PT95285B - Processo de preparacao de composicoes de proteina do factor de crescimento transformante-tgf-beta processos para a sua preparacao e utilizacao de composicoes contendo tgf-beta para inibir a proliferacao celular - Google Patents

Description

MEMORIA DESCRITIVA

INTRODUÇÃO

Campo do Invento presente invento refere-se a processos para a inibição da proliferação celular, usando um polipéptido possuidor de actividade inibitória do crescimento num veículo fisiologicamente aceitável, compreendendo uma matriz proteica, particularmente uma matriz de colagénio.

Antecedentes objectivo de qualquer sistema de distribuição de drogas é proporcionar uma quantidade terapêutica de uma droga, ao local no corpo que representa o alvo desejado para a terapia pela droga e manter uma concentração desejada de droga durante o tempo requerido para se alcançar um resultado desejado. Os dois aspectos mais importantes deste objectivo são dirigir a droga para um tecido ou orgão específico (colocação espacial) e o controlo da taxa de di.s tribuição da droga (e portanto da concentração no alvo) para o alvo (distribuição temporal).

A família de péptidos conhecida como factor de crescimento transformante do tipo (TGF-^), incluindo o TGE-/?1 e o T G Ε - β 2, regula a diferenciação e o crescimento celular. Estes polipéptidos reguladores de crescimento podem estimular e inibir a proliferação celular, dependendo largamente do tipo de célula. 0 TGF-^1 e o TGF-/?2 tem um efeito anti-proliferativo comum, por exemplo sobre o crescimento de células epiteliais, bem como um grau elevado de reactividade cruzada com o receptor. Com o uso destes factores de crescimento como agentes anti-proliferativos pode, assim, alcançaj? -se um certo grau de colocação espacial no controlo do crescimento celular, em particular no crescimento de células de tumores, mininormais mizando, simultaneamente, os efeitos sobre as células/. No entanto, o tempo de semi-vida do factor de crescimento TGF-/?, quando administrado por meios convencionais, é da ordem dos 2 a 5 minutos devido a, por exemplo, actividade enzimática de degradação ou eliminação via ligação a proteínas de ligação do soro. Assim, a dis-tri71 490

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-3- «* * buição temporal destes polipéptidos é difícil de controlar.

Foram propostos diversos sistemas para alcançar a colocação espacial de uma droga. Estes incluem o uso de sistemas de distribuição dirigidos, tais como nanopartícuias, lipossomas e eritrócitos re-selados, bem como o uso de composições que compreendem uma porção dirigível, tal como um anticorpo para um antigénio celular específico e uma porção terapêutica, por exemplo um agente citotóxico. Pode, também, ser conseguida uma certa colocação espacial em situações especializadas, tais como o uso de dispositivos intraocu. lares e de dispositivos intravaginais e intra-uterinos. A colocação espacial pode também ser conseguida pela utilização de drogas ou de compostos de ocorrência natural que possuam uma afinidade su. perior para um certo tipo de células relativamente a outras, por £ xemplo esteróides ou hormonas peptídicas e seus congéneres, que in. teractuam com receptores específicos na/sobre a célula alvo.

A distribuição temporal da droga não é bem controlada, pelas formas de dosagem de drogas, convencionais, (tais como soluções, suspensões, cápsulas, comprimidos, emulsões, aerosóis, películas, unguentos e supositórios). 0 passo limitante de velocidade na distribuição da droga para a sua área-alvo é, geralmente, a absorção da droga através de uma membrana biológica, tal como o epitélio intestinal ou o revestimento de células endoteliais dos vasos sanguíneos e linfáticos. Um meio de prolongar a bio-disponibilidade de uma composição administrada é proporcioná-la numa forma sob a qual possa, facilmente, permear uma membrana celular. Um meio alternativo é proporcionar uma libertação não imediata a partir da forma de dosagem de tal forma que a libertação da droga se torne no passo limitante da velocidade de distribuição da droga pa. ra uma área alvo específica. Os sistemas de distribuição de libertação não imediata podem tomar várias formas incluindo sistemas de libertação sustida, onde o sistema de distribuição da droga liberta, lentamente, a droga durante um período prolongado de tempo.

uso de um sistema de libertação sustida pode melhorar a bio-disponibilidade de compostos tais como polipéptidos que são susceptíveis de sofrer inactivação enzimática. 0 sistema de libertação sustida pode ser usado localmente, o que pode, ainda, propor

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-4cionar inibição selectiva da proliferação celular, uma vez que a concentração da droga no local-alvo será elevada mas a concentração sistémica será baixa. Isto é particularmente vantajoso para drogas que apresentam um baixo índice terapêutico, já que os potenciais efeitos secundários são reduzidos com a utilização de sistemas de libertação sustida. Podem ser utilizadas menores quaji tidades totais da droga, preferivelmente inferiores ao LD^g da droga. Assim, é de interesse desenvolver processos e composições para a inibição selectiva da proliferação celular, através do uso de um sistema de distribuição da droga que proporcione, colocação espacial e libertação temporal de factores de crescimento, possui, dores de actividade anti-proliferativa. Estes sistemas de distribuição podem proporcionar um tratamento mais eficaz e alcançar um efeito anti-proliferativo a concentrações totais de droga mais baixas.

Literatura Relevante

As patentes dos EUA 4 322 398; 4 347 234; 4 349 530;

391 797 e 4 619 913 descrevem implantações e libertação contr£ lada de drogas. A implantação de drogas em lesões é descrita em Maugh, Science (1981 ) 212:1128-1129; Macek et al. , Abstracts of Immunoloqy, 4109, p. 1053, Miyata et al., Câncer Research (1983) 43:4670-4675; McLaughlin et al., Câncer Research (1978) 38:1311— -1316 e Bier et al., Câncer (1979) 44:1194-1200.

