ES2216039T3 - Procedimiento de fabricacion del polvo de proteinas aciladas. - Google Patents

Abstract

UN METODO PARA RECUPERAR UNA PROTEINA ACILADA COMO UN POLVO, ESPECIALMENTE EN CASOS DONDE DICHA PROTEINA ACILADA ES UNA QUE RESISTE EL AISLAMIENTO POR PRECIPITACION ISOELECTRICA DE DISOLUCIONES ACUOSAS DE LA PROTEINA, DICHO METODO QUE COMPRENDE EN COMBINACION AJUSTAR DICHA DISOLUCION ACUOSA A CERCA DEL PH ISOELECTRICO DE LA PROTEINA Y SUMINISTRAR UNA CONCENTRACION DE ALCOHOL ADECUADA PARA PROVOCAR LA PRECIPITACION DE LA PROTEINA EN FORMA DE PARTICULAS FILTRABLES A DICHO PH.

Description

Procedimiento de fabricación de polvo de proteínas aciladas.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención se dirige, en general, a un procedimiento para recuperar, en forma de polvo, una proteína acilada, particularmente aquellas que resisten la recuperación mediante precipitación o cristalización y filtración subsecuente a partir de soluciones acuosas, y, especialmente, a ciertas proinsulinas aciladas, insulinas aciladas o análogos de insulina acilados. Más particularmente, la presente invención se refiere a la preparación de un polvo con fluidez de ciertas proinsulinas, insulinas y análogos de insulina acilados a partir de sus soluciones acuosas.

2. Descripción de la técnica relacionada

Durante mucho tiempo, ha sido un logro de la terapia con insulina el imitar el patrón de secreción de insulina endógena de los individuos normales. La demanda fisiológica diaria de insulina fluctúa y puede separarse en dos fases: a) la fase de absorción que requiere un pulso de insulina para eliminar el incremento de glucosa sanguínea relacionada con la comida y b) la fase de post-absorción que requiere una cantidad sostenida de insulina para regular la salida de glucosa hepática para mantener una glucemia óptima en el ayuno. De acuerdo con esto, la terapia eficaz implica, generalmente, el uso combinado de dos insulinas exógenas: una insulina de actuación rápida durante el tiempo de la comida proporcionada mediante inyecciones de dosis rápidas y una insulina de actuación larga y basal administrada mediante inyección una o dos veces al día.

Recientemente, se ha mostrado prometedora una clase de insulinas aciladas para el uso en la terapia con insulinas de actuación larga y basal. Estas insulinas aciladas se preparan mediante acilación, selectivamente con un derivado de ácido graso activado, del grupo o grupos amino libres de una insulina monomérica, incluyéndose una proinsulina, insulina normal y ciertos análogos de insulina. Los derivados de ácidos grasos útiles incluyen compuestos reactivos del tipo de ácidos grasos que tienen una longitud de cadena de, al menos, seis (6) átomos de carbono y, particularmente, los derivados de ácidos grasos que tienen de 8 a 21 átomos de carbono en su cadena. La insulina humana normal mono-acilada, acilada con un derivado del ácido palmítico, es un candidato particularmente prometedor. Las insulinas que caen dentro de esta categoría se describen en la solicitud de patente japonesa 1-254699.

Como se entenderá bien por los expertos en la técnica, es especialmente ventajoso, si no esencial, en muchas aplicaciones, el modo de recuperar una proteína en forma de un polvo sólido, preferentemente, de libre fluidez. La preparación de una proteína en forma de un polvo, por ejemplo, maximiza el almacenamiento y las opciones de distribución. Esto es particularmente verdad en el contexto de las composiciones destinadas a la terapia con insulina en la que deben producirse grandes volúmenes de producto para satisfacer la demanda. De un modo fortuito, hace mucho tiempo se descubrió que la insulina normal, incluyéndose la insulina de ternera, la insulina de cerdo y la insulina humana, podría recuperarse en forma de un polvo mediante precipitación, o, más exactamente, mediante cristalización de la insulina a partir de soluciones acuosas de insulina relativamente diluidas en forma de un complejo con cinc o en forma de cristales sódicos. En general, la denominada insulina con cinc se cristaliza a partir de una solución acuosa tamponada que contiene iones de cinc y puede aislarse, fácilmente, mediante filtración.

