태에서, 인슐레이터 서열은 제2 이종 핵산 서열의 5' 말단에 부착되어 있다. 실시형태에서, 인슐레이터 서열은 제1 이종 핵산 서열의 3' 말단에 부착되어 있다. 실시형태에서, 인슐레이터 서열은 제2 이종 핵산 서열의 3' 말단에 부착되어 있다.
실시형태에서, 인슐레이터 서열은 서열 번호 24의 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인슐레이터 서열은 서열 번호 24의 서열이다.
본원에 제공된 핵산의 경우, 실시형태에서, 핵산은 단일 가닥 DNA 또는 RNA 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA이다. 실시형태에서, 핵산은 단일 가닥 DNA이다. 실시형태에서, 핵산은 이중 가닥 DNA이다. 실시형태에서, 핵산은 RNA이다.
일 양태에서, 본 개시내용의 임의의 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 벡터와 같은 벡터가 제공된다. 따라서, 실시형태에서, 발현 벡터는 본원에 제공된 제1 이종 핵산 서열 및/또는 제2 이종 핵산 서열에 의해 인코딩된 치료제 및/또는 검출가능한 약제를 제조하는 데 사용될 수 있다. 발현 벡터는 바이러스에 패키징되거나 세포(예를 들어, 포유동물 세포 또는 인간 세포주와 같은 진핵 세포 또는 대장균(Escherichia coli)과 같은 원핵 세포)로 형질주입될 수 있다. 고려된 발현 벡터는 진핵 표적 세포 또는 원핵 표적 세포에 대해 고려된 것뿐만 아니라 다양한 바이러스 서열을 기반으로 한 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. "표적 세포"(예를 들어, 망막 신경절 세포)는 발현 벡터가 형질주입되고 치료제 또는 검출가능한 약제를 인코딩하는 이종 핵산 서열이 발현되는 세포를 지칭할 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 핵산을 포함하는 발현 벡터가 제공된다.
실시형태에서, 발현 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터이다. 실시형태에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-11, AAV-12, AAV113, AAVrh.74, AAV2.7m8, AAV.ANC80, Anc80L65 및 이의 유도체, 및 AAVDJ, 및 이의 조합으로부터 선택될 수 있다. 자연 발생 AAV 혈청형의 변이체를 포함하여 예시적인 AAV 혈청형의 광범위한 목록이 미국 특허 제10,662,425호에 제공되고, 이는 모든 목적을 위해 이의 전문이 본원에 포함된다.
실시형태에서, 발현 벡터는 DNA를 비리온으로 복제하고 패키징하기 위해 cis에서 필요한 AAV를 포함하는 서열(예를 들어, 기능적 ITR)을 포함한다. 실시형태에서, AAV 벡터는 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 AAV WT 유전자 중 하나 이상을 갖지만, 기능성 플랭킹 ITR 서열을 보유한다.
사용 방법
본원에 제공된 조성물(예를 들어, 바이러스 및 핵산)은 세포에서 하나 이상의 치료제 및/또는 검출가능한 약제를 발현하는 데 유용한 것으로 고려된다. 조성물은 세포(예를 들어, 뉴런)에서 유전자 발현을 위한 양방향 프로모터로서 기능할 수 있는 프로모터를 포함한다. 따라서, 일 양태에서, 세포를 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 바이러스와 접촉시키는 단계, 및 세포가 제1 이종 핵산 서열과 제2 이종 핵산 서열을 발현하도록 하는 단계를 포함하는, 제1 이종 핵산 서열과 제2 이종 핵산 서열의 발현 방법이 제공된다.
실시형태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 실시형태에서, 세포는 포유동물 신경 세포이다. 일부 실시형태에서, 뉴런 세포는 감각 뉴런이다. 실시형태에서, 세포는 망막 신경절 세포(RGC), 광수용체 세포, 또는 망막 색소 상피(RPE) 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 양극성 세포, 무축삭 세포, 또는 수평 세포와 같은 안구 뉴런이다. 실시형태에서, 세포는 망막 신경절 세포(RGC)이다. 실시형태에서, 세포는 광수용체 세포이다. 실시형태에서, 세포는 RPE 세포이다.
다른 양태에서, 세포를 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 핵산, 또는 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 발현 벡터와 접촉시키는 단계, 및 세포가 제1 이종 핵산 서열과 제2 이종 핵산 서열을 발현하도록 하는 단계를 포함하는, 제1 이종 핵산 서열과 제2 이종 핵산 서열의 발현 방법이 제공된다.
실시형태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 실시형태에서, 세포는 포유동물 신경 세포이다. 실시형태에서, 세포는 망막 신경절 세포(RGC), 광수용체 세포, 또는 망막 색소 상피(RPE) 세포이다. 실시형태에서, 세포는 망막 신경절 세포(RGC)이다. 실시형태에서, 세포는 광수용체 세포이다. 실시형태에서, 세포는 RPE 세포이다.
본원에 제공된 조성물은 일반적으로 최적이 아닌 뉴런 생존 및/또는 기능을 특징으로 하는 질환(예를 들어, 녹내장)의 치료에 효과적인 것으로 고려된다. 놀랍게도 조성물은 치료제를 인코딩하는 이종 핵산을 뉴런 세포에 전달하여 질환을 치료하는 데 효과적이다. 따라서, 다른 양태에서, 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 유효량의 바이러스, 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 핵산, 또는 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 발현 벡터를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료 방법이 제공된다.
실시형태에서, 방법은 실시형태를 포함하여 유효량의 본원에 제공된 바이러스를 투여하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 방법은 실시형태를 포함하여 유효량의 본원에 제공된 핵산을 투여하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 방법은 실시형태를 포함하여 유효량의 본원에 제공된 발현 벡터를 투여하는 것을 포함한다.
실시형태에서, 질환은 신경퇴행성 질환이다. 실시형태에서, 질환은 안구의 신경퇴행성 질환이다. 실시형태에서, 질환은 녹내장, 연령-관련 황반 변성(AMD), 또는 맥락막 혈관신생(CNV), 근시-관련 CNV, 당뇨병성 망막증, 황반 부종, 및 망막 정맥 폐쇄증, 또는 망막 색소증이다. 실시형태에서, 질환은 녹내장이다. 실시형태에서, 질환은 AMD이다. 실시형태에서, 질환은 CNV이다. 실시형태에서, 질환은 근시-관련 CNV이다. 실시형태에서, 질환은 당뇨병성 망막증이다. 실시형태에서, 질환은 황반 부종이다. 실시형태에서, 질환은 망막 정맥 폐쇄증이다. 실시형태에서, 질환은 망막 색소증이다.