A purificação e a caracterização inicial do TGF-/32 humano a partir de uma linha de células de adenocarcinoma é descrita por Ikeda et al. , Biochemistry (1987) 26:2406-2410 e a partir de plaquetas se sangue de porcino por Cheifetz et al., Cell (1987) 48: :409-415. A expressão do TGF—/31 maduro e precursor em células de ovário de criceto chinês é descrita por Gentry et al. , Molec. and Cell Biol. (1987) 7:3418-3427. A purificação de TGF- é relatada por Gentry et al. , Molec. and Cell Biol . (1988) .8:4162-4168.

Uma revisão da família de compostos com a designação TGF-/) é proporcionado por Sporn et al . , Science (1986) 233:532:534. A estrutura e relação funcional de CIF- B (factor B de indução de cartilagem) com o TGF-/S é descrita por Seydin et al. , J, Biol . Chem. (1987) 262:1946-1949. Veja-se também Seydin et al., Proc.

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Natl. Acad. Sei. USA (1985) 82: 2267-2271; Twardzik, e Sherwin, J. Cell. Biochem. (1985) 28: 289-297.

Sumário do Invento

São proporcionadas novas composições_te novos processos para o seu uso_?para a inibiçãodo crescimento celular. Os processos usam composições polipéptidicas compreendendo pelo menos um TGF- β , ou um seu fragmento, caracterizadas por possuírem um efeito anti-proliferativo sobre as células, sendo o polipéptido proporcionado em dispersão numa matriz proteica. Para uso in vivo, as composições são implantadas na vizinhança das células-alvo. 0 polipéptido é libertado continuamente da matriz, criando uma concen tração elevada de polipéptido na vizinhança das células-alvo. A composição é usada, preferivelmente, em conjunção com um agente vasoconstritor . 0 processo e as composições de tratamento são eficazes na inibição da proliferação de células, particularmente de células neoplásticas. Geralmente, para inibir a proliferação celular, são requeridas quantidades totais de polipéptido substancialmente mais baixas do que com os sistemas de distribuição convencionais.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 mostra a libertação de TGF-^ radioactivamente marcado a partir de CM-TGF-β (concentração de CM: 40, 30, 20 ou 10 mg/ml), em função do tempo.

A figura 2 mostra a percentagem de emanação de TGF-^ a partir de CM-TGF-/3 (concentração de CM 40 mg/ml), medida por ini. bição do crescimento celular em função do tempo.

DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES ESPECÍFICAS presente invento proporciona processos e composições para inibição do crescimento de células tais como células neoplásticas. 0 processo baseia-se na aplicação local de uma composição de tratamento, na qual a porção activa compreende pelo menos um TGF-β , ou um seu fragmento, encontrando-se a TGF-/3 disperso numa matriz proteica, particularmente numa matriz de colagénio. A ma71 490

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triz limita a difusão do TGF-β que pode ser implantado na vizinhani ça das células-alvo, diminuindo, por isso a degradação, particulaj? mente degradação enzirnática, que pode ocorrer por exposição sistémica. 0 TGF-β é continuamente libertado da matriz, criando uma coji contração de TGF-/2 na vizinhança imediata das células neoplásticas superior à de outras áreas. Para inibir a dispersão da droga para longe do local de libertação, as composições podem ser administradas em conjunção com um agente vasoconstritor, tal como epinefrina .

A sequência das composições de interesse será usualmente comparável a uma sequência de um segmento da molécula de TGF-/2 , incluindo polipéptidos precursores de TGF-/2» . As composições incluirão uma sequência significativamente correspondente à porção da molécula responsável pelo efeito biológico observado de TGF-^, para inibição da proliferação de células de epiderme, em particular, queratinócitos.

As composições do presente invento'possuirão como porção a_c tiva, pelo menos cerca de 8 aminoácidos, usualmente pelo menos cer ca de 25 aminoácidos, mais usualmente pelo menos cerca de 35 amin£ ácidos, até ao comprimento total de um polipéptido TGF-y# , ou precursor de TGF-/3 . Preferivelmente, a composição compreende homodímeros de TGF-β . Por homodímeros entenda-se um polipéptido compreendendo duas cadeias de aminoácidos idênticas, com pelo menos 8 aminoácidos cada uma. Um processo preferido de ligação das duas cadeias é por meio de uma ligação dissulfureto inter-cadeias, em que cada cadeia inclui, pelo menos um resíduo de cisteína, apesar de serem possíveis outras ligações.

TGF-/3 1 tem a sequência seguinte:

10 15 20

A-[_-D-T-N-Y-C-F-S-S-T-E-K-N-C-C-V-R-Q-L 25 30 35 40

-Y_I_D-F-R-K-D-L-G-W-K-W-I-H-E-P-K-G-Y-H45 50 55 60

-A-N-F-C-L-G-P-C-P-Y-I-W-S-L-D-T-Q-Y-S-K71 490

5624-135-118 _7- »

70 75 80

-V-L-A-L-Y-N-Q-H-N-P-G-A-S-A-A-P-C-C-V-P85 90 90 100

-Q_A-L-E-P-L-P-I-V-Y-Y-V-G-R-K-P-K-V-E-Q105 110 .l-s-n-m-i-v-r-s-c-k-c-s e o TGF-yô 2 tem a sequência seguinte:

10 15

A„L-D-A-A-Y-C-R-R-N-V-Q-D-N-C 20 25 30

-C_L-R-P-L-Y-I-D-F-K-R-D-L-G-W 35 40 45 .«-W-I-H-E-P-K-G-Y-N-A-N-F-C-A 50 55 60

-G-A-C-P-Y-L-W-S-S-D-T-Q-H-S-R 65 70 75

-V-L-S-L-Y-N-T-I-N-P-E-A-S-A-S 80 85 90

-P-C-C-V-S-Q-D-L-E-P-L-T-I-L-Y ' 100 105

-Y_I_G-K-T-P-K-I-E-Q-L-S-N-M-I

110

-V-K-S-C-K-C-S

As designações de uma letra, para os diversos aminoácidos, são as seguintes: A = alanina; R = arginina; N = asparagina; D = ácido aspártico; C = cisteína; Q = glutamina; E = ácido glutâmico, G = glicina; H = histidina; I = isoleucina; L = leucina; K = lisina; M = metionina; F - fenilalanina ; P - prolina; S = serina; T = treonina; W = triptofano; Y = tirosina e V = valina.

