DE1929957A1

DE1929957A1 - Verfahren zur Herstellung neuer hypocalcaemischer Peptide

Info

Publication number: DE1929957A1
Application number: DE19691929957
Authority: DE
Inventors: Riniker Dr Bernhard; Neher Dr Robert
Original assignee: Ciba Geigy AG; Ciba AG
Current assignee: Novartis AG; BASF Schweiz AG
Priority date: 1968-06-20
Filing date: 1969-06-12
Publication date: 1970-01-02
Also published as: GB1270595A; DE1929957B2; CA919591A; BE734868A; NL162365C; MY7400315A; PH13930A; NL6909396A; IL32360A; IE33157B1; IL32360A0; NL162365B; FR2011262A1; DE1929957C3; IE33157L

Description

CIBA AKTIENGESELLSCHAFT, B AS E L (S CH WE IZ) Case 6488/6492/1-4

Deutschland

Verfahren zur Herstellung neuer hypocalcämiseher Peptide

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren

;ur Herstellung neuer den Blutcalciumspiegel senkender Peptide ihrer Säureadditionssalze und Komplexe. Bei diesen Peptiden handelt es sich um menschliches Calcitonine dessen Reindarstellung (in Form von mehreren aktiven Komponenten) gelungen ist.

- 9Q9SB1/14S4

Es ist bekannt, dass hypocalcamische Hormone in Säugetieren und im Menschen vorkommen. Die Struktur des Schweine-Thyrocaleitonins wurde bereits aufgeklärt. Es ist ein Dotriacontapeptidamid mit einem Cystin-Disulfidring am N-Terminus. Im Hinblick auf die grosse Bedeutung des Calcitonins im Calcium-Stoffwechsel und Knochenaufbau und dementsprechende Therapie ist es wichtig*, menschliches Calcitonin in reiner Form zur Verfügung zu haben. Es ist nun gelungen, menschliches Calcitonin aus C-Zeil-reichen Medullarcarcinomen der Schilddrüse bzw. entsprechenden C-Zell-Metastasen in reiner Form herzustellen. Das Verfahren zur Herstellung menschlichen Calcitonins ist dadurch gekennzeichnet, dass man entfettetes, z.B. mittels Aceton oder Aether entfettetes, Medullarcarcinom der Schilddrüse oder C-Zellen-Metastase-" Materiai, das gegebenenfalls mit Alkohol oder wässriger Trichloressigsäure vorextrahiert ist, ein- oder mehrmals mit einem Wasser und ein Niederalkanol enthaltenden LÖsungs-■ mittelsystem bei einem pH von ca. 1-6 extrahiert und die erhaltene Lösung in üblicher Weise wie beim Schweine-Thyrocalcitonin, j.nsbesondere durch Gel-Chromatographie unter Verwendung von wässriger Ameisensäure als Elutionsmittel und durch Craig-Verteilung in einem n-Butanol und Essigsäure enthaltenden Lösungsmittelsystem, aufarbeitet.

Das für die Extraktion verwendete Lösungsmitte1-system enthält als Niederalkanol z.B. Methanol, Aethanol, Pro-

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panol, n-Butanol oder sec.Butanol. Der Wassergehalt des Systems kann beispielsweise zwischen 4 und 50$ liegen, vorzugsweise beträgt er 5-30$. Das genannte saure pH wird beispielsweise mit anorganischen Säuren wie Schwefelsäure oder Salzsäure oder mit organischen Säuren wie Ameisensäure, Essigsäure, oder mit sauren Puffern wie Acetatpuffer oder Citratpuffer, eingestellt. Das Lösungsmittelsystem kann gegebenenfalls weitere organische Lösungsmittel, wie Aceton, oder organische Basen, wie Pyridin oder Morpholin, und/oder anorganische Salze, wie Natriumchlorid, enthalten. Besonders hervorzuheben sind n-Butanol und Essigsäure enthaltende Systeme, vor allem n-Butanol-Eisessig-Wasser (75:7,5:21).

Die Extraktion kann in mehreren Stufen mit dem gleichen oder mit verschiedenen Lösungsmittelsystem^en durchgeführt werden.