본원에 제공된 방법의 경우, 실시형태에서, 프로모터의 양 측에서 제1 이종 핵산 서열 및 제2 이종 핵산 서열을 발현할 수 있는 프로모터(예를 들어, 프로모터10 또는 이의 변이체 등)를 포함하는 벡터(예를 들어, 발현 벡터(예를 들어, AAV 벡터))는 "유효량" 또는 "치료적 유효량", 즉 목적하는 결과를 달성하기에 필요한 투여량과 기간에서 효과적인 양으로 투여된다. 예를 들어, 세포(예를 들어, 안과 뉴런, RGC 세포 등)에서 제1 치료제 및 제2 치료제(예를 들어, 신경보호제)의 발현 시 목적하는 효과는 축삭 또는 뉴런 보호와 관련된 증상의 검출가능한 개선; 또는 질환(예를 들어, 녹내장)의 증상과 관련된 증상의 검출가능한 개선을 포함할 수 있다. 대안적으로, 본원에 제공된 벡터가 예방적으로 사용되는 경우, 목적하는 결과는 질환(예를 들어, 녹내장)의 하나 이상의 증상의 입증가능한 예방을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 방법의 경우, 실시형태에서, 벡터(예를 들어, 발현 벡터)는 약학적으로 허용가능한 비히클, 부형제 또는 희석제 중에 투여된 AAV 벡터와 같은 바이러스 벡터이다. "약학적으로 허용가능한"은 제제의 다른 성분과 상용가능하고, 이의 수용체에 유해하지 않은 담체, 희석제, 부형제 및/또는 염이다. 예는 폴록사머를 갖는 포스페이트 완충 식염수, 포스페이트 완충 식염수, 또는 식염수를 포함한다. 치료제는 현탁액 또는 용액과 같은 다양한 형태로 제공될 수 있다. 치료제는 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제, 보존제 및 완충제와 같은 제제화제와 함께 투여하기 위해 제제화될 수 있다. 대안적으로, 치료제는 사용 전 적합한 비히클, 예를 들어 멸균, 무-발열원 물과 구성하기 위해 멸균 고체의 동결건조물 또는 무균 단리물로서 제공될 수 있다. 본 발명의 치료제가 투여용으로 제조되는 경우, 이는 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합되어 약학적 제제, 또는 단위 투여 형태를 형성할 수 있다.
실시형태에서, 투여는 예를 들어 유리체강내 주사에 의한 안구로의 투여이다. 실시형태에서, 조성물(예를 들어, 핵산, 발현 벡터, AAV 바이러스 벡터 등)은 5 내지 500 마이크로리터, 흔히 100 내지 500 마이크로리터, 보다 흔히 100 내지 400 마이크로리터, 가장 흔히 100 내지 250 마이크로리터, 예를 들어 100 마이크로리터, 150 마이크로리터, 200 마이크로리터, 또는 250 마이크로리터의 부피로 투여될 수 있다. 실시형태에서, 조성물은 5 마이크로리터, 100 마이크로리터, 150 마이크로리터, 200 마이크로리터, 250 마이크로리터, 400 마이크로리터 또는 500 마이크로리터의 부피로 투여된다.
실시형태에서, 인간에 대한 바이러스 벡터(예를 들어, 발현 벡터, AAV 바이러스 벡터 등)의 투여는 주사당 109 내지 1013개의 바이러스 벡터의 투여량의 투여를 포함한다. 실시형태에서, 주사당 109 내지 1010, 1010 내지 1011, 1011 내지 1012, 또는 1012 내지 1013개의 바이러스 벡터가 투여된다. 실시형태에서, 주사당 109, 1010, 1010, 1011, 1011, 1012, 또는 1013개의 바이러스 벡터가 투여된다.
실시형태에서, 본원에 제공된 벡터(예를 들어, 발현 벡터, 바이러스 벡터)는 바이러스(예를 들어, 비리온, 바이러스 입자)로 투여된다. 실시형태에서, 벡터(예를 들어, 발현 벡터)는 "네이키드" DNA 또는 RNA로서, 즉 바이러스(예를 들어, 비리온, 바이러스 입자)에 패키징되지 않고 투여된다.
최적의 치료 반응을 제공하기 위해 투여 치료 계획은 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할된 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다.
다른 유전자 치료 벡터와의 조합을 포함하는 다중 치료는 대상체의 평생에 걸친 기간을 포함하여 임의의 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에 기재된 실시예 및 실시형태는 단지 예시의 목적으로, 이에 대한 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 시사될 것이며, 이러한 변형 또는 변경은 본 출원의 사상 및 범위, 및 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되는 것으로 이해된다. 본원에서 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
세포 조성물
본원에 제공된 조성물은 세포에서 이종 핵산을 전달하고 발현하는 데 효과적인 것으로 고려된다. 따라서, 일 양태에서, 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 바이러스, 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 핵산, 또는 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 발현 벡터를 포함하는 세포가 제공된다. 실시형태에서, 세포는 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 바이러스를 포함한다. 실시형태에서, 세포는 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 핵산을 포함한다. 실시형태에서, 세포는 실시형태를 포함하여 본원에 제공된 발현 벡터를 포함한다.
실시형태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 포유동물 신경 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 감각 뉴런이다. 일부 실시형태에서, 세포는 망막 신경절 세포(RGC), 광수용체 세포, 또는 색소 상피 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 양극성 세포, 무축삭 세포, 또는 수평 세포와 같은 안구 뉴런이다.
p 실시형태
실시형태 P1: 유전자 치료에서 두 mRNA의 발현을 구동하는 양방향 프로모터.
실시형태 P2: 실시형태 P1에 있어서, 양방향 프로모터는 프로모터 10인, 양방향 프로모터.
실시형태 P3: 실시형태 P1에 있어서, 유전자 치료는 AAV-기반 유전자 치료인, 양방향 프로모터.
실시형태 P4: 실시형태 P1에 있어서, 프로모터는 CRISPR 기구를 뉴런으로 전달하는 것을 가능하게 하는, 양방향 프로모터.
실시형태 P5: 유전자 치료 벡터에서 실시형태 P1의 양방향 프로모터를 포함하는 작제물을 작제하고 전달하는 것을 포함하는, 유전자 치료에서 두 mRNA의 발현 방법.
실시형태 P6: 실시형태 P5에 있어서, 양방향 프로모터는 프로모터 10인, 발현 방법.
실시형태 P7: 실시형태 P5에 있어서, 유전자 치료는 AAV-기반 유전자 치료인, 발현 방법.
실시형태 P8: 실시형태 P5에 있어서, 프로모터는 CRISPR 기구를 뉴런으로 전달하는 것을 가능하게 하는, 발현 방법.
실시형태
실시형태 1: i) 서열 번호 10 또는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 프로모터; ii) 프로모터의 3' 말단에 부착된 제1 이종 핵산 서열; 및 iii) 프로모터의 5' 말단에 부착된 제2 이종 핵산 서열을 포함하는 게놈을 갖는 바이러스.
실시형태 2: 실시형태 1에 있어서, 제1 이종 핵산 서열은 제1 치료제 또는 제1 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제2 치료제 또는 제2 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이거나, 제1 이종 핵산 서열은 제2 치료제 또는 제2 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제1 치료제 또는 제1 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체인, 바이러스.
실시형태 3: 실시형태 2에 있어서, 제1 치료제 및 제2 치료제는 독립적으로 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, RNA-가이드 RNA 뉴클레아제, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 가이드 RNA(gRNA), 치료용 단백질, 또는 항체인, 바이러스.
실시형태 4: 실시형태 3에 있어서, 제1 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이고 제2 치료제는 gRNA이거나, 제1 치료제는 gRNA이고 제2 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제인, 바이러스.
실시형태 5: 실시형태 3 또는 4에 있어서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 Cas9, Cas12a, 클래스 II CRISPR 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체인, 바이러스.
실시형태 6: 실시형태 3 내지 5 중 어느 하나에 있어서, gRNA는 복수의 gRNA를 포함하는, 바이러스.
실시형태 7: 실시형태 2에 있어서, 제1 검출가능 약제 및 제2 검출가능 약제는 독립적으로, 검출가능한 단백질인, 바이러스.
실시형태 8: 실시형태 7에 있어서, 검출가능 단백질은 EGFR, Scarlet, 또는 루시퍼라아제인, 바이러스.
실시형태 9: 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 300개 뉴클레오티드인, 바이러스.
실시형태 10: 실시형태 9에 있어서, 프로모터는 길이가 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드인, 바이러스.
실시형태 11: 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 서열 번호 10 또는 서열 번호 21의 서열을 포함하는, 바이러스.
실시형태 12: 실시형태 11에 있어서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열을 포함하는, 바이러스.
실시형태 13: 실시형태 11에 있어서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열을 포함하는, 바이러스.
