DD275259A1 - Verfahren zur konstruktion eines neuen expressionsvektors - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konstruktion eines neuen Expressionsvektors fuer Mikroorganismen. Anwendungsgebiete sind die chemische und pharmazeutische Industrie. Der Vektor ist dadurch gekennzeichnet dass das 3 Ende der hochexpremierbaren mikrobiellen Gensequenz mit dem Gen einer viralen Protease und nachfolgend mit einem Polylinker zur Fremdgenintegration verbunden wird. Erfindungsgemaess werden im Ergebnis der Expression von Fremdgenen mit dem neuen Vektor Verfahrensschritte bei der Produktgewinnung eingespart. Figuren

Description

Hierzu 1 Seite Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konstruktion eines neuen Expressionsvektors für Mikroorganismen. Anwendungsgebiete sind die chemische und pharmazeutische Industrie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Eine zentrale Aufgabe der modernen Biotechnologie besteht in einer effektiven Produktion biologischer und chemischer Substanzen. Dabei spielen genetisch manipulierte Zellen als Produzenten dieser Substanzen eine zentrale Rolle. Heute existieren bereits verschiedene Möglichkeiten mit Hilfe der genetischen Manipulation biologischer Zellen eine hohe Stoffproduktion fast jeden beliebigen Genproduktes zu erzielen. Dazu werden spezielle Expressionsvektoren in die Zellen eingeführt.

In Mikroorganismen gelingt eine hohe Expression zum Beispiel eukaryontischer Gene dadurch, daß spezielle Vektoren eingesetzt werden, die so konstruiert sind, daß das eukaryontische Geninein auf dem Plasmid vorhandenes bakterielles Gen (weiterhin als mikrobielle Gensequenz bezeichnet) integriert werden kann, das für sich alleine die Synthese eines geeigneten gut charakterisierten bakteriellen Proteins bewirkt. Das heißt, daß man Vektoren verwendet, bei denen eine unter der Kontrolle eines starken Promotors befindliche mikrobiello Gensequenz mit der zu expremierenden Fremdgensequenz fusioniert wird. Dadurch entstehen bei der Genexpression in der Zelle Fusionsproteine, die sowohl aus mikrobieller als auch fremdgenischer Sequenz bestehen. Das erste Beispiel eines solchen Vektors wurde 1977 zur Expression von Somatostatin vorgestellt (Science, 1977, v. 198, pp. 1056-1063).

Verschiedenste mikrobielle Gensequenzen werden für die Integration von Fremdgenen benutzt. Am häufigsten wird die ß-Galaktosidase eingesetzt, jedoch auch solche Proteine, wie z.B. die MS-2-Polymerase, Protein A, alkalische Phosphatase, Chloramphenikolacetyltransferase (CAT) und die Dihydropholatreduktase werden genutzt, um eine hohe Expression von Fromdgenen zu gewährleisten. Beispiele aus der Literatur weisen (1) sowohl auf die Vielfalt der heute existierenden Expresiionsvektoren hin als auch (2) darauf, daß die Verschiedenartigkeil der Aufgabenstellungen verschiedene Vektoren erfordert. Auf einige Arbeiten sei hier verwiesen:

1. Eine Gruppe von Vektoren ist dadurch charakterisiert, daß solche mikrobiellan Gensequenzen zur Integration von Fromdgenen genutzt worden, deren Produkt im Inneren der Zelle verbleibt. So wurde beispielsweise das Gen des ß-Endorphin an das Gen der ß-Galaktosidaso fusioniert. Zwischen beiden Fusionstoilo wurde eine Sequenz für die proteolytische Spaltung mit Hilfe von Trypsin eingebaut. Dioses fusionierte Gen wurde hochexpremiert und fiel in der Zelle unlöslich aus. Die Zellen wurden mit Ultraschall bearbeitet und zerstört. Das Zollysat wurde so zentrifugiert, daß im Pellet das Fusionsprotein, da unlöslich, gemeinsam mit den Zellbruchstücken enthalten war. Dieses Pellet wurde unter drastischen denaturierenden Bedingungen (6M Guanidinehydrochlorid) gelöst, modifiziert und bei basischem pH-Wert mit Trypsin gespalten. Daran schloß sich eine saure Hydrolyso an. Das so ontstandono Peptidgomisch wurde nun mit konventioneilen Methoden goreinigt (Nature, 1980, vol. 285, pp. 456-461). In oinor anderen Arbeit wurdo ebenfalls ein ß-Galaktosidasefusionsprotein erzeugt, η das eine spezifische Spaltsoquonz für das Enzym Collagenaso eingebaut war. Die Zellen wurden in einem sohr aufwendigen Verfahren lysiert, um das Fusionsprotoin dann mit Hilfo dor Affinitätschromatography zu roinigen. Danach wurde das Fusionsprotein mit Collagenase behandelt. Das erhaltene Peptidgomisch wurdo dann mit Hilfo der HPLC woiter gereinigt (Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 1984, vol. 81, pp. 4692-4696). Der Vektor pEX ist ebenfalls ein Vortretor der Voktoren, wo oino Fusion dos zu klonieronden Fremdgenes mit dom Gen der ß-Galaktosidaso erfolgt (EMBO-Journal, 1984, v. 3/6, pp. 1429-1434). Bei dem Vektor pEx-mer, erfolgt die Integration des Fromdgonos in das Gen dor MS-2 Polymorase (Gene, 1981, v. 15, Dp. 81-93). Weiterhin wird beschrieben, daß zur Integration von

Fremdgenen das Gen der CAT eingesetzt wird, wobei am 3'-Ende dos CAT-Genes (C-Terminus des Proteines) eine spezielle Spaltstelle eingebaut wurde, um später das Fremdgenprodukt abspalten zu können (EP WO 84/04756). 2. Eine zweite Gruppe von Vektoren beinhaltet die Fusion des Fremdgenes mit mikrobiellen Gensequenzen, deren Genprodukt aus der Zelle hinaustransponiert wird. Hierbei erscheint das Fusionsprotein dann im Medium. So wurde z. B. das Gen der alkalischen Phosphataso (EP O 023882 A2, EP 0196864), oder das Gen des ompF benutzt, um Fremdgene zu expremieren und ins Medium auszuscheiden (EMBO-Journal, 1985, vol. 4, pp. 3589-3594). Eine solche Expression hat den Vorteil, daß das Fremdgenprodukt nur von den Medienbestandteilen getrennt werden muß, aber (1) wird eine starke Konzentrierung des Produktes notwendig und (2) läßt sich nicht jedes Fremdgenprodukt auf diese Art aus der Zelle hinaustransportieren. Der Vorteil hochexpremierter nichtsekretierter Fusionsproteine besteht vor allem darin, daß sie in der Zelle unlöslich in Form von Einschlußkörpern ausfallen und somit sowob" veniger proteolytisch abgebaut werden als auch die Möglichkeit einer leichteren Fraktionierung des Fusionsproteines besteht. l> r große Nachteil solcher Fusionsproteine besteht darin, daß (1) diese Fusionsproteine nur unter sehr drastischen dena.urierenden Bedingungen in Lösung gehen, (2) dabei oftmals die biologische Aktivität des Fremdgenproduktes verlorengeht und (3) das Fremdgenprodukt kovalent mit einem mikrobiollen Protein verbunden ist und somit eine Prozedur notwendig wird beide Fusionsteile voneinander zu trennen. Die derzeit am meisten genutzte Methode besteht darin, daß in das Hybridoperon des Fusionsproteines Spaltstellen für die enzymatisch^ (mit Hilfe spezieller Proteasen, wie z. B. Trypsin oder Collagenase) oder chemische Spaltung (zum Beispiel mit Hilfe von BrCN oder Säure) eingebaut werden, so daß dann am gereinigten Fusionsprotein eine Spaltung ertolgt, und das Fremdgenprodukt ohne Fusionsanteil gereinigt werden kann.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist ein solcher Expressionsvektor, dessen Expression mit einem Fremdgen es ermöglicht, effektiver und unter Einsparung zusätzlicher Verfahrensschritte zur Schaffung von Fusionsproteinen, Peptide und Proteine herzustellen und zu gewinnen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht in der Konstruktion eines Vektors zur Expression von Fremdgenen, der eine hohe Expression des Fremdgenes ermöglicht, wobei das Fremdgenprodukt in der Zelle ohne zusätzliche Fusionsanteile vorliegt.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß in einen bereits existierenden Expressionsvektor ein neues Element eingebaut wird. Dieses neue Element ist das Gen einer viralen Protease. Das Gen der Protease wird mit dem 3'-Ende einer, unter der Kontrolle eines starken Promotors befindlichen, mikrobiellen Gensequenz verbunden. In einer Variante des neuen Expressionsvektors befindet sich am 3'-Ende des Proteasegenes ein Polylinker, so daß die Fremdgensequunz sehr leicht in diesen Vektor kloniert werden kann (Abb., A). In uiner zweiten Variante des neuen Vektors kann der Einbau dar Fremdgensequenz in einen Polylinker zwischen die mikrobielle Gensequenz und das Proteasegen erfolgen. In diesem Fall befindet sich vor dom Polylinker eine natürliche Spaltstelle derauf dem Vektor kodierten Protease (Abb., B).

