ES2232647T3

ES2232647T3 - Estimulacion del crecimiento del cartilago con agonistas (musculos no esenciales) del receptor de trombina no proteoliticamente activado.

Info

Publication number: ES2232647T3
Application number: ES01952846T
Authority: ES
Inventors: Darrell H. Carney; Roger S. Crowther; Janet Stiernberg; John Bergmann
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2000-07-20
Filing date: 2001-07-19
Publication date: 2005-06-01
Anticipated expiration: 2021-07-19
Also published as: US6855687B2; US20020198154A1; CA2416404A1; DE60105772D1; WO2002007748A2; EP1259598A2; US20050181996A1; AU2001273561B2; CN1458974A; DE60105772T2; JP3634844B2; ATE277174T1; JP2004504354A; US6815416B2; AU7356101A; HK1052367A1; EP1259598B1; US20020042373A1; JP2005053930A; WO2002007748A3

Abstract

La aplicación de un agonista del receptor de trombina no proteolíticamente activada para la producción de un medicamento para estimular el crecimiento o la reparación en una zona de un paciente que necesita tal crecimiento o reparación.

Description

Estimulación del crecimiento del cartílago con agonistas (músculos no esenciales) del receptor de trombina no proteolíticamente activado.

Antecedentes de la invención

A diferencia de la mayoría de los tejidos, el cartílago no se auto-recupera después de una lesión. El cartílago es un tejido avascular constituido en gran parte por células específicas del cartílago, los condrocitos, tipos especiales de colágeno y proteoglicanos. La imposibilidad del cartílago de auto-repararse después de una lesión, una enfermedad o una intervención, constituye un importante factor limitador de la rehabilitación de superficies de unión degradadas o de daños en el cartílago meniscal. La osteoartritis, la principal enfermedad degenerativa de las superficies de unión que soportan pesos, es ocasionada por la erosión o por superficies dañadas del cartílago y está presente en aproximadamente el 25% de la población de más de 50 años. En EE.UU más de 20 millones de personas padecen osteoartritis, ocasionando unos gastos sanitarios superiores a 8,600 millones de dólares. Además, el coste de la restauración del cartílago en el caso de una lesión articular (lesiones meniscales, daño de la superficie patelar y condromalacia) supera los 1.000 millones de dólares anuales. Por consiguiente, se necesitan nuevos enfoques terapéuticos para curar las lesiones de los cartílagos ocasionadas por degeneración o traumas agudos.

Resumen de la invención

Se ha comprobado que los condrocitos aislados de cartílagos articulares reaccionan a compuestos que activan el receptor no proteolítico de superficies celulares de trombina (en lo sucesivo "NPAR"). Así, por ejemplo, los condrocitos representan aproximadamente 233,000 puntos de fijación de trombina por célula con unas afinidades aparentes de aproximadamente 0,1 nM (3000 puntos) y 27 nM (230,000 puntos) (Ejemplo 1). Además, el TP508, un agonista de receptor de trombina no proteolítico, estimula la proliferación de condrocitos bovinos en cultivo en presencia de trombina como comitógeno (Ejemplo 2A) y estimula por sí mismo la proliferación de condrocitos de rata cultivados en cultivo matricial tridimensional (Ejemplo 3A). Este mismo TP508 estimula también la síntesis de proteoglicano determinada por la incorporación de sulfato S35 en los condrocitos bovinos (Ejemplo 2B) y en los cultivos tridimensionales de condrocitos de rata (Ejemplo 3B). Estos experimentos "in vitro" demuestran que los agonistas NPAR pueden estimular la proliferación y la producción matricial de condrocitos aislados de cartílago articular. Experimentos adicionales "in vitro" demuestran que la aplicación de TP508 en una fórmula de administración sostenida a los defectos del cartílago del intersticio troclear del conejo con inclusión de la reparación del hueso subcondrial permiten restablecer una superficie normal del cartílago y la integración del cartílago recién formado con el cartílago no dañado existente fuera de la zona defectuosa (Ejemplo 5).

Sobre la base de los resultados apuntados en el párrafo anterior, se dan a conocer a continuación nuevos sistemas de estimulación del desarrollo de condrocitos "in vivo" y de reparación de cartílagos en un paciente, así como nuevos métodos de administración de composiciones farmacéuticas en el caso de defectos articulares para coadyuvar a la recuperación de superficies y para evitar la degradación articular.

La presente invención se refiere a la utilización de un agonista de receptor de trombina no proteolíticamente activado para producir un medicamento para estimular el crecimiento de cartílagos, su regeneración o recuperación.

Otra ventaja de la presente invención la constituye un procedimiento para estimular y expandir condrocitos "in vitro", procedimiento que comprende el cultivo de condrocitos en presencia de una cantidad estimuladora de un agonista NPAR.

Descripción detallada de la invención

Las zonas de los cartílagos que precisan crecimiento, restauración o regeneración se presentan en pacientes con osteoartritis. La osteoartritis o enfermedad degenerativa de las articulaciones es una dolencia lentamente progresiva, irreversible y frecuentemente monoarticular que se caracteriza por dolores y pérdida de función. La causa subyacente del dolor y de la debilitación es la degradación del cartílago que es uno de los principales síntomas de la enfermedad. El cartílago hialino es un tejido flexible que cubre los extremos de los huesos y se encuentra entre articulaciones tales como la rodilla. También se encuentra entre los huesos de la columna. El cartílago es suave y permite un movimiento estable y flexible con una fricción mínima; pero es también resistente a la compresión y puede distribuir las cargas aplicadas. Cuando la osteoartritis progresa, las superficies del cartílago y el hueso subyacente al descubierto se vuelven irregulares y en lugar de deslizarse suavemente, las superficies que unen los huesos se rozan entre sí generando rigidez y dolor. La regeneración del cartílago dañado y el desarrollo de nuevo cartílago en estas zonas artríticas mitiga el dolor y restablece la pérdida de función asociada a la osteoartritis.