Aus dem Extrakt wird das Rohprodukt z.B. durch Eindampfen, Lyophilisieren oder Fällen, beispielsweise mit Aceton oder Trichloressigsäure, erhalten.

Die chromatographische Reinigung wird vorzugsweise an "Sephadex" G-50-oder einem äquivalenten Material vorgenommen. Zur Elution verwendet man beispielsweise 0,1-n. Ameisensäure.

Pur die Craig-Verteilung sind, wie bereits erwähnt, n-Butanol und Essigsäure enthaltende Systeme besonders vorteilhaft, z.B. n-Butanol-Eisessig-Wasser (4:1:5).

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Die Hauptköngonente des menschlichen Calcitonins (hierin als HT-Cp bezeichnet) ist ein Dotriacontapeptidamid der Aminosäurezusammensetzung Lys (l), His (l), Asp (3), Thr (5), Ser-(I), GIu (2), Pro (2), GIy (4), AIa (2), ¹^ Cys (2), Val (1), Met.(1), lie (l), Leu (2), Tyr (l), Phe (3), wobei 4 der 5 Carboxylseitenketten in Amidform vorliegen. Daneben wurden die weiteren aktiven Komponenten rein dargestellt: HT-C₁, HT-C,τ und HT-C₀₁. Die Aminosäureanalyse der

J- JLX ei.

Komponente HT-C₁ ist identisch mit der von HT-Cp. Die Hauptkomponente des Calcitonins weicht also in ihrer Aminosäurezusammensetzung stark von der des Schweine-Thyrocalcitonins ab.

HT-c und HT-Cp geben bei der enzymatischen Spaltung mit Trypsin zwei Bruchstücke Tr_T und Tr_TT der in Tabelle 1 in Beispiel 1 angegebenen Aminosäurezusammensetzung.

Die Komponenten HT-C₁, HT-C₃, HT-C₁₁ und HT-C₃₁ sind dünnschichtChromatographisch und elektrophoretisch einheitlich.

Es wurde gefunden, dass HT-Cp die folgende Strukturformel (I) hat:

Cys-GIy-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-GIn-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-GIy-Val-Gly-Ala-Pro-NH₂ (i)

C₁ ist das Dimere dieser Verbindung,

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- 5 - , ■■''■'

Aus der Tatsache, dass HT-C₁ nach Dansylierung und saurer

Hydrolyse kein Bis-dansyl-cystin gibt, kann man schliessen, ■ dass es als antiparalleles Dimeres vorliegt» Unter.basischen Bedingungen, z.B. mit verdünntem Ammoniak, oder durch Reduktion, z.B. mit Dimercaptoathanol oder Ditfciothreitol bei Zimmertemperatur in wässrigem Pyridine wird in HT-C₁ in HT-Cp umgewandelt.

Die Komponenten HT-C, und HT-Cp können durch Oxydation in an sich bekannter WeISe_-9 z.B. mittels wässrigem Wasserstoffsuperoxid, in ihre Sulfoxide übergeführt werden. Die Charakterisierung der Sulfoxide ist in den Beispielen gegeben«

Das menschliche Calcitonin (Komponenten-HT-C_1-9 HT-Cp_-9 HT-C₁₁ und HT-Cp, einzeln oder in beliebiger Mischung), zeigt an der Ratte eine Aktivität von ca. 100-200 MRC-Einheiten pro mg (Peptid)in" dem vom Kumar et al.j J. Endocrinology ^,^ ^!l1965]j> ^'7O_-5 beschriebenen Test«, Es senkt den Plasma-Calciumspiegel.und Plasma-Phosphat-spiegel des Blutes von Säugetieren, wie durch-Versuche von 50-15Og schweren Ratten nachgewiesen wurde» Bei Patienten mit erhöhtem.Knoehenmetabolismus senkt es den Calciumspiegel des Blutes bei intravenöser, intramuskulärer oder subcutaner Gäbe von O₅Ol bis 5 mg, ZoBo in 0,1-m. Acetatpuffer vom pH 4,6» Ss kann daher zur Behandlung von Hypercalcämien u&d von Kiiochenkranklieiten wie Taget^ss disease oder Osteoporose verwendet werden«

S0SSS1/14I4.

