CN113219175A - 人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，属于试剂盒技术领域。解决了现有技术中测定GDF‑15的方法灵敏度不高，操作复杂，检测时间长，自动化程度低的技术问题，本发明的试剂盒，包括链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒、含有化学发光标记物标记的人生长分化因子15单克隆抗体的缓冲液Ⅱ和含有偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原的缓冲液Ⅲ；其中，缓冲液Ⅱ和缓冲液Ⅲ中分别含有表面活性剂，表面活性剂为GENAPOLTM X‑080。该试剂盒操作简单、无污染、检测时间短、灵敏度高且检测范围宽，抗干扰性好。

Description

人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于试剂盒技术领域，具体涉及一种人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
人生长分化因子15(GDF-15)属于GDF家族，是转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员之一。生理条件下，GDF有明显的组织特异性，仅在胎盘中有较高的水平表达；在肺脏、肝脏、肾脏、乳腺及胰腺中低水平表达；在心脏中几乎不表达。GDF-15的检测意义在于，随着各种细胞刺激信号作用，适应性反映的发生，GDF-15表达水平显著升高。在毒性肝损伤时，肝细胞GDF-15的表达显著升高；在前列腺、胰腺肿瘤病灶和血清中，GDF-15的表达显著升高；在心肌缺血或缺血再灌注损伤时，GDF-15可高表达，并对心肌细胞结构及凋亡程序有调节作用。妊娠时，血清GDF-15水平高表达，提示发生脑卒中和心肌梗死的危险性加大；GDF-15水平低表达则是妊娠流产的前兆。
现有技术中，测定GDF-15的方法有酶联免疫法(ELISA)，但该方法灵敏度不高，操作复杂，检测时间长，自动化程度低。
发明内容
本发明为解决现有技术中测定GDF-15的方法灵敏度不高，操作复杂，检测时间长，自动化程度低的技术问题，提供一种人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
本发明解决上述技术问题采取的技术方案如下。
人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒，包括：链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒、含有化学发光标记物标记的人生长分化因子15单克隆抗体的缓冲液Ⅱ和含有偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原的缓冲液Ⅲ；
所述缓冲液Ⅱ和缓冲液Ⅲ中分别含有表面活性剂，表面活性剂为GENAPOLTM X-080。
优选的是，所述链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒的粒径是4～6μm。
优选的是，所述化学发光标记物标记的人生长分化因子15单克隆抗体中，人生长分化因子15单克隆抗体与化学发光标记物的物质的量比为1:(3～10)。
优选的是，所述化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌。
优选的是，所述偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原中，人生长分化因子15抗原与偶联标记物的物质的量比为1:(5～10)。
优选的是，所述偶联标记物为生物素或衍生物。
优选的是，所述人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂；
R1试剂包括链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒和缓冲液Ⅰ；
R2试剂包括化学发光标记物标记的人生长分化因子15单克隆抗体和缓冲液Ⅱ；
R3试剂包括偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原和缓冲液Ⅲ。
更优选的是，所述R1试剂中，链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒的质量百分浓度为0.01％～1％。
更优选的是，所述缓冲液Ⅰ包括50mM MES、0.05％吐温-20和0.05％Proclin300。
更优选的是，所述R2试剂中，化学发光标记物标记的人生长分化因子15单克隆抗体的浓度为0.1～2.0μg/mL；
更优选的是，所述缓冲液Ⅱ包括100～500mM BISTRIS丙烷和0.02％～0.05％GENAPOLTM X-080。
更优选的是，所述R3试剂中，偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原的浓度为0.2～3.0μg/ml。
更优选的是，所述缓冲液Ⅲ包括100～500mM BISTRIS丙烷和0.02％～0.05％GENAPOLTM X-080。
优选的是，该试剂盒中还包括人生长分化因子15校准品；所述校准品包括浓度分别为0.00pg/mL、1.0pg/mL、2.0pg/mL、4.0pg/mL、16.0pg/mL、32.0pg/mL和40.0pg/mL的人生长分化因子15蛋白溶液。
本发明还提供上述人生长分化因子15的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、制备R1试剂
将链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒溶液放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，使用缓冲液Ⅰ清洗磁颗粒后，再用缓冲液Ⅰ配成磁颗粒质量百分浓度为0.02％～1％的固相试剂，即为R1试剂；
步骤二、制备R2试剂
先将人生长分化因子15单克隆抗体放入离心管中，离心，保证人生长分化因子15单克隆抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲液，充分混匀，混匀后加入含有化学发光标记物的DMF溶液，经封闭、纯化，得到化学发光标记物标记的人生长分化因子15单克隆抗体，最后将收集好的化学发光标记物标记的人生长分化因子15单克隆抗体用缓冲液Ⅱ稀释至终浓度为0.1～2.0μg/mL，即为R2试剂；
步骤三、制备R3试剂