Entender-se-á que a sequência de aminoácidos não precisa de corresponder exactamente às sequências dadas acima, mas que p£ de ser modificada por de 1 a 4 substituições conservativas ou não conservativas, incluindo delecções e inserções envolvendo, usualmente, não mais do que cerca de 1 aminoácido, podendo as modifica ções incluir D-aminoácidos, sem afectar significativamente a acti vidade do produto. Assim, os polipéptidos obiecto podem ser subme

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tidos a várias modificações, tais como inserções, delecções e substituições, quer conservativas quer não-conservativas, podendo essas modificações proporcionar algumas vantagens na utilização dos polipéptidos. Por substituições conservativas entendem-se combinações tais como G, A; V, I, L; D, E; N, 0; F, T; K, R; e 5, Y,

W.

Particularmente interessantes são os TGF-/^ e seus fragmentos, de ocorrência natural, que estão pelo menos substancialmente isentos de outros componentes celulares, usualmente, pelo menos cerca de 90%, preferivelmente 95%, mais preferivelmente 99% puros. Os TGF-/) podem ser isolados a partir de fontes naturais ou, como apropriado, sintetisados ou preparados por meios recombinantes.

São particularmente interessantes os TGF-/2 de mamíferos, particu larmente de primatas, mais particularmente de símio. Podem ser usados individualmente, em combinação uns com os outros ou em comb/ nação com outras composições anti-proliferativas.

Os polipéptidos ou seus fragmentos, podem ser conjugados com a matriz proteica por técnicas convencionais. Os reagentes de reticulação usados para este fim, são geralmente moléculas bifunc_i onais representadas por A-R’-B em que R’ é a porção que une dois grupos funcionais A e B, os quais podem reagir com grupos tais como amino carboxilo (CO2H), e sulfidrilo (SH), que podem estar presentes no polipéptido ou no suporte sólido. A porção de ligação R' proporciona a reticulação com propriedades apropriadas tais como conformação ou comprimento de espaçador, adequados.

A porção de ligação R’ pode ser uma cadeia alquileno,

-(CH_O-) ou uma cadeia intercalada com outros substituintes,

Zn

-(CH„) Q(CH_n) -. 0 substituinte Q pode ser grupos insaturados tais 2 m 2 n como -CH = CH- e -C^C-; grupos aromáticos como fenileno -C^H^- (liga.

do de forma orto, meta ou para); grupos heteroaromaticos tais como os derivados da piridina, do imidazole, do indole; ou formas policíclicas de sistemas de anel aromático e heteroaromático. Os siste mas de anel podem possuir substituintes adicionais, por exemplo halogéneo, metilo e nitro, mas não se limitam a estes. Da mesma fo_r ma, podem estar presentes substituintes adicionais, substituindo um ou mais H nas cadeias metileno -(CH_O) - e -(CH„) -.

Z m Zn

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-9Os reagentes de reticulação em que A e B são os mesmos, são denominados reagentes homobifuncionais; aqueles em que A e B são diferentes são deniminados reagentes heterobifuncionais. Se A e B são diferentes, a reacção para a reticulação dos dois comp£ nentes- o péptido e o suporte- é geralmente efectuada por passos.

A reacção por passos também é possível quando A e B são iguais, se um grupo for activado primeiro e o outro for deixado não activo, ou uma forma bloquada ou protegida. Quando A e B são iguais, é possível a reacção simultânea com os dois componentes. Esta reacção é mais directa, mas pode ser menos selectiva que uma sequência reaccional por passos.

Para reticulação com aminas, os grupos funcionais reactivos A e B podem ser ácidos carboxílicos (activados de alguma forma), aldeídos ou agentes de alquilação.

Quando A é um ácido carboxílico, existem várias maneiras de o activar para reagir com aminas para formar amidas. Isto é discutido, na generalidade, em textos de química orgânica tais cq mo F.A. Carey e R.J. Sundberg, Advanced Organic Chemistry (1983) _2:118 e seguintes, e discutido de forma completa em livros que tr£ tam de péptidos, tais como os de E. Gross e J. Meienhofer, The P eptides (1979 ) 1_ e de M. Bodanszky, Peptide Chemistry (1988).

Uma lista de reagentes formadores de ligações peptídicas é fornecida no glossário do livro de Pettit (G.R. Pettit, Synthetic Pept ides (1970) _1). Apenas algumas formas gerais de aetivação de grupos carboxilo são aqui discutidas. θ

II

Os grupos A-CO^H podem ser activados em C-X e feitos reagir com grupos amino para formar uma ligação peptidica:

0 ¹¹ H

-C-X + H₂N-R —-> -C-NHR + HX

Os ácidos carboxílicos podem ser activados em haletos de a0 ji cilo e pseudo-hal etos (C-X, em que X = Br, Cl, CN, N^), anidridos mis· tos e ésteres activados. Usa-se, também, a aetivação por reacções de adição usando carbodiimidas e reagentes isoxazólio.

Em anidridos mistos, ο X de C-X é derivado de outro ácido

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-10carboxilico, do ácido carbónico, de um ácido sulfónico ou de um ácido contendo fósforo. São possíveis muitos exemplos (vejam-se

as referências	mencionadas);	estes exemplos são representativos:
0 0	0 0	0
II II	II II	il
-C-O-CCF	3 -C-O-C-OR,	-C-0-S02R (RzCF3 CóH5, etc.),

II II

-C-O-P-R (R=Pr ou OEt)

Em ésteres activos, C-X possui X-OR, que pode ser derivado de vários fenóis electronegativos (R = CgE^, C^Cl^, C^H (NO > ^et c), ou de compostos de N-hidroxi, tais como N-hidroxisuccinimida e N-hidroxibenzotriazole.

