DE2540545A1

DE2540545A1 - Polypeptide

Info

Publication number: DE2540545A1
Application number: DE19752540545
Authority: DE
Inventors: Harold Gregory; Beryl Margaret Preston
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date: 1974-09-11
Filing date: 1975-09-11
Publication date: 1976-03-25
Also published as: JPS5154563A; NL7510382A; SE7510082L; BE833277A; US4035485A; DE2540545C2; FR2284334A1; AU8396075A; GB1461106A; IL47962A0; ZA755170B; FR2284334B1; JPS5950316B2

Description

PATENTANWÄLTE ,-

D R- - I N G. R F ( N C !ί E ' .11· ^SEP-^{19 5}

DIPL-ING. H. UOHR - -

DlPL -IMG. S. STAMPER 2540545

8 MÜNCHEN 5

MÜLLERSTKASSE 31

23822 - Dr.K/hr
Case PH.27255

IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES LIMITED,
London, Grossbritannien

"Polypeptide"

Priorität; 11. September 1974, Grossbritannien 39600/74

Die Erfindung bezieht sich auf Polypeptide, welche die Eigenschaft besitzen, die Sekretion von saurem Magensaft zu inhibieren.

Es ist seit vielen Jahren bekannt, dass Extrakte von menschlichem Urin eine Inhibierung der Sekretion von saurem Magensaft bei Warmblütlern verursachen können. Die Isolation
zweier der ektiven Komponenten in reiner Form ist in der

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DT-OS 2 359 564 beschrieben. Diese beiden reinen Komponenten sind als ß-Urogastron bzw. Ύ-Urogastron bekannt. Die Grundlage der vorliegenden Erfindung ist die Feststellung, dass der enzymatische Abbau, von ß- oder y-Urogastron zu einem neuen Polypeptid führen kann und dass dieses neue Polypeptid und sein Reduktionsprodukt kräftige Inhibitoren für die Sekretion von saurem Magensaft sind.

Gegenstand der Erfindung ist also ein Polypeptid, bei dem es sich um ein weisses, wasserlösliches, saures Polypeptid handelt, das aus einer einzigen Polypeptidkette mit drei inneren Disulfidbindungen besteht; am N-Ende nach Dansylierung Asparaginsäure aufweist; ein Molekulargewicht von ungefähr 5500 besitzt; die folgenden physikalischen Eigenschaften zeigt:

Papierchromatografie in n-Butanol:Essigsäure:Pyridin: Wasser (30:6:24:20) - ein einziger Fleck mit E^₁ 0,62; Papierelektrophorese in Essigsäure/Ameisensäure mit einem pH-Wert von 2,1 - ein "Komet" mit einer Frontmobilität von 1,67 relativ zu ζ-DNP-Lysin; Acrylamidgelelektrophorese in 0,1 m Tris/Salzsäure-Puffer mit einem pH-Wert 8,9 - ein einziger Fleck, der sich mit einer Mobilität von 0,77 relativ zu Bromphenolblau zur Anode bewegt;

bei Analyse eines Hydrolysats ein Aminosäureverhältnis wie folgt ergibt:

Asparaginsäure 7» Serin 3, Glutaminsäure 4, Prolin 1, Glycin 4, Alanin 2, Valin 3, Cystein 6, Methionin 1, Isoleucin 2, Leucin 3, Tyrosin 5» Histidin 2, Lysin 1 und Arginin 2;

und eine biologische Wirkung, wie weiter unten definiert, im Bereich von 0,2 bis 1 ug/kg aufweist;

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OC¹Si- das ßeduktionsprodukt, bei dem die Cystinreste in Cysteinreste reduziert sind.

Das erfindungs£;emässe Polypeptid kann aus ß- oder ^-Urogastron dadurch erhalten v/erden, dass man zunächst das ß- oder γ-Uronrastron mit einer lysinspezifischen Aminoendopeptidase inkubiert, wobei ein Polypeptid mit 4? Aminosäureresten erhalten wird, und dass man dann das Polypeptic mit Carboxypeptidase-A inkubiert, wodurch ein Leucinrest vom C-Ende abgespalten wird.

