JP2004504354A - 非タンパク質分解的活性化トロンビンレセプターのアゴニストによる軟骨成長の刺激 - Google Patents

Abstract

軟骨の成長、修復または再生を必要とする被検体の部位で軟骨の成長、修復または再生を刺激する方法が開示される。本方法は、非タンパク質分解的活性化トロンビンレセプターの治療有効量を該部位に投与することを含む。インビボで軟骨細胞の増殖および拡大を刺激する方法も開示される。本方法は、ＮＰＡＲアゴニストの刺激量の存在下で軟骨細胞を培養することを含む。

Description

【０００１】
政府の支援
本発明の全部または一部は、国立衛生研究所／国立関節炎筋骨格皮膚病研究所から助成金１Ｒ４３ＡＲ４６３４３−０１を受けてなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願
本願は２０００年７月２０日に出願された米国仮出願第６０／２１９，８００の利益を主張し、同仮出願の内容は参照によって本明細書に組み入れられるものとする。
【０００３】
発明の背景
大半の組織とは異なり、軟骨は傷害後に自己修復しない。軟骨は主に軟骨特異な細胞である軟骨細胞、特別なタイプのコラーゲンおよびプロテオグリカンからなる無血管組織である。軟骨が傷害、疾患または手術後に自己修復できないことは、関節面の破壊および半月軟骨への傷害のリハビリテーションにおける主な制限因子である。体重負荷関節面の主な変性疾患である変形性関節症は軟骨面の侵食または損傷によって起こり、５０歳超の集団では約２５％に認められる。米国では２０００万人を超える人々が変形性関節症に罹っており、それに伴う年間医療費は８６億米ドルを超える。また、急性関節傷害（半月障害、膝蓋面損傷および軟骨軟化症）からの軟骨修復の費用は年間１０億米ドルを超える。したがって、変性または急性外傷によって起こる軟骨の障害を治癒させるために、新しい治療法が必要とされている。
【０００４】
発明の概要
関節軟骨から単離した軟骨細胞は、非タンパク質分解的トロンビン（ｎｏｎ−ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｔｈｒｏｍｂｉｎ）細胞表面レセプター（以下「ＮＰＡＲ」という）を活性化する化合物に反応することを、ここに見出した。例えば、軟骨細胞は１細胞あたり約２３３，０００のトロンビン結合部位を発現させ、見かけの親和性は約０．１ｎＭ（３０００部位）および２７ｎＭ（２３０，０００部位）である（実施例１）。また、非タンパク質分解的トロンビンレセプターのアゴニストである化合物ＴＰ５０８は、共同分裂促進因子としてのトロンビンの存在下に培養ウシ軟骨細胞の増殖を刺激し（実施例２Ａ）、また単独で、三次元マトリックス培養における培養ラット軟骨細胞の増殖を刺激する（実施例３Ａ）。また、このＴＰ５０８化合物は、ウシ軟骨細胞（実施例２Ｂ）およびラット軟骨細胞の３次元培養物（実施例３Ｂ）の両方で、プロテオグリカン合成（^３５Ｓ−硫酸の取込みによって測定）も刺激する。これらのインビトロ実験により、ＮＰＡＲアゴニストは、関節軟骨から単離された軟骨細胞において、増殖およびマトリックス産生を刺激できることが実証される。また、軟骨下骨に達するウサギ滑車溝欠損部に徐放性製剤の形でＴ５０８を送達すると、軟骨下骨の修復、正常な軟骨面の回復、および新たに形成された軟骨と欠損領域外の無傷害軟骨との統合を含む軟骨欠損の修復が起こることも、さらなるインビボ実験によって実証される（実施例５）。
【０００５】
先の段落に記載した結果に基づいて、本明細書には、インビボでの軟骨細胞成長および被験体における軟骨修復を刺激する新規方法、ならびに表面修復を促進し関節破壊を防止するために関節欠損部に医薬組成物を送達するための新規送達法を開示する。
【０００６】
本発明は、軟骨の成長、修復または再生が必要な被験体内の部位における軟骨の成長、修復または再生を刺激する方法である。本方法は、治療有効量の非タンパク質分解的活性化トロンビンレセプター（ｎｏｎ−ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ）のアゴニストを傷害部位に投与することを含む。
【０００７】
本発明のもう１つの実施形態は、インビトロでの軟骨細胞の増殖および拡大を刺激する方法である。本方法は、刺激量のＮＰＡＲアゴニストの存在下で軟骨細胞を培養することを含む。
【０００８】
発明の詳細な説明
軟骨の成長、修復または再生を必要とする部位は、変形性関節症を持つ被験体に見出される。変形性関節症または変性関節疾患は、痛みと機能喪失を特徴とする緩徐進行性、不可逆性で、多くの場合、単関節性の疾患である。この痛みと衰弱の根本的原因は、この疾患の主症状の一つである軟骨破壊である。硝子軟骨は骨端を覆う柔軟な組織であり、膝などの関節の間に存在する。また硝子軟骨は脊柱に沿って骨の間にも見出される。軟骨は滑らかであって、最低限の摩擦で安定した柔軟な動きを可能にするが、耐圧縮性でもあり、負荷荷重を分散させることができる。変形性関節症が進行するにつれて、軟骨および露出した下層の骨の表面は不規則になる。骨ばった関節面は滑らかにはすべらなくなり、互いに擦れ合って、硬直と痛みをもたらす。これらの関節部位における損傷軟骨の再生および新しい軟骨の成長は、その痛みを和らげ、変形性関節症に伴って喪失した機能を回復させるだろう。
【０００９】
軟骨損傷は、傷害または手術に起因する外傷からも起こりうる。スポーツ傷害は、特に膝などの関節への軟骨損傷の一般的原因である。軟骨への外傷性傷害は同じタイプの機能障害を引き起こしうる。したがって、外傷または疾患による損傷を受けた軟骨を持つ被験体内の部位には、軟骨の成長を回復しまたは促進するための治療が必要である。
【００１０】
出願人らは、非タンパク質分解的活性化トロンビンレセプター（以下「ＮＰＡＲ」という）を刺激または活性化する化合物が、軟骨細胞を刺激して増殖させうることを発見した。軟骨細胞は軟骨の体積の約１％を占め、組織の妥当な体積と機械的性質とを保つために、分解されたマトリックス分子を補っている細胞である。出願人らは、ＮＰＡＲを刺激または活性化する化合物が、軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成を刺激することも見出した。プロテオグリカンは軟骨の主要成分である。これらの結果に基づいて、出願人らは、徐放性製剤として調製したＮＰＡＲアゴニストＴＰ５０８をウサギ滑車溝軟骨の欠損部に送達し、本ペプチドが、正常な軟骨面を持つ新しい軟骨の形成を含む前記欠損の修復を刺激することを発見した。また本ペプチドは、この新しい軟骨の、隣接する無傷害軟骨への層化および統合、ならびに軟骨下骨の回復も刺激した。軟骨の成長および／または修復を必要とする部位に投与した場合、ＮＰＡＲアゴニストは軟骨の成長および修復を誘導することができると結論づけられる。
