Způsob výroby Lripeptidamidů obecného vzorce I (I) ve kLoré znečí
X L-norleucylovou skupinu, L-leucylovou skup .inu, L-norvalylovou skupinu, D-leucylovou skupinu, L-prolylovou skupinu, L-2-aminobutyrylovou skupinu, L-valylovou skupinu, L-threonylevou . skupinu, L-isoleucylovou skupinu,L-2-auinodekanoylovou skupinu, L-cyklohexylelanylovou skupinu nebo Lterc·butyiserylovou skupinu a
Ϊ L-prolylovou skupinu, nebo
X ^híLtidylovou skupinu a
Ϊ L-hoαlirlly0oюu sI^i^i^í^u nebo D-pipekolyXovou skupinu a
A vodíkový atom nebo alk/lovou skupinu s 1 a 10 uhlíkovými atomy nebo alkylovou skupinu subst^nc vanou dimetlýl·eminový® zbytkem a 1 až 3 uhlíkovými atomy v elkylové části, když ale X značí L-Iouc/Iovou skupinu, potom má A význam jiný než vodíkový atom, jakož i terapeuticky použitelných komplexů těchto sloučenin, spočívá v tom, že se amid aUnotyssliny obecného vzorce Y-NH-A, ve kterém mají Y a A shora uvedený význam, acylujs pojpřípadě chrání frýta L-ominotyselinovjm zbytkem požadovaným pro subetituent X a získaný dipeptid se acylujs L-pyoglu239907
Lemovou kyselinou, popřípadě jejím chráněným a/nebo aktivovaným derivátem a popřípadě se ochranná skupina odštěpí.
Vynález se týká způsobu výroby nových, na centrální nervový systém působících tripejtidamidů obecného vzorce I
Glp-X-Y-NH-A (I), ve kterém značí
X b-norleucylovou skupinu, D-leucylovou skupinu, ]>norValylovou skupinu, D-leucylovou skupinu, D-prolylovou skupinu, L-2-aminobutyryLovou skupinu, L-valylovou skupinu, L-threonylovou skupinu, L-isoleucylovou skupinu, L-2-aminodekanoylovou skupinu, L-cyklohexylalanylovovou skupinu nebo L-tercbutylserylovou skupinu, a
Ϊ L-prolylovou skupinu, nebo
X L-histidylovou skupinu a ϊ L-homoprolylovou skupinu nebo D-pipekolinovou skupinu a
A vodíkový atom nebo alkylovou skuoinu s 1 až 10 uhlíkovými atomy nebo dimethylaminoskupinou substituovanou alkylovou skupinu s 1 až 3 uhlíkovými atomy v alkylové ’ části, když ale substituent X .značí L-leucylovou skupinu, potom A naznačí vodíkový abom, jakož i komplexů uvedených sloučenin.
Nové tripeptidové deriváty odpovídající výše uvedenému obecnému vzorci I jsou analogy L-oyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamidu (Glp-His-Pro-NHg), známého také jako thyreotropin-releasing hormon (TRH), ve kterém je ale jedna aminokyselina a sice L-histidylová skupina stojící na druhém místě‘řetězce, nebo na třetím místě řetězce stojící L-prolylová skupina, nehrazena jinou aminokyselinou, definovanou ve výše uvedeném obecném vzorci I.
Existence TRH byla známa již od šedesátých let tohoto století, její struktura však byla objasněné teprve v letech 1969 a 1970 prakticky současně, ale navzájem nezávisle, výzkumnými skupinami R. Guillemina a A. Schally (Bowers C.Y. a kol., Endocrinology 86, 1143 /1970/; R. Burguc a kol., C. R. Acad. Sci., Paris, 269, 1870 /1969/).
Tripeptid TRH byl původně popsán jako regulační faktor uvolňování thyreotropního hormonu (TSH) v hypofýze savců; výzkum zabývající se tímto hormonem se však dal novým směrem, nebot se zjistilo, že biologická funkce tohoto tripeptidu není omezena pouze na uvolňování thyreotropního hormonu, nýbrž spočívá také v působení na centrální nervový systém (viz N. P. Plotnikoff a kol., Science 178, 417 /1972/¼ A. J. Prange a kol.M Lancet 2, 999 /1972/). Bylo totiž zjištěno, že TRH vedle funkce hormonové způsobuje toká podstatné zkrácení doby spánku způsobeného barbituráty nebo alkoholem, dále také redukuje hypothermii způsobenou různými léčivými prostředky a zvyšuje lokomotorickou aktivitu. Další důležitý faktor působení TRH na centrální nervový systém je potlačování katalepsie způsobené Halopéridolem. Jeví se tedy jako Žádoucí, vyrobit pro terapeutickou praxi takové analogy TRH, které· působí na hypofýzu pouze slabě a naproti tomu by mělo být působení na centrální nervový systém stejné jako u TRH, nebo ještě vyšší. Za tímto účelem byly vyrobeny sloučeniny podle DE-OS č. 2 343 035, DE-OS č. 2 343 037, DE-OS č. 2 449 167, DE-OS č. 2 5U 381, DE-OS Č. 2 609 154, DE-OS č. 2 639 393 a BE-PS č. 819 198. Dosavadní výzkum, týkající se tohoto problému a jehož výsledky a postupy.·jsou zahrnuty v precech A. J. Prenge a kol.
The role of Hormones in Depression , Life Sciences 20 , 1305 /1977/ а А. V. Schally a kol., Hypothalmic Regulátory Hormones , Ann. Rev. Biochem. 47, 89 /1978/, nevedl ale ze všech hledisek к uspokojivým výsledkům, které by vedly к uspokojení ootřeb terapeutické praxe.
Nyní bylo zjištěno, že se systematickou výměnou některých aminokyselin z eminokyselin, které tvoří molekulu TRH, může dosáhnout toho, že hormonové působení tripeptidu se zcela odstraní nebo alespoň podstatně zredukuje, přičemž účinek na cetrální nervový systém zůstane stejný, nebo »se dokonce podstatně zvýší.