So wird also gemäss der Erfindung weiterhin ein- Verfahren £ur Herstellung des erfindungsgemässen Polypeptids oder seines Reduktionsprodukts vorgeschlagen, welches dadurch ausgeführt wird, dass man ein Polypeptid mit 47 Aminosäureresten in den Verhältnissen Asp 7, Ser 3, GIu 4, Pro 1, GIy 4, AIa 2, VaI 3, Cys 6, Met 1, He 2, Leu 4, Tyr 5, His 2, Lys 1, Arg 2, welches eine einzige Polypeptidkette mit drei inneren Disulfidbindungen bildet und die folgenden Eigenschaften zeigt:

Papierchromatografie in n-Butanol:Essigsäure:Pyridin: Wasser (50:6:24:20) - einziger Fleck mit einer Mobilität von 0,90 relativ zu Phenylalanin; Papierelektrophorese in Essigsäure/Ameisensäure mit einem pH-Wert von 2,1 - ein "Komet" mit einer Frontmobilität von 1,58 relativ zu ζ-DNP-Lysin; Acrylamidgelelektrophorese in 0,1 m Tris/Salzsäure-FuIfer mit einem pH-Wert von 8,9 - einziger Fleck, der sich mit einer Mobilität von 0,81 relativ zu Bromphenolblau zur Anode bewegt; biologische Wirkung, wie weiter unten definiert, im Bereich von 0,2 bis 1 ^ig/kg;

in einem wässrigen Medium der Einwirkung von Carboxypepti-

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dase-A unterwirft und hierauf das gewünschte Polypeptid aus dem Reaktionsgemisch abtrennt und gegebenenfalls, sofern das Reduktionsprodukt gewünscht wird, das so erhaltene Polypeptid mit einem in der Peptidchemie zur Reduktion von Disulfidbindungen üblichen Reduktionsmittel, wie z.B. einem Thiol, beispielsweise Mercaptoäthanol oder Dithiothreit, reduziert.

Die Einwirkung der Carboxypeptidase-A auf das Ausgangspolypeptid kann so ausgeführt werden, dass das Enzym einfach in dem wässrigen Medium aufgelöst wird. Es ist aber auch möglich, das Enzym an einen Träger zu binden, der in dem wässrigen Medium löslich sein kann oder auch nicht.

Die Geschwindigkeit und das Ausmass der Reaktion zwischen dem Ausgangspolypeptid und dem Enzym hängt vom Enzym/Substrat-Verhältnis, dem pH-Wert und der Temperatur des Inkubationsmediums, der Konzentration des Substrats und der Inkubationszeit ab. Im allgemeinen wird natürlich die zur Spaltung des Substrats erforderliche Zeit umso kürzer, je höher die Konzentration des Substrats oder je höher das Enzym/Substrat-Verhältnis ist. In ähnlicher Weise beeinflussen Veränderungen des pH-Wertes oder der Temperatur des Inkubationsmediums die Spaltungszeit. Der Fortschritt der Reaktion kann dadurch verfolgt werden, dass man Proben des Reaktionsmediums unter Verwendung eines automatischen Aminosäureanalysators zur Bestimmung der Menge des abgespaltenen Leucins unterwirft, oder dadurch, dass man die Proben der "Dansylierungstechnik" unterwirft, wobei ein 1-Dimethylaminonaphthalin-5-sulfonylchlorid (Hartley, Biochem. J. 1970, 119, βΟ5) verwendet wird, und die Menge des gebildeten N-Dansyl-L-leucins bestimmt. Dadurch kann der Einfluss jeder Veränderung der Reaktionsbedingungen bestimmt werden.

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Im allgemeinen verläuft die Reaktion innerhalb einer grossen Reihe von Enzym/Substrat-Verhältnissen, jedoch ist ein Mindestverhältnis von 1 Teil Enzym auf 1000 Teile Substrat erwünscht. Die Reaktion verläuft bei einem pH-Wert des Inkubationsmediums von 5 bis 10 und bei einer Temperatur von 10 bis 4-5⁰C. Bevorzugte Bedingungen zur Erzielung der gewünschten Spaltung des Ausgangspolypeptids in einer verhältnismässig kurzen Zeit, beispielsweise 12 Stunden, sind eine Konzentration des Ausgangspolypeptids von 1 mg/ml aufwärts, ein pH von 7 bis 9, eine Temperatur von 25 bis 4-0⁰C und ein Enzym/Substrat-Verhältnis von 1 Teil Enzym auf 100 Teile Substrat bis 1 Teil Enzym auf 10 Teile Subs tra t.

Das erfindungsgemässe Polypeptid kenn aus dem Reaktionsgemisch durch jede herkömmliche Technik für die Abtrennung von Polypeptiden isoliert werden, jedoch ist die Anwendung von Gelchromatografie besonders zweckmässig. So ist es möglich, das nach der Abspaltung des Leucins aus dem Ausgangspolypeptid erhaltene wässrige Medium durch eine Kolonne eines vernetzten Dextrangels oder eines Polyacrylamidgels zu filtrieren und die Kolonne mit einem Puffer, der aus Komponenten besteht, die bei der Gefriertrocknung unter Hochvakuum flüchtig sind, wie z.B. eine wässrige Ammoniutnacetatlösung mit einem pH-Wert von 7»2, zu eluieren, wobei das gewünschte Produkt erhalten wird, das durch Gefriertrocknung des Eluats isoliert wird.