실시형태 14: 실시형태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 게놈은 하나 이상의 인트론을 추가로 포함하는, 바이러스.
실시형태 15: 실시형태 14에 있어서, 인트론은 프로모터를 제1 이종 핵산 서열에 연결시키거나, 프로모터를 제2 이종 핵산 서열에 연결시키는, 바이러스.
실시형태 16: 실시형태 14 또는 15에 있어서, 인트론은 서열 번호 22 또는 서열 번호 23에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 바이러스.
실시형태 17: 실시형태 16에 있어서, 인트론은 서열 번호 22 또는 서열 번호 23의 서열을 포함하는, 바이러스.
실시형태 18: 실시형태 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 게놈은 하나 이상의 인슐레이터 서열을 추가로 포함하는, 바이러스.
실시형태 19: 실시형태 18에 있어서, 인슐레이터 서열은 제1 이종 핵산 서열 또는 제2 이종 핵산 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 부착되어 있는, 바이러스.
실시형태 20: 실시형태 18 또는 19에 있어서, 인슐레이터 서열은 서열 번호 24의 서열을 포함하는, 바이러스.
실시형태 21: 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 단순 헤르페스 바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 알파바이러스, 장내바이러스, 유두종바이러스, 또는 폴리오바이러스인 바이러스.
실시형태 22: 실시형태 21에 있어서, AAV인 바이러스.
실시형태 23: 실시형태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 게놈은 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA를 포함하는, 바이러스.
실시형태 24: 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 게놈은 단일 가닥 RNA 또는 이중 가닥 RNA를 포함하는, 바이러스.
실시형태 25: 실시형태 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 재조합 바이러스인 바이러스.
실시형태 26: i) 서열 번호 10 또는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 프로모터; ii) 프로모터의 3' 말단에 부착된 제1 이종 핵산 서열; 및 iii) 프로모터의 5' 말단에 부착된 제2 이종 핵산 서열을 포함하는 핵산.
실시형태 27: 실시형태 26에 있어서, 제1 이종 핵산 서열은 제1 치료제 또는 제1 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제2 치료제 또는 제2 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이거나, 제1 이종 핵산 서열은 제2 치료제 또는 제2 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제1 치료제 또는 제1 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체인, 핵산.
실시형태 28: 실시형태 27에 있어서, 제1 치료제 및 제2 치료제는 독립적으로 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, RNA-가이드 RNA 뉴클레아제, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 가이드 RNA(gRNA), 치료용 단백질, 또는 항체인, 핵산.
실시형태 29: 실시형태 28에 있어서, 제1 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이고 제2 치료제는 gRNA이거나, 제1 치료제는 gRNA이고 제2 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제인, 핵산.
실시형태 30: 실시형태 28 또는 29에 있어서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 Cas9, Cas12a, 클래스 II CRISPR 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체인, 핵산.
실시형태 31: 실시형태 28 내지 30 중 어느 하나에 있어서, gRNA는 복수의 gRNA를 포함하는, 핵산.
실시형태 32: 실시형태 27에 있어서, 제1 검출가능 약제 및 제2 검출가능 약제는 독립적으로, 검출가능한 단백질인, 핵산.
실시형태 33: 실시형태 32에 있어서, 검출가능 단백질은 EGFR, Scarlet, 또는 루시퍼라아제인, 핵산.
실시형태 34: 실시형태 26 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 300개 뉴클레오티드인, 핵산.
실시형태 35: 실시형태 34에 있어서, 프로모터는 길이가 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드인, 핵산.
실시형태 36: 실시형태 26 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 서열 번호 10 또는 서열 번호 21의 서열을 포함하는, 핵산.
실시형태 37: 실시형태 36에 있어서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열을 포함하는, 핵산.
실시형태 38: 실시형태 36에 있어서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열을 포함하는, 핵산.
실시형태 39: 실시형태 26 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 하나 이상의 인트론을 추가로 포함하는, 핵산.
실시형태 40: 실시형태 39에 있어서, 인트론은 프로모터를 제1 이종 핵산 서열에 연결시키거나, 프로모터를 제2 이종 핵산 서열에 연결시키는, 핵산.
실시형태 41: 실시형태 39 또는 40에 있어서, 인트론은 서열 번호 22 또는 서열 번호 23에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 핵산.
실시형태 42: 실시형태 41에 있어서, 인트론은 서열 번호 22 또는 서열 번호 23의 서열을 포함하는, 핵산.
실시형태 43: 실시형태 26 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 하나 이상의 인슐레이터 서열을 추가로 포함하는, 핵산.
실시형태 44: 실시형태 43에 있어서, 인슐레이터 서열은 제1 이종 핵산 서열 또는 제2 이종 핵산 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 부착되어 있는, 핵산.
실시형태 45: 실시형태 43 또는 44에 있어서, 인슐레이터 서열은 서열 번호 24의 서열을 포함하는, 핵산.
실시형태 46: 실시형태 26 내지 45 중 어느 하나의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
실시형태 47: 세포를 실시형태 1 내지 25 중 어느 하나의 바이러스와 접촉시키는 단계, 및 세포가 제1 이종 핵산 서열과 제2 이종 핵산 서열을 발현하도록 하는 단계를 포함하는, 제1 이종 핵산 서열과 제2 이종 핵산 서열의 발현 방법.
실시형태 48: 실시형태 47에 있어서, 세포는 포유동물 세포인, 발현 방법.
실시형태 49: 실시형태 47 또는 48에 있어서, 세포는 포유동물 신경 세포인, 발현 방법.
실시형태 50: 실시형태 47 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 세포는 망막 신경절 세포(RGC), 광수용체 세포, 또는 망막 색소 상피 세포인, 발현 방법.
실시형태 51: 세포를 실시형태 26 내지 45 중 어느 하나의 바이러스 또는 실시형태 46의 발현 벡터와 접촉시키는 단계, 및 세포가 제1 이종 핵산 서열과 제2 이종 핵산 서열을 발현하도록 하는 단계를 포함하는, 제1 이종 핵산 서열과 제2 이종 핵산 서열의 발현 방법.
실시형태 52: 실시형태 51에 있어서, 세포는 포유동물 세포인, 발현 방법.
실시형태 53: 실시형태 51 또는 52에 있어서, 세포는 포유동물 신경 세포인, 발현 방법.
실시형태 54: 실시형태 51 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 세포는 망막 신경절 세포(RGC), 광수용체 세포, 또는 색소 상피 세포인, 발현 방법.
실시형태 55: 실시형태 1 내지 25 중 어느 하나의 바이러스; 실시형태 26 내지 45 중 어느 하나의 핵산; 또는 실시형태 46의 발현 벡터를 포함하는 세포.
실시형태 56: 실시형태 55에 있어서, 포유동물 세포인 세포.
실시형태 57: 실시형태 55 또는 56에 있어서, 포유동물 신경 세포인 세포.
실시형태 58: 실시형태 55 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 망막 신경절 세포(RGC), 광수용체 세포, 또는 색소 상피 세포인 세포.
실시형태 59: 유효량의 실시형태 1 내지 25 중 어느 하나의 바이러스, 실시형태 26 내지 45 중 어느 하나의 핵산, 또는 실시형태 46의 발현 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서의 질환의 치료 방법.
실시형태 60: 실시형태 59에 있어서, 질환은 신경퇴행성 질환인, 치료 방법.
실시형태 61: 실시형태 59 또는 60에 있어서, 질환은 녹내장, 연령-관련 황반 변성(AMD), 맥락막 혈관신생(CNV), 근시-관련 CNV, 당뇨병성 망막증, 황반 부종, 및 망막 정맥 폐쇄증, 또는 망막 색소증인, 치료 방법.