En los cartílagos pueden producirse daños por traumas debidos a lesiones o intervenciones quirúrgicas. Las lesiones deportivas son una causa común de daños en los cartílagos, especialmente en articulaciones tales como la rodilla. Las lesiones traumáticas en los cartílagos pueden ocasionar el mismo tipo de molestia funcional y, por lo tanto, las zonas de la persona cubiertas de cartílago dañadas por traumas o enfermedades requieren un tratamiento para restablecer o fomentar el desarrollo del cartílago.

Los solicitantes de la patente han descubierto que los compuestos que estimulan o activan el receptor de trombina no proteolíticamente activado (en lo sucesivo "NPAR") pueden hacer que proliferen los condrocitos. Los condrocitos son células que constituyen aproximadamente el 1% del volumen del cartílago y que sustituyen a las moléculas matriciales degradadas para mantener el volumen correcto y las propiedades mecánicas del tejido. Los solicitantes han comprobado también que los compuestos que estimulan o activan el NPAR estimulan la síntesis de proteoglicanos de los condrocitos. El proteoglicano es un componente principal del cartílago. Sobre la base de estos resultados, los solicitantes han administrado el agonista NPAR TP508, preparado en una fórmula de administración sostenida a defectos del cartílago de la ranura troclear de conejos y han descubierto que el péptido estimula la reparación del defecto y que incluye la formación de nuevo cartílago con una superficie normal. El péptido estimula también la aplicación e integración de este nuevo cartílago en el cartílago contiguo no dañado, así como el restablecimiento del hueso subcondral. En consecuencia, se deduce que el agonista NPAR puede inducir el desarrollo del cartílago y su restauración cuando se administra en zonas que precisan desarrollo y/o restauración del cartílago.

Ya se ha dicho que los compuestos que estimulan o activan el NPAR son agonistas del NPAR. El NPAR es un receptor de trombina de afinidad elevada presente en la superficie de la mayoría de las células. El NPAR es en gran parte responsable de la fijación de alta afinidad de la trombina, de la trombina proteolíticamente inactivada y de los péptidos de la trombina en las células. Los agonistas y antagonistas NPAR pueden competir en la fijación por afinidad de la trombina en las células (véase por ejemplo, Glenn y col., J. Peptide Research I;65 (1988). El NPAR parece emitir un cierto número de señales celulares que se inician por la trombina con independencia de su actividad proteolítica. Un ejemplo de un tal señal es la hiperregulación de la anexina V y de otras moléculas identificadas mediante hibridización subtrativa (véase Sower y col. Experimentall Cell Research 247;422 (1999). Por consiguiente, el NPAR se caracteriza por su interacción de elevada afinidad con la trombina en las superficies de las células y por su activación por derivados proteolíticamente inactivos de la trombina y de agonistas de péptidos derivados de la trombina según se describe más adelante. La activación del NPAR puede comprobarse sobre la base de la capacidad de sus agonistas para estimular la proliferación celular cuando se añade a fibroblastos en presencia de concentraciones submitogénicas de trombina o de moléculas que activan la quinasa proteínica C tal como se da a conocer en las patentes US 5,352,664 y 5,500,412.

El NPAR debe distinguirse de otras proteínas ligantes de la trombina y de la familia clónica de receptores proteolíticamente activados de la trombina, con inclusión de los receptores PAR1, PAR2, PAR3 y PAR4. PAR1 posee una zona de disociación específica de la trombina que permite que esta disociación quede sujeta a un nuevo campo de amino-término que actúa como un ligando que se pliega sobre sí mismo induciendo a su activación (véase, Vu y col., Cell 64;1057 (1991). PAR2 dispone de un mecanismo similar de activación; pero se activa principalmente por enzimas del tipo de la tripsina (V. Zhong y col., J. Biol. CHEM, 267;16975 (1992). PAR3 cuenta con un mecanismo similar de activación y parece funcionar como un segundo receptor de trombina en plaquitas (V. Ishihara y col., Nature 386;502 (1997). PAR4 ha sido detectado en megacariocitos de ratón y algunos estudios sugieren que también actúa en plaquetas humanas (V. Kahn y col. Nature 394;690 (1998). En contraste con estos receptores PAR, la activación de NPAR no requiere disociación proteolítica.

Varias señales evidentes indican que NPAR se distingue de los receptores PAR en que: 1) se ha aislado una serie de células que expresan receptores PAR1 completamente funcionales; pero que no reaccionan a la trombina por un defecto en la trayectoria de la transducción de señales NPAR (V. Kim y col. J. Cell. Physiol. 160;573 (1994); 2) los neutrófilos fijan la trombina 125I con una afinidad alta y su quimiotaxis se estimula con trombina proteolíticamente inactivada o con agonistas NPAR (V. Ramakrishnan y Carney, Mol. Biol. Cell 4;1993 (1993); pero no expresan PAR1 (V.J. Cell Sci. 108:3059 (1995): 3) Los fibroblastos IIC9 hiper-expresan PAR1; pero no fijan la trombina con afinidad elevada (V. Kim, Disertación de PhD. Sección médica de la Universidad de Texas en Galveston, 1995; y Low y col. "Células cancerígenas 3/factoras de desarrollo y transformación". Laboratorio de Cold Spring Hrbor, Nueva York); y 4) los agonistas NPAR tienen efectos concretos sobre la expresión de genes de los péptidos agonistas receptores PAR (V. Sower y col., Experimental Cell Research 247;422 (1999).

Un ejemplo de un agonista NPAR es un derivado péptido de la trombina; es decir, un polipéptido con no más de aproximadamente cincuenta aminoácidos, preferentemente no más de unos treinta aminoácidos y con suficiente homología con respecto al fragmento de trombina humana correspondiente a los aminoácidos de protrombina 508-530 (SEQ ID núm. 5) para que el polipéptido active el NPAR. Los derivados péptidos de la trombina aquí descritos tienen preferentemente entre 12 y 23 aminoácidos y, todavía mejor, entre 19 y 23 aminoácidos. Un ejemplo de un derivado péptido de trombina comprende un mitad representada por la fórmula estructural (I):

(I)Aso-Ala-R

en donde R es un dominio conservado de estearasa de serina como por ejemplo, tripsina, trombina, quimiotripsina y similares poseen un sector elevadamente conservado. "Dominio conservado de estearasa de serina" indica un polipéptido con una secuencia aminoácida de una de estas zonas conservadas o que es lo suficientemente homólogo uno de estos sectores conservados de forma que el derivado péptido de la trombina mantiene la capacidad de activación del NPAR.

