KR100272419B1 - 인위적 단백질분해 절단 부위를 함유하는 재조합 비루스 - Google Patents
인위적 단백질분해 절단 부위를 함유하는 재조합 비루스 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 (1) 외인성 핵산 서열 및 모 비루스매 의해 생산된 전구체 단백질을 단백질 분해 처리하는(절단하는) 비루스 또는 세포의 단백질 분해 효소에 대한 인위적 단백질 분해 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제-적응 재조합 비루스, 특히 복제-적응 재조합 폴리오비루스 및 그의 이용에 관한 것이 다. 재조합 전구체는 일반 배열의 구성 단백질로 절단되어 외인성 폴리펩티드를 유리시킨다. 복제-적응 재조합 비루스는 세균, 비루스, 곰팡이 및 효소 감염, 기생충 질병, 암 및 알레르기에 대한 백신으로서 유용하다.
Description
[발명의 명칭]
인위적 단백질분해 절단 부위를 함유하는 재조합 비루스
[도면의 간단한 설명]
제1도는 본 발명의 재조합 폴리오비루스의 도식적 표현이며, 폴리오비루스 게놈의 말단에 외인성 핵산 서열을 삽입하고 외인성 폴리펩티드를 발현하는 폴리오비루스 게놈 (SEQ ID #24 및 25) 변형체가 도시된다. 또한 비루스 C 단백질 분해 효소의 단백질 분해 프로세싱 패턴이 도시되는데, 단백질 분해 효소는 천연 폴리오비루스 다단백질 (PO) 전구체 및 외인성 단백질 삽입물 둘다를 절단한다.
제2도는 본 발명의 재조합 폴리오비루스의 도식적 표현이며, 외인성 폴리펩티드의 발현을 초래하는 폴리오비루스 게놈내 및 말단에서의 외인성 핵산 서열의 삽입이 도시된다. 또한 이 영역의 구조적 유연성을 증진시키는, 삽입 서열에 인접한, 폴리-글리신 트랙이 도시된다.
제3도는 모 폴리오비루스 및 재조합 비루스의 표현형을 나타내는 플라크 분석의 결과 사진이다. 제시된 플라크 검정에서, HeLa세포를 모 폴리오비루스 (A)또는 로터비루스 VP 4 단백질 (B.C 및 D)로부터 유래된 항원 에피토프, 또는 성숙 콜레라 독소 서브유니트 B(CTB) (E)로부터의 전체 코딩 서열을 운반하는 재조합 폴리오비루스로써 감염시켰다.
제4도는 비브리오 콜레라 B 독소 서브유니트 또는 로터 비루스 VP4 서열을 운반하는 재조합 폴리오비루스의 발현 및 프로세싱을 나타내는 검정 결과를 제공한다.
제4(a)도는 모 폴리오비루스 (레인1)또는 실시예 2에 서술된 콜레라 독소 B-폴리오비루스 재조합 단백질로써 감염된 HeLa 세포로부터의 추출물을 사용하여 제조된 웨스턴 블롯의 사진이다. 결과는 B 서브유니트가 발현되고 (화살표로 표시된) 재조합 폴리오비루스의 배경내에서 적절히 처리됨을 보여준다.
제4(b)도는 모 폴리오비루스 (레인 1) 또는 콜레라 독소 B (CTB)-폴리오 재조합 비루스 (레인 5) (실시예 2 )로써 감염되고 폴리오비루스 구조 단백질을 인식하는 토끼 항체를 사용하여 프로브로 찾아진 동일한 HeLa 세포로부터의 추출물의 사진이다. 결과는 정상 보다 큰 Pl 폴리오단백질 전구체가 폴리오비루스 재조합체에서 만들어지나, 적절한 단백질 분해 처리는 폴리오비루스 단백질 생산물의 정상 보체 발생, 뿐만아니라 CTB 뉴클레오리드 서열로부터 발생된 외인성 CTB 단백질의 방출을 보증함을 보여준다. 레일 2-4는 로터비루스 VP4 단백질로부터 유래된 항원성 에피토프(길이 21 내지 104 아미노산)을 수반하는 재조합 폴리오비루스를 함유한다.
제5도는 재조합 비리온의 구조 및 조성을 분석하기 위해 수행된 SDS-PAGE 분석의 결과를 나타낸다. 두 비루스 (모 및 재조합)의 이동 패턴은 실질적으로 구별할 수 없으며, 이는 재조합 비루스의 비루스 입자가 정상 구조 및 단백질 조성을 가짐을 시사한다. 폴리오비루스 캡시드 단백질의 동일성도 나타낸다.
제6도는 대조표준 값과 모방 주입과 비교하여, 백신주사된 숙주에서 면역 반응을 유발하는 재조합 폴리오비루스의 능력을 측정하기 위해 수행된 웨스턴 블록 분석의 결과를 도시한다.
[배경]
최근에, 질병에 대항해 개체들을 면역시키기 위해 사용되는 많은 유형의 백신이 있다. 유용한 것들은 일반적으로 안전하고, 적어도 어느 정도 면역 반응 유도에 유효하지만 모두 한계를 갖는다. 게다가, 몇몇 질병에 있어서는 효과적인 백신이 없다. 최근-유용한 백신에 대한 대안물 및 현재 유용한 백신이 없는 질병을 방지하는 새로운 백신의 개발은 많은 질병에 의해 야기된 사망율 감소에 중요한 단계이다.
[발명의 요약]
본 발명은 차후에 비루스 및/또는 세포 효소에 의해 단백질 분헤 처리되는 재조합 다단백질 전구체의 성분으로서 발현되는 외인성 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 복제-적응 재조합 비루스에 관한 것이다. 결과로서, 코딩된 외인성 폴리펩티드가 유리된다. 복제-적응 비루스는 동물 (인간외의) 비루스(예컨데, 척추동물 또는 포유동물 비루스), 사람 비루스, 또는 식물 비루스일 수 있다. 부가적으로 복제-적응 재조합 비루스, 특히 폴리오비루스에 관한 것인데, 이때 재조합 게놈은 발현될 외인성 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들을 코딩하는 외인성 핵산 서열(또는 서열들) 및 상응하는 수의 인위적 단백질 분해 절단 부위를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하고 코딩된 폴리펩티드(들)을 발현하고 폴리펩티드 (들)이 도입된 포유동물내에서 상기 폴리펩티드(들)에 대해 특이적인 항체의 생성을 유발한다. 적절히 선택된 복제-적응 비루스는 척추동물, 특히 포유동물 및 더욱더 특히, 그들이 도입된 인간과 같은 개체에게 외인성 단백질을 전달하는데 유용하다. 식물 비루스의 경우에, 예컨대 복제-적응 식물 비루스는 코딩된 외인성 폴리펩티드가 발현되고 처리되는 방식으로 증자에 또는 성장 중의 다른 단계의 식물에 삽입할 수 있다.
상기 외인성 폴리펩티드는, 예컨데 곤충에 의한 공격 또는 질병에 대해 식물을 보호하기 위해 사용할 수 있다. 식물을 사용하여 구강 섭취에 의한 백신 절달을 할 수 있다.
본 발명의 복제-적응 재조합 비루스는 광범위하게 다양한 유형의 비루스, 예컨데 피코르나비루스 (예컨데 엔테로비루스, 폴리오비루스, 구제역 비루스 (FMDV), 라이노비루스, 에코비루스, A형 간염 비루스), 토가비루스 (예컨데, 신드비스 비루스 및 루벨라 비루스) 및 플라비비루스 (예컨데 황열 비루스)를 포함한다. 사용되는 비루스의 유형은 발현될 표적 외인성 항원 (들), 결과의 재조합 비루스가 투여되는 경로 및 원하는 면역 반응의 특성에 의해 부분적으로 결정된다.
특히, 본 발명은 모 폴리오비루스와 다른, 즉 그들이 병원성이 아니고 외인성 핵산 서열 및 하나 이상의 인위적 단백질분해 절단 부위를 갖는 그런 방식으로 변형되어, 비루스 감염 과정 중에 그들이 재조합 다단백질 전구체의 성분으로서 코딩된 외인성 생성물을 안정하게 발현하는 복제-적응 재조합 폴리오비루스에 관한 것이다. 이 전구처는 단백질 분해에 의해 절단되어 정상의 폴리오루스와 코딩된 외인성 단백질을 유리시킨다.
게다가, 복제-적응 재조합 비루스는 원하는 외래 핵산 서열의 삽입을 용이하게 하는 폴리링커 서열(EcoR1, Not1, BssH2, 및 Xho1)을 함유할 수 있다.
또한 이들은 폴리-글리신 트랙과 같은 폴리-아미노산 트랙을 포함할 수 있는데, 이는 일반적으로 이 영역의 구조적 유연성을 증진시키고 단백질 분해 과정의 효율을 잠정적으로 증가시키도록 삽입 서열에 인접한다.
본 발명은 또한 외인성 핵산 서열이 비루스 게놈내로 삽입된 재조합 비루스의 신규한 생성 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에서, 비루스 생활환의 기초 국면을 사용하고, 그결과 재조합 비루스는 그의 정상 단백질 성분을 생산하고 복제하고 외인성 핵산 서열(들) (외인성 단백질)에 의해 코딩된 아미노산 서열은 감염 세포에서 유의한 양으로 생산된다. 본 방법에서, 모비루스의 게놈이 비루스 또는 세포 효소에 의해 단백질 분해되게 처리되어 하나 이상의 성숙 단백질을 생산하는, 다단백질 전구체를 코딩하는 모비루스를 하기와 같이 변형시킨다 : 생산될 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 서열 및 모비루스에 의해 비루스 생활환 중에 생산된 전구체 다단백질을 단백질분해에 의해 처리하는(절단하는) 비루스 또는 세포 단백질분해효소에 의한 인위적 단백질 분해 절단 부위 또는 부위들을 코딩하는 핵산 서열 또는 서열들을 비루스 게놈내로 도입시켜 재조합 비루스를 생산한다. 이 서열은, 그의 존재가 비루스 복제에 필요한 비루스 서열을 분해하지 않는다면 비루스 게놈의 어느위치에라도 도입될 수 있다. 예컨데, 상기 두 서열은 다단백질이 처리되어 두개의 천연 단백질을 생산하는 임의 천연 부위 (즉, 천연 다단백질이 정상적으로 단백질 분해에 의해 절단되는 부위)에 삽입될 수 있다. 외인성 핵산 서열이 단백질을 코딩하는 비루스 서열의 말단에 삽입되는 경우에, 단지 하나의 단백질 분해 처리 서열이 필요하다. 생산될 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열이 비루스 게놈내로 도입된다면, 부가적인 단백질 분해 절단 부위-코딩 핵산 서열이 필요할 것이다. 예컨데, 두개 이상의 폴리펩티드-코딩 핵산 서열을 비루스 게놈 내에(내부에로) 도입 하고 코딩된 단백질이 둘이상의 분리된 단백질을 생산하도록 절단되는 것이 바람직하다면, 또한 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열의 충분한 수를 도입해야 한다. 예컨데, 각각 생산될 단백질을 코딩하는 두개의 외인성 핵산 서열을 비루스 게놈 내에 도입하고, 두개의 분리된 (개별) 단백질을 원한다면, 단백질 분해 절단 부위를 코딩하는 세개 또는 네개의 핵산 서열이 필요하다 (즉, 두개의 단백질이 핵산 서열을 간섭 (intervenning)하지 않고 비루스 게놈 내에 존재하는 두개의 핵산 서열에 의해 코딩된다면 세개가 필요하고, 두개의 핵산 서열이 간섭하는 핵산 서열에 의해 분리된다면 네개가 필요하고, 이의 코딩된 생성물은 제거하여 두개의 코딩된 단백질을 “분리” 시켜야 한다. 서열이 비루스 게놈 내에 (말단이 아닌) 삽입되는 경우에, 외인성 핵산 서열의 양말단을 유리시키기 위해 두개의 단백질분해 프로세싱 서열이 필요하며 ; 이들 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 모 비루스 게놈 내로 두개의 서열이 비루스 단백질을 코딩하는 비루스 서열의 5′ 말단의 두번째 코돈과 첫번째 또는 유일한 출발 코돈 사이에 도입되는데, 재조합 게놈내 순서는 다음과 같은 방식이다 : 모비루스의 5′ 비번역 영역-모비루스의 독특한 출발 코돈-발현될 생성물을 코딩하는 외인성 핵산 서열-인위적 단백질 분해 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열-모비루스의 두번째 코돈-모핵산 서열의 나머지 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 서열이 비루스 게놈네에 가입되는 또다른 실시양태에서, 결과의 재조합 비루스 게놈의 서열 순서는 다음과 같다 : 모비루스의 5′ 비번역 영역-모비루스의 독특한 출발 코돈-모비루스의 번역 영역의 초기 코돈(들)-인위적 단백질분해 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열-외인성 핵산서열-인위적 단백질 분해 서열을 코딩하는 핵산서열-모 비루스 게놈의 나머지. 코딩된 단백질분해 절단 부위는 동일하거나 상이 할 수 있다.
(외인성 핵산 서열 또는 서열들을 발현하는) 재조합 폴리오비루스를 생산하는 본 발명의 한 실시양태에서 발현될 단백질 (예컨데, 항원)을 코딩하는 핵산 서열 및 폴리오비루스 3C 단백질분해 효소에 대한 인위적 인식 서열 또는 서열들을 코딩하는 핵산 서열 (들)을 모폴리오비루스의 게놈내로 도입시킨다. 또다른 실시양태에서, 폴리오비루스 2A 단백질분해 효소에 대한 인위적 인식 서열(들)을 코딩하는 서열 또는 서열들을, 발현될 단백질 (들)을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열과 함께 비루스 게놈 내로 도입시킨다. DNA 비루스의 경우에, 게놈은 DNA 형태로 조작될 것이다. RNA 비루스의 경우에, 게놈은 cDNA 형태로 조작될 것이다. 이들 둘다 모비루스의 게놈으로 언급된다. 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 서열을 폴리오비루스 게놈의 말단내로 도입시키는 실시양태에서, 결과의 재조합 폴리오비루스 게놈 구조는 다음과 같다 : 모 폴리오비루스의 5′ 비번역 영역- 폴리오비루스 독특한 출발 코돈-외인성 핵산 서열-인위적 폴리오비루스 3C 또는 2A 단백질분해효소 인식 부위-폴리오비루스 게놈의 두번째 코돈-폴리오비루스 게놈의 나머지. 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 서열이 모 폴리오비루스 게놈 내의 부위 (즉, 내부 부위)에 가입되는 실시양태에서, 결과의 재조합 폴리오비루스 게놈은 하기와 같다 : 모 폴리오비루스의 5′ 비번역 엉역-폴리오비루스 독특한 출발 코돈-폴리오 단백질 코딩 영역 (들)-인위적 3C 단백질분해 효소 인식 부위 또는 2A 단백질 분해효소 인식 부위를 코딩하는 핵산서열-외인성 핵산 서열 (들)-인위적 3C 단백질 분해효소 인식 부위 또는 2A 단백질 분해효소 인식 부위를 코딩하는 핵산 서열-폴리오비루스의 나머지, 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드가 발현될 경우에 하나 이상의 외인성 핵산서열(즉, 각각의 발현될 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산서열)이, 상기 서술된 바의 적절한 수의 인위적 단백질분해 절단 부위와 함께 재조합 복제-적응 폴리오비루스에 포함 된다.
변형된 폴리오비루스의 게놈을 번역할때, 정상보다 큰 전구체가 만들어지나, 모 폴리오비루스에 존재하는 3C 및/또는 2A 단백질분해효소(들)에 의해 구성 폴리오비루스 단백질의 보통 배열로 적절하게 절단된다. 또한 3C 및/또는 2A 단백질 분해 효소(들)은 인위적 인식 (단백질 분해 전단) 부위를 정확하게 인식하고 절단하여, 외인성 핵산 서열에 의해 코딩된 외인성 폴리펩티드를 유리시킨다. 본원에 서술된 바대로, 본 발명의 재조합 폴리오비루스는 감지할만한 양의 코딩된 외인성 단백질 (들)을 발현한다. 모비루스는 계속 복제하고 천연 단백질도 또한 생산된다.
재조합 폴리오비루스로 예시된 바의, 본 발명의 복제-적응 재조합 비루스는 세균, 비루스, 곰팡이 (예컨대, 효모) 감염, 기생충 질병, 암 또는 알레르기에 대한 백신으로 사용될 수 있다. 또한 이들을 피임약(예컨데, 정자 항원) 운반에 사용할 수 있다. 본원에 서술된 바의 복제-적응 재조합 비루스이거나 이를 포함하는 백신 및 피임 조성물 또한 본 발명의 대상이다.
본 발명의 재조합 폴리오비루스 백신은 감염을 예방하기 위해 점성막 면역성의 유발이 필요할때 특히 유용하다. 예컨대, 점성막 면역성의 유효한 유발은 HIV, 로터비루스, RS 비루스(RSV), A형 간염 비루스, 폴리오비루스, 유두종 비루스, 홍역 비루스 및 인플루앤자 비루스에 의한 감염을 예방하거나 감소시키는데 특히 이로울 것이다. 또한 재조합 비루스는 장독성 이. 콜라이 (E. coli) 및 비브리오 콜레라 (Vibrio cho1erae)에 의해 야기된 것들과 같은 세균성 질병에 대한 면역성을 유발하는데 유용하다.
게다가, 재조합 폴리오비루스를 사용하여 모 폴리오비루스의 게놈내로 하나 이상의 외인성 핵산 서열 (즉, 각각이 상이한 항원을 코딩하는 둘이상의 핵산서열)을 도입함으로써 하나 이상의 생물체에 의한 감염을 예방할 수 있다.
대안적으로, 각각이 상이한 항원을 발현하는 둘이상의 재조합 폴리오비루스의 혼합물 또는 칵테일을 사용하여 하나이상의 생물체 또는 감염제에 대항해 개체를 면역화할 수 있다. 개선된 또는 신규한 백신을 발전시키기 위한 분자 생물학의 새로운 도구들을 사용하여, “출생시의 한번 투여로 다수의 질병을 예방하는” 것으로서 Task Force on Child Survival에 서술된 “이상 백신”의 유도가 희망적으로 실현될 수 있다.