取人生长分化因子15抗原，用pH为6.0～6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入已活化的长链磺化生物素(Sulfo-NHS-LC-Biotin)，经封闭、纯化，得到偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原，最后将收集好的偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原用缓冲液Ⅲ稀释至终浓度为0.2～3.0μg/ml，即为R3试剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒具有灵敏度高、准确定量、无放射性风险及样本需求量少等优点。具体来讲：
1、本发明的人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒采用链霉亲和素羧基磁颗粒与生物素标记的抗体可以牢牢的结合在一起，减少非特异性吸附，提高测试样本的准确度，抗干扰能力强。
2、本发明的人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒选择吖啶酯等为化学发光免疫分析系统的标记材料，该材料由激发态回到基态时产生的能量跃迁为直接化学发光，不需要酶的参与，节约时间及成本，且吖啶酯的化学发光免疫分析系统线性范围宽。
3、本发明的人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒人抗鼠抗体(HAMA)或类风湿因子(RF)对检测影响的程度最小，抗干扰率小于10％；其次，其检测时间更短；另外，本发明检测方法为竞争法测试人生长分化因子15，原因为人生长分化因子15为小分子，可以消除干扰物质从而实现对小分子物质的准确检测。
4、本发明的人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒与全自动化学发光免疫检测仪器组成封闭系统，试剂、样本的添加及检测任务均由仪器自动完成，系统误差小，降低了人为操作的误差，缩短了临床检测所需的时间，提高了整个系统的灵敏度与准确度，并且实现无人值守。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式中的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例3的人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒的标准曲线图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明的人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒，包括：链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒、含有化学发光标记物标记的人生长分化因子15单克隆抗体的缓冲液Ⅱ和含有偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原(衍生物)的缓冲液Ⅲ。
上述技术方案中，链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒的粒径优选为4～6μm，更优选为6μm。
上述技术方案中，缓冲液Ⅱ和缓冲液Ⅲ中分别含有表面活性剂，表面活性剂为GENAPOLTM X-080。GENAPOLTM X-080为一种可用作表面活性剂的成分，除了具有疏水基团和亲水基团，可提高试剂稳定性，降低非特异吸附外，添加一定量的GENAPOLTMX-080到试剂中可以改善试剂的重复性(CV)，并且可以降低HAMA或RF对检测结果的影响，原因是通过仪器与配套试剂的封闭系统，GENAPOLTMX-080可以对加样针及磁珠的清洗过程更加彻底，使抗体与类似物的表位暴露更容易与被测物结合。
上述技术方案中，化学发光标记物标记的人生长分化因子15单克隆抗体中，人生长分化因子15单克隆抗体与化学发光标记物的物质的量比是1:(3～10)。
化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌，优选为吖啶酯。
上述技术方案中，偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原中，人生长分化因子15抗原与偶联标记物的物质的量比为1:(5～10)。偶联标记物为生物素或衍生物，优选为生物素，如Sulfo-NHS-LC-Biotin(购买自ACROBiosystems)。
上述技术方案中，人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂；
R1试剂包括链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒和缓冲液Ⅰ；
R2试剂包括化学发光标记物标记的人生长分化因子15单克隆抗体和缓冲液Ⅱ；
R3试剂包括偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原和缓冲液Ⅲ。
上述技术方案中，R1试剂中，链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒的质量百分浓度为0.01％～1％，优选0.072％；缓冲液Ⅰ包括50mM MES、0.05％吐温-20和0.05％Proclin300，pH为6～6.5。
上述技术方案中，R2试剂中，化学发光标记物标记的人生长分化因子15单克隆抗体的浓度为0.1～2.0μg/mL；缓冲液Ⅱ包括100～500mM BISTRIS丙烷和0.02％～0.05％GENAPOLTM X-080。
上述技术方案中，R3试剂中，偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原的浓度为0.2～3.0μg/ml，优选2μg/ml；缓冲液Ⅲ包括100～500mM BISTRIS丙烷和0.02％～0.05％GENAPOLTM X-080。
上述试剂盒中，优选还包括校准品；校准品包括浓度分别为0.00pg/mL、1.0pg/mL、2.0pg/mL、4.0pg/mL、16.0pg/mL、32.0pg/mL和40.0pg/mL的人生长分化因子15蛋白溶液。
本发明还提供上述人生长分化因子15的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、制备R1试剂
将链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒溶液放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，使用缓冲液Ⅰ清洗磁颗粒后，再用缓冲液Ⅰ配成磁颗粒质量百分浓度为0.02％～1％的固相试剂，即为R1试剂；