En una de las representaciones, la secuencia conservada de esterasa de serina tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID nº 1 (Cis-Glu-Gli-Asp-Ser-Gli-Gli-Pro-Phe-Val) o una fracción truncada con terminal C de un polipéptido con secuencia aminoácida de SEQ ID nº 1, bien se sobreentiende que cero, uno, dos o tres aminoácidos de la secuencia conservada de esterasa de serina pueden diferir de los correspondientes aminoácidos de SEQ ID nº 1. Preferentemente, los aminoácidos de la secuencia conservada de esterasa de serina que difieren de los correspondientes aminoácidos de SEQ ID nº 1 son sustituciones conservadoras y más preferentemente, sustituciones muy conservadoras. Una "fracción truncada con terminal C" indica una fracción que se mantiene después de suprimir un aminoácido o un bloque de aminoácidos del terminus C, poseyendo dicha fracción por lo menos seis y, todavía mejor, nueve aminoácidos.

Más preferentemente, la secuencia conservada de esterasa de serina tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID nº 2 (cis-X1-Gli-Asp-Ser-Gli-Gli-Pro-X2-Val; X1 es Glu o Gln y X2 es Phe, Met, Leu, His o Val) o una fracción truncada de terminal C de los mismos con, un mínimo de seis aminoácidos, preferentemente, nueve aminoácidos.

En una disposición preferida, el derivado péptido de la trombina comprende una secuencia conservada de esterasa de serina y un polipéptido con una secuencia de aminoácido de trombina, específica Arg-Gli-Asp-Ala (SEQ ID nº 3). Un ejemplo de un derivado péptido de trombina de este tipo comprende Arg-Gli-Asp-Ala-Cis-X1-Gli-Asp-Ser-Gli-Gli-Pro-X2-Val (SEQ ID nº 4), X1 y X2 son los definidos antes. Cuando el derivado péptido de la trombina comprende SEQ ID nº 4, tiene preferentemente la secuencia de SEQ ID nº 5 (Ala-Gli-Tir-Lis-Pro-Asp-Glu-Glis-Lis-Arg-Gli-Asp-Ala-Cis-Glu-Gli-Asp-Ser-Gli-Gli-Pro-Phe-Val) o una fracción truncada con terminal N de los mismos, siempre que cero, uno, dos o tres aminoácidos en las posiciones 1-9 del derivado péptido de la trombina difieran del amino-ácido de la posición correspondiente de SEQ ID nº 5. Preferentemente, los aminoácidos del derivado péptido de la trombina que difieren del aminoácido correspondiente en SEQ ID nº 5 son sustituciones conservadoras y, todavía mejor, sustituciones muy conservadoras. "Fracción truncada con terminal N" indica una fracción que se mantiene después de la eliminación de un aminoácido o de un bloque de aminoácidos del término N, preferentemente un bloque de no más de seis aminoácidos y más preferentemente un bloque de no más de tres aminoácidos.

TP508 es un ejemplo de un derivado péptido de la trombina y tiene la secuencia de aminoácido de SQ ID nº 5.

Una "sustitución conservadora" es la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tenga la misma carga electrónica neta y aproximadamente el mismo tamaño y forma. Los aminoácidos con cadenas laterales alifáticas o de aminoácidos alifáticos sustituidos tienen aproximadamente el mismo tamaño cuando el número total de átomos de carbono y de heteroátomos de sus cadenas laterales difiere en no más de aproximadamente cuatro. Tienen aproximadamente la misma configuración cundo el número de ramas de sus cadenas laterales difiere en no más de uno. Los aminoácidos con grupos fenilo o de fenilo sustituidos en sus cadenas laterales se considera que tienen aproximadamente igual tamaño y forma. A continuación se relacionan cinco grupos de aminoácidos. Sustituyendo un aminoácido de un polipéptido por otro aminoácido del mismo grupo se obtiene una sustitución conservadora:

Grupo I: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteina y aminoácidos que no se presentan naturalmente con cadenas alifáticas C1-C4 o alifáticas C1-C4 con hidroxilo sustituidos (cadenas rectas o monoderivadas).

Grupo II: Ácido glutámico, ácido aspártico y aminoácidos que no se presentan naturalmente con cadenas lateral alifáticas C1-C4 con el ácido carboxílico sustituido (no derivadas o con una derivación).

Grupo III: lisina, ornitina, arginina y aminoácidos no presentes naturalmente con cadenas laterales alifáticas C1-C4 de amina o guanidina sustituídas (no derivadas o derivadas en un punto).

Grupo IV: glutamina, asparagina y aminoácidos no presentes naturalmente con cadenas laterales alifáticas C1-C4 con la amida sustituida (no derivadas o con una derivación).

Grupo V: fenilalanina, fenilglicina, tirosina y triptofano.

Una "sustitución muy conservadora" es la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene el mismo grupo funcional en la cadena lateral y, aproximadamente, tamaño y forma iguales. Los aminoácidos con cadenas laterales alifáticas o aminoácidos alifáticos sustituidos tienen aproximadamente el mismo tamaño cuando el número total de átomos de carbono y de heteroátomos de sus cadenas laterales difiere en no más de dos. Tienen aproximadamente la misma configuración cuando poseen el mismo número de ramificaciones en sus cadenas laterales. Entre los ejemplos de cadenas muy conservadoras figuran valina para leucina, treonina para serina, ácido aspártico para ácido glutámico y fenilglicina para fenilalanina. Entre los ejemplos de sustituciones que no son muy conservadores figuran alanina para valinina, alanina para serina y ácido aspártico para serina.