Desafortunadamente, las tentativas de recuperar insulinas aciladas con derivados de ácidos grasos de cadena larga mediante filtración no han sido tan exitosas. Ciertamente, las tentativas conocidas de cristalizar las insulinas aciladas con ácidos grasos no han tenido, de modo uniforme, éxito. Se ha postulado que el carácter hidrófobo del grupo del ácido graso de cadena larga en tales monómeros de insulina contribuye a esta dificultad mediante la interferencia con, entre otros, las interacciones proteína-proteína requeridas para la formación satisfactoria del cristal. Consecuentemente, deben encontrarse otras vías para preparar estas insulinas aciladas en forma de un sólido en forma de polvo.

Un enfoque técnicamente factible para producir una proteína acilada, tal como una insulina acilada, en forma de un polvo es liofilizar una solución acuosa de la proteína. Aunque las preparaciones en polvo de insulinas aciladas con ácidos grasos pueden prepararse de este modo, las técnicas de liofilización no están convenientemente adaptadas para la producción de las grandes cantidades de insulina necesarias comercialmente. Son particularmente problemáticos los asuntos de la seguridad del operador y de la manipulación del producto en las operaciones de liofilización de grandes volúmenes.

Otra estrategia potencial implica la precipitación isoeléctrica. Se conoce de hace mucho que las proteínas en una solución acuosa se vuelven menos solubles a medida que el pH del ambiente se ajusta cerca del punto isoeléctrico de la proteína. Se ha explotado este fenómeno general en los procedimientos de purificación y recuperación de proteínas. Una vez insolubilizadas, frecuentemente, tales proteínas pueden recuperarse a partir de la suspensión acuosa resultante mediante espesamiento únicamente por gravedad o mediante filtración al vacío o a presión.

Desafortunadamente, las tentativas de recuperar las insulinas aciladas con ácidos grasos simplemente mediante el ajuste del pH de una solución acuosa de la proteína acilada cerca de su punto isoeléctrico han producido composiciones similares a emulsiones que resisten fácilmente la separación sólido-líquido, tal como el espesamiento por gravedad o la filtración al vacío o a presión. Como resultado, debe encontrarse un nuevo enfoque para recuperar tales especies de insulina acilada en la forma de un polvo.

La presente invención proporciona un procedimiento simple para recuperar proteínas aciladas mediante precipitación y filtración en forma de un polvo de libre fluidez, y, especialmente, ciertas insulinas aciladas con ácidos grasos que resisten tal aislamiento y recuperación mediante precipitación y filtración. De este modo, la presente invención proporciona un procedimiento para recuperar insulinas aciladas con ácidos grasos en forma de un polvo de libre fluidez a partir de soluciones acuosas. En particular, la presente invención proporciona un procedimiento para recuperar una insulina acilada con ácidos grasos en forma de polvo que puede adaptarse cómodamente a técnicas de producción a relativamente gran escala. La presente invención también atañe a la proteína en forma de polvo preparada mediante este procedimiento.

Descripción de la invención

Todas las abreviaturas de aminoácidos usadas en esta memoria descriptiva son las aceptadas por la oficina de marcas comerciales y patentes de Estados Unidos como se indica en 37 C.F.R. \NAK 1.822(B)(2).

Los términos "insulina" e "insulina normal" tal como se usan en el presente documento significan insulina humana, insulina porcina o insulina de ternera. La insulina posee tres grupos amino libres: B^{1}-fenilalanina, A^{1}-glicina, y B^{29}-lisina. Los grupos amino libres de las posiciones A^{1} y B^{1} son grupos \alpha-amino. El grupo amino libre de la posición B^{29} es un grupo \epsilon-amino.

El término "proinsulina" tal como se usa en el presente documento es una proteína reticulada apropiadamente de fórmula:

B-C-A

en la que:

A es la cadena A de la insulina o un derivado funcional de la misma;

B es la cadena B de la insulina o un derivado funcional de la misma que tiene un grupo \epsilon-amino; y

C es el péptido de conexión de la proinsulina. Preferentemente, la proinsulina es la cadena A de la insulina humana, la cadena B de la insulina humana, y C es el péptido de conexión natural. Cuando la proinsulina tiene la secuencia natural, la proinsulina posee tres grupos amino libres: fenilalanina (1) (grupo \alpha-amino), lisina (29) (grupo \epsilon-amino) y lisina (64) (grupo \epsilon-amino).