其中，链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒溶液可购买自安捷伦科技有限公司，浓度为10～100mg/ml。
将人生长分化因子15单克隆抗体放入离心管中，离心机室温离心，使人生长分化因子15单克隆抗体位于离心管底部位置，加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入含有化学发光标记物的DMF溶液，经封闭、纯化，得到含有化学发光标记物标记的人生长分化因子15单克隆抗体；将收集好的含有化学发光标记物标记的人生长分化因子15单克隆抗体用缓冲液Ⅱ稀释至终浓度为0.1～2.0μg/mL，2～8℃保存。
其中，含有化学发光标记物的DMF溶液中化学发光标记物的浓度优选为2mg/mL，人生长分化因子15单克隆抗体与化学发光标记物的标记摩尔比优选为1:(3～10)。
步骤三、R3试剂制备
取人生长分化因子15单克隆抗体，用pH为6.0～6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入已活化的偶联标记物，经封闭、纯化，得到偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原，最后将收集好的偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原用缓冲液Ⅲ稀释至终浓度为0.2～3.0μg/mL，2～8℃保存。
其中，人生长分化因子15单克隆抗体与偶联标记物的标记摩尔比优选为1:(5～10)；
步骤四、将R1、R2和R3试剂分别灌封于不同的试剂瓶，得到人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒。
在本发明中所使用的术语，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义，除非另有说明。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步的详细介绍。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
以下结合实施例进一步说明本发明。链霉亲和素羧基磁颗粒溶液来自安捷伦科技有限公司。生物素Sulfo-NHS-LC-Biotin，购买自ACROBiosystems。
实施例1
R1试剂的制备：取浓度是100pg/mL的链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒溶液0.5毫升(50mg)，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。用50mM MES、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300，pH6.5的缓冲液重复清洗3次后，在该缓冲液中配成磁珠浓度为0.072wt％的R1试剂。
R2试剂的制备：将500μg人生长分化因子15抗体放入离心管中，离心，人生长分化因子15抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入含有吖啶酯的DMF溶液，经过封闭、纯化，得到人生长分化因子15抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:3的化学发光标记物的人生长分化因子15抗体。将化学发光标记物的人生长分化因子15抗体浓溶液用100mM BISTRIS丙烷，0.05％GENAPOLTM X-080，pH6.5的缓冲液配制成化学发光标记物的人生长分化因子15抗体终浓度为0.1μg/mL的R2试剂。
R3试剂的制备：取500μg偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原，将pH6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入长链磺化生物素Sulfo-NHS-LC-Biotin，经过封闭、纯化，得到人生长分化因子15抗原与偶联标记物的摩尔比为1:5的偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原。将偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原浓溶液用100mM BISTRIS丙烷，0.05％GENAPOLTM X-080，pH6.5的缓冲液配制成偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原终浓度为0.2μg/mL的R3试剂。
实施例2
R1试剂的制备：取浓度是100pg/mL的链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒溶液0.5毫升(50mg)，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。用50mM MES、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300，pH6.5的缓冲液重复清洗3次后，在该缓冲液中配成磁珠浓度为0.072wt％的R1试剂。
R2试剂的制备：将500μg人生长分化因子15抗体放入离心管中，离心，人生长分化因子15抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入含有吖啶酯的DMF溶液，经过封闭、纯化，得到人生长分化因子15抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:5的化学发光标记物的人生长分化因子15抗体。将化学发光标记物的人生长分化因子15抗体浓溶液用100mM BISTRIS丙烷，0.02％GENAPOLTM X-080，pH6.5的缓冲液配制成化学发光标记物的人生长分化因子15抗体终浓度为1μg/mL的R2试剂。
R3试剂的制备：取500μg偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原，将pH6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入长链磺化生物素Sulfo-NHS-LC-Biotin，经过封闭、纯化，得到偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原与偶联标记物的摩尔比为1:10的偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原。将偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原浓溶液用100mMBISTRIS丙烷，0.05％GENAPOLTM X-080，pH6.5的缓冲液配制成偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原终浓度为2μg/mL的R3试剂。