【００１１】
ＮＰＡＲを刺激または活性化する化合物は、ＮＰＡＲアゴニストであるといわれる。ＮＰＡＲは大半の細胞の表面に存在する高親和性トロンビンレセプターである。ＮＰＡＲは主にトロンビン、タンパク質分解的に不活化したトロンビン、およびトロンビン由来ペプチドの細胞への高親和性結合を担っている。ＮＰＡＲアゴニストおよびＮＰＡＲアンタゴニストは、細胞への親和性結合に関してトロンビンと競合することができる（例えばＧｌｅｎｎら、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１：６５（１９８８）参照）。ＮＰＡＲは、トロンビンがそのタンパク質分解活性とは無関係に開始するいくつかの細胞シグナルを媒介するようである。そのようなシグナルの一例は、アネキシンＶおよび差引きハイブリッド形成法によって同定された他の分子のアップレギュレーションである（Ｓｏｗｅｒら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２４７：４２２（１９９９）参照）。したがってＮＰＡＲは、以下に述べるように、細胞表面でトロンビンと高親和性相互作用をすること、およびタンパク質分解的に不活性なトロンビン誘導体およびトロンビン由来ペプチドによって活性化されることを特徴とする。ＮＰＡＲの活性化は、米国特許第５，３５２，６６４号および第５，５００，４１２号に開示されているように、分裂促進濃度未満のトロンビンの存在下またはプロテインキナーゼＣを活性化する分子の存在下で線維芽細胞に添加した場合に細胞増殖を刺激するというＮＰＡＲアゴニストの能力に基づいて測定することができる。
【００１２】
ＮＰＡＲは、他のトロンビン結合タンパク質、およびトロンビンのタンパク質分解的活性化レセプターのクローン化されたファミリー（レセプターＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３およびＰＡＲ４を含む）とは区別されるべきである。ＰＡＲ１は特異的トロンビン切断部位を持ち、その部位がトロンビン切断されることによって新しいアミノ末端ドメインが露出し、そのアミノ末端ドメインが、自分自身に折り返して自らの活性化を誘導する繋留（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）リガンドとして作用する（Ｖｕら、Ｃｅｌｌ　６４：１０５７（１９９１）参照）。ＰＡＲ２は同様の活性化機序を持つが、主にトリプシン様酵素によって活性化される（Ｚｈｏｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６７：１６９７５（１９９２）参照）。ＰＡＲ３も同様の活性化機序を持ち、血小板において第２のトロンビンレセプターとして機能するようである（Ｉｓｈｉｈａｒａら、Ｎａｔｕｒｅ　３８６：５０２（１９９７）参照）。ＰＡＲ４はマウス巨核球中に検出されており、ヒト血小板中でも機能することが示唆されている（Ｋａｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３９４：６９０（１９９８）参照）。これらのＰＡＲレセプターとは対照的に、ＮＰＡＲの活性化はタンパク質分解的切断を必要としない。
【００１３】
ＮＰＡＲがＰＡＲレセプターとは異なることは、数系統の証拠が示している。すなわち（１）完全に機能的なＰＡＲ１レセプターを発現させるが、ＮＰＡＲシグナル伝達経路に欠損があるためトロンビンに対して非応答性である細胞集団が単離されている（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６０：５７３（１９９４）参照）；（２）好中球は^１２５ Ｉ−トロンビンを高い親和性で結合し、好中球の走化性はタンパク質分解的に不活化したトロンビンまたはＮＰＡＲアゴニストによって刺激される（ＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎおよびＣａｒｎｅｙ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ　４：１９９３（１９９３）参照）にもかかわらず、好中球はＰＡＲ１を発現させない（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ．　１０８：３０５９（１９９５）参照）；（３）ＩＩＣ９線維芽細胞はＰＡＲ１を過剰発現させるが、トロンビンを高い親和性では結合しない（Ｋｉｍ，Ｄ．博士論文（テキサス大学医学部ガルベストン校、１９９５年）およびＬｏｗら　「癌細胞３／成長因子およびトランスフォーメーション」（コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク）参照）；（４）ＮＰＡＲアゴニストは遺伝子発現に対してＰＡＲレセプターアゴニストペプチドとは異なる効果を持つ（Ｓｏｗｅｒら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２４７：４２２（１９９９）参照）。
【００１４】
ＮＰＡＲアゴニストの一例はトロンビンペプチド誘導体、すなわち、アミノ酸数が約５０以下、好ましくは約３０以下であって、プロトロンビンアミノ酸５０８〜５３０（配列番号５）に相当するヒトトロンビンの断片に対して、当該ポリペプチドがＮＰＡＲを活性化するのに十分であるようなホモロジーを持つポリペプチドである。本明細書に記載するトロンビンペプチド誘導体は、好ましくは約１２〜２３アミノ酸、より好ましくは約１９〜２３アミノ酸を持つ。トロンビンペプチド誘導体の一例は、構造式（Ｉ）：
Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｒ　（Ｉ）
によって表される部分を含む（式中、Ｒはセリンエステラーゼ保存ドメインである）。例えばトリプシン、トロンビン、キモトリプシンなどのセリンエステラーゼは高度に保存された領域を持っている。「セリンエステラーゼ保存ドメイン」は、これら保存領域の一つのアミノ酸配列を持つポリペプチドを指すか、または当該トロンビンペプチド誘導体がＮＰＡＲ活性化能を保つように、これら保存領域の一つに対して十分に相同である。
