KR20040050346A - 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터 및 이를 이용한 개량형의 재조합 소아마비 백신 조성물 - Google Patents

재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터 및 이를 이용한 개량형의 재조합 소아마비 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은인 비보에서 폴리오바이러스에 대한 중화 항체의 생성을 유도할 수 있는 폴리오바이러스 벡터, 폴리오바이러스 백신 조성물 및 폴리오바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (a) 사빈 1형 폴리오바이러스의 지놈 뉴클레오타이드 서열; (b) 추가적인 폴리오바이러스 프로테아제 절단 위치를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (c) 상기 추가적인 폴리오바이러스 프로테아제 절단 위치를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결되어 있고, 폴리오바이러스 2형 또는 3형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열을 최소 서열로 포함하는 컨포메이션 에피토프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터, 폴리오바이러스 백신 조성물 및 폴리오바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터 및 폴리오바이러스 백신 조성물{Novel Recombinant Sabin Type 1 Poliovirus Vector and Vaccine Against Poliovirus}
본 발명은 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터에 관한 것으로서, 보다 상세하게는인 비보에서 다른 혈청형의 폴리오바이러스에 대한 중화 항체의 생성을 유도할 수 있는 폴리오바이러스 벡터, 재조합 폴리오바이러스 백신 조성물 및 재조합 폴리오바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
최근에 제시된 새로운 백신 개발의 기준을 보면 대체적으로 점막 면역 유도를 강조하고 있다. 점막 면역을 효과적으로 유도하는 백신을 개발하기 위해 다음과 같은 몇 가지 실험이 진행되었다:
첫째, 콜레라 독소 또는 대장균의 외독소와 같은 점막 면역원을 사용하는 방법이 연구되었다 (Munoz, E. et al., Cholera toxin discriminates between Thelper 1 and 2 cells in T cell receptor-mediated activation: role of cAMP in T cell proliferation.J. Exp. Med.1;172(1):95-103(1990); Wilson, A.D. et al., Adjuvant action of cholera toxin and pertussis toxin in the induction of IgA antibody response to orally administered antigen.Vaccine11(2):113-8(1993)). 그러나, 콜레라 독소 또는 박테리아 내독소의 경우 사람에게 여러 가지 부작용을 일으킬 수 있으므로 이를 재조합 백신의 점막 면역 유도의 아쥬번트로 사용하기 위해서는 앞으로도 많은 연구가 있어야 할 것이다.
둘째, 항원을 미세 캡슐에 싸서 투여하는 미세캡슐화 방법이 개발되었다 (McGhee, J.R. et al., Isotype of anti-SIV responses in infected rhesus macaques and in animals immunized by mucosal routes.AIDS Res. Hum. Retroviruses8(8):1389(1992); Marx., P.A. et al., Protection against vaginal SIV transmission with microencapsulated vaccineScience28;260(5112):1323-7(1993)). 그러나, 이 방법은 전신성 면역과 점막성 면역이 조화를 이루도록 항원 조합의 최적 조건을 맞추어 주어야 하는 어려움이 있다.
셋째, 점막 면역을 가장 효과적으로 유도할 수 있는 것은, 점막 부위에 감염되어 특이 세포 독성 임파구 (cytotoxic T lymphocyte: CTL) 생성과 함께 국부 점막 면역을 유도할 수 있으며 호흡기와 소화기를 통해 감염되는 바이러스를 이용한 점막 면역 유도 방법이다 (Meitin C.A. et al., Influenza immunization: intranasal live vaccinia recombinant contrasted with parenteral inactivated vaccineVaccine9(10):751-6(1991); Offit, P.A. et al., Rotavirus-specificcytotoxic T lymphocyte response of mice after oral inoculation with candidate rotavirus vaccine strains RRV or WC3.J. Infect. Dis.160(5):783-8(1989); London, S.D. et al., Intraepithelial lymphocytes contain virus-specific, MHC-restricted cytotoxic cell precursors after gut mucosal immunization with reovirus serotype 1/Lang. Reg. Immunol.2(2):98-102(1989)).
그러므로, 이러한 점막 면역을 유도하는 바이러스를 벡터로 개발하여 여기에 각종 바이러스 서브지놈을 재조합하여 제조되는 점막면역 유도용 바이러스 백신은 가장 바람직한 백신이다.
따라서, 최근에는 점막 면역 유도 능력이 우수하며 독성이 없는 바이러스를 벡터로 사용하려는 연구가 진행되고 있으며, 특히 폴리오바이러스를 이용한 백신 벡터의 개발이 활발하게 진행되고 있다.
폴리오바이러스 백신 벡터의 개발은 크게 3 부류로 나누어 진행되고 있다. 즉, (a) 에피토프 치환 방법 (epitope substitution); (b) 디펙티브 미니레플리콘 제작 방법 (defective minireplicon); 및 (c) 자가프로세싱 재조합 벡터 (autoprocessing recombinant vector: R. Andino,Science265:1448-451(1994)); N. M. Mattion J. Virol.68:3925-3933(1994); 및Vaccine95:293-297(1995))가 있다. 상기 세 번째 방법에서 R. Andino 등은 폴리오바이러스 타입 1 야생형인 마호니주를 이용하고, N. M. Mattion은 약독화 사빈 3형을 이용하여 연구결과를 보고한 바 있다.
상기 세 가지 방법 중에서 가장 유망한 방법이 Andino와 Mattion의 방법인데, 마호니주는 말할 것도 없이 사빈 3형도 백신으로서의 안전성이 크게 문제가 있기 때문에, 백신 개발을 위한 벡터로서의 실용성은 크게 문제가 된다.
한편, 소아마비 바이러스 사빈 1형은 1963년 사빈에 의해 개발된 소아마비 백신주들 중의 하나로 신경 세포에 감염할 수 있는 능력 (neurotropism)을 상실하였고 장에서만 감염 증식되기 때문에, 많은 양을 접종해도 소아마비를 일으키지 않고 매우 효과적으로 점막 면역을 유도하는 장점을 갖고 있다. 또한 현재까지 전 세계적으로 한 번도 그 부작용이 보고된 바가 없을 만큼 안전성이 뛰어나다.
이에, 본 발명자들은 사빈 1형을 유전자 조작하여 재조합 생백신 벡터를 개발하고, 이를 "RPS-Vax 시스템"이라 명명하였다 (대한민국 특허출원 1997-37812). 또한, 본 발명자들은 RPS-Vax 시스템에 HIV-1 p24 유전자, HIV-1의 env 유전자 및 HCV의 core 유전자 등을 삽입하여 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터를 제조하였다 (대한민국 특허출원 1998-32198; 및 WO 99/7859).
RPS-Vax 시스템을 이용하여 개발된 재조합 생백신은 우수한 안전성, 접종의 편리성, 저렴한 제조 비용, 체액성 면역중 특히 점막면역 유도를 통한 면역 유도 등 많은 장점을 기대할 수 있다.
한편, 소아마비 백신으로 1953년 불활화된 소아마비 백신 (IPV: inactivated polio vaccine; Salk)이 생산되었다. 불활성화 사백신 (IPV)은 포르말린으로 불활성화시킨 야생의 소아마비 바이러스 1, 2 및 3형을 포함하고 있으며, 최근의 개량 사백신은 인간 이배체 세포나 베로 (Vero) 세포 배양으로부터 만든 백신으로 효능이 좋아 2회의 접종으로도 좋은 예방 효과를 보이며, 3회의 기초 접종으로 경구용 생백신과 같은 항체 양전율을 나타낸다고 알려져 있다. 사백신은 백신과 연관된 마비가 발생하지 않으며 경구용 생백신 보다 훨씬 안전한 백신이라는 장점은 있으나, 생백신 (5-10 x 105pfu/사람)에 비해 엄청난 양이 필요하고 (1012pfu/사람) 투여 방법이 주사이기 때문에 불편하며 면역의 확산 효과가 없고 점막 면역을 유도하지 못하는 단점이 있다.
1963년 약독화된 경구용 소아마비 백신 (OPV: attenuated oral polio vaccine; Sabin)이 생산되면서 세계적으로 소아마비 발병률이 현저히 감소되었다. 경구용 소아마비 백신의 경우 사빈 1, 2 및 3형의 약독화 백신주를 혼합하여 칵테일로 사용하고 있으나, 백신 부작용 (VAPP, vaccine associated paralytic poliomyelitis)이 지속적으로 보고되면서 1999년부터 미국과 독일은 OPV 대신 사독 백신인 솔크 (Salk) 백신으로 예방 접종을 실시하고 있다. 그러나, 솔크 백신의 경우 안전하기는 하나, 주사 투여를 하여야 할 뿐만 아니라, OPV 보다 면역 유도능이 현저히 떨어지기 때문에 충분한 백신 효과를 기대하기 힘들어 이에 대한 대비책이 시급한 실정이며 실제로 이를 위해 미국은 솔크/OPV 이중 면역화 프로그램을 권장하고 있다.
많은 연구자들이 OPV의 부작용을 제거하기 위한 연구를 오랫동안 진행하여 왔으나, 아직까지 이를 개선한 효과적이고 안전한 OPV 대체용 백신이 개발되지 못하고 있는 실정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌 및 논문이 참조되고 그 인용은 괄호내에 표시하였다. 인용된 특허 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 혈청형이 다른 폴리오바이러스에 대한 중화 항체의 생성을 유도할 수 있는 신규한 재조합 폴리오바이러스를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 다른 혈청형의 특정 구조 에피토프를 코딩하는 유전자 서열을 폴리오바이러스 사빈 1형 벡터 (RPS-Vax)에 추가적으로 결합시켜 생산한 재조합 폴리오바이러스의 경우에는 에피토프를 도입한 혈청형의 소아마비 바이러스 감염에 대해 중화 항체 생성을 유도할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 백신 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 다른 혈청형의 폴리오바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 다른 혈청형의 폴리오바이러스의 감염에 대한 재조합 사빈주의 예방 효과를 검증하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 명확하게 된다.
도 1은 본 발명에서 이용되는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터인 RPS-Vax 벡터의 유전자 지도 및 클로닝 부위를 나타내는 도면.
도 2는 RPS-Vax에서의 외래 서열의 클로닝을 나타내는 개략도. 멀티플 클로닝 위치에 삽입된 외래 서열은 화살표로 나타낸 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR로 용이하게 검출될 수 있다.
도 3은 각각 Tg-PVR 마우스로부터 수득한 항-랜싱 항혈청 (패널 A) 및 항-레온 항혈청 (패널 B)을 이용한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타내는 겔 사진. 레인 M, C, 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7은 각각 NEB 선염색 마커, 1 ㎍ 대조군 BSA, PV2-NEP (중화 에피토프 펩타이드)-BSA 접합물, PV3-NEP-BSA 접합물, PV2-NEP-난알부민 접합물, PV3-NEP-난알부민 접합물, HeLa/마호니 파쇄물, HeLa/랜싱 파쇄물 및 HeLa/레온 파쇄물을 각각 로딩한 레인을 나타낸다.
도 4는 PV2-NEP-BSA 접합물 및 PV3-NEP-BSA 접합물 의해 유도된 폴리클론항체를 이용한 웨스턴 블롯 결과를 나타내는 겔 사진. 패널 A의 레인 1, 2, 3, 4 및 M은 각각 사빈 2, W-2 (VR-301, ATCC), 랜싱 (VR-1002, ATCC), 랜싱 (VR-1002,계대배양) 및 마커를 로딩한 레인이다. 패널 B의 레인 1, 2, 3, 4 및 M은 각각 사빈 3, 레온 (VR-1004, ATCC), 레온 (VR-62, ATCC), 레온 (VR-62, 계대배양) 및 마커를 로딩한 레인이다.
