DE1929957C3 - Calcitonin M, dessen Dimer und deren Säureadditionssalze sowie diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Präparate - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung sind neue, den Blutcalciumspiegel senkende Peptide, deren Säureadditionssalze und diese enthaltende pharmazeutische Präparate. Bei diesen Peptiden handelt es sich um menschliches Calcitonin, dessen Reindarstellung (in Form von mehreren aktiven Komponenten) gelungen ist.

Es ist bekannt, daß hypocalcämische Hormone in Säugetieren und im Menschen vorkommen. Die Struktur des Schweine-Thyrocalcitonins wurde bereits aufgeklärt. Fs ist ein Dotriacontapeptidamid mit einem Cystin-Disulfidring am N-Terminus. Im Hinblick auf die große Bedeutung des Calcitonins im Calcium-Stcffwechsel und Knochenaufbau und dementsprechende Therapie ist es wichtig, menschliches Calcitonin in reiner Form zur Verfugung zu haben. Es ist nun gelungen, menschliches Calcitonin aus an C-Zellen reichen Medullarcarcinomen der Schilddrüse bzw. entsprechenden C-Zell-Metastasen in reiner Form zu gt .en. Das Verfahren zur Gewinnung menschlichen CalciiDiiins ist dadurch gekennzeichnet, daß man entfettetes, z. B. mittels Aceton oder Äthes entfettetes, Medullarcarcinom der Schilddrüse oder C-Zellen-Metastase-Material, das gegebenenfalls mit Alkohol oder wäßriger Trichloressigsäure vorextrahiert ist, ein- oder mehrmals mit einem Wasser und ein Niederalkanol enthaltenden Lösungsmittelsystem bei einem pH von ca. 1—6 extrahiert und die erhaltene Lösung in üblicher Weise wie beim Schweine-Thyrocalcitonin, insbesondere durch Gel-Chromatographie unter Verwendung von wäßriger Ameisensäure als Elutionsmittel und durch Craig-Verteilung in einem n-Butanol und Essigsäure enthaltenden Lösungsmittelsystem, aufarbeitet.

Das für die Extraktion verwendete Lösungsmittelsystem enthält als Niederalkanol z. B. Methanol, Äthanol, Propanol, n-Butanol oder sec.Butanol. Der Wassergehalt des Systems kann beispielsweise zwischen 4 und 50% liegen, vorzugsweise beträgt er 5—30%. Das genannte saure pH wird beispielsweise mit anorganischen Säuren wie Schwefelsäure oder Salzsäure oder mit organischen Säuren wie Ameisensäure, Essigsäure, oder mit sauren Puffern wie Acetatpuffer oder eo Citratpuffer, eingestellt. Das Lösungsmittelsystem kann gegebenenfalls weitere organische Lösungsmittel, wie Aceton, oder organische Basen, wie Pyridin oder Morpholin, und/oder anorganische Salze, wie Natriumchlorid, enthalten. Besonders hervorzuheben sind n-Butanol und Essigsäure enthaltende Systeme, vor allem n-Butanol-Eisessig-Wasser (75 :7,5 :21).

Die Extraktion kann in mehreren Stufen mit dem gleichen oder mit verschiedenen Lösungsmittelsystemen durchgeführt werden.

Aus dem Extrakt wird das Rohprodukt z. B. durch Eindampfen, Lyophilisieren oder Fällen, beispielsweise mit Aceton oder Trichloressigsäure, erhalten.

Die chromatographische Reinigung wird vorzugsweise an Sephadex®G-50 oder einem äquivalenten Material vorgenommen. Zur Elution verwendet man beispielsweise 0,1 n-Ameisensäure.

Für die Craig-Verteilung sind, wie bereits erwähnt, n-Butanol und Essigsäure enthaltende Systeme besonders vorteilhaft, z. B. n-Butanol-Eisessig-Wasser (4:1:5).