【００１５】
一実施形態として、セリンエステラーゼ保存配列は配列番号１のアミノ酸配列（Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）または配列番号１のアミノ酸配列を持つポリペプチドのＣ末端切断断片を有する。しかし、セリンエステラーゼ保存配列中の０、１、２または３アミノ酸は、配列番号１中の対応するアミノ酸とは異なりうると解釈される。配列番号１中の対応するアミノ酸と相違するセリンエステラーゼ保存配列中のアミノ酸は好ましくは保存的置換であり、より好ましくは高度に保存的な置換である。　「Ｃ末端切断断片（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、Ｃ末端から１アミノ酸または一続きのアミノ酸を除去した後に残っている断片を指し、前記断片は少なくとも６アミノ酸、より好ましくは少なくとも９アミノ酸を持つ。
【００１６】
より好ましくは、セリンエステラーゼ保存配列は、配列番号２のアミノ酸配列（Ｃｙｓ−Ｘ_１ −Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２ −Ｖａｌ；Ｘ_１ はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ_２ はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである）またはアミノ酸数が少なくとも６、好ましくは少なくとも９であるそのＣ末端切断断片を有する。
【００１７】
好ましい一実施形態では、トロンビンペプチド誘導体は、セリンエステラーゼ保存配列と、より特異的なトロンビンアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ（配列番号３）を有するポリペプチドとを含む。このタイプのトロンビンペプチド誘導体の一例はＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ_１ −Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２ −Ｖａｌ（配列番号４）を含む。Ｘ_１ およびＸ_２ は上記の定義に従う。トロンビンペプチド誘導体が配列番号４を含む場合、その誘導体は、配列番号５のアミノ酸配列（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）またはそのＮ末端切断断片を持つことが好ましい。ただし、当該トロンビンペプチド誘導体中の１〜９位にある０、１、２または３アミノ酸は、配列番号５の対応する位置にあるアミノ酸とは異なるものとする。配列番号５中の対応するアミノ酸とは異なるトロンビンペプチド誘導体中のアミノ酸は好ましくは保存的置換であり、より好ましくは高度に保存的な置換である。「Ｎ末端切断断片（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、Ｎ末端から１アミノ酸または一続きのアミノ酸（好ましくは６アミノ酸以下の一続きのアミノ酸、より好ましくは３アミノ酸以下の一続きのアミノ酸）を除去した後に残っている断片を指す。
【００１８】
ＴＰ５０８はトロンビンペプチド誘導体の一例であり、配列番号５のアミノ酸配列を持つ。
【００１９】
「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、あるアミノ酸を同じ正味の電荷およびほぼ同じサイズと形状を持つ別のアミノ酸で置き換えることをいう。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を持つアミノ酸は、側鎖中の炭素およびヘテロ原子の総数の相違が約４以下であれば、ほぼ同じサイズを持つ。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を持つアミノ酸は、側鎖中の分枝数の相違が１以下であれば、ほぼ同じ形状を持つ。側鎖にフェニルまたは置換フェニル基を持つアミノ酸は、ほぼ同じサイズと形状を持つとみなされる。以下に５つのアミノ酸群を挙げる。ポリペプチド中のアミノ酸を同じ群から選択した別のアミノ酸で置換すると保存的置換になる。
Ｉ群：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、およびＣ１−Ｃ４脂肪族またはＣ１−Ｃ４ヒドロキシル置換脂肪族側鎖（直鎖または一分岐）を持つ非天然アミノ酸。
ＩＩ群：グルタミン酸、アスパラギン酸、およびカルボン酸置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐点）を持つ非天然アミノ酸。
ＩＩＩ群：リジン、オルニチン、アルギニン、およびアミンまたはグアニジノ置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐点）を持つ非天然アミノ酸。
ＩＶ群：グルタミン、アスパラギン、およびアミド置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐点）を持つ非天然アミノ酸。
Ｖ群：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、およびトリプトファン。
【００２０】
「高度に保存的な置換」とは、あるアミノ酸を、側鎖中に同じ官能基を持ち、ほぼ同じサイズと形状を持つ別のアミノ酸で置き換えることをいう。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を持つアミノ酸は、側鎖中の炭素およびヘテロ原子の総数の相違が２以下であれば、ほぼ同じサイズを持つ。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を持つアミノ酸は、側鎖中の分枝の数が同じであれば、ほぼ同じ形状を持つ。高度に保存された置換の例としては、バリンによるロイシンの置換、スレオニンによるセリンの置換、アスパラギン酸によるグルタミン酸の置換、フェニルグリシンによるフェニルアラニンの置換などが挙げられる。高度に保存的な置換ではない置換の例としては、アラニンによるバリンの置換、アラニンによるセリンの置換、アスパラギン酸によるセリンの置換などが挙げられる。
【００２１】
