CS199673B2

CS199673B2 - Method of producing polypeptides

Info

Publication number: CS199673B2
Application number: CS772980A
Authority: CS
Inventors: Anand S Dutta; Barrington J Furr; Michael B Giles
Original assignee: Ici Ltd
Priority date: 1976-05-11
Filing date: 1977-05-05
Publication date: 1980-07-31
Also published as: FR2351092B1; DD136738A5; NL7705130A; NL191793B; NO771644L; NO149586C; IL52014A0; SE7705432L; DE2720245A1; FI64139B; GB1524747A; NZ183931A; FR2351092A1; SE8007763L; IL52014A; IE44426L; DE2720245C2; DK149596C; NL191793C; AT379400B

Description

Vynález se týká způsobu výroby polypeptidů vykazujících vlastnosti agonistů luliberi_f nu. Luliberin je mezinárodně přijatý triviální , název pro faktor uvolňující luteinizační hori mon (LH-RF) (viz J. Biol. Chem., 1975, 250, ^! 3215).

I Je již známo· (viz Dutta, Furr, Giles a Morky, Clinical Endocrinology, · 1976, Supple* ment, 5, str. 291s—298s), že substitučním ; zavedením a-aza-aminokyselin do poloh 6 nebo 10 luliberinu se získají sloučeniny, které jsou méně účinné než základní molekula co do schopnosti uvolňovat luteinizační hormon (LH) z hypofýzy. Nyní bylo zjištěno, že substituční zavedení azaglycinu do polohy 10 spojené se substitučním zavedením různých D-a-aminokyselin do polohy 6 luliberinu nebo· substituční zavedení azaglycinu nebo azalaninu do polohy 6 luliberinu spojené s náhradou terminálního glycinamidu v luliberinu ethylaminoskupinou vede ke sloučeninám, které jsou účinnější než luliberin z hlediska jejich schopnosti · uvolňovat luteinizační hormon.

V souhlase s tím popisuje vynález způsob výroby polypeptídů obecného· vzorce I

La-H/s -Trp ^-Аг£-^рго^-Е-Е (!) ve kterém

A znamená D-Tyr, D-Tyr(Me), D-Ser,

D-Ser(Bul), D-Phe, D-Ala nebo D-Trp,

B představuje Leu nebo MeLeu,

E znamená Azgly a

F představuje aminoskupinu, nebo

A znamená Azgly nebo Azala,

B představuje Leu,

E je přímá vazba a

F znamená ethylaminoskupinu, a jejich farmaceuticky nebo veterinárně upotřebiteiných adičních solí s kyselinami.

Ve shora uvedeném obecném vzorci I a v celém textu jsou zbytky aminokyselin označovány svými standardními zkratkami (viz Риге and Applied Chemistry, 1974, 40, 317 až 331). Zbytkem a-aza-aminokyseliny je takový zbytek, v němž α-CH-skupina aminokyseliny je nahrazena dusíkem. Zkratka a-aza-aminokyseliny se odvozuje od zkratky odpovídající aminokyseliny zařazením prefixu „Az“. Tak tedy Azgly představuje azaglycin a Azala znamená azalanin. V případech, kdy není uvedena konfigurace příslušné aminokyseliny, má tato aminokyselina (s výjimkou a-aza-aminokyselin, které v sousedství karboxylové skupiny neobsahují žádné centrum asymetrie) přírodní L-konf iguraci. Rovněž zkratky Me a Bu^l jsou v daném oboru běžiné a standardně používané a představují methylovou resp. terc.butylovou skupinu.

Zvlášť vhodnými skupinami sloučenin vyráběných způsobem podle vynálezu jsou:

látky shora uvedeného obecného vzorce I, ve kterém

A znamená D-Tyr, D-Tyr(Me), D-Ser, D-Ser (Bu^l), D-Phe, D-Ala nebo D-Trp,

В představuje Leu nebo MeLeu,

E znamená Azgly a

F představuje aminoskupinu;

látky shora uvedeného- obecného vzorce I, ve kterém

A znamená Azgly nebo Azala,

В představuje Leu,

E znamená přímou vazbu a

F představuje ethylaminoskupinu;

látky shora uvedeného obecného vzorce I, ve kterém

A znamená D-Tyr (Me), D-Ser, D-Ser (Bu^ř), D-Pihe, D-Ala .nebo D-Trp,

В představuje Leu nebo MeLeu,

E znamená Azgly a

F představuje aminoskupinu.

Výhodnou skupinu sloučenin vyráběných způsobem podle vynálezu tvoří látky shora uvedeného· obecného vzorce I, ve kterém

A znamená D-Tyr(Me) D-Ser (Bu^l) nebo D-Phe,

В představuje Leu nebo MeLeu,

E znamená Azgly a

F představuje aminoskupinu.

Tři výhodné sloučeniny vyráběné způsobem podle vynálezu mají následující struktury:

Qlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-LeuM^-Pro-Az^ly-NH^

Qzu-His-bp-Ser-V*-D-Tyr (Me )-Leu-Аг_£-Рго-А_2£1_Г№]>

Ogíu-H.S-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (Ви)-1-еи-Аг_&-Рго-А1я,1^-ЧН_?_

Vhodnými farmaceuticky nebo veterinárně upotřebitelnými adičními solemi sloučenin vyráběných způsobem podle vynálezu s ky selinami jisou například hydrochloridy, fosfáty, citráty nebo acetáty.

Způsob podle vynálezu spočívá v reakci □к -OH, Qlu-Wis-OH;

“His “Trp -Ser-OH_f

Qíw-Hzs-Trp-Ser-T yr-A-B-OH ^-—Glu-His-Trp-S&r-Tyy-A-B-Atg-OH pebo □Gřu-/-/iS-Trp-$er-Tyr-4 -B-Arg-Pro-OH .nebo vhodného aktivního derivátu libovolného z těchto peptidů, s

H-His-T.rp-Ser-Tyr-A-B-Arg-P:ro-E-F,

H-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F,

H-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F,

H-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F,

H-A-B-Arg-Pro-E-F,

H-B-Arg-Pro-E-F,

H-Arg-Pro-E-F-,

H-Pro-E-F resp.

H-Azgly-NHs, » nebo s vhodným· aktivovaným derivátem libovolné z těchto látek, podle standardních kondenzačních reakcí obvyklých v chemii peptidů.

Při práci způsobem podle vynálezu je možno použít' kteroukoli ze standardních kondenzačních reakcí obvyklých v chemii peptidů, · například ' reakce popsané v knize M. Bodanskl a M. A. Ondetti, „Peptide Synthesis“, Interscienče, New York, 1966, kapitola V, a ve svazcích 1 až 8 publikace · „Amino-acids, Peptides and Protelns“ (Speclali-st Periodical Reporte), The Chemical Society, London.

Zvlášť vhodnými kondenzačními reakcemi použitelnými při práci způsobem podle vynálezu jsou azidová metoda, metoda aktivního esteru nebo kondenzace za použití N,N‘-dicyklohexylkarbodii.midu a 1-hydroxybenztriazolu. Výhodnou kondenzační reakcí je azidová metoda, zejména pak v případě, kdy se tvoří peptidová vazba His-Trp nebo Ser-Tyir.

Výchozí materiály pro práci způsobem podle vynálezu je možno připravit ze známých sloučenin standardními kondenzačními reakcemi známými z chemie peptidů, standardním zaváděním chránících skupin, známých z chemie peptidů a standardním odštěpováním chránících skupin, známým z chemie peptidů. Tyto reakce jsou popsány například v níže uvedených příkladech 1 až 8.