Otros agonistas NPAR incluyen pequeñas moléculas orgánicas que fijan y activan NPAR. Los agonistas de este tipo pueden identificarse adecuadamente mediante un cribado de gran precisión; es decir, con ensayos que confirmen la capacidad de las moléculas para estimular la proliferación celular cuando se añaden a fibroblastos en presencia de concentraciones submitogénicas de trombina o con moléculas que activen la quinasa proteínica C o con ensayos que confirmen la aptitud de estas moléculas para competir con trombina 125I en células con receptores NPAR superficiales, tal como se revela en Glenn y col. Supra, Patentes US núms. 5,352,664 y 5,500,412. La totalidad de las enseñanzas de Glenn y col. en las patentes US 5,352,664 y 5,500,412, se indican aquí como referencia.

El término "agonista NPAR" incluye también compuestos y combinaciones de compuestos que se sabe que activan el NPAR. Algunos ejemplos se dan a conocer en las patentes US 5,352,664 y 5,500,412 e incluyen trombina y DIP-alfa-trombina.

Los agonistas NPAR utilizados en la presente invención se suelen administrar como un componente en una composición farmacéutica en el sitio que precisa crecimiento, restauración o regeneración del cartílago. La administración en el lugar que precisa tratamiento significa que la composición farmacéutica que contiene agonista NPAR se administra lo suficientemente próxima al punto que precisa tratamiento para que el crecimiento o la regeneración del cartílago se obtengan en dicho lugar (por ejemplo, un mayor volumen de crecimiento del cartílago o mejor calidad de éste con el agonista NPAR que sin él).

En una forma de administración, la composición farmacéutica es una solución que comprende el agonista NPAR y un soporte adecuado. La solución se aplica directamente en el lugar que requiere tratamiento o en sus inmediaciones. La administración de la solución puede efectuarse de forma conveniente, como por ejemplo, mediante inyección intra-articular, en la inmediata proximidad del tejido dañado, mediante inyección o mediante una incisión quirúrgica, pudiendo emplearse los procedimientos normales de las fórmulas farmacéuticas tales como las que se describen en las Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Entre los portadores farmacéuticos adecuados figuran, por ejemplo, salina fisiológica, salina bacteriostática (salina que contiene aproximadamente 0,95 mg/ml de alcohol bencílico), salina rebajada con fosfato, solución de Hank, lactato de Ringer y otras similares.

En otras formas de administración, la composición farmacéutica comprende el agonista NPAR y un soporte biocompatible implantable, el cual deberá ser no tóxico, no inflamatorio, no inmunogénico y estará desprovisto de otras reacciones indeseables en el lugar de implantación. También se preverá soportes adecuados para administrar el ingrediente activo y, preferentemente, para un administración lenta y sostenida en función del tiempo en el lugar de implantación.

Un cierto número de polímeros biodegradables sintéticos puede servir de portadores con características de administración sostenidas. Entre los ejemplos de estos polímeros figuran poli-alfa-hidroxiésteres tales como copolímeros de ácido poliláctico/ácido poliglicólico y polianhidridos.

Los homopolímeros y copolímeros del ácido poliláctico/ácido poliglicólico son perfectamente conocidos como portadores administradores sostenidos. La proporción de administración puede graduarse por el hábil artesano variando la proporción de ácido poliláctico/ácido poliglicólico y el peso molecular del polímero (véase Anderson y col. Adv. Drug Deliv. Rev. 28:5 (1997), cuyas enseñanzas de citan aquí como referencia). La incorporación de poli(glicoletileno) a la mezcla polimérica permite una atenuación más del perfil de aplicación del ingrediente activo (V. Clark y col. J. Control Release 48:259 (1997), mencionándose aquí sus enseñanzas por referencia). Unos polímeros PLGA implantables idóneos a utilizar como soportes de factores de crecimiento de cartílagos se describen en las patentes US 6,013,853, 5,607,474 y 5,876,452, cuyas enseñanzas completas se incorporan aquí como referencia.

Los polianhidridos representados en la fórmula estructural (II) tienen unas características de degradación y de aplicación características que pueden controlarse incluyendo diversas cantidades de monómeros hidrofóbicos o hidrofílicos tales como ácido sebáciso y 1,3-bis(p-carboxifenoxi)propano (V. Leong y col. J. Biomed. Mater. Res. 19:941 (1985), incorporándose aquí como referencia la totalidad de sus enseñanzas). Para mejorar la resistencia mecánica, los anhídridos se copolimerizan frecuentemente con imidas para formar polianhidrido-co-imidas. Ejemplos de polianhidrido-co-imidas idóneos para aplicaciones ortopédicas son poli(trimelitilimido-glicina-co-1,6-bis(carboxifenoxi)hexano y piromelitilmidoalanina:1,6-bis (p-carbopxifenoxi)hexano copolímeros.

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Las composiciones farmacéuticas pueden conformarse en la forma deseada antes de la intervención o configurarse por el técnico durante la cirugía. Es preferible configurar la matriz para evitar un defecto tisular y para alcanzar la forma deseada del nuevo tejido. En el caso de reparación de grandes defectos del cartílago, es conveniente utilizar dimensiones que eliminen el defecto. Después de la implantación, el material se absorbe lentamente por el cuerpo y es sustituido por el cartílago con una forma igual o muy cercana a la forma del implante.

En un aspecto, el soporte es una matriz porosa a la que pueden ir a parar las células progenitoras. Las células pueden atacar frecuentemente a tales matrices porosas, sirviendo como armadura para el crecimiento tisular y acelerando la velocidad de desarrollo del hueso. También pueden aplicarse condrocitos a dichas matrices antes del implante para acelerar la curación. El colágeno o colágeno en gel es un ejemplo de una matriz porosa adecuada.