实施例3
R1试剂的制备：取浓度是100pg/mL的链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒溶液0.5毫升(50mg)，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。用50mM MES、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300，pH6.5的缓冲液重复清洗3次后，在该缓冲液中配成磁珠浓度为0.072wt％的R1试剂。
R2试剂的制备：将500μg人生长分化因子15抗体放入离心管中，离心，人生长分化因子15抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入含有吖啶酯的DMF溶液，经过封闭、纯化，得到人生长分化因子15抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:3的化学发光标记物的人生长分化因子15抗体。将化学发光标记物的人生长分化因子15抗体浓溶液用100mM BISTRIS丙烷，0.05％GENAPOLTM X-080，pH6.5的缓冲液配制成化学发光标记物的人生长分化因子15抗体终浓度为0.1μg/mL的R2试剂。
R3试剂的制备：取500μg偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原，将pH6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入长链磺化生物素Sulfo-NHS-LC-Biotin，经过封闭、纯化，得到偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原与偶联标记物的摩尔比为1:5的偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原。将偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原浓溶液用100mMBISTRIS丙烷，0.02％GENAPOLTM X-080，pH6.5的缓冲液配制成偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原终浓度为0.2μg/mL的R3试剂。
对比例1
R1试剂的制备：取浓度是100pg/mL的链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒溶液0.5毫升(50mg)，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。用50mM MES、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300，pH6.5的缓冲液重复清洗3次后，在该缓冲液中配成磁珠浓度为0.072wt％的R1试剂。
R2试剂的制备：将500μg人生长分化因子15抗体放入离心管中，离心，人生长分化因子15抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入含有吖啶酯的DMF溶液，经过封闭、纯化，得到人生长分化因子15抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:3的化学发光标记物的人生长分化因子15抗体。将化学发光标记物的人生长分化因子15抗体浓溶液用100mM BISTRIS丙烷，pH6.5的缓冲液配制成化学发光标记物的人生长分化因子15抗体终浓度为0.1μg/mL的R2试剂。
R3试剂的制备：取500μg偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原，将pH6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入长链磺化生物素Sulfo-NHS-LC-Biotin，经过封闭、纯化，得到偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原与偶联标记物的摩尔比为1:5的偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原。将偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原浓溶液用100mMBISTRIS丙烷，pH6.5的缓冲液配制成偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原终浓度为0.2μg/mL的R3试剂
对实施例1～4的人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒的性能进行评价。
人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒使用方法：以全自动化学发光免疫分析仪(CM180)为检测工具，方法学模式为双抗体夹心法，即仪器依次加入10μL的检测样本，50μL的R2试剂，50μL的R3试剂及40μL的R1试剂。反应20min后，进行磁分离。仪器将反应物送入暗室，一次加入发光底物液进行反应，最后记录光量子数。
1.1实施例1人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒性能评价
线性的检测：检测样本为校准品(浓度分别为0.00pg/mL、1.0pg/mL、2.0pg/mL、4.0pg/mL、16.0pg/mL、32.0pg/mL和40.0pg/mL的人生长分化因子15蛋白溶液)，数据如表1所示，作标准曲线，得到线性相关系数r＝0.9991，线性范围为0.05～40pg/mL。
表1
浓度 相对光单位
0.0 1044841
1.0 809948
2.0 562517
4.0 291616
16.0 85542
32.0 11239
40.0 4605
灵敏度的检测：分析灵敏度的定义为对零值校准品进行20次测定相对光单位，取其平均值减去两倍的标准差，带入0值及相近的标准曲线所得即为灵敏度；计算人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度为0.025pg/mL，具体数据如表2所示。
表2