Jak již bylo uvedeno výše, vykazují sloučeniny, které je možno vyrobit způsobem podle vynálezu, vlastnosti agonistů luliberinu, tj. napodobují působení luliberinu. Luliberin je přírodní hormon vylučovaný hypothalamem, který působí na hypofýzu tak, že hypofýza uvolňuje luteinizační hormon (LH) a folikulostimulační hormon (FSH). Tyto dva hormony hypofýzy řídí reprodukční procesy, · přičemž posledně jmenovaný, folikulastimulační hormon, · působí na vajecníky v tom smyslu, že· napomáhá zrání folikulů, a prvně zmíněný, luteinizační hormon, vyvolává ovulaci. Sloučeniny obecného vzorce I jsou neočekávaně účinnější než luliberin pokud jde o schopnost uvolňovat luteinizační hormon, jsou proto užitečné pro řízení a/nebo zlepšování reprodukce u živočichů. Zmíněné sloučeniny jsou zejména užitečné pro množení velkých domácích zvířat během anioestru a při všech typech umělé iniseminace k přesnějšímu řízení doby ovulace. Sloučeniny podle vynálezu mohou být rovněž používány k zlepšení infertility u mužů a žen.

Agonistické vlastnosti popisovaných sloučenin vůči luliberinu je možno prokázat například jejich schopností vyvolat ovulaci u krys s konstantním esterem, sterilizovaných androgenem, nebo jejich schopností uvolňovat luteinizační hormon a folikulostimulační hormon, měřeno dvojitou radioimunologickou zkouškou· na protilátky v krevní plasmě nedospělých krysích samců nebo v krevní plasmě anestrálních nebo díestrálních ovcí.

Shora zmíněný· test na krysách sterilizovaných androgenem se provádí následovně:

Androgenem sterilizované krysí samice, připravené podáním lOO^g testosteron-propionátu krysám ve třetím, čtvrtém a pátém dnu věku, mají 'trvalý estrus, jak je možno prokázat vaginálními výtěry a přítomností četných preovulačních folikulů ve vaječnících. Aplikace luliberinu a · jeho aktivních analogů způsobí uvolnění ovulační dávky luteinizačního· hormonu a folikulostimulačního hormonu, což je možno prokázat přítomností vajíček ve vejcovodech a čerstvých žlutých tělísek ve vaječnících.

Všechny sloučeniny jmenované v tomto textu jsou účinnější než luliberin co do jejich schopnosti vyvolávat' ovulaci u krys s konstantním esterem a mimoto· nevykazují žádné známky toxicity při podání v dávce nejméně čtyřnásobně vyšší než je jejích minimální · účinná dávka. Zejména pak vý'ho-dné sloučeniny podle vynálezu, což jsou látky u199673 vedené v příkladech 4, 6 a 7, jsou zhruba stokrát účinnější než luliberin a nemají toxické účinky při podání v dávce stonásobně vyšší než je jeich minimální účinná dávka.

Sloučeniny vyrobené způsobem podle vynálezu je možno používat - ve formě farmacelutickýcih nebo veterinárních prostředků obsahujících jako.' účinou látku sloučeninu vyrobenou způsobem podle vynálezu, v kombinaci s farmaceuticky nebo veterinárně upotřébitelným ředidlem nebo nosičem.

Tento prostředek může být například ve formě vhodné k Orální nebo perlinguální aplikaci, například ve formě tablety, kapsle, roztoku či suspenze, k nasální aplikaci, například ve formě šňupacího prášku, nosního· spreje nebo· nosních kapek, k vaginální nebo· rektální aplikaci, například ve formě čípků, nebo k parenterální aplikaci, například ve formě sterilního injekčního- roztoku nebo suspenze.

Obecně je možno sho-ra uvedené prostředky -připravovat obvyklým způsobem za použití běžných pomocných látek, v případě prostředků k orální aplikaci však může být výhodné opatřit prostředek povlakem .chránícím polypeptidickou účinnou komponentu před účinkem enzymů v žaludku.

Popisované prostředky mohou kromě polypeptidu vyrobené způsobem podle vynálezu obsahovat ještě jedno nebo několik známých léčiv vybraných ze skupiny zahrnující prostaglandinbvé deriváty, například prostaglandin F_2ft, cloprostenol nebo fluprostenol, a další léčiva, jako -clomiphene nebo tamoxifen.

Výhodným prostředkem je preparát k orálnímu podání v jednotkové dávkovači formě, například tableta, kapsle, kapky nebo bolus, obsahující v každé jednotkové dávce od 2,5 do 5Ό0 mg, s výhodou od 10 do 100 miligramů, polypeptidu, nebo preparát vhodný k parenterálnímu podání, obsahující cd 5 pg -do 1 mg polypeptidu na 1 ml roztoku s výhodou od 10 pg -do 100 pg polypeptidu na 1 . ml roztoku.

Prostředkem k- parenterálnímu podání je s výhodou roztok v isotornickém solném nebo isotonickém dextrózovém roztoku, popřípadě pufirovaný na pH 5 až 9. Prostředek k parenterálnímu podání může být alternativně ve formě, z níž se účinná látka postupně pomalu uvolňuje, v kterémžto případě je .množství polypeptidu n'a jednotkovou dávku obecně vyšší než při použití běžných injekčních preparátů. Výhodný prostředek -k parenterálnímu podání s pomalým uvolňováním účinné látky obsahuje v jednotkové -dávce od 100 pg do 1,0 mg polypeptidu.

Popisované prostředky se normálně aplikují ’ tak, aby při orálním podání činila denní dávka od 50 <g/kg do- 20 mg/kg a denní dávka při parenterálním podání, například intravenózní, subkutánní či intramuskulární injekcí nebo infusí, se pohybovala od 0,2 pg/kg do 100 (tgZkg. U lidí odpovídá toto dávkování celkové denní dávce - od 3,5 mg do 1,4 g při orálním podání a celkové denní dávce od 14 pg do 7 mg při podání parenterálním. Při aplikaci prostřednictvím sliz-. nic -se dávky pohybují mezi výše zmíněnými dávkami pro orální a parenterální podání.

Vynález ilustrují následující příklady provedení, jimiž se však -rozsah vynálezu v žádném směru neomezuje.

V - příkladech uváděné hodnoty Rf se týkají vzestupné chromatografie na tenké vrstvě silikagelu. Rozpouštědlovými systémy používanými př'i -této chromatografií jsou systémy

1-butanol — kyselina octová — voda (4:1:

: 5 objem/objem) (R_fA),

1- butanol — kyselina octová — voda — - pyridin (15 : 3 : 12 : 10 objem/objem) (RfB),

2- butanol — 3% (hmotnost/objem) vodný roztok hydroxidu -amonného- (3:1 -objem/ /objem) (RfC), acetonitril — voda (3:1 objem/objem) (RfD), aceton — chloroform (1:1 objem/objem) (R_fE), chloroform — ethanol (1:4 objem/objem) (RfF), cyklohexan — ethylacetát (1:1 objem/objem) (RfG), cyklohexan — ethylacetát — methanol (1: :1: 1 objem/objem) (RfH), .............. .............

chloroform — methanol — voda (11: 8 : 2 objem/objem) (RfK), chloroform — methanol (19 :1 objem/objem) (RfP) a chloroform — methanol (9:1 objem/objem) (RfQ).

Ve všech případech se chrom-Btografické desky zkoumají v ultrafialovém -světle a detekují se fluorescaminem, ninhydrinem a chlor-škrob-jodovým -činidlem. Pokud není uvedeno jinak, znamená uvedení symbolu Rf, že při těchto postupech byla detekována pouze jediná skvrna.

Kyselé hyd-rolyzáty všech produktů v příkladech se získávají záhřevem peptidu nebo chráněného peptidu s 6 N kyselinou chlorovodíkovou -obsahující 1 % (hmotnost/objem) fenolu v zatavené evakuované ampulí na teplotu 100 - po dobu 16 hodin. Složení aminokyselin v každém hydrolyzátu se stanovuje za pomoci analyzátoru aminokyselin (LoíOirte) a ve všech případech je v souladu s -očekávaným složením.

Výraz „zpracuje se obvyklým způsobem“, používaný v příkladech, znamená, že po re199673 akci se všechny pevné podíly odfiltrují, filtrát se odpaří к suchu při teplotě pod 40 °C, zbytek se rozpustí v ethylacetátu, roztok se promyje 20% roztokem kyseliny citrónové, vodou, nasyceným -roztokem hydrogenuhličitanu sodného a znovu vodou, vysuší se bezvodým síranem sodným a ethylacetát se odpaří ve vakuu, čímž se získá žádaná sloučenina.