他のＮＰＡＲアゴニストには、ＮＰＡＲに結合して活性化する小さい有機分子が含まれる。このタイプのアゴニストは、Ｇｌｅｎｎら（前掲）ならびに米国特許第５，３５２，６６４号および第５，５００，４１２号に開示されているように、ハイスループットスクリーニングによって、例えば分裂促進濃度未満のトロンビンまたはプロテインキナーゼＣを活性化する分子の存在下で線維芽細胞に添加した場合に細胞増殖を刺激するという分子の能力を評価するアッセイによって、または表面ＮＰＡＲレセプターを持つ細胞に対して^１２５ Ｉ−トロンビンと競合するというこれらの分子の能力を評価するアッセイによって、便利に同定することができる。Ｇｌｅｎｎらならびに米国特許第５，３５２，６６４号および第５，５００，４１２号の全内容は参照によって本明細書に組み入れられるものとする。
【００２２】
「ＮＰＡＲアゴニスト」という用語は、ＮＰＡＲを活性化することが知られている化合物および化合物の組み合わせも包含する。その例は、米国特許第５，３５２，６６４号および第５，５００，４１２号に開示されており、トロンビンおよびＤＩＰ−α−トロンビンなどが挙げられる。
【００２３】
本発明の方法で使用されるＮＰＡＲアゴニストは通例、軟骨の成長、修復または再生を必要とする部位に、医薬組成物の１成分として投与される。治療を必要とする部位への投与とは、軟骨成長または軟骨再生（例えばＮＰＡＲアゴニスト不在下よりも量的に多い、または質的に高い、ＮＰＡＲアゴニスト存在下での軟骨成長）が当該部位で起こるように、治療を必要とする部位の十分近くに、ＮＰＡＲアゴニストを含有する医薬組成物を投与することを意味する。
【００２４】
投与手段の一つとして、医薬組成物はＮＰＡＲアゴニストと適切な担体とを含む溶液である。溶液は、治療を必要とする部位に直接、または治療を必要とする部位に近接して適用される。溶液の投与は、例えば注射器による関節内投与で、または損傷した組織のごく近傍に注射器で、または外科的切開によって、便利に達成することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルバニア州イーストン）に記載されているような標準的医薬製剤法を使用することができる。適切な医薬担体としては、例えば生理食塩水、静菌性食塩水　（約０．９％ｍｇ／ｍｌのベンジルアルコールを含む食塩水）、リン酸緩衝食塩水、ハンクス液、乳酸リンゲル液などが挙げられる。
【００２５】
もう１つの投与手段として、医薬組成物は、ＮＰＡＲアゴニストと、移植可能な生体適合性担体とを含む。生体適合性担体は、無毒性、非炎症性、非免疫原性であり、移植部位で他の望ましくない反応を起こさないべきである。適切な担体では活性成分の放出も可能であり、好ましくは移植部位での長時間にわたる緩慢な持続的放出が可能である。
【００２６】
多くの合成生分解性ポリマーは徐放性を持つ担体として役立ちうる。これらのポリマーの例には、ポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーなどのポリα−ヒドロキシエステル、およびポリ無水物がある。
【００２７】
ポリ乳酸／ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）ホモポリマーおよびコポリマーは徐放性賦形剤として当技術分野ではよく知られている。当業者はポリ乳酸対ポリグリコール酸比およびポリマーの分子量を変えることによって放出速度を調節することができる（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．　２８：５（１９９７）参照、この文献の全内容は参照によって本明細書に組み入れられる）。ポリマー配合物にポリ（エチレングリコール）を組み入れることにより、活性成分の放出プロフィールをさらに減衰させることができる（Ｃｌｅｅｋら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｒｅｌｅａｓｅ　４８：２５９（１９９７）参照、この文献の全内容は参照によって本明細書に組み入れられる）。軟骨成長因子用担体としての使用に適した移植可能なＰＬＧＡポリマーは、米国特許第６，０１３，８５３号、第５，６０７，４７４号および第５，８７６，４５２号に記載されており、これら米国特許の全内容は参照によって本明細書に組み入れられる。
【００２８】
構造式（ＩＩ）に示すポリ無水物は、様々な量の疎水性または親水性モノマー（セバシン酸および１，３−ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンなど）を含めることによって制御することができる明確な分解および放出特性を持つ　（Ｌｅｏｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．　１９：９４１（１９８５）、この文献の全内容は参照によって本明細書に組み入れられる）。機械的強度を向上させるために、多くの場合、無水物をイミドと共重合して、ポリ無水物−ｃｏ−イミドを形成させる。整形外科用途に適したポリ無水物−ｃｏ−イミドの例は、ポリ［トリメリチルイミドグリシン−ｃｏ−１，６−ビス（カルボキシフェノキシ）ヘキサン］、およびピロメリチルイミドアラニン：１，６−ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ヘキサンコポリマーである。
【００２９】
【化１】

【００３０】
医薬組成物は手術を想定して望ましい形状にしておくか、手術中に医師または技工士の手で形作ることができる。組織欠損部をまたいで所望する新組織の形状をとるようにマトリックスを形作ることが好ましい。大きい欠損部の軟骨修復の場合は、その欠損をまたぐ寸法を使用することが望ましい。移植後に上記材料は身体によってゆっくり吸収され、当該インプラントの形状または当該インプラントの形状に極めて近い形状の軟骨に置き換わる。
【００３１】
ある態様では、担体は、内部に前駆細胞が遊走できる多孔性マトリックスである。細胞は多くの場合このような多孔性マトリックスに付着することができ、その場合、多孔性マトリックスは組織成長の足場として機能することにより、骨成長速度を加速することができる。治癒をさらに促進するために、移植に先立って、軟骨細胞を上記のようなマトリックスに適用することができる。コラーゲンまたはコラーゲンゲルは、適切な多孔性マトリックスの一例である。
【００３２】