En otro aspecto, el soporte es una solución viscosa o gel que puede inyectarse intra-articularmente o en el sitio adecuado cuando se necesite tratamiento. Algunos productos de ácido hialurónico están comercialmente disponibles y entre ellos figuran ORTHOVISC desarrollado por Anika, SYNVISC, desarrollado por Biomatrix, HYALGAN, desarrollado por Fifia y ARTZ, desarrollado por Seikagaku. El gel plurónico es otro ejemplo de este tipo de portador. Los geles plurónicos son copolímeros de bloque no tóxicos de óxido de etileno y de óxido de propileno y poseen unas propiedades termoestables que les permiten mantenerse como líquidos viscosos a temperaturas ambientales, pero como geles a las temperaturas del cuerpo. También pueden aplicarse composiciones inyectables directamente en el lugar adecuado cuando se precise tratamiento sin necesidad de cirugía invasiva. Igualmente, están indicados polímeros de poli(óxido de etileno) y copolímeros de etileno y óxido de propileno como matrices inyectables (V. Cao y col., J. Biomater. Sci 9:475 (1998) y Sims y col. Plast Reconstr. Surg. 98;843(196) incorporándose aquí como referencia la totalidad de sus enseñanzas).

Una "cantidad terapéuticamente efectiva" es la cantidad de agonista NPAR (o de condrocitos) que permite un mayor desarrollo del cartílago o su reparación en presencia del agonista NPAR que cuando se carece de él. Alternativamente o como adición una "cantidad terapéuticamente efectiva" es la cantidad de agonista NPAR (o de condrocitos) que permite una mitigación del dolor y/o falta de función asociada al daño del cartílago. Generalmente, el agonista (o los condrocitos) se administra para un periodo suficiente para alcanzar el deseado efecto terapéutico. La cantidad administrada dependerá del volumen de crecimiento del cartílago deseado, de la salud, tamaño, peso, edad y sexo del paciente y de las características de aplicación de la fórmula farmacéutica. Normalmente, entre 0,1 \mug por día y aprox. 1 mg por día de agonista NPAR (preferentemente entre unos 5 \mug diarios y aprox. 100 \mug diarios) se administran de forma continua o mediante aplicación directa en el lugar idóneo en caso de desarrollo o reparación del cartílago.

Un "paciente" es preferentemente un ser humano: pero también puede ser un animal que precise tratamiento como, ejemplo, a los de compañía (perros, gatos, etc.), animales de labor (vacas, cerdos, caballos, etc.) y animales de laboratorio (ratas, ratones, cobayas, etc).

Los agonistas NPAR pueden emplearse para acelerar el crecimiento o para mantener la funcionalidad de condrocitos aislados. En una disposición, agonistas NPAR pueden añadirse al medio de cultivo del tejido para estimular la proliferación y lograr una proliferación más rápida y/o impedir la muerte apoptótica o la senescencia celular que frecuentemente se produce cuando se cultivan células primarias aisladas. En otro modelo, como los agonistas NPAR parecen estimular la producción matricial, estos agonistas NPAR pueden utilizarse para mantener la funcionalidad diferenciada de condrocitos en cultivo. Loa agonistas NPAR pueden emplearse únicamente en medios de cultivo de tejidos normales o como un suplemento a un medio de cultivo que contenga suero u otro factor de crecimiento para proporcionar efectos aditivos o sinergísticos a la producción "in vitro" o para el mantenimiento de condrocitos. Una cantidad suficiente de los agonistas NPAR se agrega al cultivo para proporcionar un crecimiento más rápido o para mantener una mayor funcionalidad de los condrocitos que cuando se carece del agonista; es decir, una "cantidad estimuladora". Normalmente, se emplea entre 0,1 \mug/ml y aprox. 100 \mug/ml de agonista NPAR.

También pueden emplearse condrocitos cultivados en presencia de un agonista NPAR para tratar daños en cartílagos mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de los condrocitos en el lugar que precisa tratamiento. Con respecto a los condrocitos, "terapéuticamente efectivo" significa también que permite un mayor crecimiento o reparación del cartílago con su tratamiento que cuando se carece de él. La administración de condrocitos para tratar daños en el cartílago se describe en la patente US 4,846,835, cuyas enseñanzas se indican aquí como referencia.

Los derivados de péptidos de trombina pueden sintetizarse mediante la síntesis de péptidos en fase sólida (por ej. métodos BOC o FMOC), con la síntesis en fase de solución o por cualquier otro procedimiento idóneo que incluya combinaciones de los métodos anteriores. Los métodos BOC y FMOC que están acreditados y se emplean ampliamente, han sido descritos por Merrifield, J. Am. Chem. Soc 88:2149 (1963); Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, C.H. Li, Ed. Academic Press, 1983, págs. 48-267; y Barany and Merrifield, en The Peptides, E. Gross y J. Meienhofer, Eds. Academic Press, Nueva York, 1980, págs. 3-285. Métodos de síntesis de péptidos en fase sólida se han descrito por Merrifield, R.B. en Science, 232:341 (1086); Carpino, L.A. y Han, G.Y. J. Org. Chem, 37, 3404 (1972) y Gauspohl, H. y col. Synthesis 5, 315 (1992). Las enseñanzas de estos seis artículos se incorporan aquí en su totalidad como referencia.

La invención se ilustra mediante los ejemplos que siguen que no representan limitación alguna.

Ejemplificación Detalles de los experimentos

Los condrocitos son el principal tipo de células que se encuentra en el cartílago, en el cual estas células son normalmente inactivas o no proliferativas y tienen una velocidad metabólica relativamente baja. Cuando el cartílago ha sufrido daños, estas células no participan fácilmente en el proceso de reparación y como consecuencia de la naturaleza avascular del cartílago, estas células no consideran a la trombina como iniciadora del proceso de reparación. Los ejemplos que siguen demuestran que los condrocitos poseen receptores de trombina y que los compuestos que activan NPAR estimula la proliferación de condrocitos y la síntesis de proteoglicanos matriciales.

Ejemplo 1 Fijación de trombina en condrocitos de ratas

Se aíslan cultivos primarios de condrocitos articulares de ratas y se preparan para análisis "in vitro" empleando procedimientos ya establecidos (véase Kuettner, K.E. y col. J. Cell Biology 93;743-750, 1982). Resumiendo, se diseccionan trozos de cartílago del brazuelo de ratas y se someten a digestión con tripsina durante una hora y con colagenasa durante tres horas en medio de cultivo tisular (DMEM) a 37ºC, con agitación. Las células se cultivan en frascos a gran densidad (50,000 células por cm^{2}) y después, en DMEM que contiene antibióticos en ácido ascórbico a 37ºC en una atmósfera de 5% de CO_{2}.