El término "análogo de insulina" tal como se usa en el presente documento es una proteína reticulada apropiadamente que muestra actividad insulínica de fórmula:

A-B

en la que:

A es la cadena A de la insulina o un derivado funcional de la cadena A de la insulina; y

B es la cadena B de la insulina o un derivado funcional de la cadena B de insulina que tiene un grupo \epsilon-amino y al menos una de las cadenas A o B contiene una modificación de aminoácidos de la secuencia natural.

Los análogos de insulina preferidos incluyen insulina en la que:

El resto aminoacídico de la posición B^{28} es Asp, Lys, Leu, o Ala;

El resto aminoacídico de la posición B^{29} es Lys o Pro;

El resto aminoacídico de la posición B^{10} es His o Asp;

El resto aminoacídico de la posición B^{1} es Phe, Asp, o está delecionado solo o en combinación con una deleción del resto de la posición B2;

El resto aminoacídico de la posición B^{30} es Thr, Ala, o está delecionado; y

El resto aminoacídico de la posición B^{9} es Ser o Asp; con la condición de que o bien B^{28} o bien B^{29} sean Lys.

En los términos bioquímicos estándar conocidos de ordinario por los expertos en la técnica, los análogos de insulina preferidos son Lys^{B28} Pro^{B29}-insulina humana (B^{28} es Lys; B^{29} es Pro); Asp^{B28}-insulina humana (B^{28} es Asp); Asp^{B1}-insulina humana, Arg^{B31, \ B32}-insulina humana, Asp^{B10}-insulina humana, Arg^{A0}-insulina humana, Asp^{B1}, Glu^{B13}-insulina humana, Ala^{B26}-insulina humana y Gly^{A21}-insulina humana.

El término "acilación" significa la introducción de uno o más grupos acilo covalentemente unidos a los grupos amino libres de la proteína.

El término "ácido graso" significa un ácido graso C_{6}-C_{21} saturado o insaturado. El término "éster activado de ácido graso" significa un ácido graso que ha sido activado usando técnicas generales tales como las descritas en Methods of Enzymology, 25: 494-499 (1972) y Lapidot y col., en J. of Lipid Res., 8: 142-145 (1967), cuyas memorias descriptivas se incorporan en el presente documento como referencia. Los ácidos grasos preferidos son los saturados e incluyen ácido mirístico (C_{14}), ácido pentadecílico (C_{15}), ácido palmítico (C_{16}), ácido heptadecílico (C_{17}) y ácido esteárico (C_{18}). Más preferentemente, el ácido graso es ácido palmítico. Los ésteres activados de ácidos grasos incluyen derivados de agentes tales como hidroxibenzotriazida (HOBT), N-hidroxisuccinimida y derivados de los mismos. El éster activado preferido es palmitato de N-succinimidilo.

El término "reticulado" significa la formación de enlaces disulfuro entre restos de cisteína. Una proinsulina, insulina o análogo de insulina reticulado apropiadamente contiene tres fuentes disulfuro. El primer puente disulfuro se forma entre los restos de cisteína de las posiciones 6:11 de la cadena A. El segundo puente disulfuro une el resto de cisteína de la posición 7 de la cadena A con el resto de cisteína de la posición 7 de la cadena B. El tercer puente disulfuro une la cisteína de la posición 20 de la cadena A con la cisteína de la posición 19 de la cadena B.

El término "precipitación" se refiere a un procedimiento en el que se producen partículas fácilmente filtrables en un líquido y tiene que distinguirse de un simple cambio en la solubilidad de un soluto en disolución, que conduce a la formación de suspensiones y/o mezclas de dos fases similares a emulsiones estables. Las partículas filtrables por sí solas se denominan "precipitado".

