JP2022165899A - 融合体 - Google Patents

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Yuya Yoshimitsu
一彦 加納
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Abstract

【課題】被検出物質が他の物質に接近している場合でも、分析感度が低下し難い融合体を提供すること。【解決手段】融合体７は、被検出物質１と結合する活性を有する結合物質９と、前記結合物質に融合し、観測可能な現象を生じる標識体１１と、を備える。前記結合物質は、低分子タンパク質製剤、又は核酸アプタマーである。前記標識体は、例えば、酵素を含む。前記酵素は、例えば、水素を産生する代謝、水素を消費する代謝、又は、水素を吸収する代謝を誘発する。【選択図】図１

Description

本開示は融合体に関する。
バイオテクノロジー、ヘルスケア等の技術分野において、試料中の被検出物質を分析する分析方法が用いられる。分析方法として、酵素結合免疫吸着法（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）が知られている。被検出物質はタンパク質等である。
酵素結合免疫吸着法では、免疫グロブリンと標識体との融合体を、被検出物質に結合させる。非特許文献１に融合体が記載されている。免疫グロブリンとして、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等がある。
Biosensors and Bioelectronics 117 (2018) 175－182
試料中において、被検出物質が他の物質に接近している場合がある。例えば、複数の被検出物質が複合体を形成している場合や、細胞膜等の外殻上に被検出物質が高密度に存在する場合、被検出物質は、隣の被検出物質に接近している。また、被検出物質が細胞膜等の外殻上に存在し、かつ被検出物質の近傍に他の巨大物質が存在する場合、被検出物質は、他の巨大物質に接近している。
免疫グロブリンのサイズは大きい。そのため、被検出物質が他の物質に接近している場合、免疫グロブリンを含む融合体は、他の物質からの干渉を受け、被検出物質に結合できないことがある。その結果、被検出物質の分析感度が低下する。
本開示の１つの局面では、被検出物質が他の物質に接近している場合でも、分析感度が低下し難い融合体を提供することが好ましい。
本開示の１つの局面は、被検出物質（１）と結合する活性を有する結合物質（９）と、前記結合物質に融合し、観測可能な現象を生じる標識体（１１）と、を備え、前記結合物質は、低分子タンパク質製剤、又は核酸アプタマーである融合体（７）である。
本開示の１つの局面である融合体が備える結合物質は、低分子タンパク質製剤、又は核酸アプタマーである。そのため、本開示の１つの局面である融合体のサイズは、免疫グロブリンを含む融合体に比べて小さい。よって、被検出物質が他の物質に接近している場合でも、本開示の１つの局面である融合体は、他の物質からの干渉を受け難く、被検出物質に結合し易い。その結果、本開示の１つの局面である融合体を用いれば、被検出物質の分析感度を向上させることができる。
融合体の構成、及び被検出物質の分析方法を表す説明図である。 融合体を合成する工程のフローを表す説明図である。 アルカリフォスファターゼの酵素活性により生じる代謝を表す説明図である。 分析方法のフローを表す説明図である。 吸光度の測定結果を表す説明図である。 分析方法のフローを表す説明図である。 ｐＨの記録結果を表す説明図である。 標識体の機能の発現を確認するための試験におけるフローを表す説明図である。 ｐＨの記録結果を表す説明図である。
本開示の例示的な実施形態について図面を参照しながら説明する。
１．融合体
（１－１）融合体の構成
融合体は、結合物質を備える。結合物質は、被検出物質と結合する活性（以下では結合活性とする）を有する。結合物質は、標識体と融合した状態でも、結合活性を有する。
結合物質は、低分子タンパク質製剤、又は核酸アプタマーである。低分子タンパク質製剤を構成するアミノ酸の数は、例えば、５以上２００以下である。アミノ酸の数が２００以下である場合、被検出物質が他の物質に接近していても、融合体は、他の物質からの干渉を受け難く、被検出物質に結合し易い。低分子タンパク質製剤は、例えば、アミノ酸から成る単位が複数連結したものであってもよい。各単位のアミノ酸の数は、５以上２００以下であることが好ましい。各単位のアミノ酸の数が２００以下である場合、被検出物質が他の物質に接近していても、融合体は、他の物質からの干渉を受け難く、被検出物質に結合し易い。
低分子タンパク質製剤として、例えば、フラグメント抗体、一本鎖抗体、ディアボディ（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ＶＨＨ、ペプチドアプタマー等が挙げられる。低分子タンパク質製剤は、例えば、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれでもない。
核酸アプタマーの塩基数は、例えば、１０以上１００以下である。塩基数が１００以下である場合、被検出物質が他の物質に接近していても、融合体は、他の物質からの干渉を受け難く、被検出物質に結合し易い。
核酸アプタマーは、例えば、核酸から成る単位が複数連結したものであってもよい。各単位の塩基数は、１０以上１００以下であることが好ましい。各単位の塩基数が１００以下である場合、被検出物質が他の物質に接近していても、融合体は、他の物質からの干渉を受け難く、被検出物質に結合し易い。
核酸アプタマーとして、例えば、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマーが挙げられる。結合物質は、例えば、インビトロプロセスにより化学的に合成できる。
結合物質は、例えば、抗体と抗原の間で生じるタイプの分子間相互作用により、被検出物質と結合する。抗体と抗原の間で生じるタイプの分子間相互作用による結合として、例えば、水素結合、静電気的相補性による結合、疎水性接触による結合、立体接合等が挙げられる。
融合体は、標識体を備える。標識体は、結合物質に融合している。標識体は、何らかの機能を発現する。標識体が機能を発現した場合、観測可能な現象が生じる。観測可能な現象として、例えば、イオンの生産、消費、又は吸収等が挙げられる。イオンとして、例えば、水素イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、アンモニウムイオン、塩化物イオン等が挙げられる。観測可能な現象として、例えば、酸化還元、発色、蛍光、発光、燐光、吸熱、発熱、又は沈殿等が挙げられる。生じた現象を、例えばその場で観測することで、標識体を検出することができる。また、融合体が被検出物質に結合している場合、標識体を検出することで、被検出物質を間接的に検出することができる。