La fijación específica de trombina ^{125}I a los condrocitos se efectúa utilizando muestras conocidas de fijadores de trombina de las que se describen en la patente US 5,352,664 y en Carney, DH y Cunningham DD, Cell 15;1341-1349, 1978. Resumiendo, la trombina humana muy purificada se trata con yodo y se añade a cultivos de condrocitos con o sin trombina radio-activada para corregir una fijación no específica. Incubando células con diferentes concentraciones de trombina radioactivada y midiendo la cantidad de trombina fija a las células, así como la cantidad de trombina libre existente en él es posible calcular el número de receptores por célula y la afinidad de la trombina en el lugar de
fijación.

Los análisis de Scatchard de la fijación de trombina radioactivada a partir de tres experimentos independientes parecen indicar que los condrocitos de rata indican una media de 3000 puntos de fijación de afinidad muy elevada (1000 pM de afinidad) y 230,000 puntos de afinidad elevada (27 nM).

Ejemplo 2A Estimulación de agonista NPAR de proliferación de condrocitos bovinos

Se preparan cultivos primarios de condrocitos bovinos utilizando el procedimiento descrito para los condrocitos de ratas del ejemplo 1. Los cultivos se subcultivan en 24 platos de plástico con baja densidad y se colocan en suero al 1%. La adición del agonista NPAR TP508 a estos cultivos en concentraciones de 1.0 o 10 \mug/ml no estimula directamente la proliferación celular. En cambio, la adición de estas concentraciones de TP508 junto con una pequeña cantidad de co-mitógeno de trombina, produce un pequeño; pero significativo incremento (p<0,05) del número de células en relación con el obtenido con trombina sola después de tres días en cultivo.

Ejemplo 2B Estimulación de agonista NPAR mediante síntesis con proteoglicano de condrocitos bovinos

Para determinar el efecto de agonistas NPAR en la síntesis de proteoglicano se colocan condrocitos bovinos en 96 placas de crisol con una densidad de 2 x 10^{5} por crisol y se cultivan en DMEM con 10% de suero de ternera fetal. Una vez establecidos estos cultivos multicapa, se sustituye a diario el medio por DMEM que contenga suero al 1% con concentraciones indicadas de TP508 desde 1 a 100 \mug por ml (tabla 1). Después de 6 días de cultivo con cambios diarios de medio con o sin TP508, se añade sulfato S^{35} I medio y se continúa la incubación durante otras 24 horas. Según puede verse en la tabla 1, el tratamiento con elevadas concentraciones de TP508 (100 \mug por ml) incrementa la incorporación de sulfato S^{35} con respecto a las células no tratadas en más de 10 veces.

TABLA 1

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Ejemplo 3A Estimulación con agonista NPAR de la síntesis de proliferación en condrocitos articulares de rata cultivados

Se aíslan condrocitos articulares de rata de lonchas de cartílago articular de brazuelo de rata, utilizando las digestiones de tripsina y de colagenasa que se describen en el ejemplo 1. Se establecen preparaciones de cultivos de perla de alginato "tridimensional" de condrocito empleando los procedimientos descritos por Guo y col. (Conn. Tiss. Res. 19:277-297, 1998). Después de extraer las células de los matraces de cultivos tisulares con tripsina, se ponen en suspensión las células en un gel de alginato (1,2% w/v) y lentamente se extraen en gotas con una aguja calibre 22 y se colocan en 102 mM de CaCl_{2}. Cuando las gotas entran en contacto con el CaCl_{2} se produce una polimerización casi instantánea del alginato y se forma una perla de gel. Estas perlas se lavan tres veces en medio de cultivo DMEM y se transfieren luego a cubetas de 35 mm y se mantienen en cultivo a 37ºC en una atmósfera de 5% CO_{2}, agregando medio de cultivo cada dos días.

El efecto del agonista NPAR TP508 sobre la proliferación de células de condrocitos al cabo de tres días en cultivo de alginato tridimensional se determina extrayendo las perlas de las cubetas de 35 mm, lavándolas con salina al 0,9% y disolviendo las perlas de alginato mediante la adición de 1 ml de 55 mM de citrato sódico, 0,15 M de NaCl a 37ºC durante 10 minutos. El número de células se determina diluyendo el 1 ml de perlas disuelto 1:10 con fosfato salino diluido (PBS) y contando las células con un contador Coulter serie Z. Según puede verse en la tabla 2, el TP508 estimula por sí mismo la proliferación de condrocitos en cultivos tridimensionales.

TABLA 2

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Ejemplo 3B Estimulación con agonista NPAR de síntesis de proteoglicano en condrocitos articulares de rata cultivados

Para determinar el efecto del agonista NPAR TP508 sobre la síntesis de proteoglicano, se preparan cultivos tridimensionales de alginato tal como se ha descrito ya y se ensayan para incorporar sulfato (^{35}S). Los cultivos de las perlas se someten a concentraciones indicadas de RP508, así como a sulfato (^{35}S) (20 \muCi/ml) cambiando el medio a diario y se recogen el día 7 para añadir el sulfato (^{35}S). En cada punto pronológico, se extraen de 5 a 10 perlas, se lavan tres veces con salina al 0,9%, se disuelven agregando 0,5 ml de 55 mM de citrato sódico, 0,15 M de NaCl a 37ºC durante 10 minutos en la forma antes descrita y se cuenta con un contador de centelleo líquido. La adición de sulfato (^{35}S) se normaliza en cada muestra con el número de perlas añadido Según puede verse en la tabla 3, el tratamiento exclusivo con TP508 con una concentración de 300 nM (aproximadamente 0,7 \mug por ml) estimula la incorporación de sulfato (^{35}S) aproximadamente un 50% por encima de los controles. También se registra una importante estimulación con 30 \muM TP508 (aproximadamente 70 \mug por ml); pero en cambio, se observa una gran desviación relativa en las mediciones con esta concentración.