Příklady 1 až 8

Syntéza L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptofyl-L-seryl-L-tyrosyl-A-L-leucyl-L-airginyl-L-propyl-E-F

Obecný postup (m) (schémata 1 a 2)

К suspenzi 0,2 mmol L-pyroglutamyl-L-histidin-hydrazidu v 0,9 ml dimethylformamidu a 0,7 ml dimethylsulfoxidu se za míchání a chlazení na 0 °C přidá 0,8 mmol 5,7 N chlorovodíku v dioxanu. Po pětiminutovém energickém míchání se získá -čirý roztok, který se Ochladí na —20 °C, přidá se к němu 0,22 mmol terc.butylnitritu a v míchání se -pokračuje ještě 25 minut. Teplota se sníží na —30 ^PC, roztok se zneutralizuje přidáním 0,8 mmol triethylaminu, přidá se к němu směs 0,1 mmol L-triptofyl-L-seryl-L-tyrosyl-A-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-E-F-dihydrochloridu (připraveného šestnáctihodinovou hydrogenolýzou odpovídajícího N-benzyloxykarbonylderivátu v 80% [objem/objem] vodném methanolu obsahujícím 2 ekvivalenty chlorovodíku, v přítomnosti 5% [hmotnost/hmot nost] paládia na uhlí] a 0,1 mmol triethylaminu v 1 ml dimethylformamidu, předem ochlazená na —20°C, a reakční směs se 24 hodiny míchá při teplotě 4 °C. Dimethylformamid se odpaří ve vakuu a zbytek se chromatografuje na iontoměniči Sephadex LH-20 za použití dimethylformamidu jako elučního činidla. Hydrochlorid peptidu se dále čistí rozdělovači chromatografií na molekulárním sítu Sephadex G-25 za použití rozpouštědlového systému n-butanol — kyselina octová — — voda — pyridin (5:1:5 objem/objem).

Syntéza L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptofyl-L-seryl-L-tyirosyl-A-B-argmyl-L-prolyl-azaglycin-amidu

Obecný postup (n) (schémata 3, 4 a 5)

0,2 mmol L-pyroglutamyl-L^jhistidyl-L-tryptofyl-L-serin-ihydrazldu se rozpustí ve 4 ml dimethylformamidu a postupem (m) se převede na azid, který se postupem (m) kondenzuje s 0,15 mmol L-tyrosyl-A-B-L-arginyl-L-prolyl-azaglycmamid-hydroichloridu (připraveného katalytickou redukcí N-benzyloxykarbonybO-benzyl-L-tyrosyl-A-L-leucy 1- (N^w-nitro) -L-arginyl-L-prolylazaglycinamidu v 80’% [objem/objem] vodném methanolu po dobu 20 hodin v přítomnosti 5% [hmotnost/hmotnost] paládia na uhlí). Finální produkt ve formě hydrochloridu se čistí shora popsaným způsobem.

Sloučeniny podle vynálezu, připravené podle některého z těchto dvou obecných postupů, jsou shrnuty do následující tabulky:

ООООГхМЛЮ^

CM, CO CO CM CO CM CM 00 CD CD o CD CD CD θ' o <

CO rH Гч l> CO O cd o, a, > m oo cd cn, rd i-Γ rH O O O CD O

CO K O CO CM Ό1 OCD CD CD CD ID CD CD CO, CD θ' o Г-T CD o o o

А-,-

tO CM CM o to id i—1 CO CM^CO^lrHrHCOCM ёёёдййяй >D >5 >5 ' P>>

Tj Έο Έο Τ) Έο Έο I I N N N N N N I !<<<<<<

ti

CQ

t	t	ti		2	Z3	ti
Φ	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ

£££ J J££

—. dd 'Ή и í>* Φ £*» bS<LHHDH N N i i i i ι i <<QQ-QQQQ

Tabulka

HCMC^'TilOC2t>tO ri s

>,-<

>Η .

Pj >CD

Výchozí látky pro použití ve shora uvedených postupech je možno připravit podle následujících schémat 1 a 2 [postup [m]] a schémat 3, 4 a 5 [postup (n) ].

V těchto schématech se používají následující zkratky:

OC_P = 2,4,5-trichlorfeinylester

Bzl = benzyl

Z='benzyloxykarbonyl

Boc = terc.butoxykarbonyl

DMF = dimetihylformamid

Čísla v kroužcích označují příslušné reakční stupně popsané dále.

a

199B73 rt ^E

Φ ja o

U)

azaglycin (R=H), ^zalanin. (R=CH,)

					1 ..... .
			©	©	1 ©	1 o 24
					1	24 L
		©	2 ΓΥ		o % .	1 O CD
			24	N	ISI 1		N	N 1
				i i Bzl Z__	í 1 Bzl 1/ v__	N b’	i \| Bzl 1/	Kl F
					©	©	fQ) \§/	23 1
			fuft Uy	©	fV	2i Ž 1		1 о riF
					24 l	rsi	L<1	CSJ \|
							©	i Q
								24 L·—
Ч: 4	ч ь	X 4-	\ ' г¹ 3 4-	;r, -!-	4 +	\ O rv :	к i g2	К Sn?
						í^\ \№j .	24 i		N -
							/ř3\ \gy	©
									24
								1

ω

О

2Г φ

К)

yr(Me), D-Ser(Bu )

						A
		Βζΐ Ζ	Bzl Z	\ ω N h-J	\ w c N C η τ	Γ\ ? w N 5 H	<< z <1 m U 1 --— z
		©	©	©	©	©	1 << O 4 z ©_x Ϊ s Φ
		кл к	1 rv	2 К < zz : К < >	D ( s : D (	D < s : D <	tz Φ D OČ z z D Φ > H
ж 4-	+	ч о r\J	\ OQ S3 O hj T) 4
			o © > N
			^Ί Ú4 H*

ω о rr φ Η ω

ЧЛ

Stupe* (®

19,94 g (80 mmol) N-benzyloxykarbo.nyl-L-prolinu a 8,8 ml .(80 mmol) N-methylmorfolinu se rozpustí ve 200 ml suchého tetrahydrofuranu, roztok .se ochladí na. —20 QC, přikape se k němu 7,15 ml (76 mmol) chlormravenčanu ethylnatého, po dvouminutovém míchání se přidá 20' ml (300 mmol) 70% vodného roztoku éthylaminu, ochlazeného na —20 °C .a v míchání se pokračuje 18 hodin při teplotě 4 °C. Reakční směs se zpracuje obvyklým způsobem a zbytek se krystaluje ze směsi ethylacetátu a petroletheru (teplota varu 60 až 80 °C). Výtěžek činí 12,97 gramů (58,7 %). Produkt má ' teplotu tání 107 až 10'8 °C a [α.]η²⁵'⁵=—43,88° (c=1 v methanolu),

R_řD='0,69,

RfE = '0,53, R_řF=0,67, R_fH = 0,62, r_{P = '0,57, R(Q = 0,66.

Stupeň

Pětihodinová katalytická redukce při teplotě místnosti v přítomnosti 5% paládia na uhlí ve vodném ethanolu obsahujícím 1 . ekvivalent chlorovodíku.

StupeaCl)

Roztok 13,5 g (42,3 mmol) NMterc.butoxykarbonyl-N“-nitro-L--argininu, 7,15 g (47 mmol) L-prolin-ethylamid-hydrochlorid, 11,5 gramů (85 mmol) 1-hydroxybenzotriazolu a

6,58 ml (47 mmol) triethylaminu v dimethylformamidu se ochladí na 0°C a přidá se k němu 9,13 g (44,4 mol) dicyklohexylkarbodiimidu. Reakční směs se přes noc míchá při teplotě 4 °C, filtrací se zbaví pevných podílů a filtrát se odpaří ve vakuu k suchu. Zbytek se rozdělí mezi ethylacetát a vodu proťiproudným roztřepá váním (4 stupně). Vodné fáze se spojí, odpaří se k · suchu a zbytek. se rozdělí mezi n-butanol a 5% (objem/objem) vodnou kyselinou octovou protiproudným roztřepáváním (12 stupňů). Surový peptid získaný odpařením spojených n-butanolových fází se vyčistí chromatografii na sloupci silikagelu za použití 5% (objem/objem) methanolu v chloroformu a 10% (objem/objem) methanolu v chloroformu jako elučních činidel. Frakce obsahující produkt se spojí, odpaří se k suchu a vodný roztok zbytku se k odstranění Na-terc.butoxykarbonyl-N“-nitroargininu nechá projít sloupcem aniontoměniče (AG 1-X2). Sloupec se pak promyje vodou a spojené vodné fáze a kapaliny z pro mývání se lyofilizují. Ve výtěžku 16,67 g [89 procent) se získá azapeptidový derivát tající za rozkladu při 109 . až 111 °C;

[a]_D ²⁵ = .39,0° (c = l v methanolu),

RfA=0,62,

RfB=O,74,

RfC = 0,59,

RfD — 0,70,

RfE = 0,20,

RfF = 0,60,

R_fH = 0,61, '

RfK=0,85,

RfQ = 0,13.