실시예
예시 연구 소개
역말단 반복체(ITR)를 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 사용하는 유전자 치료는 대략 4.7 킬로베이스(kb)의 바이러스 패키징 용량에 의해 제한된다. 실시형태를 포함하여 전사 지속성 및 다중 전사체 구동 능력과 조합된 본원에 제공된 작은 크기의 프로모터는 더 많은 작제물을 인코딩하는 벡터의 전달을 가능하게 하며, 종래의 AAV 작제물보다 더 긴 전사체의 발현을 허용한다. 본원에 기재된 전이유전자와 벡터를 사용하여, 치료용 단백질, CRISPR-관련 단백질, 가이드 RNA, 및 억제성 RNA를 인코딩하는 전사체가 표적 세포에서 발현될 수 있다. CRISPR 시스템의 경우, 이는 Cas 단백질을 인코딩하는 전사체뿐만 아니라 gRNA의 배열을 인코딩하는 전사체 둘 모두가 단일 바이러스에 의해 전달될 수 있는 올인원 설계를 포함한다.
하기 기재된 것과 같이, 20개의 후보 양방향 프로모터를 일 측에서 GFP의 발현 및 다른 측에서 RFP의 발현에 대해 시험하였다. 그 중 일부만이 양방향성이고 강력한 것으로 나타났으며, 단 하나의 프로모터("프로모터 10")만이 중추신경계(CNS) 뉴런(예를 들어, 망막 신경절 세포)에서 활성을 보였다.
실시예 1: 프로모터 10은 인간 배아 신장(HEK) 293 T 세포에서 강력한 양방향 전사를 구동한다.
문헌[Trinklein et al., 2004, Genome Res. 14: 62-66]에 의해 생물정보학적으로 식별된 추정 양방향 프로모터를 선택하였다. 단방향 프로모터로서 4개의 세포주에서 이전에 보고된 발현 수준(문헌[Trinklein et al] 참조)을 기반으로 이들의 순위를 매기고, 추가 시험을 위해 20개를 선택하였다. 또한 길이가 약 0.35 kb 미만의 후보 프로모터에 중점을 두었다. 각 후보 프로모터를 mScarlet 및 eGFP 리포터의 발현을 동시에 외부적으로 구동할 수 있는 플라스미드로 클로닝하였다. 비교를 위해 CMV 프로모터와 CAG 프로모터를 사용하여 각각 GFP와 mScarlet을 발현하였다. 플라스미드를 인간 배아 신장(HEK) 293T 세포에 형질주입시키고, 24시간 후 Molecular Devices Image Xpress/MetaXpress 시스템을 사용하여 형광 발현 효율을 정량화하였다. CMV 프로모터를 이용하여 얻은 GFP 발현과 CAG 프로모터를 이용하여 얻은 mScalret 발현과 비교하여, 프로모터 10을 사용하여 GFP 및 mScarlet의 발현(EGFP-LRRC29/TMEM208-mScarlet)을 보여주는 이미지가 도 1에 제공된다. 도 2는 20개의 테스트 프로모터와 비교 CAG 및 CMV 프로모터로부터의 발현을 정량화한다. 예측치 못하게도, 단지 20개 중 5개의 프로모터(프로모터 8, 9, 10, 14, 15)가 유의한 양방향 발현을 가졌다. 프로모터 LRRC29/TMEM208(프로모터 10)(서열 번호 10)은 프로모터의 양 측에서 최고 수준의 전사(형광 발현으로 측정됨)를 가졌다. 도 1은 CAG 또는 CMV로 얻은 것과 유사한 발현 수준을 보여준다. 양방향 프로모터로부터의 연장과 프로모터 간섭에 관한 알려진 문제점을 고려할 때(예를 들어, 문헌[Curtin et al., Gene Therapy 15:384-390, 2008]; 문헌[Core et al., Science 322:1845-1848, 2008]), 이는 프로모터 10이 독특하게 2개의 코딩 RNA의 전사를 동시에 구동하고, 간섭을 회피할 수 있음을 시사한다.
실시예 2: 프로모터 10은 일차 마우스 망막 신경절 세포에서 양방향 발현을 구동한다.
유사분열 후 뉴런의 전사 인자 환경이 상기 사용된 분열 세포주와 반드시 다르기 때문에, CNS 뉴런에서 작제물을 시험하였다. 자성 나노입자 시스템(NeuronMag, OzBiosciences)을 사용하여, 플라스미드를 일차 마우스 망막 신경절 세포(mRGC)에 일시적으로 형질주입시키고, 24시간 후 녹색 형광과 적색 형광을 이미지화하였다. 특히, HEK 293T 세포와 같은 분열 세포주와 비교할 때 일차 신경 세포에서 형질주입 효능은 낮다. 따라서, 플라스미드-함유 세포의 수가 낮다. 그럼에도 불구하고, 드물게 형질주입된 세포에서, 프로모터 10(서열 번호 10)은 주목할 만한 양방향 발현을 제공했다(도 4a 및 도 4b). 추가로, 녹색 형광과 적색 형광은 동일한 단일 세포에서 관찰되었다(도 3). 이러한 동일한 세포에서의 녹색과 적색의 시각화는 프로모터가 동일한 세포에서 프로모터의 양 말단에서 전사를 구동할 수 있음을 시사한다. 따라서, 두 개의 전이유전자가 단일 세포에서 발현될 수 있다.
실시예 3: 마우스 프로모터 10 동원체
다음으로, 프로모터 10[서열 번호 10]과 비교하여 프로모터 10의 마우스 동원체(서열 번호 25)를 시험하였고, 인간 세포주 HEK 293T에서 유사한 양방향 전사를 확인하였다(도 5a 및 도 5b, "m프로모터 10"= 마우스 프로모터 10). 인간 및 마우스 프로모터 서열의 정렬(도 6)은 높은 수준의 서열 보존을 보여준다.
실시예 4: 프로모터 10의 절단 효과
유전자 전달 시스템의 크기를 최적화하기 위해, 높은 수준의 양방향 발현을 유지하면서 프로모터 10을 절단하여 프로모터를 더 작게 만들 수 있는지를 평가하였다. 프로모터 활성을 HEK 293T 세포에서 평가하였다(도 5a 및 도 5b). 프로모터(서열 번호 21)의 TMEM208 측(온전한 LRRC29, hP10 마이너스 TMEM208(hP10-TMEM208)로 지정된 플라스미드)의 절단이 양 측에서 유전자 발현을 유의하게 변경하지 않아, 더 큰 페이로드를 갖는 바이러스 작제 설계를 허용함을 발견하였다. 대조적으로, 67 bp만큼 LRRC29 측(온전한 TMEM208, hP10 마이너스 LRRC29(hP10-LRRC29)로 지정된 플라스미드)의 절단은 양 방향에서 유전자 발현을 방해하였으며, 이는 주요 전사 인자 결합 부위의 존재를 시사한다.