또한 재조합 비루스를 사용하여 조직 배양물에서 외인성 폴리펩티드를 생산할 수 있으며, 이는 외인성 폴리펩티드가 생산되는 세포 및 비루스로부터 단리 또는 분리될 수 있다. 이를 사용하여 척추동물 세포, 사람세포를 포함하는 포유동물 세포, 및 식물 세포에서 외인성 폴리펩터드를 생산 할 수 있다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 비루스 생활환 중에 생산될 외인성 다단백질을 코딩하는 외인성 단백질 및 모비루스에 의해 생산된 전구체 다단백질을 절단하는 비루스 또는 세포의 단백질 분해 효소에 대한 인위적 단백질 분해 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 복제-적응 비루스에 관한 것이다. 이 두 유형의 서열은 그의 존재가 비루스 복제에 필요한 비루스 서열을 분해하지 않는한 모 비루스 게놈내 어느 위치에도 존재할 수 있다.
본 발명은 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 서열이 비루스 게놈의 말단에서 또는 비루스 게놈내의 부위에서 (즉, 내부 부위에서) 비루스 게놈내로 가입될 수 있고 비루스 생활환 중에 전구체 다단백질로서 생산될 수 있는데, 전구체 다단백질은 정상적으로 모비루스에 의해 생산된 전구체단백질 (즉, 외인성 핵산서열이 도입된 비루스)을 절단하는 비루스 또는 세포의 단백질 분해 효소에 의해 절단된다는 출원인의 증명에 근거한다. 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 서열이 비루스 게놈의 말단내로 가입되는 실시양태에서, 결과의 재조합 게놈내 순서는 다음과 같다. 모비루스의 5′ 비번역 영역-모비루스의 독특한 출발 코돈-외인성 핵산 서열 - 인위적 단백질 분해 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열-모비루스의 두번째 코돈-모핵산 서얼의 나머지. 비루스 게놈의 5′ 비번역 영역인 재조합 게놈의 부분은 그것이 모 비루스에서 발생하므로 5′ 비번역 영역의 전부 또는 부분일 수 있다. 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 서열이 비루스 게놈내에 가입되는 또다른 실시양태에서, 결과의 재조합 비루스 게놈의 서열 순서는 다음과 같다: 모 비루스의 5′ 비번역 영역- 모비루스의 유일한 출발 코돈(들)-모비루스의 번역 영역의 초기 코돈 (들)-인위적 단백질분해 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열 - 외인성 핵산 서열-인위적 단백질분해 서열을 코딩하는 핵산 서열-모 비루스 게놈의 나머지.
코딩된 외인성 폴리펩티드는 (외인성 폴리펩티드 인위적 단백질 분해 인식 부위 또는 부위들 및 비루스의 다단백질을 포함하는) 재조합 또는 융합 전구체 폴리펩티드의 성분으로서 정상 비루스 단백질 번역의 배경내에서 발현된다. 재조합 전구체 폴리펩티드는 모 비루스 전구체 다단백질을 처리하는 비루스 또는 세포의 단백질 분해 효소(들)에 의해 단백질 분해 처리되어 비루스 단백질로부터 자유로운 외인성 단백질을 유리시킨다.
외인성 서열을 포함하도록 변형된 비루스는 모비루스로서 언급되고, 이는 천연 비루스 (병원성 또는, 바람직하게 비병원성), 감쇄 비루스, 백신 균주 또는 재조합 비루스일 수 있다. 본원에 사용된 바의 용어 폴리펩티드란 단백질 또는 그의 일부 (펩티드), 둘이상의 단백질 또는 펩티드의 융합물 및 단백질 및 펩티드의 융합물을 포함한다.
구체적 실시양태로, 출원인은 폴리오비루스 게놈내 부위 또는 폴리오비루스 게놈의 말단내로 가입되는, 발현된 외인성 단백질을 코딩하는 외인성 핵산 서열 및 폴리오비루스 3C 단백질 분해 효소 및/또는 2A 단백질 분해 효소에 대한 인위적 단백질 분해 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제-적응 재조합 폴리오비루스를 생산했다. 이들은 외인성 단백질이 발현되고 단백질 분해 프로세싱에 의해 폴리오비루스 단백질로부터 유리됨을 입증했다. 결과의 복제-적응 재조합 폴리오비루스는 그들이 외인성 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들 및 하나 이상의 인위적 단백질 분해 부위를 코딩하는 외인성 핵산 서열 (들)을 포함하고 비루스 감염 중에 외인성 생산물을 발현한다는 점에서 모 비루스와 다르다. 모 폴리오비루스는 천연 또는 야생형 폴리오비루스, 감쇠된 폴리오비루스, 백신 균주 또는 재조합 또는 유전학적으로 조작된 폴리오비루스 (이 경우에 변화 또는 변이된 서열은 본 발명의 폴리오비루스에 대해 본 원에 서술된 목적에 유용한 외인성 단백질을 코딩하지 않음)일 수 있다.
본 발명의 실시 양태에서, 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산서열 및 인위적 단백질 분해 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열은 폴리오비루스 게놈의 독특한 출발 코돈과 두번째 코돈 사이에, 폴리오비루스 게놈의 말단에 위치되는데, 재조합 게놈내 서열의 순서는 하기와 같다 :
폴리오비루스 게놈의 5′ 비번역 영역-폴리오비루스 독특한 출발 (첫번째) 코돈-외인성 핵산서열-인위적 단백질 분해 효소 인식 부위-폴리오비루스 게놈의 두번째 코돈-폴리오비루스 게놈의 나머지 결과로서, 재조합 폴리오비루스 게놈의 발현은 외인성 단백질, 인위적 단백질 분해 효소 절단 부위 및 폴리오비루스 다단백질을 포함하는 재조합 또는 융합 다단백질 전구체를 생산한다. 출원인은 단백질 분해 효소에 의한, 인위적 절단 부위가 포함된 재조합 다단백질 전구체의 단백질 분해 프로세싱이 정상 폴리오비루스 단백질 성분의 생산 및 외인성 단백질의 유리를 초래함을 보였다. 또한 비루스 복제가 일어났으나 외인성 단백질은 폴리오비루스 비리온에 포함되지 않는다.
외인성 핵산 및 인위적 단백질분해 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열을 폴리오비루스 게놈의 말단에 가입시킨 본 발명의 두 가지 재조합폴리오 비루스가 제 1 및 2 도에 표현된다 (pMOV 1. 3) 재조합 폴리오비루스 게놈은 폴리오비루스의 마오네이 유형 1 균주의 아미노 말단에 존재하는 5개 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산서열 (독특한 출발 코돈의 바로 3′ )을 포함한다. 이들 서열의 존재는 필수적이지는 않으나, 그의 존재는 발현 효율에 영향을 미칠 수 있다. 제2도에 나타낸 바대로 재조합 폴리오비루스 게놈을 또한 삽입된 (외인성)서열에 인접한 폴리글리신 트랙을 포함 할 수 있다.
발현될 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 서열을 비루스 게놈, 예컨데 폴리오비루스 게놈내에 도입할 수 있다. 제2도에 도시된 바대로, 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산서열 및 인위적 단백질 분해 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열이 위치조정되어 코딩된 생산물을 발현하는 복제-적응 재조합 폴리오비루스를 생산할 수 있는 폴리오비루스 게놈내에 다수의 첨가 위치가 있다. 폴리오비루스의 게놈내의 상기 부위들은 Vp1 코딩 영역과 2A 코딩 영역 사이의 접합점, 2A 코딩 영역과 2B 코딩 영역 사이의 접합점 및 2C 코딩 영역과 3A 코딩 영역 사이의 접합점을 포함한다. 폴리링커/단백질분해 프로세싱 모티브는 이들 부위에 삽입되었고 결과의 재조합 비루스는 복제-적응성을 나타내었다. 본원에 서술된 방법 및 공지된 방법을 사용하여, 외인성 핵산서열 또는 서열들을 이들 부위에 삽입할 수 있다. Vpg 코딩 영역과 3C 코딩 영역의 접합점에로의 폴리링커/단백질분해 모티브의 삽입은 비루스 복제를 파기했다.
비루스 단백질의 내부내로 외인성 서열의 프로세싱을 용이하게 하기 위하여, 삽입물의 양 말단에 적절한 단백질 분해 프로세싱 신호를 포함하는 것이 필수적이다. 따라서, 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 서열 및 인위적 단백질 분해 절단 부위를 코딩 하는 핵산 서열이 예컨데 Vp1 코딩 영역과 2A 코딩 영역 사이의 접합점에 삽입된 폴리오비루스 게놈내 서열 순서는 다음과 같다 : 폴리오비루스 게놈의 5′ 비번역 영역-폴리오비루스 독특한 출발 코돈 - Vp0 코딩 영역- Vp3 코딩 영역- Vp1 코딩 영역 - 인위적 3C 단백질 분해 효소 인식 부위 또는 2A 단백질 분해 효소 인식 부위를 코딩하는 핵산 서열 - 외인성 핵산 서열 - 인위적 3C 단백질 분해 효소 인식 부위 또는 2A 단백질 분해 효소 인식 부위를 코딩하는 핵산 서열-폴리오비루스 게놈의 나머지.
외인성 핵산 서열이 삽입되어 복제 - 적응 재조합 폴리오비루스 수단을 생산할 수 있는 폴리오비루스 게놈내에 다수 부위가 있다는 판단은, 광의의 의미로, 예컨대 백신으로서 유용한 재조합 비루스의 고안 및 생산 및 단백질 생산시에 가능한 상당한 유연성 및 변화가 있음을 의미한다.
발현될 및 단백질 분해 처리될 외인성 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산서열을 본원에 서술된 비루스 게놈내에 (말단에 또는 내부에) 하나 이상의 부위에 도입할 수 있다. 게다가, 삽입이 비루스의 복제 능력을 파기하지 않고 이루어질 수 있는 기타 부위들을 확인할 수 있다. 몇몇 외인성 핵산 서열은 더 우수하게 견디거나 더 효율적으로 발현되고/또는 비루스 게놈내 특정 부위에 가입된다면 단백질 분해 처리되는 것도 가능하다. 이것이 올바르거나 올바르지 않은지는 본 원에 서술된 방법 및 따라서 생산된 재조합 비루스, 예컨데 폴리오비루스를 사용하여 평가될 수 있다.
재조합 벡터내로 원하는 외래 서열의 삽입을 용이하게 하기 위해 폴리링커서열 (예컨데, EcoR1, Not1, BssH2, 및 Xho1)과 같은 부가적인 특징들이 복제-적응 재조합 비루스의 패턴내로 가입될 수 있다. 또한, 폴리-글리신 트랙과 같은 변이체도 영역의 구조적 유연성을 증진시키고 단백질 분해 프로세싱 효율을 잠정적으로 증가시키기 위해 삽입 서열에 인접하게 삽입할 수 있다.
생산될 외인성 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열이 재조합 복제-적응 비루스내에 포함될 수 있고, 결과로서 상응하는 수의 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하다. 둘 이상의 핵산 서열은 각각 상이한 생성물을 코딩할 수 있고, 또는 (예컨데, 단백질 또는 폴리펩티드의 증진된 생산을 원한다면) 동일한 생산물을 코딩할 수 있다. 더욱이, 폴리오비루스의 경우에 단백질 분해 절단 부위 (들)은 3C 절단 부위, 2A 절단 부위 또는 둘다일 수 있다.
본 발명이 재조합 폴리오비루스의 생산으로 예시되지만, 비루스 전구체 단백질의 단백질 분해 과정이 일어나는 임의 비루스를 변형하여 외인성 단백질을 발현하고 그것을 적절히 처리하는 재조합 비루스를 생산할 수 있다. 예컨데, 재조합 퍼코르나 비루스 (예컨대, 엔테로비루스, 폴리오비루스, FMDV, 리노 비루스, 에코비루스, A형 간염 비루스)및 재조합 플라비비루스 (예컨데, 황열 비루스)가 재조합 폴리오비루스에 대해 서술된 것과 유사한 방식으로 생산될 수 있고 사용될 수 있다.
외인성 단백질을 발현하고 단백질 분해 처리하는 복재-적응 재조합 비루스의 본 발명 생산 방법은 다음과 같다: 천연 생활환에 있는 비루스 (모 비루스로 언급된) 또는 세포의 단백질 분해 효소(들)에 의해 단백질 분해 처리되는 단백질 전구체를 생산하는 비루스를 공지된 유전자 조작 기술 (Sambrook. J. et al., Molecula Cloning: A Laboratory Manual (2d, ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)을 사용하여 변형시켜 적어도 다음 두 유형의 핵산 서열을 비루스 게놈내로 도입시킨다:
재조합 비루스에 의해 발현되고 처리될 외인성 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산서열 (그것이 도입되는 비루스의 유형 외의 원천으로부터 얻어진 핵산 서열) 및 발현된 재조합 단백질을 처리하여 비루스 및 외인성 단백질을 유리시킬 비루스 및/또는 세포의 단백질 분해 효소(들)에 대한 인위적 인식 부위를 코딩하는 핵산 서열. 폴리-글리신 트랙과 같은 추가 유형의 핵산서열도 영역의 구조적 융연성을 증진시키고 효율을 잠정적으로 증가시키기 위해 외인성 핵산 서열에 인접하게 삽입할 수 있다.
본 발명을 예시하는 폴리오비루스 벡터 cDNA 클론의 구성는 실시예 1에 서술된다. 각각 외인성 생산물(들)을 코딩하는 외인성 핵산 서열 또는 서열들, 하나 이상의 인위적 단백질분해 인식 부위 (들)및 임의로 부가적 핵산서열, 예컨데 폴리-글리신 트랙을 포함하는, 하나 이상의 “유니트들”을 상기 방식으로 도입할 수 있다. 예컨데, 면역 반응을 원하고 단백질 분해 처리를 위한 인위적 인식 부위가 비루스 게놈의 5′ 말단에 도입된 외인성 단백질 항원을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 하나의 “유니트”. 대안적으로, 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드 및 적절한 수의 단백질 분해 절단 부위 (예컨데, 둘이상의 상이한 단백질 항원 또는 한 단백질 항원의 두개의 복사물을 발현 및 유리시키는)를 코딩하는 핵산 서열들을 포함하는 둘이상의 “유니트들” 또는 하나의 “유니트”를 비루스 게놈내로 도입할 수 있다. 발현될 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 “유니트”내에 일렬로 (즉, 간섭하는 서열 없이) 또는 발현될 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하지 않는 핵산에 의해 분리되게 있을 수 있다.
하나 이상의 유니트를 비루스 게놈내 몇몇 또는 전부의 부위에 도입할 수 있다. 결과의 재조합 다단백질 전구체는 하나 이상의 외인성 단백질 또는 펩티드 및 하나 이상의 단백질 분해 절단 부위를 포함할 것이다. 재조합 다단백질 전구체의 프로세싱은 외인성 생산물 또는 생산물들을 유리시킨다.
본원에 서술된 재조합 폴리오비루스와 같은 재조합 비루스를 사용하여 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 유발할 수 있고 따라서 항원이 야기하는 외인성 병원균 (세균, 비루스, 곰팡이, 기생충)에 의한 감염 또는 공격에 대해 보호한다. 따라서 상기 병원균에 대해 보호하기 위한 백신으로서 유용하다. 실시예 2에 서술된 바대로, 로터비루스 Vp4 단백질로부터의 항원 에피도프를 코딩하는 핵산서열을 포함하는 재조합 폴리오비루스를 구성했다. 또한 실시예 7에 서술된 바대로, 콜레라 독소 서브유니트 B로 부터의 전체 코딩 영역을 포함하는 재조합 폴리오비루스를 구성했다. 또한 인플루엔자 A 비루스 항원 또는 비브리오 콜레라의 독소 보조 조절된 필루스 (tcpA)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리오비루스를 생성했다. 이들 재조합체 및 모 폴리오비루스의 표현형은 제3도에 도시된다.
콜레라 독소 서브유니트 B로부터의 전체 코딩 영역을 함유하는 재조합 폴리오비루스를 HeLa 세포에서 발현시켰고 그의 발현 및 프로세싱을 평가했다.
결과는 B 서브유니트가 발현되고 재조합 비루스의 전후 배경내에서 적절히 처리됨을 보였다 (제4(a)도). 또한 결과는 정상보다 큰 Pl 다단백질 이 재조합 폴리오비루스에서 만들어지나 적절한 단백질 분해 프로세싱이 일어나므로, 폴리오비루스 단백질 생성물의 정상 보체 및 자유로운 콜레라 독소 B 서브유니트 서열을 발생함을 보였다 (제4(b)도). 또한 HeLa 세포에서 로터비루스 Vp4 단백질로부터 유래된 항원 에피도프 (길이 21-104 아미노산)를 함유하는 재조합 폴리오비루스도 발현시켰다. 제4(b)도의 레인 2-4는 이들 에피도프를 수반하는 재조합 폴리오비루스를 함유한다.
실시예 3은 본원에 서술된 바대로 생성된 재조합 폴리오비루스의 면역 원성의 평가를 서술한다. 사람 폴리오비루스 수용체를 발현하는 유전자 변이 생쥐를 마호네이 또는 사빈 -기재 벡터의 배경내 전체 콜레라 독소 B 서브유니트 (CTB)로써 근육내 주사에 의해 감염시켰다. 대조표준 생쥐를 모방-감염시키거나 비브리오 콜렐라 필린을 발현하는 재조합 비루스로 감염시켰다. 웨스턴 블롯 분석은 마호네이-기재 CTB-복제 폴리오비루스로 면역화된 생쥐가 분명히 CTB 단량체 및 오량체와 반응성인 IgG 항체를 함유함을 보였다 (제6도). 예상한 바대로 대조표준 생쥐는 상기의 특이적 항체를 결여했다. 게다가, 사빈-기재 CTB-재조합 폴리오비루스로써 면역화된 생쥐는, 이 한 경우에, CTB-특이적 항원 반응성을 생성하지 않았다.
이 이유는 명확하지 않으나 재조합 폴리오비루스의 복제 특성에 관련될 것이고 재조합 비루스 백신의 투여량을 증가시킴으로써 해결가능할 것이다.
