SU1116698A1 - Аналоги энкефалина, обладающие анальгетической активностью - Google Patents

Abstract

Аналоги энкефалина ойцей форму Tyr-DOrn-Gly-Phe-y X-J У ОН ОН ОН Pro Leu , где Asn Pro NH, обладающие анальгетической активностью . (Л

Description

Изо етение относитс  к новым бкологически активным соединени м аналогам энкефалина, обладающим анальгетической активностью, которые могут найти применение в медицине.

Энкефалин - природный антагонист опиатного рецептора в мозгу, был выделен и : тздентифицирован в виде смеси двух пентапептидов: H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH (метионинэнкефапин) и H-Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuOH (лейцилэнкефапин ). Оба пептида про вл ют морфиноподобную активность в опытах на специфических модел х опиатного рецептора, а также подавл ют стереоО

специфическое св зывание с рецептором, опиатного антагониста налрксона в го05 могенатах мозга. СО 00

Met- и Leu- энкефалина показывают анальгезию в течение 5-15 мин при внутрижелудочковом введении в мозг мыши .

Наиболее близким к описываемому соединению  вл етс  аналог энкефалина (D-Arg) - энкефапин, содержащий во втором положении D-изомер амино- ; кислоты с основными свойствами, про вл кнций анапьгетическую активность при внутримозговом введении и не обла дающий анальгезией при внутривенной введении. Цель изобретени  - поиск новых пеп тидных производных аналогов энкефа .лина, обладающих более высокой ана ьгетической активностью, чем известные природные знкефалины или их синтетические аналоги. Поставленна  цель достигаетс  опис ваемыми аналогами энкефалина общей формулы Tyr-DOrn-GVy-Phe-y X- Описываемые соединени  синтезируют известными методами пептидной химии в растворе согласно приведенной схемы с использованием активированных эфиров трет-бутилоксикарбониламинокислот . Дл  синтеза аналогов энкефалина ( 1) используют аминокислоты и их производные фирмы Reanal (Венгри ). Все аминокислоты, кроме D-opнитина , имеют L-конфигурацию. Температуру плавлени  веществ определ ли в капилл рах (без коррекции). Индивидуальность промежуточных соединений контролировали с помоисью ТСХ на пласт тинках Silufо1 (ЧССР),.Дл  хроматографии аналогов энкефалина примен ли стекл нные пластинки с закрепленным слоем силикагел  Silika Gel 60 F-254 фирмы Merck (ФРГ). Использовали следующие системы растворителей хлоррФорм - этанол - уксусна  кислота (АсОН) 85:10:5 (А); н-бутанол-пиридин-АсОН5-Н О 15:10:3:6 (Б); н-бутанол -/АсОН - 4:1:1 (В); хлороформ-метанол-АсОН-Н О 30:20:4:6 ( В); 60:18:2:3 (Г); н-бутанол-пиридин-АсОН-Н О 15:12:3:10 (D). Удельнов оптическое вращение пептидов измер ют на пол риметре Perkin Elmer 14Ш (США). Кислотный гидролиз провод т при 120С в течение 24 ч. Амин кислотный состав определ ют па йнали заторе 1во1-3. Дл  всех соединений дантш элемен ного анализа удовлетворительно совпадают с вычисленным содержанием С, Н и др.. Пример 1. N-трет-бутилоксикарбонилглицилфенилапанин (4). 11 6,6 г (АО ммоль) L-фенилаланина (2) раствор ют в 40 мл 1 н.