도 5는 2, 3 혈청형 폴리오바이러스 또는 2, 3 혈청형 중화 에피토프를 면역하여 얻은 항혈청의 중화항체 반응 결과를 보여 주는 플레이트 사진.
도 6a는 Tg-PVR 마우스에서 얻은 서로 다른 혈청형의 폴리오바이러스 백신주 에 대한 항혈청의 교차 면역 반응의 여부를 검증하기 위한 웨스턴 블롯 분석 사진: M은 염색마커, 1 HeLa/사빈 1형감염 파쇄물, 2 HeLa/사빈 2형 감염 파쇄물, 3 HeLa/사빈3형 감염 파쇄물.
도 6b는 서로 다른 혈청형의 야생주 폴리오바이러스에 대한 Tg-PVR 마우스 항혈청의 교차 면역 반응 여부를 검증하기 위한 웨스턴 블롯 분석 사진: 1 HeLa/마호니감염 파쇄물, 2 HeLa/W-2 감염 파쇄물, 3. HeLa/랜싱 감염 파쇄물, 4 HeLa/레온 감염 파쇄물.
도 7a 및 도 7b는 각각 폴리오바이러스 2형 및 3형의 선별된 컨포메이션 에피토프 중 일부를 나타내는 도면.
도 8a는 RPS-Vax 유래 재조합 폴리오바이러스에 도입된 2, 3형의 유전자를 RT-PCR로 확인한 사진.
도 8b는 재조합 폴리오바이러스에 도입된 2, 3형의 유전자의 발현을 웨스턴 블롯 실험으로 확인한 사진.
도 9는 본 발명의 일 구현예인 RPS-Vax/PV2-138 및 RPS-Vax/PV3-138의 유전적 안정성 및 발현을 RT-PCR 및 웨스턴 블롯 실험으로 확인한 사진: 레인 C는 외래 서열이 삽입되지 않은 RPS-Vax에 의해 감염된 대조군 HeLa 세포의 파쇄물을 나타내며, 각 레인 상의 숫자는 패시지 수를 나타낸다. 화살표는 PCR-증폭된 삽입 서열 및 발현된 단백질을 가리킨다.
도 10은 접종경로 접종량 및 바이러스 활성 유무에 따른 면역유도능을 조사한 웨스턴 블롯 결과임. 패널 A는 Tg-PVR 마우스에서 최적의 접종 경로를 나타내는 웨스턴 블롯 분석 사진: 레인 1, 접종하지 않은 대조군 혈청; 2, 뇌; 3, 정맥; 4, 근육; 5, 피하; 6,복강; 7, 코 점막; 8, 구강으로 Tg-PVR 마우스에 재조합 바이러스 감염 후 얻은 항혈청; 및 9, 마호니주 감염 원숭이 양성 항혈청. 패널 B는 Tg-PVR 마우스에 사빈 1형을 여러 농도로 감염시킨 후 얻은 항혈청의 바이러스와의 반응 역가를 웨스턴 블롯으로 분석한 사진: 레인 1, 감염되지 않은 마우스 혈청; 레인 2부터 6까지는 각각 2 x 103pfu, 2 x 104pfu, 2 x 105pfu, 2 x 106pfu, 2 x 107pfu의 사빈 1형 바이러스로 접종 후 얻은 마우스 항혈청. 패널 C는 Tg-PVR에 사빈 1형 바이러스를 감염하여 얻은 항혈청이 바이러스 증식에 의한 것임을 확인한 웨스턴 블롯 사진: 레인 1은 배지만 접종시킨 마우스 혈청, 2는 재조합 바이러스 (1 x 107pfu)를 자외선으로 조사하여 불활화 시킨 후 접종하여 얻은 항혈청, 3은 자외선을 조사하지 않은 재조합 바이러스를 (1 x 107pfu) 접종하여 얻은 항혈청.
도 11은 Tg-PVR 마우스에 접종 시 사빈 1형 바이러스, RPS-Vax/PV2-에피토프로부터 유래된 재조합 폴리오바이러스 및 RPS-Vax/PV3-에피토프로부터 유래된 재조합 폴리오바이러스의 마호니 (패널 A) 렌싱 (패널 B) 및 레온 (패널 C) 야생주에 대한 중화 항체 유도능을 보여주는 그래프: 패널 A에서, 레인 1은 사빈 1형을 3회 접종한 마우스 항혈청, 2 및 3은 RPS-Vax 바이러스를 접종 후 불활화시킨 (formalin-inactivated) 사빈 2형을 1회 및 2회 추가 접종한 마우스 항혈청, 4 및 5는 사빈 1형 접종 후 불활화 시킨 사빈 3형을 1 회 및 2회 추가 접종한 마우스의 항혈청으로, 각각의 항혈청의 마호니에 대한 중화항체 역가를 측정한 그래프; 패널 B에서, 레인 1은 사빈 2형을 3회 접종한 항혈청, 2는 RPS-Vax 바이러스를 투여한 후 불활화시킨 사빈 2형을 2회 추가 접종한 마우스 항혈청, 3은 RPS-Vax/PV2-110 재조합 바이러스를 접종 후 불활화 사빈 2형을 2회 추가 접종한 마우스 항혈정, 4는 RPS-Vax/PV2-110-Tag 재조합 바이러스를 1차 접종 후 불활화 사빈 2형을 2회 추가 접종한 마우스 항혈정, 5는 RPS-Vax/PV2-138 재조합 바이러스를 1회 접종 후 불활화 사빈 2형을 2회 추가 접종한 마우스 항혈청, 6은 RPS-Vax/PV2-138-PTD를 1회 접종 후 불활화 사빈 2형을 2회 추가 접종한 마우스 항혈청으로, 각각의 항혈청의 2형 야생주인 렌싱주에 대한 중화항체 역가를 측정한 그래프; 패널 C에서, 레인 1은 사빈 3형을 3회 접종한 마우스 항혈청, 레인 2는 RPS-Vax 바이러스를 투여한 후 불활화시킨 사빈 3형을 2회 추가 접종한 마우스 항혈청, 3은 RPS-Vax/PV3-110 재조합 바이러스를 접종 후 불활화 사빈 3형을 2회 추가 접종한 마우스 항혈정, 4는 RPS-Vax/PV3-110-Tag 재조합 바이러스를 1차 접종 후 불활화 사빈 3형을 2회 추가 접종한 마우스 항혈정, 5는 RPS-Vax/PV3-138 재조합 바이러스를 1회 접종 후 불활화 사빈 3형을 2회 추가 접종한 마우스 항혈청, 6은 RPS-Vax/PV3-138-PTD를 1회 접종 후 불활화 사빈 3형을 2회 추가 접종한 마우스 항혈청으로, 각각의 항혈청의 3형 야생주인 리욘주에 대한 중화항체 역가를 측정한 그래프.
도 12a-12c는 OPV-OPV-OPV 프로그램, IPV-IPV-IPV 프로그램 및 본 발명의 r-OPV-IPV-IPV 프로그램에 따라 Tg-PVR 마우스에 면역 후 유도된 중화 항체를 각 혈청형 별로 조사하여 중화 항체의 양을 나타내는 그래프.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 사빈 1형 폴리오바이러스의 지놈 뉴클레오타이드 서열; (b) 추가적인 폴리오바이러스 프로테아제 절단 위치를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (c) 상기 추가적인 폴리오바이러스 프로테아제 절단 위치를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결되어 있고, 폴리오바이러스 2형 또는 3형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열을 최소 서열로 포함하는 컨포메이션 에피토프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터를 제공한다.
폴리오바이러는 숙주 세포에 감염되면 12시간 안에 자손 바이러스가 숙주세포를 파괴하고 방출되어 주위 세포에 다시 감염되는 등 비교적 짧은 라이프 사이클을 가지므로, CTL (cytotoxic T lymphocyte) 유도용 백신 개발은 주요 전략이 되지 못한다. 이보다는, 바이러스가 숙주 세포와 결합하는 것을 막을 수 있는 중화 항체 유도용 백신이 훨씬 효과적이다. 따라서, 본 발명자들은 중화 항체 유도에 효과적인 재조합 폴리오바이러스를 개발하게 되었다.
한편, 인간 폴리오바이러스의 구조 단백질인 캡시드는 외부에 노출된 VP1, VP2 및 VP3, 그리고 안쪽에 위치하는 VP4로 구성된 캡소머 60개가 서로 결합하여이루어져 있다. 캡시드는 "캐년 (canyon)"이라 불리는 포켓을 가지고 있어 숙주 세포의 PVR (poliovirus receptor)과 결합하고 수용체 매개 엔도사이토시스 방법으로 숙주 세포에 감염된다.
또한, 폴리오바이러스의 중화 에피토프 (neutralizing epitope)의 위치와 형태는 3 종류의 혈청형에서 매우 유사하나 구성 아미노산의 차이에 의해 서로 다른 항혈청형을 갖는다. 본 발명의 벡터로부터 유래된 재조합 폴리오바이러스에 의해 유도되는 중화 항체는 바이러스 단백질 중 B 세포 에피토프에 의해 유도된 구조를 인식하는 컨포메이션 항체로 상기 캐년 부위에 결합하여 결국 폴리오바이러스가 PVR과 결합하는 것을 막는다. 이와 같이, 중화 항체의 형성을 유도하기 위해서, 본 발명의 벡터는 중화 에피토프 (neutralizing eptitope)를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열을 최소 서열로 포함하는 컨포메이션 에피토프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "컨포메이션 에피토프 (conformational epitope)"는 다음과 같은 조건을 만족하는 에피토프를 의미한다: (a) 폴리오바이러스의 VP1 전체 서열 중 중화 에피토프에 해당하는 서열을 최소한의 서열로 갖는다. (b) 폴리오바이러스의 VP1 전체 서열에 의해 이루지는 단백질 3차 구조에서 중화 에피토프가 갖는 도메인 구조를 형성할 수 있다. (c) 크기가 약 150 aa 이하이다. (d) 항원성 (antigenicity)를 갖는다. (e) 폴리오바이러스의 캡시드의 캐년 부위에 결합능이 있는 항체 생성을 유도한다.
상기 컨포메이션 에피토프의 정의 중 하나인 크기의 제한은 본 발명자에 의해 규명된 사빈 벡터에 가장 적합한 외래 단백질의 크기로서, 이를 초과하는 경우에는 상기 컨포메이션 에피토프를 코딩하는 DNA 서열의 유전적 안정성이 크게 감소되는 문제점이 있다 (참조: 대한민국 특허출원 제 2001-6229 호; 및 Lee 등J. Virol76:1649-1662(2002)). 또한, 상기 컨포메이션 에피토프는 도메인 구조 형성 능력을 반드시 갖고 있어야 하며, 이는 컨포메이션 항체, 즉 중화 항체의 생성을 유도하기 위한 것으로서, 본 발명자들은 분자 모델링 방법으로 이러한 도메인 구조를 형성할 수 있는 서열을 VP1 서열에서 선택하였다.
본 발명의 벡터는 폴리오바이러스 프로테아제에 대한 외래성 절단 위치를 기본적으로 이용한 것으로서, 이와 같은 전략은 본 발명자들의 특허 출원 WO 99/07859 및 대한민국 특허출원 제 2001-6229 호, 그리고 미합중국 특허 제 5,965,124 호에도 개시되어 있으며, 상기 특허 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 구현예에 따르면, 상기 추가적인 폴리오바이러스 프로테아제 절단 위치는 폴리오바이러스 3C, 3CD 프로테아제또는 2A 프로테아제가 작용하는 절단 위치이며, 바람직하게는 폴리오바이러스 3C 프로테아제가 작용하는 절단 위치이다. 본 발명의 구현예에 따르면, 이러한 추가적인 절단 위치는 폴리오바이러스의 복제 및 증식에 상당한 악영향을 주지 않도록 폴리오바이러스 지놈 서열의 특정 부분에 형성된다. 예를 들어, 폴리오바이러스 폴리단백질의 N-말단의 첫 번째와 두 번째 사이, VP0와 VP3 사이, VP3와 VP1 사이, VP1과 2Apro 사이, 2Apro와 2B 사이, 2B와 2C 사이, 2C와 3A 사이, 3A와 Vpg 사이, Vpg와 3Cpro 사이 및 3Cpro와 3Dpol 사이가 있다. 바람직하게는, 상기 추가적인 절단 위치는 폴리오바이러스 폴리단백질의 N-말단의 첫 번째와 두 번째 아미노산 사이, VP1과 2Apro 사이, 2Apro와 2B 사이, 2C와 3A 사이 또는 Vpg와 3Cpro 사이이고, 가장 바람직하게는 N-말단의 첫 번째와 두 번째 아미노산 사이이다.