면역반응을 원하는 다른 항원을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 재조합 폴리오비루스는 콜레라 독소 서브유니트B 및 로터비루스 VP4 단백질에 대해 서술된 것과 유사한 방식으로 생산할 수 있다. 재조합 폴리오비루스가 감염 예방을 위한 점성 면역성의 유발을 필요로하는 질병 예방에 (또는 질병 발생의 심각성 감소에)특히 유용하다. 예컨대, 재조합 폴리오비루스는 HIV, 로터비루스, RSV, A형 간염 비루스 및 인플루엔자 비루스에 의한 감염을 막거나 심각성을 감소시키는데 특히 유용하다.
사람 몸의 점성 표면은 400m2이상을 덮고 면역 체계와 환경사이의 가장 큰 접촉면을 나타낸다. 점성 표면과 관련된 림프 세포의 총수는 모든 다른 림프 조직을 합한 것을 초과하고 이들 세포는 매일 생산된 전체 면역글로볼린 합성의 적어도 60%의 원인이다 (Childers, N. K et al., Annu. Rev. Microbiol. 43 : 503-536 (1989)). 국소 항원 노출 없이 눈물, 침, 및 모유와 같은 분비시에 특이적 IgA항체의 존재는 일반 점성 면역 체계의 개념을 생성했다. 거트-관련 임파성망피 조직(GALT)애서 합성된 면역 세포의 자손은 먼 점성 표면에로 이동하고 그를 보호한다고 생각된다. 점성 면역체개의 정도와 중요성에도 불구하고, 점성 표면에 대한 세포 및 체액 면역의 결정인자에 관해 비교적 거의 알려져 있지 않다. 이런 문제제기의 실험 평가는 상응하는 임파구에 대한 상대적 접근 불가능, 뿐만아니라 재현성 목적 부위에로 잘 특성화된 폴리오비루스 운반의 어려움때문에 제한되었다. 재조합 폴리오비루스는 재현 방식으로 잘 특성화된 항원을 운반할 수 있고 이들 시험 장벽중 몇몇은 개선할 수 있다. 유의하게 중요한 다수의 비루스 및 세균 질병은 현재의 백신주사로는 예방할 수 없다. 이들은 로터비루스에 의해 야기된 설사 질병, RSV 감염으로부터 초래된 호흡기 질병 및 V. 콜레라 또는 외독성 E. 콜라이에 의해 유발된 세균성 위장염을 포함한다. 점성 면역은 이들 병원균에 의한 하기 천연 감염을 발생하고, 이는 재감염에 대해 유의한 또는 완전한 내성을 부여한다. 본 발명의 재조합 폴리오비루스는 점성 면역 체계에 관련 보호 항원을 운반하여 새로운 백신 계획을 제공하는데 사용할 수 있다.
폴리오비루스 백신은 광범위하게 사용되어 왔고 매우 안전하고 효과적이다. 사용된 폴리오비루스의 생물학적으로 활성인 분자 클론은 폴리오비루스 유형 1 (마호네이 균주) (Racaniello, V. et al., Proc. Nat1. Acad Sci., U.S.A 폴리오비루스 유형 1, 2 및 3의 사빈 백신 균주 (0mata, T. et al., Gene 32 : 1-10 (1984); Toyoda, H. et al., J. Mol. Bio. 174 : 561-585 (1984))를 포함한다. 또한 폴리오비루스의 유도체를 만들수 있는데, 이는 덜 전염성 형태로 전화하는 경향이 있거나 뉴클레오티드 서열의 삽입, 결실, 및/또는 변형을 통한 부위 조작 돌연변이 유발을 통해 전염성 형태로부터 무독성 형태로 만들어질 수 있다.
재조합 폴리오비루스 백신은 현재 사용되는 구강 폴리오비루스 백신에 대한 유용한 대체물일 수 있는데, 현재의 폴리오비루스 백신은 세개의 상이한 감쇠 균주(PV1, PV2 및 PV3)의 혼합물을 필요로하고, 이들 각각은 다양한 수준의 면역 효험 및 야생형 병원균 형태로 재전화할 약간의 위험을 갖는다. PV1 은 가장 안전하고 가장 항원성이 성분으로 생각되는 한편, PV3 는 병원성 형으로 재전화하는 가장 높은 빈도로 곤란을 겪는다고 알려져 있다. 엔테로비루스 : 폴리오비루스, 콕사키비루스, 에코비루스, 및 뉴어 엔테로비루스 멀니크, J.L. In : Virology (2d ed. ), D. N. Fidlds, D. M. Knipe et al. (ed.) Raven Press Ltd, NY 1990, pp. 549-604; Nkowane, B. M. et al., Vaccine-Associated Paralytic Poliomyelitis United States : 1973-1984 JAMA, 257 : 1335-l340 (1987); Melnick, J.L. Population Genetics App1ied to Live Poliovirus Vaccine, Am. J. Pub. Health 52 : 472-483 (1962). PV2 및 PV3 성분이 삽입된 PV1 을 기재로한 재조합 폴리오비루스는 현재 유용한 것들보다 더 안전한 백신임이 입증된다. 게다가, PV1 을 기재로한 재조합 폴리오비루스에 있어, 최대로 감쇠된, 모든 세가지의 폴리오비루스 혈청형으로부터 항원 결정인자를 운반하는 항원으로서 효능있는 재조합 비루스의 관리에 의해 모든 폴리오비루스 균주에 대한 효과적인 면역을 이룰 수 있다.
백신으로서 재조합 폴리오비루스의 이용에 대한 특정 잇점은 그것이 유전학적으로 안정하고 재현가능하게 복제시에 세포로부터 세포에로 폴리오비루스 게놈을 전파시키므로 삽입된 정보를 운반한다는 것이다.
결과적으로, 면역화는 제한된 수의 재조합 폴리오비루스 투여로써도 유효 할 수 있다. 게다가, 도입된 항원이 감염 세포내에서 발현되므로, 세포-중개 및 호르몬 면역 모두를 자극할 수 있다. 외인성 핵산 서열이 재조합 폴리오비루스에 의해 운반되고 복제 주기 중에 발현되지만, 외인성 단백질은 성숙 단백질 입자에는 포함되지 않는다. 따라서, 비리온 구조 및 재조합 폴리오비루스의 숙주 범위는 외인성 단백질에 의해 변하지 않는다. 다수의 중요한 변수는, 특히 그것들을 개발도상국애서 사용할 때 유용한 백신의 효험을 제한한다. 이런 문제제기 중 몇몇은 실제적 또는 경제적 문제이고, 나머지는 생물학적 기초를 갖는다. 홍역 백신에 의한 면역화는 생물학적 장벽의 우수한 실례이며, 본 발명은 이를 극복하는데 유용하다. 홍역은 개발도상국에서 해마다 2 백만명 어린이의 사망 원인이다. Bloom. B.R., Nature, 342 : 115-120 (1989). 유효 백신은 홍역 비루스 감염을 예방하는 것이고, 엄격하게 백신을 중화하는 모계 유래된 항원의 존재는 어린 아이에게 효험을 갖는다. Murphy, B.R. and R. M. Chanock, In : Virology (2d ed.), B. N. Fields et al. (ed.), Raven Press, NY, pp. 467-502 (1990) : Preblud, S. R. and S. L. Katz, Vaccines, S. A. Plotkin and E. A. Mortimer, W. B. Sounders Publishing, Philade1phia(1988). 개발도상국에서, 홍역 감염의 피부학은 많은 어린이들이 효과적으로 백신주사되기 전에 질병과 접촉하는 그런것이다. 홍역 비루스로부터 유래된 항원을 운반하는 재조합 폴리오비루스는 상기 장벽을 극복하는데 도움을 줄수 있다. 폴리오비루스 백신은 출생 후에 빨리 주어야하고, 그의 효율은 모계 유래된 항체의 존재에 의해 유의하게 손상되지 않는다. 폴리오-홍역 재조합 비루스는 감염 세포내에서 홍역 항체를 발현하는 면역 반응을 발생할 것이다. 그러나, 홍역 항원은 재조합 비루스 입자내애 포함되지 않으므로, 백신 벡터의 복제는 이루어지지 않는다.
본 발명의 백신이 유용한 부가적 영역이 있다. 예컨대, 설사 질병은 매년 5-10백만의 사망을 야기한다고 추정된다. Institute of Medicine, New Vaccine Development : Establisling Priorities, National Academy Press, Washington, D.D. (1985). 로터비루스는 유아 및 어린이의 심각한 설사의 단일한 가장 중요한 원인제이고 매년 이 인구의 대략 백만명 사망을 야기한다고 생각된다. Kapikian. A. Z. 및 R.M. Chanock, In : Virology (3d, ed.), B.N. Field et al. (Ed.), Raven Press. NY, pp. 1353-1404 (1990). 로터비루스 감염에 대한 숙주 면역 반응의 정의에 있어 유의한 진전이 있었으나, 백신 효과는 비루스의 유전적 복잡성 및 사용가능한 감쇠 백신 균주의 제한된 효율에 의해 제한되었다.
유사하게, V. 콜레라의 항원이 보호 면역 반응의 유사한 표적임이 서술되었다. 그러나, 콜레라에 대한 후보 백신들은 원치않는 부작용 또는 부적절한 면역원성에 의해 제한되었다. 면역원이지만, 비병원성인, 로터비루스 및 V. 콜레라로부터의 보호 결정인자를 운반하는 재조합 폴리오비루스는 후보 백신으로서의 평가를 보증한다.
감염제에 의해 야기된 호흡기 질병은 1차 비루스 병원균을 나타내는 RSV 에 의해 연간 추정치 천만명의 사명을 초래한다. Mclntoch, K. 및 R.M. Chanock. In : Virology (2d. ed.), B.N. Field et al. (Ed.), Raven Press, N. Y., pp. 1045-1074 (1990). RSV 백신을 개발하고자 하는 노력은 최근까지 성공하지 못했으나, 보호 항윈의 확인에 대한 유의한 진전이 있었다. 유효한 RSV 백신에 있어, 그것은 점성 면역성을 유발해야만 하고, 출생 후에 즉시 접종되고. 여전히 모계-유리 항원에 대한 중화 효과를 피해야 한다. 재조합 RSV-폴리오비루스는 모든 상기 기준을 잠정적으로 충족시킬 수 있다.
B형 간염 비루스에 의해 야기된 질병 예방은 또한 본 발명에 따라 제조된 백신에 대한 목적이다.
B형 간염 비루스는 헤파드나비리드로 불리는 비루스의 과에 속한다. 이 비루스는 부분적으로 단일 가닥인 DNA 의 작은 환형 단편을 함유한다. 또한 감염성 비리온은 DNA 게놈을 완전히 이중-가닥으로 만드는 DNA 폴리머라제를 함유한다. B형 간염 비루스 (HBV)의 복제 주기는 RNA 중간체의 형성을 수반한다.
B 형 간염 비루스는 세계 곳곳에 분포되어 있다. 비루스의 표면 항원이 몇몇 사람외의 영장류 종들에서 발견되었지만 사람이 이비루스의 주요 저장소인 듯한다. 미합중국에서, 인구 1000,000명 당 22명의 간염 병증이 있다고 추정되며, 이 추정은 10-배 정도 적게 평가된 것이라고 생각 된다. 이들 경우에, 45% 는 B 형 간염 때문이다. 따라서, 미합중국에서는 만성 B형 간염에 걸린, 추정상 1-1.25 백만명이 있다.
B형 간염 비루스의 가장 효과적인 전달 경로는 비경구 도입이다. 비루스는 감염된 것의 다른 신체 분비물에서도 발견되었으나, 다른 방식의 비루스 전달 방식은 잘 성립되지 않았다.
또한 HBV 는 상기 비루스로 만성 감염된 것들에서 1차 간세포 악성 종양의 진전시에 내포된다. 이 질병은 아프리카, 중국, 동남 아시아, 알래스카 및 그린랜드 해변에 가장 퍼져있다. 간세포 악성 종양 빈도는 연속 HBV감염의 것과 동일한 일반적인 지리적 분포 패턴으로 분포된다.
보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)에 의해 야기된 질병 예방이 본 발명의 부가적 목적이다. 이 세균은 호흡관의 심각하고 잠재적인 치명적 전염 질병인 백일해의 원인제이다. 현재 사용되는 백일해 백신은 B. 퍼투시스의 화학적으로 불활성화된 전세포를 함유한다. 세포 백일해 백신이 개발되었으며, 이는 B. 퍼투시스 배양물의 화학적 및 물리적 분별에 의해 얻어진 물질에 근거한다.
게다가, 개별의 특이적 백일해 항원을 정제하여 제조되고, 이어서 이를 배합하여 백신을 형성한 백신이 서술되었다 (공개 유럽 특허 출원 484,621). 상기 백신에 포함된 항원들 중 하나는 69 킬로달톤 (69kD) 외부막 단백질이다 (Shahin, R. D. et al., Abstracts of the 89th Annual Meeting of the American Society for Microbiology, page51 (1989)).
이 항원은 본 발명에 따라 생산할 수 있다.
포진 비루스(헤르패토비리드)애 의헤 야기된 질병의 예방 및 치료도 본 발명의 또다른 목적이다. 포진 비루스는 숙주의 수명동안 지속되는 잠재 감염을 일으키는 큰 DNA 비루스이다. 잠복 기간 후에, 이 비루스는 면역억제 또는 조사와 같은 자극에 의해 재활성화될 수 있다.
단순 포진 비루스 유형 1은 “발진”과 같은 구강 병변의 원인균이다. 단순 포진 비루스 유형 2는 경부의 악성종양에 관련된 생식기 포진에 대한 원인제이다. 이런 포진 비루스는 사람들에게 널리 퍼져있고, 현재에, 이들 비루스에 대한 백신이 등록되어 있지 않다.
포진 비루스에 대항해 개발 중인 백신은, 비루스를 세포내로 들여보내기 위해 필수적인 비루스 단백질인 당단백질을 사용하다. 단순 포진 유현 1 및 2의 당단백질 명칭 gD 가 특히 관심있다. gD-1 및 gD-2 를 코딩하는 유전자의 DNA 서열을 미합중국 특허 번호 4,818,694 및 4,891,315에 나열되어 있다. 이 당단백질들은 본 발명에 따라 생산할 수 있다.
또한 단순 포진 유령 1 및 2의 당단백질 명칭 gB 도 관심있다. gB-1 및 gB-2 를 코딩하는 유전자의 DNA 서열은 Stuve, L. L. et al., J. Virology, 61 : 326-335 (1987) 및 Bzik. D. J. et al., Virology, 155 : 322-333 (1986)에 나열되어 있다. 이들 당단백질은 본 발명에 따라 생산할 수 있다.
로터비루스에 의해 야기된 질병도 본 발명의 부가적 목적이다.
로터비루스는 이제 WHO에 의해 유아 위장병의 주원인으로 안정되었고 적절한 벅신 생산에 의해 이 질병을 제어하는 것이 매우 우선적이다 (Bull. W. H. O. 61 : 251-254 (1983)).
로터비루스 게놈은 이중-가닥 DNA 의 11개 분절로 구성된다. 이들 유전자는 이 비루스의 적어도 6개 구조 단백질의 생산을 코딩하며, 이는 완전한 비루스 입자에서 이중-껍질 배열로 발생한다. 이들 단백질 중 세개는 외부 껍질 당단백질이다.
상기 백신의 개발에 추구된 방법은 로터비루스의 상기 외부 껍질 당단백질의 몇몇 재조합 DNA 기술에 의해 생산하는 것이다. 이들 당단백질 중의 하나는 VP7 로 명시된다. VP7 을 코딩하는 유전자의 DNA 서열은 Both. G. W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 80 : 3091-3095 (1983)에 나열되어 있다. 이 당단백질은 본 발명에 따라 생산할 수 있다.
발현시에, 항원에 의해 야기된 상태 또는 장애에 대해 또는 외인성 생물체에 대해 보호 면역성을 일으키는 외인성 생물체의 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 임의 DNA 서열을 본 발명의 목적을 위한 외인성 핵산으로 고려할 수 있다. 하나 이상의 외인성 폴리펩티드 (예컨데, 항원 또는 에피토프)를 코딩하는 핵산 서열도 본 발명의 백신에 포함될 수 있다.
외인성 핵산 서열에 의해 하나 이상의 외인성 항원 또는 에피토프가 코딩된다면, 그것들은 하나이상의 (상이한) 병원균으로부터의 항원 또는 에피토프 또는 단일 병원균의 항원 또는 에피토프일 수 있다. 바람직한 실시 양태로, 상기 생물체는 병원성 미생물이다. 예컨대, 상기 외인성 에피토프는 질병 또는 장애의 원인제인 세균, 기생충, 비루스 또는 곰팡이 상에 있다. 게다가, 알레르기원, 정제 및 암 세포의 에피토프를 사용할 수 있다. 상기 세균, 기생충, 비루스 또는 곰팡이는 하기 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
복제-적응 재조합 비루스는 광범위하게 다양한 병원균에 대한 백신으로서 유용하다. 예컨대, DNA 또는 RNA는 하기에 기재된 생물 중 임의 것으로부터 얻을 수 있고 이를 사용하여 재조합 비루스를 생산한다.
기생충 :
플라스모듐 종들 (Plasmodium spp.)
에이머리아 종들 (Eimeria spp.)
쉬스토소마 종들 (Schistosoma spp.)
트리파노소마 종들 (Trypanosoma spp.)
바베신 종들 (Babesin spp.)
레이시마니아 종들 (Leishmania spp.)
크립토스포리디아 종들 (Cryptosporidia spp.)
톡소플라스마 종들 (Toxoplsma spp.)
뉴모사이티스 종들 (Pneumocystis spp.)
세균 :
비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae)
스트렙토코커스 피오케네스 (Streptococcus pyogenes)
네이세리아 매니기티더스 (Neisseria menigitides)
네이세리아 고노르호세 (Neisseria gonorrhosae)
코리네박테리아 디프테리아 (Corynabacteria diphtheriae)
클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani)
브랜하멜라 카타르할리스 (Brodetella pertussis)
보르데텔라 카타르할리스 (Branhamella catarrhalis)
헤모필루스 종들 (Haemophilus spp. (예컨데, 인플루엔자 (influenzae)))
클라미디아 종들 (Chlamydia spp.)