Jako obzvláště výhedné se jeví takevé deriváty, ve kterých je namísto L-histidylevé skupiny v poloze 2 alifatická aminokyselinová skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem· Taková analoga TRH vykazují při prakticky úplném potlačení hormonového působení účinek, který mnohokrát převyšuje účinek TRH na centrální nervový systém. Výhodná jsou dále taková analoga TRH, ve kterých zůstává L-histidylová skupina v poloze 2 nezměněna, v poloze 3 je však L- pro ly Levá skupina TRH zaměněna za i.b-homo přely levou skupinu nebo za D-pipekolyiovou skupinu.
Při výrobě nových tripeptidamidů obecného vzorce I, se podle vynálezu vychází z amidu aminokyseliny substituovaného na místě Y aminokyselinovou skupinou požadovanou v konečném produktu, obecného vzorce
Y - NH - A , ve kterém má Y a A význam uvedený výše u sleučeniny obecného vzorce I, z toho amidu se potom postupně syntetisuje pomocí method běžných v chemii peptidů nejprve L-eminokyselina požadovaná pro SAbstituent X v konečném produktu a .nakonec L-pyreglutamylevá skupina ležící v poloze 1 konečného produktu. Potom se popřípadě odštěpí při uvažované kopulační reakci používané ochranné skupiny.
Výše uvedeným způsobem vyrobené tripeptidamidy obecného vzorce I se mohou z reakční směsi isolovat krystalisací nebo lyefilisací; pokud je to žádoucí, mohou se získané produkty běžnými způsoby převést na komplexy.
Při stupňovité probíhající výstavbě tripeptidové molekuly se výhodně nechají reagovat výchozí sloučeniny obecného vzorce
Y - NH - A;
ve kterém mají Y a A výše uvedený význam, v přebytku s aktivovaným derivátem, výhodně s pentafluorfenylesterem nebo popřípadě se smíšeným anhydridem chráněné aminokyseliny obecného vzorce
Boc-X-OH, ve kterém má X výše uvedený význam. Při použití pentafluorfenylesteru se získají odpovídající chráněné dipeptiůové deriváty obecného vzorce
Boc-X-Y-NH-A ve kterém mají X, Y a A výše uvedený význam, v podstatně kratší reakční době, totiž v průběhu několika minut, přičemž produkt se může isolovat velmi lehce a většinou ve formě, která nevyžaduje dalšího čištění. Z, tímto způsobem získaných, chráněných dipeptidovýcn derivátů se mohou získat pomocí acidoíysy odpovídající a na své koncové skupině volné dipeptidy obecného vzorce.
H-X-í—A, ve kterém mají X, Y a A výše uvedený význam; tyto se nechají reagovat s L-pyroglutamovcu kyselinou, chráněnou pentafluorfenylesterem, obecného vzoree
Z-Glp-OPFP, ve kterém má Z výše uvedený význam, přičemž se získá chráněný tripeptiid obecného vzorce
Z-Glp-X-Y-NH-A, ve kterém má Z, X, Y a A výše uvedený význam, ze kterého se ochranná skupina Z výhodně odstraní katalytickou hydrogenací.
Čištění získaného konečného produktu se může provádět jednoduchou krystal!sací nebo vysrážením, pokud je to nutné, může se také použít chromatografie na sloupci. Konečný produkt se může popřípadě po odstranění vedlejších produktů také vypreparovat jednoduchou lyofilisací.
Tripeptidové deriváty obecného vzorce I, vyrobené podle vynálezu se zkoušejí podle dále popsaný biologických method na svůj farmakologický účinek.
1. Potlačení haloperidolové katalepsie u krys (viz *J. Delay a P. Deniker: Cpníbt. Rend. Cong. Med. Alenistes Neurologistes, j.9, 497, Luxemburg 1952).
m&''kg На _ . „cridih..:, .cž je 4-(p~chlorf myll-l- z3-(p-fluorbenzoyl)propyl/- piperiain-aJL se aplikuje zsířa 7... ndkožně a po uplynutí 120 ainnz se kontroluje nástup katalěpsle. Potom sa krysy rozdělí ·' . u.*upin vždy po 10 kussch a intravenosné se jim podává dávka TRH, popřípadě dávcs nových .nniogú TRH podle vynalezu. Zvířatm kcniroiní skupiny se podává fyziologicky roztok idu sodného. V intervalu 15, 30, 90 a 120 minut po podáni se zkouší účinek jednotlivých sloučenin, snižující katalepsii, Jako kataleptická jsou posuzována ta zvířata, která, kiy* jsou es jejich přední nohy dají na 7 cm vysoký sloupek, nezmění. během 30 sekund svojí -osičí,
Z počtu zvířat, která nevykazují katalepssi, se zjistí pro jednotlivé účinné 'Látky 'pomocí probit-analysy odpovítidaící hodnoty 3D-50. Uvedené pokusy se provádějí se samci krys o celkové hmotnosti 160 až 160 g.
2. Stupňování lokomo'Joгické aktivity u oIí, způsobené L-Dopa (viz The Tlhyroid Ais, Druga nad Behavior, str. 116, A. J. Prage Jr>, Raven Press, New York, 1974).
Zvířata se nejprve intrαperiSoneálné podá 40 mg^kg N-meethy.-M-propargylbenzyl aminu (Par^Hn), potom 20 m^kg TRH, popřípadě stejná dávka zkoušených nových trPpepiídaoidt podle vynálezu a nakonec 100 mm/kg L-Dopa. Vždy po 30, 60 a 90 minutách po výše uvedeném zpracování se oOM loko^o©rieká aktivita pokusných zvířat. Zjištěné hodnoty jsou uvedeny v náj^le^i^ující tabulce udané v procentech, ve vztahu ke zvířatm zpracovaných TRH. K tomuto pokusu se pouuije vždy 15 mmH-ch samců o celkové hmotnost vždy 18 až 22 g.