ORIGINAL^

-C₁, HT-Cp, HTrC₁₁ und HT-C sind Basen, die mit anorganischen oder organischen Säuren Säureadditionssalze bilden. Aus den Säureadditionssalzen kann die freie Base, in an sich bekannter Weise hergestellt werden. Für pharmazeutische -Zwecke kann die Base in therapeutisch verwendbare Säureadditionssalze übergeführt werden, z.B. in Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, z.B. Salzsäure oder Bromwasserstoff säure, Salpetersäure,- Thiocyansäure, Schwefelsäure^ Phosphorsäure, oder mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Stearinsäure., G-lykolsäure.» Milchsäure, Brenztraubensäure,-oxalsäure, Zitronensäure'^ Benzoesäure,, Zimtsäure, Salicylsäure* 2-Phenoxy- oöer 2-Acetoxybenzoesäure, Mandelsäure _s Methansulfonsäure_# Asthansulf on-säure., Eydroxyäthansulfonsäure, Benzol- oder -Toluolsulfon-'säure, TrIchior- oder Trifluoressigsäure»

"Menschliches Galeitonin kann' in an sich bekannter Weise in Pharmazeutiseh verwendbare Komplexe mit protrahierter 'wirkung übergeführt werden. z-.B. Komplexe mit Substanzen^, 'die bekannterweise die Aktivität von "Peptiden- verlängern, wie nichtantigene Gelatine, besonders Oxypolygelatine, PoIyvmylpyrrolidon^ "Polyphloretinphosphst, - Phytinsäure, Protamine Polyglutaminsäure,. oder schwerlösliche Metallverbindungen,, 2«B, Phosphate, Pyrophosphate oder Hydroxyde von Aluminium^ Magnesium,, Cobalt insbesondere Zink.

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mm 7' m»

Die Salze und Komplexe können in gleicher Weise wie das freie Peptid verwendet werden.

Zwecks Verwendung in pharmazeutischen Präparaten können die Verbindungen mit einem pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial, das für enterale oder parenterale Anwendung geeignet ist, vermischt werden. Geeignete Träger sind z.B. Wasser, physiologische Salzlösungen, Gelatine, Laktose, Glukose, Stärke, pflanzliche OeIe, BenzjLjL-alkohole, Polyalkylenglykole und andere bekannte pharmazeutische Träger. Die Präparate können sterilisiert werden und/ oder Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-,Netzoder Emulgiermittel, enthalten. Sie können auch noch weitere therapeutisch wertvolle Zusätze aufweisen.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Tenraeraturen sind in Celsiusgraden angegeben.

In der DünnschichtChromatographie werden die folgenden Systeme verwendet:

System 45 : see. Butanol-3#iges wässriges Ammoniak (7O); System 52 ; n-Butanol-Eisessig-Wasser (75:7,5:21); System 79 ^: n-Butanol-Pyridin-Wasser (1:1:1); System 101A : n-Butanol-Pyridin-Eisessig Wasser (42:24:4:30); System 104 : Chloroform-Methanol-17#iges wässriges Ammoniak

(41:41:18).

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Die Dünnschichtchromatographie wird, wenn nicht

anders angegeben, auf Alox D-O (Camag) durchgeführt. Alle Weste (Rs) sind bezogen auf die Schweine-α-Thyrocalcitoninsulfoxid = 1.

Die Elektrophorese wird auf Avicel-Cellulose oder Cellogel (CelluLoseacetatfolie) bei pH 1,9 [mit dem Puffer Eisessig -Ameisensäure-Wasser (95:26,5:980)] bei l40 Volt, 2 Stunden, durchgeführt. Die Laufstrecke(d) wird in Bezug auf Schweine-a-Thyrocalcitoninsulfoxid = 1 angegeben.