A activação de grupos carboxilo por carbodiimidas processa -se através de um intermediário que reage com o grupo amino:

0 HNR H₇NR' 0 0

II 0 i ² II IL

-C-OH + R-N=C=N-R —> -C-O-C = NR -> -C-NHR'+ C(NHR)₂

Se o intermediário se formar na presença de N-hidroxisucc_i nimida ou N-hidroxibenzotriazole, forma-se, presumivelmente, um éster activo (veja-se acima) e este reage com o grupo amino.

Quando A é um aldeído, o reagente de reticulação é um di-aldeído. Um tipo é representado por 0=CH-(CH₂) -CH=O. Este reage 2 3^{Z Π} com o polipéptido (R NH^) e com o suporte (R NH^) da forma seguinte: R²NH_q + R³NH„ + O=CH(CH„) CHO -> R²N=C(CH„) CH=NR³ + z z z n z n

2H₂0. 0 glutaraldeído, com n=2, é um reagente de reticulação comum. Quando n aumenta, o espaçador entre o péptido acoplado e o suporte sólido, torna-se mais comprido. Geralmente, há uma gama óptima para o comprimento do espaçador.

Os dialdeidos podem também ser derivados de compostos aromá ticos ou heteroaromáticos, como se mostra neste exemplo do ftalaldeído.

roí

CHO (ch₂)cho m

CHO (CH₂)_nCH0

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-11A substituição nas posições orto, para ou meta, em conjunto com diferentes comprimentos de cadeias laterais, é mostrada na estrutura _2. Os anéis benzénicos em 2 podem ser substituídos por outros sistemas de anel que sejam policíclicos ou heterocíclicos. Po dem encontrar-se nesses sistemas de anel outros substituintes, por exemplo, halogéneo, nitro, alquilo.

Apesar de o formaldeído não ser um aldeído bifuncional, pode reagir com dois grupos amino e é utilizado como reagente de reticulação.

r²nh2 + r³nh2 + ch₂o —> r²nh-ch2-nhr³ + h2o

Os reagentes de reticulação bifuncionais derivados de agentes de alquilação (A-R’-B em que A e B são grupos de alquilação), não são, vulgarmente, utilizados na reticulação de péptidos, apesar de serem utilizados na reticulação de outro tipo de polímeros e suportes. Dois exemplos são os ésteres sulfonato e os epóxidos, como se mostra no exemplo seguinte:

A=0S0₂CF₃ e A = CH^-CH0'

3 1 haqp 9 1 3

R NH„ + R^PNH? + CF,SO R^XSO CF _££££> R^ZNH-R -NHR + 2CF^S03 + 2base-H + r²nh9+r³nh9+ch₉-ch-r¹-ch-ch9 -> r²nhch9^{2 2} \7 \/ ^{2 2}

0 ch-r¹ch-ch₉nhr³

HO

OH

Estes reagentes podem também reagir com grupos sulfidrilo:

RSH + CH₂-CH-R· •B -> RS-CH₉-CH-R B ² I

OH

Outros reagentes funcionais de reticulação que podem reagir com grupos sulfidrilo podem ter A=maleimido ou A=ICH₂C-:

R^ZSH +

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r²sh + ich₉c-r-b----> r sch₉cr-b ²II ²II

0

Os reagentes/reticulação bifuncionais que podem reagir com grupos carboxilo nos componentes a acoplar (o péptido ou o suporte) podem ter A=amino:

activação h^N-R^-B 0 r²co₂h------> R²C0X------> r²cnhr¹b

Se B for também amino, ou se existirem grupos amino no corci ponente (polipéptido ou suporte) a acoplar, esses grupos amino d_e vem ser bloqueados ou protegidos antes da reacção e, posteriormeni te, desbloquados.

Alguns reagentes/reticulação bifuncionais estão disponíveis comercialmente. Por exemplo, uma série de reagentes de reticuiação homobifuncionais (exemplo, cpd 5) ^e heterobifuncionais (exemplo, cpd 4), são comercializados pela Pierce Chemical Company.

'0

2'6 ^R yV 0 0

N-OC? (CH₉)_zC-0N

3a, R=H 4a _? R=H

2b, R=S0₃Na 4b, R=S0₃Na

Na reticulação de dois componentes-péptido e suporte-existe a possibilidade de se formarem reticulações intra-componente, em lugar das reticulações inter-componentes, desejadas. Essas reacções secundárias podem ser minimizadas pela selecção dos reagentes e das condições reaccionais e pelo uso de grupos bloqueadores rem_o viveis.

Podem ser utilizados vários suportes sólidos para a prepara ção das composições objecto. As composições objecto são amorfas, injectáveis e viscosas de modo a reterem substancialmente uma pos2 ção localizada, sem fluirem significativamente para longe do local da administração. As composições podem fluir sob pressão moderada mas não se moverão significativamente após terem sido posicionadas

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-13num local particular. A matriz proteica será capaz de ligar, cov_a lentemente ou não covalentemente os polipéptidos anti-prol i ferat_i vos, sem afectar o seu efeito terapêutico, servindo ao mesmo tempo para reter os agentes aotivos no local de introdução ou retardar a transferência dos agentes activos do local de introdução.

Preferivelmente, a composição será constituida por uma quantidade significativa da matriz proteica, para proporcionar as caracteristicas de composição desejadas. A matriz pode ser form_a da por péptidos individuais ou por combinações de péptidos ou pro teinas, por exemplo, proteínas estruturais como colagénio e fibr_i nogénio, ou albumina ou outra proteína que proporcione um posicio^ namento estável, ou suas combinações. De interesse particular são o colagénio, o fibrinogénio e os seus derivados.

As matrizes proteicas no sistema de distribuição da droga, compreendendo cerca de 5 por cento, em peso, preferivelmente pelo menos 10 por cento, em peso, e até 50 por cento, ou mais, em peso de fibrinogénio, têm um interesse particular quando usadas em com binação com trombina ou com o seu equivalente enzimática. Desta forma, o fibrinogénio é modificado enzimaticamente em fibrina, pa. ra aumentar a propriedade não migratória da composição, formando, ao mesmo tempo, uma matriz de fibrilas para estabilizar adicional, mente a composição.