Stupen

N-terc.butoxykarbonylderivát se rozpustí v ethylacetátu a .nechá se 1 hodinu reagovat při teplotě místnosti s. 3 N .chlorovodíkem v ethylacetátu (4 ekvivalenty).

Stupen (R^eH)

Roztok 2,90 g (22 mmol) terc,butoxykarbonylhydrazidu a 11,71 g (20 mmol) 2,4,5-trichlorfenylesteru N-benzyloxykarbonyl-O-benzyl-L-tyrosin.u ve 40 ml dimethylformamidu se nechá přes noc stát při teplotě místnosti. Reakční směs se .pak zpracuje <obvyklým způsobem a zbytek se překrystaluje ze směsi etheru a petroletheru (teplota varu 60 až 80' °C. Získá se 3,46 g (67%) chráněného hydrazidu ve formě bílého prášku o teplotě tání 126 až 127 QC;

[a]D²⁵=—13,2° (c='1 v methanolu),

RfD = 0,82,

R_fE =0,65,

R_fF = 0,63,

R_£H = 0,70. ' ® №¹

5,19 g (10 mmol) l-(N-benzyloxykarbonyl-O-benzyl-L-tyr osyl} -2-terc.butoxykarbonylhydrazidu · se rozpustí v 50 ml ethylacetátu a 1 hodinu se nechá reagovat při teplotě místnosti s 8 ml [40 mmol) 5 N chlorovodíku v ethylacetátu. Ethylacetát se odpaří ve vakuu, hydrochlorid se odfiltruje, promyje se etherem a vysuší se.

stu_Pe£0

Shora zmíněný hydrochlorid se vyjme 75 mililitry tetrahydrofuranu .a k roztoku se přidá nejprve 1,15 g (8 mmol) tríethylaminu a pak . 1,36 g (8 mmol) methylesteru N-karbo199673 nyl-L-leucinu. Po šestnáctih-odinové reakci při teplotě místnosti se reakční směs zpracuje obvyklým způsobem a zbytek se překrystaluje ze směsi ethylacetátu a petroletheru (teplota varu 60 až 80 °C).

Získá se 4,57 g (77,,7%) žádaného azatripeptidu o teplotě tání 156 až 157 °C;

[a]o24 — —10,3° [c — 1 v methanolu),

R_řD = 0,81,

R_řE = 0,45,

R_fP —0,26,

R_fQ = 0,47.

_c. , ® SÍUPqOl

K roztoku 2,95 g (5 mmol) methylesteru N-be·гlzyicxykarbonyl-O-benzyi-L-tyrosylazaglycyl-L-leucinu v 50 ml methanolu se přidá 5 ml (100 mmol) hydrazinihydrátu. Po dvouhodinové reakci při teplotě místnosti se hydrazid vysráží vodou a překrystaluje se ze směsi methanolu a etheru. Získá se 2,74 g (92,8 %) produktu o teplotě tání 169 až 170 stupňů Celsia;

[a]Z' = -9,0P (c = l v dimethylformamidu),

R[A — 0,76, R_fB=0,75, RfC = 0,73, R_fD = 0,63, R_řF = '0,60, R_fH = 0,55.

SturnÁ ®*® (R=h)

1,18 g (2,0 mmol) N-benzyloxykarbonyl-O-beiizyl-L4yrosylazag]ycyI-L-leuciⁱnhydrazidu se rozpustí v 10 ml dimethylformamidu, roztok se ochladí na —20 °C a přidá se k němu nejprve 1,46 ml (8 ¹ mmol) 5,49 M roztoku chlorovodíku v dioxanu a pak 0,25 ml (2,2 mmol) terc.butylnitritu. Po 5 minutách se roztok ochladí na —30 °C a přidá se k němu ochlazená směs 0,836 g (2,2 mmol) · hydrochloridu N^ω-mtro-L-argmyl-L-prclin-etιhylamiamidu a 1,43 ml (10,2 mmol) triethylaminu v 10 ml dimethylformamidu. Reakční směs se míchá nejprve 1 hodinu při 'teplotě —10 °C a pak 48 hodin při teplotě 4 °C, načež 'se zpracuje obvyklým způsobem a výsledný pentapeptid se vyčistí chromatografií na sloupci silikagelu za použití chloroformu a 3% (objern/objem) methanolu v chloroformu jako elučních činidel. Výtěžek produktu činí 0,695 g (38,5 %),

R(.A = 0,71,

R_{B = 0,72,

RfC = 0,84.

Stupen ®) (R-H)

Katalytická redukce v 80% (objem/objem) vodné kyselině octové obsahující 2 ekvivalenty chlorovodíku, v přítomnosti 5% (hmotnost/hmotnost) paládia na uhlí.

Stu.pgQ·

K roztoóu· 33,84 g (100 mmol) N-benzylcxykarbonyi-L-tryptofanu a 11,0 ml (100 mmol) N-methylmorfolinu ve 200 ml tetrahydrofuranu se za ' energického míchání a chlazení na —20 °C přidá 9,0 ml (95 mmol) chlormravenčanu ethylnatého. Po' 2 minutách se přidá roztok 17,10 g (110 mmol) hydrochloridu methylesteru L-serinu a 12,1 ml (110 mmol) N-meth-ylmorfolinu ve 150 ml dimethylformamidu, předem ochlazený na —20 °C, a v míchání se pokračuje nejprve 30 minut při teplotě —20 °C a pak 3 hodiny při teplotě místnosti. Obvyklým zpracováním se získá olejovitý produkt, který dvojnásobnou krystalizací ze směsi ethylacetátu a petroletheru (teplota varu 60 až 80 °C) poskytne 30,53 g (69,5 ' %) žádaného dipeptidového derivátu o teplotě tání 140,5 až 141 °C;

fa]D²⁴= -22,13° (c = l,4 v dimethylfcrmamidu).

Stupen®

30,53 g (69,5 mmol) shora připraveného esteru se rozpustí v 1 litru methanolu a k roztoku se přidá 15 · ml 62% (hmotnost/objem) roztoku hydrazinhydrátu. Po 16 hodinách se hydrazid shromáždí, promyje se methanolem a etherem a krystaluje se z horkého ethanolu. Získá se 23,18 g (75,8 %) žádaného 'produktu o teplotě tání 178 až 179 stupňů Celsia;

[a],+ = —25,27° (c —1 v dimethylformamidu),

RfD=0,65,

RfE = 0,20,

RfF = 0,43,

RfH = 0,50.

stupně ® A®

K roztoku 0,502 g (1,16 mmol) N-benzylcxy'^karbcnyl-L-tI’ypt(Cfyl-L--errnιhyd.razídu v 5 mililitrech dimethylformamidu, ochlazenému na —20 °C, se za míchání přidá 0,77 ml (4,64 mmol) 6,02 N chlorovodíku v dioxanu a pak 0,14 ml (1,22 mmol) terc.butylnitritu. Po· ' 30 minutách se roztok ochladí na —30 °C, zneutralizuje se přidáním 0,65 ml (4,65 mmol) triethylaminu, přidá se k němu směs 0,547 g (0,77 mmol) dihydrochloridu L-tyrosylazaglycyl-L-leucyl-L-arglnyl-L-prolin-ethylamidu a 0,108 ml (0,77 mmol) trietihylamínu v 5 mililitrech dimetihylformamidu, předem ochlazená na —20 °C, a v míchání se pokračuje nejprve 1 hodinu při teplotě —20 °C a pak 48 hodin při teplotě 4 °C. Reakční směs se zfiltruje a filtrát se odpaří ve vakuu к suchu. Surový peptid se vyčistí chromatografií na sloupci silikagelu za použití chloroformu, 10% (objem/objem) methanolu v chloroformu a směsi chloroform — methanol — voda (11: 8 : 2 objem/objem) jako elučních činidel. Získá se 0,424 g (52,9%) produktu o (a]o²⁵=—16,84° (o—1,5 v methanolu),

R_fA=0,61, R_fC=0,36, R_fD = 0,67, R_fK = 0,90.