標識体として、例えば、磁気標識、蛍光標識、酵素、ＤＮＡザイム、ＲＮＡザイム、化学発光プローブ、ナノ粒子等から成る群から選択される１以上が挙げられる。ナノ粒子として、例えば、金属粒子、非金属粒子、色素粒子、顔料粒子、電気化学的活性種、半導体ナノ結晶、量子ドットフルオロフォア等から成る群から選択される１以上が挙げられる。
酵素は、例えば、基質を出発物質とする代謝を誘発する活性（以下では酵素活性とする）を有する。代謝として、例えば、イオンを産生する代謝、イオンを消費する代謝、イオンを吸収する代謝、特定の波長の光を吸収する物質を生成する代謝等がある。イオンとして、例えば、水素イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、アンモニウムイオン、塩化物イオン等が挙げられる。
イオンを産生する代謝、イオンを消費する代謝、又は、イオンを吸収する代謝が生じると、溶液におけるイオン濃度が変化する。特定の波長の光を吸収する物質が生成すると、溶液が発色又は発光する。酵素活性は、酵素が発現する機能に対応する。溶液におけるイオン濃度の変化、及び、溶液の発色又は発光は、酵素活性により生じる観測可能な現象に対応する。
酵素として、例えば、1,3-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ、15-ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ、1H-ピロール-2-カルボニル-[ペプチジル担体タンパク質]クロリナーゼ、2,4-ジクロロベンゾイル-CoAレダクターゼ、2,5-ジオキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、2-アミノベンゼンスルホン酸2,3-ジオキシゲナーゼ、2-イミノブタノエート/ 2-イミノプロパノエートデアミナーゼ、2-エン酸レダクターゼ、2'-デヒドロカナマイシンレダクターゼ、3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン還元性デアミナーゼ、3α-ヒドロキシステロイド3-デヒドロゲナーゼ、3-アミノブチリル-CoAアンモニアリアーゼ、3-オキソ-5α-ステロイド4-デヒドロゲナーゼ、3-オキソステロイド-1-デヒドロゲナーゼ、3-クロロ-D-アラニンデヒドロクロリナーゼ、4-クロロフェニル酢酸3,4-ジオキシゲナーゼ、4-クロロベンゾイル-CoAデハロゲナーゼ、4-クロロ安息香酸デハロゲナーゼ、4-トリメチルアンモニオブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、4-メチルアミノブタノエートオキシダーゼ、4-メチレングルタミン酸-アンモニアリガーゼ、5-ホスホオキシ-L-リジンホスホリアーゼ、7,8-ジデメチル-8-ヒドロキシ-5-デアザリボフラビンシンターゼ、7-カルボキシ-7-デアザグアニンシンターゼ、7-クロロ-L-トリプトファン6-ハロゲナーゼ、7-シアノ-7-デアザグアニンシンターゼ、AMPデアミナーゼ、CTPシンターゼ、DDT-デヒドロクロリナーゼ、dTDP-4-アミノ-4,6-ジデオキシ-D-グルコースアンモニアリアーゼ、D-アラビノース-1-デヒドロゲナーゼ、D-アルギニンデヒドロゲナーゼ、D-キシロースレダクターゼ、D-グルコサミネート-6-リン酸アンモニアリアーゼ、D-セリンアンモニアリアーゼ、D-乳酸デヒドロゲナーゼ、GDP-4-デヒドロ-6-デオキシ-α-D-マンノース3-デヒドラターゼ、GMPシンターゼ、L-2-アミノ-4-クロロペント-4-エノエートデヒドロクロリナーゼ、L-シスチンβ-リアーゼ、L-システインデスルフィダーゼ、L-システイン酸スルホリアーゼ、L-セリンアンモニアリアーゼ、L-トリプトファンアンモニアリアーゼ、L-リジンシクロデアミナーゼ、N1-アセチルポリアミンオキシダーゼ、N8-アセチルスペルミジンオキシダーゼ、NAD +-ジフタミドADP-リボシルトランスフェラーゼ、NAD +シンターゼ、NAD +-二窒素レダクターゼADP-D-リボシルトランスフェラーゼ、N-スクシンラルギニンジヒドロラーゼ、S-（ヒドロキシメチル）ミコチオールデヒドロゲナーゼ、S-カルボキシメチルシステインシンターゼ、UDP-2-アセトアミド-2,6-β-L-アラビノ-ヘキシル-4-オースレダクターゼ、UDP-N-アセチル-2-アミノ-2-デオキシグルクロネートデヒドロゲナーゼ、UDP-N-アセチル-D-マンノサミンデヒドロゲナーゼ、UDP-N-アセチル-α-D-キノボサミンデヒドロゲナーゼ、UDP-N-アセチルグルコサミン3-デヒドロゲナーゼ、UDP-N-アセチルグルコサミン6-デヒドロゲナーゼ、UDP-グルクロン酸デヒドロゲナーゼ、β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ、β-ウレイドプロピオナーゼ、β-ラクタマーゼ、γ-ブチロベタインジオキシゲナーゼ、アスパラギニル-tRNAシンターゼ、アスパラギンシンターゼ、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ、アスパラギン酸-アンモニアリガーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ、アデニリル硫酸塩-アンモニアアデニリルトランスフェラーゼ、アデノシルクロリドシンターゼ、アトラジンクロロヒドロラーゼ、アミノメチルトランスフェラーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、アラントイン酸デイミナーゼ、アルカリフォスファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アンモニアキナーゼ、アンモニアモノオキシゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、イミダゾールグリセロール-リン酸シンターゼ、ウリカーゼ、ウレアーゼ、ウレイドグリコレートアミドヒドロラーゼ、ウロン酸デヒドロゲナーゼ、エタノールアミンアンモニアリアーゼ、エリスロ-3-ヒドロキシ-L-アスパラギン酸アンモニアリアーゼ、オクトパミンデヒドラターゼ、オルニチンシクロデアミナーゼ、ガラクトースデヒドロゲナーゼ、カルバメートキナーゼ、カルバモイル-セリンアンモニアリアーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、カルボニルレダクターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グリシンレダクターゼ、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコキナーゼ、グルコサミネートアンモニアリアーゼ、グルコサミン-6-リン酸デアミナーゼ、グルタミニル-tRNAシンターゼ、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、クロトノベテニル-CoAヒドラターゼ、クロライドペルオキシダーゼ、コプロポルフィリノーゲンデヒドロゲナーゼ、コリンオキシダーゼ、コリンモノオキシゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ジアセチルレダクターゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノプロピオン酸アンモニアリアーゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シクロヘキサン-1,2-ジオールデヒドロゲナーゼ、ジクロロクロモピロレートシンターゼ、ジクロロメタンデハロゲナーゼ、シスタチオニンγ-リアーゼ、システイン-S-コンジュゲートβ-リアーゼ、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ、ジフチン-アンモニアリガーゼ、シンナモイル-補酵素A-レダクターゼ、スクシニルグルタミン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、スタキドリンN-デメチラーゼ、スレオ-3-ヒドロキシ-D-アスパラギン酸アンモニアリアーゼ、スレオ-3-ヒドロキシ-L-アスパラギン酸アンモニアリアーゼ、スレオニンアンモニアリアーゼ、セリン硫酸アンモニアリアーゼ、チオレドキシンジスルフィドレダクターゼ、チロシンアンモニアリアーゼ、チロシンフェノールリアーゼ、テトラクロロエテン還元デハロゲナーゼ、テトラサイクリン7-ハロゲナーゼ、トリプトファナーゼ、トリプトファン5-ハロゲナーゼ、トリプトファン6-ハロゲナーゼ、トリプトファン7-ハロゲナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸-デヒドロゲナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸-ヘムタンパク質レダクターゼ、ニトロゲナーゼ、バナジウム依存性ニトロゲナーゼ、ハパリンドール型アルカロイドクロリナーゼ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、ヒドラジンシンターゼ、ヒドラジンデヒドロゲナーゼ、ヒドロキシメチルビランシンターゼ、ヒドロキシルアミンレダクターゼ、ピリドキサール5'-リン酸シンターゼ、ヒ酸レダクターゼ、フェニルアラニン/チロシンアンモニアリアーゼ、フェニルアラニン2-モノオキシゲナーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、フェレドキシン-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん酸レダクターゼ、フェレドキシン-亜硝酸還元酵素、フマル酸レダクターゼ、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ベタインレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、ホモシステインデスルフヒドラーゼ、ホモスペルミジンシンターゼ、ホルムイミドイルテトラヒドロ葉酸シクロデアミナーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、メタノールデヒドロゲナーゼ、メタンモノオキシゲナーゼ、メチオニンγ-リアーゼ、メチルアスパラギン酸アンモニアリアーゼ、メチルアミンデヒドロゲナーゼ、メチレンジ尿素デアミナーゼ、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、リボース-5-リン酸-アンモニアリガーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ルブレドキシン-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん酸レダクターゼ、亜塩素酸塩O2-リアーゼ、亜硝酸レダクターゼ、亜硫酸デヒドロゲナーゼ、塩化物ペルオキシダーゼ、塩素酸レダクターゼ、脂質IIイソグルタミニルシンターゼ、炭酸アンヒドラーゼ、及び非特異的ポリアミンオキシダーゼから成る群から選択される１以上が挙げられる。
例えば、標識体と結合物質とは、それぞれ化学置換基又は核酸結合タンパク質を備える。例えば、標識体が備える化学置換基又は核酸結合タンパク質と、結合物質が備える化学置換基又は核酸結合タンパク質とが結合することにより、標識体は結合物質に融合している。
標識体が備える化学置換基として、例えば、ビオチン、一級アミン、アジド、アルキン、ジベンゾシクロオクチン、ビシクロノニン、2´-O-プロパルギル、2´-O-プロパルギル、チオール、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、N-ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド、及び５－ハロウラシル等から成る群から選択される１以上が挙げられる。５－ハロウラシルとして、例えば、５－ヨードウラシル、５－ブロモウラシル等が挙げられる。５－ハロウラシルは、ＵＶ架橋が可能な化学置換基である。
標識体が備える核酸結合タンパク質として、例えば、ジンクフィンガー、ＣＲＩＳＰＲ等から成る群から選択される１以上が挙げられる。
結合物質が備える化学置換基として、例えば、ビオチン、一級アミン、アジド、アルキン、ジベンゾシクロオクチン、ビシクロノニン、2´-O-プロパルギル、2´-O-プロパルギル、チオール、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、N-ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド、及び５－ハロウラシル等から成る群から選択される１以上が挙げられる。５－ハロウラシルとして、例えば、５－ヨードウラシル、５－ブロモウラシル等が挙げられる。５－ハロウラシルは、ＵＶ架橋が可能な化学置換基である。