もう一つの態様では、担体は、関節内にまたは治療を必要とする部位に注射することができる粘性溶液またはゲルである。ヒアルロン酸はこのタイプの担体の一例である。ヒアルロン酸製品は市販されており、例えばＡｎｉｋａが開発したＯＲＴＨＯＶＩＳＣ、Ｂｉｏｍａｔｒｉｘが開発したＳＹＮＶＩＳＣ、Ｆｉｄｉａが開発したＨＹＡＬＧＡＮ、および生化学工業が開発したＡＲＴＺなどがある。プルロニックゲルはこのタイプの担体のもう１つの例である。プルロニックゲルはエチレンオキシドとプロピレンオキシドの無毒性ブロックコポリマーである。プルロニックゲルは熱硬化性を示すため、室温では粘性液体として存在し、体温ではゲルとして存在することができる。注射用組成物は治療を必要とする部位に直接適用することができ、侵襲的手術を行う必要はない。ポリ（エチレンオキシド）のポリマーおよびエチレンとプロピレンオキシドのコポリマーも、注射可能なマトリックスとして適切である（Ｃａｏら、Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ　９：４７５（１９９８）およびＳｉｍら、Ｐｌａｓｔ　Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．　９８：８４３（１９６）参照；これらの文献の全内容は参照によって本明細書に組み入れられる）。
【００３３】
「治療有効量」とは、ＮＰＡＲアゴニスト存在下でＮＰＡＲアゴニスト不在下よりも大きい軟骨成長または軟骨修復をもたらすＮＰＡＲアゴニスト（または軟骨細胞）の量をいう。前記に代えて、または前記に加えて、「治療有効量」とは、軟骨損傷に伴う痛みおよび／または機能喪失の緩和をもたらすＮＰＡＲアゴニスト（または軟骨細胞）の量をいう。通例、アゴニスト（または軟骨細胞）は、所望の治療効果を達成するのに十分な期間にわたって投与される。投与量は、所望する軟骨成長の量、被験体の健康状態、サイズ、体重、年齢および性別、ならびに当該医薬製剤の放出特性に依存するだろう。通例、約０．１μｇ／日〜約１ｍｇ／日のＮＰＡＲアゴニスト（好ましくは約５μｇ／日〜約１００μｇ／日）を、連続的放出によって、または軟骨の成長もしくは修復を必要とする部位への直接適用によって投与する。
【００３４】
「被験体」は好ましくはヒトであるが、治療を必要とする動物、例えば伴侶動物（例：イヌ、ネコなど）、家畜（例：ウシ、ブタ、ウマなど）および実験動物（例：ラット、マウス、モルモットなど）であってもよい。
【００３５】
ＮＰＡＲアゴニストは、単離された軟骨細胞の成長を促進するために、または単離された軟骨細胞の機能性を維持するために使用することができる。一実施形態として、増殖を刺激してより迅速な増殖を可能にし、そして／または初代細胞単離物を培養状態に置いた時にしばしば認められるアポトーシス死または細胞の老化を防止するために、ＮＰＡＲアゴニストを組織培養培地に添加することができる。もう１つの実施形態として、ＮＰＡＲアゴニストはマトリックス産生を刺激するらしいので、培養軟骨細胞の分化した機能性を維持するために、かかるＮＰＡＲアゴニストを使用することもできるだろう。ＮＰＡＲアゴニストは標準的に規定された組織培養培地に単独で使用するか、軟骨細胞のインビトロでの産生または維持に対する相加的または相乗的効果を得るために、血清または他の成長因子を含有する組織培養培地への補助物質として使用することができる。アゴニストが存在しない場合と比較して、より迅速な軟骨細胞の成長が得られるように、またはより高い軟骨細胞の機能性が維持されるように、十分な量（すなわち　「刺激量」）のＮＰＡＲアゴニストを培養物に添加する。典型的には約０．１μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌのＮＰＡＲアゴニストが使用される。
【００３６】
ＮＰＡＲアゴニストの存在下で培養した軟骨細胞は、治療を必要とする部位に治療有効量の軟骨細胞を投与することによって軟骨損傷を治療するために使用することもできる。軟骨細胞の場合も、「治療有効」とは、治療により、治療を施さない場合よりも大きい軟骨成長または軟骨修復が得られることを意味する。軟骨損傷の治療を目的とする軟骨細胞の投与は、米国特許第４，８４６，８３５号に記載されており、その全内容は参照によって本明細書に組み入れられるものとする。
【００３７】
トロンビンペプチド誘導体は固相ペプチド合成（例えばＢＯＣまたはＦＭＯＣ）法、液相合成、または他の適切な技術（前記方法の組み合わせを含む）によって合成することができる。確立された方法であって広く使用されているＢＯＣ法とＦＭＯＣ法は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．　８８：２１４９（１９６３）、Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｈｏｒｍｏｎａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｃ．Ｈ．Ｌｉ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９８３）の４８〜２６７頁、ならびにＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｅ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９８０）の３〜２８５頁に記載されている。固相ペプチド合成の方法は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３２：３４１（１９８６）、Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｌ．Ａ．およびＨａｎ，Ｇ．Ｙ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．　３７：３４０４（１９７２）、ならびにＧａｕｓｐｏｈｌ，Ｈ．ら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　５：３１５（１９９２）に記載されている。これら６つの文献の内容は、参照により完全な形で本明細書に組み入れられるものとする。
【００３８】
以下、実施例によって本発明を例証するが、以下の実施例は決して限定を意図するものではない。
【００３９】
実施例
実験の詳細
軟骨細胞は軟骨中に見出される主要な細胞タイプである。軟骨では、これらの細胞は通常、休止状態または非増殖性であり、比較的低い代謝率を持っている。軟骨への傷害後、これらの細胞は修復プロセスにすぐに参加するわけではない。軟骨の無血管性ゆえに、これらの細胞はおそらく修復プロセスの開始因子としてのトロンビンに出会わないのだろう。以下の実施例では、軟骨細胞がトロンビンレセプターを持っていること、およびＮＰＡＲを刺激する化合物は軟骨細胞の増殖とマトリックスプロテオグリカンの合成とを刺激することを実証する。