La frase "fácilmente filtrables" y otras frases similares se refieren a un estado en el que las partículas de una mezcla sólido-líquido o una pasta fluida pueden aislarse mediante un procedimiento de filtración en terminación ciega y técnicas relacionadas hasta obtener una torta de masa filtrante manejable, es decir, un material con un contenido en humedad residual que no interfiere con la manipulación de la torta en forma de un sólido en vez de una pasta fluida. En la filtración en "terminación ciega", se administra la pasta fluida y se hace pasar al líquido del filtrado de un modo sustancialmente perpendicular al plano del filtro en contraste con la filtración de "flujo transversal" o "flujo tangencial", en la que el flujo líquido principal es paralelo a la superficie del medio de filtración. De un modo importante, el procedimiento de la presente invención produce una pasta fluida de una proteína acilada que puede aislarse mediante filtración en terminación ciega y técnicas relacionadas a una velocidad media o promedio de filtración que excede 5 l/m^{2}/hora (LMH) y, frecuentemente, a una velocidad media o promedio de filtración mayor de 20 LMH, siendo, normalmente, el punto final de la filtración, el punto en el que la torta puede manipularse como un sólido. Tales velocidades de filtración son críticas para la economía de la operación en una escala de producción comercial.

El término "acuoso" incluye sistemas co-disolventes así como el uso de agua solamente como un disolvente.

La presente invención se refiere a un procedimiento para recuperar una proteína acilada en forma de un polvo a partir de una mezcla acuosa, especialmente, las proteínas aciladas que resisten el aislamiento y recuperación mediante precipitación isoeléctrica a partir de una solución acuosa de la proteína acilada. El procedimiento comprende ajustar una solución acuosa de la proteína acilada a un pH que provoque que la proteína en solución se haga insoluble y añadir suficiente alcohol a la mezcla acuosa de la proteína para provocar la precipitación de la proteína en forma de partículas filtrables a dicho pH.

La proinsulina, insulina y análogos de insulina usados para preparar las proteínas aciladas que son el foco principal de la presente invención pueden prepararse mediante cualquiera de una diversidad de técnicas de síntesis peptídica reconocidas incluyéndose los procedimientos clásicos (en solución), los procedimientos en fase sólida, los procedimientos semi-sintéticos y, más recientemente, los procedimientos del ADN recombinante. Por ejemplo, Chance y col., solicitud de patente de Estados Unidos Nº 07/388.201, solicitud EPO Nº 383.472, Brange y col., documento EPO 214.826, y Belagaje y col., patente de Estados Unidos Nº 5.304.473, describen la preparación de diversas proinsulinas y análogos de insulina y se incorporan en el presente documento como referencia. Las cadenas A y B de los análogos de insulina de la presente invención también pueden prepararse a través de una molécula precursora semejante a una proinsulina usando técnicas del ADN recombinante. Véase Frank y col., Peptides: Synthesis-Structure-Function, Proc. Seventh Am. Pept. Symp., Eds. D. Rich y E. Gross (1981) que se incorpora en el presente documento como referencia.

Generalmente, la proinsulina, insulina y los análogos de insulina se acilan haciéndolos reaccionar con un derivado de ácidos grasos activado, tal como un éster activado de ácidos grasos. La acilación de la insulina normal con un ácido graso se describe en la solicitud de patente japonesa 1-254.699. Véase también Hashimoto y col., Pharmaceutical Research, 6: 171-176 (1989). Estas memorias descriptivas se incorporan en el presente documento como referencia.

Preferentemente, la acilación se realiza en condiciones básicas, es decir, a un pH mayor de 9,0 y, preferentemente, aproximadamente, 10,5, en un disolvente polar. Aunque la reacción puede realizarse en un disolvente polar totalmente orgánico usando una base que tiene un pKa acuoso mayor o igual de 10,75, se prefiere un disolvente mezclado orgánico y acuoso para el medio de reacción. Las bases preferidas son tetrametilguanidina, diisopropiletilamina o hidróxido de tetrabutilamonio. Un disolvente particularmente adecuado ha sido el acetonitrilo y agua, que contiene, aproximadamente, acetonitrilo 50%. Otros disolventes polares incluyen dimetilsulfóxido, dimetilformamida y similares. Los sistemas co-disolventes también incluyen acetona y agua, alcohol isopropílico y agua, y etanol y agua. Las condiciones de tiempo y temperatura adecuadas para realizar las reacciones no son críticas de un modo estrecho. Una temperatura de 0 a 40ºC y un tiempo de reacción de 15 minutos a 24 horas serían, generalmente, adecuados. Un modo particularmente preferido de preparar tales insulinas aciladas con ácidos grasos se describe en la solicitud de Estados Unidos Nº de serie 08/341.231 de tramitación junto con la presente, presentada el 17 de noviembre de 1994, cuya memoria descriptiva se incorpora en el presente documento como referencia.

