DE2359564C2

DE2359564C2 - β-Urogastron und γ-Urogastron, Verfahren zu deren Gewinnung und diese Polypeptide enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen

Info

Publication number: DE2359564C2
Application number: DE2359564A
Authority: DE
Inventors: Harold Gregory; Ian Robert Macclesfield Cheshire Willshire
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date: 1972-11-29
Filing date: 1973-11-29
Publication date: 1984-06-14
Also published as: NL185345C; GB1394846A; BE807934A; DE2359564A1; US3883497A; JPS5930685B2; SE411297B; AU6195173A; FR2207726B1; NL185345B; CH608372A5; HU169712B; IL43499A; IL43499A0; FR2207726A1; NL7315504A; AU477190B2; ZA738179B; JPS4993516A

Description

Tyr-Gly-Val-Val-Cys-Asn*-

—»Ile-Gly-Glu-Arg-Cys-Gln-Tyr—

X—Leu-Glu-Trp-Trp-Lys-Leu-Asp-Arg<—
mit den Bedeutungen

X: HO-Arg für^-Urogastron,

X: HO für/-Urogastron.

2. Verfahren zur Gewinnung der Urogastrone gemäß Anspruch 1 aus rohem Urogastron dadurch gekennzeichnet, daß man

a) ein in Wasser gelöstes Urogastronpräparat mit einer spezifischen Aktivität von 5—10 μg/kg auf eine Carboxymethylcellulose enthaltende mit einem 0,01 molaren wäßrigen Natriumacetat/Essigsäure-Puffer mit pH 4,5 equilibrierte Säule aufgibt, die Säule mit einem Natriumacetat/Essigsäure-Puffer mit pH 5,0 und mit einem Konzentrationsgradienten von 0,01 molar bis 0,5 molar eluiert und das biologische Aktivität aufweisende Eluat sammelt,

b) das gemäß Verfahrensstufe a) erhaltene, biologisch aktive Material auf eine poröses, eine Ausschlußgrenze für Moleküle mit einer Masse von mehr als 5000 Dalton aufweisendes Polyacrylamidgel enthaltende Säule in einem 0,05 molaren wäßrigen Ammoniumacetat-Puffer mit pH 7,2 aufgibt, die Säule mit dieser Puffer-Lösung eluiert und das biologische Aktivität aufweisende Eluat sammelt,

c) das gemäß Verfahrensstufe b) erhaltene biologisch aktive Material auf eine Aminoäthylcellulose enthaltene, mit einem 0,01 molaren wäßrigen Ammoniumacetat/Essigsäure-Puffer mit pH 5,5 equilibrierte Säule aufgibt, die Säule anfangs mit diesem Puffer der angegebenen Molarität, dann mit dem gleichen Puffer mit einem Konzentrationsgradienten von 0,01 molar bis 0,3 molar eluiert und
Ci) einen/?-Urogastron enthaltenden mittleren sowie

C2) einen /-Urogastron enthaltenden späteren Fraktionsbereich mit biologischer Aktivität sammelt,

di) die Fraktionen ei) auf eine Carboxymethylcellulose enthaltende mit einem 0,01 molaren wäßrigen Natriumacelat/Essigsäure-Puffer mit pH 5,0 equilibrierte Säule aufgibt, die Säule mit einem Natriumacetat/Essigsäure-Puffer mit pH 5,0 und mit einem Konzentrationsgradienten von 0,01 molar bis 0,5 molar eluiert, das biologische Aktivität aufweisende Eluat sammelt und

ei) unter den in Verfahrensslufe b) angegebenen Bedingungen Chromatographien,

d2) die Fraktionen C2) auf eine Carboxymethylcellulose enthaltende, mit einem 0,01 molaren wäßrigen Natriumacetat/Essigsäure-Puffer mit pH 4,8 equilibrierte Säule aufgibt, die Säule mit einem Natriumacetat/Essigsäure-Puffer mit pH 4,8 und mit einem Konzentrationsgradienten von 0,01 molar bis 0,5 molar eluiert, das biologische Aktivität aufweisende Eluat sammelt und

e2) unter den in Verfahrensstufe b) angegebenen Bedingungen Chromatographien.

3. Pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend /?-Urogastron oder /-Urogastron und übliche Verdünnungsmittel oder Trägermittel.

Die Erfindung betrifft als/f-Urogastron und/-Urogastron bezeichnete Polypeptide gemäß Anspruch 1. Diese Peptide besitzen die Eigenschaft, die Sekretion von saurem Magensaft zu verhindern.