【００４０】
実施例１　ラット軟骨細胞へのトロンビン結合
確立された方法を用いて、ラット関節軟骨細胞の初代培養物を単離し、インビトロ分析用に調製した（Ｋｕｅｔｔｎｅｒ，Ｋ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　９３：７４３−７５０，１９８２参照）。簡単に述べると、軟骨片をラットの肩から切り取り、その軟骨片を３７℃の組織培養培地（ＤＭＥＭ）中、トリプシンで１時間、コラゲナーゼで３時間、撹拌しながら消化した。細胞を高密度（５０，０００細胞／ｃｍ^２ ）でフラスコに入れ、抗生物質とアスコルビン酸を含むＤＭＥＭ中、５％ＣＯ_２ の雰囲気下に３７℃で培養した。
【００４１】
米国特許第５，３５２，６６４号ならびにＣａｒｎｅｙ，ＤＨおよびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ，ＤＤ，Ｃｅｌｌ　１５：１３４１−１３４９，１９７８に開示されている確立されたトロンビンレセプター結合アッセイを用いて、軟骨細胞への^１２５ Ｉ−トロンビンの特異的結合を行った。簡単に述べると、高度に精製したヒトトロンビンをヨウ素化し、非特異的結合について補正するために非標識トロンビンと共にまたは非標識トロンビンなしで、軟骨細胞の培養物に添加した。細胞を様々な濃度の標識トロンビンと共にインキュベートし、細胞に結合したトロンビンの量および培地中の遊離トロンビンの量を測定することにより、１細胞あたりのレセプターの数と、当該結合部位に対するトロンビンの親和性を見積もることができる。
【００４２】
３つの独立した実験から得た標識トロンビン結合のスキャッチャード解析により、ラット軟骨細胞は平均３０００の超高親和性結合部位（親和性１００ｐＭ）と、２３０，０００の高親和性部位（２７ｎＭ）を発現させることが示唆される。
【００４３】
実施例２Ａ　ウシ軟骨細胞増殖のＮＰＡＲアゴニスト刺激
実施例１にラット軟骨細胞に関して記載した方法を用いて、ウシ軟骨の初代培養物を調製した。その培養物を２４ウェルプラスチック培養皿に低密度で継代して、１％血清中においた。これらの培養物に濃度１．０または１０μｇ／ｍｌのＮＰＡＲアゴニストＴＰ５０８を単独で添加したところ、細胞増殖は刺激されなかった。これに対し、これらの濃度のＴＰ５０８を少量のトロンビン共同分裂促進因子と共に添加すると、培養三日後に、トロンビン単独の場合に認められた細胞数と比較して小さいが有意な（ｐ＜０．０５）細胞数の増加が起こった。
【００４４】
実施例２Ｂ　ウシ軟骨細胞プロテオグリカン合成のＮＰＡＲアゴニスト刺激
プロテオグリカン合成に対するＮＰＡＲアゴニストの効果を決定するために、ウシ軟骨を２×１０５細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中で培養した。これらの多層培養物を確立した後、培地を１％血清と１〜１００μｇ／ｍｌの表示した濃度のＴＰ５０８（表１）とを含むＤＭＥＭに毎日交換した。ＴＰ５０８を含むまたは含まない培養培地を毎日交換しながら６日間培養した後、^３５Ｓ−硫酸を培地に添加し、さらに２４時間培養を続けた。表１に示すように、高濃度のＴＰ５０８（１００μｇ／ｍｌ）による処理は無処理の細胞と比較して^３５Ｓ−硫酸の取込みを１０倍以上増加させた。
【００４５】
【表１】

【００４６】
実施例３Ａ　培養ラット関節軟骨細胞における増殖合成のＮＰＡＲアゴニスト刺激
ラット関節軟骨細胞を、実施例１に記述したようにトリプシンおよびコラゲナーゼ消化を用いて、ラット関節肩軟骨の切片から単離した。軟骨細胞「３次元」アルギネートビーズ培養物の調製は、Ｇｕｏらが記載した確立された技術（Ｃｏｎｎ．Ｔｉｓｓ．Ｒｅｓ．１９：２７７−２９７，１９９８）を用いて行った。トリプシンを用いて組織培養フラスコから細胞を取り出した後、それらの細胞をアルギネートゲル（１．２％ｗ／ｖ）に懸濁し、２２ゲージ針を通して１０２ｍＭ　ＣａＣｌ_２ 中にゆっくり滴下した。液滴がＣａＣｌ_２ と接触すると、ほとんど即座にアルギネートの重合が起こり、ゲルビーズを形成する。次にそのビーズをＤＭＥＭ培養培地で３回洗浄し、３５ｍｍ培養皿に移し、２日毎に培養培地を補給することにより、５％ＣＯ_２ 雰囲気下に３７℃で培養維持した。
【００４７】
３日間の３次元アルギネート培養後に、３５ｍｍ培養皿からビーズを取り出し、そのビーズを０．９％食塩水で洗浄し、１ｍｌの５５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ　ＮａＣｌを３７℃で１０分間加えることでアルギネートビーズを溶解することにより、軟骨細胞細胞増殖に対するＮＰＡＲアゴニストＴＰ５０８の効果を決定した。溶解したビーズ１ｍｌをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１：１０希釈し、Ｚシリーズコールターカウンターで細胞を数えることにより、細胞数を決定した。表２に示すように、ＴＰ５０８は３次元培養における軟骨細胞の増殖を単独で刺激した。
【００４８】
【表２】

【００４９】
実施例３Ｂ　培養ラット関節軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成のＮＰＡＲアゴニスト刺激
プロテオグリカン合成に対するＮＰＡＲアゴニストＴＰ５０８の効果を決定するために、３次元アルギネート培養物を上述のように調製し、［^３５Ｓ］−硫酸の取込みについて測定した。ビーズ培養物を、培地を毎日交換しながら表示した濃度のＴＰ５０８および［^３５Ｓ］−硫酸（２０μＣｉ／ｍｌ）に曝露し、［^３５Ｓ］−硫酸取込み量を測定するために７日目に収集した。各時点で５〜１０個のビーズを取り出し、０．９％食塩水で３回洗浄し、上記のように０．５ｍｌの５５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ　ＮａＣｌを３７℃で１０分間添加することによって溶解し、液体シンチレーションカウンターで計数した。［^３５Ｓ］−硫酸取込み量は、各試料内で、添加したビーズの数について規格化した。表３に示すように、濃度３００ｎＭ（約０．７μｇ／ｍｌ）でのＴＰ５０８処理は単独で　［^３５Ｓ］−硫酸の取込みを対照に対して約５０％刺激した。３０μＭ　ＴＰ５０８（約７０μｇ／ｍｌ）でも大きな刺激が認められたが、この濃度での測定値には大きな相対標準偏差があった。