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Beispiel 1 :

10 g Medulla-Carcinom wird sofort tiefgefroren und lyophilislert. Nach Behandlung mit Aether zur Entfernung fettiger Anteile wird das trockene Gewebe (2g) 3 mal mit dem 10-fachen Volumen eines Gemisches von η-Butanol-Eisessig Wasser (75:7,5:21) bei 20° gründlich extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt, im· Vakuum von Butanol befreit und lyophilisiert. Man erhält 45Q mg Trockenrückstand mit einer Aktivität von 12 MRC-Einheiten/mg. Davon werden 300 mg in 0,1 n-Ameisensäure durch Gelfiltration an einer Säule (450 ml)_t von Bio Gel Ρβ oder Sephadex G-50 in 0,1 η-Ameisensäure gereinigt; nach Vereinigung und Lyophilisierung der aktiven Fraktionen (0,5-0,7 Säulen-Volumen) erhält man 18 'mg eines Produktes mit 50 MRC-Einheiten/mg. Dieses Material unterzieht man sodann einer multiplikativen Verteilung im System n-Butanol Eisessig-Wasser (4:1:5) über l40 Stufen* wobei man ein Phasenverhältnis von 1 und ein Phasen-Volumen von 3 ml· wählt. Die nach Testierung ermittelten aktiven Fraktionen werden in Gruppen

zu je 10 Elementen vereinigt, vom Lösungsmittel befreit und lyophilislert. Für die Fraktionen mit maximaler Aktivität ist K = 0,6. Das daraus erhaltene Peptid HT-C₂ ist dünrischichtchromatographisch und elektrophoretisch einheitlich. Es zeigt an der Ratte eine Aktivität von ca. 100-200 MRC-Einheiten/mg Peptid. Die Laufstrecke im Verhältnis zu Schweine -a-thyro-

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ealcitoninsulfoxid im System 52 auf Alox DO ist 1,16; im . System 79 auf Alox DO ist sie 1,79; im System 104 auf Alox DO ist sie 1,28 ; im System 45 auf Alox DO ist sie 1,37- In Eisessig Ameisensäure-Wasser (95:26,5:980) pH 1,9 wandert das Produkt bei

Volt in 2 Stunden auf Avicel-Cellulose kathodisch bezogen auf Schweine-Thyrocalcitoninsulfoxid.= 1 mit d = 0,77· Das Produkt gibt positive Farbreaktionen mit Ninhydrin, Chlor-Tolidin,

·■ * ■-■.■.·■-. Kaliumhexacyanoferrat (il)r Eisen (III) chlorid., diazotiertem Sulfanilsäureamid, keine Reaktion mit 4-Dimethyl-amin benzaldehyd -Salzsäure oder Sakaguchi-Reagens^ keine UV-Fluoreszenz: Abwesenheit vcn Tryptophan. Die Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse ergibt folgendes Resultat: Lysin (1), Histidin (1), Asparaginsäure (3), Threonin (5), Serin (1), Glutaminsäure (2), Prolin (2), Glycin (4), Alanin (2), 1/2 Cystin (2), Valin (l), Methionin (l), Isoleucin (l), Leucin (2), Tyrosin (l), Phenylalanin (3), NE,. Das SuIfoxid von HT-Cp zeigt folgende Rs-Werte: Rs 52 = 1,Q7; Rs 45 = 1,20; Rs 79 = 1,66.

Zur weiteren Charakterisierung dient die enzymatische Spaltung des Peptides mit Trypsin. Man erhält zwei Fragmente, nämlich Tr-* welches die Aminosäuren 1-18 umfasst, und Tr., mit den Aminosäuren 19-32. Die Aminosäurezusammensetzung der beiden Fragmente ist aus der Tabelle 1 ersichtlich. Tr-- ist in der Dünnschichtchromatographie auf Alox DO deutlich lipophiler als Tr- und wandert in der Elektrophorese schneller"

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zur Kathode als Tr., .

Fragment Tr₃.: Rs ₂ = 0,53; Rs 79 = 0,54; Rs 104 = 0,51; Elektrophorese an Avicel-Cellulose: d = 0,8l.

Fragment Tr₁₁: Rs 52 = 1,38; Rs 79 = 1,45; Rs 104 = 1,43; Elektrophorese an -Avicel-Cellulose : d = 0,94.

' '■ ^{: v} " ^:: Tabelle 1

Φτ» Φτ»

I II

• (2)

NH,	13
Lys	1
HIs
Asp	3
Thr	3
Ser	1
GIu	1
Pro
GIy	2
AIa
1/2 Cys	2
VaI
Met	1
lie
Leu	CVJ
Tyr	1
Phe	1
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2 2 2

2 14

Beispiel 2 :

110 g tiefgefrorenes C-Zellen-Metastase-Material,, das man aus dem Brustkorb entnommen hatte, wird mit Aether entfettet und dann wie in Beispiel 1 beschrieben mit n-Butanol Eisessig Wasser (75:7,5:21) extrahiert. Man erhält 6 g Trockenextrakt als dunkelbraunes Pulver. Es wird mehrmals mit 0,1-n.