TABLA 3

4

Ejemplo 4 Preparación de microsferas de copolímero de ácido poliláctico/ácido poliglicólico de TP508

Se utilizó una técnica de doble emulsión para preparar microsferas de copolímero de ácido poliláctico/ácido poliglicólico (PLGA) con contenido en TP508. En pocas palabras, los componentes matriciales se disolvieron en cloruro de metileno y el TP508 se disolvió en agua. Los dos se mezclaron gradualmente entre sí al tiempo que se centrifugó para formar una emulsión de agua en aceite (W/O). Luego, se añadió alcohol de polivinilo (0,3% en agua) a la emulsión centrifugando nuevamente para formar la segunda emulsión (O/W), formando una doble emulsión: una emulsión O/W formada por gotas de PLGA y, dentro de estas gotas, una segunda fase dispersa constituida por TP508 en agua. Después de la separación de fases, las gotas de PLGA formaron microsferas discretas que contenían cavidades con TP508. Para lograr la separación de fases de las microsferas, se agregó una solución alcohólica de isopropilo al 2%. Las partículas se recogieron por centrifugación y después se liofilizaron para eliminar la humedad residual. La composición de la matriz se varió para formar microsferas con diferente cinética de desprendimiento
(Tabla 4).

TABLA 4

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El diámetro medio de las microsferas se midió en un contador Coulter y la eficacia de retención de la droga se midió mediante ensayo espectrofotométrico en 276 después de la disolución de una muestra pesada de microsferas en cloruro de metileno y de la extracción de la droga soltada en agua (Tabla 5).

TABLA 5

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Para medir la salida de TP508 de las diferentes matrices de PLGA, se colocaron 29 mg de microsferas en 1.0 ml de PBS contenido en 1.5 ml de tubos microcentrífugos de polipropileno.

Los tubos se incubaron a 37ºC y se agitaron a 60 rpm. En diversas ocasiones se centrifugaron los tubos y se eliminó el TP508 soltado que contenía sobrenadante y se congeló para análisis subsiguiente. Luego, se agregó PBS reciente a las microsferas y se continuó la incubación. El TP508 del sobrenadante se midió por absorbancia en 276 nm. Para cada fórmula se realizaron determinaciones cuadruplicadas de la salida. Las fórmulas B y D no demostraron salida de droga detectable durante 28 días de incubación a 37ºC, mientras que las fórmulas restantes registraron cantidades detectables de TP508, aunque en todos los casos la cantidad de droga salida se encontraba debajo de límites detectables (<1 \mug/mg matriz/día). Las fórmulas A y C registraron la mayor salida de TP508, soltando 60-80% de la droga retenida en 3-4 días. La fórmula C registró la cinética más rápida de desprendimiento y fue elegida para comprobar el modelo de defectos del cartílago en el conejo que se describe en el ejemplo 5.

Ejemplo 5 El agonista NPAR TP508 estimula el crecimiento del cartílago en modelos de conejo

Se anestesiaron conejos jóvenes machos neozelandeses (2-3 kilos) (n=15) a los que se administraron artrotomías paratelares bilaterales longitudinales y mediales. Se incidieron la piel, el tejido subcutáneo y la cápsula articular para minimizar la hemorragia. La superficie de la articulación se dejó al descubierto mediante la dislocación lateral de la rótula. Se practicó una incisión de 3 mm de diámetro y 1-2 mm de profundidad en todo el espesor en la hendidura troclear del fémur utilizando un taladro quirúrgico y una punta de acero inoxidable. El objetivo era el de extender la incisión en el interior de la placa subcondral sin perforar el hueso subcondral.

Los conejos se dividieron tres grupos. Para cada conejo, se rellenaron el mismo tratamiento los defectos de la ranura troclear derecha e izquierda. Para este estudio, el TP508 se formuló en microsferas PLGA de salida controlada, preparadas en la forma descrita en el ejemplo 4 (Fórmula C). Las microsferas se mezclaron con suficiente gel plurónico F68 para ligar las esferas entre sí con una consistencia pastosa que pudiera aplicarse fácilmente en el defecto. El grupo de control recibió microsferas PLGA sin TP508 en ambos defectos y los grupos tratados recibieron microsferas que contenían 10 ó 50 mg de TP508 por defecto. Un conejo de cada grupo fue sacrificado a las 4 semanas, dos de cada grupo fueron sacrificados a las 6 semanas y los restantes animales fueron sacrificados a las 9 semanas. Las muestras se fijaron y procesaron para análisis histológico.

En el momento del sacrificio se observó considerable tejido de granulación fibroso y no se observaron evidencias de material cartilaginoso blanco en los defectos de control. En cambio, el defecto tenía un relleno de material blanco, denso y casi uniforme en los defectos del grupo de 10 \mug tratado y del grupo de 50 \mug. A las 6 semanas de la cirugía, las diferencias macroscópicas entre los defectos tratados y los de control no eran tan acusadas.

La histología de las muestras de cuatro semanas demostró que indudablemente se rellenaron los defectos de control con lo que parecía representar tejido de granulación incipiente con inclusión de células inflamatorias y fibroblásticas. En cambio, los defectos tratados de 10 y 50 microgramos parecían tener un gran número de condrocitos y señales prematuras de formación de cartílago, efecto este que se comprobó más espectacularmente en la semana sexta. Los controles tenían una pequeña cantidad de tejido conectivo; pero pocas señales de reparación del cartílago. En cambio, en los dos defectos tratados de 10 \mug y 50 \mug se parecía observar una buena integración con la formación de cartílago hialino en la parte superior del defecto y una amplia reparación del hueso subcondral.