Stupen ®) (R* methyl)

Pracuje se stejně jako ve stupni

Výtěžek produktu činí 66 %, teplota tání 102 až 104 °C;

(a]_D ²⁴=—15,5° (с —1 v methanoluj,

RíD = 0,76,

RfE'=0,68,

R_fF=0,76,

R₍H = 0,74.

stupeň ® (R^s methyl)

Pracuje se stejně jako ve stupni

Stuperi ®

К roztoku 2,41 g (4 mmol) methylosteru N-benzyloxykarbonyl-O-benzyl-L-tyrosylazalanyl-L-leucinu ve 36 ml methanolu se při teplotě místnosti za míchání přidá 12 ml (12 mmol) 1 N hydroxidu sodného a v míchání se pokračuje ještě 3 hodiny. Methanol se odpaří ve vakuu, zbytek se rozpustí ve 40 mililitrech vody, roztok se okyselí kyselinou citrónovou na pH 3 a extrahuje se ethylacetátem. Ethylacetátový extrakt se promyje vodou, vysuší se síranem sodným, rozpouštědlo se odpaří, odparek se rozpustí ve 200 mililitrech směsi dimethylformamidu a vody (3:2 objem/objem) a nanese se na sloupec 100 ml aniontoměniče (AG 1 X-2). Sloupec se promyje 50 ml shora uvedeného rozpouštědla a tripeptid se vymyje 0,2 M kyselinou octovou ve směsi dimethylformamidu a vody (3:2 objem/objem). Frakce obsahující tripeptid se spojí, odpaří se ve vakuu, zbytek se trituruje s etherem a pak se odfiltruje. Získá se 1,22 g žádaného produktu (51,7 procent) tajícího za rozkladu při 195°'C;

[a] o²⁴ =-25,4° (c='l v dimethylformamidu).

Stupeň® (R^metbyl)

Pracuje se stejně jako u postupu Výtěžek produktu činí 43 %;

[a]_D ²⁵= —25,9° (c='l v methanolu),

R_fA = 0,72,

R_fB = 0,76,

R_fC = 0,85.

Stupen ® (R = methyl)

Pracuje se stejně jako ve stupni

Výtěžek produktu činí 93 %, teplota tání 145 až 146 °C;

(«]d²⁵=+8,7° (c —1,2 v methanolu),

R[A = 0,88,

R_fB = 0,88,

R_fC = 0,83,

R₍D = 0,80, R₍E=0,59,

Stupen®) (R- methyl)

Pracuje se stejně jako u postupu

stupen®) (R⁼ methyl)

Pracuje se stejně jako u postupu ^5) s tím, že produkt po chromatografii na sloupci silikagelu se čistí rovněž filtrací na molekulárním sítu Sephadex LH-20 v dimetihylformamidu. Výtěžek produktu činí 63 %;

R_fF = 0,78,

R_fH = 0,73.

[α]ο^{25 =}—24,76° (c=O,8 v methanolu),

RfA’=O,58,

RfC = 0,42,

RfD = 0,65, R_fK=O,95.

Stupen

К suspenzi 24,9 g (100 mmol) N-benzyloxykarbonyl-L-prolinu, 11,2 g (100 mmol) semikarbazid-hydrochloridu a 14,5 ml (100 mmol) triethylaminu ve 200 ml dimethylformamidu, ochlazené na 0 °C, se za míchání přidá 20,6 g (100 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu a v míchání se pokračuje ještě 16 hodin při teplotě 4 °C. Dicyklohexylmočovina se odfiltruje a filtrát se odpaří na malý objem. Přidá se 200 ml vody a roztok se extrahuje třikrát vždy 50 ml ethylacetátu. Z vodného roztoku se zhruba během 1 hodiny vysráží produkt, který po překrystalování z vodného methanolu 'poskytne 16,5 g (53,9 %) žádaného dipeptid-amidu o teplotě tání 189 až 190 °C;

Í«]d²⁴ =--43,6° (c='l,4 v dimethylformamidu),

R_fD=0,54,

R_fF=0,52,

R₍H=0,38,

R_fK=0,78.

Stupen QÉ)

Šestihodinová katalytická redukce při teplotě místnosti za použití 5% paládia na uhlí v 80% (objem/objem) vodiném dimethylformamidu v přítomnosti 2 ekvivalentů chlorovodíku.

Stupen &

К roztoku 8,24 g (31 mmol) N-benzyloxykarbonyl-L-leucinu a 4,55 ml (32,5 mmol) triethylaminu ve 100 ml tetrahydrofuranu se při teplotě od —10 do —15 °C přidá 2,83 ml (29,5 mmol) chlormravenčanu ethylnatého. Reakční směs se 3 minuty míchá při shora uvedené teplotě, načež se vnese do intenzívně míchaného roztoku 5,79 g (31 mmol) N^<ú-nltro-L-argininu v 15,5 ml (31 mmol) 2 N hydroxidu sodného a 50 ml dimethylformamidu, ochlazeného na —10 °C. V míchání se pokračuje ještě 30 minut při teplotě —10 °C a pak 1 hodinu při teplotě místnosti. Rozpouštědla se odpaří ve vakuu a zbytek se rozdělí mezi 50 ml ethylacetátu a 50 ml vody. Vodná fáze se oddělí a extrahuje se dvěma dalšími podíly ethylacetátu. Spojené organické fáze se promyjí ještě jednou 25 ml vody a odloží se. Spojené vodné fáze se okyselí nasyceným vodným roztokem kyseliny citrónové a extrahují se třikrát vždy 100 ml ethylacetátu. Ethylacetáťové extrak ty se spojí, promyjí se vodou, vysuší se síranem sodným a odpaří se k suchu. Překrystalováním zbytku ze směsi ethylacetátu a; petrol-etheru (teplota varu 60 až 80°C) se získá 8,98 g (62 %) dipeptidu tajícího za rozkladu při 150 až 165 °C.

Roztok 9,2 g [20 mmol) N-benzyloxykarbonyl-L-leucyl-(N^w-nitro)-L-arginmu, 4,2 g (20 mmol) hydrochloridu L-prolylazaglycinamidu, 5,4 g (40 mmol) 1-hydroxybenzotriazolu a 3 ml (20 mmol) triethylaminu ve 200 ml dimethylformamidu se ochladí na 0 °C a přidá se k němu 8,2 g (40 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu.

Reakiční směs se přes noc míchá při teplotě místnosti, pak se 'dicyklohexylmočovina odfiltruje a filtrát se odpaří k suchu. Překrystalováním zbytku ze směsí methanolu a etheru se získá tetrapeptidický derivát o teplotě tání 88 až 90 °C. Výtěžek 'činí 12,2 g (98,3 %);

( + + = -30,2° (0=1,6 v dimethylformamidu),

R_fD = 0,57, R_fF=0,40, RfH = 0,26, R_fK = 0,63.

Siu.pen

Hydrogenace za použití 5% paládia na uhlí ve vodném ethanolu v přítomnosti 2 ekvivalentů chlorovodíku, trvající 16 hodin.