Típicamente, una vez que la reacción está concluida, la mezcla de reacción que contiene la proteína acilada se diluye con agua y se añade un ácido para neutralizar la alcalinidad. El ácido se suministra en forma de una solución acuosa a la proteína acilada y sirve para hacer disminuir el pH de la solución por debajo del punto isoeléctrico de la proteína. De un modo normal, en este punto la proteína está en una solución acuosa tamponada apropiadamente para el procesamiento adicional. Particularmente, tal procesamiento incluye la purificación mediante procedimientos cromatográficos estándar tales como cromatografía en fase inversa o hidrófoba, concentración mediante filtración transversal, intercambio de disolventes mediante ultrafiltración y similares. Para la proinsulina acilada, insulina acilada y análogos de insulina acilados, particularmente, Lys B^{29}-insulina humana de N-palmitoilo y Lys B^{28} Pro B^{29}-insulina humana de B^{28}-N-palmitoilo, el pH, normalmente, debe ajustarse por debajo de, aproximadamente, 3,0, y, preferentemente, entre, aproximadamente 1,5 y 2,5, usando el ácido según se necesite. Los ácidos adecuados incluyen HCl, ácido acético, glicina y, especialmente, ácido cítrico. Se ha encontrado adecuado el uso de ácido cítrico a una concentración de 50 mM. Si se necesita, el pH también puede reajustarse con una base, tal como hidróxido sódico, para mantenerlo dentro del intervalo deseado.

En este punto, la solución acuosa de la proteína acilada aislada y, preferentemente, purificada, particularmente, una proinsulina acilada con ácidos grasos, una insulina acilada con ácidos grasos o un análogo de insulina acilado con ácidos grasos, puede procesarse de acuerdo con la presente invención para recuperar la proteína soluble en forma de un polvo. De acuerdo con la invención, el pH de la solución acuosa de la proteína se ajusta, mediante la adición de una base, preferentemente, una base hidrosoluble tal como hidróxido sódico, en una cantidad suficiente para provocar que la proteína soluble se haga insoluble. Esto se realiza ajustando el pH de la solución a cerca del punto isoeléctrico de la proteína acilada, alternativamente, denominado pH isoeléctrico. En el caso de una proinsulina acilada con ácidos grasos, una insulina acilada con ácidos grasos y un análogo de insulina acilado con ácidos grasos, particularmente, Lys^{B29}-insulina humana de N-palmitoilo, se ha encontrado adecuado el ajuste del pH dentro del intervalo de, aproximadamente, 4,0 a 6,0 y, preferentemente, aproximadamente, 4,5 a 5,5. A este pH, la carga neta de la proteína acilada debe estar en un mínimo y la solubilidad de la proteína debe ser la menor. Durante el ajuste del pH, la solución debe agitarse para obtener un mezclamiento completo.

Las soluciones acuosas de las proteínas aciladas, que son especialmente apreciadas para el tratamiento de acuerdo con la presente invención, forman una composición similar a una emulsión cuando el pH se ajusta a cerca de su pH isoeléctrico. Este estado interfiere con el aislamiento de la proteína usando las técnicas de separación sólido/líquido, tales como la filtración en terminación ciega, que se desean en el procesamiento a gran escala. Una característica clave de la presente invención se refiere al uso de un alcohol, especialmente etanol, que se añade a la mezcla acuosa de la proteína para ayudar en la formación de un precipitado fácilmente filtrable de la proteína acilada.

La secuencia de ajustar el pH de la solución y añadir el alcohol no es crítica. El alcohol puede añadirse a la solución de proteína antes del ajuste de pH requerido para la insolubilización y formación final del precipitado de la proteína y también puede añadirse después del ajuste del pH de la solución de proteína.