본 발명의 구현예에 따르면, 사빈 1형 벡터에 추가적으로 첨가되는 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열은 다양한 서열이 가능할 수 있지만, 기본적으로 사빈 1형 폴리오바이러스의 복제 및 증식에 상당한 악영향을 주지 않는 서열을 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열은 유전적 안정성 (genetic stability)이 우수한 것을 이용하는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 용어 "유전적 안정성"은 재조합 폴리오바이러스 벡터가 한 숙주에서 다른 숙주로 전파되고 증식될 때 외래성 뉴클레오타이드 서열을 계속적으로 유지하는 것을 의미한다. 이와 같은 유전적 안정성은 본 발명의 재조합 폴리오바이러스 벡터가 백신으로 이용되기 때문에 특히 중요하며, 유전적 안정성을 나타내는 서열만이 여러 세대 동안 동일한 면역 반응을 유도할 수 있게 된다.
따라서, 본 발명자들은 삽입 서열의 유전적 안정성을 개선하기 위하여 연구를 하였고, 그 결과 획기적인 방법을 개발하였다 (참조: 대한민국 특허출원 제 2001-6229 호; 및 Lee 등J. Virol.76:1649-1662(2002)). 본 발명자에 의해 제시된 방법에 따르면, 외래성 삽입 서열의 유전적 안정성은 서열 크기가 약 450 bp 이하이고, 국부적인 A/T 풍부 부위가 없으며, G/C 분포가 서열 전체적으로 균일하게 되어 있는 경우에 크게 개선된다. 이와 같은 특성을 갖는 서열은 자연에서 발견되는 (naturally-occurring) 서열로부터 선택되어 얻을 수 있고, 변이 유발 (mutagenesis)을 통해 얻을 수도 있다. 상기한 변이 유발은 당업계에서 통상적으로 실시되는 위치-특이적 변이 유발 (site-directed mutagenesis) 또는 카세트 변이 유발을 통해 실시될 수 있다. 또한 상기한 유전적 안정성을 위한 특성을 갖는 서열은 본 발명자에 의해 개발된 연결반응-부재 (ligation-free) PCR (참조: 대한민국 특허출원 제 2001-6229 호; 및 Lee 등J. Virol.76:1649-1662(2002))에 의해 제조될 수도 있다.
본 발명에 따르면, 상기 컨포메이션 에피토프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 폴리오바이러스 2형 (참조: 서열목록 제 3 서열) 또는 3형의 VP1의 중화 에피토프 (참조: 서열목록 제 4 서열)를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열을 최소 서열로 포함한다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 3 서열 또는 제 4 서열을 코딩하는 어떠한 뉴클레오타이드 서열도 가능하나, 바람직하게는 폴리오바이러스 2형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 5 서열에 기재된 서열이고, 폴리오바이러스 3형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 6 서열에 기재된 서열이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 폴리오바이러스 2형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열을 최소 서열로 포함하는 컨포메이션 에피토프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 폴리오바이러스 2형 VP1 서열에서 아미노산 65-202를 코딩하는 서열이고, 보다 바람직하게는 서열목록 제 7 서열에 기재된 서열이다. 상기한 VP1의 아미노산 65-202 서열은 상술한 유전적 안정성의 개선을 위한 방법에 의해 변형될 수 있으며, 컨포메이션 항체의 생성능에 실질적으로 큰 악영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 방법으로 변형될 수 있다. 또한, 상기한 VP1의 아미노산 65-202 서열은 본 발명의 바람직한 일 구현예일 뿐, 이와 기능적으로 등가물인 다른 아미노산 서열도 본 발명의 바람직한 서열에 포함되는 것으로 해석하여야 한다. 예를 들어, VP1의 아미노산 65-202 서열에 몇 개 또는 몇 십개의 아미노산이 추가된 서열, 결손 (deletion)된 서열, 또는 치환된 서열도 컨포메이션 항체의 생성능에 실질적으로 큰 악영향을 미치지 않는 범위 내에서는 본 발명의 바람직한 서열에 포함되는 것으로 해석되어야 한다는 것은 당업자에게 자명하다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 폴리오바이러스 3형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열을 최소 서열로 포함하는 컨포메이션 에피토프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 폴리오바이러스 3형 VP1 서열에서 아미노산 63-200를 코딩하는 서열이고, 보다 바람직하게는 서열목록 제 8 서열에 기재된 서열이다. 상기한 VP1의 아미노산 63-200 서열은 상술한 유전적 안정성의 개선을 위한 방법에 의해 변형될 수 있으며, 컨포메이션 항체의 생성능에 실질적으로 큰 악영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 방법으로 변형될 수 있다. 또한, 상기한 VP1의 아미노산 65-202 서열은 본 발명의 바람직한 일 구현예일 뿐, 이와 기능적으로 등가물인 다른 아미노산 서열도 본 발명의 바람직한 서열에 포함되는 것으로 해석하여야 한다. 예를 들어, VP1의 아미노산 65-202 서열에 몇 개 또는 몇십개의 아미노산이 추가된 서열, 결손 (deletion)된 서열, 또는 치환된 서열도 컨포메이션 항체의 생성능에 실질적으로 큰 악영향을 미치지 않는 범위 내에서는 본 발명의 바람직한 서열에 포함되는 것으로 해석되어야 한다는 것은 당업자에게 자명하다.
첨부한 서열목록 제 1 서열은 폴리오바이러스 2형 (랜싱)의 VP1의 아미노산 서열이고, 서열목록 제 2 서열은 폴리오바이러스 3형 (레온)의 VP1의 아미노산 서열이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 사빈 1형 재조합 벡터의 기본적인 구조는 본 발명자가 개발한 사빈 1형 재조합 벡터이며 (참조: 대한민국 특허출원 1998-32198; 및 WO 99/7859), 이의 구체적인 일 구현예는 도 1에 도시되어 있다.
본 발명의 사빈 1형 재조합 벡터는 중화 항체의 생성 유도를 목적으로 개발된 것으로서, 사빈 1형의 지놈 서열을 포함하고 있기 때문에 폴리오바이러스 1형 (마호니)에 대한 중화 항체의 유도능을 기본적으로 갖고 있으며, 더불어 추가되는 컨포메이션 에피토프의 서열에 의해 폴리오바이러스 2형 (랜싱) 및 폴리오바이러스 3형 (레온)에 대한 중화 항체의 유도능도 갖게 된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 본 발명의 재조합 폴리오바이러스 벡터로부터 유래된 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 백신 조성물을제공한다.
본 발명의 백신 조성물은 기본적으로 상술한 재조합 폴리오바이러스 벡터를 이용하기 때문에, 본 발명의 백신 조성물과 재조합 폴리오바이러스 벡터에 공통된 사항은 명세서의 과도한 중복성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 상술한 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터로부터 형성된 RNA 전사체로 형질감염된 숙주 세포, 예컨대 인간 자궁경부암세포 (HeLa cells)로부터 분리한 재조합 폴리오바이러스를 포함하는 약제학적 백신 조성물을 제공한다. 상술한 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스에는 중화 반응을 유도할 수 있는 컨포메이션 에피토프를 코딩하는 서열이 삽입되어 있다.
본 발명의 백신 조성물은 중화 항체의 생성을 유도하며, 이러한 중화 항체는 폴리오바이러스 캡시드의 캐년 구조에 결합하여 인간의 PVR이 상기 캐년 구조에 결합하는 것을 방해하므로, 폴리오바이러스 감염에 대한 예방 백신으로서의 작용을 하게 된다.
현재까지 중화 항체 생성능을 갖는 재조합 폴리오바이러스 생백신은 개발되어 있지 않은 상황이다. 본 발명의 백신에서 이용되는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스는 야생형 폴리오바이러스 2 형 및/또는 3 형의 중화 에피토프를 갖고 있을 뿐만 아니라 상기 중화 에피토프는 VP1 전체 단백질에서 갖고 있는 컨포메이션을 그대로 유지하도록 디자인 되어 있기 때문에, 폴리오바이러스 1, 2 및 3 형 모두에 대한 방어 면역을 유도할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 약제학적 조성물에 함유되는 재조합사빈 1형 폴리오바이러스는 (ⅰ) 폴리오바이러스 2형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열을 최소 서열로 포함하는 컨포메이션 에피토프 부위를 포함하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스; 및 (ⅱ) 폴리오바이러스 3형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열을 최소 서열로 포함하는 컨포메이션 에피토프 부위를 포함하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스의 혼합물이다. 이러한 혼합물을 백신으로 투여하는 경우에는, 폴리오바이러스 1형, 2형 및 3형 각각에 대한 중화 항체의 생성을 유도할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 추가적으로 포함하고, 백신 제조에 통상적으로 이용되는 어떠한 담체 또는 희석제도 이용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 제조된 키메릭 폴리오바이러스는 MgCl2,수크로오스 및 인산염 용액 내에서 안정화될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 가장 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 면역에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 백신 조성물을 경구 투여하는 경우, 적합한 투여량은 2 x 105-2 x 107TCID50이며, 보다 바람직하게는 1 x 106TCID50-1 x 107TCID50이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물의 가장 큰 특징은 중화 항체 생성능이 있는 컨포메이션 에피토프를 코팅하는 서열을 갖는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스를 이용하는 것이다. 본 발명의 백신 조성물에 포함되는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스는 사빈 1형의 지놈 서열을 갖고 있을 뿐만 아니라, 야생형 폴리오바이러스 2 형 또는 3형의 VP1으로부터 유래된 컨포메이션 에피토프에 대한 서열도 갖고 있기 때문에, 각각의 혈청형 폴리오바이러스 감염 모두에 대한 감염을 예방할 수 있게 한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 본 발명의 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터로부터 유래된 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 백신 조성물을 포유동물에게 투여하여 폴리오바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 면역 반응 유도 방법은 상술한 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하기 때문에, 본 발명의 면역 반응 유도 방법과 백신 조성물에 공통된 사항은 명세서의 과도한 중복성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 면역 반응에 이용되는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스는 (ⅰ) 폴리오바이러스 2형의 VP1의 중화 에피토프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 최소 서열로 포함하는 컨포메이션 에피토프 부위를 포함하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스; 및 (ⅱ) 폴리오바이러스 3형의 VP1중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열을 최소 서열로 포함하는 컨포메이션 에피토프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스의 혼합물이다. 상기 혼합물을 이용하는 경우에는 폴리오바이러스 1형, 2형 및 3형 모두에 대한 중화 항체의 생성을 유도할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 사빈 1형, 2형 및 3형 폴리오바이러스의 사백신 (IPV)에 의한 부스팅 단계를 추가적으로 포함한다. 변형예로서, 본 발명의 방법은 사빈 2형 및 3형 폴리오바이러스의 사백신에 의한 부스팅 단계를 추가적으로 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 부스팅 단계는 2회 실시한다. 부스팅 단계에서 약독화된 사빈 생백신이 아닌 사백신을 이용하는 것이 바람직한 이유는 약독화된 사빈 생백신을 이용하는 경우에는 백신 부작용 (VAPP, vaccine associated paralytic poliomyelitis)를 유발할 위험성이 있기 때문이다.