結合物質が備える核酸結合タンパク質として、例えば、ジンクフィンガー、ＣＲＩＳＰＲ等から成る群から選択される１以上が挙げられる。
標識体が備える化学置換基と、結合物質が備える化学置換基とは異なる。例えば、標識体が備える化学置換基がビオチンである場合、結合物質が備える化学置換基は、アビジン、ストレプトアビジン、又はニュートラアビジンである。
被検出物質として、例えば、タンパク質、糖、脂質、核酸、低分子化合物、抗原、細胞、ウイルス等が挙げられる。抗原として、例えば、細胞やウイルスが提示する抗原、又は、細胞やウイルスが含む抗原等が挙げられる。細胞やウイルスが提示する抗原、又は、細胞やウイルスが含む抗原として、例えば、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２におけるＲＢＤ領域（以下ではＲＢＤとする）等が挙げられる。ウイルスとして、例えば、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等が挙げられる。
（１－２）融合体が奏する効果
本開示の融合体は以下の効果を奏する。
（１Ａ）複数の被検出物質が複合体を形成している場合がある。複合体として、例えば、二量体、三量体、四量体等が挙げられる。１つの複合体において、それぞれの被検出物質は、他の被検出物質に接近している。
融合体のサイズが小さいため、融合体が１つの被検出物質に近づくとき、他の被検出物質からの干渉を受けにくい。そのため、融合体は、複合体を形成している被検出物質のそれぞれに結合することができる。その結果、本開示の融合体を用いれば、被検出物質の分析感度を向上させることができる。
生体中のタンパク質は、複合体を形成していることが多い。生体中のタンパク質として、例えば、膜タンパク質、外殻タンパク質等が挙げられる。膜タンパク質として、例えば、受容体タンパク質等が挙げられる。外殻タンパク質として、例えば、ウイルスのスパイクタンパク質等が挙げられる。本開示の融合体を用いれば、生体中のタンパク質が複合体を形成している場合でも、生体中のタンパク質の分析感度を向上させることができる。
（１Ｂ）複数の被検出物質が、例えば細胞膜等の外殻上に、高密度に存在する場合がある。この場合、それぞれの被検出物質は、隣の被検出物質に非常に接近している。
融合体のサイズが小さいため、融合体が１つの被検出物質に近づくとき、他の被検出物質からの干渉を受けにくい。そのため、融合体は、高密度に存在する被検出物質のそれぞれに結合することができる。その結果、本開示の融合体を用いれば、被検出物質の分析感度を向上させることができる。
生体中のタンパク質は、細胞膜の外殻上に、高密度に存在することが多い。生体中のタンパク質として、前記（１Ａ）で挙げたタンパク質がある。本開示の融合体を用いれば、生体中のタンパク質が細胞膜の外殻上に高密度に存在する場合でも、生体中のタンパク質の分析感度を向上させることができる。
（１Ｃ）被検出物質が、例えば細胞膜等の外殻上に存在し、かつ被検出物質の近傍に他の巨大物質が存在する場合がある。
融合体のサイズが小さいため、融合体が被検出物質に近づくとき、他の巨大物質からの干渉を受けにくい。そのため、融合体は、他の巨大物質の近傍に存在する被検出物質に結合することができる。その結果、本開示の融合体を用いれば、被検出物質の分析感度を向上させることができる。
生体中のタンパク質は、細胞膜等の外殻上に存在し、かつタンパク質の近傍に他の巨大物質が存在することが多い。生体中のタンパク質として、前記（１Ａ）で挙げたタンパク質がある。本開示の融合体を用いれば、生体中のタンパク質の近傍に他の巨大物質が存在する場合でも、生体中のタンパク質の分析感度を向上させることができる。
（１Ｄ）突然変異等の原因により、被検出物質のエピトープが変化することがある。被検出物質のエピトープが変化した場合、現状の結合物質は、結合活性を失う場合がある。特に、被検出物質がインフルエンザウイルスやコロナウイルス等のＲＮＡウイルスが発現するタンパク質である場合、突然変異が高頻度に起こり、エピトープが高頻度に変化する。
本開示の融合体が備える結合物質は、例えば、インビトロプロセスによって化学的に合成できる。結合物質をインビトロプロセスによって化学的に合成できる場合、エピトープが変化した被検出物質に対して結合活性を有する結合物質を、モノクローナル抗体やポリクローナル抗体を新たに合成し直す場合に比べて、容易に開発することができる。
２．被検出物質の分析方法
（２－１）被検出物質の分析方法の手順
被検出物質の分析方法は、例えば、以下の手順で実施することができる。
(i)図１の（１）に示すように、被検出物質１を用意する。被検出物質１は、例えば、溶液３の中に存在する。被検出物質１と溶液３とは試料５を構成する。
(ii)次に、図１の（２）に示すように、融合体７の少なくとも一部と、被検出物質１とを結合させる処理を行う。例えば、溶液３の中で、融合体７と被検出物質１とを共存させることで、融合体７の少なくとも一部と、被検出物質１とを結合させる。
融合体７は、結合物質９と、標識体１１とを備える。融合体７は、前記「１．融合体」の項で説明したものである。少なくとも一部の融合体７が備える結合物質９と、被検出物質１とが結合し、結合体が形成される。
(iii)次に、融合体７のうち、結合物質９が被検出物質１と結合していない融合体７を除去する。
(iv)次に、融合体７が備える標識体１１の機能を発現させる。標識体１１の機能が発現することにより、観測可能な現象が生じる。標識体１１の機能として、例えば、酵素活性、化学発光、蛍光の発生等が挙げられる。
酵素活性は、例えば、図１の（３）に示すように、基質１３を出発物質とする代謝を誘発する。基質１３を出発物質とする代謝は、生成物１５を生成する。生成物１５は、例えば、水素イオンを含む。あるいは、生成物１５は、水素イオンを消費する。よって、基質１３を出発物質とする代謝は、例えば、水素イオンを産生するか、水素イオンを消費する。水素イオンを産生するか、水素イオンを消費する代謝が生じると、溶液３における水素イオン濃度が変化する。水素イオン濃度の変化は、標識体１１の機能が発現することで生じる、観測可能な現象に対応する。
生成物１５は、例えば、特定の波長の光を吸収する。その結果、融合体７を含む溶液３は発色する。溶液３の発色は、標識体１１の機能が発現することで生じる、観測可能な現象に対応する。