Die Hauptkomponente des menschlichen Calcitonins (hierin als HT-C2 bezeichnet) ist ein Dotriacontapeptidamid der Aminosäurezusammensetzung Lys (1), His (I), Asp (3), Thr (5), Ser (1), GIu (2), Pro (2), GIy (4), AIa (2), "/2 Cys (2), VaI (1), Met (1), He (1), Leu (2), Tyr (1), Phe (3), wobei 4 der 5 Carboxylseitenketten in Amidform vorliegen. Daneben wurden weitere aktive Komponenten rein dargestellt; die hier als Komponente HT-Ci bezeichnete besitzt dieselbe Aminosäurezusammensetzung wie die Komponente HT-C2. Die Hauptkomponente des Calcitonins weicht also in ihrer Aminosäurezusammensetzung stark von der des Schweine-Thyrocalcitonins ab. HT-Ci und HT-C₂ geben bei der enzymatischen Spaltung mit Trypsin zwei Bruchstücke Tn und Trii der in Tabelle 1 im Beispiel 1 angegebenen Aminosäurezusammensetzung.

Die Komponenten HT-Ci und HT-C₂ sind dünnschichtchromatographisch und elektrophoretisch einheitlich. Es wurde gefunden, daß HT-C₂ die folgende Strukturformel (I) hat:

Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Lcu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-

-TlIr-PlIe-PiO-GIn-TlIr-AIa-IIe-GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂ (I)

HT-Ci ist das Dimere dieser Verbindung.

Aus der Tatsache, daß HT-Ci nach Dansylierung und saurer Hydrolyse kein Bis-dansyl-cystin gibt, kann man schließen, daß es als antiparalleles Dimeres vorliegt

Unter basischen Bedingungen, z. B. mit verdünntem Ammoniak, oder durch Reduktion, z. B. mit Dimercaptoäthan oder Dithiothreitol bei Zimmertemperatur in wäßrigem Pyridin, wird HT-Ci in HT-C2 umgewandelt

Die Komponenten HT-Ci und HT-C2 können durch Oxydation in an sich bekannter Weise, z, B. mittels wäßrigem Wasserstoffsuperoxid, in ihre Sulfoxide übergeführt werden. Die Charakterisierung der Sulfoxide ist in den Beispielen gegeben.

Das menschliche Calcitonin (Komponenten HT-Ci und HT-C2 einzeln oder in beliebiger Mischung) zeigt an der Ratte eine Aktivität von ca. 100—200 MRC-Einheiten pro mg (Peptid) in dem vorn Kumar et al., J. Endocrinology 33 (1965), 470, beschriebenen Test. Es senkt den Plasma-Calcium-Spiegel und Plasma-Phosphat-Spiegel des Blutes von Säugetieren, wie durch Versuche an 50—150 g schweren Ratten nachgewiesen wurde. Bei Patienten mit erhöhtem Knochenmetabolismus senkt es den Calciumspiegel des Blutes bei intravenöser, intramuskulärer oder subcutaner Gabe von 0,01 bis 5 mg, z. B. in 0,1-m. Acetatpuffer vom pH 4,6. Es kann daher zur Behandlung von Hypercalcämien und von Knochenkrankheiten wie Paget's disease oder Osteoporose verwendet werden.

HT-Ci und HT-C2 sind Basen, die mit anorganischen oder organischen Säuren Säureadditionssalze bilden. Aus den Säureadditionssalzen kann die freie Base in an sich bekannter Weise hergestellt werden. Für pharmazeutische Zwecke kann die Base in therapeutisch verwendbare Säureadditionssalze übergeführt werden, z. B. in Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, z. B. Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, oder mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Stearinsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxybenzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzol- oder Toluolsulfonsäure, Trichlor- oder Trifluoressigsäure.

Menschliches Calcitonin kann in an sich bekannter Weise in pharmazeutisch verwendbare Komplexe mit protrahierter Wirkung übergeführt werden, z. B. Komplexe mit Substanzen, die bekannterweise die Aktivität von Peptiden verlängern, wie nichtantigene Gelatine, besonders Oxypolygelatine, Polyvinylpyrrolidon, Polyphloretinphosphat, Phytinsäure, Protamin, Polyglutaminsäure, oder schwerlösliche Metallverbindungen, z. B. Phosphate, Pyrophosphate oder Hydroxyde von Aluminium, Magnesium, Cobalt, insbesondere Zink.