Figure BDA0003079783500000111
抗干扰的检测：共检测8例干扰样本，包括2份脂血样本，3份HAMA阳性样本、2份RF阳性样本和1份溶血样本，具体如表3所示。
表3
Figure BDA0003079783500000112
测试以上干扰样本，临床偏差均在±10％范围内。
1.2实施例2人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒性能评价
线性的检测：检测样本为校准品(浓度分别为0.00pg/mL、1.0pg/mL、2.0pg/mL、4.0pg/mL、16.0pg/mL、32.0pg/mL和40.0pg/mL的人生长分化因子15蛋白溶液)，数据如表4所示，作标准曲线，得到线性相关系数r＝0.9991，线性范围为0.05～40pg/mL。
表4
浓度 相对光单位
0.0 2052103
1.0 1008457
2.0 761450
4.0 492134
16.0 104756
32.0 52143
40.0 11521
灵敏度的检测：分析灵敏度的定义为对零值校准品进行20次测定相对光单位，取其平均值减去两倍的标准差，带入0值及相近的标准曲线所得即为灵敏度；计算人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度为0.020pg/mL，具体数据见表5。
表5
Figure BDA0003079783500000121
Figure BDA0003079783500000131
抗干扰的检测：共检测8例干扰样本，包括2份脂血样本，3份HAMA阳性样本、2份RF阳性样本和1份溶血样本，具体如表6所示。
表6
样本信息 竞品测值(pg/mL) 本发明测值(pg/mL) 本发明与竞品偏差
脂血样本1 25.32 26.23 3.59％
脂血样本2 16.32 16.78 2.82％
HAMA阳性1 14.20 14.44 1.69％
HAMA阳性2 5.32 5.80 9.02％
HAMA阳性3 22.27 24.12 8.31％
RF阳性样本1 16.30 17.21 5.58％
RF阳性样本2 15.57 14.98 -3.79％
测试以上干扰样本，临床偏差均在±10％范围内。
1.3实施例3人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒性能评价
线性的检测：检测样本为校准品(浓度分别为0.00pg/mL、1.0pg/mL、2.0pg/mL、4.0pg/mL、16.0pg/mL、32.0pg/mL和40.0pg/mL的人生长分化因子15蛋白溶液)，数据如表7所示，作标准曲线，如图1所示，得到线性相关系数r＝0.9991，线性范围为0.05～40pg/mL。
表7
Figure BDA0003079783500000132
Figure BDA0003079783500000141
灵敏度的检测：分析灵敏度的定义为对零值校准品进行20次测定相对光单位，取其平均值减去两倍的标准差，带入0值及相近的标准曲线所得即为灵敏度；计算人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度为0.030pg/mL，具体如表8所示。
表8
Figure BDA0003079783500000142
抗干扰的检测：共检测8例干扰样本，包括2份脂血样本，3份HAMA阳性样本、2份RF阳性样本和1份溶血样本，具体如表9所示。
表9
样本信息 竞品测值(pg/mL) 本发明测值(pg/mL) 本发明与竞品偏差
脂血样本1 25.32 26.24 3.63％
脂血样本2 16.32 17.26 5.76％
HAMA阳性1 14.2 13.51 -4.86％
HAMA阳性2 5.32 5.29 -0.56％
HAMA阳性3 22.27 23.59 5.93％
RF阳性样本1 16.3 15.23 -6.56％
RF阳性样本2 15.57 16.09 3.34％
测试以上干扰样本，临床偏差均在±10％范围内。
1.4对比例1人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒性能评价
线性的检测：检测样本为校准品(浓度分别为0.00pg/mL、1.0pg/mL、2.0pg/mL、4.0pg/mL、16.0pg/mL、32.0pg/mL和40.0pg/mL的人生长分化因子15蛋白溶液)，数据如表7所示，作标准曲线，如图1所示，得到线性相关系数r＝0.9991，线性范围为0.05～40pg/mL。
表10
浓度 相对光单位
0.0 1103158
1.0 843000
2.0 556847
4.0 286327
16.0 84238
32.0 13668
40.0 4444
灵敏度的检测：分析灵敏度的定义为对零值校准品进行20次测定相对光单位，取其平均值减去两倍的标准差，带入0值及相近的标准曲线所得即为灵敏度；计算人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度为0.865pg/mL，具体如表11所示。
表11
Figure BDA0003079783500000161
抗干扰的检测：共检测8例干扰样本，包括2份脂血样本，3份HAMA阳性样本、2份RF阳性样本和1份溶血样本，具体如表12所示。
表12
Figure BDA0003079783500000162
Figure BDA0003079783500000171
测试以上干扰样本，临床相对偏差的绝对值均大于10％。
从以上检测结果可以看出，对于添加了GENAPOLTM X-080的实施例1～3，其重复性＜0.5％，测试临床偏差都较小，在±10％范围内；而没有添加GENAPOLTM X-080的对比例1，其重复性>7％，测试临床相对偏差的绝对值大于10％。所以，GENAPOLTM X-080是本发明重要的组成成分，其可以提高试剂的重复性及降低抗干扰。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括：链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒、含有化学发光标记物标记的人生长分化因子15单克隆抗体的缓冲液Ⅱ和含有偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原的缓冲液Ⅲ；
所述缓冲液Ⅱ和缓冲液Ⅲ中分别含有表面活性剂，表面活性剂为GENAPOLTM X-080。
2.根据权利要求1所述的人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒的粒径是4～6μm。