раствора гидроокиси натри , добавл ют 3,34 г бикарбоната натри , 50 Ил диметилформаМИДа (ДМФА) и 16,94г (40 ммоль) пентахлорфенилового эфира трет-бутилоксикарбонилглицина (3), растворенного в 20 мл ДМФА. Смесь перемешивают в течение нескольких часов. После завершени  реакции (хроматографический контроль) реакционную массу разбавл ют этилацетатом и водой (до разделени  слоев), охлаждают до и подкисл ют 0,5 н. сол ной кислотой до рН 3. Этилацетатный слой отдел ют, водную фазу экстрагируют повторно. Объединенный этилацетатный слой промывают водой, насыщенной раствором хлористого натри , и сушат над безводным сульфатом натри . Кристаллический осадок, полученный после отгонки растворител , перекристаллизовывают из этилацетата с небольшой добавкой петролейного эфира. Выход дипептида (4) - 11,4 г (88%); т.пл. ПЗ-ПЗ С; + 15,7(с. 1 ДМФА); Rf 0,73 (А); 0,80 (В). Ы-трет-бутилоксикарбонилу .N -бен Рбонил-В-орнитилглицилфенилаланин (7). 10,9 г (33,8 ммоль) дипептида (4) раствор ют в 50 мл 70%-ного раствора трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане и вьщерживают 30 мин. Растворитель отгон ют, остаток растирают с эфиром, отфильтровывают, промывают эфиром на фильтре и сушат в вакууме над гидроокисью кали . Получают 10,4 г (91%) трифторацетатй дипептида (5), Rf 0,63 (В). 5,2 г (15,5 ммоль) трифторацета- та (5) раствор ют в 50 мл ДМФА, охлаждают до и при охлаждении добавл ют 2,65 4п (15,5 ммоль) диизопропилэтиламина в 5 мл ДМФА и 8,2 г ( 15,5 моль) пентафторфенилового эфира N -трет-бутилоксикарбонил, N бензилоксикарбонил-О-орнитика (6), растворенного в 15 мл ДМФА. Рейкционкую массу перемешивают несколько часов и после завершени  реакции обрабатывают аналогично соединению .4. Про . дукт, полученный после отгонки растворител , очищают на колонке с силикагелем фирмы Merck. Элюироваиие провод т в системехлороформ-эта олэтнлацетат-AcOH-HjiO 285:5:8:2:0,25. Соответствующие фракции собирают, упаривают и сушат в вакууме. Получают 5,9 г (67%) масла защищенного трипептида (7) с Rf 0,65 (А) 0,72 (Б). N,0-ди-тpeт-бyтилokcикapбoнилтирозил-К -бензилокси-карбонил-П-орнитилглицилфенилаланин (10). 20.0г (35 ммоль) трипептида (7) раствор ют в 100 мл 50% раствора три фторуксусной кислоты в дихлорметане и выдерживают в течение 20 мин. Раст воритель отгон ют, остаток растирают с эфиром,, Образовавшийс  осадок отфильтровывают , вновь промывают эфиро и высушивают в вакууме над гидроокис кали . , - - , . Получают 19,2 г (94%) трифторацетата трипептида (8) с Rf 0,62 (Д). 18.1г (31 ммоль) трифторацетата трипептида (8 раствор ют в 100 мл , охлаждают до добавл ют при перемешивании 5,3 мл (31 ммоль) диизопропилэтиламина в 10 мл ДМФА и 16,6 г (31 ммоль) пентафторфенилового эфира Н,0-ди-Вос-Ь-тирозина (9). Реакционную массу- перемешивают 1,5-2 часа (хроматографический контроль) и после завершени  реакции обрабатывают аналогично соединению 4 Продукт, полученный после отгона этилацетата, размешивают с эфиром и охлаждают. Выпавший осадок отфильтро вывают, промывают эфиром и сушат в эксикаторе. Выход 16,0 г (62%) запощенного тетрапептида (10); Rf 0,75 (А), 0,55 (Б Merck); + 5,6 (с.IjДМФА) N-0-ди-трет-бутилоксикарбонилтирозил- К - (М -бензилоксикарбонил-. пролин)J D-орнитилглицилфенилаланин ( К 18 г (2,2 моль) защищенного тет рапептида (10) в 150 мл метанола, 15 мл АсОН и 20 мл воды добавл ют палладиевую чернь и гидрируют в тече ние нескольких часов. Катализатор от фильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растирают с эфиром и фильтру ют, затем дважды переосаждают из спирта эфиром, вновь промывают эфиром и сушат в вакууме над гидроокисью кали . Получают 13,8 г (91%) тетрапептида ( 1 1 ) с Rf 0,15 (А); Rf 0,72 (В, Merck). 5,1 г (6,8 ммоль) тетрапептида (II) раствор ют в 100 мл ДМФА и при перемешивании и охлаждении добавл ют 1,16 МП (6,8 ммоль) диизопропилэтиламина в 3 мл ДМФА и 2,8 г (6,8 ммоль) пентафторфенилового эфира Ы-бензилоксикарбонил-Ъ-пролина растворенного в 15 мл ДМФА. Через 2-3 ч реакцигнную массу обрабатывают аналогично соединению 9. Продукт, полученный после отгонки растворител , очищают на колонке с силикагелем фирмы Merck. Элюирование провод т в системе хлороформ-этанол-этилацеTaT-AcOK-Hj ,0 185:5:8 2:0,25. Соответствующие фракции собирают, упаривают и сушат в вакууме. Получают 4,3 т (68%) защищенного пентапептида (12) 17° (с. 1, ДМФА); Rf 0,79 (В. Merck); 0,65 (Г. Merck)Ы ,0-ди-трет-бутилоксикарбонилтиро-., (Ы -бензилоксикарбонил-лейцил ) D-орнитилглицилфенилаланин (13). Из 5,1 г (6,8 ммоль) тетрапептида (11) п 3,5 г (6,8 ммоль) пентахлорфенилового эфира Ы-бензилоксикарбонилL-лейцина получают пентапептид (13) аналогично соединению 12. Выход 4,8 г (74%) белого порошка защищенного пентапептида(13) ( -5 (с. 1,ДМФА); Rf 0,80 (А); 0,84 (В). N-0-ди-трет-бутилоксикарбонилтирозш1- Ы -(N -бензилоксикарбонилacпapaгинил )J-D-орнитилглицилфенилаланин (14). Из 5,1 г (6,8 ммоль) тетрапептида (П) и 3,3 г (6,8 ммоль) нитрофенилового эфира N-бензилоксикарбонил-oi аспарагина получают пентапептид (14) аналогично соединению 12. Выход 4,7 г (70%) белого порошка защищенного пентапептида (14); + + 8,2(с.1, ДMФA);Rf 0,83 (Б). л Тирозил-(Н -пропил)-0-орнитилглищшфенилаланин (1). К 300 мг (0,32 ммоль) защищенного пентапептида .12 п 20 мл метанола, 2 мл АсОН и 0,5 мл воды добавл ют палладиевую чернь и гидрируют в течение 2-3 ч. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растирают с эфиром и сушат в вакууме над гидроокисью кали . Полученный продукт раствор ют в 5 мл 70%-ного раствора TFA в хлористом метилене и выдерживают в течение 30 мин. Растворитель отгон ют и остаток растирают с эфиром. Образовавшийс  осадок отфильтровывают , повторно промывают эфиром и су- шат в. вакууме. Полученный продукт очищают высокоэффективной жидкостной хроматографией на хроматографе Du Pont-830. Элюированне осуществл ют смесью этанол- О, I н.раствора ацетата аммони  20:80. Соответствующие фракции собирают и лиофилизуют. Вы- ход 70 г (37%) разветвленного пентапептида аналога энкефалина (I)} Coijg-f 41 (с, 1; 0,2 и АсОН); Rf 0,30 (Б) 0,74 (В), аминокислотый состав:. Gly 1,00; Туг 0,93; Phe 1 ,10; Oru 0,93; Pro 1,03. «