Wenn das Reduktionsprodukt gewünscht wird, dann wird des erfindungsgemässe Polypeptid zweckmässig in einem wässrigen Puffer mit einem pH-Wert von 7 bis "Ό unter Ausfluss von Sauerstoff und Licht reduziert. Das Produkt kann wiederum unter Verwendung von Gelchromatographie isoliert werden.

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Wie oben bereits angedeutet, kann das Ausgangspolypeptid aus entweder ß- oder γ-Urogastron durch. Inkubierung des ß- oder γ-Urogastrons mit einer lysinspezifischeη Aminoendopeptidase erhalten werden. Ein besonders geeignetes derartiges Enzym ist AM-Prοtease, die aus reifen Fruchtkörpern des Pilzes Armillaria mellea erhalten werden kann, wie 'es näher in der GB-PS 1 263 956 beschrieben ist. Bevorzugte Inicubationsbedingungen sind eine Urogastronkonzentration von 1 mg/ml aufwärts, ein pH von 6 bis 9, eine Temperatur von 20 bis 4-0 G und ein Enzym/Substrat-Verhältnis von 1:8 bis 1:100. Nach beendeter Inkubation wird das gewünschte biologisch aktive Polypeptid durch Gelchrometografie unter Verwendung eines vernetzen Dextrangels oder eines Polyacrylamidgels isoliert.

Wie oben angegeben, sind das erfindungsgemasse Polypeptid und sein Reduktionsprodukt kräftige Inhibitoren für die Sekretion von saurem Magensaft bei Warmblütlern. Diese Eigenschaft kann dadurch demonstriert werden, dass sie die Sekretion von saurem Magensaft bei Hunden inhibieren, die mit einer Heidenhain-Tasche versehen sind und deren Magensaftsekretion mit Histamin stimuliert worden ist. Dieser Test wird zur Bestimmung der biologischen Wirkung der Produkte verwendet. Die biologische Wirkung wird definiert als die Menge des Produkts, die bei Verabreichung durch intravenöse Injektion an einen Hund, der mit einer Heidenhain-Tasche versehen ist und dessen Magensäuresekretion durch Infusion von Histamin auf 60 bis 80 % des.maximalen Sekretionswerts stimuliert ist, eine 50-bis 70 #ige Inhibierung dieser Säuresekretion verursacht. Eine gewisse Variation der biologischen Wirkung einer bestimmten Probe wird gefunden, wenn sie zu verschiedenen Gelegenheiten bei verschiedenen Hunden gemessen wird, weshalb das Ergebnis am besten als Dosierungsbereich ausgedrückt

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wird. Die physiologische Wirkung der Inhibierung der Sekretion des sauren Magensafts ist bei der Behandlung von DuodenaIgeschwüren von Wert. Unter den Testbedingungen wurden keine ernst zu nehmenden toxischen Wiriamgen festgestellt. Die Polypeptide zeilen ausserdem bei einem Standardtest Geschwürheilungseigenschaften.

Bei Verwendung zur Erzielung einer Inhibierung der Sekretion von saurem Magensaft bei Warmblütlern kann eine grosse Reihe von Dosierungen verwendet werden, wie z.B. von 0,05 bis 10 Wg/kg, je nach den Umständen und dem Ausmass der gewünschten Inhibierung. Die Dosis kann durch Injektion, insbesondere intravenöse oder subkutane Injektion, oder durch intravenöse Infusion verabreicht werden. Die Wirkung einer einzigen intravenösen Injektion dauert ungefähr 1 1/2 Stunden, und die Wirkung einer Infusion währt ungefähr 1 1/2 Stunden nach Beendigung der Infusion, so dass die Aufrechterhaltung eines niedrigen Aciditätswerts es erfordert, dass entweder die Dosis wiederholt wird oder dass ein Depotpräparat injiziert wird, aus welchem der aktive Bestandteil langsam während einer längeren Zeit in Freiheit gesetzt wird. Bei der Verwendung beim Menschen liegt eine typische Einzeldosis zwischen 5 und 500 ng/Mensch, verabreicht durch Injektion oder Infusion.