장독성 에쉬리키아 콜라이 (Escherichia coli)
비루스 :
사람 면역 결핍 비루스, 유형 I
사람 면역 결핍 비루스, 유형 II
원숭이 면역결핍 비루스
사람 T 임파추향성 비루스, 유형 I 및 II
RS 비루스
A 형 간염 비루스
B 형 간염 비루스
C 형 간염 비루스
비-A형, 비-B형 간염 비루스
단순 포진 비루스, 유형 I
단순 포진 비루스, 유형 II
시토메갈로 비루스
인플루엔자 비루스
파라인플루엔자 비루스
폴리오비루스
로터비루스
코로나비루스
루벨라비루스
홍역 비루스
이하선염 비루스
수두
엡스테인 바르 비루스
아데노비루스
유두종 비루스
황열 비루스
광견병 비루스
곰팡이 :
칸디나 종들 (Candida (특히 알비칸스 (albicans))
크렙토코커스 종들 (Crytococcus)(특히 네오포만스 (neoformans)
블래스토마이세스 종들 (Blastomyces) (디마티티디스 (dermatitidis))
히스토플라스마 종들 (Histoplasma) (캡슐레튬 (capsulatum)))
코시디오드 종들 (Coccidioides) (특히 임미티스 (immitis)
파라코시터오이드 종들 (Paracoccidioides) (특히 브라실리엔시스 (brasiliensis))
아스퍼질러스 종들 (Asperqillus)
백신 배합물로 잠정적으로 유용한 항원은 병원균의 감염성의 중화시에 항원의 수반물 (Norrby, E., 1985, Summary, In : Vaccines 85, Larnet, R.A., R.M. Chanock, 및 F. Brown (eds)., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 388-389), 특이성 유형 또는 군, 환자의 항혈청 또는 면역 세포에 의한 인지, 및/또는 항원에 대해 특이적인 항혈청 또는 면역 세포의 보호 효과의 증명과 같은 다양한 기준에 의해 확인할 수 있다. 게다가, 코딩된 에피토프(들)은 바람직하게 동일 병원균의 상이한 단리물들 중에 또는 때맞춰 적은 또는 없는 정도의 항원 변이를 나타내야 한다.
항원 결정인자를 함유한다고 공지된 펩티드 또는 단백질을 재조합 비루스내로 가입시킬 수 있다. 특이적 항원이 공지되어 있지 않다면, 면역반응 서열의 확인 및 특성화를 수행해야 한다. 이를 수행하는 한가지 방법은 병원균의 표면 또는 다른 분자에 대해 발생된 모노클로날 항체의 사용을 통한 것이다. 항체에 의해 인지될 수 있는 펩티드 서열은 한정된 에피토프이다. 대안적으로, 캐리어 분자에 접합된 작은 합성 펩티드를 무상(intact) 분자상에서 펩티드에 상응하는 부위에 결합하는 모노 클로날 항체의 발생에 대해 시험할 수 있다 (참고, 예컨데, Wilson et al., Cell 37 : 767 (1984)). 또한 항원 결정인자의 확인 및 특성화를 위해 사용할 수 있는, 당업계에 공지된 다른 방법들도 본 발명의 범위내이다.
또한 본 발명의 백신 배합물내 외인성 단백질은 외인성 생물체의 에피포프일 수 있다. 외인성 폴리펩티드가 척추동물 숙주에서 발현될 때, 그것은 에피토프를 함유하는 항원에 의해 야기된 장애 또는 상태에 대해 보호하는 면역 반응을 일으킨다. 예컨데, 본 발명의 이 실시양태에서, 뱀 독액, 벌 독액, 호르몬, 정자(피임용), 알레르기-유발항원 또는 면역 반응을 원하는 임의 다른 항원을 코딩하는 외인성 단백질들을 사용할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 암-특이적 항원은 암에 대한 보호 면역 반응의 유발을 위한 재조합 외인성 비루스로서 발현될 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 비루스에 의해 발현될 외인성 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 당업계에 공지된 기술에 의해 분리할 수 있으며, 이 기술로 미생물의 RNA로부터 cDNA 합성에 의한, 재조합 DNA 법에 의한 (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1982, Lold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), 또는 화학적 합성에 의한, 미생물의 게놈 DNA로부터의 정제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
이들을 백신으로서 사용할때, 본 발명의 재조합 비루스를 공지 방법을 사용하여 개체에게 투여한다. 이들은 일반적으로 통상적인(현재-사용가능한) 백신이 투여되는/또는 관심있는 병원균에 의한 감염이 일어나는 경로를 모방하는 경로에 의해 투여될 것이다. 예컨데, 재조합 폴리오비루스 백신은 경구로 투여될 수 있고 재조합 홍역 또는 재조합 플라비비루스 백신과 같은 다른 것들은 피하내로 투여될 수 있다.
이들은 복제-적응 재조합 비루스에 더하여, 약리학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 백신 조성물로 투여될 수 있다. 또한 조성물은 면역자극체 또는 보조약, 풍미제, 또는 안정화제를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 비루스, 특히 재조합 폴리오비루스는 또한 포유동물, 특히 사람, 세포 또는 다른 세포 유형들(여컨데 폴리오비루스 수용체를 갖도록 변형된 포유동물 세포)과 같은 숙주 세포에서 외인성 다단백질을 생산하기 위한 시스템으로서 사용될 수 있다. 그다음 외인성 단백질을 그것이 생산된 세포로부터 공지 방법을 사용하여 단리 한다.
어떤 적용시에(즉, 면역화 또는 조직 배양물 생산) 비루스내로 도입된 외인성 핵산 서열은 그것이 유전자 조작 방법을 사용하여 생산되거나 화학적으로 합성된, 자연적으로 발생하는 원으로부터 얻어진 것일수 있다. 비루스내로 도입된 외인성 핵산 서열은 면역 반응을 원하는 전체 항원 또는 항원 에피토프 또는 일부를 코딩할 수 있다. 비루스 게놈내로 삽입될 수 있는 핵산 서열의 크기는 무제한적 인듯하다. 외인성 핵산 서열의 최대 크기는 본원에 서술된 바의, 비루스 복제에 대한 효과의 평가와 같이 측정할 수 있다. 적어도 150개의 추가 아미노산을 코딩하는 외인성 핵산 서열 (즉, 450 뉴클레오티드)을 비루스 복제 효율의 유의한 절충없이 폴리오비루스 게놈내로 삽입되었다. 삽입된 서열은 1차 서열 및 구조적 일치에 의해 정의된 항원 구조물인 숙주 면역 체계에 존재할 것이다.
또한 모비루스로서 식물 비루스도 사용할 수 있는데, 외인성 핵산 서열을 상기 서술된 바대로 도입한다. 예컨데, DNA 게놈을 갖는 식물 비루스 (예컨데, 콜리플라워 모자이크 비루스) 또는 RNA 게놈을 갖는 식물 비루스 (예컨데, 담배 모자이크 비루스, 턴입 황색 모자이크 비루스)를 사용할 수 있다. 이것들은 식물체내에서 발현될 외인성 폴리펩티드 (예턴데, 곤충 또는 질병에 대한 독소)를 코딩하는 외인성 핵산 서열 (또는 서열들)을 도입함으로써 변형될 수 있다. 그다음 결과의 복제-적응 재조합 식물 비루스를 식물에 (예컨데 종자에 또는 식물의 다른 성장 단계에) 적용하여, 여기서 외인성 폴리펩티드가 생산된다. 예컨데, 전갈 또는 거미 독소와 같은, 독소틀 코딩하는 외인성 핵산 서열은 식물체를 먹고사는 곤충을 막도록, 독소들이 식물내에서 발현되는 그런 방식으로 도입할 수 있다. 게다가, 외인성 핵산 서열이 발현된 식물을 코딩된 단백질 또는 폴리펩티드의 원천으로 구강 투여할 수 있다.
유사하게, 모비루스는 (예컨데 병원균에 대항해 동물을 보호하거나 면역화하거나 성장 증진 인자를 제공하기 위해) 동물내에서 발현될 외인성 핵산 서열을 포함하도록 개질된 동물 비루스 일 수 있다.
이제 본 발명은 하기 실시예에 의해 예시되며, 어떤 방식으로든 제한하지는 않는다.
[실시예]
[실시예 1]
[폴리오비루스 벡터 cDNA 클론의 구성]
분자 클론의 모든 조작은 표준 재조합 DNA 방법론에 따른다(Ausubel, F. M. et al. Current Protocols In Molecular biology, Greene Publishing-wiley Intergcience. New York. 1987) 사용된 생물학적 활성 분자 클론은 폴리오비루스 유형 1 (마호네이 균주) (Racaniello, V. et al., Proc. Natl. Acad Sci., U. S. A. 78:4887-4891(1981) 및 폴리오비루스 유형 1,2 및 3의 사빈 백신 균주(Omata, T. et al., Gene 32:1-10(1984); Toyoda, H. et al., J. Mol. Bio. 174 : 561-585(1984)를 포함한다. 이들 분자 클론은 전염성 폴리오비루스 RNA의 T7 RNA 폴리머라제에 의한 생체의 전사를 용이하게 하기위해 비루스 게놈의 5′ 말단에 T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 삽입함으로써 변형시켰다. Auaubel, F. M. et al., Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing-Wiley Interscience, N. Y. (1987) . 폴리오비루스는 다양한 제한 효소 인식 부위 (즉, EcoRI 및 Xhol)를 함유하는 인-프레임 합성 폴리링커를 함유하도록 부가적으로 변형되었다.
폴리오비루스 게놈 내에 삽입된 서열은 폴리오비루스 3C 단백질 분해효소 (AXXQG)에 대한 인식 및 절단 부위를 코딩하는 이들 서열을 3′ 경계에 포함한다 (Palmenberg, A.C., Ann. Rev. Micorbio. 44 : 603-623(1990)).
이들 변형은 중첩 확장으로 공지된 폴리머라제 연쇄 반응 (RCR)의 변형에 의해 수행했다. (Horton, R. M. et al., Biotechniques 8 : 528-535(1990)). 이는 유형 1 폴리오비루스의 실례를 사용하며 하기와 같이 예시된다.
간략히, 두개의 독립 적인 RCR 반응을 올리오뉴클레오티드 1 및 2, 및 3 및 4를 사용하여 (표 참조) 각각 위치 1 내지 740, 및 740 내지 1540으로 부터의 폴리오비루스 게놈의 부분을 증폭시키도록 수행했다.
[표 1]
삽입될 단편을 함유하는 PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하고, 올리고뉴클레오티드 1 및 4를 사용하여 두번째 PCR 증폭을 수행 했다. 이 증폭으로부터 귀결된 1582 염기쌍 (bp)DNA 단면은 42개 뉴클레오티드 삽입물(단백질분해 프로세싱 신호를 코딩하는 새로운 제한 효소 부위 및 서열을 운반) 및 서열 1 내지 740, 및 740 내지 1540을 나타낸다 (42개 뉴클레오티드 삽입물은 염기 740과 741 사이에 삽입되었다). 이 단편을 SaI 1 및 Aat 2로 소화시키고, 겔 전기영동에 의해 정제하고 SaI 1-Aat 2 소화된 폴리오비루스 클론 pSR-XpA(앞서 서술된 전체 길이 폴리오비루스 cDNA 클론을 함유하는 플라스미드)에 결찰시켰다 (Andino, R. et al., Cell 63 : 369-0(1990)). 결과의 플라스미드 (pMV 2.2로 언급)를 ClaI로써 소화얘 의해 선형화하고 T7폴리머라제에 의한 비루스 RNA의 생체의 합성을 통상의 프로토콜에 의해 수행했다 (Ausubel, F. M. et al., Current Protocols In Melecular Biology, Greene Publishing-Wiley Interscience, New York, 1987).
복제-적응 폴리오비루스를 서술된바대로 HeLa S3 세포내로 생체외 합성된 폴리오비루스 RNA의 트랜스펙션에 의해 회수할 수 있다 (Lutbman, H. et al., Nucl. Acids Res. 11 : 1295-1308(1983)). 회수된 비루스는 복재 용량, 구조 조성 및 뉴클레오티드 서열에 관한 기준 기술을 사용해 특성화 했다 (Ausubel, F. M, et al., Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing-Wiley Interscience, New York, 1987).
다양한 비루스 및 세균 병원균으로부터 유래된 외인성 유전자 서열이 이들 재조합 폴리오비루스에서 발현되었다. 사용된 일반 계획은 하기와 같이, 완전한 콜레라 독소 B 서브유니트의 실례로써 예시된다.
(폴리오비루스 벡터내로의 인-프레임 삽입을 허용하도록 선택된)하기 서열은 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 플라스미드 pJM17에 함유된 전체 콜레라 독소 B 서브유니트를 증폭시켰다 (Perarson, D. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A. 79 : 2978-2980 (1982)).
5′-TCA GGA ATT CAC ACC TCA AAA TAT T-3′ (SEQ ID #5)
5′-TCA GCT CGA GGG ATT TGC CAT ACT AAT-3′ (SEQ ID #6).
표에 프라이머 5 및 6이 제시된다.
결과의 312 bp DNA를 EcoRI 및 XhoI (PCR 프라이머에 의해 도입된 부위)로써 소화시키고 EcoRI 및 XhoI-절단에 pMV2.2에 결찰시켰다.
결과의 플라스미드를 pPCH-52로 명명하고 PCH-52로서 RNA 트랜스펙션에 따라 비루스를 얻었다. 유사한 방법을 사용하여 비브리오 콜레라(tcpA)의 독소-보조조절 필리아(Sun, D. et al., Infect. Immun, 59 : 114-118(1991)), 로터비루스 VP4 유전자 (Gorziglla. M. et al., Proc. Natl. Sci., U. S. A. 87 : 7155-7159(1990)) 및 인플루엔자 A 비루스 헤미클루티닌 유전자 (Wiley, D.C. et al., Ann. Rev. Biochem. 56 : 365-394(1987))의 플라스미드 클론으로부터 유래된 삽입서열에 대해 유사한 방법을 사용 했다. tcpA의 경우에, 삽입된 핵산 서열의 단백질의 아미노산 (157-199)의 카르복시 말단에 상응했다. 인플루엔자 A의 경우에, 삽입된 핵산 서열은 아미노산 134-284에 상응했다.
폴리오비루스 구성물 뿐만아니라 삽입된 서열의 적절한 발현 및 프로세싱을 증명하기 위한 재조합 폴리오비루스의 면역학적 특성화는 웨스턴 블롯 분석에 의해 수행했다 (Ausubel, F. M. et al., Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing-Wiley Intescience, New York, 1987). 천연 비리온 조성물 및 구조물의 보존은 감염 세포의 물질교대로- 표지된 (35S) 용해질의 통상적인 수크로즈 구배에 의해 확증되었다.
그다음 구배 분획은 표준 SDS-PAGE 분석에 의해 분석했다 (Ausubel, F.M. et al., Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing-wiley Interscience, New York. 1987).
[실시예 2]
[비브리오 콜레라 B 독소 서브유니트를 운반하는 재조합 폴리오비루스의 구성 및 평가]
콜레라 독소 서브유니트 B (103 아미노산) 또는 로터비루스 VP4캡시드 단백질의 몇몇 부분(깅이 21-104 아미노산)으로부터의 전체 코딩 영역을 함유하는 재조합 폴리오비루스를 구성했다. 서브유니트 B 또는 VP4 펩티드를 코딩하는 DNA 단편을 증폭시키고 클로닝을 위해 적절한 제한 부위를 함유함으로써 그의 말단을 변형시켰다. 독소 A 서브유니트로부터의 단리시에 발현된, 콜레라 B 서브유니트는 독성이 아니나 보호 면역 반응을 일으키는 항원 자극을 제공할 수 있다. DNA 단편을 폴리오비루스 벡터 cDNA 클론에 삽입시키고 RNA를 결과의 플라스미드로부터 전사시켰다.
콜레라 독소 서브유니트 B 및 로터비루스 VP4 cDNA 클론을 따로따로 HeLa 세포내로 트랜스펙션시켰다. 37℃에서 3일동안 인쿠베이션한 후에 재조합 폴리오비루스 플라크를 얻었다 (제2도). 제2도는 모 및 재조합 폴리오비루스 플라크의 형태를 나타낸다. 야생형 폴리오비루스(레인1) 또는 콜레라 독소 B-폴리오비루스 재조합 비루스(레인2)로써 감염된 HeLa 세포로부터 제조된 추출물을 SDS PAGE 겔 상에서 일렉트로포레이션시키고 웨스턴 불롯에 의해 분석했다(제3(a)도). 웨스턴 블롯을 무상 콜레라 독소(A 및 B 서브유니트)에 대한 특이적 토기 항혈청과 함께 전개시켰다. 볼수있는 바대로, B 서브유니트가 발현되고 (화살표로 표시된) 재조합 폴리오비루스의 배경내에서 적절히 진행된다.
모 폴리오빌스(제3(b)도, 레인 1), 또는 콜레라 독소 B-폴리오 재조합 비루스 (제3(b)도, 레인 5)로써 감염된 동일한 HeLa 세포로부터의 추출물을 폴리오비루스 구조 단백질을 인식하는 토끼 항체를 프로브로 하여 찾았다.
볼수 있는 바대로, 재조합체에 정상 Pl 다단백질 보다 큰 것이 외인성 폴리 펩티드의 존재 때문에 폴리오비루스 만들어진다. 적절한 단백질분해 프로세싱은 폴리오비루스 단백질 생산물의 정상 보체 생산, 뿐만아니라 외인성 콜레라 독소 서열의 방출을 계속한다. 재조합 비루스의 면역학적 특성화를 웨스턴 블롯 분석에 의해 수행한다.(Ausubel, F.M. et al., Current Proocols in Molecular Biology, Greene Publishing-Wi1ey Interscience, New Yerk, 1987) 천연 비리온 구조의 보존은 통상의 밀도 구배 원심분리 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 확증된다 (Ausubel, F.M. et al., Current Protcols in Molecular Biology, Greene Publishing-Wi1ey Interscience, New Yerk, 1987).