Пример 2. Тирозил-(Ы -лейцш1 )-Б-ррнитш1глицш1фенилаланин (1°)

700 мг (0,73 ммоль) защищенного пентапептида (13) обрабатывают аналогично соединению 1а. Получают 205 мг (А6%) разветвленного пентапептида аналога энкефалина (1); foijf + 52 (с. 1; 0,2н. АсЦН); Rf 0,60 (Б), 0,50 (В), аминокислотный состав: Gly 1,00, Туг 0,95, Phe 1,26, Orn 0,98, Leu 1 ,05.

Примерз. Тирозш1-(М -аспарагинил )-В -орнитилглицилфенилаланин (I).

700 Mt- (0,73 ммоль) защищенного пентапептида (14) обрабатывают аналогично соединению l. Получают 270 мг (60%) разветвленного пентапептида аналога энкефалина (1); Ijyi + 37(с. 1; 0,2 н АсОН); Rf ,0,42 (В); Rf 0,8 (Д),аминокислотный состав: Gly 1,00; Туг 0,89; Phe 1,13; Orn 0,97; Asn 1,09.

П р и м е р 4. 0-ди-трет-бутилоксикарбонил-тирозил-Ы- (Ы-бензилоксикарбонш1-пролил )-Б-орнитил-глицил-фенилаланииамид (15).

К раствору 0,50 г (0,54 ммоль) соединени  (12) в 3 мл ДМФА добавл ю 0,08 г (0,54 ммоль) аммониевой соли L-окси бензотриазола и 0,11 г (0,54 ммоль) дициклогексилкарбодиими да. Реакционную смесь оставл ют на ночь, отфильтровывают и обрабатывают аналогично соединению 4. Получают 0,46 г (91%) запущенного амида пентапептида 15 с Rg 0,48 (А.Мерк).

Тирозил-(N -пролил)-D-орнитилглицилфенилапанинамид (I )..

К 0,28 г (0,30 ммоль) защищенного пептапептида (15) в 20 мл метанола, 2 МП АсОН и 0,5 мол воды добавл ют палладиевую чернь и гидрируют в течение 2-3 ч. Катализатор отфильтровывают , фильтрат упаривают. Остаток растирают с эфиром и сушат в вакууме

над гидроокисью кали . Полученный продукт раствор ют в 5 мл 70% раствора TFA в хлористом метилене -и выдерживают в течение 30 мин. Растворитель отгон ют и остаток растирают в с эфиром. Образовавщийс  осадок отфильтровывают , повторно промывают эфиром и сушат в вакууме. Полученный продукт очищают высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке Zorbax-Co. Элюирование осуществл ют смесью этанола и 0,1 М раствора ацет та аммони  5:95. Соответствующие фраи ции собирают и лиофилизуют. 90 мг (50%) разветвленного амида пентапептида (1) ; foiU +20(с.1; О,2 н АсОН); Rf О,53 (В), 0,22 (В, Мерк), аминокислотный состав,%: Туг 0,86; Gly 1,00; Phe 0,91; Orn 0,92; Pro 1,08.

Проведены испытани  биологической активности описываемых соединений

).

Анальгетическую активность опреде ли по методу H.Ueda et. al.

В работе бьши использованы беспородные мыши-самцы массой 18-22 г. сследй емое вещество, растворенное в стерильном физиологическом растворе, вводили при помощи У-образной иглы в isterna mague мозга неанестезированым мьщ1ам в количестве 10 мкл. Исслеовалс  диапазон доз от 0,25 до , . 10 мкг/животнс е дл  (l) , от 0,25 о 100 . мкг/животное дл  аналогов энкефалина (1) и (I) и от 0,05 до. 0,5 мкг/животное дл  (1). Контрольным животным вводили 10 мкл стерильного физиологического раствора. При внутривенном введении препарат вводилс  в хвостовую вену мьшей в диапазоне доз от 10 до 100 мг/кг( дл  соединени  I от 15 до 25 мкг/кг). Кажда  экспериментальна  группа состо ла из 8-10 . Анальгетическую активность оценивали по методу Buescher при помощи артериального зажима , накладываемого на основание хвоста , бпределение болевой реакции проводилось через 5,15,30,60 и 90 мин йоеле введени  и затем каждые 30 мин до исчезновени  анальгетической реакции .