【００５０】
【表３】

【００５１】
実施例４　ＴＰ５０８のポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーマイクロスフェアの製造
二重乳化法を使って、ＴＰ５０８を含有するポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）のマイクロスフェアを製造した。簡単に述べると、マトリックス成分を塩化メチレンに溶解し、ＴＰ５０８を水に溶解した。両者をボルテックスしながら徐々に混合して、油中水型（Ｗ／Ｏ）エマルジョンを形成させた。さらにボルテックスしながら、そのエマルジョンにポリビニルアルコール（０．３％水溶液）を加えて第２のエマルジョン（Ｏ／Ｗ）を形成させることにより、二重エマルジョン（すなわちＰＬＧＡ液滴と、その液滴内のＴＰ５０８水溶液からなる第２分散相とから構成されるＯ／Ｗ型エマルジョン）を形成させた。相分離により、ＰＬＧＡ液滴は、ＴＰ５０８を保持する空洞を含有する分離したマイクロスフェアを形成した。マイクロスフェアの相分離を引き起こすために、２％イソプロピルアルコール溶液を加えた。粒子を遠心分離によって集めた後、凍結乾燥して残留水分を除去した。マトリックスの組成を変えるこことにより、様々な放出速度を持つマイクロスフェアを形成させた（表４）。
【００５２】
【表４】

【００５３】
マイクロスフェアの平均直径をコールターカウンターで測定し、薬物捕捉効率は、秤量したマイクロスフェア試料を塩化メチレンで溶解し、放出された薬物を水に抽出した後、２７６ｎｍでの分光光度測定法によって測定した（表５）。
【００５４】
【表５】

【００５５】
種々のＰＬＧＡマトリックスからのＴＰ５０８放出を測定するために、１．５ｍｌポリプロピレン製微量遠心管に入った１．０ｍｌのＰＢＳに、２０ｍｇのマイクロスフェアを入れた。遠心管を３７℃でインキュベートし、６０ｒｐｍで振とうした。様々な時刻に、遠心管を遠心分離し、放出されたＴＰ５０８を含む上清を取り出し、後の分析に備えて凍結した。新しいＰＢＳをマイクロスフェアに加え、インキュベーションを続けた。上清中のＴＰ５０８は、２７６ｎｍでの吸光度によって測定した。各製剤について４重に放出測定を行った。製剤ＢおよびＤは３７℃で２８日間のインキュベーション中に検出可能な薬物放出を示さなかった。残りの製剤は全て検出できる量のＴＰ５０８を放出した。ただし、いずれの場合も放出される薬物量は３〜４日以内に検出限界未満（＜１μｇ／ｍｇ−マトリックス／日）になった。製剤ＡおよびＣは最大のＴＰ５０８放出量を示し、捕捉された薬物の６０〜８０％を３〜４日間で放出した。製剤Ｃは最も速い放出速度を示し、これを実施例５に記載するウサギ軟骨欠損モデルでの試験に選択した。
【００５６】
実施例５　ＮＰＡＲアゴニストＴＰ５０８はウサギモデルにおける軟骨成長を刺激する
若い雄ニュージーランドウサギ（２〜３キログラム）（ｎ＝１５）を麻酔し、両側内側縦膝蓋周囲関節切開術を施した。出血を最小限に抑えるために電気メスを使って皮膚、皮下組織および関節嚢を切開した。膝蓋の横転位によって関節面を露出させた。手術用ドリルと尖ったステンレス鋼製ドリルビットとを使って、大腿骨の滑車溝に直径３ｍｍ、深さ１〜２ｍｍの全層欠損を作った。軟骨下骨を突き刺さずに欠損を軟骨下板内に到達させることを目的とした。
【００５７】
ウサギを３群に分割した。各ウサギについて、右および左滑車溝欠損部を同じ治療剤で満たした。この試験では、実施例４で述べたように製造したＰＬＧＡ制御放出マイクロスフェア（製剤Ｃ）中にＴＰ５０８を製剤化した。このマイクロスフェアを十分量のＰｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ６８ゲル（５％ｗ／ｖ）と混合して、欠損部に容易に充填できるペースト状の稠度を持つように、マイクロスフェアを固めた。対照群では、ＴＰ５０８を含まないＰＬＧＡマイクロスフェアを両欠損部に与えた。治療群には１欠損あたり１０または５０ｍｇのＴＰ５０８を含有するマイクロスフェアを与えた。各群のウサギ１匹を４週間後に屠殺し、各群の２匹を６週間後に屠殺し、残りのウサギを９週間後に屠殺した。標本を固定し、組織学的解析用の処理を施した。
【００５８】
屠殺の時点で、対照欠損部にはかなりの線維性肉芽組織が認められ、白色軟骨様物質の証拠は見られなかった。これに対し１０μｇ治療群および５０μｇ治療群の欠損部はほぼ均一で密な白色物質で満たされていた。手術後６週間までは、治療欠損部と対照欠損部の間の肉眼的相違はそれほど顕著ではなかった。
【００５９】
４週間標本の組織学的検査から、実際に対照欠損部は炎症細胞および線維芽細胞を含む初期肉芽組織に相当すると思われるもので満たされていることが明らかになった。これに対し、１０および５０マイクログラム治療欠損部は、多数の軟骨細胞および軟骨形成の初期徴候を持っているように見えた。この効果は６週間目にはさらに劇的に観察された。対照は、少量の結合組織を持つものの、軟骨修復を示す証拠はほとんどなかった。これに対し、１０μｇおよび５０μｇ治療欠損部では、どちらにおいても、欠損部上に形成された硝子軟骨との良好な統合および広範な軟骨下骨修復が起こっているようだった。
【００６０】
９週間ＴＰ５０８治療した欠損部は大部分が硝子様マトリックスを示し、かなりのアグリカン含量を示す証拠が、陽性のサフラニンＯ染色によって明らかになった。ほとんどの例では、修復部位と元からある組織の間にアグリカン含量の相違はなかった。組織学的検査結果は、Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌら、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｊｏｉｎｔ　Ｓｕｒｇ．　１２６：１４４８−１４５２（２０００）の分類表を改造してＦｒｅｅｄら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　Ｒｅｓ．　２８：８９１−８９９（１９４４）が作った分類方法を使用し、正常な関節軟骨を２５の最高スコアとして、定量的に評価した。実験的ＴＰ５０８治療欠損は対照欠損より有意に高い平均スコアを記録した（表６）。
【００６１】
【表６】

【００６２】