실시예 5: 마우스 N2A 세포의 프로모터 10-구동 CRISPR 유전자 편집 시스템
CRISPR 유전자 편집을 수행하기 위한 프로모터 10 시스템에서 사용하기 위한 Cas12a 단백질과 gRNA 서열을 선택하기 위해, 먼저 4개의 Cas12a 변이체를 비교하였다. 평가된 Cas 12a 단백질은 AsCas12a-Ultra(문헌[Zhang et al, Nat. Commun. 12:3908, 2021]), Lb2Cas12a(문헌[Tran et al, Mol Ther. Nucleic Acids 24:40-53, 2021]), OpAsCas12a(문헌[Gier et al, Nat. Commun. 11:23455, 2020]), 및 enAsCas12a(문헌[Kleinstiver et al, Nat Biotechnol. 37(3):276-282, 2019])였다. 각각의 Cas12a 변이체는 프로모터 10의 일 말단으로부터의 플라스미드에서 발현되었고, 신경퇴행성 유전자, Dlk 및 Lzk(프로모터 10에서도 발현됨)를 표적으로 하는 단일 gRNA 어레이를 발현하는 별도의 플라스미드와 조합되었다. 반대로, 또한 gRNA 설계를 평가하기 위해 Dlk 및 Lzk를 표적으로 한 일련의 gRNA 변이체를 생성하였다. gRNA의 각각의 세트는 프로모터 10의 일 측으로부터 발현되었고, 프로모터 10의 일 말단에서 enAsCas12a 단백질을 발현하는 별도의 플라스미드와 조합되었다. 이전의 실험은 Cas12a 및 gRNA 설계를 최적화하고자 하였지만, 양방향 프로모터의 어느 측이 각 작업(즉, Cas 단백질 발현 및 gRNA 발현)에 가장 적합한지는 다루지 않았다. 이를 다루기 위해, 인간 프로모터 10(서열 번호10)을 LRRC29 측 또는 TMEM208 측에서 gRNA를 발현하는 작제물에 클로닝하였다. 유사하게, Cas12a는 양 방향 모두에서 프로모터와 클로닝되었다. 플라스미드를 뉴런으로 분화할 수 있는 마우스 신경능선 유래 세포주인 N2A 세포에 형질주입시켰다.
제한 단편 길이 다형성(RFLP) 어세이를 사용하여 가이드 RNA와 복합체화된 Cas12a 단백질에 의해 생성된 표적 돌연변이 유발을 평가하였다. 이러한 어세이를 위해, 가이드 RNA를 선택하여 예측된 Cas12a 절단 부위가 제한 효소 인식 서열과 중첩되도록 하였다. 내인성 비상동 말단 연결 기구(NHEJ)에 의해 복구되는 Cas12a 유도 이중 가닥 파괴(DSB)는 제한 부위를 파괴하는 삽입/삭제 돌연변이("indel")를 생성할 것이다. 따라서, 좌위의 제한 효소 절단은 Cas12a 유전자 편집의 양에 반비례한다.
RFLP 어세이를 하기와 같이 수행하였다: N2A 추출된 게놈 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다(하기 방법 참조). 제한 엔도뉴클레아제 반응에 대해 200 ng의 PCR 산물이 사용되었다. 엔도뉴클레아제 AcuI(NEB)는 Dlk 돌연변이 유발을 평가하는 데 사용되었고, 엔도뉴클레아제 AluI(NEB)는 Lzk 돌연변이 유발을 평가하는 데 사용되었다. 엔도뉴클레아제에 대한 제조업체의 프로토콜에 따라 반응물을 37℃에서 1시간 동안, 80℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 제한 단편은 1.5% 아가로오스 겔에서 분리되었다. 도 7a는 Dlk-표적화된 유전자 편집을 평가하기 위한 결과를 보여준다. 도 7b는 Lzk-표적화된 유전자 편집을 평가하기 위한 결과를 보여준다. 각 샘플은 두 개의 레인을 갖는다. 좌측 레인은 소화되지 않은 PCR 산물이다. 우측 레인은 제한 효소로 인큐베이션된 DNA이다.
가장 두드러진 게놈 편집은 Dlk(도 7a) 및 Lzk(도 7b) 좌위들 모두에서, 다른 Cas12a 변이체에 비해 opAsCas12a에서 나타났다. 유사하게, gRNA는 Dlk(도 11) 및 Lzk(도 12) 좌위들 모두에서 TMEM208 측에서 발현될 때(레인 7 대 레인 5 비교) 가장 효과적이었다. 각 gRNA 프로토스페이서의 3' 말단에 추가된 작은 스페이서 서열은 또한 Dlk(도 11) 및 Lzk(도 12) 좌위들 모두에서 유전자 편집(레인 9 대 레인 5 비교)을 개선하는 역할을 했다. 마지막으로, 헤마글루티닌(HA)-태깅된 enAsCas12a의 발현은 TMEM208 또는 LRRC29 측에서 HA-enAsCas12a를 구동하는 프로모터 10으로 형질주입된 293T 세포의 항-HA 면역형광 염색에 의해 측정되었다(도 13). 대조군 CAG-HA-enAsCas12a 작제물에 대한 유사한 발현은 양 측으로부터의 발현에 의해 나타났으며, TMEM208 측에 대해 약간 선호되었다.
enAsCas12a를 선택하고, LRRC29 측에서 Dlk 및 Lzk 유전자를 표적으로 하는 다중 gRNA 배열과 프로모터 10의 TMEM208 측에서 enAsCas12a 발현을 동시에 구동하기 위한 단일 플라스미드 작제물을 생성하였다. 단일 플라스미드 작제물을 사용한 유전자 편집을 2개의 별도의 플라스미드를 사용하여 얻은 편집(상기 수행된 것과 같음)과 비교하였다. 유전자 편집은 RFLP 어세이로 평가되었다. 도 8a는 Dlk에 대한 결과를 보여주는 한편, 도 8b는 Lzk에 대한 결과를 보여준다. 각각의 경우, 유전자 편집은 단일 올인원 설계를 사용하여 관찰되었다.
실시예 6: 인트론의 효과
프로모터 10에 의한 유전자 발현을 추가로 향상시키기 위해, 작은 인트론을 포함시키는 것이 프로모터의 능력을 개선하는 것을 보조할 수 있는지를 시험하였다.
게놈 전체에 걸친 작은 인트론에 대한 생물정보학 평가를 사용하여 후보 인트론을 식별하였다(문헌[Abebrese et al., 2017, PLoS One. 2017; 12(5): e0175393]). 후보 인트론을 다음 플라스미드 작제물에 서브클로닝하였다: 프로모터 10(TMEM 측)-INTRON-SpyCas9-P2A- EGFP-sNRP 종결자. sNRP 종결자는 그다지 효율적이지 않기 때문에, 기준선에서 GFP 리포터의 발현이 최소이거나 발현되지 않는다. CCDC115, CUEDC2, MAT2A, UQCRFS1, MVM, BRSK2, SV40, ZDHHC2, SLC35F2, SNF286A, 미지의 명칭의 유전자로부터의 인트론, MVM No CBA, 및 UQCRFS1 인트론을 포함한 13개의 후보 인트론을 시험하였으며, 이들 각각은 100 bp 미만이다. 작제물을 HEK293T 세포에 형질주입시키고, 24시간 후 녹색 형광에 대해 분석하였다(도 9 내지 도 10). 결과는 CCDC115, CUEDC2, MAT2A, 미지, UQCRFS 및 MVM 인트론으로부터의 활성을 입증하였다. 이후 동일한 작제물을 CNS 뉴런에 형질주입시켰고, CCDC115 및 CUEDC2만이 활성이었다.
실시예 7: 시험관내 투여 및 발현
프로모터가 AAV 에피좀의 맥락에서 작동하는지에 대한 첫 번째 시험으로서, mScarlet 및 EGFP의 양방향 전사를 구동하는 프로모터 10으로 바이러스 작제물을 제조하였다. AAV 입자가 생성되었고, 109개의 바이러스 게놈이 성체 C57Bl/6J 마우스에 유리체강내 주사되었다. 2주 후, 망막을 평평하게 장착하고, 적색/녹색 형광에 대해 검사하였다. 이미지(도 14)는 두 전이유전자의 강력한 양방향 발현을 보여준다. 초점 평면은 신경절 세포 층/망막 신경 섬유 층(망막내 축삭에 의해 입증됨)에 있으며, 이는 망막 신경절 세포에서의 발현을 나타낸다.