Es ist bekannt, beispielsweise aus Science, 1939, 89, 489, daß Extrakte von menschlichem Urin die Sekretion von saurem Magensaft verhindern können. Es wurden bereits viele Versuche unternommen, das aktive Material, welches üblicherweise »Urogastron« bezeichnet wird, zu isolieren und zu charakterisieren. Bisher hat man immer angenommen, daß eine einzige chemische Verbindung für die biologischen Eigenschaften eines rohen Urogastronpräparats verantwortlich ist. Von der reinsten Urogastronprobe, die bisher beschrieben wurde

t>5 (American Journal of Digestive Diseases, 1970, 15, 145—148), wurde behauptet, daß sie eine einzige Verbindung ist.

Es wurde gefunden, daß sogar dieses Material nicht homogen ist. Die Basis für die vorliegende Erfindung ist die Fraktionierung von rohem Urogastron in mindestens drei Komponenten, von denen jede ein äußerst

kräftiger Inhibitor für die Sekretion von saurem Magensaft ist. Die Basis der vorliegenden Erfindung ist weiterhin die Zurverfügungstellung zweier dieser Komponenten in reiner Form. In dieser Beschreibung werden diese drei Komponenten als «-Urogastron.^-Urogastron und/-Urogastron bezeichnet. Von Λ-IJrogastron wird nach wie vor angenommen, daß es inhomogen ist y?-Urogastron und /-Urogastron sind aber einheitliche Verbindungen.

y?-Urogastron und /-Urogastron sind weiße, wasserlösliche, saure Polypeptide, die aus einer einzigen Polypeptidkette mit drei inneren Disulfidbindungen und mit einen·. Molekulargewicht von ungefähr 6000 bestehen.

Die ß-Komponente weist die folgenden physikalischen Eigenschaften auf:

Papierchromatographie in n-ButanoI zu Essigsäure zu Pyridin zu Wasser (30 :6 ·. 24 :20) — einziger Fleck RfO,59;

Papierelektrophorese in Pyridinacetat bei pH 6,5 — eine kleine ovale Fläche, die sich leicht anodisch bewegt;

Papierelektrophorese in Essigsäure/Ameisensäure bei pH 2,1 — ein 'Komet' mit einer Frontbeweglichkeit von 1,75 im Verhältnis zu f-DNP-Lysin; Acrylamidgelelektrophorese in 0,1 m Tris/Salzsäure-Puffer bei pH 8,9 — ein einziger Fleck, der sich mit einer Beweglichkeit von 0,53 im Verhältnis vu Bromphenolblau zur Anode bewegt;

isolekektrischer Punkt — pH 4,5; und

spezifische Aktivität, wie weiter unten definiert, 0,2 bis 0,5 μg/kg.

Die/-Komponente weist die folgenden physikalischen Eigenschaften auf:

Papierchromatographie in n-Butanol zu Essigsäure zu Pyridin zu Wasser (30 : 6 :24 :20) — einziger Fleck RfO,63;

Papierelektrophorese in Essigsäure/Ameisensäure bei pH 2,1 — ein 'Komet' mit einer Frontbeweglichkeit von 1,57 im Verhältnis zu f-DNP-Lysin;

Acrylamidgelelektrophorese in 0,1 m Tris/Salzsäure-Puffer bei pH 8,9 — ein einziger Fleck, der sich mit einer Beweglichkeit von 0,65 im Verhältnis zu Bromphenolblau zur Anode bewegt; isolektrischer Punkt — pH 4,3; und

spezifische Aktivität, wie weiter unten definiert, 0,2 bis 0,5 μg/kg.