따라서, 본 발명의 방법에 따르면, 폴리오바이러스 감염에 대한 예방 방법으로서 가장 바람직한 프로그램은 다음과 같다: (ⅰ) 폴리오바이러스 2형의 컨포메이션 에피토프을 갖는 본 발명의 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 및 폴리오바이러스 3형의 컨포메이션 에피토프을 갖는 본 발명의 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스의 혼합물의 접종; (ⅱ) IPV에 의한 1차 부스팅; 그리고 (ⅲ) IPV에 의한 2차 부스팅.
본 발명의 폴리오바이러스에 대한 면역 유도 방법은 면역 반응 중 중화 반응에 특히 유리하며, 효과적으로 폴리오바이러스에 의한 감염을 막을 수 있는 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 폴리오바이러스 수용체를 코딩하는 유전자에 의해 형질전환된 마우스에 시험 대상의 재조합 사빈주를 접종하는 단계; (b) 상기 접종된 형질전환 마우스에 야생형 폴리오바이러스를 감염시키는 단계; 및 (c) 상기 마우스에서 회백수염 또는 사망의 발생을 확인하는 단계를 포함하는 폴리오바이러스의 감염에 대한 재조합 사빈주의 예방 효과를 검증하는 방법을 제공한다.
폴리오바이러스의 감염에 대한 예방 효과, 특히 PVR에 폴리오바이러스가 결합하는 방해하여 예방 효과를 나타내는 백신주의 효능을 검증할 수 있는 동물 모델은 아직까지 개발되어 있지 않다. 이에, 본 발명의 동물 모델을 이용한 검증 방법은 매우 획기적인 것이다.
본 발명의 검증 방법에서 이용되는 동물은 인간폴리오바이러스 수용체 (PVR) 유전자로 형질전환된 마우스로서, 그 구체적인 일 예는 하기의 실시예에 기재된 바와 같이, ICR 마우스에 인간의 PVR 유전자가 형질전환된 Tg-PVR 마우스이다 (참조: Racaniello V.R. et al., Transgenic mice and the pathogenesis of poliomyelitis,Arch. Virol. Suppl.9:79-86(1994); Koike S. et al., Characterization of three different transgenic mouse lines that carry human poliovirus receptor gene-influence of the transgene expression on pathogenesis,Arch. Virol.139(3-4):351-63(1994); Dragunsky E. et al., Transgenic PVR Tg-1 mice for testing of poliovirus type 3 neurovirulence: comparison with monkey test.Biologicals.21(3):233-7(1993); Racaniello V.R. et al., Poliovirus attenuation and pathogenesis in a transgenic mouse model for poliomyelitis,Dev. Biol. Stand.78:109-16(1993); Ren R. et al., Human poliovirus receptor gene expression and poliovirus tissue tropism in transgenic mice,J. Virol.66(1):296-304(1992); Ren R.B. et al., Transgenic mice expressing a human poliovirus receptor: a new model for poliomyelitis,Cell19;63(2):353-62(1990)). 이 형질전환 마우스는 인간 폴리오바이러스에 대해 감염성이 있어, 폴리오바이러스가 잘 증식한다.
본 발명의 검증 방법의 대상이 되는 재조합 사빈주는 당업계에 공지된 어떠한 사빈주도 가능하지만, 바람직하게는 본 발명자들에 의해 개발된 사빈주을 기본 구조로서 갖는 것이며, 이는 도 1에 도시되어 있다. 본 발명자들에 의해 개발된 사빈주를 기본 구조로 갖는 재조합 사빈주는 Tg-PVR 마우스에서 혈청형 간에 어떠한 교차 반응도 유발하지 않기 때문에 혈청형-특이 면역 반응을 조사하는 데 매우유용하다.
본 발명의 검증 방법에서, 상기 접종은 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으나, 접종을 한 경우 항체 유도능 등의 측면에서, 뇌내 또는 근육내 주입으로 실시하는 것이 효율적이며, 상기 감염도 뇌내 또는 근육내 주입으로 실시하는 것이 효율적이다. 보다 바람직하게는 상기 접종 및 감염은 근육내 주입이며, 이는 근육내 주입이 접종이 편리하고, 반복 접종을 할 때 오차가 가장 적기 때문이다.
상기 접종되는 재조합 사빈주의 양은 1 x 105- 5 x 107TCID50이 바람직하며, 보다 바람직하게는 2 x 106- 2 x 107TCID50이고, 가장 바람직하게는 약 1 x 107TCID50이다. 상기 감염되는 야생형 폴리오바이러스의 양은 1 x 105- 5 x 107TCID50이 바람직하며, 보다 바람직하게는 2 x 106-2 x 107TCID50이고, 가장 바람직하게는 약 1 x 107TCID50이다.
본 발명의 검증 방법에서, 이용되는 형질전환 마우스는 각각의 폴리오바이러스 혈청형 사이에 어떠한 교차 면역 및 교차 예방 효과를 나타내지 않기 때문에, 비특이 반응이 거의 없어 사람에서와 유사한 방어면역 효력시험을 기대할 수 있다.
따라서, 본 발명의 동물모델 검증 방법을 이용하는 경우에는 단시간에 보다 편의적으로 예방 백신주를 선별할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험 재료
1. 플라스미드 및 E. coli 균주
사빈 1형 폴리오바이러스의 cDNA는 Jung, H. 및 Y.-S. Bae,J. Biochem. Mol. Biol.31:432-443(1998)에 개시된 방법에 따라 제작된 RPS-Vax 벡터 (기탁번호: KCTC 0365BP, 기탁명: pTZ-PVS-3m)에 있는 것을 사용하였다. 상기 cDNA는 3Cpro(AXXQ/G)에 대한 인위적 절단 부위 및 다중 클로닝 부위(SstⅡ, HpaⅠ 및EagI 절단 부위)를 포함하는 30 bp의 폴리링커를 갖는다 (참조: 도 1). 일반적인 PCR 생성물 클로닝과 시퀀싱에는 pGEM-T easy 벡터 (Promega)를 사용하였다.E. coli균주로는 비교적 성장 속도가 느린 반면 큰 크기 (11 kb)의 플라스미드를 안정적으로 증폭할 수 있는 JM109 (Stratagene)를 사용하였다. 배지는 LB (1% 박토 트립톤, 1% 이스트 추출물 및 0.5% NaCl; Difco)이며 선택 표지로서 암피실린 (50 ㎍/㎖)을 첨가하여 37℃에서 배양하였다. 그리고, PCR을 통한 항원 유전자의 증폭에는 프루프-리딩 기능이 있는 PWO 효소 (Roche)를 사용하였으며, 플라스미드 분리에는 RNase 오염이 적은 Wizard mini prep 키트 (Promega)를 사용하였다.
2. 바이러스 및 세포주
폴리오바이러스 사빈 1 바이러스는 pTZ-PVS 플라스미드를 T7 RNA 중합효소로in vitro전사 방법으로 합성된 RNA를 DEAE-덱스트란 방법으로 HeLa 세포에 트랜스펙션하여 얻었다. 사빈 2형 및 3형은 POLIOVAX ((주) 녹십자)를 HeLa 세포에 감염시킨 후 단일 플라크 분리로 확보하였다. 야생형 폴리오바이러스 중 1형, 마호니는 Nomoto 박사 (동경대, 일본국)에서 분양 받은 플라스미드를 HeLa 세포에 트랜스펙션하여 확보하였다. ATCC로부터 야생형 2형:W-2 (cat#. VR-301, TN주가 약독화된 것이기는 하지만 Tg-PVR 마우스에서 신경 병원성을 나타내는 것), 랜싱 (cat#: VR-1002) 및 3형:레온 (cat#. VR-62, VR-1004)을 구입하였으며, 각 바이러스에 대한 원숭이 혈청도 함께 구입하여 실험에 사용하였다. HeLa 세포는 모든 폴리오바이러스의 증식과in vitro중화항체 분석에 사용하였으며, 10% FBS (GiBcoBRL)가 혼합된 DMEM (GiBcoBRL)을 이용하여 5% CO2, 37℃에서 습윤 배양하였다. 특히 동물 실험에 사용된 폴리오바이러스의 증식에는 무혈청 배지 (OPTI-MEM I: GiBcoBRL)를 이용하였다.
3. 형질전환 마우스
ICR 마우스에 인간의 PVR 유전자가 형질전환된 Tg-PVR 마우스는 Nomoto 박사(동경대, 일본국)로부터 분양 받아, 생명공학연구소 (대한민국) 실험동물 연구실 현병화 박사 팀에서 증식시키고, PCR을 통하여 PVR 유전자가 확인된 마우스를 실험에 사용하였다. 증식과정에서 약 80% 이상의 자손 마우스가 PVR 유전자를 안정적으로 유지하여 정기적으로 공급받을 수 있었다. 항체 생산용 BALB/c 마우스는 한국 화학연구소에서 구입하여 사용하였다.
4. 에피토프 펩타이드 및 항혈청
(1) 폴리오바이러스 항혈청의 혈청형 특이성
5 x 106TCID50투여량의 야생형 2형:랜싱 및 3형:레온 바이러스를 4 주령의 Tg-PVR 마우스에 근육내 접종한 후, 마우스에서 회백수염 (poliomyelitis)에 의한 마비가 일어날 때 (주사 후 3-7 일) 안구 정맥에서 혈액을 체취하여 항혈청을 분리하였다. 또한, 사빈 1, 2 및 3형의 바이러스에 대한 항혈청도 동일한 조건으로 접종하여 4주 후 분리하였다. 분리된 혈청은 웨스턴 블롯 및in vitro중화항체 분석 등에 사용하였다.
(2) 펩타이드-유도 항체
야생형 폴리오바이러스 2형 및 3형의 중화 에피토프 (주 항원성 부위 1)의 20 아미노산을 선정하고 C-말단에 시스테인을 추가하여 접합이 용이하도록 하였다. 21개의 아미노산은 항원성을 높이기 위한 BSA 또는 난알부민 접합 펩타이드 및 유리 펩타이드 형태로 합성하였다 ((주) PEPTRON). 합성된 펩타이드는 12% SDS-PAGE 상에서 접합 상태 및 농도를 확인한 후 실험에 사용하였다. 합성된 펩타이트의 아미노산 서열은 다음과 같다:
PV2-NEP (neutralizing eptiopte peptide): 랜싱 VP1 (92-111 a.a)
N'- A I I E V D N D A P T K R A S K L F S V C -C'
PV3-NEP: 레온 VP1 (92-111 a.a)
N'- I E V D N E Q P T T R A Q K L F A M W R C -C'
각각의 BSA 접합 펩타이드 50 ㎍를 완전 아쥬번트 (cat#:F-5881, SIGMA)와 1:1 부피비로 혼합하고 초음파발생기로 충분히 혼합한 후 4 주령의 BALB/c 마우스의 피하로 1차 면역하고, 2주 후에 동일 양의 단백질을 불완전 아쥬번트 (cat#:F-5506, SIGMA)와 혼합하여 피하 또는 복강으로 2차 면역시켰다. 동일한 방법으로 9일에서 2주 간격으로 3차 및 4차 면역을 수행한 후 최종 면역 5일 후에 안구 정맥에서 채혈하여 항혈청을 분리하여 실험에 사용하였다.
실험 방법
1. RPS-Vax 벡터에 에피토프 유전자의 클로닝
ATCC에서 구입한 폴리오바이러스 2형:W-2 균주 및 랜싱, 그리고 3형:레온 바이러스의 VP1 에피토프를 포함한 여러 형태의 유전자를 각각 RPS-Vax 시스템에 재조합하여 RPS/PV2 및 RPS/PV3를 합성하였다. 또한, 2형 및 3형 폴리오바이러스의VP1 에피토프를 합쳐서 만든 키메라 에피토프를 설계하여 RPS-Vax 시스템에 삽입하였으며, 이러한 재조합 RPS-Vax로부터 생성된 키메릭 바이러스의 증식속도, 계대배양 시 클로닝된 유전자의 안정성, 물리화학적 안정성 등을 여러 가지 분자생물학 및 면역학적인 방법으로 분석하여 백신 후보 물질들의 특성을 확인하였다. RPS-Vax 벡터에로의 클로닝은 도 2에 나타나 있다.
2. In vitro 전사
외부 유전자가 도입된 재조합 RPS-Vax 플라스미드를SalI으로 절단하여 선형 플라스미드로 만든 다음, 페놀/클로로포름 추출, 에탄올 침전 과정을 3번 반복해 RNase 오염 가능성을 최소화하였다. 반응용액 (40 mM Tris-Cl; pH 8.0, 8 mM MgCl2, 2 mM 스퍼미딘, 25 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 unit/㎕ RNasin, 각각의 NTP 2 mM)에 0.1 ㎍/㎕의 선형 DNA와 5 units/㎕의 T7 RNA 중합효소를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이어, 페놀/클로로포름으로 여러 차례 추출한 다음 에탄올로 침전시켜 최종 재조합 RNA 전사체를 수득하였다.
4. 동물 세포에 트랜스펙션
DEAE-덱스트란 방법 (Van der Welf et al.,PNAS83:2330-2334(1986))을 이용해 HeLa 세포에 재조합 RNA 전사체를 트랜스펙션 시켰다. 1-2 ㎍의 RNA 0.2 ㎖을 동일 부피의 DEAE-덱스트란 (1 mg/㎖ in HEPES-buffered saline)과 혼합한 다음, 70% 정도 성장한 단일층 세포에 이 용액을 도포하여 상온에서 15분간 방치하였다. 그 후 세포를 PBS로 2회 세척하고 10% FCS가 함유된 DMEM으로 배양하여 2-3일 후 세포병변 효과를 확인하였다.
5. 바이러스 감염
100 mm 플레이트에 성장한 HeLa 세포 (3 x 106)를 PBS로 2번 세척한 후, 원하는 M.O.I (multiplicity of infection)가 되도록 적당량의 바이러스를 감염시켰다. 이때 바이러스가 세포에 붙도록 상온에서 1시간 동안 항온처리 하였고, 바이러스 흡착 후에 PBS로 2번 세포를 세척한 다음, 10% FBS가 함유된 DMEM 5 ㎖을 첨가하여 37℃, CO2항온기에서 배양하였다. 1일 후에 CPE (세포병변 효과)를 관찰하였다.
6. RT-PCR에 의한 삽입 유전자의 확인 및 유전적 안정성 조사
재조합 바이러스 증식시 각 계대 마다 M.O.I = 10으로 HeLa 세포에 감염시켰고, 감염된 세포를 37℃에서 18시간 동안 항온배양 하였다. 재조합 바이러스에 감염된 세포로부터 총 RNA를 페놀-클로로포름 추출과 에탄올 침전로 수득하였다. cDNA 합성은 10 ㎍의 세포질 총 RNA를 1 ㎍의 프라이머와 혼합시킨 후, 70℃에서 10분 동안 변성시킨 후, 즉시 얼음에 옮기고 여기에 역전사효소 반응용액 (50 mM Tris·HCl pH 8.3, 65 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM dNTP 혼합물, 20 유니트 RNAsin)과 200 유니트의 MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) 역전사효소를 첨가한 후 42℃ 60분간 반응시켰다. 반응이 완전히 끝난 후 100℃에서 3분간 항온처리하여 효소를 불활성화 시켰다. PCR 증폭은 사빈 1 프라이머 (680-697/센스 및 797-814/안티센스, 2545-2528/안티센스)를 사용하였으며 삽입된 유전자 서열이 포함된 폴리오바이러스 지놈 영역을 증폭하였다 (도 8). PCR은 PERKIN ELMER 9700 기기를 사용하였으며 Taq 중합효소를 이용하여 94℃, 30sec; 45℃, 30sec; 72℃, 45sec; 총 25 사이클을 수행하였다.
7. 웨스턴 블롯 분석에 의한 패시지 안정성 조사
HeLa 세포를 사빈 1형 및 재조합 폴리오바이러스 (M.O.I=10)로 감염시킨 후, 37℃에서 24시간 동안 항온 배양한 후 세포를 수확하였다. 세포를 적당량의 PBS로 재현탁한 후 동일 부피의 2x 시료 완충액 (62.5 mM Tris-Cl pH 6.8, 10% 글리세롤, 2% SDS, 1% β-머르캅토에탄올, 브로모페놀 블루 및 크실렌 시아놀 0.01 ㎎/㎖)를 첨가하여 100℃에서 10분 동안 끓이고 핵은 원심분리에 의해서 제거하고, 총 분해액의 단백질 중 일부를 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔을 통해 전기영동 하였다. 분리된 단백질 밴드를 반-건조 겔 전이 장치 (Bio-Rad)를 사용하여 니트로셀룰로오스 막에 옮겼다. 이 막을 마우스 폴리오바이러스 항혈청과 OPV로 예방접종을 받은 사람의 폴리오바이러스 항혈청으로 각각 1차 반응시켰고, 여기에 알카린 포스파타아제 (AP)로 접합된 염소-항-마우스 (혹은 인간)-IgG로 2차 반응시킨 다음, 막을 NBT/BCIP가 첨가된 알칼린 포스파타아제 반응용액에 옮겨 밴드를 확인하였다.
8. 단일 플라크 분리
OPV (oral polio vaccine: Sabin)를 HeLa 세포에 1 x 102TCID50으로 감염시키고, 1.5% 메틸 셀룰로오스가 포함된 반 고형 배지로 3일 동안 배양한 후 현미경 하에서 다양한 크기와 형태의 플라크를 분리하는 방법으로 플라크 정제를 수행하였다. 분리된 바이러스 RNA를 사빈 1 [센스(680-697), 안티센스(814-796); 135 bp], 사빈 2 [센스(681-699), 안티센스(950-933); 270 bp] 및 사빈 3 [센스(723-740), 안티센스(961-942); 239 bp]- 형 특이 프라이머를 이용한 RT-PCR로 타입을 결정하여 순수한 사빈 1, 2 및 3형의 백신주로서의 폴리오바이러스를 확보하였다.
9. Tg-PVR 마우스를 이용한 동물 실험
(1) 폴리오바이러스 사빈 1형의 Tg-PVR에 대한 접종 조건 정립
폴리오바이러스 사빈 1을 가지고 Tg-PVR 마우스에 대한 접종 조건을 확립하였다. 우선, 효과적인 접종 부위를 확인하였으며, 실험을 하기에 적절한 마우스의 월령, 적절한 바이러스의 접종량, 접종 후의 면역유도 확인에 필요한 최소한의 시간 등을 조사하여 실험 조건을 표준화하였다. 접종 부위는 뇌내, 척추내, 정맥내, 근육내, 피하내 및 복강내에 접종하고 경구로도 투여하여 항체 생성 여부를 확인하였다. 뇌내, 척추내 접종은 26 게이지 바늘에 30 게이지 바늘을 결합시킨 특수 주사기를 사용해야 접종시의 충격을 완충시킬 수 있었다. 정맥내, 피하내 및복강내 접종은 26 게이지 바늘을 사용하였다. 경구투여는 마우스용 존데를 사용하였다
(2) 본 발명의 RPS/r-OPV의 면역 유도능 연구
야생형의 폴리오바이러스가 Tg-PVR에 감염됐을 때 사람에서의 경우와 유사한 마비 증상을 보이며 치사율이 매우 높을 뿐만 아니라, 폴리오바이러스 각각의 혈청형에 대한 특이성이 높은 것으로 보고 (Koike, S.C. et al.,PNAS. USA, 88:951-955(1991)) 되고 있기 때문에 확실한 예방 동물 모델이 될 것으로 본 발명자들은 판단하였다. 따라서, RPS/r-OPV (recombinant-oral polio vaccine)에 의해 2형 및 3형에 대한 면역이 유도되었는지, 또는 폴리오바이러스 1형, 2형 및 3형 모두에 대한 면역을 유도할 수 있는지를 확인하였다.
10. In vitro 중화항체 분석
Tg-PVR 마우스의 뇌내, 근육내에 접종하여 만든 백신 유전자 단백질에 대한 혈청 (항체), 그리고 폴리오바이러스의 야생형인 마호니, W-2, 랜싱 및 레온과 이들의 백신주인 사빈 1, 2 및 3형의 바이러스를 혼합하여 중화능을 확인하였다. 96-웰 배양 플레이트 상에서 표준 마이크로타이터 분석 방법에 따라in vitro중화 분석을 수행하였다. 각 혈청형의 항체와 대조군 혈청 (Tg-PVR 마우스로부터 얻은 정상 혈청 및 위약)을 희석하여 연속 희석된 바이러스와 혼합하고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 중화 Ab에 의해 바이러스가 중화되었는지의 여부를 확인하기 위하여, 숙주 세포인 HeLa 세포를 웰 당 1 x 103으로 첨가하여 3일간 배양한 후 1% 크리스탈 바이롤렛으로 염색하여 세포병변을 확인하였다. 동시에 각 바이러스의 정량실험을 수행하여 중화된 바이러스 타이터를 측정하였다.
11. 폴리오바이러스에 의한 예방
Tg-PVR 마우스를 3 그룹으로 나누었다. 1 그룹은 양성 대조군으로 경구용 백신주인 사빈 1, 2 및 3형의 바이러스를 Tg-PVR 마우스에 감염시켜 면역을 유도한 군이고, 2 그룹은 본 발명의 MucOra-Vax/rec-OPV 를 혼합하여 근육 내에 각각 접종하여 폴리오바이러스에 대한 면역을 유도한 군이다. 3 그룹은 폴리오바이러스 사백신 (IPV)으로 면역을 유도한 군이다. 폴리오바이러스의 야생형인 마호니, 랜싱 및 레온을 1 x 107TCID50양으로 감염시켜 발병 또는 예방 여부를 확인하였다.
실험 결과
1. 서로 다른 항혈청을 이용한 혈청형 특이성 분석
1. 1 폴리오바이러스 항혈청을 이용한 폴리오바이러스 항원의 웨스턴 블롯 분석
Tg-PVR 마우스에 야생형의 2 형 및 3형 폴리오바이러스를 접종하여 얻은 항혈청을 사용하여 각 혈청형의 접합 에피토프 펩타이드 및 바이러스에 감염된 HeLa 세포 파쇄물을 타깃으로 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 전체 VP1을 포함한 바이러스 단백질이 혈청형에 특이적으로 반응함을 확인하였다. 그러나, 도입한 중화 에피토프 펩타이드는 항혈청과 거의 반응하지 않는 것으로 보아, 이 바이러스 항혈청이 선형의 에피토프를 인식하는 Ab는 포함하고 있지 않음을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명자가 도입한 폴리오바이러스 중화 에피토프는 컨포메이션 에피토프이므로, 재조합 RPS-Vax가 발현하는 컨포메이션 (중화) 에피토프는 바이러스 항혈청으로 수행하는 웨스턴 블롯으로는 검색이 용이치 못함을 확인하였다 (도 3).