Результаты выражены альтернативным методом (процент мьш1ей, показавптх анальгетическую реакцию). При вычислении КД (эффективна  доза исследуемого вещества, котора  вызы 111 вает анальгетический эффект у 50% подопытных животных) использован метод Литчфилда и Уилкоксона. Анальгетическа  активность исследуемых соединений приведена в табл. и 2. Синтезированные аналоги энкефалина с разветвленной пептидной цепью () обладают выраженной аиальгети ческой активностью. Максимальный эффект наблюдаетс  на 5-15 (I ,1), либо на 5-30 мин (I,) после введени . Анальгетическа  активность аналогов () значительно превышает активность природных энкефалинов (соединени  6,7 в таблице 1) активность (Е-Аг§)-Ьеигэнкефалина (соединение 5, табл.1). Анальгетический эффект новых аналогов энкефалина ( в 1,5-2 раза и (I) в 6 раз выше анальгетического эффекта морфина в мол рных соотношени х при интрацистер напьном введении мышам (см.табл.1). По продолжительности анальгетического действи  соединение I превосходит мо соединение I - в 1,5 ра фин в 3 раза, за, В отличие от природных энкефалинов и от соединени , вз того дл  сравнени ..0 и при внутривенном введении. Анальгетическа  активность энкефалинов при интрацистернальном введении .№Ш1ам (метод tail pirch) эти аналоги активны при внутривенном введении (см.табп.2). Аналоги энкефалина обладают анальгетической активностью в интервале от 18 до 69% анапьгетического эффекта морфина при внутривенном введении мьш1ам. Сравнение терапевтических индексов и широты терапевтического действи  описываемых соединений (таблицы 3 и 4) с теми же параметрами их ближайшего структурного аналога. Tyr-DArg-Gly- . -Phe-Leu показывает, что описываемые соединени  малотоксичнь и превосхо,7 д т известное соединение по широте терапевтического действи  и терапевтическому индексу при интрацистернальном введении мышам. Описываемые соединени  про вл ют. высокую активность при внутривенном введении мьш1ам, известное соединение, вз тое дл  сравнени , при таком.способе введени  неактивно. I. Проведенные исследовани  показали, что описываемые соединени  малотоксичны и превосход т по анальгетической активности известные соединени , при этом их. активность сохран етс  Таблица

)

при Данные по активности (ЕД;, приведены из литературного источника (3) . .

Анальгетическа  активность энкефалинов и его разветвленных аналогов при внутривенном введении мышам (метод tail pitch)

доэа пептида (нкг/г-1вотное), котора  еше не вызывает токсических эффектов и снерги животных , следоаательни, терапевтический индекс (.ТИ) составл ет величину больвую, чем приведеивое в тавЯнпе отношение, что достаточно дн :создани  терапевтического средства.

доэа пептида, выэываю|Еа  смерть 20Z животных

Даэа пептида, еце не вызывающа  токсических эффектов, следовательно ТИ больве, чей пр веде  ое соотновение

Доза пгптида, вызывающа  сйерть 402 животиых, следовательно ТИ больве 10,2. Доза пепти/-. , вызывающа  смерть 50t животных, следовательно ТИ составл ет 12,5.

Т а б л и ц а 2

Терапевтическа  широта действи  описываемых аналогов Доза пептидов (мкг/животное), которые еще

ности, следовательно, терапевтическа  широта (Till) превьшает приведенные в таблице отношени .

Доза соединени  11, вызывающа  смерть 20% животных.

Максимальные исследованные дозы, которые еще не вызывали токсических эффектов , следовательно, ТШ превьшает приведенные отношени .

Доза соединени , вызывающа  смерть30% животныхДоза соединени  I г, вызывающа  смерть 50% животных.

Т а б л и ц а 4

энкефалина не вызывают признаков токсич1116698

ЛОгп&1у

Туг

Phe

Claims (1)

1. Аналоги энкефалина общей форму- ’

   Туг-1)0гп-С1у-РЬе-у

   а X У I Рго ОН т 5* где I 1^В Ьеи ОН Азп ОН I² Рго νη₂ обладающие анальгетической активно-

   СТЬЮ.

   со оо