(v)次に、標識体１１を検出する。融合体７は被検出物質１に結合しているので、標識体１１を検出することは、被検出物質１を検出することに等しい。
標識体１１を検出するために、標識体１１の機能が発現することで生じる現象を観測する。現象を観測できれば、標識体１１を検出できたことになる。
例えば、標識体が生じる現象が水素イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、アンモニウムイオン、又は塩化物イオンの生産、消費、又は吸収である場合、例えば、ｐＨ計測機、イオンセンサ、又はイオン感応性電界効果トランジスタを用いて現象を検出することができる。
標識体が生じる現象が発色、発光、蛍光、又は燐光である場合、例えば、受光デバイスを用いて現象を検出することができる。標識体が生じる現象が吸熱、又は発熱である場合、例えば、熱分析機を用いて現象を検出することができる。
標識体が生じる現象が酸化還元である場合、例えば、電位計測機、イオンセンサ、又はイオン感応性電界効果トランジスタを用いて現象を検出することができる。標識体が生じる現象が沈殿である場合、例えば、質量分析機、吸光光度計、又は分光光度計を用いて現象を検出することができる。
例えば、標識体１１の機能が、水素イオンを産生するか、水素イオンを消費する代謝を誘発する酵素活性である場合、図１の（３）に示す計測機１７を用いて、水素イオン濃度の変化量を計測する。水素イオン濃度の変化があれば、標識体１１を検出できたことになる。
また、標識体１１の機能が、溶液の発色を生じさせる酵素活性である場合、計測機１７を用いて、発色の程度を計測する。発色があれば、標識体１１を検出できたことになる。
また、標識体１１の機能が、化学発光又は蛍光の発生である場合、計測機１７を用いて、光量を計測する。化学発光又は蛍光の発生を観測できれば、標識体１１を検出できたことになる。
（２－２）被検出物質の分析方法が奏する効果
本開示の被検出物質の分析方法は、前記（１Ａ）～（１Ｄ）の効果を奏し、さらに以下の効果を奏する。
（２Ａ）本開示の被検出物質の分析方法によれば、簡単に、且つ高感度に試料中の被検出物質の濃度を計測することができる。
（２Ｂ）標識体の機能が、溶液の発色を生じさせる酵素活性である場合、溶液の発色により、被検出物質を検出することができる。
本開示の被検出物質の分析方法によれば、被検出物質と結合した融合体のみが、溶液の発色を生じさせる。そのため、被検出物質の濃度が高いほど、溶液の発色が強くなる。よって、本開示の被検出物質の分析方法によれば、溶液の発色の強さに基づき、被検出物質の濃度を定量することができる。
（２Ｃ）標識体の機能が、水素イオンを産生するか、水素イオンを消費するか、イオンを吸収する代謝を誘発する酵素活性である場合、溶液における水素イオン濃度の変化により、被検出物質を検出することができる。
本開示の被検出物質の分析方法によれば、被検出物質と結合した融合体のみが、水素イオンを産生するか、水素イオンを消費するか、イオンを吸収する代謝を誘発する。そのため、被検出物質の濃度が高いほど、溶液における水素イオン濃度の変化量が大きくなる。よって、本開示の被検出物質の分析方法によれば、溶液における水素イオン濃度の変化量に基づき、被検出物質の濃度を定量することができる。
３．実施例
（３－１）融合体の合成
配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡアプタマー（以下では未修飾ＤＮＡアプタマーとする）を、インビトロプロセスにより化学的に合成した。未修飾ＤＮＡアプタマーの塩基配列は、「５’－ＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣ ＣＴＴＧＴＧＣＴＴＴ ＧＧＧＡＧＴＧＣＴＧ ＧＴＣＣＡＡＧＧＧＣ ＧＴＴＡＡＴＧＧＡＣ Ａ－３’」であった。未修飾ＤＮＡアプタマーは、Anal. Chem. 2020, 92, 9895－9900（以下では文献１とする）に記載されている。
なお、文献１の記載によると、未修飾ＤＮＡアプタマーは、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク糖タンパク質におけるＲＢＤを被検出物質とするＤＮＡアプタマーである。次に、未修飾ＤＮＡアプタマーの５’末端を、Ｃ６スペーサーを介して、ビオチンで化学修飾した。
以上の工程により、ＤＮＡアプタマーが得られた。ＤＮＡアプタマーは結合物質に対応する。ＤＮＡアプタマーをリン酸緩衝液（以下では１ｘＰＢＳ／Ｔとする）に溶解し、ＤＮＡアプタマー溶液を製造した。ＤＮＡアプタマー溶液におけるＤＮＡアプタマーの濃度は、１０μｍｏｌ／ｌであった。
１ｘＰＢＳ／Ｔは、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％（ｖ／ｖ）含んでいた。また、１ｘＰＢＳ／Ｔは、１３７ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌと、８．１ｍｍｏｌ／ｌのＮａ２ＨＰＯ４と、２．７ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌと、１．４７ｍｍｏｌ／ｌのＫＨ２ＰＯ４とを含んでいた。
標識体として、ストレプトアビジン－アルカリフォスファターゼ結合体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、製品番号Ｓ９２１）を用意した。この標識体は酵素である。ストレプトアビジン－アルカリフォスファターゼ結合体は、アルカリフォスファターゼを、ストレプトアビジンで修飾することで得られる。ストレプトアビジンは、標識体を修飾する化学置換基である。標識体を、１ｘＰＢＳ／Ｔに溶解し、標識体溶液を製造した。標識体溶液における標識体の濃度は、２０μｍｏｌ／ｌであった。
１００μＬのＤＮＡアプタマー溶液と、５μＬの標識体溶液とを混合し、室温で１時間静置した。このとき、ビオチン－ストレプトアビジンの相互作用により、ＤＮＡアプタマーと標識体とが融合し、融合体が合成された。
次に、融合体を精製し、回収した。具体的には、限外濾過フィルターを用いて、標識体と融合しなかったＤＮＡアプタマーを融合体から分離し、融合体を回収した。融合体を合成する工程のフローを図２に示す。
なお、結合物質は、前記のＤＮＡアプタマー以外の結合物質であってもよい。結合物質は、例えば、低分子タンパク質製剤、又は、ＲＮＡアプタマーであってもよい。低分子タンパク質製剤として、例えば、フラグメント抗体、一本鎖抗体、ディアボディ（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ＶＨＨ、ペプチドアプタマー等が挙げられる。