3. Účinek obraceeící reserpinovou hypothermii u mrší (viz Β. M. Askew: Life Sci. 2, 725-730/19633).
Myším samcům o hmSnosti 18 už 22 g rozděleném do skupin po 10 zvířatech, se intrapetLí □reálně podá 5 mg/kg reserpinu. Po 16 hodinách se těmto zvířatim dále podá TRH v dávce 20 кУ«8» popřípadě . stejné mnoství nových tršpeptddimidů podle vynálezu.
Rkkální teplota zvířat se mmří před aplikací reserpinu (v následnicí tabulce označeno noim’9» po '6 hodinách po aplikaci reserpinu (v následuuící tabulce označeno res) a po jedné, popřípadě po dvou hodinách po podiájni zkoumaného ti'p[^<^p>idami^du (v tabulce oznaČsuo po zpr.). V táto tabulce jsou uváděny průměrné teploty naměřené u všech deseti myší. ·
4. Olivnění doby spánku způsobeného hexoberbitαleo.
Myším samcům, rozdělezým do skupin po 10 zvířatech se intravenosné podá vždy 60 m^pkg hexobbabbtalu-Na. Po 10 minutách se myším podá dávka vždy 20 mmpkg TRH, popřípadě zkoumaných tripepidčamidů podle vynálezu, což se provede intraperitotálně. V následnicí tabulce jsou uvedeny hodnoty doby spánku takto ošetřených zvířat, vztaženo na dobu spánku zvířat kontrolní skupiny (vždy průměrná hodnota pro 10 zvířat).
S^anolo^ narkóza (viz J. M. Cott a kol.; J. Phanmaol, Exp. Ther., 196, 594/1977/)?
Myším CFLP (LATI) obou pokhavi, rozdělerým do skupin po dvaceti zvířatech o hooSnosti 18 až 22 g se intraperiS<nιedLné podá vždy 4,5 g ethylalkoholu. Po 10 minutách se potom zvířeům podá dávka vždy 20 m^/kg zkoumaného tripeoiiaamidu. podle vynálezu intraperitoneálně. V následnicí tabulce jsou uvedeny doby spánku takto ošetřených zvířat, vztažené na doby spánku zvířat k^Jntrslní skúpiny (vždy průměrná hodnota pro 20 zv!řat),
6. Hormonová aktivita (účinek TSH u krys.
Krysí samci o hmoSntsti asi 200 g se rozdělí do skupin po 7 až 8 kusech a intrаvлnssnS se jim aplikuje vždy 20 m^kg TRH,posřípаdé 'koumaného tripeptidu;_ 15 minut po aplikaci
239907 se zjiStuje TSH-reakce u zvířat radioimunologicky z plazmy. Relativní výšky účinku se spočítají podle čtyřbodové metody za pomoci počítače, přičemž výška účinku TRH se uvažuje jako 100.
Biologické účinky důležitějších sloučenin obecného vzorce I, zjištěné výše popsanými farmakologickými metodami, jsou zahrnuty v následující tabulce.
T a b u 1 к a
Glp-X-X-NH-A |
Potlačení haloperidolové |
Stupňování lokomotorické aktivity L-Dopa |
THS-účinek |
X |
Y |
A |
katalepsie
ED50 (mg/kg) |
doba (min) |
v %
30’ |
DO
60’ |
90’ |
Nva |
Pro |
H |
И,4 |
120 |
254 |
156 |
214 |
0 |
Nleu |
Pro |
H |
16,8 |
120 |
249 |
105 |
112 |
’ 3,8 |
Leu |
Pro |
Et |
56,6 |
30 |
102 |
90 |
201 |
0 |
His |
HPro |
H |
13,7 |
120 |
209 |
85 |
110 |
68,6 |
Abu |
Pro |
H |
80 |
15 |
27 |
14 |
18 |
0,02 |
|
TRH |
|
80 |
15 |
100 |
100 |
100 |
100 |
T a |
bulka |
(pokračování) |
|
|
|
|
|
|
Glp-X-Y-NH-A |
Obrácení |
reserpinové hypothermie |
doba spánku |
doba spánku |
|
|
rektální |
teplota |
°C |
|
po hexobar- |
po ethanolu |
X |
Y A |
norm. |
res. |
po
1 h |
zprac.
2 h |
bitalu
% |
% |
Nva |
Pro H |
36,2 |
25,9 |
36,4 |
32,0 |
114 |
77 |
Ileu Pro H |
36,3 |
27,1 |
37,6 |
32,0 |
77 |
74 |
Leu |
Pro Et |
36,2 |
28,7 |
30,7 |
33,4 |
126 |
65 |
His |
Hťro H |
36,5 |
28,5 |
35,3 |
35,4 |
63 |
114 |
Abu |
Pro H |
36,3 |
19,7 |
22,2 |
25,4 |
84 |
39 |
|
TRH |
36,2 |
25,9 |
35,5 |
30,2 |
56 |
35 |
Doba hexobarhitalového spánku (X + SE) : 38,4 + 1,36 min. Doba ethanolového spánku (Я + + SE) : 46,9 * 2,17 min.
Z údajů uvedených v tabulce je zřejmé, že výměnou histidinu za alifatickou aminokyselinu s přímým nebo rozvětveným uhlovodíkovým řetězcem v molekule TRH, nastává zánik nebo minimálně podstatná redukce vylučování thyreotropního hormonu, přičemž například potlačení katalepaie způsobené Haloperidolem je 2 až 7krát silnější. Některá nová analoga TRH podle vynálezu vykazují rovněž značné potencování lokomotorické aktivity, popřípadě redukování spánku způsobeného hexobarbitalem nebo ethylalkoholem. Je také pozoruhodné, že nová analoga TRH, která obsahují histidin, vykazují sice asi 70 % hormonového působení, současně však mají značné účinky na centrální nervový systém.