[실시예 3]
[재조합 폴리오비루스의 면역원성의 평가]
초기 면역원성 연구를 위한 시험 모델은 사람 폴리오비루스 수용체를 발현하는 변이 생쥐를 사용했다 (Dr. Vincent Racaniello가 공급함, Ren et al., Cell 63 : 353-362(1990)). 변이 생쥐를 마호네이 또는 사빈-기재 벡터의 배경 (각각 MoSB및 MsSB)내 전체 콜레라 독소 B 서브유니트 (CTB)를 발현하는 재조합 폴리오비루스 (2×108pfu/ml 덩어리 50㎖)로써 근육내 주사에 의해 감염시켰다. 대조표준 생쥐를 모방 감염시키거나 비브리오 콜레라 필린 (TcpA) (MoPi)를 발현하는 재조합 비루스로써 감염시켰다. 생쥐를 30일의 기간에 의해 따로따로 두번의 기회로 감염시켰다. 43일 후에, 백신주사된 생쥐에게 불완전 프로인트 보조약내 정제 CTB(Ca1biochem) 10㎎를 회음내에 주사했다. 5일 후에, 생쥐로부터 채혈하고 그의 혈청을 정제 CTB와 반응성인 IgG 항체의 존재여부를 시험했다. CTB와 반응성인 항체는 상기와 같이 웨스턴 블롯 분석에 의해 감지했다. CTB(5ng)를 10% 폴리아크릴아미드 겔의 단일한 넓은 레인내 SDS-PAGE 분리에 적용시키고 니트로셀룰로스에로 이동시켰다. 면역화된 동물로부터의 혈청 (1:100 희석)을 다수-슬롯 장치의 독립적인 레인들 상에 적재했다 (Mini-Protein II, multi-screen, Biorad). 결합된 항체는 표준 방법에 따라 과산화 효소와 접합된 친화 정제된 토끼 황-쥐 IgG를 사용하여 검출했다 (ECL, Amersham).
이 분석의 결과는 제6도에 제시된다. CTB-재조합비루스로써 면역화된 5마리 생쥐의 5마리로부터의 혈청, MoSB(레인 3-7)은 분명하게 CTB 단량체 및 오량체와 반응성인 IgG 항체를 함유한다. 모방-감염된 (레인 1 및 2) 또는 무관한 대조표준 (MoPi, 레인 12-14)로부터의 혈청은, 예상한 바대로 상기 특이적 항원을 결여한다. 게다가, 사빈-기지 재조합 CTB-발현 폴리오비루스로써 면역화된 생쥐는 CTB-특이적 항체 반응성을 나타내지 않는다 (MsSB, 레인 8-11). 상기 예비결과들을 통해 많은 결론이 제안된다. 먼저, 재조합 폴리오비루스를 사용한 면역화는 면역화된 동물내에서 적절한 항체 반응을 직접 발생하거나 특이적으로 개시할 수 있다. 정재 CTB로써 유사하게 면역화된 대조표준 생쥐의 혈청내 CTB-특이적 항체, 및 CTB-반응성 항체의 IgG 이소타입의 부재는 기억 반응이 백신 주사에 의해 유발됐음을 나타낸다. 이의 이유는 명확하지 않으나, 재조합 폴리오비루스의 상대적 복제 성질에 관련된 것일 것이고 재조합 비루스 백신의 투여량을 증가시킴으로써 해결할 수 있을 것이다. 야생형 및 재조합 사빈 폴리오비루스 모두는 야생형 마호네이 대응물보다 덜 잘 복제한다. 더욱이, 이 실험에 사용된 변이 생쥐는 폴리오비루스의 사빈 백신의 효율적 복제를 지원하지 않는다. 따라서 생체내 제한된 복제는 사비-기지 재조합체에 일한 효과적 면역화의 발생을 막았다.
[실시예 4]
[재조합 비루스의 안전성 평가]
재조합 폴리오비루스의 면역원성 연구와 함께, 예비 연구를 수행하여 비루스의 안전성을 평가했다. 이를 위해, 변이 생쥐에게 모 마호네이 (병원성) 또는 사빈 (감쇠된) 균주, 또는 CTB를 발현하는 그의 재조합체 유도체의 동일한 적정량(5×106pfu)를 뇌내로 접종했다. 마호네이 균주를 접종한 모든 생쥐가 마비되었지만. 재조합체로 주사된 생쥐는 어느것도 마비를 겪지 않았다. 이 결과를 폴리오비루스 게놈내 CTB 서열의 삽입이 결과의 재조합 비루스의 병원성을 증가시킨다기 보다는 오히려 감소시킴을 시사한다. 이 현상에 대한 보다 상세한 연구를 계속한다.
[실시예 5]
[부가적 복제 적응 폴리오비루스의 구성]
제2도에 도식적으로 표현된 재조합 폴리오비루스는 본원에 서술된 방법 및 물질(실시예 1 및 2 참조) 및 당업계-인지된 방법을 사용하여 유사한 방식으로 구성했다. 재조합 폴리오비루스 다단백질의 5′ 외의 부위에서 외인성 코딩 서열을 위한 위치를 찾기 위해, 폴리링커/단백질 분해 프로세싱 모티브를 비루스 게놈내 다수의 부가적 위치에 도입시켰다.
이들 부위는 Vp1 과 2A (pMoV 2. 1 과 pMoV 2. 2)사이의 접합점, 2A와 2B의 접합물 (pMoV 2. 5), 2C 와 3A의 접합물(pMoV 3. 1) 및 Vpg 와 3C의 접합물 (pMoU 3. 5)을 포함한다. 비루스 다단백질의 내부 안에 외인성 서열의 프로세싱을 용이하게 하기 위해, 적절한 단백질 분해 프로세싱 신호는 삽입물의 양 말단에 포함되었다. 상기 방식으로 도입했을때, 삽입을 위한 새로운 부위들 중 세개는 원하는 삽입물을 안정하게 운반하는 복제-적응 재조합 비루스를 생성했다. 제2도에 제시된 pMoV 2. 1, pMoV 2. 2, pMoV 2. 5 및 pMoU 3. 1로 명명된 모두 복재-적응성이고 사실상 거의 야행성 플라크 형태 및 복제 운동성을 나타낸다. 비루스 복제의 파기를 초래하는 유일한 재조합 변형은 Vpg 와 3C의 접합물에 삽입된 서열을 놓는다. 폴리오비루스 게놈내 적어도 네개의 가능한 위치에서 외인성 항원 서열을 삽입하는 능력은 재조합 폴리오비루스 백신의 유도시에 유연성을 준다.
제2도에 제시된 바대로, 3C 절단 부위를 포함하는 벡터 및 2A 절단 부위를 포함하는 벡터를 구성했다. 폴리오비루스 3C 단백질 분해 효소를 사용하여 당단백질 전구체로부터 외인성 서열을 방출하는 벡터는 Q-G 프로세싱 부위를 포함한다. 재조합 다단백질 전구체의 적절한 프로세싱을 수행하기 위해 폴리오비루스 2A 단백질 분해 효소에 의존하는 유사한 재조합 비루스는 Y-G 쌍 및 주위 아미노산에 의해 제공된 특징적 2A 프로세싱 부위를 포함한다. 제2도 내 비루스 pMoV 2. 1 및 pMoV 2. 2는 상기 서술된 바와 같은 2A-기재 벡터를 나타내고 거의 야생형 성장을 전개한다. 폴리오비루스 벡터(제2도)를, 재조합 벡터내로 원하는 외인성 핵산 서열의 삽입을 용이하게 하기 위해 제1도에 표현된 재조합 폴리오비루스내 존재하는 것보다 넓은 폴리-링커 서열(EcoRl, Not1, BssH2및 Xhol)을 함유하도록 구성했다. 게다가 또한 영역의 구조적 유연성을 증진시키고, 단백질 분해 프로세싱의 효율을 잠정적으로 증가시키기 위해 삽입된 서열에 인접한 폴리-글리신 트랙을 함유하는 변이체들이 성공적으로 유도되었다. 모두에게서, 이들 벡터는 기본 계획의 자유로움을 증진시키고 백신 벡터의 생성을 위한 다양한 대안 방법을 제공한다.
발현될 단백질 또는 다단백질을 각각 코딩하는 외인성 핵산 서열 또는 서열들, 및 단백질 분해 절단부위를 각각 코딩하는 핵산 서열 또는 서열들 (예컨데 3C 단백질 분해 부위 또는 2A 단백질 분해 부위를 본원에 서술된 방법 및 공지의 방법을 사용하여 상기 부위중 임의 것에 모 폴리오비루스 게놈내로 도입할 수 있다. 코딩된 단백질(들) 또는 폴리펩티드(들)을 생산하는 결과의 재조합 폴리오비루스의 능력을 상기 서술된 바와 같이 평가 할 수 있다. 재조합 폴리오비루스의 면역원성 및 그의 안전성도 또한 상기 서술된 바와 같이 평가할 수 있다 (실시예 3 및 4 참고).
[실시예 6]
[재조합 폴리오비루스의 구성 계획]
상기 실시예 1-5는 제한 효소 인식 부위를 함유하는 인-프레임 합성 폴리링커의 폴리오비루스 게놈내로의 삽입을 사용한다. 이 실시예 6는 외인성 제한 부위의 도입 또는 외인성 유전자에 대한 삽입 부위 주위에 인접 폴리오비루스 게놈의 변화가 필요치 않은 재조합 폴리오비루스의 구성 계획을 서술한다. 부가적으로 이 실시예 6는 다단백질 오픈 리딩 프레임과 함께 프레임내 외인성 핵산 서열의 삽입 계획을 서술한다. 하기 실시예 7-9는 외인성 폴리펩티드의 발현을 위한 벡터를 형성하기 위헤 상기 재조합 폴리오비루스내로 특이적 외인성 핵산 서열의 삽입을 서술한다.
실시예 6는 폴리오비루스의 유접적 조작을 허용하는 Racaniello 및 Baltimore의 시스템을 사용한다 (Racaniello, V. R. , and Baltimore, D. , Science. 214 : 916-919(1981)). 폴리오 게놈 RNA의 전체-길이 cDNA 복사물을 함유하는 플라스미드는 배양물내 적절한 숙주 세포내로 트랜스펙션 하여 감염 비루스를 생산함을 발견했다. 이 시스템을 사용하여 많은 양상의 폴리오비루스 복제, 유전적 안정성 및 백신 균주의 감쇠들을 조사했다.
특히, 사용된 폴리오비루스 벡터는 플라스미드 pLED 3. 2 로부터 유래된다. 플라스미드 pLED 3. 2는 사빈 유형 3 폴리오비루스 게놈의 전체- 길이 cDNA 복사물이 삽입된 플라스미드 pBR 322로 구성된다. 사빈 유형 3 비루스는 구강 폴리오 백신으로서 현재 사용되는 감쇠 백신이다. 폴리오비루스 cDNA 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제를 프로모터 뒤에 클로닝한다. 상기 프로모터의 존재는 T7 RNA 폴리머라제를 사용한 생체외 전사를 허용하여 전체-길이 RNA 전사체를 형성하고 이는 조직 배양 세포 내로 트랜스펙션하여 폴리오비루스를 생산한다. 플라스미드 pLED 3. 2 의 샘플을 1991년 8월 20일자로 미국 맬릴랜드주 20852 록크빌시 파크러언 드라이브 12301에 소재하는 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁하고 수탁 번호 ATCC 75062을 받았다.
폴리오비루스 다단백질 오픈 리딩 프레임과 함게 프레임내 외인성 핵산 서열의 삽입 계획은 중첩 확장 폴리머라제 연쇄 반응(RCR)외 사용을 수반하다 (Horton. R. M. , et al., Gene, 77 : 61-68 (1989)). 이 방법은 제한 부위를 도입할 필요없이 유전자 서열의 융합을 허용한다. 외인성 유전자를 인접 몰리오비루스 서열의 변화없이 다단백질 오픈 리딩 프레임과 프레임내 연결한다.
이 계획은 2회의 RCR을 수반한다. 처음은 클로닝될 유전자상에 중첩인접 서열을 도입하고, 두번째는 주형 DNA로서 두개의 PCR 단편을 사용하고 중첩 서열에 의해 중개된 정확한 융합을 초래한다.
폴리오비루스 다단백질 코딩 영역 (염기 743)의 출발시에 외인성 유전자를 융합하도록 중합 확장 PCR을 사용하여 발현 클론을 구성한다.
게다가, 폴리오 3C 단백질 분해 효소 인식 부위를 코딩하는 서열은 외인성 유전자에로 3′ 삽입된다. 하기에 나열된 실시예에 사용된 특이적 프라이머는 표 2에 서술된다.
[표 2]
1회 PCR 반응은 대략 2ng 주형 DNA, 100pmo1 각각의 프라이머, 각각의 dNTP 200μmo1, KCL 10mM, PH 8.3의 Tris-HC1 10mM, MgClz 3.75mM 및 Ampli Taq DNA 폴리머라제 5 유니트, Stoffel 단편 (Perking-Elmer/cetus, Norwalk, CT)를 함유한다. 반응은 40㎛ 경광유로 덮힌 100㎛ 부피로 시작한다.
30 주기동안 PCR 주기 조건을 다음과 같다 : 95℃ 2분, 얼음 2분, 이어서 95℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 2분. 결과의 PCR 단편은 Promega′s Magic PCR 키트 (Promega, Madison. WI)를 사용하거나 아가로스 겔 전기 영동(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning ; A Laboratory Manual (2nd Ed., Cold Spring Harbor Press, Leld Spring Harbor, NY (1989))에 의해 정제한다.
또한 염기 743에 인접한 pLED 3. 2의 영역을 또한 첫번째 PCR 반응에서 증폭시켜 융합체를 형성하는 두번째 주형 DNA를 제공한다. 부가적 중첩서열을 이들 단편상에 추가하지 않고 ; 이는 각각이 상이한 외인성 유전자를 함유하는 다수의 상이한 융합체의 구성을 위해 단편이 사용되도록 한다.
염기 743에로 영역 상류(5′)에 사용된 프라이머는 프라이머 C및 D이다.
(표 2참조). 엽기 743에 대해 영역 하류(3′)를 위해 사용된 프라이머는 프라이머 E 및 F이다 (표 2 참조). 이들 반응을 위한 주형은 Xbal로 선형화 된 pLED 3. 2이다. PCR반응은 상기 서술된 바대로 수행한다. 이들 반응은 각각 pLED 3. 2의 5′ 및 3′ 영역에 대한 472 염기 쌍 및 524 염기쌍의 단편을 생성한다. 결과의 PCR 단편을 0.8% 저융점 아가로스 (Sea Plaque, FMC (Rockland, ME)) 상에서 정제한 다음 후속 반응을 위해 주형으로 사용된다.
2회 PCR 반응은 바로 서술된 두개의 PCR 단편을 혼합하고 외부 프라이머의 존재하에 증폭을 수행하여 결과의 융합 생성물을 생성하는 것을 수반한다. 실시예 7-11에 서술될 구조물에서, 외인성 유전자를 따로따로 PCR 반응에서 5′ 또는 3′ 단편과 융합한다. 그다음 융합 생산물을 그 플라스미드에 존재하는 독특한 제한 부위를 사용하여 pLED 3.2 내로 클로닝한다.
2회 PCR 반응은 각각의 주형 1 ㎛, 각각의 프라이머 100 pmol, 각각의 dNTP 200 μmol, KCI 10mM, pH 8.3 의 Tris-HC1 10mM, MgCl23.75 mM 및 Amp1i Taq DNA 폴리머라제 제 5 유니트, Stoffel 단편 (Pertain-Elmer/Cetus, Norwalk CT)를 함유한다. 반응은 40㎛ 경광유로 덮힌 100㎛ 부피로 시작한다.
30 주기동안 2회 반응에 대한 PCR 주기 조건은 다음과 같다: 94℃ 5분, 72℃ 10분, 이어서 94℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 2분. 융합 단편은 0.8% 저융점 아가로스 상에서 단리하고, 적절한 제한 효소로 소화시키고 pLED 3.2 내로 서브클로닝 한다.
[실시예 7]
[B형 간염 표면 항원을 운반하는 재조합 폴리오비루스의 구성]
실시예 6에 서술된 바의 플라스미드 pLED 3. 2로부터 유래된 폴리오비 루스 백터를 B형 간염 비루스의 표면 (5) 항원을 코딩하는 5 유전자의 발현을 위한 비루스 벡터 구성에 사용한다. S항원이 B 형 비루스에 대해 보호성임을 알려져 있다. S항원은 길이가 226 아미노산인 단백질이다. 이 실시예에서, B형 감염 S 유전자는 사람 비루스의 아형 ayw 로부터, 특히 클로닝된 게놈 DNA 로부터 유래된다. 아형 ayw 로 부터의 B형 간염 S 유전자는 길이가 675 염기쌍이다(Galiber. F., et al., Nature, 281 : 646-650 (1979)).
S 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 1회에 프라이머 A 및 B (참고 표 2)를 사용하는 이는 중첩 pLED 3. 2 서열을 PCR 생성물내로 가입시킨다.
이들 두 프라이머내 밑줄친 서열은 pLED 3. 2 내 서열에 상응하고, 나머지 서열은 s 유전자에 상응한다. 프라이머 A 에서, S 유전자 서열은 B형 간염 게놈내 염기쌍 157의 s 항원에 대한 개시 코돈에 상응한다. 안티 센스 프라이머 B는 S 항원의 카르복시 말단과 폴리오 3C 단백질 분해 효소에 대한 인식부위를 코딩한다. 이들 프라이머는 717 염기쌍의 PCR 단편을 생성하는 주형으로서 클로닝된 B형 간염 움 와 함게 사용한다.
1회 PCR 주기 조건은 하기와 같이 실시예 6에 서술된 것들과 다르다;
10 주기 동안 94℃ 2분, 얼음 2분, 이어서 94℃ 1분, 26℃ 1분, 70℃ 2분, 20주기 동안 94℃ 1분, 45℃ 1분, 70℃ 2분.
두번째 PCR 반응은 상기 서술된 PCR 단편을 사용하여 pLED 3.2 인접 영역과 S 항원 사이의 융합을 일으킨다. 두개의 PCR 반응은 5′ LED 3.2 인접 영역 또는 3′ LED 3.2 인접 영역과 주형으로서 S 유전자 PCR 단편으로 수행된다. 5′ 융합을 위한 센스 프라이머는 프라이머 C 이며, 이는 pLED 3.2 인접 영역의 5′ 말단에서 개시한다. 안티센스 프라이머 B는 S 유전자의 3′ 말단에서 개시한다. 3′ 융합에 있어, 센스 프라이머는 S 유전자 센스 프라이머 (A)이고, 3′ SED 3.2 안티센스 프라이머 (F)을 사용한다.