Die Fraktionierung des rohen Urogastrons zur Herstellung der reinen Komponenten verwendet ähnliche Techniken, wie sie allgemein in dem Aufsatz in Amer. J. Dig. Dis., der oben erwähnt wurde, beschrieben sind. Die letzten Stufen stellen jedoch eine beträchtliche Verbesserung gegenüber der präparativen Elektrophorese dar, die in diesem Aufsatz beschrieben wurde, da nämlich die Ausbeute und die Reinheit des Endprodukts viel höher sind. Die Reinheit eines Urogastronpräparats ist schwierig durch chromatographische Methoden zu bstimmen, sofern nicht das Präparat in der Tat hochgereinigt ist. Die spezifische biologische Aktivität des Präparats wird als bester Hinweis auf die Reinheit angesehen. In dieser Beschreibung bedeutet »spezifische biologische Aktivität« die Menge des Präparats, ausgedrückt in μg/kg, welche bei Verabreichung durch intravenöse Injektion an einen Hund, der mit einem Heidenhain-Beutel versehen ist und dessen Magensäuresekretion durch eine Histamininfusion auf 60—80% des maximalen Sekretionswertes stimuliert ist, eine 50—70%ige Inhibierung dieser Säuresekretion verursacht. Eine gewisse Verschiedenheit der spezifischen Aktivität einer bestimmten Probe wird festgestellt, wenn die Messung bei verschiedenen Hunden durchgeführt wird. Für einen äußerst genauen Vergleich der spezifischen Aktivitäten verschiedener Proben sollte deshalb für die Messung der gleiche Hund verwendet werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin das im Anspruch 2 definierte Verfahren zur Gewinnung von /?-Urogastron und/-Urogastron.

Bei diesem Gewinnungsverfahren wird die Anwesenheit von Material im Eluat aus irgendeiner Kolonne zweckmäßigerweise durch Messen des Ausmaßes bestimmt, in welchem die Fraktionen des Eluats UV-Licht mit einer Wellenlänge von 280 μηι absorbieren. Die biologische Aktivität des Materials in solchen Fraktionen wird wie oben angegeben gemessen. Das Material wird zweckmäßig durch Lyophilysierung der entsprechenden Fraktionen des Eluats gesammelt.

Das Ausgangsmaterial kann so erhalten werden, wie es allgemein in dem oben erwähnten Aufsatz in Amer. J. Dig. Dis. oder wie es speziell im Beispiel 1 beschrieben ist.

Wie oben angegeben, besitzen die Komponenten des Urogastrons die Eigenschaft der Inhibierung der Sekretion von saurem Magensaft. Diese Eigenschaft wird durch ihre Inhibierungswirkung der Sekretion von saurem Magensaft bei Hunden demonstriert, die mit einer Heidenhain-Tasche versehen sind und deren Magensaftsekretion durch Histamin stimuliert worden ist. Sie kann aber auch durch die Inhibierungswirkung der b0 Sekretion des sauren Magensafts bei Menschen, deren Magensekretion durch Pentagastrin stimuliert ist, demonstriert werden. Die Demonstration dieses Effekts bei Hunden wird ausgeführt, wie es weiter unten bei der Bestimmung der spezifischen Aktivität einer Probe angegeben ist. Beim Menschen wird dieser Effekt wie folgt demonstriert:

Ein Mensch fastet über Nacht und schluckt dann ein nasogastrischcs Rohr. Eine Lösung von Pentagastrin in b5 isotonischer Salzlösung wird in den Menschen mit einer Geschwindigkeit von 0.2 μg/kg/st infusiert, und der Magensaft wird in Abständen von 15 min abgesaugt. Die Aktivität des Magensafts wird durch Titration bestimmt. Nachdem eine stetige Sekrciionsgcschwindigkcit erreicht worden ist. wird eine gesonderte Infusion

einer Lösung von ß- oder /-Urogastron in isotonischer Dextrose mit einer Geschwindigkeit von 0,25 μg/kg/st eingeführt. Diese infusion wird während 1 st fortgesetzt, währenddessen die Geschwindigkeit der Säuresekretion um 60—80% der vorherigen stetigen Geschwindigkeit verringert wird.

Dieser physiologische Effekt ist von Wert bei der Behandlung von Zwölffingerdarmgeschwüren. Unter den obigen Bedingungen werden keine ernst zu nehmenden giftigen Effekte beobachtet.

Bei Tieren, wie z. B. bei Ratter., Kaninchen und Krallenaffen, wurden Dosen bis zu 50 μg/kg verabreicht, ohne daß wesentliche toxische Effekte erkennbar wurden.

Bei der Erzielung einer Inhibierung der Magensäuresekretion bei Warmblütern kann ein großer Bereich von Dosen verwendet werden, wie z.B. von 0,05 bis 1Gμg/kg, je nach den Umständen und äer gewünschten ίο Inhibierung. Die Dosis kann durch Injektion, insbesondere durch intravenöse Injektion, oder durch intravenöse Infusion verabreicht werden. In jedem Fall hält der Effekt mindestens ungefähr 1¹A st nach Beendigung der Injektion oder Infusion an. Bei dieser Anwendung kann an einen Menschen eine wirksame Dosis von 5 bis 500 μg durch Injektion oder Infusion verabreicht werden. Bei der Verwendung zur Behandlung eines Zwölffingerdarmgeschwürs sollte die Dosis wiederholt werden oder sollte ein Depotpräparat verwendet werden.
/?-Urogastron oder v-Urogastron können in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden. Die Erfindung betrifft deshalb des weiteren pharmazeutische Zusammensetzungen, die ^-Urogastron oder;'-Urogastron und ein pharmazeutisch zulässiges Verdünnungsmittel oder Trägermittel enthalten.