.Ameisensäure/insgesamt 15O mij ausgeschüttelt. Dabei gehen 3,6 g des Trockenrückstandes in Lösung. Die Lösung wird in .2 Portionen an einer Bio Gel P6-Säule (5 cm; 85 cm; Volumen ca. ΐβΟΟ my mit 0,1-n, Ameisensäure gelchromatographiert und in Fraktionen zu 20 ml aufgefangen. Es sind zwei Peaks mitaktivem Material vorhanden, und zwar die Fraktionen 13-21 mit dem Peak-Maximum bei 0,4 Säulen-Volumen und die Fraktionen die 25-34 mit dem Peak Maximum bei 0,55 Säulen-Volumen, Die vereinigten Fraktionen 25-34 geben bei Lydphilisierung 105 "ig Rohprodukt, das identisch ist mit dem gemäss Beispiel 1 bei der Gelfiltration erhaltenen Produkt und bei der multiplikativen Verteilung wie in B-ispiel 1 das reine HT-Cp gibt. Die vereinigten Fraktionen 13-21 ergeben bei der Lyophilisierung 202 mg Rohprodukt. Dieses wird einer multiplikativen Verteilung im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (4:1:5) über 400 Stufen in co Elementen von je 3 ml Phasenvolumen unterzogen. Das Maximum

IT der Aktivität liegt bei K =0,19. Das so erhaltene reine Pro-

j dukt (HT-C₁) ist im Rattentest nach Kumar et al; I.e. etwa

■gleich aktjLv wie das gemäss Beispiel 1 erhaltene Produkt

O
(O
CO

(HT-C ). Es kann in das ebenfalls aktive Sulfoxid übergeführt werden, z.B. mit 5#igem Wasserstoffsuperoxid. In der Dünn- ' Schichtchromatographie auf Alox DO ist Rs 52 = 1,04; Rs 79 =

1,4-2; Rs₁= 1,20. Das Sulfoxid zeigt folgende Werte: Rs 52 = . . 45 . .

0,88; Rs 79 = 1,29; Rs 45 = 1,09. In der Elektrophorese auf Avicel-Cellulose ist d = 0,90 für HT-C, und dessen Sulfoxid. Auf Cellogel ist d =1,15 für HT-C₁ und d = 1,35 für dessen Sulfoxid. HT-C, gibt positive Reaktionen mit Ninhydrin, Chlor-Tolidin, Pauly-Reagens und Barton^Ts Reagens. Die Reaktionen nach Sakaguchi und nach Ehrlich und di.e UV-Fluoreszenz sind negativ.

Die Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse ergibt: Lysin (l), Histidin (l), Asparaginsäure (3), Threonin (5), Serin (l), Glutaminsäure (2), Prolin,-(2), Glycin' (4), Alanin (2), 1/2 Cystin (2), Valin (1), Methionin (l), Isoleucin (l), Leucin (2), Tyrosin (1), Phenylalanin (3), NH,. " ' ' "■

Bei der Trypsin-Spaltung werden Fragmente'mit^{: :}- gleichen Aminosaurezusammensetzungeh wie für-HT-Gp in Tabelle von Beispiel 1 angegeben erhalten. 'Tr_.^; ist-identisch für HT-C₁ und HT-Cg. ' ^r ' - ; '· .λ

• Für Fragment Tr- ist Rs 52 (auf, Alox) = .0,55; Rs 101 A (auf Cellulose) = 0,86. Bei der Elektrophorese auf •Avicel-Cellulose istT d = 0,91. . ■ ■ ' ■ . ■ ν . ^: . . . .- Für. Fragment Tr₁₁ ist Rs^₂ (^auf Alox) =■ 1>38·;; .. · Rs lOlA (auf Cellulose), = 1,31.. B,ei der Elektrophorese · auf _; Avieel-Cellulose ist d = .0,94. _v: ' _:; , .-■:.,- '; ■ ■·. "