A trombina pode ser misturada com uma composição proteica contendo fibrinogéniodesde um instante imediatamente anterior à utilização, até pouco após a injecção. A quantidade de trombina eni pregue (cerca de 1 a 1000 IU/mg) variará, geralmente, dentre cerca de 0,1 e 10 por cento, em peso, do fibrinogénio presente, dependendo do tempo de utilização, da taxa de formação desejada para a matriz sólida, da quantidade de outros componentes, do efeito da droga sobre a actividade da trombina e semelhantes.

material proteico, particularmente contendo colagénio ou fibrinogénio, que é usado, pode ser derivado de qualquer fonte ma mífera hospedeira tal como bovina, porcina ou humana ou pode ser preparado, como disponível, por outras técnicas, por exemplo técnicas de ADN recombinante. 0 colagénio empregue pode ser colagénio natural ou pode ser modificado, como o tropocolagénio, o atro

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-14pocolagénio ou semelhantes. 0 colagénio pode ser não imunogénico, imunogénico ou apenas ligeiramente imunogénico.

São conhecidos na literatura diversos processos para a pre: paraçao de colagénio ou dos seus derivados, em forma purificada, para administração a um hospedeiro mamífero. Esses métodos podem ser encontrados na patente dos EUA NS 3949073 e nas referências aí citadas. De interesse, salienta-se o cologénio bovino que é purificado e obtido a partir de vacas e vitelos jovens. A purificação envolve normalmente a dispersão ou precipitação em vários meios, por exemplo, ácido acético diluido. Em certas situações emprega-se colagénio xenogénico para aumentar uma resposta imunogénica na área de injecção, ou podem ser empregues adjuvantes imunogénicos .

Adicionalmente, a(s) droga(s) pode ser empregue encapsulada em lipossomas ou outras composições de taxa de libertação controlada, que estão incluídas na composição proteica para proporcionar taxas separadas e distintas de libertação da droga. Desta fo£ ma, podem ser preparadas composições multifásicas de forma a proporcionar a libertação sustida da droga durante longos períodos de tempo. A formação de lipossomas com inclusão de vários materiais é descrita em Papahadjopoulos (1978) Annals of the N.Y. Academy of Science, 308; Gregoriadis e Allison (1980) Liposomes in Bioloqical Systems (John Wiley and Sons); Leserman et al., Nature (1981)

293: 226-228; Barhet et al. , Supramol Struct. Cell Bio. Chem. (981) 16:243-258j e Heath et al., Science (1980) 255:8015-8018. Alternativamente, podem empregar-se outros processos de encapsulamento, nos quais a droga é encapsulada nu ma substância biodegradável em que a taxa de libertação estã relacionada com a espessura do revestimento biodegradável.

As composições objecto compreendendo a matriz proteica e o agente anti-proliferativo podem ser usadas in vitro ou in vivo. P_a ra uso, in vitro, podem ser usadas para inibir seleetivamente a proliferação de células que são sensíveis aos efeitos de inibição de crescimento de um TGE-/3 . As composições objecto podem ser preparadas de forma qu a quantidade da porção activa que se difunde da matriz proteica, esteja numa quantidade sufi ciente para inibir a proliferação de células sensíveis não desejadas. A quantidade de porção activa libertada da matriz por unidade de tempo pode ser va

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riada e pode ser optimizada para situações particulares, modificando a quantidade ou concentração quer da porção aetiva quer da matriz proteica, na composição.

In vivo, a composição pode ser implantada, directarnente, numa área de hiperproliferação de células ou numa área de lesão celular, ou pode ser implantada num local imediatamente adjacente a esses áreas, de forma a proporcionar uma concentração mais eleva, da da porção aetiva na vizinhança imediata das células em proliferação do que no tecido circundante. A quantidade de porção aetiva libertada do suporte sólido, pode ser variada, dependendo da natureza do crescimento celular a modular, do tamanho da população celular, da sensibilidade da célula à porção aetiva, da eficácia da porção aetiva e semelhantes. A quantidade de T G F - β ligado ao supor, te sólido está, geralmente, entre lng/ml e 10 mg/ml de colagénio (10-40mg/ml), mais usualmente de lOng a lmg/ml, preferivelmente de lOOng a 100,ug/ml. A quantidade de libertação de TGF-/3 do suporte sólido é, geralmente, de cerca de 1% a cerca de 60% durante as 4-6 horas iniciais de libertação e atinge uma quantidade de libertação em estado estacionário, de cerca de 1% a 20% por dia, depois disso.

TGF-beta associado com a matriz pode ser usado individual, mente ou em combinação com outros agentes anti-proliferativos, dependendo da natureza do agente, do tipo de células a inibir e de a acção cooperativa ser ou não farmacologicamente indicada. As comp£ sições objecto podem ser ainda modificadas, modificando a porção aetiva, particularmente por meio de ligações que permitam a clivagem enzimática, por exemplo, hidrólise, ou por introdução de materiais na composição que auxiliarão na manutenção, ou na retenção da porção aetiva no local de introdução.

Podem ser usadas várias técnicas para diminuir a migração do agente anti-proliferativo para longe da matriz proteica, por exemplo, acoplando o agente com ligandos específicos, tais como 11pidos, fosfolípidos, péptidos, aminoácidos, acúcares ou semelhantes, Estas modificações dependerão do agente individual, variando a solubilidade do agente no meio aquoso e proporcionando interacções covalentes ou não-covalentes com a matriz proteica. Adicional

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-16mente, podem empregar-se vários agentes aglomerantes ou agentes de concentração, fisiologicamente aceitáveis, que servem para proporcionar interacções droga-matriz, com uma redução consequente na t_a xa de libertação da droga. Os materiais ilustrativos incluem substâncias inorgânicas como a hidroxiapatite e substâncias orgânicas como hidratos de carbono, por exemplo, agarose, celulose, mucopolisacáridos, ácido hialurónico; sulfato de condroitona- e semelha_n t es.