Los solicitantes han encontrado que la cantidad de alcohol que debe añadirse a la proteína acilada para obtener un precipitado fácilmente filtrable cae dentro de un intervalo estrecho. En particular, los solicitantes han descubierto que para una insulina acilada con ácidos grasos, y especialmente Lys^{B29}-insulina humana de N-palmitoilo, el resultado deseado, es decir, la formación de un precipitado fácilmente filtrable, se obtiene solamente tras la adición de una cantidad de alcohol, especialmente etanol, en un intervalo estrecho para proporcionar una concentración final de alcohol de, al menos, aproximadamente, 20% y hasta, aproximadamente, 35% y, preferentemente, aproximadamente, 25% a 30%, en la suspensión acuosa de la proteína o pasta fluida. Aunque el etanol es claramente el alcohol elegido, otros alcoholes tales como metanol e isopropanol deben ser sustitutos adecuados en ciertas circunstancias.

Añadir demasiado alcohol a la proteína acuosa interfiere con la obtención de un nivel aceptable de formación de precipitado, mientras que añadir una cantidad insuficiente no resolverá adecuadamente la composición similar a una emulsión producida tras el ajuste del pH de la proteína acilada en una pasta fluida o suspensión fácilmente filtrable. Ciertamente, con niveles de alcohol mayores que los deseados, la proteína se disolverá de nuevo contribuyendo a una reducción posible en el rendimiento. La determinación de una cantidad de alcohol, tal como etanol, necesaria para facilitar la precipitación y filtración de otras proteínas aciladas con ácidos grasos, puede hacerse usando la experimentación ordinaria.

En efecto, por tanto, la invención se basa en el reconocimiento de que para recuperar, en forma de un polvo de libre fluidez, una proteína acilada, particularmente, una que de otro modo resiste el aislamiento y la recuperación mediante precipitación isoeléctrica y filtración a partir de soluciones acuosas de la proteína, se debe producir la siguiente combinación de condiciones: a) un pH en o cerca del pH isoeléctrico de la proteína y b) una concentración suficiente de alcohol para ayudar en la precipitación y filtración de la proteína facilitando la formación de partículas fácilmente filtrables. Como se indica anteriormente, se ha encontrado que, en el caso de la Lys^{B29}-insulina humana de N-palmitoilo, una concentración de etanol de, aproximadamente, 20% a 35% en volumen de pasta fluida y, preferentemente, 25% a 30% en volumen, es particularmente adecuada para ayudar en la precipitación de la proteína en forma de partículas fácilmente filtrables.

El procedimiento mediante el cual se prepara una mezcla acuosa de proteína para que tenga, en sentido amplio, la concentración requerida de alcohol (por ejemplo, etanol) y muestre el pH isoeléctrico de la proteína acilada no es crítico. Por ejemplo, se puede obtener tal mezcla diluyendo, con agua, una solución acuosa de pH ajustado de la proteína que tiene una concentración de alcohol mayor que la requerida, es decir, en el caso de la Lys^{B29}-insulina humana de N-palmitoilo, diluyendo una concentración de alcohol de, aproximadamente, 35% en volumen, es decir, del 40 al 45% de etanol, hasta una concentración de alcohol en el intervalo deseado. Preferentemente, la composición se agita (mezcla) suavemente hasta el punto en el que tanto la concentración de alcohol como el pH se encuentren dentro de los límites deseados para facilitar la formación del precipitado.

La concentración de la solución de la proteína acilada antes del tratamiento de acuerdo con la presente invención tampoco es crítica. En el caso de las insulinas aciladas, incluyéndose también la proinsulina acilada y los análogos de insulina acilados, debe usarse, de un modo general, una concentración de, al menos, aproximadamente, 1 mg/ml y, preferentemente, al menos, aproximadamente, 5 mg/ml, aunque el uso de una concentración de proteína tan alta como 35 a 50 mg/ml y mayor debe proporcionar una proteína precipitada que puede procesarse a velocidades de filtración más aceptables. Como se indica anteriormente, la pasta fluida de proteína producida mediante el tratamiento combinado de ajuste de pH y adición de alcohol debe mostrar una velocidad media o promedio de filtración de, al menos, aproximadamente, 5 LMH y, preferentemente, muestra una velocidad media de filtración de, al menos, aproximadamente, 15 LMH. Sorprendentemente, se han observado velocidades medias de filtración de, aproximadamente, 20 LMH y mayores después del tratamiento de las soluciones de Lys^{B29}-insulina humana de N-palmitoilo de acuerdo con la presente invención.