■ ' , - 909881 / 1 4^A ' ""·"- ^Λ " '^:

HT-C wird in der 50-f achen_ Menge einer 0,l$igen Cysteinhydrochloridlösung gelöst und während einer Stunde bei 45 gehalten. Dann wird die Lösung chromatographiert. Das Chromatogramm zeigt unter den Produkten einen Fleck, welcher dem Dimeren HT-C₁ entspricht. . ' - - ' ■ ;'.'■'■*

Wird HT-C-, eine Stunde bei 45° mit 0,5-n. Ammoniak' behände 1 ty so wird es in HT-C_p übergeführt. ■ " ■" —^V;l

Beispiel 3 ϊ

Wenn man Medulla-Carcinom wie in Beispiel 1 beschrieben extrahiert, den Trockenrückstand durch Gelfitration reinigt und das so erhaltene Produkt mit 50 MRC-Einheiten/mg einer multiplikativen Verteilung wie in Beispiel 1 unterwirft, erhält man neben den Fraktionen mit maximaler Aktivität mit

K = 0,6 solche mit K= 2,7. Das daraus erhaltene Peptid HT-C₂₁ _ ist dünnschichtchromatographisch und elektrophoretisch"einheitlich.

Es hat die gleiche Aminosäurezusammensetzung wie HT-Cp* weist aber keine freie a-Aminqgruppe auf. Es zeigt an der Ratte, eine Aktivität von oa.. 100-200 MRC-Einheiten pro

Bei der Dünnschicht.Chromatographie an -AIoX-D-O ist Rs. _k52 = 1,40;, Rsl04- * l,,40; Rs 79 = l,"8o. Bei der Elektrophorese · auf Avicel-Cellulose ist d = 0,56. .

Das Produkt zeigt positive Farbreaktionen mit Ninhydrin, Chlor-Tolidin, Kaliumhexacyanoferrat(II)-Eisen(III)chiorid und diazotierten! Sulfanilsäureamid.

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·- 15 -.

Beispiel 4

Wenn man Medulla-Careinom wie in Beispiel 2 beschrieben extrahiert, den Trockenrückstand des Extraktes durch Gelfiltration reinigt und das Produkt der Fraktionen 13-21 der multipliativen Verteilung unterwirft, erhält man ausser den aktiven Fraktionen mit K = 0,19 solche mit K = 4,0. Das daraus erhaltene Peptid HT-C _ ist dünnschichtehromatographisch und elektrophoretisch einheitlich. Es.zeigt an der Ratte eine Aktivität .von ca. 100-200 MRC-Einheiten/mg Peptid. Bei der DünnschichtChromatographie auf Alox-D-0 ist Rs 52 = 1,4-5; Rs 104 = 1,60; Rs 79 = l.,60. Bei der Elektrophorese auf Avicel-Cellulose ist d = 0,54.

Das Produkt gibt positive Farbreaktionen mit Ninhydrin, Chlor-Tolidin, Kaliumhexacyanoferrat(II)-Ei sen(III)Chlorid und diazotierten! Sulfanilsäureamid.

Beispiel 5

Man löst 0,5 mg Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-A sp-Phe-A sn-Lys-Phe-Hi s-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Alä-IIe-Gly-Val-GIy-Ala-Pro-NHg (I) (HT-Cg) in 1 ml einer wässerigen Lösung vön^ 20 mg Mannit und 4,6 mg Ameisensäure. Die Lösung wird steril filtriert und unter aseptischen Bedingungen in eine 5-rol-^Arnpulle

. 909881 .■/'USA'

■.- . -ν . ■■ - 16 - .

gefüllt, tiefgekühlt und lyophilisiert. Vor dem Gebrauch wird das Lyophilisat in destilliertem Wasser gelöst. Der .Inhalt der Ampulle entspricht ca. 70 MRC-Einheiten. Die Lösung wird intramuskulär oder intravenös angewendet, z.B. 10 - 70 Einheiten pro Tag.