Outras drogas para uso em combinação com os agentes anti-proliferativos, são as drogas que retardam a difusão para longe do local de implantação do agente anti-proliferativo. Isto serve para reduzir a ofensa fisiológica e aumentar o ganho terapêutico. De interesse particular como anti-difusores são os agentes que res tringem a vasculatura regional, quer no que se refere ao crescimen to quer à abertura de passagem, por exemplo, agentes vasoconstritores ou simpatomiméticos. Estes agentes podem incluir catecolaminas, por exemplo, epinefrina e norepinefrina; alcaloides da crava gem do centeio, prostaglandinas; angiotensina, ou semelhantes. P£ dem ser usados outros agentes que podem afectar a arquitectura dos tecidos ₍incluindo enzimas que danificam o estroma, tais como as peptidases, por exemplo papaína, quimopapaína, tripsina, amilase, colagenase, e quimotripsina; ou podem ser empregues agentes que afectem a permeabilidade celular, tais como detergentes não-iónicos, por exemplo Tween 80; anfotericina B, dimetilsulfóxido e anestésicos como procaína. Outros agentes que podem ser utilizados incluem os envolvidos na inibição da reparação do ADN e na inibição da síntese do ADN ou do ARN.

De particular interesse como células-alvo são as células de tumores, sensíveis aos efeitos de inibição de crescimento da porção activa (factor anti-proliferativo de crescimento) associada com a matriz. As composições objecto encontram uso particular com carcinomas que são facilmente acessíveis para implantação e que são sensíveis à porção activa, incluindo cancro do pulmão, carcin£ ma de célula escamosa e carcinoma de célula basal, cancro da mama, melanoma, bem como tumores de origem endotelial e fibroblástica, tais como sarcomas, por exemplo, osteosarcoma e linfoma.

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-17Como já foi indicado, a razão de materiais secos na composi ção pode variar largamente. No entanto, a quantidade de material de matriz proteica no sistema de distribuição da droga não será, u. sualmente, inferior a 30% e não superior a cerca de 95%, variando geralmente entre 40 e 90%, mais usualmente entre 50% e 90%, em peso. Destes, preferivelmente, 10 a 100% serão colagénio e/ou fibrinogénio. A(s) droga(s) anti-proliferativa será, normalmente, um Ijl quido ou um sólido, ou será proporcionada sob uma forma sólida e variará, geralmente, de pelo menos cerca de 0,0001%, em peso, até cerca de 5% em peso, sendo,mais usualmente, de cerca de 0,001% a 1% em peso, sendo geralmente de cerca de 0,001% a 0,1%, em peso, do material proteico.

Outros aditivos ou agentes auxiliares variarão entre uma quantidade total de cerca de 0,005 a 15, usualmente de cerca de 0,01 a 10 por cento, em peso, do peso seco da composição total .

A composição é uniformemente dispersa num meio aquoso fisiologicamente aceitável, tal como solução salina, solução salina tamponada com fosfato, água destilada, água para injecção, etc. 0 meio aquoso será suficiente para proporcionar dispersão amorfa capaz de fluir sob pressão moderada. Usualmente, o meio aquoso liqujL do consistirá em pelo menos 90 por cento, em peso, de toda a comp£ sição, mais usualmente pelo menos 95 por cento em peso, e não mais do que cerca de 99,8 por cento, em peso, usualmente não mais do que cerca de 99,5 por cento, em peso, de forma a proporcionar uma mistura flulvel. A quantidade variará com dependência na natureza da(s) droga(s), na natureza do material da matriz, na presença de outros materiais e semelhantes. A concentração de proteína no meio aquoso variará de cerca de 5 a 75 mg/ml.

Em adição aos componentes principais, pode também ser incluido uma série de componentes menores para uma variedade de fins. Estes agentes, na sua maioria, conferem propriedades que pro tegem a estabilidade da composição, controlam o pH, ou semelhantes. Agentes ilustrativos incluem tampões fosfato ou acetato, metil ou propilparabeno, polietilenoglicóis, etc. Estes agentes encontrar-se-ão, geralmente, presentes uma quantidade inferior a cerca de

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-182 por cento, em peso, da composição total, usualmente menos do que cerca de 1 por cento, em peso, e, individualmente variarão entre cerca de 0,001 por cento, em peso, e cerca de 1 por cento, em peso .

Como já indicado, em certos casos a droga será encapsulada, particularmente em lipossomas. Os lipossomas são preparados a partir de uma variedade de lípidos formadores de lamelas, incluindo fosfolípidos, por exemplo, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, etc, gangliósidos, esfingomielinas, esteróides, por exemplo, colesterol, etc. Usualmente, o peso dos lípidos em relação ao peso da droga variará entre 1 a 5 litros de droga aprisionada, por mole de lípido antipático.

A composição pode ser preparada combinando os vários comp£ nentes num ambiente estéril. A matriz será proporcionada numa forma conveniente, usualmente misturada com pelo menos uma porção do meio aquoso total a ser empregue. A composição será suficientemente processável de forma que, após a mistura com os outros agentes, se possa obter uma dispersão uniforme. Quando se utiliza colagénio ou um seu derivado, o material colagenoso será normalmente proporcionado /numa forma monomérica ou polimérica, particularmente dirné rica ou trimerica/ ou como uma dispersão uniforme de fibrilas de colagénio num meio aquoso, no qual o material colagenoso será de cerca de 5 mg/ml a não mais de 100 mg/ml, usualmente não mais de 75 mg/ml. A draga pode, então, ser adicionada ã dispersão colagenosa com agitação, para assegurar a dispersão uniforme da droga na mistura resultante. Outros materiais, como apropriado, podem ser adicionados concomitante ou sequencialmente. Após se assegurar a dispersão uniforme dos vários componentes na mistura, a mistura pode ser esterilizada e selada num recipiente apropriado.

A esterilização será, usualmente, conseguida usando técnicas assépticas e condições assépticas para misturar todos os compci nentes estéreis.