Stupe o &)

6,484 g (11,0 mmol) 2,4,5-trichlorfenylesteru N-benzyloxykarbonyl-O-benzyl-L-tyrosinu a 1,396 g (10 mmol) hydrochloridu methylesteru D-alaninu se rozpustí v 50 ml dimethylformamidu, ipřidá se 1,4 ml (10,0 mmol) triethylaminu a výsledný roztok se přes noc míchá při teplotě místnosti. Reakční směs se zpracuje obvyklým způsobem a zbytek se krystaluje z horkého ethylacetátu. Získá se 3,782 g (77,2 %) methylesteru chráněného dipeptidu o teplotě tání 163 °C;

[«Id²⁴·⁸ = —12,84° (0=1,1 v dimethylformamidu).

Stupwí Θ

3,435 g (7,0 mmol) methylesteru N-benzyloxykarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-alaninu se rozpustí ve 400 ml teplého methanolu, k roztoku se přidá 10 ml (120 mmol) 62% (hmotnost/objem) hydrazinhydrátu a· směs se nechá přes noc stát při teplotě 25 ^QC.

Hydrazid se odfiltruje, promyje se methanolem a etiherem, a dvakrát se překrystaluje z vroucího methanolu. Získá se 3,068 g (89,2 procent) žádaného produktu o teplotě tání 217 °C;

[a]_D ²⁴ = —20,44° (c = l,l v dimethylforinamidp),

R(A = 0,73, R_fB = 0,7'5, RfC='0,67, j R_fp = 0,70,

R_fE='0,50, R_fF='0,54, RfH —0,67, у R₍K = 0,85,

R_fQ=0,25.

Stupce

К roztoku 1,18 g (2,4 mmol) N-benzyloxykarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-Ď-alaninhydrazidu se Za míchání a chlazení na —20 °C přidá nejprve 1,6 ml (9,6 mmol) 6,02 M roztoku chlorovodíku v dioxanu a pak 0,29 ml (2,52 mmol) terc.butylnitritu. Po 14 minutách se přidá roztok 1,03 g (2,0 mol) dihydrochloridu L-leucyl-L-arginyl-L-prolylazaglycinamidu a 1,62 ml (11,6 mmol) triethylaminu v 15 ml dimethylformamidu, předem ochlazený na —20 °C a v míchání se pokračuje 24 hodiny při teplotě 4°C. Triethylamin-'hydrochlorid se odfiltruje a filtrát se odpaří ve vakuu k suchu. Odparek se nanese na sloupec silikagelu a sloupec se vymývá 5% (objem/objem) methanólem v chloroformu, - 10% (objem/objem) methanólem v chlproformu a směsí chloroform — methanoj — — voda (11: 8 : 2 objem/objem). Frakce obsahující produkt se spojí, odpaří se a peptid 1 se znoyu chromatografuje na sloupci silikpgeju za použití směsí acetonitrilu a vodv (3:1 objemově) jako elučního činidla. Získá se 890 mg (46,4 %) produktu o (a]_D ²⁵ = —45,7° (c=l,l v methanolu),

R_fA'=Ú,54, R_fB = 0,69, R_fC'=0,41.

Stupen.

Pracuje se stejně jako u postupu ^7) .

StUPea®

Pracuje se stejně jako u post,upu (l5) .

Výtěžek čiflí 4? %;

2?

[a]o²⁵= - 41,4° (c—1,3 v methanolu),

RjA-0,80,

RfČ = 0,47,

RfD =0,65, R_fK=IO,95.

Pracuje se stejně jako u Výtěžek činí 69 %;

teplota tání 135 °C, postupu .

R_fA=O,49, R_fB =0,65, RfC=O,46, RfD'=O,64, R_fF = 0,35, R_fH = 0,19, R_fK=0,86.

Stupen <3

Pracuje se stejně jako u postupu

Stupeá © ^=0-Phe)

Roztok 7,41 g (24,8 mmol) N-benzylpxykarbonyl-D-fenylalaninu a 3,62 g (25 mmol) metihylesteru L-leucinu ve 100 ml ethylácetátu se ochladí na 0°C a přidá se k němu 5,15 g (25 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu. Reakční směs se přes noc míchá při teplotě 4 °C, načež se obvyklým způsobem zpracuje. Překrystalováním zbytku ze směsi ethylacetátu a petroletheru (teplota varu 60 až 80 °C) se získá 9,1 g (86 %) žádaného dipeptidu o teplotě tání 123 až 124 ?C;

[tt]_D ²⁶-'-18,7° (c = 2,l v methanolu),

RfD=0,76, RfE = 0,65, RfF=0,74, RfH—0,73.

Stupen®) (A-D~Ph.e)

Katalytická redukce v přítomnosti 5% paládia na uhlí v ethanolu obsahujícím 1 ekvivalent chlorovodíku, trvající 5 hodin.

Stupeň© (A=D Phe)

К roztoku 4,89 g (8,36 mmol) 2,4,5-trichlorfenylesteru N-benzyloxykarbonyl-O-benzyl-L-tyrosinu a 2,5 g (7,6 mmol) hydrochloridu methylesteru D-fenylalanyl-L-leucinu v dimethylformamidu se přidá 1,1 ml (7,6 mmol) triethylaminu a v míchání se pokračuje přes noc při teplotě místnosti. Triethylamin-hydrochlOríd se odfiltruje a filtrát se odpaří k suchu. Překrystalováním zbytku z vodného methanolu se získá 3,6 g (69,,7%) tripeptidického· derivátu o teplotě tání 183 až 184 °C;

RfD = 0,82,

RfE-0,69,

RfH = 0,78,

RfP=O,71, RfQ=0,82.

Stupe !© <A=D-Pbe)

Roztok 3,42 g [5,04 mmol) shora uvedeného methylesteru a 60 mmol hydrazinhydrátu ve 30· ml dimethylformamidu se 4 hodiny míchá při teplotě místnosti, pak se zahustí na malý objem a hydrazid sé vysráží přidáním 500 ml vody, načež se shromáždí, promyje se vodou, směsí methanolu a etheru - [1:4 objem/objem) a etherem, a vysuší se. Výtěžek produktu činí 2,94 g (85,9 %);

teplota tání 179 až 180 · °C,

Rf A=0,81,

RfB· = 0,79,

RfC = 0,88,

RfD=0,69,

RfE=0,49,

RfF=lO,65,

R_fH = 0,67,

RfP = 0,25,

RfQ =0,57.

K roztoku 1,86 g (2,75 mmol) N-benzyloxykarbonyl-O-benzyl-L-tyro₁syi-D-fenylalanyl-L-leucinhydrazidu v 5 ml dimethylformamídu se pří teplotě —20 °C přidá 1,83 ml (11 mmol) 6,02 M roztoku - chlorovodíku v dioxanu a pak 0,33 ml (2,89 mmol) terc.butylnitritu. Po 2 mtoutách se přidá roztok 1,89 mililitrů (13,5 mmol) triethylaminu a 1,02 g (2,5 mmol) hydrochloridu N“-nitro-L-arginyl-L-prolylazaglycinamidu v 10 ml dimethylformamidu a reakční směs se přes noc míchá při teplotě 4°C. Obvyklým zpracováním se získá hexapeptidický derivát, který se dále čistí chromatografií na sloupci 120 g silikagelu za použití - 5¹% - (objem/objem) methanolu v chloroformu, 10% (objem/objem) methanolu v chloroformu a směsi chloroform - methanol - voda - (11:8:2 objem/objem) jako elučních rozpouštědel. Získá se 0,74 g (29,3 ·%) žádaného produktu o teplotě tání 137 až 139 °C;

RfA=iO,68, RfB = 0,72,

RfC = 0,58,

R_řD=0,62,

RfH^O.39, RfK = 0,95.

mmo- L-pyiogiutamy-L-histidinhydrazidu -se postupem popsaným u obecného postupu (a) převede na azid, který se kondenzuje s 11 mmol methylesteru L-tryptofyl-L-serinu (připraveným hydrogeinací N-benzyloxykarbonylderivátu v dimethylformamidu v přítomnosti 5% paládia na uhlí) nejprve po· χ dobu 30 minut při teplotě —10 °C ia pak 24 hodiny při teplotě 4 °C. Triethylamm-hydroc^ll^jrid -se -odfiltruje a filtrát se odpaří -k suchu. Surový produkt se vyčistí chromato- <

grafií na sloupci silikagelu za použití - 10% (»c^t^jj^i^/4^>bjem) methanolu v chloroformu, 20% (objem/objem) methanolu v chloroformu a směsi chloroform - methanol - voda (11:8:2 -objem/objem) jako elučních činidel.