1.2 에피토프 펩타이드-유도 항혈청에 의한 웨스턴 블롯 분석
야생형 폴리오바이러스 2형 및 3형의 VP1 중화 에피토프를 BSA-접합 펩타이드로 합성하고 이를 BALB/c 마우스에 면역하여 제작한 폴리클로날 Ab (이하, "pAb")가 실제 웨스턴 블롯 상에서 각 혈청형별 바이러스의 VP1 단백질을 인식할 수 있는지를 조사한 결과 각각의 에피토프 유래 항혈청이 혈청형별 야생주 및 백신주 바이러스의 VP1을 잘 인식함을 확인하였다 (도 4).
PV2-NEP 펩타이드로 제작한 pAb는 사빈 2형 바이러스, W-2주 (2형 야생주) 및 랜싱주와 랜싱주를 계대배양 한 것의 VP1을 잘 인식하였으며 (도 4의 패널 A) PV3-NEP 펩타이드로 제작한 pAb는 사빈 3형 바이러스, 3형 레온주 (VR-1004), 레온주 (VR-62) 및 레온 (VR-62)의 계대배양한 것의 VP1을 효과적으로 인식하였다 (도 4의 패널 B).
이 실험을 통하여 에피토프 펩타이드를 이용한 Ab 제작과, 각 혈청형의 pAb가 본 발명의 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터에서 재조합 항원의 발현 및 발현된 재조합 항원의 안정성 (단백질 폴딩) 여부를 확인하는 실험에 적합함을 확인할 수 있었다.
1.3 중화 항체는 컨포메이션 에피토프를 인식함을 확인
바이러스 또는 에피토프를 면역하여 얻은 항혈청이 야생형의 각 혈청형 폴리오바이러스의 중화 에피토프를 인식하여 바이러스를 중화할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 96-웰 배양 플레이트 상에서 표준 마이크로타이터 분석 방법에 따라in vitro중화 분석을 수행하였다.
각 혈청형의 Ab와 대조군 혈청 (Tg-PVR로부터 얻은 정상 혈청) 을 1:100으로 희석하여 연속 희석 (1:5)된 랜싱 또는 레온 바이러스와 혼합하고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 항혈청에 포함된 중화항체에 의해 바이러스가 중화되었는지의 여부를 확인하기 위하여, 숙주 세포인 HeLa 세포를 웰 당 1 x 103으로 첨가하여 3일간 배양한 후 1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 세포 파괴여부를 확인하였다. 동시에 각 항혈청의 중화항체 활성 정도를 비교한 결과, 항-바이러스 혈청만이 강력한 혈청형 특이 중화항체 활성을 보였으며 펩다이드로 제작한 항혈청은 전혀 중화항체 활성을 보이지 않았다 (도 5). 이는 폴리오바이러스 중화항체는 특정 구조를 인식하는 항체임을 시사하며, 반면에 선형 에피토프는 인식하지 못함을 알 수 있었다. 본 실험 결과는 다음 표 1에 요약되어 있다:
항 원혈 청 웨스턴 블롯 폴리오바이러스 중화
바이러스 VP1 에피토프 펩타이드
바이러스 감염된 Tg-PVR 마우스 혈청 + - +
펩타이드 면역화된 BALB/c 마우스 혈청 + + -
2. 혈청형 간의 항체 특이성 조사
RPS-Vax/OPV의 개발 목적은 OPV에 포함된 백신형 폴리오바이러스 중 VAPP를 유발하는 사빈 2와 3의 중화 에피토프를 RPS-Vax 시스템에 재조합하여 3가지 혈청형 모두를 중화할 수 있는 안전한 경구용 소아마비 백신을 개발하는데 있다. 또한, 이 백신의 예방 효과를 확인하기 위한 전임상 동물 모델로서 Tg-PVR 형질전환 마우스의 사용 가능성 여부를 확인하는데 있다. 따라서, 정확한 예방 효과를 확인하기 위해서는 RPS-Vax 벡터의 모체인 사빈 1형에 의해 유도되는 면역성이 사빈 2형 또는 3형에 교차 중화 면역이 없어야 한다.
2.1 웨스턴 블롯에 의한 교차 면역 시험
교차 면역 반응의 여부를 검증하기 위해 사빈 1형, 2형 및 3형의 바이러스를 Tg-PVR 마우스에 뇌내 경로로 접종한 후 항혈청을 분리하여 웨스턴 블롯을 수행하였다 (도 6a). 보유하고 있는 각 혈청형의 모든 바이러스를 대상으로 조사한 결과, 사빈 1, 2, 3형 각각의 항혈청은 각 혈청형의 VP1을 효과적으로 인식하였으며,혈청형 간의 교차반응은 전혀 나타나지 않았다.
한편, 야생형 폴리오바이러스, 마호니, 랜싱 그리고 레온주의 바이러스를Tg-PVR 마우스에 접종하여 제작한 항혈청을 이용하여 혈청형 간에 교차-반응성 여부를 웨스턴 블롯 방법으로 조사하였다 (도 6b). 경구용 소아마비 백신인 OPV를 접종한 사람의 항혈청은 모든 야생형 폴리오바이러스 VP1을 효과적으로 인식하는 반면에, 각 혈청형별 마우스 항혈청은 각 각의 혈청형 바이러스의 VP1만을 특이하게 인식하고 교차반응이 없음을 웨스턴 블롯 실험에서 확인하였다.
2. 2 교차-중화 활성 시험
웨스턴 블롯으로 확인한 혈청형 특이 면역반응이 실제 바이러스 중화에도 유효한지를 검증하기 위해,in vitro중화항체 분석을 수행하였다. 교차 면역 반응에 따른 교차 중화 여부를 확인하기 위해, 상기 웨스턴 블롯에 사용한 항혈청을 1:100으로 희석하여 마호니, 랜싱 그리고 레온주의 폴리오바이러스를 대상으로 시험한 결과 RPS-Vax의 근원인 사빈 1형의 항혈청에는 2형과 3형의 바이러스를 중화하는 교차-중화항체가 전혀 없음을 확인할 수 있었다 (표 2).
그러므로, RPS-Vax 벡터의 재조합 백신인 개량형 OPV는 Tg-PVR 마우스를 이용한 전임상 동물 실험에서 교차 면역반응에 의한 비특이적 반응이 없이 정확한 방어면역 효과를 측정할 수 있음을 확인하였다
타겟 폴리오바이러스 항혈청
배지 사빈-1 사빈-2 사빈-3
마호니 0 2900 3 3
랜싱 0 9 2750 9
레온 0 3 0 3120
3. 컨포메이션 에피토프의 디자인 및 발현
3.1 폴리오바이러스 2형 및 3형의 컨포메이션 에피토프 맵핑 및 디자인
기존의 연구 결과에 따르면, 폴리오바이러스는 바이러스 부착 부위에 깊게 패인 캐년이 있어 이 부분에 세포 표면의 폴리오바이러스 수용체가 결합하므로 중화 항체가 정확히 이러한 결합 부분을 차단하지 않으면 중화가 잘 되지 않는 것으로 알려져 있다. 각 혈청형 별 폴리오바이러스의 중화 에피토프는 잘 밝혀져 있으나, 본 발명자의 반복적인 실험 결과에 의하면 이러한 에피토프를 완전히 포함하는 비교적 큰 유전자를 발현시켜 실험 동물에서 항혈청을 얻어도 중화 항체 역가가 매우 낮거나 거의 중화력을 나타내지 않는다. 이와 같은 결과는 폴리오바이러스의 중화 에피토프가 정확한 구조를 이룰 때만 중화력을 나타내는 중화 항체를 유도할 수 있음을 시사한다.
따라서, 본 발명자들은 중화 항체를 유도할 수 있는 컨포메이션 에피토프를 디자인하기 위하여, 분자 모델링 및 소수성 (hydropathy) 조사를 하였다. 우선,본 발명자들은 폴리오바이러스와 그의 수용체 (PVR: human poliovirus receptor) 결합 구조에 대한 결정으로부터 얻어진 NMR 데이터와 아미노산서열의 소수성 조사를 기초하여, 기존에 알려진 중화 에피토프를 포함하면서 도입된 단백질이 발현 시 하나의 도메인으로 폴딩되어 천연 (native)의 에피토프의 구조를 유지할 수 있는 부위를 후보 서열로 선별하였다.
첨부한 도 7a 및 도 7b는 디자인 과정에서 상술한 기준에 따라 선별된 서열중 일부를 나타내는 것이다. 도 7a 및 도 7b에서 쉐이드 (shade) 서열 중 단서열은 HIV-1의 태트(Tat) 단백질로부터 유래된 PTD (protein transduction peptide)를 나타내는 것이고, 장서열은 Tag 서열을 나타내는 것이다. 이용된 상기 PTD의 서열은 YGRKKRRQRRR 이고, Tag 서열은 SMTGG QQMGR DLYDD DDKDR WGS 이다.
3.2 항원 유전자 (삽입 서열)의 발현 및 유전적 안정성
ATCC에서 구입한 폴리오바이러스 2형:W-2 또는 랜싱주, 타입 3:레온주를 HeLa 세포에 형질감염시켜 37℃에서 18시간 동안 항온 배양하였고, 각각의 계대마다 MOI = 10으로 형질감염시켰으며, 또한 각각의 계대마다 폴리오바이러스를 수확하여 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전 방법으로 총 RNA를 얻었다. 이어, VP1 유전자의 cDNA를 얻기 위하여, 10 ㎍의 총 RNA를 1 ㎍의 프라이머 (5'-TTT TTT TTT TTT TTT TTT-3')와 혼합시킨 후 70℃에서 10분간 변성시키고, 즉시 얼음에 옮긴 다음, 여기에 역전사효소 반응용액 (50 mM Tris·HCl pH 8.3, 65 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM dNTP 혼합물, 20 units RNAsin)과 200 unit의 MMLV (Moloney Murine Leukemia virus) 역전사효소를 첨가한 후 42℃에서 60분간 반응시켰다.
그런 다음, 에피토프 맵핑을 통하여 분석된 자료를 토대로 2형 및 3형 그리고 2형과 3형을 혼합할 항원 유전자를 결정한 후 클로닝 효소 부위 (SstII,EagI)가 포함된 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다. PCR은 퍼킨 엘머사 9700 기기를사용하였으며, 중합효소는 베링거만하임사로부터 구입한 PWO DNA 중합효소(Cat#:1644947)를 사용하였고, 대체적으로 어닐링은 47℃에서 30초, 연장반응은 72℃에서 1분, 변성은 94℃에서 30초간으로 하여 총 25 사이클을 수행하였다. 이용된 프라이머의 서열은 다음과 같다:
PV2-138/s (ATT ATTCCg CggCAC gTC ATC CAA AAg Cg),
PV2-138/a (AAT ATACgg CCgAAT gCC CAC gTA ggg CA),
PV3-138/s (ATT ATACCg CGgCAC gTA gTC CAA CgA Cg), 및
PV3-138/a (ATA TTACgg CCgggC TAA CCC CAC gTA Tg).
PCR 증폭물 각각을 RPS-Vax의 다중 클로닝 부위의SstⅡ(NEB, Cat#:157S) 및EagI(NEB, Cat#:505S) 절단 부위에 삽입시킨 다음, 대장균 JM109 숙주 균주(STRATAGENE, Cat#;200235)에서 증폭하여 RPS/r-OPV 후보주를 생산하였고, 이러한 후보 백신들의 도입한 유전자와 이들의 발현 여부를 조사하였다 (도 8). 또한 도 9에서 확인할 수 있듯이, 백신 후보주인 RPS-Vax/PV2-138 및 RPS-Vax/PV3-138 재조합 바이러스는 지속적 계대 시에도 우수한 유전적 안정성을 나타내었다.