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Claims

Patentansprüche :

1. Verfahren zur Herstellung von menschlichem Calcitonin in reiner Form, dadurch gekennzeichnet, dass man entfettetes Medullarcarcinom der Schilddrüse: oder C-Zellen-> Metastase-Material, das. gegebenenfalls mit Alkohol oder ver<dünnter wässeriger Trichloressigsaure vorgereinigt ist, mit einem Wasser und .ein Niederalkanol enthaltenden Lösungs-. mittelsystem bei einem pH von ca..1-6 extrahiert und die erhaltene Lösung in üblicher Weise, gegebenenfalls unter wiederholter verfahrensgemässer Extraktion, aufarbeitet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man mit Aether entfettetes Ausgangsmaterial ver-

wendet. . . .

3· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch.gekenn-. zeichnet, dass man ein Lösungsmittel verwendet, das als

ϊ ι

Niederalkancl n-Butanol enthält. ;' " · .

4. Verfahren nach einem der Ansprüche l-3> dadurch gekennzeichnet, dass man ein Lösungsmitteisystem verwendet, das Essigsäure enthält» . ". .

5· Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch 'gekennzeichnet, dass man das erhaltene Rohprodukt durch

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. Chromatographie unter Verwendung von Ameisensäure weiterreinigt. .

6. · Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man an Sephadex G-50 chromatographiert.

7· Verfahren nach Anspruch 5* dadurch gekennzeichnet j, dass man an Bio Gel P6 chromatographiert..

8. Verfahren nach.einem der Ansprüche 1-7* dadurch gekennzeichne"c, dass man die^bei der Gelchromatographie erhaltenen aktiven Komponenten isoliert.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Rohprodukte durch Gegenstrom-Verteilung weiterreinigt _c und die Komponenten HT-C^, HT-Cg,

HT-C₁₁ und HT-C₂I isoliert. . ^r

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man die Gegenstromverteilung in einem n-Butanol

und Essigsäure enthaltenden System vornimmt. .

11;. Verfahren zur Herstellung von menschlichem
Caleitonin in Form der Komponenten HT-C₁, HT-C₂, HT-C₁- .
und HT-C₂₁ wie in den Beispielen beschrieben, seiner

Säureadditionssalze undKomplexe.

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12. Verfahren nach den Ansprüchen 1-11, dadurch gekennzeichnet, dass man HT-C." in HT-Cg. umwandelt.

13. Verfahren nach den Ansprüchen 1-11, dadurch gekennzeichnet, dass man HT-Cg in HT-C₁ umwandelt.

1^. Das nach dem Verfahren der Ansprüche 1-13 erhaltene Calcitonin in Form der Komponenten HT-C,, HT-Gp₁, HT-C₁₁ und HT-Cp,, seine Säureadditionssalze und Komplexe.

15.) Menschliches Calcitonin in Form seiner Komponenten HT-C₁, HT-Cg, HT-C _ und HT-C_g und seine Säureadditionssalze und Komplexe.

16. Das Dotriacontapeptidamid der Aminosäurezusammensetzung Lys (I)", His (l), Asp (3), Thr (5)., Ser (l), GIu (2), Pro (2), GIy (4), AIa (2), ^λ/2 Cys (2), VaI (l), Met (l), He (l)_t Leu (2), Tyr (l), Phe (3), wobei mindestens 4 der 5 Carboxylseitenketten in Amidform vorliegen und seine Säureadditionssalze und Komplexe.

17. Die Komponente HT-C₁ des menschlichen Calcitonins. -

18 . Die Komponente HT-Cp des menschlichen

Calcitonins. ·

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19. Die Komponente HT-C,, des menschlichen Calcitonins.

20. Die Komponente HT-Cp₁ des menschlichen Calcitonins.

21. Pharmazeutische Präparate, die ein Produkt gemäss einem der Ansprüche 14-20 enthalten.

22. Das Dotriacontapeptidamid der Formel

Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-GIn-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gin-Thr-Ala-Ile-GIy-Val-Gly-Ala-Pro-NH₂, seine Säureadditionssalze und Komplexe.

23. · Das Dimere des Dotriacontapeptidamids der Formel

Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-GIn-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Prο-Gln-Thr-Ala-lie-GIy-VaI-GIy-AIa-Pro-NHp, seine Säureadditionssalze und Komplexe.

24. Pharmazeutische Präparate, welche menschliches Calcitonin enthalten.

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