Výtěžek - produktu činí 70%;

teplota tání 142 až 145 °C (rozklad),

RfA=O,39, f=t,,72, R_fC = 0,45, RfD=0,48, RfK=D,61.

Stup*!®

5,4 mmol methylesteru L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptofyl-L-serinu se rozpustí v 70 mililitrech dimethylformamidu a roztok se nechá 4 hodiny reagovat se 100 mmol hydrazinhydrátu. Dimethylformamid se odpaří ve vakuu, zbytek se trituruje s ethanolem, produkt se shromáždí, promyje se ethanolem a etherem, a vysuší se. Získá -se produkt o teplotě tání 184 až 189 °C. Výtěžek činí 82 %;

RfA = 0,18,

RfB=O,55,

RfC = 0,39,

RfD=0,27, RfK=O,58.

Stupen (A-D~Trp)

K roztoku 7,27 g (21,5 mmol) N-benzyloxykarboonyllD-tryptofanU) 3,12 g (21,5 mmol) methylesteru leuicinu a 5,8 g (43 mmol) 1-hydroxybenzotriazolu v 50 ml -dimethylformamidu se -při teplotě 0 °C přidá

4,87 g -23,6 πιπίϋΐ) dicyklohexylkarbodiimidu). Reakční směs se -přes -noc - míchá při teplotě místnosti, načež se obvyklým způsobem zpracuje. Po překrystalování ze směsi ethylacetátu a petroletheru (teplota varu 60 až 80 - °C) se získá 9,55 g -dipeptidického derivátu, který podle chromatografie na tenké vrst- vě obsahuje stopy nečistot. Tento materiál se vyčistí chromatografií na sloupci 300 g silikagelu za použití chloroformu a 5% (objem/objem) methanolu v chloroformu jako elučnícih činidel. Výtěžek produktu činí 9,18 gramu (91,7%);

teplota tání 151 až 153 '°C,

R_fA = 0,84,

RfB = 0,80,

RfC=0,86, RfD=0,78, J RfE=0,61,

R_fF=O,68,

RfH=0,73, RfP—0,55, J RfQ —0,73.

S^upeh (A=í^-Trp⁾

Pětihodinová katalytická redukce v 80% (objem/objem) vodném 'dimethylformamidu v přítomnosti 5% paládia na uhlí.

Sfqpea @ (A=D~^Trp)

Roztok 11,69 g (20 mmol) 2,4,5-trichlorfenylesteru N-benzyloxykarbonyl-O-benzyl-L-tyrosinu, a 6,28 g (19 mmol) methylesteru D-tryptofyl-L-leucmu ve 100 ml dimethylformamidu se 60 hodin míchá při teplotě místnosti, načež se reakční směs obvyklým způsobem zpracuje a zbytek se krystaluje ze směsi ethylacetátu a petroletheru (teplota varu 60 až 80 °C). Získá se 8,52 g (62,5 %) žádaného tripeptidického derivátu o teplotě J tání 165 až 166 °C;

RfA = 0,78,

RfB = 0,73,

J RfC=t>,84,

RfD = 0,80,

R(E = 0,62,

R_řF=iO,7O,

RfH = 0,76, RfP=0,58, R_fQ=0,68.

Stupeň. ® !A--D-Tr^p)

K roztoku 7,26 g (10,1 mmol) methylesteru N-benzyloxylkarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-tryptofyl-L-leucinu ve směsi 200 ml methanolu a 50 ml dimethylformamidu se při teplotě místnosti přidá 100 mmol hydrazinhyrátu. Po 24 hodinách se roztok zahustí zhruba na objem 30 ml a k odparku se přidá 500 ml vody. ' Tripeptid-hydrazid ' se shromáždí, promyje se vodou, směsí methanolu a etheru (1:4 objem/objem) a etherem, a vysuší se. Získá se 6,86 g (94,6 %) žádaného produktu o teplotě 'tání 200 až 202 °C;

Rf A =0,90,

RfB = 0,95,

R_{C=0,90,

RfD = 0,74,

RfQ = 0,59.

StupcP®*® (frO-Kp)

K roztoku 1,97 g (2,75 mmol) N-benzyloxykarbonyl-O-be^ιnzyllLltyrosyllD--tryptofyl-Ll leucinhydrazidu v 10 ml dimethylformamidu se za míchání a chlazení na =20 “C přidá nejprve 1,83 ml (11 mmol) 6,02 M roztoku chlorovodíku v dioxanu a pak 0,33 ml (2,89 mmol terc.buitylniitritu. Po 2 min. se přidá roztok 1,02 g (2,5 mmol) hydrochloridu Ν^ω-пИго-Ь-а^1пу1-Ьфго1у1а^:2^1ус1пат1йп a 1,89 ml (13,5 mmol) triethylaminu v 10 ml diimethylforniaiinidu, předem ochlazený na —20 °C, reakční směs se přes noc míchá při teplotě 4 °C, načež se zpracuje obvyklým způsobem.

Zbytek (1,27 g) se nanese na sloupec 230 g silikagelu a sloupec se vymývá chloroformem a 5% ' (objem/objem) methanolem v chloroformu. Získá se 0,91 g (34,,4%) produktu o teplotě tání 139 až 140 °C (rozklad);

RfA=0,67,

RfB=O,72,

RfD'=0,62, RfH = 0,34, RfK=O,95.

Stupe a® [A= D-Tyr

Roztok 3,17 g (9,64 mmol) Z-D-Tyr(Me)-OH, 1,92 g (10,6 mmol) 2,6 gramu (19,2 mmol) l-hydroxybenzotriazolu a 1,6 ml ' (11 mmol) triethylaminu ve 30 ml dimethylformamidu se ochladí na 0 °C a přidá se k němu 2,29 g (11,1 mmol) N,N‘-dicyklohexylkarbodiimidu. Reakční směs se přes noc míchá při teplotě 4 °C, načež se obvyklým ' způsobem zpracuje. Po překrystalování z horkého cyklohexanu se získá chráněný dipeptidický derivát ve výtěžku 1,41 g (95,2 %);

R_řD=0,83,

RfE = 0,69,

RfP'=0,72,

RfQ' = 8,76.

SuPeri ® = D~ Tyr ^jj]

Katalytická redukce ve směsi methanol-dimethylfomiiamid - voda (8:1:1) obsahující 1,2 ekvivalentu chlorovodíku, v přítomnosti 5% paládia na uhlí, trvající 3 hodiny.

199973

Μ'

Stupe ο (¾ ^— = D~ Туг (íj

Roztok 8,2 mmol Z-Tyr(Bzl)-OOp, 8,2 mmol H-D-Tyr(Me)-Leu-OMe.HCl a 8,2 mmol triethylaminu v 60 ml dimethylformamidu se přes noc míchá . při teplotě místnosti, načež se reakční směs zpracuje. obvyklým způsobem. .Produkt se rozmíchá v . . etheru, zfitruje se, promyje .se etherem a vysuší se. . Výtěžek činí 81,2%; . teplota tání 191 až - 192°Ό,

Rf 0=0,85,

R_fE=0,73,.

R_fF = 0,72,

RfQ'=D,'78.

Stupě.* ® [д-о-ψ. ÍMe/]

K roztoku 4,59 g (6,4 mmol) Z-Tyr(Bzl)-D-Tyr(Me)-Leu-OMe . - ve ·25 ml dimethylformamidu a 50 ml methanolu se .přidá 12,9 mmol hydrazin-hydrátu a směs · se nechá .přes noc stát při teplotě místnosti. Methanol se odpaří ve vakuu, produkt se vysráží vodou, shromáždí se, promyje se vodou a vysuší se. Teplota tání činí 212 až 213 °C,

RfE=0,49,

RfF=0,66,

RfH =0,69, RfQ = 0,70.