Das erfindungsgemässe Polypeptid oder Reduktionsprodukt kann in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, so dass gemäss der Erfindung weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung vorgeschlagen wird, die das Polypeptid oder das Reduktionsprodukt, wie sie oben definiert sind, und ein pharmazeutisch zulässiges Verdünnungsmittel oder Trägermittel enthält.

Bevorzugte Zusammensetzungen sind solche, die sich für psren-

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terale Verabreichung eignen, wie z.B. sterile, injizierbare Lösungen oder Suspensionen und sterile, injizierbare Depotpräparate oder Präparate mit langsamer Abgabe. Eine injizierbare Lösung oder Suspension kann 0,5 bis 500 pg/ml enthalten, wobei die verdünnteren Lösungen durch Infusion verabreicht werden. Ein injizierbares Depotpräparat oder ein Präparat mit langsamer Abgabe kann dagegen bis zu 2 mg des aktiven Bestandteils je Dosis enthalten. Besonders zweckmässige sterile, injizierbare Lösungen werden in isotonischen SaIa- oder isotonischen Dextroselösungen hergestellt, die nötigenfalls auf einen pH-V/ert von 5 bis 9 gepuffert sind und 1 bis 100 ug/ml enthalten können.

Die oben erwähnten sterilen, injizierbaren Zusammensetzungen können als solche hergestellt und gelagert werden, oder sie können unmittelbar vor der Verwendung hergestellt werden, indem ein steriles Medium, wie z.B. Wasser, zu einem bekannten Gewicht, wie z.B. 10 bis 200 ^Jg, des sterilen Bestandteils zugegeben wird, der in einem Behälter, wie z.B. einer Phiole oder Ampulle, welche die Sterilität aufrechterhält, eingeschlossen ist. Das bekannte Gewicht an sterilem Bestandteil kann auch ausreichend sterile Dextrose oder ausreichend steriles Natriumchlorid enthalten, so dass nach Verdünnung mit dem sterilen Medium eine isotonische Lösung entsteht.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Die chromatografischen Materialien, die mit dem Warenzeichen oder der Bezeichnung des Herstellers benannt wurden, sind wie folgt erhältlich:

ein poröses PolyacryLsmidgel, Biogel P6 von Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, U.S.A.;

ein poröses vernetztes Dextrangel, Sephadex G-25 von Pharmacia Pine Chemicals AB, Uppsala, Schweden;

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Carboxypeptidase-A, Carboxypeptidase-A-DFP von Worthington Biochemical Corporation, Freehold, N.J., U.S.A.

Bei den Verfahren, bei denen eine Chrometografiekolonne verwendet wurde, wurde das Eluat in Fraktionen aus einer bestimmten Anzahl von Tröpfchen gesammelt, wobei ein Ultrorac LKB 7.000-Fraktionssammler (LKB Instruments Ltd., Croydon, Surrey, Grossbritannien) verwendet wurde und wobei diese Fraktionen durch Messung der UV-Absorption bei 280 mu auf Peptidmaterial untersucht wurden. Das Material wurde in Fraktionen gesammelt. Die biologische Aktivität wurde wie folgt bestimmt:

Hunde wurden mit gesonderten entnervten Fundustaschen versehen, und es wurde eine subkutane Infusion von Histamin verwendet, eine Magensaftsekretion von annähernd 60 bis 80 % der Maximalgeschwindigkeit zu stimulieren (üblicherweise war eine Infusion einer Lösung von 600 ^Jg Histamin (ausgedrückt als Base) in 0,48 ml je Stunde ausreichend). Eine bekannte Menge Testmaterial wurde in isotonischer Salzlösung aufgelöst, und nachdem der Hund Magensaft mit stetiger Geschwindigkeit sekretierte, wurde eine einzige intravenöse Injektion dieses Materials verabreicht. Die Inhibierung der Magensaftsekretion wurde für die jeweils getestete Dosis notiert.

Die spezifische Aktivität kann aus den für die verschiedenen Dosen erhaltenen Resultaten bestimmt werden.

Aminosäureenelysen wurden unter Verwendung eines Locerte-Aminosäure-Analysators (Locarte Ltd., 24 Emperors Gate, London S.W. 7) ausgeführt.

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Alle Kolonnenchromatografien wurden bei 4⁰C ausgeführt, und alle Pufferlösungen waren mit Toluol gesättigt.