Aunque no es crítica con estrecho margen, para obtener mejores resultados, la temperatura durante la filtración se mantiene en el intervalo de 20ºC a 30ºC. Las temperaturas de 0ºC o menores, sin embargo, deben evitarse durante la filtración ya que tales temperaturas interfieren con la operación a las altas velocidades de filtración deseadas. Aunque la filtración se hace, preferentemente, a esencialmente, una temperatura ambiente, las etapas del ajuste previo del pH y la adición de etanol pueden hacerse a cualquier temperatura por encima del punto de congelación de la pasta fluida.

En este punto, la composición acuosa de proteína está preparada para ser filtrada para aislar la proteína precipitada. En algunos casos, puede ser ventajoso realizar un espesamiento o compactación por gravedad de la composición acuosa de proteína o pasta fluida antes de filtrar para minimizar la carga hidráulica en el equipo de filtración. Aunque la filtración centrífuga de la composición acuosa de proteína puede ser ventajosa en escalas de tratamiento más grandes, por ejemplo, producción de lotes mayores de, aproximadamente, 0,5 kg, puede usarse cualquier medio de separación liquido/sólido, incluyéndose la filtración al vacío o a presión, para recuperar la proteína precipitada en la práctica general de la presente invención. En una escala más pequeña, por ejemplo, tamaños de lote por debajo de, aproximadamente, 0,3 a 0,5 kg, puede usarse con ventaja la filtración a presión usando un dispositivo de filtración que tiene una superficie de filtración de material sinterizado poroso. Se ha comprobado que es bastante eficaz la filtración a través de un material sinterizado poroso con un tamaño nominal de poro de, aproximadamente, 5,0 \mum. El equipo usado para filtrar la pasta fluida no es crítico con estrecho margen y puede usarse cualquiera de la amplia diversidad de sistemas de filtración conocidos compatibles con el procesamiento de composiciones farmacéuticas.

Tras la filtración, se recupera y se seca la torta de masa filtrante, generalmente, mediante evaporación al vacío. En la práctica general de la presente invención, puede usarse cualquier procedimiento para secar una pasta espesada de sólidos que no sea perjudicial, de otro modo, para la proteína aislada. Los modos de recuperar la torta de masa filtrante y los otros modos para secar la torta de masa filtrante deben ser evidentes para los expertos en la técnica y no son críticos.

Los polvos de insulina acilada de la presente invención son útiles como sustancia a granel del fármaco (BDS), para preparar composiciones farmacéuticas usadas en la terapia con insulina, es decir, para administrar a un paciente en necesidad de la misma (es decir, un paciente que padezca hiperglucemia). Tales composiciones farmacéuticas contienen una cantidad eficaz del polvo en combinación con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Para este fin, las composiciones farmacéuticas pueden, típicamente, formularse para contener, aproximadamente, 100 U/ml o concentraciones similares que contengan una cantidad eficaz del polvo de insulina acilada. Típicamente, estas composiciones son, aunque no necesariamente, parenterales en su naturaleza y pueden prepararse mediante una cualquiera de una diversidad de técnicas usando excipientes o vehículos ordinarios para los productos parenterales que son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, edición 17, Mack Publishing Company, Easton, PA, Estados Unidos (1985) que se incorpora en el presente documento por referencia. Por ejemplo, las formas farmacéuticas para la administración parenteral pueden prepararse suspendiendo o disolviendo la cantidad deseada del polvo de proteína en un vehículo líquido atóxico adecuado para la inyección tal como un medio acuoso y esterilizando la suspensión o solución. Alternativamente, puede colocarse en un vial una cantidad medida del polvo; y el vial y su contenido, esterilizase y sellarse. Puede proporcionarse un vial o vehículo acompañante con el fin de mezclar antes de administrar.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración parenteral emplean diluyentes, excipientes y vehículos tales como agua y disolventes orgánicos miscibles en agua tales como glicerina, aceite de sésamo, aceite de cacahuete, propilenglicol acuoso, N,N-dimetilformamida y similares. Los ejemplos de tales composiciones farmacéuticas incluyen soluciones salinas acuosas estériles e isotónicas del polvo que pueden estar tamponadas con un tampón farmacéuticamente aceptable y que son apirógenas. Además, la formulación farmacéutica parenteral puede contener conservantes tales como metacresol, otros agentes para ajustar el pH del producto final tales como hidróxido sódico o ácido clorhídrico y estabilizantes tales como sales de cinc.