PARTE EXPERIMENTAL colagénio utilizado para a preparação da matriz de colagé

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-19nio foi obtido essencialmente como descrito na Patente dos E.U.A.

949 073 e nas referências al citadas, cujas descrições são aqui incorporadas como referência. Para preparar CM-TGF-β , foi primeiramente preparada uma composição de pH neutro compreendendo 6,5% (p/v) de colagénio. Mesmo antes da utilização, ou uma hora antes da utilização, preparou-se TGF-beta (Oncogen), de acordo com as instrjj ções do fabricante, por re-suspensão numa solução tamponada com fos. fato, a uma concentração para proporcionar a razão final desejada de TGF-beta: colagénio, geralmente 1 ng/ml a 10 mg/ml de colagénio.

TGF-β e o colagénio foram então misturados usando um dispositivo de mistura Luerlock, binário. Encheu-se uma seringa com colagénio e a outra com TGF-beta e os conteúdos das duas seringas foram misturja dos impelindo repetidamente, para a frente e para trás, à temperatu. ra ambiente, durante aproximadamente 20 batidas, até a suspensão se revelar homogénea por inspecção visual. 0 CM-TGF-beta foi armazenado durante, no máximo, uma hora, a 4°C, ou à temperatura ambiente até ã utilização.

Exemplo i

Libertação de TGE-β da Matriz de Colagénio (CM) in vitro

Adicionou-se I-TGF-β (2 /tCi) a TGF—/2» frio, de forma a se obter uma concentração final de TGF-^ de 400 ng/ml em concentrações de CM de 10, 20, 30 ou 40 mg/ml.

Aproximadamente 0,7 ml de cada formulação de CM contendo

125

I—TGF —/? foram colocados no fundo de tubos de ensaio de plástico, descartáveis, e a radio actividade do CM-TGF-/2 foi determinada num contador gama. Seguidamente, cerca de 1,4 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) foram cuidadosamente depositados sobre a pelota de CM-TGF-β no tubo de ensaio. 0 PBS foi removido do tubo de ensaio, em função do tempo. A pelota de CM-TGF-/? foi novamente contada em cada ponto no tempo.

125

A libertação de I-TGF-β do veículo CM parecia ser influ. enciada pela concentração de CM. A libertação inicial de TGF-/2 oco£ reu mais rapidamente durante o primeiro dia, para a formulação con. tendo 10 mg/ml de CM, relativamente às outras formulações estudadas. A libertação em estado estacionário de TGF-β , para todas as formu71 490

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lações, pareceu estabilizar de forma que fosse libertado, aproxima damente, l?ó de TGE-^ por dia, no conjunto dos seis dias de experi_ ência para todos os grupos testados. Estes resultados são apresentados na Figura 1.

Exemplo II

Cinética de Activação e Emanação de TGF-/^ da Matriz de Colagénio (40 mg/ml)

A actividade biológica e a taxa de libertação de TGF-^ de um veiculo de colagénio bovino foram avaliadas como se segue.

Foram misturados quinhentos ng de TGE-β de simio (Oncogen) em 0,4 ml de PBS, com 0,8 ml de Matriz de Colagénio (CM) (65 mg/ml) (Matrix Pharmaceutical, Inc., Menlo Park, CA), originando uma formulação final contendo 417 ng/ml de TGF-y2> e CM(43 mg/ml). Quinhentos ng de TGE-^ em 1,2 ml de PBS, originando 417 ng/ml de TGF-^ em PBS, serviram de controlo.

Colocou-se um ml de TGF-^ e CM no fundo de um tubo de ensaio. Depositaram-se, cuidadosamente, dois ml de meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM), no topo da formulação. 0 controlo foi diluído da mesma forma.

Em cada ponto no tempo, recolheu-se uma alíquota de 300 ytl, do sobrenadante. Os pontos no tempo foram os seguintes:

0' 10' 20' 30' lHr 3Hr 8Hr 17Hr 24Hr 72Hr

Foi removida de cada · amostra uma alíquota de 50 /d e foi dicionada ^: a cada um de 3 alvéolos de uma placa de cultura de tec£ dos, de alvéolos múltiplos contendo 3000 células de pulmão humano

A549 por alvéolo. Três a cinco dias mais tarde, os alvéolos foram 125 pulso-marcadas com I-timidina para medir a quantidade de incorp£ ração de timidina nas células A549 em proliferação activa. As células foram incubadas a 37°C em 5% CO2- 95% ar. Todos os passos e preparações foram realizados sob condições assépticas. Os resultados demonstram que 0 TGE-^ foi libertado lentamente da CM de forma log-linear durante as primeiras 8 horas. As concentrações cada vez ma71 490

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-21- ** iores de TGF-β libertado da CM resultaram numa maior inibição do crescimento celular quando testadas em relação a células A549 sensíveis a TGF-/> , com uma libertação de droga suficiente, ao fim de uma hora, para provocar uma inibição de crescimento celular de 50%. Observou-se inibição total após 8 horas, a qual permaneceu constante durante a totalidade das 72 horas da experiência. 0 TGF-/? em PBS sem o veículo CM inibiu aproximadamente 80% da actividade de proliferação celular, durante a totalidade da experiência. Estes r_e sultados são apresentados na Figura 2.

Exemplo III

Efeito da Distribuição de TGF-^1 Mediada pela Matriz de Colagénio (CM) Sobre o Crescimento de Células de Tumor de Pulmão Humano A549 em Ratos Nus.