Beispiel 1

216 ug eines Polypeptide mit 47 Aminosäureresten in den weiter unten angegebenen Verhältnissen, die eine einzige Polypeptidkette mit drei inneren DisuIfidbindungen darstellte und die weiter unten angegebenen Eigenschaften zeigte, wurden in 116 ul 0,1 m Amrnoniumbicarbonatlösung aufgelöst, worauf eine Lösung von 4 ug Carboxypeptidase-A (Carboxypeptidase-A-DET) in 4 ul 0,1 tn Ammoniumbicarbonatlösung zugegeben wurde. Das Gemisch wurde 3 Stunden bei 37°C inkubiert, und eine Probe wurde der Aminosäureanalyse unterworfen. Eine weitere Menge von 12 ug des Enzyms wurde zugegeben, und die Inkubation wurde weitere 3 Stunden fortgesetzt, worauf eine weitere Probe der Aminosäureanalyse unterworfen wurde. Jede Analyse zeigte die Anwesenheit von freiem Leucin im Reaktionsgemisch. Die zweite Analyse zeigte eine Menge entsprechend einem Viertel des Leucingehalts im Ausgangspolypeptid, woraus sich ergibt, dass das Enzym vom C-Ende des Ausgangspolypeptids einen Leucinrest abgespalten hatte, wobei ein Polypeptid mit 46 Aminosäureresten zurückblieb, das sich vom Ausgangspolypeptid im Aminosäureverhältnis nur dadurch unterschied, dass drei Leucinreste anstelle der vier Leucinreste im Ausgangspolypeptid vorhanden waren.

Eine Probe der Lösung des so erhaltenen Polypeptide ergab bei einer Einfachbestimmung eine biologische Aktivität entsprechend einer 42 #igen Inhibierung, wenn eine Dosis entsprechend 0,6 ug/kg des Ausgangsmaterials verwendet wurde.

Das eis Ausgangsmaterial!verwendete Polypeptid wurde wie folgt erhalten:

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Eine Lösung von 1,0 mg ß-Urogastron in einem Gemisch aus 200 ul eines 0,1 m Ammoniumbicarbonatpuffers mit einem pH-Wert von 8,2 und 50 pl einer 0,01 m Magnesiumchloridlösung wurde mit 60 ug AM-Protease in 200 ul Wasser 16 Stunden bei 37°C inkubiert. Die erhaltene Lösung wurde auf eine Kolonne (35 x 1 cm) eines porösen vernetzten Dextrangels (Sephadex G-25) aufgebracht, und die Kolonne wurde mit 0,05 m Ammoniumacetat mit einer Fliessgeschwindigkeit von 8 ml/st entwickelt. Fraktionen von 1 ml wurden gesammelt, und peptidisches Material wurde in den Fraktionen 12-20 und 38-52 festgestellt.

Das Material in den Fraktionen 38-52 war biologisch inaktiv, und Proben wurden mit Säure, Bese oder Leucinaminopeptidase hydrolysiert. Analyse der resultierenden Lösungen zeigte, dass das ursprüngliche Peptid Aminosäuren in den folgenden Verhältnissen enthielt: GIu 1, Leu 1, Lys 1, Trp 2, Arg 1. Dansylierung ergab die Anwesenheit von Lysin am N-Ende.

Das Material 8us den Fraktionen 12-20 war biologisch aktiv, und diese Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei ein weisses, wasserlösliches, saures Polypeptid mit den folgenden Eigenschaften erhalten wurde:

1. biologische Aktivität bei einer Einzelbestimmung: 30 % Inhibierung bei einer Dosis entsprechend 0,7 ug/kg Ausgangsmaterial;

2. Aminosäureverhältnisse bei einer Analyse eines Hydrolysats:

Asp 7, Ser 3, GIu 4, Pro 1, GIy 4-, AIa 2, VaI 3, Cys 6, Met 1, He 2, Leu 4, Tyr 5, His 2, Lys 1, Arg 2;

3. einziger Fleck mit einer Mobilität von 0,90 im Verhältnis zu Phenylalanin bei Papierchromatografie in n-Butanol:Essigsäure:Pyridin:Wasser (30:6:24:20)·

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4. ein "Komet" mit einer Frontmobilität von 1,58 relativ zu £-DNP-Lysin bei Papierelektrophorese in Essigsäure/Ameisensäure mit pH-Wert 2,1 (20 ml Ameisensäure, 80 ml Essigsäure, mit Wasser auf 1 1 gebracht);

5. einziger Fleck mit einer Mobilität von 0,81 relativ zu Bromphenolblau bei Acrylamidgelelektrophorese in 0,1 m Tris/Salzsäure-Puffer mit pH-Wert 8,9.

Dansylierung des Produkts zeigte die Anwesenheit von Asparaginsäure am N-Ende.