CRISPR 유전자 편집 시스템은 일 측에서 Cas 단백질을 구동하고 다른 측에서 DLK gRNA를 구동하는 프로모터 10을 사용하며 +/- DLK의 녹아웃이 강력한 신경보호적 모델인, 시신경 크러시에서 인트론 향상이 평가될 것이며, RGC 생존율이 평가될 것이다.
실시예 8: 인슐레이터 서열
작은 인슐레이터/스페이서 서열, 예를 들어 5'-AAAT-3'(서열 번호 24)의 포함도 시험하였다. 인슐레이터 스페이서 서열을 포함하는 것은 gRNA 사이에 삽입될 때 유전자 편집을 개선하였다. (도 12, 레인 8 내지 레인 9 참조). 문헌[Magnussun et al, eLIFE 2021:10:e66406, 1-20; doi 10.7554/eLife.66406] 참조.
실시예 9: 다른 변경
추가 실험(데이터는 표시되지 않음)은 gRNA 뒤의 종결자 서열, gRNA의 길이, gRNA의 순서 및 Cas12a 효소의 핵 국소화 신호가 유전자 편집에 대해 상대적으로 적은 영향을 가졌음을 시사한다.
실시예 10: 방법
세포 배양: HEK 293 세포를 10% FBS를 갖는 DMEM에서 배양하고 유지시켰다. 파파인 중에서 망막을 분리하고 항-Thy1.2 항체로 코팅된 플레이트를 사용하여 면역패닝(immunopanning)하여 일차 마우스 RGC를 P0 내지 P2 마우스 새끼로부터 단리하였다. 세포를 24웰 또는 96웰 플레이트에 파종하였고, 리포펙타민 3000 또는 NeuroMag를 사용하여 다양한 플라스미드 작제물로 형질주입시켰다.
이미징: Image Xpress 이미지화기를 사용하여 세포를 10X 또는 20X 배율로 이미지화하고, 세포 수와 신호 강도를 MetaXpress 이미지 분석 소프트웨어(Molecular Devices)로 정량화하였다.
제한 효소 소화 기반 유전자 편집 분석: 제한 효소 소화 부위와 중첩된 CRISPR 유전자 편집 표적 부위를 선택하였다. PCR을 사용하여 표적 유전자 파괴 부위 주위에 작은 DNA 단편을 생성하였다. DNA 단편은 적절한 제한 효소로 소화되었으며, 제한 효소에 의한 DNA 단편의 소화 부족은 유전자 표적이 CRISPR 유전자 편집에 의해 파괴되었음을 나타낸다. N2A 게놈 DNA의 제조 및 추출: 마우스 신경모세포종(N2A) 세포를 분리하고, 웰당 2.5 x 105개의 세포로 6웰 플레이트 상에 플레이팅하였다. 다음날, gRNA 및 Cas12a 변이체의 선택을 위해, 두 개의 플라스미드를 이용하는 실험에서 세포를 Cas12a 발현 플라스미드 2 μg, gRNA 발현 플라스미드 2 μg, 및 EGFP 발현 플라스미드 1 μg으로 형질주입시키거나; Cas12a와 gRNA 배열 및 eGFP 발현 플라스미드를 모두 함유하는 하나의 발현 플라스미드로 형질주입시켰다. 형질주입 36시간 후, 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 세포를 수집하였다. 수집된 세포를 16,000 x g에서 원심분리하여 펠렛화하였다. QuickExtract DNA 추출 용액을 사용하여 세포에서 게놈 DNA를 추출하였다.
[표 2]
CCDC115(80 bp)(서열 번호 22)
CAGCCCTGCAGGGAGAGGAAAGCGGTGAGACTCAGTTTACGCCCGTGTACCC TCCTGCCCGCCCCAGGCGCCTACCTCCT
CUEDC2(42 bp)(서열 번호 23)
GGCGGCCCGTCCGGGGCCAGCGGCCGCGACAATAGTCGCGGC
인슐레이터(서열 번호 24)
5'- AAAT-3'
마우스 프로모터 10(서열 번호 25)
ggggcctgtc cccgaccaag gcctgaagga ccgctcgctt cctctcacct ccagaggcag cgagtccgcc atcgcagttc tgccgtctcc gcccccacgc aaggttttct gggaagtgta gtcccaccga ctcagggggc ggggcttcgg aaggaaatga aatccacttc cgcccaggag cgaacgattg cgctctttac cggaagtgca tgtgctgccg atgtggtgtc tactgactg
역방향 프로모터 10(서열 번호 26)
caatcactaa gcaccacatc ggcagctcat gcacttccgg cgcagaccga agtcgtcagc ttttgcgacg gaaataggtc tcacttcctt cccaagcccc gccccaaaga ggcgagacta catttcccag aaagccttgc gcagtggggg cggaggcggc agggatgcga tggcggagtc gctgcccctg gaggtgagag gaagccgccc tcaggcctag ctctggacag gcccc
인간 및 마우스 프로모터 10 서열의 정렬로부터의 공통 서열(서열 번호 27)
GGGGCCTGTNCCMGASCWAGGCCTGARGGNNCGNNNGCTTCCTCTCACCTCCAGRGGCAGCGASTCCGCCATCGCAKYYCTGCCGYCTCCGCCCCCACNNNGCAAGGYTTTCTGGGAARTGTAGTCYCRCCNWCTNWKGGGGCGGGGCTTSGGAAGGAARTGARAYCYAYTTCCGYCNCARRAGCKRACGAYTKCGSTCTKYRCCGGAAGTGCATGWGCTGCCGATGTGGTGYYTASTGAYTG
SEQUENCE LISTING <110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY Derek Welsbie Amit Patel Tianlun Lu Natalie Chau Donald J. Zack Pingwu Zhang <120> PROMOTERS FOR VIRAL-BASED GENE THERAPY <130> 048537-652001WO <150> US 63/174,679 <151> 2021-04-14 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 265 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 accacctcaa tgcagttgcc gccgcctcag cagcagcagc tcctcgaaca gccctcggag 60 ccacaacaac ctccacttcc gcctcccggc cgccgtcgct gacctgcggt ttacgcatgc 120 gcgcaggacc gcgcacagcg attgggcggc gtggcagggg tcacccactg ctcttccgga 180 cgcaattttg aggaggtcgg agcggaagga cgtcgtggag attgcttgcg ctggggtgcc 240 acacttaggc tgagctgcag gtttt 265 <210> 2 <211> 130 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 accagcagcg agagaaggag cccggcatgc ggcgactcag agtgacgaca cacgcgagtc 60 tccgcccgag tacgtcactt ccgcaacgct tccttcgcgg ggctttgtgg gtagccgact 120 ggggtctcct 130 <210> 3 <211> 239 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 aagaaaatag gctttctccg ctctaccgcc tcgggcagcc acacctccac acttccggcg 60 gtgtaccggc caaatgccgc ctgccagcaa cttccgtcct cctagctaaa agcggaaaac 120 agaggctcgg aaccgctgcg tggttcttgc tcttcactcg gccgttttaa agggtgactc 180 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<211> 306 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gtagctataa agcgccaacg aaaaggaaaa acagcgtgag cagggtatga caaggcgctt 60 ttatatagaa tcgcttatgc aaataaggtg aagagttgaa gtcttgtgtc tgattggtag 120 ttattcaggg taacgtcaga ggtcaggtct gcccaatcag gattcgcaaa tccagaagac 180 gcactactat tggttgaaat taaactgcag ccctaaccaa caacacgtct tctttttcgc 240 gcccaatagt gtttataaaa agcgccgcct ttcccgttca ctttgtggtt gctcgtagtg 300 agttgc 306 <210> 8 <211> 255 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gctctacagc caggaaaagt gaagcgaaaa cggcttccgt agactccgcc accaccgagt 60 aacagaccaa ctctgacagc ccgaagatcg cacttccgct tccggggcat agcaccggaa 120 aggctcgtat cggagaacgg tgtggccacg agagtctaga ggaaaccaac ccgcaactca 180 ctggagctga agggctggta gtcaggccga atctcgcgag aattggaact atttcagagc 240 cagaggagga tagtg 255 <210> 9 <211> 133 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 cagcctcagc aaggatgact tccggctatc gagtcgctgg gtcgcacgcc tagagagcct 60 ccgccgagca caaaaattat ttccggctcc tcccggaagt gccgaagctg gctactaagg 120 gaacttggga gga 133 <210> 10 <211> 235 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ggggcctgtc cagagctagg cctgagggcg gcttcctctc acctccaggg gcagcgactc 60 cgccatcgca tccctgccgc ctccgccccc actgcgcaag gctttctggg aaatgtagtc 120 tcgcctcttt ggggcggggc ttgggaagga agtgagacct atttccgtcg caaaagctga 180 cgacttcggt ctgcgccgga agtgcatgag ctgccgatgt ggtgcttagt gattg 235 <210> 11 <211> 295 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cagacggaaa ggaaagagct