결과의 PCR 단편은 5′ 및 3′ 융합에 있어 각각 1175 및 1222 염기 쌍이다. 그다음 융합 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제한다.
그다음 2회 PCR 반응으로부터 귀결된 융합 단편을 S 유전자를 함유하는 폴리오비루스 벡터의 최종 구성을 위해 제한 효소로써 소화시킨다.
5′ LEO 3.2-S 유전자 융합체를 Mlul 및 BstxI (S 유전자내 유일한 부위)로써 소화시킨다. 3′ LED 3.2-S 유전자 융합체를 AvrII 및 BstxI로써 소화시킨다. 플라스미드 pLED 3.2 를 염기쌍 278에서 MluI 로써 소화시키고 염기쌍 1249에서 AvrII로써 소화시켜 971개 염기 쌍 단편을 제거한다. 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제한 후에, 결과의 소화물을 혼합하고 표준 기술 (Sambrook, et al., supra)을 사용하여 함께 결찰시켜 pLED 3. 2/HBV를 형성한다. 이 전체 길이 폴리오-융합 구성물의 DNA 서열은 어플라이드 바이오시스텝 (Foster City, CA) 370A DNA 서열해독기를 사용하여 측정했다.
그다음, 전사 및 트랜스펙션 반응을 수행한다. T7 프로모터로부터 발생된 RNA 전사물을 베로 세포내로 트린스펙션시켜 전염성 폴리비루스를 생성한다. 이 실험에 있어, 대략 pLED 3.2/HBV 5㎛을 제조하고 PvuI로써 플라스미드를 소화시켜 RNA 전사물을 생성한다. PvuI 소화는 두개의 단편을 초래하는데, 더큰 단편은 T7 프로모터를 함유하고 전체-길이 폴리오 게놈은 S 유전자 융합체를 함유한다. 소화 반응물을 페놀 추출시키고 에탄올 침전 시킨다. 침전된 DNA 를 물 20㎛에 재현탁한다. 전체 길이 RNA 전사효소를 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 PvuI-소화된 DNA 로부터 생체외에서 합성한다 (Moss. E. G., et al, J. Virol., 63 : 1884-1890 (1989)).
전사 생성물은 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석한다.
보조유동물 베로 셀 단층 25㎠ 을 DEAE-트랜스펙션 프로토콜을 사용하여 전사물로써 트랜스펙션시킨다 (Van der Werf. S. , Proc. Natl Acad Sci., U. S. A., 83 : 2330-2334 (1986)) RNA 대략 25㎍을 DEAE-덱스트란 (0.5㎎/㎖)과 혼합한 다음 베로 셀 상에 놓는다. 실온에서 30분 인큐베이션한후에, 접종원을 제거하고 세포를 세척한다. 새로운 변형 이글스 락탈 항상성 배지를 첨가하고 세포를 33. 5℃ 에서 인큐베이션한다. 5일간 인큐베이션한 후에, 전체 세포병원성 작용 (단층내 세포의 용해)가 관찰되고, 재조합 폴리오 비루스를 배양 배지로부터 수확한다.
구성물 pLED 3.2/HBV로 부터 생성된 재조합 폴리오비루스를 함유하는 비루스 덩어리를 베로 세포 상에서 플라크 검정에 의해 적정한다. 게다가, 재조합 비루스로부터 RNA를 추출하고 GeneAmp 열안정성 rTth 역전사효소 RNA PCR 키트 (Perkin-Elmer/Ceus)를 사용하는 역전사 및 PCR에 의해 분석 한다. 결과는 S유전자가 배양물내 통로를 통하여 재조함 pLED 3.2/HBV 비루스내에서 안정하게 유지됨을 증명한다.
다양한 방법을 사용하여 폴리오비루스 벡터로부터 S 항원의 발현을 분석한다. 표준 절차인 이들 방법은 감염 세포의 면역-과산화 효소 염색, 비루스 및 외래 단백질의 면역침전, 웨스턴 블롯 및 도트 블롯을 포함한다 (Coligan, J.E., et al., eds., Current Protocols in Immunology., Joho Wiley and Sons (1992)).
면역과산화수소 염색 검정은 비루스-감염 베로 세포내 단백질의 감지를 위해 사용된다. 베로 세포를 비루스로 감염시키고 감염후 다양한 시간에 에탄올 또는 메탄올과 고정시킨다. 고정된 세포 단층을 폴리오비루스 단백질 또는 S 항원에 대한 항혈청과 함께 인큐베이션한다. 평판을 세척한 다음 호스 래디쉬 과산화효소 (HRP)에 접합된 제 2 항체 (예컨대 염소 항-토끼 IgG)와 함께 인큐베이션한다. 평판을 다시 세척한 다음 HRP기질, 3,3′-디아미노벤지딘 테트라히드로클로라이드 (Sigma, St. Louis, MO)를 첨가한다. 항원과 상호반응하는 단백질을 발현하는 세포는 염색된다.
베로 세포 단층을 재조합 비루스로 감염시킨다. 세포 용해질을 면역침강 또는 웨스턴 블롯에 의해 비루스 코딩된 단백질이 있는지 조사할 수 있다. 면역 침강에 있어, 모든 용해질을 외인성 단백질 또는 폴리오비루스에 대한 항혈청과 인큐베이션한다. 그다음 단백질 A 세파로스 ( Sigma, St, Louis, Mo)를 혼합물에 첨가하고 부가적으로 인큐베이션한다. 세파로스 비이드를 원심분리하고, 세척하고 SDS 해리 완충액으로 용출시킨다.
침전된 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석할 수 있다. 웨스턴 블로팅에 있어서는, 세포 용해질을 SDS-PAGE 에 의해 분리시키고, 니트로셀룰로스에로 이동시키고 관심있는 단백질에 대한 항혈청과 인큐베이션한다. 블롯을 세척하고 HRP에 접합된 제 2 항체 (예컨대 염소 항-토끼 IgG)화 인큐베이션한다. 블롯을 다시 세척한 다음 HRP 기질, 4-클로로-1-나프톨 ( BioRad, Richmond, CA)와 과산화수소를 첨가하여 상호-반응하는 단백질들을 확인한다.
이 실시예 7 및 이어지는 실시예에서, 변이 생쥐를 사용하여 상기 실시예 3에 서술된 방법을 사용하여 재조합 폴리오비루스 및 외인성 폴리펩티드의 면역원 성을 평가할 수 있다.
[실시예 8]
[B 형 간염 per-S 영역 유전자를 운반하는 재조합 폴리오비루스의 구성]
B 형 간염 비루스의 엔벨로프는 모두 B 형 간염 게놈의 S 유전자 영역내에 코딩된 세개의 단백질을 함유한다. 각각의 항원은 길이가 226 아미노산인 S 항원이다. 나머지 두개의 단백질은 각각 pre-S1 및 pre-S2 유전자에 의해 코딩된 중간 및 큰 단백질이다 (Tiollais, p., et al., Nature, 317 : 489-495 (1985)). 부가적으로 S 항원을 함유할 수 있는 백신내 pre-S1 및/또는 pre-S2 의 포함이 B 형 간염 백신의 효율을 증가시킬 수 있다고 생각된다.
pre-S1 또는 pre-S2 를 함유하는 폴리오비루스 벡터를 구성하기 위한 계획은 S 유전자에 대해 실시예 7에 서술된 바와 유사하다. 프라이머는 각각의 유전자를 증폭시키고 유전자의 각각의 말단에 폴리오비루스 인접 서열을 도입시키도록 고안한다. 프라이머는 표 2에 나열된다. PCR 반응 및 주기 조건은 하기 서술된 바와 같다.
B 형 간염 DNA 로 부터 pre-S1 영역의 증폭을 위해 프라이머 G 및 H 를 사용한다.
프라이머 G 는 pre-51 유전자의 5′' 말단에 폴리오비루스 서열 (표 2에 밑줄친 부분)을 도입하고 pre-S1 서열은 B 형 간염 게놈내 염기 2580 에서 시작한다. 안티센스 프라이머 H는 염기 3152-6으로부터의 게놈의 pre-S 영역 (pre-S1 및 pre-S2 에 대해 공통)에 위치하고 염기 1에 EcoRI 부위를 포함한다. 프라이머 G 및 H 로써 클로닝된 B 형 간염 DNA 의 PCR증폭은 338 염기쌍 단편을 초래한다. 이 단편을 두번째 PCR 반응에서 5′ LED3.2 단편 (실시예 6에 서술된 프라이머 C 및 D로 부터)와 함께 주형 DNA 로서 사용한다. 프라이머 C 및 H 에 의한 증폭은 770 염기쌍의 융합된 5′ LED3.2-pre-S1 단편을 초래한다.
pre-S1 유전자의 3′ 말단의 구성을 위해, PCR 단편 3′LED3.2/pre-S2 를 사용하는데 (다음 문단 참조), 이는 상기 영역이 두 pre-S 구성물과 동일하기 때문이다. 5′ LED3.2-pre-S1 단편을 MluI 및 EcoRI 으로 소화시킨다. 3′ LED3.2-pre-S2 단편을 EcoRI 및 AvrII로써 소화시킨다. 결과의 단편을 아가로스겔 전기영동에 의해 정제하고 MluII 및 AvrII로써 소화되어 있는 pLED3.2 내로 결찰시킨다. 결과의 구성물은 pLED3.2/pre-S1 으로 명명했다.
실시예 7의 절차에 따라, 전체 길이 폴리오-융합 구성물의 DNA 서열은 어플라이드바이오시스템 370A DHA 서열 분석기를 사용하여 결정한다.
그다음, 전사 및 트랜스펙션 반응을 수행한다. T7 프로모터로부터 발생된 RNA 전사물을 베로 세포내로 트랜스펙트시켜 전염성 폴리오비루스를 얻는다. 이 실험에 있어, RNA 전사물의 생산을 위해 대략 5㎛ pLED3.2/pre-S1 를 PvuI 로써 플라스미드의 소화에 의해 제조한다. PvuI 소화는 두개의 단편을 초래하는데, 큰 단편은 T7 프로모터를 함유하고 이어서 전체-길이 폴리오 게놈은 pre-S1 유전자 융합체을 함유한다. 소화 반응물을 페놀 추출시키고 에탄올 침전시킨다. 침전된 DNA를 물 20㎕로 재현탁한다. 전체-길이 RNA 전사물을 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 PvuI-소화된 DNA로부터 생체외 합성한다.
전사 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석한다.
보조유동물 베로 셀 단층 25 ㎠을 DEAE-트랜스펙션 프로토콜을 사용하여 전사물로써 트랜스펙션시킨다. RNA 대략 25㎍ 을 DEAE-덱스트란 (0.5 mg/ml)과 혼합한 다음 베로 셀 상에 놓는다. 실온에서 30분 인큐베이션한 후에, 접종원을 제거하고 세포를 세척한다. 새로운 변형 이글스 락탈 항상성 배지를 첨가하고 세포를 33.5℃ 에서 인큐베이션 한다. 전체 세포병원성 효과가 관찰될 때까지 인큐베이션하고 재조합 폴리오비루스를 배양 배지로부터 수확한다.
구성물 pLED3.2/pre-S1 으로부터 생성된 재조합 폴리오비루스를 함유하는 비루스 덩어리를 베로 세포 상에서 플라크 검정에 의해 적정한다. 게다가, 재조합 비루스로부터 RNA 를 추출하고 GeneAmp 열안정성 rTth 역 전사효소 RNA PCR 키트 ( Perkin - Elmer/Cetus)를 사용하는 역전사 및 PCR 에 의해 분석한다. 결과는 pre-S1 유전자가 배양물내 통로를 통하여 재조합 pLED3.2/pre-S1 비루스내에서 안정하게 유지됨을 증명한다.
다양한 방법을 사용하여 폴리오비루스 벡터로부터 pre-S1 항원의 발현을 분석한다.
이들 방법은 감염 세포의 면역-과산화 효소 염색, 비루스 및 외래 단백질의 면역침전, 웨스턴 블롯 및 도트 블롯을 포함한다.
pre-S2 에 대한 발현 클론은 센스 프라이머로서 프라이머 I 를 사용하고 안티센스프라이머로서 프라이머 B 를 사용한다 (표 2 참조). 이 프라이머는 전체 pre-S2 유전자의 증폭을 초래하고 양 5′ 및 3′ 말단에 LED3.2 서열을 도입시킨다. PCR 반응은 867 염기쌍 단편을 생성한다. 정제 후에, 이 단편을 5′ LED3.2 또는 3′ LED3.2 단편과 함께 2회 PCR 반응을 위한 주형으로 사용하여 5′ LED3.2/pre-S2 및 3′ LED3.2/pre-S2로 명명된 융합 단백질의 형성을 초래한다. 2회 PCR에 사용된 프라이머는 C 이고 5′ 융합에 대해서는 B, 그리고 3′ 융합에 대해서는 F를 사용한다. 5′ LED3.2/pre-S2 단편을 MluI 및 XbaI로써 소화시킨다. 3′ LED3.2/pre-S2 단편을 XbaI 및 AvrII 로써 소화시킨다. 결과의 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하고 M1uI 및 AvrII로써 소화되어 있는 pLED3.2내로 결찰한다. 결과의 구성물은 pLED3.2/pre-S2 로 명명한다.
실시예 7의 절차에 따라, 이 전체 길이 폴리오-융합 구성물의 DNA 서열은 어플라이드 바이오시스템 370A DNA 서열해독기를 사용하여 결정한다.
그다음, 전사 및 트랜스펙션 반응을 수행한다. T7 프로모터로부터 발생된 RNA 전사물을 베로 세포내로 트랜스펙트시켜 전염성 폴리오비루스를 얻는다. 이 실험에 있어, RNA 전사물의 생산을 위해 대략 5㎍ pLED3.2/pre-S2 를 PvuI 로써 플라스미드의 소화에 의해 제조한다. PvuI 소화는 두개의 단편을 초래하는데, 큰 단편은 T7 프로모터를 함유하고 이어서 전체-길이 폴리오 게놈은 pre-S2 유전자 융합체를 함유한다. 소화 반응물을 페놀 추출시키고 에탄을 침전시킨다. 침전된 DNA를 물 20 ㎕로 재현탁한다. 전체-길이 RNA 전사물을 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 PvuI-소화된 DNA 로부터 생체외 합성한다.
전사 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석한다.
보조유동물 베로 셀 단층 25 ㎠ 을 DEAE-트랜스펙션 프로토콜을 사용하여 전사물로써 트랜스펙션시킨다. RNA 대략 25 ㎍ 을 DEAE-덱스트란 (0.5 mg/ml)과 혼합한 다음 베로 셀 상에 놓는다. 실온에서 30분 인큐베이션한 후에, 접종원을 제거하고 세포를 세척한다. 새로운 변형 이글스 락탈 항상성 배지를 첨가하고 세포를 33.5℃ 에서 인큐베이션 한다. 전체 세포병원성 효과가 관찰될 때까지 인큐베이션하고 재조합 폴리오비루스를 배양 배지로부터 수확한다.
구성물 pLED3.2/pre-S2 으로부터 생성된 재조합 폴리오비루스를 함유하는 비루스 덩어리를 베로 세포 상에서 플라크 검정에 의해 적정한다. 게다가, 재조합 비루스로부터 RNA 를 추출하고 GeneAmP 열안정성 rTth 역 전사효소 RNA PCR 키트 ( Perkin -E1mer/Cetus)를 사용하는 역전사 및 PCR 에 의해 분석한다. 결과는 Pre-S2 유전자가 배양물내 통로를 통하여 재조합 pLED3.2/pre-S2 비루스내에서 안정하게 유지됨을 증명한다.
다양한 방법을 사용하여 폴리오비루스 벡터로부터 pre-S2 항원의 발현을 분석한다. 이들 방법은 감염 세포의 면역-과산화 효소 염색, 비루스 및 외래 단백질의 면역침전, 웨스턴 블롯 및 도트 블롯을 포함한다.
베로 세포 단층을 재조합 비루스로 감염시킨다. 세포 용해질을 면역침강 또는 웨스턴 블롯에 의해 비루스 코딩된 단백질이 있는지 조사할 수 있다. 면역 침강에 있어, 모든 용해질을 외인성 단백질 또는 폴리오비루스에 대한 항혈청과 인큐베이션한다. 그다음 단백질 A 세파로스 ( Sigma, St. Louis, Mo)를 혼합물에 첨가하고 부가적으로 인큐베이션한다. 세파로스 비이드를 원심분리하고, 세척하고 SDS 해리 완충액으로 용출시킨다.
침전된 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석할 수 있다. 웨스턴 블로팅에 있어서는, 세포 용해질을 SDS-PAGE 에 의해 분리시키고, 니트로셀룰로스에로 이동시키고 관심있는 단백질에 대한 항혈청과 인큐베이션한다. 불롯을 세척하고 HRP 에 접합된 제 2 항체 (예컨대 염소 항-토끼 IgG)와 인큐베이션한다. 블롯을 다시 세척한 다음 HRP 기질, 4-클로로-1-나프톨 ( BioRad, Richmond, CA)와 과산화수소를 첨가하여 상호-반응하는 단백질들을 확인한다.
[실시예 9]
[로터비루스 VP7 유전자를 운반하는 재조합 폴리오비루스의 구성]
발현 클론 명칭 pLED3.2/VP7 을 구성하는데, 이때 로터비루스 VP7 항원을 코딩하는 유전자를 폴리오비루스 게놈 내로 삽입한다. 클론은 길이가 대략 1 킬로베이스인 VP7에 대한 전체-길이 유전자를 함유한다. 이 클론은 중첩 확장 PCR 및 폴리오비루스 오픈 리딩 프레임 (743 염기)의 출발부에 삽입된 유전자를 사용하여 구성한다. 1회 PCR 에 사용된 프라이머는 P 및 Q 이다 (표 2). 주형 DNA는 전체-길이 로터비루스 VP7유전자를 함유하는 플라스미드 클론이다. 이 증폭으로부터의 PCR 생성물은 길이가 1012 염기쌍이다.