Nové tripeptidy, jakož i jejich farmaceuticky použitelné soli, popřípadě komplexy, vyrobené způsobem podle vynálezu, se mohou používat v terapii ve formě běžných farmaceutických preparátů. Tyto farmaceutické preparáty obsahují účinné látky podle vynálezu ve společnosti s anorganickými nebo organickými nosnými substancemi, vhodnými pro parenteráiní nebo enterálni aplikaci. Farmaaeutické preparáty se mohou připravit například ve formě'pevných lyofilisátů, u kterých se mohou pouUít jako nosné substance s peptidy nereagující sloučeniny, například uhlohydráty. Tyto preperáty se však mohou připravovat také ve formě koncentrovaných nebo zředěných suspenzí nebo emulii, ve formě tablet, nebo injekčních preparátů.
Praktické provedeni způsobu podle vynálezu, popřípadě chemická výroba novýcn analog TRH podle vynálezu, je blíže objasněna v následujících příkladech provedeni. V těchto příkladech používané zkratky odppoídeaí běžným konvenčním zkratkám používaným v chemii peptidů (viz J. Biol. Chem. 247, 977 /1972/). V následujících příkladech se oouužvaaí ještě další zkratky :
Ada |
kyseinne I--2crmnnodikanová |
Abu |
kyseMna L-2-aminomáselná |
Cha |
L-cyklohejqryalanin |
píp · |
kyselina L-pipekolinová |
HPro |
L-homooproin |
DAE |
2-dime thylaminoo etyl- |
DCC |
dicyklohexylkarbodiimid |
PFPOH |
pentafllsrftosl |
DCU |
dicyklohexylmočovina |
DMFA |
dimethylformamid |
|
Teploty tání jednotlivých sloučenin, uváděné v jednotlivých příkladech provedenn,by- |
ly určovány pomocí přístroje pro měření bodů tání podle dr. Trttoliho. Hodnoty optické otáčivosti byly určovány na polarimetru. Při měření pomocí chromaaoégafie na tenké vrstvě se používaly k pokusům destičky silikagelu G podle Stahla. K vbíjení chromatogramů se používají následující sm^í^iL rozpouštědel :
(1) chloroform : methylalkohol 9 : 1 (2) ethylester tyseliny octové : (pyridin : kyselina octová : voda) 9 : 1 : 6 : 11 (3) ethylester tyseliny octové : (pyridin : kyselina octová : voda) 8 : 2 : 6 : 11 (4) ethylester kyseliny octové : (pyridin : kyselina octová : voda) 3 : 2 : 6 : 11
K vyvíjení skvrn se používá roztok ninhydrinu, přičemž po postříkání se destičky suší po dobu asi 5 minut při teplotě 105 °C . Potom se chromatogramy uloží do prostředí s obsahem chloru a po vyrětrání se vysejí roztokem s-tslidinkallmjsdidl.
Pro čištění za pomoci chromaaoogafie na sloupci se používá silikagel G o velikosti částic 0,062 až 0,2 mm.
Pro odpařování roztoků ve vakuu se · Douuívá rotační vakuová odparka, ořičemž odpařování se provádí při teplotách 50 °C.
Pennaf ^ог^пуУсб^г aminooyysein, chráněných BOC, se připraví pommci metody L. Kisfaludy a koo., Aoo. И973, 1421.
Bližší podrobnnoti výroby nových analog TRH podle vynálezu, jsou patrné z následujících příkladů provedení.
Příklad 1
L-pyroglutamyl-L-norleucyl-L-prolinamid stupeň 1 hydrochlorid L-norleucyl-L-prolinamidu
2,28 g (20 mmol) H-Pro-NH^ 8 3,97 g (10 mmol) BOC-NLe-OPFP (viz Kisfaludy a kol. Hoppe-Sayler's Z. Physiol. Chemie 359, 887 /1978/) se rozpustí ve 40 ml dimethylformamidu a po 5 minutách stání se tento roztok ve vakuu odpaří. Jako zbytek získaná olejovitá kapalina se rozpustí v 50 ml chloroformu a takto získaný roztok se nejprve třikrát protřepe vždy 10 ml IN roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát vždy 10 ml IN roztoku hydrogen uhličitanu sodného a nakonec 10 ml vody. Nakonec se vysuší bezvodým síranem sodným a odpaří. Zbytek po odpaření se rozpustí v 5 ml ethylesteru kyseliny octové a získaný roztok se smísí s 10 ml 5N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové. Po 30 minutách stání se reakční směs zředí diethyletherem, vyloučená sraženina se odfiltruje a ve vakuu se vysuší pomocí bezvodého hydroxidu sodného. Tímto způsobem se získá 2,48 g H-Nle-Pro-NHg> coí odpovídá 94 % teoretického výtěžku, vztaženého na BOC-Nle-OPFP; Rf(4) = 0,20.
Stupeň 2 benzyloxykarbonyl-L-pyroglutamyl-L-norleucyl-L-prolinamid
1,05 g (4 mmol) H-Nle-Pro-NHg. Hel se rozpustí v 10 ml dimethylformamidu a získaný roztok se za míchání a chlazení ledem smísí s 0,56 ml (mmol) triethylaminu a 1,89 g (4,4 mmol) Z-Glp-OPFP. Po pětiminutovém míchání se přidá dalších 0,56 ml (4 mmol) triethylaminu, načež se reakční směs míchá po dobu dalších 20 minut a nakonec se ve vakuu odpaří do sucha. Zbytek po odpaření se rozpustí ve 40 ml chloroformu a získaný roztok se protřepe nejprve dvakrát vždy 10 ml 1N kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát vždy 10 ml IN · roztoku hydrogen uhličitanu sodného a nakonec jednou 10 ml vody. Potom se tento roztok vysuší bezvodým síranem sodným a ve vakuu se odpaří. Jako zbytek získaná olejovitá kapalina se pomocí diethyletheru přivede ke krystalizaci a takto získaný surový produkt (1,52 g) sn preKrystalířuje z 8 ml ethylesteru kyseliny octové. Tímto způsobem se získá 1,36 g Z-Qlp-Nle-Pro-HH2, což odpovídá 72 % teorie.