Die Salze und Komplexe können in gleicher Weise wie das freie Peptid verwendet werden.

Zwecks Verwendung in pharmazeutischen Präparaten können die Verbindunpen mit einem pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial, das für enterale oder parenterale Anwendung geeignet ist, vermischt werden. Geeignete Träger sind z. B. Wasser, physiologische Salzlösungen, Gelatine, Laktose, Glukose, Stärke, pflanzliche Öle, Benzylalkohol, Polyalkylenglykole und andere bekannte pharmazeutische Träger. Die Präparate können sterilisiert werden und/oder Hilfsstoffe, wie Konservieruhgs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel, enthalten. Sie

können auch noch weitere therapeutisch wertvolle Zusätze aufweisen.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

In der Dünnschichtchromatographie werden die folgenden Systeme verwendet:

System 45: see Butanol-3°/oiges wäßriges

Ammoniak (7:3);
System 52: n-Butanol-Eisessig-Wasser

(75:7,5:21);

System 79: n-Butanol-Pyridin-Wasser(l : 1 :1);
System 101A: n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser

(42 :24 :4 :30);
System 104: Chloroform-Methanol-17°/oiges

wäßriges Ammoniak (41:41:18).

Die Dünnschichtchromatographie wird, wenn nicht anders angegeben, auf Alox® D-O (Camag) durchgeführt. Alle Werte (Rs) sind bezogen auf die Schweine-a-Thyrocalcitoninsulfoxid = 1.

Die Elektrophorese wird auf Avicel®-Cellulose oder Cellogel (Celluloseacetatfolie) bei pH 1,9 (mix dem Puffer Eisessig-Ameisensäure-Wasser [95 :26,5 :980]) bei 140VoIt, 2 Stunden, durchgeführt. Die Laufstrecke (d) wird in bezug auf Schweine-zx-Thyrocalcitoninsulfoxid = 1 angegeben.

Beispiel 1

10 g Medulla-Carcinom werden sofort tiefgefroren und lyophilisiert. Nach Behandlung mit Äther zur Entfernung fettiger Anteile wird das trockene Gewebe (2 g) 3mal mit dem lOfachen Volumen eines Gemisches von n-Butanol-Eisessig-Wasser (75:7,5:21) bei 20° gründlich extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt, im Vakuum von Butanol befreit und lyophilisiert. Man erhält 450 mg Trockenrückstand mit einer Aktivität von 12 M RC-Einheiten/mg. Davon werden 300 mg in 0,1 η-Ameisensäure durch Gelfiltration an einer Säule (450 ml) von Bio Gel P6 oder Sephadex G-50 in 0,1 η-Ameisensäure gereinigt; nach Vereinigung und Lyophilisierung der aktiven Fraktionen (0,5—0,7 Säulen-Volumen) erhält man 18 mg eines Produktes mit 50 MRC-Einheiten/mg. Dieses Material unterzieht man sodann einer multiplikativen Verteilung im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (4:1:5) über 140 Stufen, wobei man ein Phasenverhältnis von ί und ein Phasen-Volumen von 3 ml wählt. Die nach Testierung ermittelten aktiven Fraktionen werden in Gruppen zu je 10 Elementen vereinigt, vom Lösungsmittel befreit und lyophilisiert. Für die Fraktionen mit maximaler Aktivität ist K = 0,6. Das daraus erhaltene Peptid HT-C₂ (4,9 mg) ist dünnschichtchromatographisch und elektrophoretisch einheitlich. Es zeigt an der Ratte eine Aktivität von ca. 100-200 MRC-Einheiten/mg Peptid. Die Laufstrekke im Verhältnis zu Schweine-a-thyrocalcitoninsulfoxid imSystem 52 auf Alox DO ist 1,16; im System 79 auf Alox DO ist sie 1,79; im System 104 auf Alox DO ist sie 1,28; im System 45 auf Alox DO ist sie 1,37. In Eisessig-Ameisen-