gtactcccac aatgcctttt gggctcctcc cccacctcag 60 ccaccctctt tccggtggaa agctgcggcc tcccagagcg tcatgggaca tgtagttccg 120 gcatcgcgcc tggtggcgga gttctgccga gtggggcgcc gcggccgcta ttgtcccgcc 180 ccctgctccg caagattcga gcctgagcgg cctgggcgtc tcgagaggtg agagagttgg 240 cggcgaggtc tcggcggcta agcgagcgtc ggcgactgtc tctccgcgag aggag 295 <210> 12 <211> 250 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ggaaacgcaa tgtcagtttc cgcggaagag acccgcgccc cgaacctgta gccagaacgc 60 cgaagcagtt ctcgcgatac cctgggatgt gctctcgcga tacgtaggcg gagcttccgg 120 ccggtgctgg gcaaccaagc tcatgcgccg tagctcttca gctcgggaag gctatattta 180 gcaggtttcc ggaagttgcc ggactggctg tgaggcggtc ctgcctcgct gccttcagtc 240 cctagtgtct 250 <210> 13 <211> 213 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ggctccatgg tgatgcagtc gctgtgcgac gcttcccggc gcaggttctg gcgcgtagtg 60 acgtcacccg ctccgcgcct gcgcgatggt aggaggggcg gaggctgagc gggcgaggcc 120 caggcgcgca tgctcgggcg ggtaaaatcc gcgccgggga cagtcaggga tgctcccagg 180 cccttcgctc ttgctttcag ctagtcattg tcg 213 <210> 14 <211> 206 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 ggtcctcttc tatccgcagt cccggacctg gagcgggtca gaccccgact tccgcccctg 60 actccccagg cggtcacatg accgaagcgg ctgggagcag ggaggggcat catgtgacca 120 ctcgccggcg acggctgatg acgcaagagc ccgctctcac ttttcagcgg caggcgaagg 180 gggctgagga aaggaggtgg gtctag 206 <210> 15 <211> 236 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 gaaactcaga ttctcggcac ctccagcagc tggcttcgcc aacggcgttg aacaagggtc 60 gcagctcaat gacgtcatat ctccctacct acctccaggg ttccgcctca cgctctatgt 120 cgcgcgcgcg cactacgtcc tatggcttgc gcgtgcggcg gctgggcacc gccattttgg 180 ccggtggccg tgagaacacg ctgtgtggct gaaaagtgaa ggcaagagct gatttg 236 <210> 16 <211> 162 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 gctgttctcc gccatcttcg ccgcctgctg ggtttccggc cggcgcagct cagcccccgc 60 cttgcgtcac gtccggcctg cgagttaccg cccactcgct gcggcgcttc tggctccaga 120 ccgccctccg gatcggaccc tgcgaatggt tttggctata tc 162 <210> 17 <211> 219 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 gttcaggaag ctccgcacct atccggccgc caccctcagc acagccacgg cagccgactc 60 ggcgttccta ctgccccgga agtgctcctt cagcgcagag gcgtgccggt gtgtccgaga 120 aaacttccga gttaagccgc cgctgaggcc ggaaggagct agacggcggt cgggtaggtg 180 acggcttggt tggggtcgct gcgaggggac tactaggag 219 <210> 18 <211> 162 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 gctgttctcc gccatcttcg ccgcctgctg ggtttccggc cggcgcagct cagcccccgc 60 cttgcgtcac gtccggcctg cgagttaccg cccactcgct gcggcgcttc tggctccaga 120 ccgccctccg gatcggaccc tgcgaatggt tttggctata tc 162 <210> 19 <211> 219 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 gttcaggaag ctccgcacct atccggccgc caccctcagc acagccacgg cagccgactc 60 ggcgttccta ctgccccgga agtgctcctt cagcgcagag gcgtgccggt gtgtccgaga 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 24 aaat 4 <210> 25 <211> 239 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 25 ggggcctgtc cccgaccaag gcctgaagga ccgctcgctt cctctcacct ccagaggcag 60 cgagtccgcc atcgcagttc tgccgtctcc gcccccacgc aaggttttct gggaagtgta 120 gtcccaccga ctcagggggc ggggcttcgg aaggaaatga aatccacttc cgcccaggag 180 cgaacgattg cgctctttac cggaagtgca tgtgctgccg atgtggtgtc tactgactg 239 <210> 26 <211> 235 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 caatcactaa gcaccacatc ggcagctcat gcacttccgg cgcagaccga agtcgtcagc 60 ttttgcgacg gaaataggtc tcacttcctt cccaagcccc gccccaaaga ggcgagacta 120 catttcccag aaagccttgc gcagtggggg cggaggcggc agggatgcga tggcggagtc 180 gctgcccctg gaggtgagag gaagccgccc tcaggcctag ctctggacag gcccc 235 <210> 27 <211> 243 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (30)..(31) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(36) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (99)..(101) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (132)..(132) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (136)..(136) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (178)..(178) <223> n is a, c, g, or t <400> 27 ggggcctgtn ccmgascwag gcctgarggn ncgnnngctt cctctcacct ccagrggcag 60 cgastccgcc atcgcakyyc tgccgyctcc gcccccacnn ngcaaggytt tctgggaart 120 gtagtcycrc cnwctnwkgg ggcggggctt sggaaggaar tgaraycyay ttccgycnca 180 rragckracg aytkcgstct kyrccggaag tgcatgwgct gccgatgtgg tgyytastga 240 ytg 243

Claims (61)

  1. 하기 i) 내지 iii)을 포함하는 게놈을 갖는 바이러스:
    i) 서열 번호 10 또는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 프로모터;
    ii) 프로모터의 3' 말단에 부착된 제1 이종 핵산 서열; 및
    iii) 프로모터의 5' 말단에 부착된 제2 이종 핵산 서열.
  2. 제1항에 있어서,
    제1 이종 핵산 서열은 제1 치료제 또는 제1 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제2 치료제 또는 제2 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이거나,
    제1 이종 핵산 서열은 제2 치료제 또는 제2 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제1 치료제 또는 제1 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체인, 바이러스.
  3. 제2항에 있어서, 제1 치료제 및 제2 치료제는 독립적으로 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, RNA-가이드 RNA 뉴클레아제, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 가이드 RNA(gRNA), 치료용 단백질, 또는 항체인, 바이러스.
  4. 제3항에 있어서, 제1 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이고 제2 치료제는 gRNA이거나, 제1 치료제는 gRNA이고 제2 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제인, 바이러스.
  5. 제3항에 있어서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 Cas9, Cas12a, 클래스 II CRISPR 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체인, 바이러스.