Bei der Klonierung einer Fremdgensequenz in den neuen Vektor würde ein Gen entstehen, welches aus drei Teilsequenzen aufgebaut ist: einer mikrobiellen Gensequenz, dem Proteasegen und der Fremdgensequenz.

Der Einbau der Protease führt dazu, daß im Falle der Expression eines Fremdgenes in diesem Vektor in der Zelle kein Fusionsprotein entsteht, da sich die Protease autokatalytisch abspaltet. Im Ergebnis der katalytischen Aktivität der Protease entsteht das Fremdgenprodukt ohne zusätzliche Fusionsanteile, die die biologische Funktion des Fremdganproduktes behindern.

Durch die erfindungsgemäße Vektorkonstruktion werden einige Nachteile existierender Expressionsvektoren beseitigt. Es entstehen als Endprodukt keine Fusionsproteine mehr. Das Fremdgenprodukt muß nicht mehr unter drastischen denaturierenden Bedingungen gelöst v/erden. Die Abspaltung des Fremdgenproduktes von dem Produk; der mikrobiellen Gensequenz erfolgt bereits in der ZeIi \ so daß zusätzliche arbeitsaufwendige Verfahronsschritte für die "rennung der Spaltprodukte der Fusionsproteine eingespart werden.

Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß sowohl die biologische Aktivität erhalten bleibt als nuch einige Arbeitsschritte bei der Reinigung des Fromdgenproduktes weglallen.

Claims (4)

1. Verfahren zur Konstruktion eines neuen Expressionvektors, bestehend aus der Umkonstruktion eines bekannten Ausgangvektors für Mikroorganismen mit hoher Expressionsleistung, auf dem eine hochexpremierbare mikrobielle Gensequenz (hmg) (unter der Kontrolle eines starken Promotors) vorhanden sind, dadurch gekennzeichnet, daß sich im Ergebnis der Umkonstruktion (A) das 3'-Ende der hochexpremierbaren mikrobiellen Gensequenz mit dem Gen einer viralen Protease (vPr) und deren 3'-Ende mit einem Polylinker (P1) zur Fremdgenintegration verbindet oder sich im Ergebnis der Umkonstruktion (B) das 3'-ende der hochexpremierbaren mikrobiellen Gensequenz mit der Nukleotidsequenz einer Spaltstelle (Sp) für eine virale Protease, deren 3'-Ende mit einem Polylinker zur Fremdgonintegration und dessen 3'-Ende mit dem Gen dieser viralen Protease verbindet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen einer viralen Protease verwendet wird, die in der Lage ist, sich autokatalytisch von dem bei der Translation entstehenden Fusionsprotein abzuspalten.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Gen einer viralen Protease das Gen einer retroviralen Protease verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß als Gen einer viralen Protease das Gen der Protease des Bovinen-Leukämie-Virus verwendet wird,