T. t. - 146 až 148 °C; Rf(3)_= 0,32;
-79,8° (с = I, kyselina octová);
analýza pro ^24^32θ6^4 ^m°Tekulová hmotnost 472,55): vypočteno : C 61,00 % H 6,85 % N 11,86 % zjištěno : C 60,90 % H 7,04 % N11,87%.
Stupeň 3
L-pyroglutamyl-L-norleucyl-L-prolinamid
1,16 g (2x46 mmolů) Z-Glp-Ne-Pro-NH2 se rozpustí ve 25 ml methylalkoholu a tento roztok se smísí s 0,2 g 10 % paládiového katalyzátoru na aktivním uhlí. Potom se do této reakční směsi zavádí po dobu 30 minut plynný vodík, po ukonční hydrogenece se katalyzátor odfiltruje a filtrát se odpaří. Pevný amorfní zbytek se rozetře diethyletherem a odfiltruje» Tímto způsobem získaný surový produkt (0,72 g) se rozpustí ve vodě, roztok se vyčeří pomocí aktivního uhlí a čirý roztok se lyofilisuje. Takto se získá 0,66 g Glp-Nle-Pro-NH2, což odpovídá 79,5 % teorie. Rf(4) = 0,43;
£«%Jd2^= -77,1° (c = 1, kyselina octová); Analýz8 aminokyselin : Glu 0,96 (1,0), Nle
1,00 (1,0), Pro 1,00 (1,00).
239907 8
Příklad 2
L-pyrogluteml-Lnorvalyl-L-prolinemid
Stupeň 1
L-norvalyl-L-prolinmidhydrotlhLorid
2,2 g (20 mrnml) H-Prc—N^ i 3,83 g (10 mami) BX-Nva-OPFP (viz L. Kisfiludy i kol·, HoopoeSeyyer^s Z..Ptysiol. Chemie 395,·887 /1978/) se rozpustí . ve 40 ml dimethylformimidu, vzniklý roztok se oechá stát po dobu 5 minut i potom se ve vikuu odpiií. Jiko zbytek získs oá olejovité kapalini ci rozpustí v 50 ml chloroformu, teoto roztok se . protřepe nejprve tř krát vždy 10 ml IN roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát vždy 10 ml IN roztoku hydrogen uhličitanu sodného i nakonec jednou 10 ml vody i konečně se vysuší bezvodýýjssrinem sodným i odpeií. po odpaření se rozpustí v 5 ml ethylesteru kyseliny octové i tento roztok se smí^:í s 10 ml 5N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové. Po třieetiminцrvéém stání se reikční směs zředí diethyletherm, vyloučená sriženini se oddiltruje i ve vikuu se vysuší zi pomocí bezvodého hydroxidu sodného. Tímto způsobem se získá 1,83 g H-Nva-Pro-NHg HCL, což odpovídá 73 % teoretického výtěžku, vztiženo ni BOC-Nva-OPFP; й/4) = 0,10.
Stupeň 2
Beniyloκykairoool-.-LpprrolesaIгnil-.-l-nnorvlyl-L-prrlinamid
1,25 g (5 mmmo) H-Nva-Pro-NHg. HCL se rozmíchá v 1 5 ml dimethylfommimidu i tito směs se zi chlizení ledem i zi mícháni smísí s 0,7 ml (5 mmmo) trietyliaminu i 2,15 g (5 mamo) Z-Glp-OPFP. Po pěti minutách se do rsekční smmši přidá dalších 0,7 ml (5 mami) treettylimrninu, reikční směs se dalších 20 minut míchá i potom se ve vikuu odpsií. Zbytek po odpaření se rozpětí v 50 ml chloroformu, tento roztok se vytřepe nejprve třikrát vždy 10 ml IN roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát vždy 10 ml IN vodného roztoku hydrogen uhličitanu sodného i konečně jednou 10 ml vody, potom se vysuší pomocí bezvodého sírinu sodného i odppií. Jeko zbytek získiná olejovitá kipalini se pomocí diethyletheru přivede ke krystalizici i tímto způsobem získiný produkt surový (1,80 g) se překkystaiizuje ze směsi ethylllkrhrlu diethyletheru. Tímto způsobem se získá 1,66 g Z-Glp-Nva-Pro-NH2, což odpovídá 72 % teoretického výtěžku.
T. t. = 166 iž 167 °C;
Ri<3) = 0,29;
wD?5= -87,5° (c = 1, kyselini octová);
inalýzi pro С23^0°6^ (molekulová hmoonost 458,52): vypočteno: 0 60,25 % H 6,59 » N 12,22 % zjištěno : C 60,08 % H 6,70 % N 12,15 %.
Stupeň 3
L-pyroglutlmmS·^jLnioralyS-L-prolinamid
1,42 g (3,1 mami) Z-Glp-Nva.-Pro-lHg se rozpustí ve 30 ml meethylalkoholu, .tento roztok se smísí s 0,2 g 10 % palidiového katilyzátoru ni iktivnim uhlí i do reikční smmsi se po dobu 30 minut zivádí plynný vodík. Po ukončení hydrogenice se katilyzátor oddiltruje i filtrát se odpaří. Pevný imoofní zbytek se rozetře s diethyletheeem i o^c^ě^ělí. Tímto způsobem získiný surový produkt se rozoustí ve vodě, roztok se vyčeří pomocí iktivního uilí, toto se potom odfiltruje i čirý roztok se esofieitsje. Získá se tikto 0,95 g Glp-Nva-ProNN2, což odpovídá 94 % teoretického výtěžku.