Beispiel 2

1,5 mg eines Polypeptids mit 47 Aminosäureresten in den weiter unten angegebenen Verhältnissen, welches eine einzige Polypeptidkette mit drei inneren Disulfidbindungen bildete und die in Beispiel 1 angegebenen Eigenschaften zeigte, wurden in 200 ul 0,1 m Ammoniumbicarbonat aufgelöst, worauf eine Lösung von 60 ug Carboxypeptidase-A (Carboxypeptidase-A-DS¹P) in 60 ul 0,1 m Ammoniumbicarbonatlösung zugegeben wurde. Das Gemisch wurde 20 Stunden bei 37 C inkubiert, worauf eine weitere Menge von 60 ug Enzym zugegeben wurde und die Inkubierung weitere 20 Stunden fortgesetzt wurde. Die erhaltene Lösung wurde auf eine Kolonne (100 χ 0,9 cm) eines porösen Polyacrylamidgels (Biogel P6; 200-400 Mesh), das mit 0,05 m Ammoniumacetat ins Gleichgewicht gebracht worden war, aufgegeben. Die Kolonne wurde mit dem gleichen Lösungsmittel entwickelt, und es wurden Fraktionen von 1 ml. gesammelt. Das biologisch aktive Material wurde in den Fraktionen 27-34 entdeckt, die vereinigt und lyophilisiert wurden, wobei ein weisses,wasserlösliches, saures PoIypeptid mit den folgenden Eigenschaften erhalten wurde:

1. Aminosäureverhältnis bei Analyse eines Hydrolysats:

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Asp 7, Ser 3, GIu 4, Pro 1, GIy 4, Ala 2, VaI J, Cys 6, Met 1, lie 2, Leu 3, Tyr 5, His 2, Lys 1, Arg 2;

2. einziger Fleck Rn, 0,62 bei Papierchromatografie in n-Butanol:Essigsäure:Pyridin:Wasser (30:6:24:20);

3. ein "Komet" mit einer Frontmobilität von 1,67 relativ zu £-DNP-Lysin bei Papierelektrophorese in Essigsäure/Ameisensäure mit einem pH-Wert von 2,1 (20 ml Ameisensäure, · 80 ml Essigsäure mit Wasser auf 1 1 gebracht);

4. einziger Fleck mit einer Mobilität von 0,77 relativ zu Bromophenolblau bei Acrylemidgelelektrophorese in 0,1 m Tris/Salzsäure-Puffer mit einem pH-Wert von 8,9.

Beispiel 3

300 pg des in Beispiel 2 erhaltenen Polypeptide wurden in Wasser aufgelöst, worauf 25 mg Harnstoff, 0,5 mg Äthylendiamin-tetra-essigsäure und 25 pi Ί,5 πι Tris/Salzsäure-Puff er mit pH 8,6 zugegeben wurden. Die Lösung wurde mit Wasser auf 60 ul verdünnt,.mit Stickstoff, der keinen Sauerstoff enthielt, gespült und dann mit 1 ul Mercaptoäthanol versetzt. Die erhaltene Lösung wurde 3 Stunden im Dunkeln gehalten und dann in zwei gleiche Portionen geteilt.

Die erste Portion wurde auf eine Kolonne (100 χ 0,9 cm) eines porösen Polyacrylamidgels (Biogel P6, 200-400 Mesh) aufgebracht, und die Kolonne wurde mit 0,05 m Ammoniumacetat entwickelt, wobei eine Lösung eines Polypeptids erhalten wurde, worin· die Cystinreste in Cysteinreste reduziert waren.

14 Der zweite Teil wurde mit einer Lösung von 3»6 mg C-Jodoacetamid in 10 pl Wasser 30 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Die erhaltene Lösung wurde auf eine Kolonne (35 x

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Λ cm) eines porösen vernetzten Dextrangels (Sephsdex G-25) aufgebracht, und die Kolonne wurde mit 0,05 m Ammoniumacetat entwickelt. Es wurde ein einziges radioaktives Produkt festgestellt, und dieses Produkt ergab bei einer Aminosäureanalyse eines Säurehydrolysats Carboxymethylcystein und nicht Cystin, wodurch demonstriert wurde, dass die Reaktion mit Mercaptoäthanol ein Polypeptid ergab, worin die Cystinreste in Cysteinreste reduziert worden waren.