また、ＤＮＡアプタマーの塩基配列は、配列番号１の塩基配列以外の塩基配列であってもよい。ＤＮＡアプタマーの塩基配列は、分析したい被検出物質に応じて選定できる。
また、結合物質と標識体との融合は、ビオチン－ストレプトアビジンの相互作用に基づく融合以外の融合であってもよい。また、核酸アプタマーを結合物質として使用する場合、核酸アプタマーにおける５’末端以外の末端が標識体と融合してもよい。
また、低分子タンパク質製剤を結合物質として使用する場合、低分子タンパク質製剤におけるＮ末端が標識体と融合してもよいし、Ｃ末端が標識体と融合してもよい。
（３－２）被検出物質の分析方法の実施
被検出物質として、Ｓｐｉｋｅ Ｓ１－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、製品番号４０５９１－Ｖ０８Ｈ）を用意した。この被検出物質を、以下ではＳ１とする。Ｓ１のアミノ酸配列はＲＢＤを含む。
Ｓ１を０．１Ｍ炭酸緩衝液に溶解し、Ｓ１－Ａ溶液と、Ｓ１－Ｂ溶液とを製造した。Ｓ１－Ａ溶液におけるＳ１の濃度は５μｇ／ｍＬであった。Ｓ１－Ｂ溶液におけるＳ１の濃度は１μｇ／ｍＬであった。０．１Ｍ炭酸緩衝液のｐＨは９．６に調整されていた。
また、陰性コントロールの被検出物質として、α－アミラーゼ（Lee Biosolutions社、製品番号１２０－１７）を用意した。α－アミラーゼを０．１Ｍ炭酸緩衝液に溶解し、α－アミラーゼ溶液を製造した。α－アミラーゼ溶液におけるα－アミラーゼの濃度は５μｇ／ｍＬであった。
なお、Ｓ１－Ａ溶液、Ｓ１－Ｂ溶液、及びα－アミラーゼ溶液の製造に使用する緩衝液は、前記の０．１Ｍ炭酸緩衝液以外の緩衝液であってもよい。緩衝液として、例えば、１ｘＰＢＳ／Ｔ、１ｘＰＢＳ、１ｘＴＢＳ／Ｔ、１ｘＴＢＳ等の一般的に用いられる緩衝液が挙げられる。
次に、ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートＨタイプ（住友ベークライト社、製品番号ＭＳ－８８９６Ｆ）の一部のＥＬＩＳＡウェルに、１００μＬのＳ１－Ａ溶液を滴下し、４℃で一晩静置した。Ｓ１－Ａ溶液を滴下したＥＬＩＳＡウェルを、以下では、Ｓ１－Ａウェルとする。このとき、Ｓ１はＳ１－Ａウェルに固着した。
また、Ｓ１－Ａウェル以外のＥＬＩＳＡウェルの一部に、１００μＬのＳ１－Ｂ溶液を滴下し、４℃で一晩静置した。Ｓ１－Ｂ溶液を滴下したＥＬＩＳＡウェルを、以下では、Ｓ１－Ｂウェルとする。このとき、Ｓ１はＳ１－Ｂウェルに固着した。
また、Ｓ１－Ａウェル及びＳ１－ＢウェルのいずれでもないＥＬＩＳＡウェルに、１００μＬのα－アミラーゼ溶液を滴下し、４℃で一晩静置した。α－アミラーゼ溶液を滴下したＥＬＩＳＡウェルを、以下では、α－アミラーゼウェルとする。このとき、α－アミラーゼはα－アミラーゼウェルに固着した。
次に、Ｓ１－Ａウェル、Ｓ１－Ｂウェル、及びα－アミラーゼウェルを、それぞれ、２００μＬの１ｘＰＢＳ／Ｔで洗浄した。洗浄は３回行った。
次に、ウシ血清由来アルブミン（富士フイルム和光純薬社、製品番号０１３－１５１０４）を、１ｘＰＢＳ／Ｔで溶解し、ＢＳＡ溶液を製造した。ウシ血清由来アルブミンを、以下ではＢＳＡとする。ＢＳＡ溶液におけるＢＳＡの濃度は３％（ｗ／ｖ）であった。
次に、Ｓ１－Ａウェル、Ｓ１－Ｂウェル、及びα－アミラーゼウェルのそれぞれに、２００μＬのＢＳＡ溶液を滴下し、常温で２時間静置した。このとき、ブロッキングが行われた。
次に、Ｓ１－Ａウェル、Ｓ１－Ｂウェル、及びα－アミラーゼウェルを、それぞれ、２００μＬの１ｘＰＢＳ／Ｔで洗浄した。洗浄は３回行った。
次に、Ｓ１－Ａウェル、Ｓ１－Ｂウェル、及びα－アミラーゼウェルのそれぞれに、５０μＬの融合体溶液を滴下し、常温で１時間静置した。融合体溶液は、前記「（３－１）融合体の合成」において合成した融合体を含む溶液である。このとき、Ｓ１－Ａウェル、及びＳ１－Ｂウェルにおいて、融合体の一部と、Ｓ１とが結合した。
次に、Ｓ１－Ａウェル、Ｓ１－Ｂウェル、及びα－アミラーゼウェルを、それぞれ、２００μＬの１ｘＰＢＳ／Ｔで洗浄した。洗浄は３回行った。このとき、被検出物質と結合していない融合体が除去された。
リン酸4-ニトロフェニル二ナトリウム六水和物（東京化成工業、製品番号Ｎ０２４１）を用意した。リン酸4-ニトロフェニル二ナトリウム六水和物を、以下ではｐＮＰＰとする。ｐＮＰＰは、アルカリフォスファターゼが誘発する代謝の基質である。
次に、ｐＮＰＰを、炭酸緩衝液と硫酸マグネシウムとを含む溶液に溶解し、ｐＮＰＰ溶液を製造した。ｐＮＰＰ溶液におけるｐＮＰＰの濃度は１０ｍｍｏｌ／ｌであった。炭酸緩衝液と硫酸マグネシウムとを含む溶液は、１ｍｍｏｌ／ｌの炭酸緩衝液と、１ｍｍｏｌ／ｌの硫酸マグネシウムとを含んでいた。炭酸緩衝液と硫酸マグネシウムとを含む溶液のｐＨは、９．６となるように調整されていた。
なお、ｐＮＰＰを溶解する溶液は、炭酸緩衝液と硫酸マグネシウムとを含む溶液以外の溶液であってもよい。ｐＮＰＰを溶解する溶液として、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グッドバッファー等が挙げられる。グッドバッファーとして、例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ等が挙げられる。
ｐＮＰＰを溶解する溶液のｐＨは、９．６以外の値であってもよい。ｐＮＰＰを溶解する溶液は、弱アルカリ性の溶液であることが好ましい。ｐＮＰＰを溶解する溶液のｐＨは、８以上１１以下であることが好ましい。ｐＮＰＰを溶解する溶液が弱アルカリ性の溶液である場合、ｐＮＰＰを基質とする代謝に由来するｐＨの変化が大きくなる。ｐＮＰＰを溶解する溶液のｐＨが８以上１１以下である場合、ｐＮＰＰを基質とする代謝に由来するｐＨの変化が大きくなる。
次に、Ｓ１－Ａウェル、Ｓ１－Ｂウェル、及びα－アミラーゼウェルのそれぞれに、１００μＬのｐＮＰＰ溶液を滴下し、３７℃で１０分間静置した。このとき、Ｓ１－Ａウェル、及びＳ１－Ｂウェルにおいて、図３に示すように、融合体が備えるアルカリフォスファターゼの酵素活性により、ｐＮＰＰを基質とする代謝が誘発され、ｐＮＰＰからリン酸基が分離した。
その結果、Ｓ１－Ａウェル、及びＳ１－Ｂウェルにおいて、無機リン酸と、ｐ－ニトロフェノールとが生成した。ｐ－ニトロフェノールの吸収極大波長は４０５ｎｍである。そのため、ｐ－ニトロフェノールを含む溶液は黄色に発色した。また、生成した無機リン酸は、溶液中において電離し、水素イオンを放出した。そのため、溶液のｐＨが低下した。