й/4)= 0,36;
Г.<Ъ23- - 87,0° (c.= 1, kyselini octová);
AuaLýza pro vypočteno : íjištěno :
WčC 60,25 % g 60,08« (moletauLová hmoonoot 458,52):
H 6,59 % N 12,22 %
H 6,70 % N 12,15«.
Stupeň 3
L-pyyrgluSammS-ILnooralyl- L-prolinamid
1,42 g (3,1 mami) Z-Glp-Nva-ErONHg s rozpustí ve 30 ml mee^l-alkoholu, tento roztok se smísí s 0,2 g 10 « - paxadiového katalyzátoru na aktivniím u]hLí a do reakční směsi se po dobu 30 minut zavádí plynný vodík. Po ukončení hydrogenace se katalyzátor oddiltruje a filtrát se odpaří. Pevný amoofní zbytek se rozetře s diethyletherem a odddtí. Tímto způsobem získaný surový produkt se rozpětí ve vodt, roztok se vyčeří pomocí aktivního uhLÍ, toto se potom odfiltruje a čirý . roztok se Lyofilisuje. Získá se takto 0,95 g Glp-Nva-Pro-MHg, což odpovídá 94 « teoretického výtěžku.
f(4) - = 0,36;*' °Ъ25 = _87,0°
Aialýza aminotysslin : Olu 0,97 (1,0), (1,0), Pro 1,00 (c = 1, kyselina octová);
Nva 1,09 (1,0T.
Příklad 3
L-pyroglu tamyl-P-prp lyl-L pro linamid
Stupeň 1
L··prolyL-L-arolinamidhydrtchlorid
2,28 g (20 mami) H-Pro-NHg a 3’81 g (10 immol) Baj-Pro-OPFP se roznítí ve 40 ml dimethy^o^ami^, získaný roztok se protřepe nejprve třikrát 10 ml 1- vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom rovněž třikrát vždy 10 ml 1- vodného roztoku hydrogen uhličitanu sodného a nakonec jednou 10 ml vody, načež se tento roztok vysuší- za pomoci bezvodého síranu sodného odppaí.. Zbytek po odpaření se rozpustí v 5 ml ethyl^te^ kyseliny octové a smísí se s 10 ml 5N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethyl^te^ kyseliny octové. Po 30 minutách se a vysuší se ve H-Pro-Pro-NKg. Rf(4) = 0,05.
tato reakční směs zředí diethrLetherem, vyloučená sraženina se odfiltruje vakuu ze pomoci bezvodého hydroxidu sodného.
HCL, což odpovídá 83 « teoretického výtěžku,
Tímto způsobem se získá 2,06 g vztaženo na Bl-Pro-OPFP;
Stupeň 2
BθnzySo]χSarbonyl-L-ayrtglstamS-L·prolyl-L-artlinaoif
0,75 u (3 mrnml) H-Pro-PrON-Hg. HCL se rozmíchá v 10 ml dioethyliOoroaoifs a za chlazení ledem a za míchání se smíchá s 0,42 ml (3 mnmo) triehrlaaoins e 1,35 g (3,15 mimi) Z-Glp-OPFP. Po 5 minutách, se k reakční soOsí přidá dalších 0,42 ml (3 minml) triehlyllomins a po dalších deseti minutách míchání se vzniklá hustá suspenze va vakuu odppří. Kasalický zbytek po odpaření se rozetře s 8 ml filthyLlthlrs a tato směs se nechá stát - po dobu 3 hodin v ledničce. Získaná sraženina se potom odfiltruje a vysuší. Tímto způsobem se získá 1,0 g Z-Glp-Pro-ProNHg, což odpovídá 73 « teoretického výtěžku.
T. t. = 247 až 248 °C (rozklad);
Bf(3) = 0,19;
- -82,8° (c = 1, kyselina octová);
Aialýza pro C23^28°6N4 Molekulová hmotnost 456,50): vypočteno : C 60,52 « H 6,18 « N 12,27 « zjištěno : C 60,03 « H 6,20 « N 12,20 «.
239907 10
Stupeň 3
L-pyroglut t nm/l-U· · prolyl - L-· p r o linaoí d
1,0 g '2,2 Ζ-01ρ~Ργο-Ργο-ϊΉ2 se rozpustí v >0 ml kyseliny octové, k tomuto roztoku se přidá 0,2 g 10 % pAladiového katalyzátoru na aktivním uhlí a do reakční smmsi se po dobu jedné hodiny zavádí plynný vodík. Po ukončení hydrogenace se katalyzátor odfiltruje, filtrát se od:a?í s zbytek po odpaření se rozetře s diethyletherem. Tímto způsobem získaný anoOfní surový produkt (0,60 g) se rozpustí ve vodě, ' roztok se vyčeři za pomoci aktivního uhlí a po odfiltrování aktivního uhlí se čirý roztok lyofilisuje. Získá se takto 0,50 g
Gla-PropPt--№^1, což odpovídá 70 % teoretického výtěžku. |
r (4) = 0,10; |
= 223>1 ° (c = b kyselina octová), |
Příklad 4 · |
L- p jy o g i u tamyli L - v v a у l-L-proli n a míd
Stupen 1
L-valyl-L-prolinamidhydrochlorid
0,49 g (4,2 mmmou) H-Pro-NWg a 0,82 g (2,14 mmmlu) BX-Val-OPFP se rozpustí v 10 ml dimethylformaniidu a po třCettmrninutovém stání se roztok ve vakuu odnaaí. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se rozpustí v 10 ml chloroformu . a získaný roztok se protřepe nejprve dvalknát. vždy 3 ml 1N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát vždy 3 ml 1ž vodného roztoku hydrogen uhličitanu sodného a nakonec jednou 3 ml vody. Potom se roztok vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a odpoří. Zbytek po odpaření se rozpásl ve 3 ml ethylesteru kyseliny octové a tento roztok se smísí se 3 ml 5N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové. Po jedné hodině stání se reakční směs zředí diet^hyl^eÍV^^<remr, vyloučená sraženina se oddiltruje a ve vakuu se suší za pomoci bezvodého hydroxidu sodného. Tímto způsobem se získá 0,51 g Н-УаХ-Рго-КН^ což odpovídá 95 % teoretického výtěžku, vztaženo na BO-Vsl-OPFP;
Rf(4) = 0,1u.