Bevorzugte Zusammensetzungen sind solche, die sich für parenteral Verabreichung oder für die Herstellung solcher Zusammensetzungen eignen. Beispiele für geeignete solche Zusammensetzungen sind sterile, injizierbare Lösungen oder Suspensionen, sterile injizierbare Depotpräparate oder ein steriles Pulver, welches in einem sterilen Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel leicht aufgelöst oder suspendiert werden kann. Solche injizierbare Lösungen oder Suspensionen, in denen der aktive Bestandteil direkt durch den Körper des Patienten verteilt wird, können 0,5—500 μg/ml enthalten. Jedoch kann ein Depotpräparat, bei dem der aktive Bestandteil von der Körperflüssigkeit nur langsam erreicht wird, bis zu 2 mg von dem aktiven Bestandteil enthalten. Eine besonders zweckmäßige sterile injizierbare Lösung ist eine sterile Lösung in isotonischer Salzlösung oder isotonischer Dextrose.

Die Erfindung wird durch Beispiele näher erläutert, worin die speziellen Chromatographiematerialien durch die Bezeichnung des Herstellers bezeichnet sind.

Carboxymethylcellulose: Whatman CM 52;

Ein poröses Polyacrylamidgel, welches Moleküle mit einem Molekulargewicht von mehr als 5000 ausschließt: Biogel P 6;
Aminoäthylcellulose: A-E Cellex;
Kieselgur: Celite 545;

Schwachbasisches Ionenaustauschharz: Deacidite G-IP 3—5% DVB;

Poröses vernetztes Dextrangel: Sephadex G-50 und G-25.

Im Falle einer Stufe, bei der eine Chromatographiekolonne verwendet wurde, wurde das Eluat in Fraktionen gesammelt, die aus einer definierten Anzahl von Tropfen bestanden, wobei ein Ultrorac LKB 7000 Fraction Collector verwendet wurde.

Diese Fraktionen wurden auf das Vorhandensein von Peptidmaterialien mit Hilfe einer UV-Absorption bei 280 τημ untersucht. Das Material wurde dann in Fraktionen gesammelt, und schließlich wurde es wie folgt auf die biologische Aktivität untersucht:

Hunde wurden mit gesonderten, entnervten Fundustaschen versehen, und eine subcutane Infusion von Histamin wurde zur Stimulierung der Magensekrektion auf annähernd 60—80% der maximalen Geschwindigkeit verwendet (gewöhnlich ist eine Infusion einer Lösung von 600 μg Histamin (ausgedrückt als Base) in 0,48 ml je Stunde ausreichend). Ein bekanntes Gewicht eines Testmaterials wurde in isotonischer Salzlösung aufgelöst, und, nachdem der Hund mit einer stetigen Geschwindigkeit Magensaft absonderte, wurde eine einzige intravenöse Injektion einer bekannten Menge Material verabreicht. Die Inhibierung der Magensekretion wurde so festgehalten, und aus der bekannten Dosisansprechkurve wurde die Dosis in μg/kg errechnet, die eine 50—70%ige Inhibierung erzeugte.

Aminosäure-Analysen wurden unter Verwendung eines Locarte-Aminosäure-Analysators ausgeführt.
Alle Kolonnenchromatographien wurden bei 4°C ausgeführt. Alle Pufferlösungen waren mit Toluol gesättigt.

Beispiel 1

Trennung von rohem Urogastron in drei Komponenten

Eine Kolonne (20 cm Länge · 1,4 cm Durchmesser) wurde mit Carboxymethylcellulose (Whatman CM 52) bepackt und mit einem 0,01 m Natriumacetat/Essigsäure-Puffer mit pH 4,5 ins Gleichgewicht gebracht. 100 mg eines Urogastronpräparats mit einer spezifischen Aktivität von 5—10 μg/kg wurden in 20 ml Wasser aufgelöst und mit einer Geschwindigkeit von 15 ml je Stunde auf die Kolonne aufgegeben. Nachdem Aufgeben wurde die Kolonne mit der gleichen Geschwindigkeit mit einem Na;-iumacetat/Essigsäure-Puffer mit pH 5,0 unter Verwendung eines Gradienten von 0,01 m bis 0,5 m (200 ml eines jeden Puffers) eluiert. Dabei wurden Fraktionen bi mit 100 Tropfen gesammelt. Das biologisch aktive Material wurde in den Fraktionen 46 — 54 entdeckt. Diese wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei ein Material erhalten wurde, das Natriumacetat wie auch Polypeptid enthielt.