4. Tg-PVR 마우스를 이용한 효능 실험 가능성 조사
4.1 Tg-PVR 마우스에서 폴리오바이러스의 증식 확인
외부 항원 유전자가 재조합 되지 않은 RPS-Vax 벡터의 근원인 사빈 1 형을 Tg-PVR 마우스에 접종하면 2주 후부터 VP1에 대한 항체가 높게 나타나서 12주 이상지속되었다. 이때 접종한 바이러스의 양은 5 x 106TCID50이었다. 또한, 동일한 양의 사빈 1 형을 자외선(UV)으로 15분 간 처리하고 이 중 일부를 HeLa 세포에 감염시켜 감염 능력이 완전히 사라진 것을 확인한 후 정상 바이러스와 동일한 조건으로 Tg-PVR 마우스에 접종한 결과 폴리오바이러스에 대한 항체가 전혀 생성되지 않았다 (도 10c). 이 결과로 보아 사빈 1 형 폴리오바이러스가 Tg-PVR 마우스에서 잘 감염되고 생존시만 증식하여 항체를 생성하며 이 경우 소량의 바이러스 접종만으로도 효과적으로 면역을 유도함을 확인할 수 있었다. 그리고, ICR 마우스에서도 사빈 1 바이러스가 어느 정도의 증식이 이루어짐을 확인하였으나, PVR 형질전환 마우스에서 VP1에 대한 항체가 훨씬 더 높게 나타났으므로 PVR 효과를 확인할 수 있었다 .
4.2 최적의 접종 경로 및 접종량의 결정
Tg-PVR 마우스 3마리를 한 그룹으로 하여 같은 접종량의 RPS-Vax를 뇌, 정맥, 근육, 피하, 복강내, 표면 점막 및 구강 경로로 감염시키고, 1차로 6주 후에 각 그룹의 마우스로부터 혈청을 분리하여 웨스턴 블롯을 수행하여 VP1에 대한 항체형성 정도를 비교하였다. 그 결과 뇌, 정맥, 근육 그리고, 복강내 경로로 감염한 마우스에서 VP1에 대한 항체가 높게 유도됨을 관찰하였다 (도 10의 패널 A). 또한, 감염 12주 후에 2차 시험을 동일한 방법으로 수행한 결과에서도 유사한 결과가 확인되었다. 1차와 2차의 웨스턴 블롯 결과를 비교할 때 뇌와 근육 경로에서만항체의 양이 12주까지 유지됨을 확인하였다.
또한, 최적의 접종량을 결정하기 위하여 사빈 1 바이러스의 양을 2 x 103에서 2 x 107TCID50으로 증가시켜 가면서 근육 주사한 후 동일 방법으로 확인한 결과, 1 x 107TCID50이 가장 적합한 것으로 확인되었다 (도 10의 패널 B).
이 결과에 근거하여 Tg-PVR 마우스 면역은 접종의 편리성 및 오차의 최소화를 위하여 근육투여 하기로 결정하였다.
또한 동일한 양의 바이러스를 자외선을 조사하여 불활성화하고 이를 상기와 동일한 방법으로 마우스에 투여한 경우 VP1에 대한 항체를 전혀 유도하지 못하는 것으로 보아 VP1 특이 항체는 모두 바이러스 증식에 의해 유도된 것임을 확이하였다 (도 10의 패널 C).
5. 개량형 OPV의 동물 예방 모델 정립
5.1 대조군 백신 시험
교차 면역이 없는 것으로 확인된 사빈 1, 2 및 3을 대조군 백신으로 사용하여 Tg-PVR 마우스에 접종한 후 중화 항체 형성 유무를in vitro중화 분석으로 확인하였다. 또한, 각각의 야생형 폴리오바이러스를 3가지 혈청형의 백신을 접종한 마우스 그룹에 감염시킨 후, 회백수염 유무를 확인하여 예방 여부를 결정하였다. 실험 결과 방어면역력 확인 (challenge)에 적합한 야생형 폴리오바이러스의 투여량은 1 x 107TCID50이었으며 (LD50값의 5-10배), 백신 접종 부위와 같은 근육 주사가 감염에 가장 적합한 것으로 확인되었다. 실험 결과는 다음 표 3에 나타나 있다.
백신 감염 회백수염 발생률(%)(또는 사망) 예방
사빈-1 마호니 0 8/8
사빈-1 랜싱 100 0/11
사빈-1 레온 100 0/8
사빈-2 마호니 100 0/7
사빈-2 랜싱 6.7 14/15
사빈-2 레온 100 0/8
사빈-3 마호니 100 0/6
사빈-3 랜싱 100 0/6
사빈-3 레온 8.3 11/12
5.2 중화 항체 유도능 및 방어면역 분석
in vitro중화항체 분석 결과, 2형에서는 RPS/PV2-138과 RPS-PTD/PV2-138이, 3형에서는 RPS/PV3-138 후보 백신에서 가장 높은 중화 항체가 유도 되었음을 확인하였다 (도 11). 도 11의 패널 B에서 보는 바와 같이, RPS-Vax/PV2-110-Tag의 경우 불활화시킨 사빈 2형을 2차 추가 접종하여도 중화항체가 전혀 유도되지 않는 것으로 보아 불활화시킨 사빈 2형의 2차 접종만으로는 중화항체가 유도되지 않음을 알 수 있었다. 그러나, RPS-Vax/PV2-138 및 RPS-Vax/PV2-138-PTD를 면역 접종한 후 불활화 시킨 사빈 2형을 2회 추가 접종한 마우스에서는 사빈 2형 생백신을 3회 투여한 대조군의 60% 이상에 달하는 중화항체 가 생산되었다. 또한, 이러한 결과는 RPS-Vax나 RPS-Vax/PV3-110-Tag 재조합 바이러스를 면역접종 후 불활화시킨 사빈 3형을 2차로 추가 접종했을 때 야생형 레온주에 대한 중화항체가 유도되지 않았으나 RPS-Vax/PV3-138 재조합 백신주를 면역접종한 후 불활화한 사빈 3형을 2회 추가 접종했을 때는 사빈 3형 생백신을 3회 접종하여 유도한 중화항체의 80%에 달하는 중화항체가 유도되었다. 이는 RPS-Vax/PV2-138 이나 RPS-Vax/PV3-138 재조합 백신 투여 시 2 형과 3형에 대한 중화항체 생성 B 세포 클론이 만들어지고 이것이 불활화 사빈 2, 3형의 추가 접종에 의해 증폭되면서 2, 3형 각각에 대한 중화항체 생산이 효과적으로 유도된 것으로 판단된다. 그러나 2, 3형 각각의 불활화된 사빈 만으로 2회 접종한 대조군에서는 전혀 중화항체가 유도되지 않는 것으로 보아 유도된 중화항체는 불활화된 사빈 2, 3 형에 의해 새로 유도된 항체가 아님을 짐작할 수 있다.
또한 각각의 재조합 폴리오바이러스를 감염시킨 Tg-PVR 마우스에 각 혈청형 별 야생형 소아마비 바이러스 (마호니, 랜싱 및 레온)를 농도 별로 주입하여 키메릭 바이러스의 방어 면역 유도능을 조사하였다. 감염 후 10 LD50에서도 발병이 억제되는 그룹의 마우스를 조사하고 생체 내의 바이러스 생존 유무를 확인한 다음, 기존의in vitro실험 결과와 종합하여 최종적으로 방어 면역이 뛰어난 RPS/PV2-138 및 RPS/PV3-138 키메릭 바이러스를 섞어 재조합 소아마비 생백신 후보주 (RPS-Vax/r-OPV; 간략히 r-OPV)로서 선정하였다. 백신 후보주의 유전적 안정성, 중화 항체 유도능 및 예방능은 다음 표 4에 나타나 있다.
r-OPV 유전적 안정성(안정적 계대수) 웨스턴 블롯 중화 항체(3rd접종 이후) 생존율(challenge)
랜싱
RPS/PV2-127 >12 - N.A 0/3
RPS/PV2-110 >12 + - 0/6
RPS-Tag/PV2-110 >12 + - 0/6
RPS/PV2-118 >12 - N.A 0/6
RPS/PV2-138 >12 + +++ 9/9
RPS-PTD/PV2-138 >12 + +++ 9/9
레온
RPS/PV3-115 >12 - N.A 0/3
RPS/PV3-110 >12 + - 0/6
RPS-Tag/PV3-110 >12 + + 2/9
RPS/PV3-138 >12 + +++ 9/9
RPS-PTD/PV3-138 <4 + - 0/9
5.3 r-OPV 백신 프로그램 개발
5.3-1: 중화 항체 형성능 조사
개량형의 소아마비 백신 후보주 (RPS/PV2-138 및 RPS/PV3-138: r-OPV)들을 동일 접종량 (1 x 107TCID50)으로 혼합하여 Tg-PVR 마우스에 근육 주사를 통해 감염시키고 4주 후에 시판되는 IPV (inactivated polio vaccine: 아반테스 코리아, 0.5 ㎖/vial 1인 1회)를 농도를 달리하면서 2주 간격으로 2회 추가 접종하였다. 최종 접종 이후 10일이 경과한 다음, 마우스로부터 혈액을 채취하여 야생형 소아마비 바이러스 (마호니, 렌싱 및 레온) 각각에 대한 중화 항체유도 정도를in vitro중화항체 분석실험으로 확인하였다. 또한, 기존에 진행되고 있는 OPV-OPV-OPV 프로그램, IPV-IPV-IPV 프로그램 그리고 IPV-OPV-OPV 프로그램들에 대해서도 동일한 실험을 수행하였다.
실험 결과, 기존의 OPV-OPV-OPV 프로그램이 예상대로 중화항체 유도능이 가장 좋은 것으로 나타났으며 (참조: 도 12a 패널 A), r-OPV의 경우 이를 3회 투여 시는 2, 3형에 대한 중화항체가 전혀 유도되지 않았다 (참조: 도 12a 패널 B). 그러나, r-OPV 투여 후 15 ㎕ 이상의 IPV를 2회 추가 접종할 경우 레온에 대해서는 OPV-OPV-OPV 프로그램의 87%에 달하는 중화항체 유도능을 보였으며, 렌싱의 경우 양성 대조군인 OPV-OPV-OPV 프로그램의 75% 정도의 중화항체 유도능을 유도하였다 (참조: 도 12c). 그러나, IPV-IPV-IPV 만으로는 15 ㎕ 투여 시는 양성 대조군 (OPV-OPV-OPV 프로그램)에 비해 1/30 이하의, 그리고 25 ㎕ 투여에서도 양성 대조군에 비해 1/10 이하의 중화항체 밖에 유도하지 못하였다 (참조: 도 12b). 이러한 결과는 본 발명의 r-OPV 백신 프로그램 (r-OPV-IPV-IPV)이 2차 및 3차 부스팅 접종 시 기존 IPV-IPV-IPV 프로그램에 비해 극히 소량의 IPV만을 사용하여도, IPV-IPV-IPV 프로그램 그리고 IPV-OPV-OPV 프로그램 (미국에서 현재 권장하는 대체 프로그램) 보다 훨씬 효과적으로 중화 항체를 유도할 수 있음을 시사한다. 실재 본 발명자들의 실험에 따르면 IPV-OPV-OPV 프로그램의 경우 IPV의 농도를 높이면 OPV의 추가 접종효과가 오히려 현저히 떨어지는 현상을 발견하였으며, IPV의 농도를 낮출 경우 OPV로 추가 접종하면 중화항체 역가는 높아지나 이는 IPV에 의해 유도된 B 세포 클론이 증폭 되었다기 보다는 IPV가 거의 면역을 유도하지 못한 상태에서 OPV에 의해 면역이 유도되어 나타난 현상으로 이 경우 OPV에 의한 VAPP 문제는 여전히 해결되지 않은 상태로 남게된다. 본 연구자들의 반복 실험결과, 본 발명의 r-OPV 백신 프로그램에 의해 면역된 마우스로부터 얻은 중화 항체의 역가는 OPV-OPV-OPV 프로그램에 의해 유도되는 중화항체 역가에 거의 준하거나 최소한 80% 이상에 이르는 것으로 나타났다.