Stupeň 2
Benizlotχkaarotyl--LpprrtglStorl-L-valyllLρpol·inaIiif
0,38 g (1,52 mmo) H-Val-Pгt-NH1. HC1 se rozmíchá v 10 ml dimethylformamidu a ze chlazení ledem a za míchání se smísí s 0,22 ml (1,52 ml) ti’i(thylami^nu a s 0,69 g (1,6 mml) Z-Glp-OPFP. Po 10 minutách se do reakční směsi přidá dalších 0,22 ml (1,52 mmml) ti*ietlylami^nu a po dalších 30 minutách míchání se reakční směs ve vakuu odpaří. Zbytek po odpaření se rozpustí v 15 ml chloroformu a získaný roztok se protřepe nejprve dvakrát vždy 5 ml 1N roztoku vodné kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát vždy 5 ml 1N vodného roztoku hydrogen uhličitanu sodného a konečně jednou 5 ml vody. Potom se reakční roztok vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a ve vakuu se odppaí.. Po odpaření zbylá olejovitá kappaina se za pomoci diethyletheru přivede ke krystalizaci. Tímto způsobem 'se získá . 0,54 g Z-GIp-VoI-^I^i^oK^Hi, což odpovídá 77 % teoretického výtěžku.
T. t. = 116 až 118 °C;
Rf(3) = 0,30;
= -100,5° (c = 1, kyselina octová).
Stupeň 3
D·pJΠΌO1utaImllLvveyl-L-aгolinarid
9,65 g (21,2 mnml) Z-GIp-VoI-^P^j^oKHi se rozpustí ve 300 ml vody a po přídavku 2 g
1' 239907 % paladiového katalyzátoru na aktivním uhlí se po dobu 5 hodin zavádí do reakčního roztoku plynný vodík. Katalyzátor se potom odfiltruje a filtrát se odpaří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se rozpustí v ethylalkoholu, roztok se odpaří a tato operace se opakuje ještě dvakrát. Nakonec získaný amorfní pevný zbytek se rozetře s diethyle» therem. Tímto způsobem se získá 4,47 g Glp-Val-Pro-NH2, což odpovídá 65 % teoretického výtěžku. Rf (4) = 0,34i = -104,9° (с = 1, kyselina octová)
Analýza aminokyselin: Glu -1,03 (1,01), Val 1,00 (1,0), Pro 0,94 (1,0.
Příklad 5 b-pyroglutamyl-l/-isoleucyl-Lprolinamid
Stupeň 1
Benzyloxykarbonyl-L-isoleucyl-L-prolinamid
51,4 g (0,1 mmol) Z-Ile-0PFP a 12,5 g (0,11 mmol) H-Pro-NH2 se rozpustí ve 250 ml dimethylformemidu a tento roztok se smísí se 14,0 ml (0,1 mmol) triethylaminu. Reakční směs se nechá přes noc stát a příští den se ve vakuu odpaří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se rozpustí v 500 ml chloroformu a tento roztok se protřepe nejprve dvakrát vždy 100 ml IN vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom rovněž dvakrát 100 ml IN vodného roztoku hydrogen uhličitanu sodného a konečně jednou 100 ml vody, potom se roz-; tok vysuší pomocí bezvod^ho síranu sodného a nakonec se odpaří. Olejovitý zbytek se pomocí směsi 100 ml diethyletheru a 100 ml n-hexanu přivede ke krystalizaci. Tímto způsobem získaný surový produkt (31,7 g) se překrystalizuje ze směsi 60 ml ethylesteru kyseliny octové a 60 ml n-hexanu. Získá se 30,32 g Z-Ile-Pro-NH2, což představuje 84 % teoretického výtěžku.
T. t. = 127 až 128 °C;
Rf (2> = 0,54.
Stupeň 2
L-isoleucyl-Xz-prolinamid-hydrochlorid
24,0 g (66,5 mmol) Z-Ile-Pro-NH2 se rozpustí ve 470 ml methylalkoholu, přidá se 30 ml 2,4N methylalkoholového roztoku kyseliny chlorovodíkové a 4 g 10 % paladiového katalyzátoru na aktivním uhlí a doLtéto reakční směsi se po dobu jedné hodiny zavádí plynný vodík. Po ukončení hydrogenace se katalyzátor odfiltruje a filtrát se odpaří. Zbytek po odpaření se rozetře s diethyletherem a tímto způsobem získaný surový produkt (20 g) se překrystalizuje ze směsi methylalkoholu a diethyletheru. Získá se takto 16,05 g H-Ile-Pro-NH^ HCL, což představuje 81 % teoretického výtěžku.
T. t. = 135 až 140 °C;
r/4> = 0,15.