Das ganze gemäß obiger Vorschrift erhaltene Material wurde in 2 ml Wasser aufgelöst und auf eine Kolonne

(85 · 1,5 cm) von porösem Polyacrylamidgel, welches ein Molekulargewicht von mehr als 5000 ausschloß (Biogel P 6: 75 — 40 μπι) und das mit 0,05 m wäßrigem Ammoniumacetat ins Gleichgewicht gebracht worden war, aufgegeben. Die Kolonne wurde mit dieser Lösung unter einer Geschwindigkeit von 7 ml pro Stunde eluiert, und es wurden Fraktionen von 66 Tropfen gesammelt. Das biologisch aktive Material wurde in den Eluatfraktionen 27 bis 42 gefunden. Eine Gefriertrocknung dieser Fraktionen ergab 35 mg eines Materials mit einer spezifischen Aktivität von 3 — 5 μg/kg.

Die Gesamtmenge dieses Materials wurde darin in Wasser (5 mg/ml) aufgelöst und mit einer Geschwindigkeit von 4 ml pro Stunde auf eine Kolonne (10 · 1 cm) aufgegeben, die mit Aminoäthylcellulose(A-E Cellex) bepackt war und die mit einem 0,01 m Ammoniumacetat/Essigsäure-Puffer mit pH 5,5 ins Gleichgewicht gebracht worden war. Nachdem 10 Fraktionen von jeweils 66 Tropfen gesammelt worden waren, wurde die Kolonne mit einem Puffer unter Verwendung eines Gradienten von 0.01 m bis 0,3 m (40 ml für jeden Puffer) eluiert. Das biologisch aktive Material wurde in drei Fraktionsgruppen, 24—29,30—33 und 34—42, gefunden, die gesondert gehalten und lyophilisiert wurden, wobei aus den Fraktionen 24—29 Λ-Urogastron, aus den Fraktionen 30—33 Material, das hauptsächlich aus /d'-Urogastron (6 mg) mit einer spezifischen Aktivität von ungefähr 1 μg/kg bestand, und aus den Fraktionen 34—42 Material, das hauptsächlich aus /-Urogastron (6 mg) mit einer spezifisehen Aktivität von ungefähr i μ§/'ι^ bestand, erhalten wurde.

Weitere Reinigung von /ii'-Urogastron

Eine Kolonne (32 · 1 cm) wurde mit Carboxymethylcellulose (Whatman CM 52) bepackt und mil 0,01 m Natriumacetat/Essigsäure-Puffer mit pH 5,0 ins Gleichgewicht gebracht. Das oben erhaltene Material, das hauptsächlich aus /?-Urogastron bestand, wurde in 2 mg/ml Wasser aufgelöst und mit 5 ml je Stunde auf die Kolonne aufgegeben. Die Kolonne wurde dann mit der gleichen Geschwindigkeit mit einem Nalriumacetat/Essigsäure-Puffer mit pH 5,0 unter Verwendung eines Gradienten von 0,01 m (130 ml) bis 0,5 m (65 ml) eluiert, wobei Fraktionen von 66 Tropfen gesammelt wurden. Das biologisch aktive Material wurde in der Spitze entdeckt, die zwischen die Fraktionen 50—60 fiel, welche vereinigt und lyophilisiert wurden.

Das ganze gemäß obiger Vorschrift erhaltene Material wurde in 1 ml Wasser aufgelöst und mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 3 ml je Stunde auf eine Kolonne (100 · 1 cm) von porösem Polyacrylamidgel, welches ein Molekulargewicht von mehr als 5000 ausschloß (Biogel P 6; 75 — 40 μπι) und das mit 0,05 m Ammoniumacetat ins Gleichgewicht gebracht worden war, aufgegeben. Die Kolonne wurde mit dieser Lösung bei der gleichen Strömungsgeschwindigkeit eluiert. und Fraktionen von 30 Tropfen wurden gesammelt. Das biologisch aktive Material wurde in den Fraktionen 28—39 entdeckt. Diese wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei 2—4 mg/?-Urogastron erhalten wurden, das die folgenden Eigenschaften aufwies:

1. spezifische Aktivität — 0,2 — 0,5 μg/kg,

2. Aminosäureverhältnis bei Analyse - Asp 7, Ser 3, GIu 5, Pro 1, GIy 4, AIa 2, VaI 3, Cys 6, Met 1, Me 2, Leu 5, Tyr 5, His 2, Lys 2, Trp 2, Arg 3,

3. isoelektrischer Punkt — pH 4,5 durch isoelektrische Fokussierung,

4. einziger Fleck Rf 0,59 bei Papierchromatographie in n-Butanol zu Essigsäure zu Pyridin zu Wasser

(30 : 6 : 24 : 20),

5. ein Komet mit einer Frontmobilität von 1.75 im Verhältnis zu f-DNlP-Lysin bei Papierelektrophorese in Essigsäure/Ameisensäure mit pH 2,1 (20 ml Ameisensäure, 80 ml Essigsäure und aufgefüllt auf 1 1 mit Wasser),

6. eine kleine ovale Fläche, die sich leicht anodisch bewegt bei Papierelektrophorese in Pyridinacetat mit

pH 6,5(3 ml Essigsäure, 100 ml Pyridin und aufgefüllt mit Wasser auf 1 1),

7. ein einziger Fleck mit einer Mobilität von 0,53 im Verhältnis zu Bromphenolblau bei Acrylamidgelelektrophorese in 0,1 m Tris/Salzsäure-Puffer mit pH 8,9.

Weitere Reinigung von /-Urogastron

Das oben für die weitere Reinigung von ^-Urogastron beschriebene Verfahren wurde mit dem Material wiederholt, das hauptsächlich aus v-Urogastron bestand, außer daß die Chromatographie auf Carboxymethylcellulose bei einem pH von 4,8 anstelle auf 5.0 ausgeführt wurde und daß das Endprodukt aus der Kolonne mit porösem Polyacrylamidgel in den Fraktionen 30—41 entdeckt wurde. Das auf diese Weise erhaltene ^-Urogastron besaß die folgenden Eigenschaften:

1. spezifische Aktivität — 0,2 — 03 μg/kg,

2. Aminosäureverhältnis bei Analyse — Asp 7, Ser 3, GIu 5, Pro 1, GIy 4, AIa 2, VaJ 3, Cys 6, Met 1, He 2, Leu 5, Tyr 5, His 2, Lys 2, Trp 2, Arg 2,

3. isoelektrischer Punkt — pH 43 durch isoelektrische Fokussierung,

4. einziger Fleck Rf 0,63 bei Papierchromatographie in n-Butanol zu Essigsäure zu Pyridin zu Wasser (30:6:24:20),

5. ein Komet mit einer Frontmobilität von 1,57 im Verhältnis zu f-DNP-Lysin bei Papierelektrophorese in Essigsäure/Ameisensäure mit pH 2,1 (20 ml Ameisensäure, 80 ml Essigsäure und aufgefüllt mit Wasser auf IQ.

6. eine kleine ovale Räche, die sich leicht anodisch bewegt bei Papierelektrophorese in Pyridinacetat mit pH 6^ (3 ml Essigsäure, 100 ml Pyridin und aufgefüllt mit Wasser auf 1 1),

7. ein einziger Fleck mit einer Mobilität von 0,65 im Verhältnis zu Bromphenolblau bei Acrylamidgelelektro-

phorcse in 0,1 m Tris/Salzsäure-Puffer mit pH 8,9.

Das Ausgangsmaterial, ein Urogastronpräparat mit einer spezifischen Aktivität von 5—10 μg/kg, wurde wie folgt erhalten:

Menschlicher, männlicher Urin wurde während 24 st in Behältern gesammelt, welche ausreichend Chloroform enthielten, daß zu allen Zeiten eine gesättigte Lösung erhalten wurde. Der gesammelte Urin wurde rasch gerührt, währenddessen der pH unter Verwendung von Eisessig (ca. 2,2 ml/1 Urin) auf 5 eingestellt wurde. Eine 25%ige (G/V) wäßrige Lösung von Tanninsäure B. P. wurde in Mengen von 20 ml/1 Urin zugegeben, und ungefähr 1 st später wurde mit Säure gewaschener Kieselgur (Celite 545) zugegeben (ca. 1 g/l). Die Suspension wurde gerührt, und die Ausfällung wurde über Nacht absitzen gelassen. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgehebert, und der Rückstand wurde in einen großen gesinterten Glastrichter überführt, der vorher mit einer dünnen Schicht von Kieselgur versehen worden war. Die Ausfällung wurde mit etwas Wasser und dann mit Methanol gewaschen, bis die Waschflüssigkeiten farblos waren. Die Ausfällung wurde dann getrocknet, in einen Becher überführt und mit Methanol, das 1% (V/V) konzentrierte Salzsäure enthielt, in eine dünne Paste gemischt. Die Paste wurde filtriert, und der Rückstand wurde mit dem obigen sauren Methanol gewaschen, bis die Waschflüssigkeiten farblos waren. Je Liter Ausgangsurin wurden 5 ml saures Methanol verwendet. Die vereinigten Filtrate wurden dann langsam mit vier Volumina Aceton filtriert, und die so hergestellte Ausfällung wurde absitzen gelassen. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert, und die Ausfällung wurde durch Zentrifugieren gesammelt. Der Rückstand (ca. 20 mg/1 Urin) wurde dann zweimal mit Aceton gewaschen und unter Vakuum getrocknet.

Ein schwachbasisches Ionenaustauschharz (Deacidite G-IP, 3—5% DVB, 150 — 75 μηι) wurde in die Acetatform überführt, in eine Kolonne (35 · 2,8 cm) gepackt und mit 2 m Essigsäure und dann mit Wasser gewaschen. Das oben erhaltene Produkt (20 g) wurde in Wasser aufgelöst, die Lösung wurde auf pH 5—6 eingestellt, auf 2 I verdünnt und dann durch das Harz mit einer Geschwindigkeit von 80 ml je Stunde filtriert. Die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen, bis das Eluat klar war, und dann mit 400 ml 50% (V/V) wäßriger Essigsäure eluiert, wobei ein dunkles Eluat erhalten wurde, das unter vermindertem Druck eingedampft und abschließend in ein Pulver lyophilisiert wurde.

Eine Kolonne (100 · 2,8 cm) aus porösem, vernetztem Dextrangel (Sephadex G-50) wurde mit 0,1 m Ammoniumbicarbonat ins Gleichgewicht gebracht, und eine Lösung des gesamten Produkts der vorherigen Stufe in 20 ml Wasser, die mit 0,88-Ammoniak auf pH 7 eingestellt war, wurde zusammen mit Waschflüssigkeiten (2 · 2 ml) auf die Kolonne aufgegeben. Die Kolonne wurde mit 0,1 m Ammoniumbicarbonat unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 40 ml je Stunde entwickelt, und die Eluatfraktionen zwischen 350 und 550 ml Eluatvolumen wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei 600 mg eines Materials mit einer spezifischen Aktivität von 100—200 μg/kg erhalten wurden.

Das Material aus den vier Chargen der vorhergehenden Stufe wurde dann unter Verwendung von zwei Systemen einer Lösungsmittelextraktion unterworfen:

a) Umdestilliertes t-Butanol (150 ml), Wasser (150 ml) und Ammoniumsulfat (30 g)

b) Umdestilliertes Isopropanol (300 ml), Wasser (300 ml) und Ammoniumsulfat (60 g)

Jedes System war bei Raumtemperatur im Gleichgewicht.

Das Material (2,4 g) wurde in 40 ml der unteren Phase des Systems (a) aufgelöst und in ein 100 ml-Zentrifugenrohr eingebracht. 30 ml der gleichen unteren Phase des Systems (a) wurden außerdem in drei weitere solche Rohre eingebracht, und das erste Rohr wurde mit 30 ml der oberen Phase des Systems (a) extrahiert. Der Extrakt wurde in ein jedes der anderen Rohre aufeinanderfolgend überführt, und das gesamte Verfahren wurde dreimal wiederholt. Die Rohre wurden dabei zwischen einer jeden Extraktion zentrifugiert, so daß eine klare obere Phase erhalten wurde. Die vereinigten oberen Phasen wurden dann verworfen, und die unteren Phasen wurden mit 8 aufeinanderfolgenden Portionen von 30 ml der oberen Phase des Systems (b) extrahiert Die 8 Extrakte wurden nach dem Durchgang durch die vier Rohre, welche die untere Phase des Systems (a) enthielten, vereinigt, unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 35° C eingedampft und abschließend in ein Pulver lyophilisiert.