Beispiel ⁴ oder 2

Das in Beispiel 11 beschriebene Polypeptid oder ein Reduktionsprodukt davon, bei welchem die ursprünglichen Cystinreste in Cystein reduziert sind, wird in einer pyrogenfreien 5 #igen (G/V) Dextroselösung aufgelöst, so dass eine Endkonzentration von 40 ug/ml erhalten wird. Diese Lösung wird in Mengen von 2,5 ml in Phiolen eingebracht, und zwar jeweils durch ein sterilisierendes Membranfiltrationssysten, wie z.B. ein 0,22 mu "Millipore"-Filter ("Millipore" ist ein Warenzeichen). Der Inhalt einer jeden Phiole wird dann lyophilisiert, und die Phiolen werden unter sterilen Bedingungen verschlossen und zugeschmolzen. Die Phiolen, die ein steriles Gemisch aus Polypeptid und Dextrose enthalten, werden bei 4⁰C gelagert.

Beispiel 5

In eine Phiole, die gemäss Beispiel 4 hergestellt worden ist, werden unmittelbar vor der Verwendung 2,5 ml steriles Wasser eingebracht, wobei eine sterile, injizierbare Lösung von 40 ug/ml eines Polypeptids in einer 5 #igen (G/V) Dextroselösung erhalten wird.

Beispiel 6 _{oder 2}

10 mg des in Beispiel 1' beschriebenen Polypeptids oder eines Reduktionsprodukts davon, bei welchem die ursprünglichen

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Cystinreste in Cystein reduziert sind, werden in 50 pyrogenfreiem Wasser aufgelöst, und die Lösung wird durch ein sterilisierendes Membranfiltrationssystem filtriert, wie z.B. durch ein 0,22 ταμ "Millipore"-Filter ("Millipore" ist ein Warenzeichen), wobei das Filtrieren in Ampullen erfolgt, so dass jede Ampulle 0,5 ml aufnimmt. Der Inhalt einer jeden Ampulle wird dann lyophilisiert, und die Ampullen werden unter sterilen Bedingungen verschlossen. Die Ampullen, von denen jede 100 /ag des sterilen Polypeptide enthält, werden bei -2C⁰C gehalten.

Beispiel 7

Der Inhalt .einer Ampulle, die wie in Beispiel 6 hergestellt worden ist, wird in steriler, pyrogenfreier, 5 #iger (G/V) Dextroselösung aufgelöst, so dass eine Lösung erhalten wird, die 1 bis 5 «Pg/ml Polypeptid in 5 #iger (G/V) Dextroselüsung enthält. Diese Lösung eignet sich für die Verabreichung durch Infusion.

Wenn eine für Injektion geeignete Lösung gewünscht wird, dann wird der Inhalt einer Ampulle mit steriler, pyrogenfreier 5 %iger (G/V) Dextroselösung verdünnt, so dass eine Lösung erhalten wird, die 5-50/ig/ml des Polypeptids enthält.

Alternativ k8nn die 5 #ige (G/V) Dextroselösung durch isotonische Salzlösung ersetzt werden.

Das erfindungsgemässe Polypeptid wurde durch Verfahren untersucht, die zur Bestimmung der Struktur von Polypeptiden zur Verfugung stehen, wobei die folgende Struktur gefunden wurde:

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H.Asn.Ser.Asp.Ser.Glu.Cys.Pro.Leu.Ser.His.Asp.GIy.Tyr ~"

Tyr.Met.Cys.VaI.GIy.Asp.His.Leu.Cys

lie.GIu.Ala.Leu.Asp.Lys.Tyr.Ala.Cys

Tyr.GIy.VaI.VaI.Cys.Asn

lie.GIy.GIu.Arg.Cys.Gin.Tyr

HO.Asp.Arg

Patentens pr üc he:

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Claims

PATENTANSPRÜCHE;

M-/ Polyp ept id, welches ein weisses, wasserlösliches, saures Polypeptid ist, das aus einer einzigen Polypeptidkette mit drei inneren Dosulfidbindungen besteht; am N-Ende nach Dsnsylierung Asparaginsäure aufweist; ein Molekulargewicht von ungefähr 5500 bessitzt; die folgenden physikalischen Eigenschaften zeigt: Papierchromatografie in n-Butanol:Essigsäure: Pyridin:Wasser (30:6:24:20) - ein einziger Fleck % 0,62;

Papierelektrophorese in Essigsäure/Ameisensäure mit einem pH-Wert von 2,1 - ein "Komet" mit einer Frontmobilität von 1,67 relativ zu £-DNP-Lysin; Acrylamidge!elektrophorese in 0,1 m Tris/Salzsäure-Puffer mit einem pH-Wert von 8,9 - ein einziger Fleck, der sich mit einer Mobilität von 0,77 relativ zu Bromphenolblau zur Anode bewegt;

bei Analyse eines Hydrolysats ein Aminosäureverhältnis wie folgt ergibt:

Asparaginsäure 7, Serin 3, Glutaminsäure M-, Prolin 1, Glycin 4·, Alanin 2, Valin 3, Cystein 6, Methionin 1, Isoleucin 2, Leucin 3, Tyrosin 5» Histidin 2, Lysin 1 und Arginin 2;

und eine biologische Wirkung, wie weiter oben definiert, im Bereich von 0,2 bis 1 ug/kg aufweist;

oder das Reduktionsprodukt, bei dem die Cystinreste in Cysteinreste reduziert sind.
2. Das Polypeptid der Formel

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H.Asn.Ser.Asp.Ser.Glu.Cys.Pro.Leu.Ser.His.Asp.GIy.Tyr

Tyr.Met.Cys.VaI.GIy.Asp.His.Leu.Cys

lie.GIu.Ala.Leu.Asp.Lys.Tyr.Ala.Cys

—Tyr.Gly.Val.Val.Cys.Asn

lie.GIy.GIu.Arg.Cys.Gin.Tyr —

HO.Asp.Arg

oder dessen Reduktionsprodukt, bei dem die Cystinreste in Cysteinreste reduziert sind.
3. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptide nach

Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Polypeptid mit 47 Aminosäureresten in den Verhältnissen Asp 7, Ser 3, GIu 4, Pro 1, GIy 4, AIa 2, VaI 3, Cys 6, Met 1, He 2, Leu 4, Tyr 5, His 2, Lys 1, Arg 2, welches eine einzige Polypeρtidkette mit drei inneren Disulfidbindungen bildet und die folgenden Eigenschaften aufweist: Papierchromatografie in n-Butanol:Essigsäure:Pyridin: V/asser (30:6:24:20) - ein einziger Fleck mit einer Mobilität von 0,90 relativ zu Phenylalanin; Papierelektrophorese in Essigsäure/Ameisensäure mit einem pH-Wert von 2,1 - ein "Komet" mit einer Frontraobilität von 1,58 relativ zu £-DNP-Lysin; Acryl8midgelelektrophorese in 0,1 m Tris/Salzsäure-Puffer mit einem pH-V/ert von 8,9 - ein einziger Fleck, der sich mit einer Mobilität von 0,81 relativ zu Bromphenolblau zur Anode bewegt;

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biologische Wirkung, wie weiter oben definiert, im Bereich von 0,2 bis 1 jug/kg;

in einem wässrigen Medium der Einwirkung von Carboxypeptidase-A unterwirft und hierauf, sofern das Reduktionsprodukt gewünscht wird, das so erhaltene Polypeptid mit einem in der Peptidchemie zur Reduktion von Disulfidbindungen üblichen Reduktionsmittel reduziert.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dedurch gekennzeichnet, dass die Reaktion mit einer Konzentration des Ausgangs polypeptids von 1 mg/ml aufwärts, einem pH von 7,9, einer Temperatur von 25 bis 40⁰C und einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1 Teil Enzym auf 100 Teile Substrat bis 1 Teil Enzym auf 10 Teile Substrat ausgeführt wird.
5- Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das gewünschte Polypeptid aus dem Reaktionsgemisch durch Gelchrom8top~rafie abgetrennt v/ird.
6. Verfahren nach Anspruch 3» 4- oder 5, dadurch gekennzeichnet, dasn die Reduktion mit einem Thiol bei einem pH-Wert von 7 bis 10 unter Ausschluss von Sauerstoff und Licht durchgeführt wird.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Polypeptid oder dessen Reduktionsprodukt nach Anspruch 1 oder 2 und ein pharmazeutisch zulässiges Verdünnungsmittel oder Trägermittel enthält.
8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine für parenterale Verabreichung geeignete Form aufweist.

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9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekenn- zeichnet, dass sie die Form einer sterilen, injizierbaren Lösung oder Suspension aufweist.
10. Zusammensetzung nech Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, dass sie 0,5 bis 500 μ g/ml Polypeptid oder Reduktionäprodukt enthält.
11. Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Form eines sterilen, injizierbaren Depotpräparats oder eines Präparats mit langsamer Abgabe aufweist*
12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie bis zu 2 mg von dem Polypeptid oder Reduktionsprodukt enthält.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein bekanntes Gewicht eines sterilen Polypeptide oder Reduktionsprodukts nach Anspruch 1 oder aufweist, welches in einem Behälter eingeschlossen ist, der seine Sterilität bewahrt.

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Magensaft bei Warmblütlern, dadurch gek^jin*exöEnet7 dass men an einen V7armblütler__eiAe--T7irEsame Menge eines Polypeptide ^dsr-.-edn^s^Reduktionsprodukts nach Anspruch 1 oder

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