1회 반응에 대한 PCR 주기 조건은 하기와 같이 실시예 6에 서술된 표준 조건과 다르다:
10 주기 동안 94℃ 2분, 얼음 2분, 이어서 94℃ 1분, 26℃ 1분, 70℃ 2분, 20주기 동안 94℃ 1분, 45℃ 1분, 70℃ 2분.
2회 PCR 반응을 상기 서술된 바대로 수행한다. 1회 PCR 단편을 5′LED3.2 또는 3′ LED3.2 와 혼합하고 5′ 융합에 대해 프라이머 C 및 Q로 그리고 3′ 융합에 대해 P 및 F로 증폭시킨다. 결과의 융합 생성물을 5′ 융합에 대해서는 M1uI 및 Bg1III로 또는 3′ 융합에 대해서는 Bg1II 및 AvrII 로 소화시킨다. 그다음 이들 소화 생성물을 pLED3.2 내로 서브클로닝하여 pLED3.2/VP7을 형성한다.
이 전체 길이 폴리오-융합 구성물의 DNA 서열은 어플라이드 바이오시스템 (Foster City, CA)370A DNA 서열해독기를 사용하여 측정한다.
그다음, 전사 및 트랜스펙션 반응을 수행한다. T7 프로모터로부터 발생된 RNA 전사물을 베로 세포내로 트랜스펙션시켜 전염성 폴리비루스를 생성한다. 이 실험에 있어, 대략 pLED3.2/VP7 5㎍ 을 제조하고 PvuI 로써 플라스미드를 소화시켜 RNA 전사물을 생성한다. PvuI 소화는 두개의 단편을 초래하는데, 더큰 단편은 T7 프로모터를 함유하고 전체-길이 폴리오 게놈은 VP7 유전자 융합체를 함유한다. 소화 반응물을 페놀 추출시키고 에탄을 침전시킨다. 침전된 DNA 를 물 20 ㎕에 재현탁한다. 전체 길이 RNA 전사효소를 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 Pv7l-소화된 DNA 로부터 생체외 합성한다(Moss, E. G., et al., J.Virol., 63 : l884-l890 (1989)). 전사 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석한다.
보조유동물 베로 셀 단층 25 ㎠ 을 DEAE-트랜스펙션 프로토콜을 사용하여 전사물로써 트랜스펙션시킨다(Van der Werf, S., Proc. Nat1. Acad. Sci., U. S. A., 83 : 2330-2334(1986)). RNA 대략 25 ㎍ 을 DEAE-덱스트란 (0.5 mg/㎖)과 혼합한 다음 베로 셀 상에 놓는다. 실온에서 30분 인큐베이션한 후에, 접종원을 제거하고 세포를 세척한다. 새로운 변형 이글스 락탈 항상성 배지를 첨가하고 세포를 33.5℃ 에서 인큐베이션한다. 전체 세포병원성 효과가 관찰될 때까지 인큐베이션하고 재조합 폴리오비루스를 배양 배지로부터 수확한다.
구성물 pLED3.2/VP7 으로부터 생성된 재조합 폴리오비루스를 함유하는 비루스 덩어리를 베로 세포 상에서 플라크 검정에 의해 적정한다. 게다가, 재조합 비루스로부터 RNA를 추출하고 GeneAmp 열안정성 rTth 역 전사효소 RNA PCR 키트 (Perkin - Elmer/cetus)를 사용하는 역전사 및 PCR 에 의해 분석한다. 결과는 VP7 유전자가 배양물내 통로를 통하여 재조합 pLED3.2/VP7 비루스내에서 안정하게 유지됨을 증명한다.
다양한 방법을 사용하여 폴리오비루스 벡터로부터 S 항원의 발현을 분석한다. 표준 절차인 이들 방법은 감염 세포의 면역-과산화 효소 염색, 비루스 및 외래 단백질의 면역침강, 웨스턴 블롯 및 도트 블롯을 포함한다(Coligan, J, E., et al., eds., Current Protocols in Immunology., Joho Wiley and Sons (1992)).
면역과산화수소 염색 검정은 비루스-감염 베로 세포내 단백질의 감지를 위해 사용된다. 베로 세포를 비루스로 감염시키고 감염후 다양한 시간에 에탄올 또는 메탄올과 고정시킨다. 고정된 세포 단층을 폴리오비루스 단백질 또는 VP7 항원에 대한 항혈청과 함께 인큐베이션한다. 평판을 세척한 다음 호스 래디쉬 과산화효소 (HRP)에 접합된 제 2 항체 (예컨대 염소 항-토끼 IgG)와 함께 인큐베이션한다. 평판을 다시 세척한 다음 HRP 기질, 3,3′-디아미노벤지딘 테트라히드로클로라이드 (Sigma, St. Louis, MO)를 첨가한다. 항원과 상호반응하는 단백질을 발현하는 세포는 염색 된다.
베로 세포 단층을 재조합 비루스로 감염시킨다. 세포 용해질을 면역침강 또는 웨스턴 블롯에 의해 비루스 코딩된 단백질이 있는지 조사할 수 있다. 면역 침강에 있어, 모든 용해질을 외인성 단백질 또는 폴리오비루스에 대한 항혈청과 인큐베이션한다. 그다음 단백질 A 세파로스 ( Sigma, St. Louis, MO)를 혼합물에 첨가하고 부가적으로 인큐베이션한다. 세파로스 비이드를 원심분리하고, 세척하고 SDS 해리 완충액으로 용출시킨다. 침전된 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석할 수 있다. 웨스턴 블로팅에 있어서는, 세포 용해질을 SDS-PAGE 에 의해 분리시키고, 니트로셀룰로스에로 이동시키고 관심있는 단백질에 대한 항혈청과 인큐베이션한다. 블롯을 세척하고 HRP 에 접합된 제 2 항체 (예컨대 염소 항-토끼 IgG)와 인큐베이션한다. 블롯을 다시 세척한 다음 HRP 기질, 4-클로로-1-나프톨 ( BioRad, Richmond, CA)와 과산화수소를 첨가하여 상호-반응하는 단백질들을 확인한다.
[실시예 10]
[폴리오비루스 폴리링커 카세트 벡터의 구성]
또한 실시예 1-5에 서술된 것과 유사한 두개의 폴리오비루스 클로닝 벡터의 구성을 통해 외인성 유전자를 폴리오비루스 게놈내로 삽입할 수 있다. 즉 각각의 벡터는 폴리오비루스 게놈내 상이한 위치 각각에 독특한 제한 효소 클로닝 부위를 삽입한다. 이 폴리 링커 카세트 벡터 방법은 실시예 6의 방법보다 간단한 클로닝 절차를 제공하나, 후자는 원래 외인성 폴리펩티드에서는 없는 추가 아미노산의 추가를 제한한다.
첫번째 벡터 (벡터 1)은 염기 743 의 개시코돈 AUG 에 이어 바로 폴리오비루스 다단백질과 프레임내에 폴리링커 카세트를 함유한다. 그다음 하기 제한 부위를 도입한다 :
NotI, HPaI 및 pacI. 이들에 폴리오 3C 단백질 분해 효소 인식 부위를 코딩하는 서열이 바로 이어진다. 그다음 이 서열을 1-2개의 여분 염기의 추가 또는 결실에 의해 조정하여 이 영역을 관통하는 정확한 오픈 리딩 프레임을 유지한다.
중첩 확장 PCR 을 사용하여 벡터의 구성중에 제한 부위를 도입한다. 벡터 1을 구성하기 위하여, 프라이머 J 및 K (표 2)를 합성하여 염기 743 에 폴리링커 카세트를 도입한다. 1회 PCR 반응은 주형 DNA 로서 pLED3.2 를 사용하고, 5′ 영역에 대해 프라이머 K 및 F, 그리고 3′ 영역에 대해 프라이머 K 및 F를 사용한다. 증폭된 단편의 예상 크기는 5′ 및 3′ 영역에 대해 각각 512 및 551 염기쌍이다. PCR 반응으로부터 직접 이들 단편을 사용하여 프라이머 C 및 F 와의 2회 PCR 에 대한 주형으로 작용한다. 결과의 단편은 길이가 1016 염기쌍이고 단편의 중간에 폴리링커 서열 및 3C 단백질분해 효소 인식 부위를 함유한다. 단편을 정제하고, MluI 및 ,AvrII 로써 소화시키고 동일한 제한 효소로 소화되어 있는 pLED3.2 내로 서브클로닝한다.
폴리오비루스 다단백질의 단백질 분해 프로세싱은 비루스 복제 중에 다단계로 일어난다. 개시 단백질 분해 절단은 2A 단백질 분해 효소에 의해 일어나며, 단백질 명칭 Pl 및 P2-P3 의 형성을 초래한다. 이들 각각을 부가적으로 3C 단백질 분해 효소에 의해 절단시켜 개별 비루스 단백질을 생성한다. 다단백질의 단백질 분해 프로세싱 중에, 부분적 단백질분해 절단 단백질이 최종 절단 생성물과 다른 기능을 가짐을 알 수 있었다. (Harris, K,S., et al., Semin. Virol., 1 : 323-333 (1990)). 기능 전구체를 코딩하는 영역에서 폴리 단백질내로 외인성 유전자와 삽입은 가시적인 비루스를 생성하지 않을 것이다. 두번째 카세트 벡터를 Pl 과 P2 사이의 접합부 (염기 3377)에 제한 부위를 도입하도록 고안한다.
도입된 제한 부위는 NotI, HpaI 및 PacI 이다. 이들 제한 부위에 대해 2A 단백질 분해효소 인식 부위 5′ 가 있고; 3C 단백질 분해 효소 인식 부위는 이들 부위에 대해 3′에 도입된다. 1회 PCR 반응은 주형 DNA 로서 pLED3.2, 5′ 영역에 대해 프라이머 L 및 M, 그리고 3′ 영역에 대해 프라이머 N 및 0를 사용한다.
증폭 단편에 대해 예상 크기는 5′ 및 3′ 에 대해 각각 563 및 592 bp 이다. 이들 단편을 PCR 반응으로부터 직접 사용하여 프라이머 L 및 0 와의 2회 PCR 을 위한 주형으로 사용한다. 결과의 단편은 길이가 1096 bp 이고 2A 단백질 분해 효소 인식부위, 폴리링커 서열 및 3C 단백질 분해 효소 인식 부위를 중간에 함유한다. 그다음 단편을 BstEII로 소화시키고 동일한 효소로써 소화된 pLED3.2 내로 서브 클로닝한다.
이 카세트 벡터를 외인성 유전자에 대한 발현 벡터로서 사용한다. 외인성 유전자를 존재하는 조화성 제한 부위를 사용하거나 PCR 에 의해 유전자의 말단에 상기 제한 부위들을 첨가하여 카세트 백터내로 클로닝한다. 후자의 경우에, 외인성 유전자를 유전자의 5′ 및 3′ 말단에 상응하는 프라이머를 사용하여 PCR 에 의해 증폭시킨다. 이들 프라이머를 합성할 때, 제한 부위를 센스 프라이머의 5′ 말단에 추가하고 두번째 제한 부위를 안티센스 프라이머의 5′ 말단에 추가한다. 표준 PCR 반응으로 유전자를 증폭시킨 후에, 결과의 PCR 단편은 두개의 제한 부위가 인접한 유전자를 가질 것이다. 벡터 및 PCR 단편 모두를 두개의 재한 효소로 소화시킨 다음 함께 결찰시켜, 관심있는 발현 클론을 초래한다.
프라이머는 관심있는 외인성 유전자의 임의 영역에 상응하여 부분적인 유전자가 벡터내로 가입될 수 있도록 고안할 수 있다. 더욱이, HpaI 로써 백터의 소화는 평활 말단 단편을 초래한다. 따라서 외인성 유전자의 임의 평활 단편을 백터내로 클로닝할 수 있다.
[실시예 11]
[B. 퍼튜시스 69 kD 외부 막 단백질 유전자를 운반하는 재조합 폴리오비루스의 구성]
실시예 10의 폴리오비루스 카세트 벡터를 사용하여 B. 퍼튜시스 의 69 kD 외부 막 단백질을 발현시켰다. 약 1.8 kb 의 유전자 영역내에서 성숙 단백질이 코딩되었다. 서열 특이 프라이머로써 PCR 에 의해 오픈 리딩 프레임의 이 영역 또는 보다 짧은 영역을 증폭할 수 있었다. 프라이머는 센스 프라이머의 5′ 말단에 있는 NotI 부위 및 안티센스 프라이머의 5′ 말단에 있는 PacI 부위를 함유하도록 고안되어 있다. 프라이머는 또한 오픈 리딩 프레임 및 폴리오비루스 3C 단백질 분해효소 인식 부위가 프레임내에 있도록 조정되어야만 한다. PCR 에 의해 증폭시킨 후에, 결과의 겔을 아가로스 겔 전기영동에 의해 또는 매직 PCR 키트 (Promega)로써 정제하고, NotI 및 PacI 로써 소화시키고, 동일 효소로써 제한된 벡터내로 결찰시킨다. 결과의 플라스미드를 pLED3.2/69kD로 명명했다. 이 전체 길이 폴리오-융합 구성물의 DNA 서열은 어플라이드 바이오시스템 (Foster City, CA)370A DNA 서열 해독기를 사용하여 측정한다.
그다음, 전사 및 트랜스펙션 반응을 수행한다. T7 프로모터로부터 발생된 RNA 전사물을 베로 세포내로 트랜스펙션시켜 전염성 폴리비루스를 생성한다. 이 실험에 있어 대략 pLED3.2/69 kD 5㎍ 을 제조하고 PvuI 로써 플라스미드를 소화시켜 RNA 전사물을 생성한다. PvuI 소화는 두개의 단편을 초래하는데, 더큰 단편은 T7 프로모터를 함유하고 전체-길이 폴리오 게놈은 69 kD 유전자 융합체를 함유한다. 소화 반응물을 페놀 추출시키고 에탄올 침전시킨다. 침전된 DNA 를 물 20 ㎕에 재현탁한다. 전체 길이 RNA 전사효소를 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 PvuI-소화된 DNA 로부터 생체외 합성한다(Mose, E,G., et al., J.Virol., 63 : 1884-1890 (1989)). 전사 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석한다.
보조유동물 베로 셀 단층 25 ㎠ 을 DEAE-트렌스펙션 프로토콜을 사용하여 전사물로써 트랜스펙션시킨다(Van der Werf, S., Proc. Nat1. Acad. Sci., U. S. A., 83 : 2330-2334 (1986)), RNA 대략 25 ㎍ 을 DEAE-덱스트란 (0.5 ㎎/㎖)과 혼합한 다음 베로 셀 상에 놓는다. 실온에서 30분 인큐베이션한 후에, 접종원을 제거하고 세포를 세척한다. 새로운 변형 이글스 락탈 항상성 배지를 첨가하고 세포를 33.5℃ 에서 인큐베이션한다. 전체 세포병훤성 효과가 관찰할 때까지 인큐베이션하고 재조합 폴리오비루스를 배양 배지로부터 수확한다.
구성물 pLED3.2/69 kD 으로부터 생성된 재조합 폴리오비루스를 함유하는 비루스 덩어리를 베로 세포 상에서 플라크 검정에 의해 적정한다. 게다가, 재조합 비루스로부터 RNA 를 추출하고 GeneAmp 열안정성 rTth 역 전사효소 RNA PCR 키트 ( Perkin -Elmer/cetus)를 사용하는 역전사 및 PCR 에 의해 분석한다. 결과는 VP7 유전자가 배양물 내 통로을 통하여 재조합 pLED3.2/69 kD 비루스내에서 안정하게 유지됨을 증명한다.
다양한 방법을 사응하여 폴리오비루스 백터로부터 69 kD 항원의 발현을 분석한다. 표준 절차인 이들 방법은 감염 세포의 면역-과산화 효소 염색, 비루스 및 외래 단백질의 면역침전, 웨스턴 블롯 및 도트 블롯을 포함한다(Coligan, J. E., et al. , eds., Current Protocols in Immunology., Joho Wiley and Sons (1992)).
면역과산화수소 염색 검정은 비루스-감염 베로 세포내 단백질의 감지를 위해 사용된다. 베로 세포를 비루스로 감염시키고 감염후 다양한 시간에 에탄올 또는 메탄올과 고정시킨다. 고정된 세포 단층을 폴리오비루스 단백질 또는 69 kD 항원에 대한 항혈청과 함께 인큐베이션한다. 평판을 세척한 다음 호스 래디쉬 과산화효소 (HRP)에 접합된 제 2항체 (예컨대 염소 항-토끼 IgG)와 함께 인큐베이션한다. 평판을 다시 세척한 다음 HRP기질,3,3′-디아미노벤지딘 테트라히드로클로라이드 (Sigma, St. Louis, MO)를 첨가한다. 항원과 상호반응하는 단백질을 발현하는 세포는 염색 된다.
베로 세포 단층을 재조합 비루스로 감염시킨다. 세포 용해질을 면역침강 또는 웨스턴 블롯에 의해 비루스 코딩된 단백질이 있는지 조사할 수 있다. 면역 침강에 있어, 모든 용해질을 외인성 단백질 또는 폴리오비루스에 대한 항혈청과 인큐베이션한다, 그다음 단백질 A 세파로스 ( Sigma, St. Louis, MO)를 혼합물에 첨가하고 부가적으로 인큐베이션한다. 세파로스 비이드를 원심분리하고, 세척하고 SDS 해리 완충액으로 용출시킨다.
침전된 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석할 수 있다. 웨스턴 블로팅에 있어서는, 세포 용해질을 SDS-PAGE 에 의해 분리시키고, 니트로셀룰로스에로 이동시키고 관심있는 단백질에 대한 항혈청과 인큐베이션한다. 블롯을 세척하고 HRP 에 접합된 제 2 항체 (예컨대 염소 항-토끼 IgG)화 인큐베이션한다. 블롯을 다시 세척한 다음 HRP 기질, 4-클로로-1-나프톨 ( BioRad, Richmond, CA)와 과산화수소를 첨가하여 상호-반응하는 단백질들을 확인한다.