®^л® (А=0’Т_уг(МеГ|

3,54 g . (5,0 mmol) hydrazidu ze stupně

se rozpustí v . 10 ml . dimethylformamidu, roztok se . .za . míchání ochladí na—^20.°C· a . přidá . se k němu nejprve 3,38 ml . (20 . mmol) 5,9 M chlorovodíku v dioxanu a . . pak 0,6 ml (5,25 mmol) terc.butylnitritu. . Po·· 2 minutách se . přifU · předem . ochlazený .. roztok ·. - 2,04 .·.g (5 mmol) H-Arg(NO2)-Pro-Azgly-NH2.HCl.a 3,55 ^:ml tríethylaminu (25 mmo)) v 10 . ml dimeťhylformamidu a . v míchání se pokračuje přes noc při teplotě 4 °C. Reakční směs se obvyklým způsobem zpracuje a .surový produkt se vyčistí chromatografií na sloupci Í5ilikagelu za použití chloroformu, 5%o .(objem/objem) methanolu v chloroformu . a .10⁰/o (objem/objem) methanolu v chloroformu jako elučních činidel. Výtěžek produktu činí

3,72 g .(70,9 %);

S/upeoT D”Ser (Bu íj

Rracuje se stejně . jako ve st^yppj ^-

Produkt se krystaluje z vodného methanolu. Výtěžek činí 90,4 . %; teplota tání . 1Q7 . až 108 °C,

RfD = 0,80,

RfE=0,68,

RfF ='0,73,

R₍H=0,72,

R₍P=0,72, R₍Q=0,74.

Stupeo.

® D-S&>

Pětiihodinová katalytická redukce v přítomnosti . 5 % . (hmotnest/hmotnpst) . paládia na uhlí, ve směsi . dimethylformamidu a .vody (8:2).

St^upea® - [A=D-Sen ffiuj]

Roztok . 19,17 g . . (32,7 mmol) . Z-Tyr(Bzl)-OCp - a‘ ..32,7 mmo. . H-SpríBu¹ J-LemO-Me ve 100 . ml dimethyfformamldu se nechá . 72 hodiny stát . při . teplotě . . místnosti. Obvyklým zpracovánfa ..se .- .z$ská..pevný produkt, . který se shromáždí, . promyje . .se . . etherem a vysuší se. Výtěžek . činí . 17,6. g (79,4 .. %);. teplota. tání 135 až 137 °C,

R_fD=0,80,

RfH=0,77,

RfQ = 0,81.

Stupou {Á^e D~Ser (Bu Tj

Pracuje se stejně jako ve stupni.

Produkt se překrystaluje z vodného . methanolu. Výtěžek činí 56,2 %; teplota tání 134 až 136 °C,

RfD=0,66, RfH=0,64, RíQ=Q;64.

RfA=0,64,

RíB‘.=0,72,

RfC=0,55,

RfD=0,66, R_fF=0,40, RfH=0,52.

Produki· -se vyčistí- eheamaíografií na -stoup» ci silikagelu · za použití ·chloroformu · a 5% (objem/objem.) methanolu-, v - chloroformu jaPracuje. se stejně j-afcp,-y.e stupních ko elučnícih činidel. Výtěžek produktu činí 38,5%; teplota tání 142 až 145 °C,

RfA='0,84,

R₍B = 0,71,

RfG='O,55,

R_fD = 0,85.

RfF=0,46,

R_fH=0,43,

R_fQ = 0,16.

SiUPen ® JA = D- lyr (Me ^J

K roztoku 22,6 mmol Z-D-Tyr(Me]-OH, 5,98 g ( 22,9 rnmoll H-MeLeu-OMe.HBr, 335 ml (2,4,9 mmol] triethylaminu a 6,12 g (4'5,2 mmol] l-hydroxybenzotriazolu v 50 ml dimethylformamidu se za míchání a chlazení na 0°C přidá 5,13 g (24,9 mmol) dicyklohexylkarbodiimldu a v míchání se pokračuje ještě přes noc při teplotě 4 °C. Reakční směs se zpracuje obvyklým způsobem a produkt ' se vyčistí chromatografií na sloupci silikagelu za použití chloroformu jako elučního činidla. Zíiská se olejovitý produkt ve výtěžku 55,2'%.

RfD=0,83,

RfE^:=0,78, R_fH=0,79, R₍P = 0,80, Rf° =0,79.

f=O-7-_yHM<0

Šestihodinová katalytická redukce v přítomnosti 5% (hmotnost/ihmotnost] paládia na uhlí ve směsi methanolu a vody (8:2 objem/objem] obsahující 1 ekvivalent chlorovodíku.

Slupé ® β=Ο-γ ÍMU)

Produkt se vyčistí chromatografií na sloupci silikagelu za použití etheru jako elučního činidla.

OmÍ ® 2A=⁰--ríMj]

Roztok 4,85 g (6,69 mmol] Z-Tyr(Bzlj-D-Tyr(Mu)-Mueuu-OMu a 120,7 mmol hydrazinihydrátu ve 150 ml methanolu se nechá přes noc reagovat při teplotě místnosti. Hydrazid se vysráží přidáním vody, shromáždí se a krystaluje se ze směsi methanolu a vody. Výtěžek činí 91,1 %; teplota tání 129 až 131 stupňů Celsia,

RfD = 0,79,

RfE=0,60, RfF=O,68, RfH =01,73, R_fQ = 0,77.

Stupně®*® [Á=P--yfMej]

Pracuje se stejně jako ve stupních .

@ a ®

Produkt se překrystaluje ze směsi methanolu a etheru. Výtěžek činí 23,8 %, teplota tání 152 až 154 °C,

RfA=0,67,

RfB(=0,68,

RfC=0,58,

RfD = 0,59,

R_f H(=(0,50,

RfK=O,94,

Rf°=0,35.

Příklad 9 a 10

Za použití jednoho z obecných postupů (m] a (n], uvedených' v příkladech 1 až 8, je možno připravit následující sloučeniny:

Pracuje se stejně jako ve stupni

Příklad číslo	A	B	Papírová elektroforéza Rf (vztaženo	RfA
na ^libertn] pH 2,1	pH 6,5
9	D-Ser	Leu	0,94	0,96	0,25
10	D-Phe	MeLeu	0,84	0,87	0,35

Claims

PREDMET VYNALEZU

1. Způsob výroby poly.peptidů obec-ného vzorce I lurHis ^-Trp -ЗАГ-Туп-д-д ^-Ar^j-pr0^-E^-F ve kterém

A znamená D-Tyr, D-Tyr-(Me), D-Ser,

D-Serf(Bu^l), D-Phe, D-Ala nebo D-Trp,

B představuje Leu nebo MeLeu,

E znamená Azgly a

F představuje aminoskupinu, nebo (!)

A znamená Azgly nebo Azala,

B představuje Leu,

E je přímá vazba a£

F znamená ethylamtaoiskupinu,] a jejich farmaceuticky a veterinárně upotřebitelných adičních solí · s kyselinami, vyzna-i čující se tím, že se nechá reagovat1

-OH, Q1U-W--0H,

I—klu.-Hi s-Trp-OHj

LZgíu“Hís -Trp -Ser-OH)

-HifTrp-Ser-Tip-ArOH ^P~^OH

E^ll^-^řyís-^Trp-eB |тТуг-А- S-AI£-OH pebo nebo aktivní derivát libovolné z těchto látek, s

H-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F,

H-Tnp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F,

H-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F,

H-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F,

H-A-B-Arg-Pro-E-F,

H-B-Arg-Pro-E-F,

H-Arg-Pro-E-F,

H-Pro-E-F nebo

H-Azgly-NH2, nebo s aktivním derivátem libovolné z těchto látek, načež se popřípadě výsledný produkt v neprotonované formě reakcí s kyselinou poskytující farmaceuticky nebo veterinárně upotřebitelný anion převede na svoji sůl.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako aktivní derivát prvně zmíněné reakční složky použije azid.
3. Způsob podle bodu 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se použijí výchozí látky, v nichž

A znamená D-Ser (Bul ],

B představuje Leu,

E znamená Azgly a

F představuje aminoskupinu.