次に、Ｓ１－Ａウェル、Ｓ１－Ｂウェル、及びα－アミラーゼウェルのそれぞれに、終濃度０．５ｍｏｌ／ｌのエチレンジアミン四酢酸を５μＬ滴下した。このとき、アルカリフォスファターゼによる代謝が停止した。
次に、Ｓ１－Ａウェル、Ｓ１－Ｂウェル、及びα－アミラーゼウェルのそれぞれにおいて、マイクロプレートリーダ―を用い、４０５ｎｍの波長の光における吸光度を測定した。また、ブランクにおいても、同様に吸光度を測定した。
以上の工程フローを図４に示す。吸光度の測定結果を図５に示す。図５における「Ｓ１ ５μｇ／ｍＬ」は、Ｓ１－Ａウェルに対応する。図５における「Ｓ１ １μｇ／ｍＬ」は、Ｓ１－Ｂウェルに対応する。図５における「α－アミラーゼ ５μｇ／ｍＬ」は、α－アミラーゼウェルに対応する。図５に示すように、Ｓ１－Ａウェル、及びＳ１－Ｂウェルのみにおいて、発色が認められた。
吸光度の測定結果は、以下のことを示す。融合体が備えるアルカリフォスファターゼは、ＤＮＡアプタマーと融合した状態でも、ｐＮＰＰを基質とする代謝を誘発する酵素活性を有していた。また、融合体が備えるＤＮＡアプタマーは、標識体と融合した状態でも、Ｓ１に対する結合活性を有していた。また、融合体が備えるＤＮＡアプタマーは、α－アミラーゼに対する結合活性を有していなかった。
（３－３）被検出物質の分析方法の実施
被検出物質として、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２(以下ではＳＡＲＳ－Ｃｏ－Ｖ２とする）を用意した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を１ｘＰＢＳ／Ｔに懸濁させることで、５種類の懸濁液を製造した。５種類の懸濁液は、懸濁液に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコピー数のみにおいて相違する。５種類の懸濁液におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコピー数は、それぞれ、定量ＰＣＲ換算で、懸濁液１μＬあたり１０の１乗、１０の２乗、１０の３乗、１０の４乗、１０の５乗であった。以下の工程は、５種類の懸濁液のそれぞれについて行った。
次に、２５μＬの懸濁液に、２５μＬの融合体溶液を滴下し、常温で１０分間静置した。融合体溶液は、前記「（３－１）融合体の合成」において合成した融合体を含む溶液である。融合体溶液における融合体の濃度は１０ｎｍｏｌ／ｌであった。このとき、一部の融合体と、被検出物質とが結合した。
次に、静置後の懸濁液の全量を、ナノセップ遠心ろ過デバイス分画分子量３００Ｋ（ＰＡＬＬ社、製品番号ＯＤ３００Ｃ３４）に滴下し、高速遠心分離を行った。高速遠心分離により、被検出物質と結合した融合体を回収し、被検出物質と結合しなかった融合体を分離した。
次に、ナノセップ遠心ろ過デバイス分画分子量３００Ｋを、１ｘＰＢＳ／Ｔで３回洗浄した。このとき、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と結合していない融合体が除去された。
次に、ｐＮＰＰを、炭酸緩衝液と硫酸マグネシウムとを含む溶液に溶解し、ｐＮＰＰ溶液を製造した。ｐＮＰＰ溶液におけるｐＮＰＰの濃度は１０ｍｍｏｌ／ｌであった。炭酸緩衝液と硫酸マグネシウムとを含む溶液は、１ｍｍｏｌ／ｌの炭酸緩衝液と、１ｍｍｏｌ／ｌの硫酸マグネシウムとを含んでいた。炭酸緩衝液と硫酸マグネシウムとを含む溶液のｐＨは、９．６となるように調整されていた。
次に、ｐＮＰＰ溶液を、ナノセップ遠心ろ過デバイス分画分子量３００Ｋへ滴下し、３７℃で１０分間静置した。このとき、図３に示すように、アルカリフォスファターゼの酵素活性により、ｐＮＰＰを基質とする代謝が誘発され、ｐＮＰＰからリン酸基が分離した。その結果、無機リン酸とｐ－ニトロフェノールとが生成した。ｐ－ニトロフェノールの吸収極大波長は４０５ｎｍである。そのため、ｐ－ニトロフェノールを含む溶液は黄色に発色した。また、生成した無機リン酸は、溶液中において電離し、水素イオンを放出した。そのため、溶液のｐＨが低下した。
次に、ナノセップ遠心ろ過デバイス分画分子量３００Ｋ内の溶液を、ｐＨメータに滴下した。ｐＨメータは、コンパクトｐＨメータ ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ（堀場製作所、製品番号ｐＨ－３３Ｂ）であった。ｐＨメータに滴下した溶液のｐＨを記録した。以上の工程のフローを図６に示す。ｐＨの記録結果を図７に示す。図７における「コピー数」は、懸濁液におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１μＬ当たりのコピー数を意味する。
図７に示すように、懸濁液におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコピー数が多いほど、ｐＨの変化量が大きかった。ｐＨの変化量とは、ブランクに対するｐＨの変化量を意味する。
ｐＨの記録結果は、以下のことを示す。融合体が備えるＤＮＡアプタマーは、標識体と融合した状態でも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対し結合活性を有していた。また、融合体が備えるアルカリフォスファターゼは、ＤＮＡアプタマーと融合した状態でも、ｐＮＰＰを基質とする代謝を誘発する酵素活性を有していた。また、ｐＮＰＰを基質とする代謝により生成される無機リン酸が溶液中において電離し、水素イオンを放出した。その結果、溶液のｐＨが低下した。また、懸濁液におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコピー数が１０の３乗以上である場合、ｐＨの変化量が一層大きかった。
なお、被検出物質と結合しなかった融合体を除去するために、ナノセップ遠心ろ過デバイス分画分子量３００Ｋ以外の遠心ろ過デバイスを使用してもよい。遠心ろ過デバイスは、例えば、ナノセップ遠心ろ過デバイス分画分子量３００Ｋと同等の分子量カットオフ値を有する。
また、被検出物質と結合しなかった融合体を除去する方法は、遠心ろ過以外の方法であってもよい。被検出物質と結合しなかった融合体を除去する方法として、例えば、ＥＬＩＳＡプレートや磁性体ビーズを利用したサンドイッチ方式の除去方法、ろ紙又はゲルを利用したろ過クロマトグラフィーによる除去方法、ゲル等の担体に抗体を担持したアフィニティークロマトグラフィーによる除去方法等が挙げられる。