bü säure-Wasser (95:26,5:980), pH 1,9, wandert das Produkt bei 140 Volt in 2 Stunden auf Avicel-Cellulose kathodisch bezogen auf Schweine-Thyrocalcitoninsulfoxid = 1 mit d=0,77. Das Produkt gibt positive Farbreaktionen mit Ninhydrin, Chlor-Tolidin, Kaliumhexacyanoferrat(lI)-Eisen(IIl)-chlorid, diazotierten! SuI-fanilsäureamid, keine Reaktion mit 4-Dimethyl-aminbenzaldehyd-Salzsäure oder Sakagüchi-Reagens, keine UV-Fluoreszenz: Abwesenheit von Tryptophan. Die

Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse ergibt folgendes Resultat: Lysin (1), Histidin (1), Asparaginsäure (3), Threonin (5), Serin (1), Glutaminsäure (2), Prolin (2), Glycin (4), Alanin (2), 1/2 Cystin (2), Valin (1), Methionin (1), Isoleucin (1), Leucin (2), Tyrosin (1), Phenylalanin (3), NHj. Das Sulfoxid von HT-C₂ zeigt folgende Rs-Werte: Rs 52 =1,07; Rs 45 =1,20; Rs 79= 1,66.

Zur weiteren Charakterisierung dient die enzymatische Spaltung des Peptides mit Trypsin. Man erhält zwei Fragmente, nämlich Tn, welches die Aminosäuren 1 — 18 umfaßt, und Trn mit den Aminosäuren 19—32. Die Aminosäurezusammensetzung dep beiden Fragmente ist aus de? Tabelle 1 ersichtlich. Tm ist in der

Tabelle 1

Dünnschichtchromatographie auf Alox® DO deutlich lipophiler als Tn und wandert in der Elektrophorese schneller zur Kathode als Tn.

Fragment Tn:

Elektrophorese an
Avicel-Cellulose:
Fragment Trn:

Elektrophorese an
Avicel®-Cellulose:

Rs 52 = 0,53; Rs 79

0,54;

Rs 104 = 0,51;

d = 0,81.

Rs 52 = 1,38; Rs 79

1,45;

Rs 104 = 1,43;

d = 0,94.

Tr₁,

NH,

Lys

His

Asp

Thr

Ser

GIu

Pro

GIy

AIa

V2 Cys

VaI

Met

He

Leu

Tyr

Phe

Beispiel 2

110 g tiefgefrorenes C-Zellen-Metastase-Material, das man aus dem Brustkorb entnommen hatte, wird mit Äther entfettet und dann wie im Beispiel 1 beschrieben mit n-Butanol-Eisessig-Wasser (75 :7,5 :21) extrahiert. Man erhält 6 g Trockenrückstand als dunkelbraunes Pulver. Es wird mehrmals mit 0,1 n-Ameisensäure (insgesamt 150 ml) ausgeschüttelt. Dabei gehen 3,6 g des Trockenrückstandes in Lösung. Die Lösung wird in 2 Portionen an einer Bio Gel® P6-Säule (5 cm; 85 cm; Volumen ca. 1600 ml) mit 0,1 η-Ameisensäure gelchromatographiert und in Fraktionen zu 20 ml aufgefangen. Es sind zwei Peaks mit aktivem Material vorhanden, und zwar die Fraktionen 13—21 mit dem Peak-Maximum bei 0,4 Säulen-Volumen und die Fraktionen 25—34 mit dem Peak-Maximum bei 0,55 Säulen-Volumen. Die vereinigten Fraktionen 25—34 geben bei Lyophilisierung 105 mg Rohprodukt, das identisch ist mit dem gemäß Beispiel 1 bei der Gelfiltration erhaltenen Produkt und bei der multiplikati-en Verteilung wie im Beispiel 1 das reine HT-C₂ gibt. Die vereinigten Fraktionen 13—21 ergeben bei der Lyophilisierung 202 mg Rohprod-:U. Lueses wird einer multiplikativen Verteilung im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (4:1 :5) über 400 Stufen in Elementen von je 3 ml Phasenvolumen unterzogen. Das Maximum der Aktivität liegt bei K = 0,19. Das so erhaltene reine Produkt HT-Ci (22,2 mg) ist im Rattentest nach Kumar et al, I.e.