Los defectos tratados con TP508 en nueve semanas exhibieron una matriz predominantemente hialina con señales de contenido en agrecano como lo indicaba una coloración positiva en safranina O. En la mayoría de los casos no se registró diferencia en el contenido en agrecano entre el lugar de reparación del tejido nativo. Los resultados histológicos se evaluaron cuantitativamente utilizando un sistema de graduación adaptado por Free y col., J. Biomed. Materials Res. 28:891-899 (1944) a partir del esquema de O'Driscoll y col. J. Bone Joint Surg. 126:1448-1452 (2000) con una puntuación máxima de 25 para el cartílago articular normal. Los defectos tratados con TP508 alcanzaron unas puntuaciones medias significativamente mayores que los defectos de control (Tabla 6).

TABLA 6

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Los defectos tratados con péptidos se repararon con superficies articulares suaves y ligaron generalmente bien en la unión entre la reparación y el tejido nativo. La calidad del tejido de reparación de control se caracterizó como en su mayor parte como fibrocartílago con superficies de unión deficientes. La integración en la unión entre los tejidos de reparación y nativo fue generalmente mala. En general, la calidad del cartílago reparado con TP508 fue significativamente mejor que la de los defectos de control no tratados. Esta calidad mejorada del tejido de reparación conduce a una restauración más duradera y funcional de la biomecánica de la articulación y a una disminución de la incidencia de osteoartritis en pacientes que sufren daños traumáticos en los cartílagos.

Claims

1. La aplicación de un agonista del receptor de trombina no proteolíticamente activada para la producción de un medicamento para estimular el crecimiento o la reparación en una zona de un paciente que necesita tal crecimiento o reparación.

2. La aplicación de la reivindicación 1 cuando el asentamiento es una articulación artrítica.

3. La aplicación de la reivindicación 1 cuando el asentamiento está siendo tratado por daños o pérdida de cartílago.

4. La aplicación de la reivindicación 1 cuando el asentamiento está siendo tratado por daños o pérdida de cartílago a causa de lesiones traumáticas.

5. La aplicación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 cuando el agonista es un derivado péptido de la trombina.

6. La aplicación de la reivindicación 5 cuando el agonista es un derivado péptido de la trombina que contiene un polipéptido representado por la siguiente fórmula estructural:

Asp-Ala-R;

en donde R es una secuencia conservada en esterasa de serina.

7. La aplicación de la reivindicación 5 cuando el derivado péptido de la trombina contiene la secuencia de aminoácido Arg-Gli-Asp-Ala (SEQ ID nº 3).

8. La aplicación de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 cuando el derivado péptido de la trombina tiene entre 12 y 23 aminoácidos.

9. La aplicación de la reivindicación 6 cuando la secuencia conservada en esterasa de serina tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID nº 1 (Cis-Glu-Gli-Asp-Ser-Gli-Gli-Pro-Phe-Val) o una fracción truncada con terminal C con un mínimo de seis aminoácidos, siempre que los aminoácidos cero, uno, dos o tres de la secuencia conservada en estarasa de serina difieran de la posición correspondiente de SEQ ID nº 1.

10. La aplicación de la reivindicación 6 cuando la secuencia conservada en estarasa de serina tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID nº 1 (Cis-Glu-Gli-Asp-Ser-Gli-Gli-Pro-Phe-Val) o una fracción truncada de terminal C de la misma con un mínimo de nueve aminoácidos, siempre que los aminoácidos cero, uno o dos de la zona conservada en estarasa de serina sean sustituciones conservadoras del aminoácido correspondiente en la SEQ ID núm. 1.

11. La aplicación de la reivindicación 6 cuando la secuencia conservada en esterasa de serina tenga la secuencia de aminoácido de SEQ ID núm. 2 (Cis-X1-Gli-Asp-Ser-Gli-Gli-Pro-X2-Val, en donde X1 es Glu o Gln y X2 es Phe, Met, Leu, His o Val), o una fracción truncad de término C de SEQ ID núm. 2, conteniendo dicha fracción por lo menos seis aminoácidos.

12. La aplicación de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 cuando el derivado péptido de la trombina contiene la secuencia de aminoácido Arg-Gli-Asp-Ala-Cis-X1-Gli-Asp-Ser-Gli-Gli-Pro-X3-Val (SEQ ID núm. 4), en donde X1 es Glu o Gln y X2 es Phe, Met, Leu, His o Val.

13. La aplicación de la reivindicación 12 cuando el derivado péptido de la trombina posee la secuencia de aminoácido Ala-Gli-Tyr-Lis-Pro-Asp-Glu-Gli-Lis-Arg-Gli-Asp-Ala-Cis-Glu-Gli-Asp-Ser-Gli-Gli-Pro-Phe-Val (SEQ ID núm. 5) o una fracción truncada de terminal N de la misma, siempre que los aminoácidos cero, uno, dos o tres de las posiciones 1-9 del derivado péptido de la trombina difieran del aminoácido de la posición correspondiente de SEQ ID núm. 5.

14. La aplicación de la reivindicación 12 cuando el derivado péptido de la trombina tiene la secuencia de aminoácido Ala-Gli-Tir-Lis-Pro-Asp-Glu-Gli-Lis-Arg-Gli-Asp-Ala-Cis-Glu-Gli-Asp-Ser-Gli-Gli-Pro-Phe-Val (SEQ ID núm. 5) o una fracción truncada de terminal N de la misma, siempre que los aminoácidos cero, uno o dos de las posiciones 1-9 sean sustituciones conservadoras del aminoácido en la correspondiente posición de SEQ ID núm. 5.

15. La aplicación de la reivindicación 14 cuando el derivado péptido de la trombina posee la secuencia Ala-Gli-Tir-Lis-Pro-Asp-Glu-Gli-Lis-Arg-Gli-Asp-Ala-Cis-Glu-Gli-Asp-Ser-Gli-Gli-Pro-Phe-Val (SEQ ID núm. 5).

16. La aplicación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 cuando el medicamento es una composición farmacéutica que contiene, además, un soporte implantable biocompatible.

17. La aplicación de la reivindicación 16 cuando el portador contiene un homopolímero o copolímero de ácido poliláctico/ácido poliglicólico.

18. Un procedimiento para cultivar condrocitos "in vitro" que comprende el cultivo de los condrocitos en presencia de una cantidad estimuladora de un receptor superficial celular de trombina no proteolítica.