El siguiente ejemplo se presenta para ilustrar y explicar la invención. Aunque la invención se ilustra en referencia a la recuperación de Lys^{B29}-insulina humana de N-palmitoilo en forma de un polvo, no debe considerarse que el alcance de la invención está limitado a este ejemplo. A no ser que se indique de otro modo, todas las referencias a partes y porcentajes están en base al peso y todas las temperaturas se expresan en grados centígrados.

Ejemplo

Se trata una solución acuosa (8,8 litros) de una insulina humana biosintética acilada con ácidos grasos (Lys^{B29}-insulina humana de N-palmitoilo), que tiene una concentración proteínica de 50 mg/ml y un pH de 2,6, a una temperatura de 2-8ºC, con 530 ml de hidróxido sódico 10% que incrementa el pH hasta 5,7. Tras agitar la solución de pH ajustado para obtener un mezclamiento exhaustivo, se añade etanol absoluto, en una cantidad de 0,46 litros por litro de solución de pH ajustado (hasta un volumen total de solución de 13 litros), agitando suavemente, para ayudar en la precipitación de la insulina acilada. La pasta fluida de la proteína acilada se deshidrató en un filtro a presión que tiene un material sinterizado de acero inoxidable con un tamaño nominal de poro de 5,0 \mum. la velocidad media observada de filtración fue, aproximadamente, 25 LMH. Se descartó el filtrado. Seguidamente, la torta de masa filtrante se lavó con una solución acuosa que contiene etanol 30% en volumen y la torta de masa filtrante lavada se recuperó del filtro y se secó al vacío para proporcionar un polvo sin cinc. Se ha observado que este polvo tiene una excelente estabilidad durante el almacenamiento haciéndolo adecuado como sustancia farmacéutica del fármaco a granel. Sustancialmente, se recuperó toda la proteína en la torta de masa filtrante con muy poco pérdida a través del filtrado.

Los principios, realizaciones preferidas y modos de funcionamiento de la presente invención se han descrito, particularmente, en la memoria descriptiva anterior, principalmente en referencia a la proinsulina, insulina y análogos de insulina acilados con ácidos grasos, particularmente, la Lys^{B29}-insulina humana de N-palmitoilo. Sin embargo, la invención que tiene la intención de ser protegida en el presente documento, no debe interpretarse como limitante a las formas particulares descritas, ya que éstas deben ser vistas como ilustrativas en vez de restrictivas. Los expertos en la técnica pueden hacer variaciones y cambios sin desviarse del espíritu de la invención tal como se define en las siguientes reivindicaciones.

Claims (7)

1. Un procedimiento para recuperar una proteína seleccionada entre una proinsulina acilada con ácidos grasos, una insulina acilada con ácidos grasos y un análogo de insulina acilado con ácidos grasos en forma de un polvo a partir de una mezcla o solución acuosa, comprendiendo, dicho procedimiento, ajustar el pH de la mezcla o solución a un pH que provoque que la proteína se haga insoluble y añadir suficiente alcohol a la mezcla o solución acuosa de la proteína para ayudar en la precipitación de la proteína en forma de partículas filtrables a dicho pH.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la solución acuosa se ajusta a un pH de, aproximadamente, 4,0 a 6,0.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que en la proinsulina, insulina o análogo de insulina acilado con ácidos grasos, el resto aminoacídico de la posición B30 es Thr, Ala o está delecionado y el ácido graso es ácido mirístico.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la proteína es Lys^{B29}-insulina humana de N-palmitoilo.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el alcohol es etanol añadido en una cantidad para proporcionar una concentración de alcohol del 20% al 35% en volumen de la mezcla acuosa.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la concentración de alcohol es 25 a 30% en volumen.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente, filtrar y secar la proteína para obtener el polvo.