(2)

2 2 2

1
1

_2
14

etwa gleich aktiv wie das gemäß Beispiel 1 erhaltene Produkt (HT-C2). Es kann in das ebenfalls aktive Sulfoxid übergeführt werden, z. B. mit 5%igem Wasserstoffsuperoxid. In der Dünnschichtchromatographie auf Alox DO ist Rs 52 = 1,04; Rs 79 = 1,42; Rs 45 = 1,20. Das Sulfoxid zeigt folgende Werte: Rs 52 = 0,88; Rs 79 = 1,29; Rs45=l,09. In der Elektrophorese auf Avicel®-Cellulose ist J= 0,90 für HT-Ci und dessen Sulfoxid. Auf Cellogel ist J= 1,15 für HT-C, und J= 1,35 für dessen Sulfoxid. HT-Ci gibt positive Reaktionen mit Ninhydrin, Chlor-Tolidin, Pauly-Reagens und Barton's Reagens. Die Reaktionen nach Sakaguchi und nach Ehrlich und die UV-Fluoreszenz sind negativ.

Die Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse ergibt: Lysin (1), Histidin (1), Asparaginsäure (3), Threonin (5), Serin (1), Glutaminsäure (2), Prolin (2), Glycin (4), Alanin (2), '/2 Cystin (2), Valin (1), Methionin (1), Isoleucin (1), Leucin (2), Tyrosin (1), Phenylalanin (3), NH₃.

Bei der Trypsin-Spaltung werden Fragmente mit gleichen Aminosäurezusammensetzungen wie für HT-C₂ in Tabelle 1 von Beispiel 1 angegeben erhalten. Tm ist identisch für HT-Ci und HT-C₂.

Für Fragment Tn ist Rs 52 (auf Alox) = 0,55; Rs 101 A (auf Cellulose) = 0,86. Bei der Elektrophorese auf Avicel®-Cellulose ist J = 0,91.

Für Fragment Tr» ist Rs 52 (auf Alox) = 1,38; Rs 101 A(auf Cellulose) = 1,31. Beider Elektrophorese auf Avicel®-Cellulose ist d = 0,94.

HT-C₂ wird in der 50fachen Menge einer O,l%igen Cysteinhydrochloridlösung gelöst und während einer Stunde bei 45° gehalten. Dann wird die Lösung Chromatographien. Das Chromatogramm zeigt unter

den Produkten einen Fleck, welcher dem Dimeren HT-Ci entspricht.

Wird HT-Ci eine Stunde bei 45° mit 0,5 n-Ammoniak behandelt, so wird es in HT-C2 übergeführt.

Beispiel 3

Man löst 0,5 mg

Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-i

-Phe-PrO-GIn-ThX-AIa-IIe-GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂ (1)

(HT-C2) in 1 ml einer wäßrigen Lösung von 20 mg dem Gebrauch wird das Lyophilisat in destilliertem

Mannit und 4,6 mg Ameisensäure. Die Lösung wird Wasser gelöst. Der Inhalt der Ampulle entspricht ca. 70

steril filtriert und unter aseptischen Bedingungen in eine MRC-Einheiten. Die Lösung wird intramuskulär oder

5-ml-Ampulle gefüllt, tiefgekühlt und lyophilisiert. Vor 20 intravenös angewendet, z. B. 10—70 Einheiten pro Tag.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Calcitonin M der Formel

Cys-GIy-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-

-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gin-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pm-NH₂

dessen Dimer und deren Säureadditionssalze.

2. Pharmazeutische Präparate, gekennzeichnet durch den Gehalten einer Verbindung gemäß Anspruch 1.