  6. 제3항에 있어서, gRNA는 복수의 gRNA를 포함하는, 바이러스.
  7. 제2항에 있어서, 제1 검출가능 약제 및 제2 검출가능 약제는 독립적으로, 검출가능한 단백질인, 바이러스.
  8. 제7항에 있어서, 검출가능 단백질은 EGFR, Scarlet, 또는 루시퍼라아제인, 바이러스.
  9. 제1항에 있어서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 300개 뉴클레오티드인, 바이러스.
  10. 제9항에 있어서, 프로모터는 길이가 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드인, 바이러스.
  11. 제1항에 있어서, 프로모터는 서열 번호 10 또는 서열 번호 21의 서열을 포함하는, 바이러스.
  12. 제11항에 있어서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열을 포함하는, 바이러스.
  13. 제11항에 있어서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열을 포함하는, 바이러스.
  14. 제1항에 있어서, 게놈은 하나 이상의 인트론을 추가로 포함하는, 바이러스.
  15. 제14항에 있어서, 인트론은 프로모터를 제1 이종 핵산 서열에 연결시키거나, 프로모터를 제2 이종 핵산 서열에 연결시키는, 바이러스.
  16. 제14항에 있어서, 인트론은 서열 번호 22 또는 서열 번호 23에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 바이러스.
  17. 제16항에 있어서, 인트론은 서열 번호 22 또는 서열 번호 23의 서열을 포함하는, 바이러스.
  18. 제1항에 있어서, 게놈은 하나 이상의 인슐레이터 서열을 추가로 포함하는, 바이러스.
  19. 제18항에 있어서, 인슐레이터 서열은 제1 이종 핵산 서열 또는 제2 이종 핵산 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 부착되어 있는, 바이러스.
  20. 제18항에 있어서, 인슐레이터 서열은 서열 번호 24의 서열을 포함하는, 바이러스.
  21. 제1항에 있어서, 단순 헤르페스 바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 알파바이러스, 장내바이러스, 유두종바이러스, 또는 폴리오바이러스인 바이러스.
  22. 제21항에 있어서, AAV인 바이러스.
  23. 제1항에 있어서, 게놈은 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA를 포함하는, 바이러스.
  24. 제1항에 있어서, 게놈은 단일 가닥 RNA 또는 이중 가닥 RNA를 포함하는, 바이러스.
  25. 제1항에 있어서, 재조합 바이러스인 바이러스.
  26. 하기 i) 내지 iii)을 포함하는 핵산:
    i) 서열 번호 10 또는 서열 번호 21의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 프로모터;
    ii) 프로모터의 3' 말단에 부착된 제1 이종 핵산 서열; 및
    iii) 프로모터의 5' 말단에 부착된 제2 이종 핵산 서열.
  27. 제26항에 있어서,
    제1 이종 핵산 서열은 제1 치료제 또는 제1 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제2 치료제 또는 제2 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체이거나,
    제1 이종 핵산 서열은 제2 치료제 또는 제2 검출가능 약제를 인코딩하고 제2 이종 핵산 서열은 제1 치료제 또는 제1 검출가능 약제를 인코딩하는 서열의 역 보체인, 핵산.
  28. 제27항에 있어서, 제1 치료제 및 제2 치료제는 독립적으로 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, RNA-가이드 RNA 뉴클레아제, 뉴클레아제-결핍 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 가이드 RNA(gRNA), 치료용 단백질, 또는 항체인, 핵산.
  29. 제28항에 있어서, 제1 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이고 제2 치료제는 gRNA이거나,
    제1 치료제는 gRNA이고 제2 치료제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제인, 핵산.
  30. 제28항에 있어서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 Cas9, Cas12a, 클래스 II CRISPR 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체인, 핵산.
  31. 제28항에 있어서, gRNA는 복수의 gRNA를 포함하는, 핵산.
  32. 제27항에 있어서, 제1 검출가능 약제 및 제2 검출가능 약제는 독립적으로, 검출가능한 단백질인, 핵산.
  33. 제32항에 있어서, 검출가능 단백질은 EGFR, Scarlet, 또는 루시퍼라아제인, 핵산.
  34. 제26항에 있어서, 프로모터는 길이가 약 150 내지 약 300개 뉴클레오티드인, 핵산.
  35. 제34항에 있어서, 프로모터는 길이가 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드인, 핵산.
  36. 제26항에 있어서, 프로모터는 서열 번호 10 또는 서열 번호 21의 서열을 포함하는, 핵산.
  37. 제36항에 있어서, 프로모터는 서열 번호 10의 서열을 포함하는, 핵산.
  38. 제36항에 있어서, 프로모터는 서열 번호 21의 서열을 포함하는, 핵산.
  39. 제26항에 있어서, 하나 이상의 인트론을 추가로 포함하는 핵산.
  40. 제39항에 있어서, 인트론은 프로모터를 제1 이종 핵산 서열에 연결시키거나, 프로모터를 제2 이종 핵산 서열에 연결시키는, 핵산.
  41. 제39항에 있어서, 인트론은 서열 번호 22 또는 서열 번호 23에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 핵산.
  42. 제41항에 있어서, 인트론은 서열 번호 22 또는 서열 번호 23의 서열을 포함하는, 핵산.
  43. 제26항에 있어서, 하나 이상의 인슐레이터 서열을 추가로 포함하는 핵산.
  44. 제43항에 있어서, 인슐레이터 서열은 제1 이종 핵산 서열 또는 제2 이종 핵산 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 부착되어 있는, 핵산.
  45. 제43항에 있어서, 인슐레이터 서열은 서열 번호 24의 서열을 포함하는, 핵산.
  46. 제26항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  47. 세포를 제1항의 바이러스와 접촉시키는 단계, 및 세포가 제1 이종 핵산 서열과 제2 이종 핵산 서열을 발현하도록 하는 단계를 포함하는, 제1 이종 핵산 서열과 제2 이종 핵산 서열의 발현 방법.
  48. 제47항에 있어서, 세포는 포유동물 세포인, 발현 방법.
  49. 제47항에 있어서, 세포는 포유동물 신경 세포인, 발현 방법.
  50. 제47항에 있어서, 세포는 망막 신경절 세포(RGC), 광수용체 세포, 또는 망막 색소 상피 세포인, 발현 방법.
  51. 세포를 제46항의 발현 벡터와 접촉시키는 단계, 및 세포가 제1 이종 핵산 서열과 제2 이종 핵산 서열을 발현하도록 하는 단계를 포함하는, 제1 이종 핵산 서열과 제2 이종 핵산 서열의 발현 방법.
  52. 제51항에 있어서, 세포는 포유동물 세포인, 발현 방법.
  53. 제51항에 있어서, 세포는 포유동물 신경 세포인, 발현 방법.
  54. 제51항에 있어서, 세포는 망막 신경절 세포(RGC), 광수용체 세포, 또는 색소 상피 세포인, 발현 방법.
  55. 제1항의 바이러스를 포함하는 세포.
  56. 제55항에 있어서, 포유동물 세포인 세포.
  57. 제55항에 있어서, 포유동물 신경 세포인 세포.
  58. 제55항에 있어서, 망막 신경절 세포(RGC), 광수용체 세포, 또는 색소 상피 세포인 세포.
  59. 유효량의 제1항의 바이러스를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료 방법.
  60. 제59항에 있어서, 질환은 신경퇴행성 질환인, 치료 방법.
  61. 제59항에 있어서, 질환은 녹내장, 연령-관련 황반 변성(AMD), 맥락막 혈관신생(CNV), 근시-관련 CNV, 당뇨병성 망막증, 황반 부종, 및 망막 정맥 폐쇄증, 또는 망막 색소증인, 치료 방법.
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