また、ｐＮＰＰを溶解する溶液は、炭酸緩衝液と硫酸マグネシウムとを含む溶液以外の溶液であってもよい。ｐＮＰＰを溶解する溶液として、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グッドバッファー等が挙げられる。グッドバッファーとして、例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ等が挙げられる。
また、ｐＮＰＰを溶解する溶液のｐＨは、９．６以外の値であってもよい。ｐＮＰＰを溶解する溶液は、弱アルカリ性の溶液であることが好ましい。ｐＮＰＰを溶解する溶液のｐＨは、８以上１１以下であることが好ましい。ｐＮＰＰを溶解する溶液が弱アルカリ性の溶液である場合、ｐＮＰＰを基質とする代謝に由来するｐＨの変化が大きくなる。ｐＮＰＰを溶解する溶液のｐＨが８以上１１以下である場合、ｐＮＰＰを基質とする代謝に由来するｐＨの変化が大きくなる。
（３－４）標識体の機能の発現を確認するための試験
融合体にｐＮＰＰ溶液を添加することで、３種類の融合体－ｐＮＰＰ溶液を製造した。融合体は前記「（３－１）融合体の合成」で合成したものである。ｐＮＰＰ溶液は、前記「（３－２）被検出物質の分析方法の実施」で製造したものである。
３種類の融合体－ｐＮＰＰ溶液は、融合体の濃度のみにおいて相違する。３種類の融合体－ｐＮＰＰ溶液における融合体の濃度は、それぞれ、１ｐｍｏｌ／ｌ、１０ｐｍｏｌ／ｌ、１００ｐｍｏｌ／ｌであった。
３種類の融合体－ｐＮＰＰ溶液では、それぞれ、融合体が備えるアルカリフォスファターゼにより、ｐＮＰＰを基質とする代謝が生じた。以下の工程は、３種類の融合体－ｐＮＰＰ溶液のそれぞれについて行った。
融合体－ｐＮＰＰ溶液の製造直後に、融合体－ｐＮＰＰ溶液をｐＨメータに滴下した。ｐＨメータは、コンパクトｐＨメータ ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ（堀場製作所、製品番号ｐＨ－３３Ｂ）であった。
滴下から１０分後、滴下から２０分後、及び滴下から３０分後に、それぞれ、融合体－ｐＮＰＰ溶液のｐＨを記録した。以上の工程のフローを図８に示す。ｐＨの記録結果を図９に示す。図９における「融合体終濃度」は、融合体－ｐＮＰＰ溶液における融合体の濃度を意味する。
図９に示すように、融合体－ｐＮＰＰ溶液における融合体の濃度が高いほど、ｐＨの変化量が大きかった。ｐＨの変化量とは、滴下直後のｐＨに対するｐＨの変化量である。
ｐＨの記録結果は、以下のことを示す。融合体が備えるアルカリフォスファターゼは、ＤＮＡアプタマーと融合した状態でも、ｐＮＰＰを基質とする代謝を誘発する酵素活性を有する。また、ｐＮＰＰを基質とする代謝により生成される無機リン酸が溶液中において電離し、水素イオンを放出する。その結果、溶液のｐＨが低下する。
４．他の実施形態
以上、本開示の実施形態について説明したが、本開示は上述の実施形態に限定されることなく、種々変形して実施することができる。
（４－１）上記実施形態における１つの構成要素が有する複数の機能を、複数の構成要素によって実現したり、１つの構成要素が有する１つの機能を、複数の構成要素によって実現したりしてもよい。また、複数の構成要素が有する複数の機能を、１つの構成要素によって実現したり、複数の構成要素によって実現される１つの機能を、１つの構成要素によって実現したりしてもよい。また、上記実施形態の構成の一部を省略してもよい。また、上記実施形態の構成の少なくとも一部を、他の上記実施形態の構成に対して付加又は置換してもよい。
（４－２）上述した融合体の他、当該融合体を構成要素とする部材、融合体の製造方法、被検出物質の分析方法等、種々の形態で本開示を実現することもできる。
１…被検出物質、３…溶液、５…試料、７…融合体、９…結合物質、１１…標識体、１３…基質、１５…生成物、１７…計測機
ｐＮＰＰを溶解する溶液のｐＨは、９．６以外の値であってもよい。ｐＮＰＰを溶解する溶液は、アルカリ性の溶液であることが好ましい。
また、ｐＮＰＰを溶解する溶液のｐＨは、９．６以外の値であってもよい。ｐＮＰＰを溶解する溶液は、アルカリ性の溶液であることが好ましい。

Claims (6)

  1. 被検出物質（１）と結合する活性を有する結合物質（９）と、
    前記結合物質に融合し、観測可能な現象を生じる標識体（１１）と、
    を備え、
    前記結合物質は、低分子タンパク質製剤、又は核酸アプタマーである、
    融合体（７）。
  2. 請求項１に記載の融合体であって、
    前記被検出物質は、タンパク質、糖、核酸、低分子化合物、又は脂質である、
    融合体。
  3. 請求項１又は２に記載の融合体であって、
    前記標識体は、酵素、ＤＮＡザイム、ＲＮＡザイム、磁気標識、蛍光標識、化学発光プローブ、及びナノ粒子から成る群から選択される１以上である、
    融合体。
  4. 請求項１～３のいずれか１項に記載の融合体であって、
    前記現象は、水素イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、アンモニウムイオン、又は塩化物イオンの生産、消費、又は吸収、若しくは、発色、蛍光、発光、燐光、吸熱、発熱、酸化還元、又は沈殿から成る群から選択される１以上である、
    融合体。
  5. 請求項１～４のいずれか１項に記載の融合体であって、
    前記標識体は、水素イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、アンモニウムイオン、及び塩化物イオンから成る群から選択される１以上のイオンの生産、消費、又は吸収を誘発する酵素である、
    融合体。
  6. 請求項１～５のいずれか１項に記載の融合体であって、
    前記結合物質と前記標識体とは、それぞれ、化学置換基又は核酸結合タンパク質を備え、
    前記結合物質が備える前記化学置換基又は前記核酸結合タンパク質と、前記標識体が備える前記化学置換基又は前記核酸結合タンパク質とが結合することにより、前記結合物質と前記標識体とが融合しており、
    前記化学置換基は、ビオチン、一級アミン、アジド、アルキン、ジベンゾシクロオクチン、ビシクロノニン、２´－Ｏ－プロパルギル、２´－Ｏ－プロパルギル、チオール、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド、及び５－ハロウラシルから成る群から選択される１以上であり、
    前記核酸結合タンパク質は、ジンクフィンガー、及びＣＲＩＳＰＲから成る群から選択される１以上である、
    融合体。
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