ペプチド治療した欠損部は滑らかな関節面をもって修復し、修復組織と元からある組織の接合部分は、通例、十分に接合されていた。対照修復組織の質はほとんど線維軟骨であり、関節面の質も良くないと判断された。修復組織と元からある組織の間の接合部での統合状態は通常不十分だった。総合的にみて、ＴＰ５０８を使って修復された軟骨の質は、対照非治療欠損部よりも有意に改善された。この修復組織の質の改善は、関節バイオメカニクスの耐久性と機能性の向上、および外傷性軟骨傷害を負った患者における変形性関節症の発生率の低下につながるはずである。
【００６３】
本発明を具体的に示し、その好ましい実施形態について説明したが、本願特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、その形態と詳細に様々な改変を施しうることは、当業者には理解されるだろう。

Claims (21)

1. 軟骨の成長または修復を必要とする被験体の部位で軟骨の成長または修復を刺激する方法であって、非タンパク質分解的活性化トロンビンレセプターのアゴニストの治療有効量を該部位に投与することを含む方法。
2. 部位が関節炎の関節である、請求項１記載の方法。
3. 部位が軟骨の損傷または損失について治療される、請求項１記載の方法。
4. 部位が外傷性傷害による軟骨の損傷または損失について治療される、請求項１記載の方法。
5. アゴニストが、以下の構造式：
   Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｒ；
   （式中、Ｒはセリンエステラーゼ保存配列である）
   により表されるポリペプチドを含むトロンビンペプチド誘導体である、請求項１記載の方法。
6. トロンビンペプチド誘導体が約１２〜約２３個のアミノ酸を有する、請求項５記載の方法。
7. セリンエステラーゼ保存配列が、配列番号１（Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）のアミノ酸配列、または少なくとも６個のアミノ酸を有するそのＣ末端切断断片（ただしセリンエステラーゼ保存配列中の０、１、２または３個のアミノ酸が配列番号１の対応する位置とは異なる）を有する、請求項６記載の方法。
8. セリンエステラーゼ保存配列が、配列番号１（Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）のアミノ酸配列、または少なくとも９個のアミノ酸を有するそのＣ末端切断断片（ただしセリンエステラーゼ保存領域中の０、１または２個のアミノ酸が配列番号１の対応するアミノ酸の保存的置換である）を有する、請求項６記載の方法。
9. セリンエステラーゼ保存配列が、配列番号２（Ｃｙｓ−Ｘ_１ −Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２ −Ｖａｌ、式中Ｘ_１ はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ_２ はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである）のアミノ酸配列、または配列番号２のＣ末端切断断片を有し、該断片が少なくとも６アミノ酸を有する、請求項６記載の方法。
10. トロンビンペプチド誘導体がアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ（配列番号３）を含む、請求項９記載の方法。
11. トロンビンペプチド誘導体が、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ_１ −Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２ −Ｖａｌ（配列番号４）（式中、Ｘ_１ はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ_２ はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである）を含む、請求項１０記載の方法。
12. トロンビンペプチド誘導体がアミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−（配列番号５）、またはそのＮ末端切断断片（ただし、トロンビンペプチド誘導体の１〜９位の０、１、２または３個のアミノ酸が配列番号５の対応する位置のアミノ酸とは異なる）を有する、請求項１１記載の方法。
13. トロンビンペプチド誘導体が、アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−（配列番号５）、またはそのＮ末端切断断片（ただし、トロンビンペプチド誘導体の１〜９位の０、１または２個のアミノ酸が配列番号５の対応する位置のアミノ酸の保存的置換である）を有する、請求項１１記載の方法。
14. トロンビンペプチド誘導体が、移植可能な、生体適合性キャリアをさらに含む医薬組成物で投与される、請求項１２記載の方法。
15. キャリアがポリ乳酸／ポリグリコール酸ホモポリマーまたはコポリマーを含む、請求項１４記載の方法。
16. 軟骨の成長または修復を必要とする被験体の部位で軟骨の成長または修復を刺激する方法であって、配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号５）を有するペプチドの治療有効量を該部位に投与することを含む方法。
17. 被験体の関節炎の関節で軟骨の成長を刺激する方法であって、配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号５）を有するペプチドの治療有効量を該部位に投与することを含む方法。
18. 軟骨の損失について治療される被験体の部位で軟骨の成長を刺激する方法であって、配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号５）を有するペプチドの治療有効量を該部位に投与することを含む方法。
19. 外傷性傷害による軟骨の損失について治療される被験体の部位で軟骨の成長を刺激する方法であって、配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号５）を有するペプチドの治療有効量を該部位に投与することを含む方法。
20. ＮＰＡＲアゴニストの刺激量の存在下で軟骨細胞を培養する工程を含む、インビトロで軟骨細胞を培養する方法。
21. 治療有効量の培養軟骨細胞を、軟骨の修復または成長を必要とする被験体の部位に投与することをさらに含む、請求項２０記載の方法。