[실시예 12]
[단순포진 당단백질 D 유전자를 운반하는 재조합 폴리오비루스의 구성]
실시예 10의 폴리오비루스 카세트 벡터를 사용하여 단순 포진 비루스의 당단백질 D를 발현시켰다. 이 단백질은 약 1.2 kb 의 유전자에 의해 코딩된다. 서열 특이 프라이머로써 PCR 에 의해 오픈 리딩 프레임의 이 영역 또는 보다 짧은 영역을 증폭할 수 있었다. 프라이머는 센스 프라이머의 5′ 말단에 있는 NotI 부위 및 안티센스 프라이머의 5′말단에 있는 PacI 부위를 함유하도록 고안되어 있다. 프라이머는 또한 오픈 리딩 프레임 및 폴리오비루스 3C 단백질분해효소 인식 부위가 프레임내에 있도록 조정되어야만 한다.
PCR 에 의해 증폭시킨 후에, 결과의 겔을 아가로스 겔 전기영동에 의해 또는 매직 PCR 키트 (Promega)로써 정제하고, NotI 및 PacI 로써 소화시키고, 동일 효소로써 제한된 벡터내로 결찰시킨다. 결과의 플라스미드를 pLED3.2/gD 로 명명했다. 이 전체 길이 폴리오-융합 구성물의 DNA 서열은 어플라이드 바이오시스템 ( Foster City, CA )370A DNA 서열 해독기를 사용하여 측정한다.
그다음, 전사 및 트랜스펙션 반응을 수행한다. T7 프로모터로부터 발생된 RNA 전사물을 베로 세포내로 트랜스펙션시켜 전염성 폴리비루스를 생성한다. 이 실험에 있어, 대략 pLED3.2.gD 5㎍ 을 제조하고 PvuI 로써 플라스미드를 소화시켜 RNA 전사물을 생성한다. PvuI 소화는 두개의 단편을 초래하는데, 더큰 단편은 T7 프로모터를 함유하고 전체-길이 폴리오 게놈은 gD 유전자 융합체를 함유한다. 소화 반응물을 페놀 추출시키고 에탄올 침전시킨다. 침전된 DNA 를 물 20 ㎕에 재현탁한다. 전체 길이 RNA 전사효소 를 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 PvuI-소화된 DNA 로부터 생체외 합성한다(Moss, E. G., et al., J.Virol., 63 : 1884-1890 (1989)). 전사 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석한다.
보조유동물 베로 셀 단층 25 ㎠ 을 DEAE-트랜스펙션 프로토콜을 사용하여 전사물로써 트랜스팩션시킨다(Van der Werf, S., Proc. Nat1. Acad. Sci., U. S. A., 83: 2330-2334(1986)). RNA 대략 25 ㎍ 을 DEAE-덱스트란 (0.5 mg/ml)과 혼합한 다음 베로 셀 상에 놓는다. 실온에서 30분 인큐베이션한 후에, 접종원을 제거하고 세포를 세척한다. 새로운 변형 이글스 락탈 항상성 배지를 첨가하고 세포를 33.5℃ 에서 인큐베이션한다. 전체 세포병원성 효과가 관찰될 때까지 인큐베이션하고 재조합 폴리오비루스를 배양 배지로부터 수확한다.
구성물 pLED3.2/gD으로부터 생성된 재조합 폴리오비루스를 함유하는 비루스 덩어리를 베로 세포 상에서 플라크 검정에 의해 적정한다. 게다가, 재조합 비루스로부터 RNA를 추출하고 GeneAmp 열안정성 rTth 역 전사효소 RNA PCR 키트 ( Perkin - E1mer/cetus)를 사용하는 역전사 및 PCR 에 의해 분석한다. 결과는 S 유전자가 배양물내 통로를 통하여 재조합 pLED3.2/gD 비루스내에서 안정하게 유지됨을 증명한다.
다양한 방법을 사용하여 폴리오비루스 벡터로부터 gD 항원의 발현을 분석한다. 표준 절차인 이들 방법은 감염 세포의 면역-과산화 효소 염색, 비루스 및 외래 단백질의 면역침전, 웨스턴 블롯 및 도트 블롯을 포함한다(Coligarl, J. E., et al. , eds., Current Protocols in Immunology Joho Wiley and Sons (1992) ).
면역과산화수소 염색 검정은 비루스-감염 베로 세포내 단백질의 감지를 위해 사용된다. 베로 세포를 비루스로 감염시키고 감염후 다양한 시간에 에탄을 또는 메탄올과 고정시킨다. 고정된 세포 단층을 폴리오비루스 단백질 또는 gD 항원에 대한 항혈청과 함께 인큐베이션한다. 평판을 세척한 다음 호스 래디실 과산화효소 (HRP)에 접합된 제 2 항체 (예컨대 염소 항-토끼 IgG)와 함께 인큐베이션한다. 평판을 다시 세척한 다음 HRP 기질, 3,3′-디아미노벤지딘 테트라히드로클로라이드 (Sigma, St. Louis, MO)를 첨가한다. 항원과 상호반응하는 단백질을 발현하는 세포는 염색 된다.
베로 세포 단층을 재조합 비루스로 감염시킨다. 세포 용해질을 면역침강 또는 웨스턴 블롯에 의해 비루스 코딩된 단백질이 있는지 조사할 수 있다. 면역 침강에 있어, 모든 용해질을 외인성 단백질 또는 폴리오비루스에 대한 항혈청과 인큐베이션한다. 그다음 단백질 A 세파로스 ( Siema, St. Leuis, Mo)를 혼합물에 첨가하고 부가적으로 인큐베이션한다. 세파로스 비이드를 원심분리하고, 세척하고 SDS 해리 완충액으로 용출시킨다.
침전된 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석할 수 있다. 웨스턴 블로팅에 있어서는, 세포 용해질을 SDS-PAGE 에 의해 분리시키고, 니트로셀룰로스에로 이동시키고 관심있는 단백질에 대한 항혈청과 인큐베이션한다. 블롯을 세척하고 HRP 에 접합된 제 2항체 (예컨대 염소 항-토끼 IgG)와 인큐베이션한다. 블롯을 다시 세척한 다음 HRP 기질, 4-클로로-1-나프톨 ( BioRad, Richmond, CA)와 과산화수소를 첨가하여 상호-반응하는 단백질들을 확인한다.
[동등성]
당업자들은 단지 일상 실험을 사용하여 본 원에 서술된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 많은 동등물을 확인할 수 있거나 인지할 것이다. 이런 동등물은 하기 청구범위에 포괄된다.
[서열목록]
(1) 일반 정보:
(i) 출원인: Whitehead Institute for Biomedical Research
(ii) 발명의 명칭: 재조합 백신 및 그의 생산 방법
(iii) 서열 수: 39
(iv) 통신 주소:
(A) 수신인: Hamilton, Brook, Smith & Reynolds, P.C.
(B) 거리: 밀리타 드라이브 2
(C) 시: 렉싱톤
(D) 주: MA
(E) 국가: 미합중국
(F) 우편 번호: 02173
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 형태: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환성
(C) 운영체계: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) 현 출원 자료:
(A) 출원 번호: PCT/US92/10543
(B) 출원일: 1992년 12월 4일
(C) 분류:
(xiii) 대리인 정보:
(A) 이름: Granahan, Patricia
(8) 등록 번호: 32,227
(C) 참고: 서류 번호: WHI(c)91-01AA PCT
(ix) 우편통신 정보
(A) 텔레폰: (617) 861-6240
(B) 텔레펙스: (617) 861-9540
(2) SEQ 10 NO:1 에 대한 정보:
(i) 서열 륵성
(A) 길이: 31 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:1:
(2) SEQ ID NO:2 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 46 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:2:
(2) SEQ ID NO:3 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 39 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:3:
(2) SEQ ID NO:4 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:4:
(2) SEQ ID NO:5 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 25 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:5:
(2) SEQ ID NO:6 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:6:
(2) SEQ ID NO:7 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 50 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:7
(2) SEQ ID NO:8 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 37 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:8:
(2) SEQ ID NO:9 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:9:
(2) SEQ ID NO:10 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 18 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:10:
(2) SEQ ID NO:11 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 33 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:11:
(2) SEQ ID NO:12 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:12:
(2) SEQ ID NO:13 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 47 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:13:
(2) SEQ ID NO:14 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 41 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:14:
(2) SEQ ID NO:15 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 49 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:15:
(2) SEQ ID NO:16 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 54 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:16:
(2) SEQ ID NO:17 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 57 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:17:
(2) SEQ ID NO:18 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:18:
(2) SEQ ID NO:19 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 53 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:19:
(2) SEQ ID NO:20 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 58 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:20:
(2) SEQ ID NO:21 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:21:
(2) SEQ ID NO:22 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 39 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:22:
(2) SEQ ID NO:23 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 37 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:23:
(2) SEQ ID NO:24 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 22 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: RNA (게놈)
(ix) 특징:
(A) 이름/키이:CDS
(B) 장소: 5..2
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:24:
(2) SEQ ID NO:25 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 26 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:25:
(2) SEQ ID NO:26 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 33 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: RNA (게놈)
(ix) 특징:
(A) 이름/키이:CDS
(B) 장소: 1..33
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:26:
(2) SEQ ID NO:27 에 대한 정보:
(i)서열 특성:
(A) 길이: 11 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:27:
(2) SEQ ID NO:28 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 93 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(ix) 특징:
(A) 이름/키이:CDS
(B) 장소: 1..93
(xi)서열 서술: SEQ ID NO:28:
(2) SEQ ID MO:29 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 31 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 서술: SEQ ID NO:29:
(2) SEQ ID NO:30 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 99 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(ix) 특징:
(A) 이름/키이:CDS
(B) 장소: 1..99
(xi)서열 서술: SEQ ID NO:30:
(2) SEQ ID NO:31 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 33 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi)서열 서술: SEQ ID NO:31:
(2) SEQ ID NO:32 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 111 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(ix) 특징:
(A) 이름/키이:CDS
(B) 장소: 1..111
(xi)서열 서술: SEQ ID NO:32:
(2) SEQ ID NO:33 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 37 아미노산
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(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi)서열 서술: SEQ ID NO:33:
(2) SEQ ID NO:34 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 93 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(ix) 특징:
(A) 이름/키이:CDS
(B) 장소: 1..93
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(2) SEQ ID NO:35 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 31 아미노산
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(xi)서열 서술: SEQ ID NO:35:
(2) SEQ ID NO:36 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 78 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
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(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(ix) 특징:
(A) 이름/키이:CDS
(B) 장소: 1..78
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(2) SEQ ID NO:37 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 26 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi)서열 서술: SEQ ID NO:37:
(2) SEQ ID NO:38 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 75 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥: 단일
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(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(ix) 특징:
(A) 이름/키이:CDS
(B) 장소: 1..75
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(2) SEQ ID NO:39 에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 25 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi)서열 서술: SEQ ID NO:39:
Claims (12)
- 재조합 게놈이 하기 (a) - (c)를 포함하여 구성되며 모 비루스가 피코르나비루스, 토가비루스, 및 플라비비루스로 구성되는 군으로 부터 선택되는 복제-적응 재조합 비루스 : (a) B형 간염 S 항원, B형 간염 pre-S1 항원, B형 간염 pre-S2 항원, B. 퍼투스시스 69kD 외부 막 단백질, 단순포진 당단백질 D, 및 로터비루스 VP7 항원, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로 부터 선택되는 발현될 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 서열; (b) 재조합 비루스를 형성하도록 변형된 모 비루스에 의해 생산되는 단백질 전구체를 단백질 분해 처리하는 단백질 분해 호소에 대한 인위적 단백질 분해 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열; 및 (C) 재조합 비루스를 형성하도록 개질된 모 비루스의 게놈, 여기서, (a) 및 (b)의 핵산 서열은 비루스 복제에 필요한 비루스 서열을 분해하지 않도록 하는 모 비루스의 게놈 내 위치로 (C) 내에 삽입된다.
- 제11 항에 있어서. 상기 (a) 및 (b)의 핵산 서열이 하기의 순서로 재조합 게놈 내에 존재하는 복제-적응 재조합 비루스 : 모 비루스의 5′ 비번역영역 - 모 비루스의 독특한 출발 코돈 - (a)의 외인성 핵산 서열 - (b)의 인위적 단백질 분해 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열 - 모 비루스의 두 번째 코돈 - 모 비루스 게놈의 나머지.
- 제1항에 있어서, 상기 모 비루스는 폴리오비루스이고 서열 (b)는 폴리오비루스 3C 단백질 분해 효소 또는 폴리오비루스 2A 단백질 분해 효소에 대한 인위적 단백질 분해 절단 부위를 로딩하는 핵산 서열이며, 강기 (a) 및 (b)의 핵산 서열이 하기의 순서로 재조합 게놈 내에 존재하는 복제-적응 재조합 비루스 : 폴리오비루스 게놈의 5′ 비번역 영역 - 폴리오비루스의 독특한 출발 코돈 - (a)의 외인성 핵산 서열 - (b)의 인위적 단백질 분해 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열 모 폴리오비루스 게놈의 두 번째 코돈 - 모 폴리오비루스 게놈의 나머지.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 및 (b)의 핵산 서열이 하기의 순서로 재조합 게놈 내에 존재하는 복제-적응 재조합 비루스 모 비루스의 5′ 비번역 영역 - 모 비루스의 독특한 출발 코돈(들) - 모 비루스의 번역 영역의 초기 코돈 (들) - 인위적 단백질분해 절단 부위를 코딩하는 서열 - 외인성 핵산 서열 - 인위적 단백질 분해 절단 부위를 로딩하는 핵산 서열 - 모 비루스 게놈의 나머지.
- 제1항에 있어서, 모 비루스가 폴리오비루스이고 서열 (b)가 폴리오비루스 3C 단백질 분해 효소 또는 폴리오비루스 2A 단백질 분해 효소에 대한 인위적 단백질 분해 절단 부위를 코딩하며, 상기 (a) 및 (b)의 핵산 서열이 재조합 폴리오비루스 게놈 내에 하기 순서로 존재하는 복제-적응 재조합 비루스 : 폴리오비루스 게놈의 5′ 비번역 영역 - 폴리오비루스의 독특한 출발 코돈 - 폴리오 단백질 코딩 영역(들) - 인위적 3C 또는 2A 단백질 분해 효소 인식 부위 - 외인성 핵산 서열 - 인위적 3C 또는 2A 단백질 분해 효소 인식 부위 - 폴리오비루스 게놈의 나머지.
- 제1항, 제2항, 제3항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 모 비루스의 게놈은 마호네이 폴리오비루스 또는 그의 유도체의 게놈이거나, 또는 사빈 폴리오비루스 유형 1, 사빈 폴리오비루스 유형 2 또는 사빈 폴리오비루스 유형 3 또는 이들의 유도체의 게놈인 복제-적응 재조합 비루스.
- 하기 (a) 및 (b)의 단계들을 포함하여 구성되는 복제-적응 재조합 비루스의 제조 방법 : (a) 피코르나비루스, 토가비루스 및 플라비비루스로 구성되는 군으로부터 하나의 비루스를 선택하므로써 자연적 생활 주기에서 단백질 분해 처리되는 다단백질 전구체를 생산하는 비루스를 제공하고; (b) 단계 (a)의 비루스의 게놈 내로 (1) B형 간염 S 항원, B형 간염 pre-S1 항원, B형 간염 pre-S2 항원, B. 퍼투스시스 69 KD 외부 막 단백질, 단순포진 당단백질 D, 및 로터비루스 VP7 항원, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로 부터 선택되는 발현될 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 서열 ; 및 (2) 단계 (a)에서 제공된 비루스에 의해 생산되는 단백질 전구체를 단백질 분해 처리하는 단백질 분해 효소에 대한 인위적 단백질 분해 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열을 도입하되, 상기 (b)(1) 및 (b)(2)의 핵산 서열이 비루스 복제에 필요한 비루스 서열을 분해하지 않도록 하는 위치로 (a)의 비루스의 게놈 내로 삽입된다.
- 제7항에 있어서, 상기 (b)(1) 및 (b)(2)의 핵산 서열이 하기의 순서로 재조합 게놈 내에 존재하는 방법 : 모 비루스의 5′ 비번역 영역 - 모 비루스의 독특한 출발 코돈 - (b)(1)의 외인성 핵산 서열 - (b)(2)의 인위적 단백질 분해 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열 - 모 비루스의 두 번째 코돈 - 모 비루스 게놈의 나머지.
- 제8항에 있어서, 단계 (a)에서 제공되는 비루스가 사빈 폴리오비루스 및 마호네이 폴리오비루스로 구성되는 군으로부터 선택되고, 인위적 단백질 분해 절단 부위를 코딩하는 (b)(2)의 핵산 서열은 폴리오비루스 3C 단백질 분해 효소 또는 폴리오비루스 2A 단백질 분해 효소에 대한 인위적 단백질 분해 절단부위를 코딩하는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 단계 (a)에서 제공되는 비루스는 폴리오비루스이고, 상기 (b)(1)의 외인성 핵산 서열 및 (b)(2)의 인위적 단백질 분해 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열의 유니트는 폴리오비루스의 게놈 내에서 1) Vpl 과 2A 사이의 접합점 ; 2) 2A 와 2B 사이의 접합점 ; 및 3) 2C 와 3A 사이의 접합점으로 구성되는 군으로부터 선택되는 한 부위에 위치하는 방법.
- 제10항에 있어서, 인위적 단백질 분해 절단 부위를 코딩하는 (b)(2)의 핵산 서열이 폴리오비루스 3C 단백질 분해 효소 또는 폴리오비루스 2A 단백질 분해 효소에 대한 단백질 분해 절단 부위를 코딩하는 것인 방법.
- 하기 (a) 및 (b)의 단계들을 포함하여 구성되는, 제1항, 제2항, 제3항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 복제-적응 재조합 비루스에 의하여 발현되는 외인성 폴리펩티드에 특이적인 항체의 제조 방법 : (a) 제1항, 제2항, 제3항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 복제-적응 재조합 비루스를 인간을 제외한 적절한 숙주 세포 내로 도입시키고; (b) 상기 복제-적응 재조합 비루스의 복제를 위한 적절한 조건 하에 단계 (a)의 생산물을 유지시킨다.
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