5.3-2: 예방 효과 조사
개량형의 소아마비 백신 후보주 (r-OPV; RPS/PV2-138 + RPS/PV3-138)를 동일 접종량 (1 x 107TCID50)으로 혼합하여 Tg-PVR 마우스에 근육 주사를 통해 감염시키고 4주 후에 사빈 1, 2 , 3형을 포르말린으로 불활화 한 sIPV (사빈유래 IPV)를 2주 간격으로 2회 접종한 후 1 x 107TCID50의 각 야생형 바이러스를 접종하여 방어면역 정도를 측정하였다. 또한, 기존에 진행되고 있는 OPV-OPV-OPV 프로그램, sIPV-sIPV-sIPV 프로그램 그리고 sIPV-OPV-OPV 프로그램들도 각각의 Tg-PVR 마우스 그룹으로 나누어 실험하였으며, VP1 중화 에피토프 치환 백신인 사빈-1/레온도 제작하여 비교 실험하였다. 감염시킨 후, 일정 기간 발병 여부를 관찰한 결과 r-OPV-sIPV-sIPV 프로그램에서 OPV 프로그램과 동일하게 100%의 방어면역을 확인하였다. 미국에서 현재 대체 프로그램으로 추천하고 있는 IPV-OPV-OPV 프로그램의 효과를 보기 위해, sIPV-OPV-OPV 방법으로 면역하였을 때도 상당한 방어면역 효능을 보였으나, OPV-OPV-OPV 프로그램에 비해 충분한 중화항체를 유도하지 못하였으며 (15%) 랜싱주 실험에서 5마리 중 한 마리가 마비를 보이며 사망하였다. 그리고 치환 백신인 사빈-1/레온에서도 부분적으로나마 예방 효과가 있었으나, sIPV-sIPV-sIPV로 접종한 마우스 그룹은 단 한 마리도 방어면역을 보이지 않고 모두 1주일 이내에 사망하였다. 이는 본 실험에 사용한 sIPV가 사빈 1, 2 및 3형을 포르말린으로 불활화하여 자체 제작하는 과정에서 면역에 사용할 만큼 충분한 양을 얻지 못하여 추가 접종시에 충분한 양을 사용하지 못하였기 때문일 가능성도 있으나, 동일한 양의 sIPV를 사용한 rOPV-sIPV-sIPV에서는 충분한 중화항체가 유도되고 방어면역을 유도하는 것으로 보아 투여한 sIPV가 1차 면역 시에는 충분한 면역을 유도하지 못하지만 rOPV로 1차 면역을 유도하여 2, 3형에 대한 B세포 클론이 만들어진 마우스에 추가접종 시에는 효과적으로 부스팅(boosting) 면역을 유도함을 확인하였다.
실험 결과는 다음 표 5에 나타나 있다.
백신 면역화 예방 중화항체역가*
1st 2nd 3rd 마호니주 랜싱주 레온주 (%)**
사빈-1, 2 및 3(OPV) 사빈-1, 2 및 3(OPV) 사빈-1, 2 및 3(OPV) 12/12 12/12 12/12 100
사빈-1, 2 및 3(sIPV***) 사빈-1, 2 및 3(OPV) 사빈-1, 2 및 3(OPV) 6/6 5/6 6/6 15
사빈-1, 2 및 3(sIPV) 사빈-1, 2 및 3(sIPV) 사빈-1, 2 및 3(sIPV) 0/3 0/3 0/3 0
RPS-Vax (사빈-1) 사빈-1, 2 및 3(sIPV) 사빈-1, 2 및 3(sIPV) 6/6 0/6 0/6 0
r-OPV 사빈-2 및 3(sIPV) 사빈-2 및 3(sIPV) 6/6 6/6 6/6 >80
사빈-1/레온(키메라) 사빈-1/레온(키메라) 사빈-1/레온(키메라) 3/3 0/3 2/6 30(레온)
*3개의 혈청형모두를 동시에 사용하여 중화항체 역가를 측정
** OPV-OPV-OPV 프로그램의 중화항체 역가를 100%로 하여 환산함
*** sIPV: 사빈주를 본 발명자들이 포르말린으로 불활화 시킨 IPV
현재 구미 선진국을 중심으로 OPV-OPV-OPV 프로그램은 VAPP 유발로 인한 안전성의 문제로 사용이 기피되고 있는 추세이다. 또한, 많은 추가 비용이 소요되는 IPV-OPV-OPV 프로그램도 IPV를 먼저 접종하므로, IPV에 의해 유도된 중화력 때문에 오히려 생백신의 효능이 떨어질 가능성이 크며, 또한 이 경우 살아있는 사빈-2와 사빈-3를 사용하므로 여전히 VAPP의 위험성이 남아 있다. 반면, r-OPV 프로그램은 2, 3형의 구조 에피토프만을 사용하고 살아있는 사빈-2 형과 사빈-3형을 사용하지 않으므로 안전성이 뛰어나며, 예방 효능도 높다. 또한 현재 구미지역에서 사용하고 있는 IPV-IPV-IPV 프로그램의 경우 효능도 떨어질 뿐 아니라 백신제조를 위해 상당량의 야생형 바이러스를 생산하여야 하나 (10 ℓ배양으로 15명 투여), rOPV-IPV-IPV 프로그램으로 대체할 경우 상기에서 본 바와 같이 소량의 바이러스 만으로도 OPV 프로그램 수준의 충분한 면역을 유도할 수 있어 상당 수준 생산원가를 줄이는 면에서도 매우 경제적이다. 그러므로 본 발명을 통해 개발된 r-OPV-IPV-IPV 프로그램은 기존의 소아마비 백신 프로그램의 여러 가지 단점을 보완한 새로운 백신 프로그램으로 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터, 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 백신 조성물, 폴리오바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법 및 폴리오바이러스의 감염에 대한 재조합 사빈주의 예방 효과를 검증하는 방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 소아마비 생백신은 사빈 1형의 주형에 2, 3형의 중화 컨포메이션 에피토프를 코딩하는 유전자 서열을 갖고 있기 때문에, 1, 2 및 3형에 대한 중화 항체 유도능력이 우수할 뿐 아니라 OPV의 부작용을 배제할 수 있으므로 폴리오바이러스 감염에 대한 새로운 개량형 예방 생백신을 제조하는 데 유용하다.

Claims (25)

  1. 다음을 포함하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터:
    (a) 사빈 1형 폴리오바이러스의 지놈 뉴클레오타이드 서열;
    (b) 추가적인 폴리오바이러스 프로테아제 절단 위치를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및
    (c) 상기 추가적인 폴리오바이러스 프로테아제 절단 위치를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결되어 있고, 폴리오바이러스 2형 또는 3형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열을 최소 서열로 포함하는 컨포메이션 에피토프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 추가적인 폴리오바이러스 프로테아제 절단 위치는 폴리오바이러스 3C 프로테아제 또는 2A 프로테아제가 작용하는 절단 위치인 것을 특징으로 하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 추가적인 폴리오바이러스 프로테아제 절단 위치는 폴리오바이러스 3C 프로테아제가 작용하는 절단 위치인 것을 특징으로 하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리오바이러스 2형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 1 서열에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 서열인 것을 특징으로 하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 폴리오바이러스 2형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열을 최소 서열로 포함하는 컨포메이션 에피토프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 폴리오바이러스 2형의 VP1 서열에서 아미노산 65-202를 코딩하는 서열인 것을 특징으로 하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리오바이러스 3형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 2 서열에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 서열인 것을 특징으로 하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 폴리오바이러스 3형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열을 최소 서열로 포함하는 컨포메이션 에피토프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 폴리오바이러스 3형 VP1 서열에서 아미노산 63-200를 코딩하는 서열인 것을 특징으로 하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터.
  8. 다음을 포함하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 백신 조성물:
    (a) 상기 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 재조합 폴리오바이러스 벡터로부터 유래된 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스; 및
    (b) 약제학적으로 허용되는 담체.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스는 (ⅰ) 폴리오바이러스 2형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열을 최소 서열로 포함하는 컨포메이션 에피토프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스; 및 (ⅱ) 폴리오바이러스 3형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열을 최소 서열로 포함하는 컨포메이션 에피토프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스의 혼합물인 것을 특징으로 하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 백신 조성물.
  10. (a) 다음의 서열을 포함하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 벡터로부터 유래된 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스 백신 조성물을 포유동물에게 투여하여 폴리오바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법:
    (ⅰ) 사빈 1형 폴리오바이러스의 지놈 뉴클레오타이드 서열;
    (ⅱ) 추가적인 폴리오바이러스 프로테아제 절단 위치를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및
    (ⅲ) 상기 추가적인 폴리오바이러스 프로테아제 절단 위치를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결되어 있고, 폴리오바이러스 2형 또는 3형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열을 최소 서열로 포함하는 컨포메이션 에피토프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 추가적인 폴리오바이러스 프로테아제 절단 위치는 폴리오바이러스 3C 프로테아제 또는 2A 프로테아제가 작용하는 절단 위치인 것을 특징으로 하는 폴리오바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 추가적인 폴리오바이러스 프로테아제 절단 위치는 폴리오바이러스 3C 프로테아제가 작용하는 절단 위치인 것을 특징으로 하는 폴리오바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 폴리오바이러스 2형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 1 서열에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 서열인 것을 특징으로 하는 폴리오바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 폴리오바이러스 2형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열을 최소 서열로 포함하는 컨포메이션 에피토프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 폴리오바이러스 2형의 VP1 서열에서 아미노산 65-202를 코딩하는 서열인 것을 특징으로 하는 폴리오바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  15. 제 10 항에 있어서, 상기 폴리오바이러스 3형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 2 서열에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 서열인 것을 특징으로 하는 폴리오바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 폴리오바이러스 3형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열을 최소 서열로 포함하는 컨포메이션 에피토프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 폴리오바이러스 3형의 VP1 서열에서 아미노산 63-200를 코딩하는 서열인 것을 특징으로 하는 폴리오바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  17. 제 10 항에 있어서, 상기 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스는 (ⅰ) 폴리오바이러스 2형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열을 최소 서열로 포함하는 컨포메이션 에피토프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스; 및 (ⅱ) 폴리오바이러스 3형의 VP1의 중화 에피토프를 코팅하는 뉴클레오타이드 서열을 최소 서열로 포함하는 컨포메이션 에피토프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스의 혼합물인 것을 특징으로 하는 폴리오바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 방법은 사빈 1형, 2형 및 3형 폴리오바이러스의 사백신에 의한 부스팅 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리오바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 방법은 사빈 2형 및 3형 폴리오바이러스의 사백신에 의한 부스팅 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리오바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 상기 부스팅 단계는 2회 실시하는 것을 특징으로 하는 폴리오바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  21. 다음의 단계를 포함하는 폴리오바이러스의 감염에 대한 재조합 사빈주의 예방 효과를 검증하는 방법:
    (a) 폴리오바이러스 수용체를 코딩하는 유전자에 의해 형질전환된 마우스에 시험 대상의 재조합 사빈주를 접종하는 단계;
    (b) 상기 접종된 형질전환 마우스에 야생형 폴리오바이러스를 감염시키는 단계; 및
    (c) 상기 마우스에서 회백수염 또는 사망의 발생을 확인하는 단계.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 접종은 뇌내 또는 근육내 주입으로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 21 항에 있어서, 상기 감염은 뇌내 또는 근육내 주입으로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 21 항에 있어서, 상기 접종되는 재조합 사빈주의 양은 1 x 105- 5 x 107TCID50인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 21 항에 있어서, 상기 감염되는 야생형 폴리오바이러스의 양은 2 x 105- 2 x 107TCID50인 것을 특징으로 하는 방법.
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