Ratos nus macho (Balb/c-nu⁺/nu⁺) com 12 semanas de idade,f£ ram injectados subcutaneamente, na região dorsal do pescoço com

1,3 x 10^ células de carcinoma de pulmão humano (A549), num volume de 0,2 ml de PBS. Ao fim de 20 dias tinham-se desenvolvido tumores palpáveis (> 10 mm^ -3x3x1 mm), em aproximadamente 80% dos an£ mais. 0 tamanho dos tumores foi medido com compassos, de calibre s_e gundo três diâmetros. Os animais apresentando tumores foram então seieccionados aleatoriamente para diferentes grupos de tratamento.0 dia 1 de tratamento corresponde ao primeiro dia em que os animais foram tratados após o desenvolvimento de tumores mensuráveis. 0 TG£ -y£l foi purificado até à homogeneidade, a partir de células de ovário de criceto chinês, expressando TGF-βΊ recombinante de símio (p_a ra preparação veja-se LISSN 147 842, depositada em 25 de Janeiro de 1988 , cuja descrição é aqui incorporada como referência) e estabil^i zado com um excesso de 10 vezes de albumina de soro bovino (BSA).

As quantidades totais de cada factor administradas durante a duração desta experiência particular, são as indicadas sob Tratamento

A eficácia da distribuição de TGF-/J1 mediada por CM peritumoralmente, em relação a um veículo salino, foi avaliada como se segue. Os grupos experimentais (veja-se Tabela 1) receberam TGF—/31 n£ ma dose de 2 /ig administrados de uma vez, peritumoralmente, ou de 400 ng administrados 5 vezes a intervalos de 2-3 dias. Estudou-se

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uma avaliação de CM-TGF-/1 com ou sem o modificador vasoactivo epi. nefrina, em comparação com o veículo isolado (CM(30 mg/ml)), solução salina tamponada com fosfato (PBS) isolada, ou CM (30 mg/ml) i solada. 0 ponto final foi tomado no dia 16 e a percentagem dos volumes dos tumores tratados relativamente aos tumores controlo não tratados, foi estabelecida como se apresenta na Tabela 1.

Tabela 1

Efeito de TGF-^1 Administrado Isolado ou em Combinação com CM e

Epinefrina, sobre o Crescimento de Tumores A549 em Ratos Nus

Grupo	Tratamento	Na. Rato Crescimento do
			Tumorl
1	Solução Salina Controlo	5	100
2	CM (30 mg/ml) 0,1 ml s.e.2 x 1	5	84
3	TGF-β (400 ng/0,1 ml)
	s.e, x 5 (separador 2-3 dias)	5	57
4	TGF-/3 (2 yUg/0,1 ml) s.e. x 1	5	72
5	TGE-βΐ (2/xg/0,l ml)
	+ CM, s.e. x 1	5	84
6	TGF-β (2 pg/0,1 ml) + CM +
	Epi (25/Xg/0,l ml) s.e. x 1	5	63
''Percentagem do Volume do Tumor tratado	com Solução	Salina Controlo
no dia 16.
2 s.e.	indica injecção subcutânea peritumoral
	Como é mostrado acima, o regime	mais eficaz	para TGF-/31,

consiste em administrar o TGF-^1 peritumoralmente em cinco doses de 400 ng cada uma a intervalos de 2-3 dias (Grupo 3). Os resultados sugerem ainda que a exposição repetida das células de tumor a TGF-/?1 é mais eficaz que uma única administração de uma dose superior (2 ) (Grupo 4). No entanto, quando TGF-βΙ foi administrado com CM, em combinação com o modificador vasoactivo epinefrina (Grupo 6), uma injecção única resultou numa supressão do crescimento de tumores semelhantes à observada com doses múltiplas reduzidas de TGF-βΙ (Grupo 3). 0 tumor foi, presumivelmente, exposto a uma dose crónica

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baixa de TGF-^1, à medida que TGF-/31 era libertado da CM para o alvo .

Os resultados acima demonstram que CM-TGF-βΐ, particularmente em combinação com um agente vasoactivo, é eficaz para inibir a proliferação celular. Como se evidencia na descrição acima, são descritas composições que proporcionam a libertação lenta de um agente anti-proliferativo na proximidade de uma célula-alvo.

Todas as publicações e pedidos de patente mencionadas nesta especificação são indicativos do nível de perícia dos peritos na ar te a que o presente invento se destina. Todas as publicações e ped£ dos de patente são aqui incorporados como referência, na mesma extensão, como se cada publicação ou pedido de patente individual fo_s se específica e individualmente indicado para ser incorporado como referência.

Será evidente para os entendidos na arte que podem efectuaj? -se diversas mudanças e modificações no processo do invento totalmente descrito acima, sem sair do espírito ou âmbito das reivindicja ções em apêndice.

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Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Processo de preparação de uma composição caracterizado por compreender a dispersão, numa matriz proteica, de pelo menos oito aminoácidos consecutivos de um TGF-β (factor de crescimento transformante do tipo β ).
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o TGF-/3 ser TGF-M ou TGF-/62.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida matriz proteica compreender, pelo menos, um de entre o colagénio e o fibrinogénio.
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a matriz proteica referida ser colagénio, numa concentração de colagénio de cerca de 10 mg/ml a 40 mg/ml.
5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a referida concentração ser de cerca de 30 mg/ml de colagénio.
6. 6 - Processo de preparação de uma composição caracterizado por compreender a dispersão, numa matriz de colagénio numa concentração de cerca de 10 mg/ml a cerca de 40 mg/ml, de TGF-β numa concentração de cerca de 1 ng a 10 mg/ml de colagénio,
7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracretizado por o referido TGF-/? ser TGF-y^l de símio.
8. 8 - Processo de preparação de uma composição caracterizado por compreender a dispersão de pelo menos um de entre TGF-/21 e TGF-A2, numa matriz de colagénio, numa quantidade suficiente para, quando libertado da referida matriz, inibir a proliferação de uma célula alvo.
9. 9 - Processo para a inibição selectiva da proliferação de células sensíveis a TGF-/?, caracterizado por compreender o contacto, in vitro das células referidas com uma composição anti-prolife rativa, compreendendo uma matriz proteica e pelo menos um TGF-/? nu ma quantidade suficiente para, quando libertado da matriz referida, inibir a proliferação das células referidas.

   71 490

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   -2510 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a matriz proteica referida compreender pelo menos um de entre colagénio e fibrinogénio.
10. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizja do por o TGF-4 referido ser TGF-y)l de símio.

    Lisboa, 11.