Das ganze Pulver wurde in 35 ml Wasser aufgelöst und auf eine Kolonne (100 ■ 3,3 cm) aus porösem, vernetztem Dextrangel (Sephadex G-25), das mit 0,4 m Essigsäure ins Gleichgewicht gebracht worden war, aufgegeben. Die Kolonne wurde mit 0,4 m Essigsäure unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 50 ml je Stunde entwickelt.

Dabei wurden Fraktionen von 10 ml gesammelt. Das biologisch aktive Material wurde in den Fraktionen 43—68 entdeckt Diese wurden vereinigt und in ein Pulver (ca. 1 g) lyophilisiert, das eine spezifische Aktivität von 50—100 μg/kg aufwies.

Eine Kolonne (24 - 3,2 cm) wurde mit Carboxymethylcellulose (Whatman CM 52) gepackt und mit einem 0,01 m Ammoniumacetat/Essigsäure-Puffer mit pH 4,5 ins Gleichgewicht gebracht Eine Lösung des gesamten Produkts aus der vorhergehenden Stufe in Wasser (10 mg/mi) wurde auf die Kolonne mit einer Geschwindigkeit von 45 ml je Stunde aufgebracht Die Kolonne wurde mit einem 0,01 m Ammoniumacetat/Essigsäure-Puffer mit pH 4,5 eluiert, bis das Eluat kein Material mehr enthielt welches bei 280 πιμ absorbierte. Die Kolonne wurde dann mit Ammoniumacetat/Essigsäure-Puffer unter Verwendung eines Gradienten von 0,01 m, pH 4,5 (500 ml) bis 0,2 m, pH 6,7 (500 ml) eluiert Das biologisch aktive Material wurde dann in einer einzigen Spitze entdeckt, und das Eluat wurde lyophilisiert

Das gesamte Material aus der vorhergehenden Stufe wurde dann in dem geringsten Volumen Wasser (ca. 2 ml) aufgelöst und auf eine Kolonne (120 · 1,6 cm) aus porösem Polyacrylamidgel (Biogel P 6; 75 — 40 μπι), das mit 0,2 m Essigsäure ins Gleichgewicht gebracht worden war, aufgegeben. Die Kolonne wurde mit dem gleichen

gj Lösungsmittel mit einer Geschwindigkeit von 10 ml je Stunde eluiert, und es wurden Fraktionen von 99 Tropfen

gesiimmelt. Das biologisch aktive Material wurde in den Fraktionen 70—84 entdeckt. Diese wurden vereinigt ','·, und lyophilisiert, wobei 100 mg eines Urogastronpräparats mit einer spezifischen Aktivität von 5—10μg/kg

'ff erhalten wurden.

;-ϊ B e i s ρ i e I 2

;:^! 10 mg ^-Urogastron oder ;'-Urogastron wurden in 50 ml pyrogenfreiem Wasser aufgelöst, und die Lösung

Vf₁ wurde durch ein Sterilisierungsmembranfiltrationssystem, beispielsweise 0,22 ιημ-Millipore ®-Filter in Ampullen

\). filtriert, so daß jede Ampulle 0,5 ml aufnahm. Der Inhalt einer jeden Ampulle wurde dann lyophilisiert, und die io

'■ Ampullen wurden unter sterilen Bedingungen verschlossen. Die Ampullen, von denen jede 100 μg Urogastron

Ii enthielt, wurden bei —20⁰C gehalten.

§ Beispiel 3

H Der Inhalt einer Ampulle, die gemäß Beispiel 2 hergestellt worden war, wurde in einer sterilen, pyrogenfreien,

5°/oigen (G/V) Dextroselösung aufgelöst, wobei 125 ml einer Lösung erhalten wurde, die 0,8 μg/ml Urogastron in 5% (G/V) Dextroselösung enthielt. Diese Lösung eignete sich für die Verabreichung durch Infusion zur Inhibierung der Sekretion eines sauren Magensafts.

Wenn eine Lösung für eine Injektion erforderlich ist, dann wird der Inhalt der Ampulle in 5% (G/V) Dextrose- 20 lösung verteilt, so daß eine Lösung erhalten wird, die 5—50 μg/ml Urogastron enthält.

Alternativ kann die 5°/oige (G/V) Dextroselösung durch eine isotonische Salzlösung ersetzt werden.

Claims

Patentansprüche:
l.^-Urogastron und/-Urogastron der Formel

H-Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His-Asp-üly-

i Tyr-Met-Cys-Val-Gly-Asp-His-Leu-Cys-Tyr«-

Γ ι

¹ »Ile-GIu-Ala-Leu-Asp-Lys-Tyr-Ala-Cys