3.根据权利要求1所述的人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物标记的人生长分化因子15单克隆抗体中，人生长分化因子15单克隆抗体与化学发光标记物的物质的量比为1:(3～10)；所述化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌。
4.根据权利要求1所述的人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原中，人生长分化因子15抗原与偶联标记物的物质的量比为1:(5～10)；所述偶联标记物为生物素或衍生物。
5.根据权利要求1所述的人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂；
R1试剂包括链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒和缓冲液Ⅰ；
R2试剂包括化学发光标记物标记的人生长分化因子15单克隆抗体和缓冲液Ⅱ；
R3试剂包括偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原和缓冲液Ⅲ。
6.根据权利要求5所述的人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中，链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒的质量百分浓度为0.01％～1％；所述缓冲液Ⅰ包括50mM MES、0.05％吐温-20和0.05％Proclin300。
7.根据权利要求5所述的人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中，化学发光标记物标记的人生长分化因子15单克隆抗体的浓度为0.1～2.0μg/mL；所述缓冲液Ⅱ包括100～500mM BISTRIS丙烷和0.02％-0.05％GENAPOLTM X-080。
8.根据权利要求1所述的人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述R3试剂中，偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原的浓度为0.2～3.0μg/ml；所述缓冲液Ⅲ包括100～500mM BISTRIS丙烷和0.02％-0.05％GENAPOLTM X-080。
9.根据权利要求1所述的人生长分化因子15化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还包括人生长分化因子15校准品；所述校准品包括浓度分别为0.00pg/mL、1.0pg/mL、2.0pg/mL、4.0pg/mL、16.0pg/mL、32.0pg/mL和40.0pg/mL的人生长分化因子15蛋白溶液。
10.权利要求1～9任何一项所述的人生长分化因子15的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、制备R1试剂
将链霉亲和素带有环氧乙烷官能团磁颗粒溶液放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，使用缓冲液Ⅰ清洗磁颗粒后，再用缓冲液Ⅰ配成磁颗粒质量百分浓度为0.02％～1％的固相试剂，即为R1试剂；
步骤二、制备R2试剂
先将人生长分化因子15单克隆抗体放入离心管中，离心，保证人生长分化因子15单克隆抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲液，充分混匀，混匀后加入含有化学发光标记物的DMF溶液，经封闭、纯化，得到化学发光标记物标记的人生长分化因子15单克隆抗体，最后将收集好的化学发光标记物标记的人生长分化因子15单克隆抗体用缓冲液Ⅱ稀释至终浓度为0.1～2.0μg/mL，即为R2试剂；
步骤三、制备R3试剂
取人生长分化因子15抗原，用pH为6.0～6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入已活化的长链磺化生物素，经封闭、纯化，得到偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原，最后将收集好的偶联标记物标记的人生长分化因子15抗原用缓冲液Ⅲ稀释至终浓度为0.1～2.0μg/mL，即为R3试剂。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CN111157712A (zh) * 2018-11-07 2020-05-15 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 可抗脂血干扰的血液样本检测试剂盒及方法
CN112698041A (zh) * 2020-12-16 2021-04-23 深圳上泰生物工程有限公司 一种复合物及其生长分化因子15检测试剂盒与应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106053791A (zh) * 2016-06-30 2016-10-26 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和应用
CN111157712A (zh) * 2018-11-07 2020-05-15 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 可抗脂血干扰的血液样本检测试剂盒及方法
CN110082519A (zh) * 2019-04-17 2019-08-02 迪瑞医疗科技股份有限公司 胱抑素c化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN110618261A (zh) * 2019-08-27 2019-12-27 迪瑞医疗科技股份有限公司 一种定量检测地高辛的化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN112698041A (zh) * 2020-12-16 2021-04-23 深圳上泰生物工程有限公司 一种复合物及其生长分化因子15检测试剂盒与应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114891086A (zh) * 2022-06-01 2022-08-12 恺佧生物科技(上海)有限公司 一种生物素标记的gdf15的复性方法
CN114891086B (zh) * 2022-06-01 2024-03-26 恺佧生物科技(上海)有限公司 一种生物素标记的gdf15的复性方法

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