Stupeň 3
Benzyloxykarbonyl-L-pyroglutamyl-L-isoleucyl-L-prolinamid
0,90 g (3,5 mmol) H-Ile-Pro-NH2· HCL se rozmíchá ve 20 ml dimethylformamidu a za chlazení ledem a za míchání se tato směs smísí s 0,49 ml (3,5 mmol) triethylaminu a s 1,57 g (3,7 mmol) Z-Glp-OPFP. Po uplynutí pěti minut se přidá dalších 0,49 ml (3,5 mmol) triethylaminu a po dalších 20 minutách míchání se reakční směs ve vakuu odpaří. Zbytek po odpaření se rozpustí ve 30 ml chloroformu a tento roztok se protřepe nejprve třikrát vždy 7 ml
239907 12
1N roztoku hydrogen uhličitanu sodného a r.akonec jednou 7 ml vody. Tento roztok se ootom vysuší bezvodým síranem sodným a odpaří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se několikrát zpracuje diethyletherem a diethylether se oddekantuje; nakonec se surový produkt přivede pomocí diethyletheru ke krystalizaci, krystaly se oddělí, rozpustí se v ethylesteru kyseliny octové a přídavkem diethyletheru se opět vysráží. Tímto způsobem e získá 1,18 g Z-Glp-Ile-Pro-NH2, což představuje 71,? # teoretického výtěžku.
T. t. = 87 až 89 °C; |
|
Rf (3) = 0,36; |
|
= -91,4° (c = |
1, kyselina octová); |
Analýza pro G24^32°6H4 |
(molekulová hmotnost 427,55) |
vypočteno: C 61,1)0 |
H 6,83 % N11,6 ъ |
zjištěno: C ?9,i9 % |
H 6,88 ά h 11,16 %. |
Stupen 4
L-pyroglutamyl-L-isoleucyl-L-prolinamid
4,72 g (10 mmol) Z-Glp-Ile-Pro-řUU se roznustí ve 100 ml methylalkoholu, к roztoku se přidá 1 g 103» oaladiového katalyzátoru no aktivni/í. uhlí a po dobu jedné* hodiny se do reakční směsi zavádí plynný vodík. Po ukončení hydrogenace se katalyzátor odfiltruje, filtrát se odpaří a zbytek po odpaření se rozetře s diethyletherem. Tímto způsobem získaný surový produkt (3,22 g) se rozpustí ve vodě a roztok se vyčeří pomocí aktivního uhlí. Po odfiltrování aktivního uhlí se čirý roztok lyofilisuje a získá se 3,03 g Glp-Ile-Pro-NH2, což odpovídá 98 % teoretického výtěžku.
Rf (4>= o,45;
-100,7° (c = 1, kyselina octová),
Analýza aminokyselin: Glu 0,95 (1,0), Ile 1,00 (I,0), Pro 1,02 (1,0).
Příklad 6
L-pyroglutamyl-L-alfa-aminobutyryl-L-prolinamid
Stupeň 1 pentafluorfenylester kyseliny tecbutyloxykarbonyl-L-alfa-aminomáselné
7,7 g (20 mmol) BOC-Abá-OH. DCH se rozmíchá v 60 ml diethyletheru, do této směsi se přidá 20 ml 2N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové a reakční směsí se třepe až do rozpuštění suspendované substance. Diethyletherová fáze se potom, vytřepe se 20 ml 2N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové a potom 20 ml vody, vysuší se bezvodým síranem sodným a Odpaří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina (4,14 g) a 3,7 g (20 mmol) PFPOH se rozpustí ve 25 ml ethylesteru kyseliny octové, roztok se ochladí pod teplotu 5 °C a za míchání se do něj přidá 3,92 g (19 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu. Tato reakční směs se míchá po dobu jedné hodiny na ledové lázni, potom se odfiltruje dicyklohexylmočovina a filtrát se odpaří. Jako zbytek získaná olejovitá kapalina se rozpustí v n-hexanu a získaný roztok se nechá stát po dobu jedné hodiny v ledničce. Ještě vyloučená dicyklohexylmočovina se znovu odfiltruje filtrát se zahustí na objem 20 ml. Po počátku vylučování krystalů se suspenze uloží do ledničky a nechá se tam stát přes noc. Příští den se vyloučené krystaly oddělí filtrací a získá se 5,57 g BOC-Abu-OPFP, což odpovídá 76 % teoretického výtěžku.
T. t. = 83 až 84 °C:
1 = 0,86;
£«Č]d25= _32,8o (c = 1, ethylester kyseliny octové);
Analýza pro C^H^O^RF^ (mol. hmotnost 369,29): vypočteno: C 48,79 % H 4,37 % N 3,79 % F 25,72 % zjištěno : C 48,55 % H 4,28 % N 3,70 % F 25,44 %.
Stupeň 2
L-alfa-aminobutyryl-L-prolinamidhydrochlorid
3,2 g (28 mmol) H-Pro-NHg a 5,16 g (14 mmol) BOC-Abu-OPFP se rozpustí v 60 ml dimethylformamidu a po pětiminutovém stání se vzniklý roztok ve vakuu odpaří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se rozpustí ve 100 ml chloroformu a tento roztok se protřepe nejprve dvakrát vždy 20 ml 1N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové a potom dvakrát rovněž 20 ml 1N vodného roztoku hydrogen uhličitanu sodného. Potom se roztok vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a odpaří. Jako zbytek pó odpaření získaná olejovitá kapalina se rozpustí ve 20 ml ethylesteru kyseliny octové a roztok se smísí s 20 ml 6N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové. Po uplynutí jedné hodiny se reakční směs zředí diethyletherem, získaná sraženina se odfiltruje a ve vakuu se vysuší za pomoci bezvodého hydroxidu sodného. Tímto způsobem získaný surový produkt (3,86 g) se rozetře s 20 ml studeného dimethylformamidu a tímto způsobem se získá 2,40 g H-Abu-Pro-NH2. HCLp což odpovídá 75 % teoretického výtěžku, vztaženo na BOC-Abu-OPFP;
Rf (4) = 0,10.
Stupeň 3
Benzyloxykarbonyl-L-pyroglutamyl-alfa-aminobutyryl-I^-prolinninid
2,13 g (9 mmol) H-Abu-Pro-NH^. HCL se rozmíchá ve 30 ml dimethylformamidu a za chlazení ledem a za míchání se к této směsi přidá 1,26 ml (6 mmol) triethylaminu a 3,95 g (9,2 mmol) Z-Glp-OPFP. Po uplynutí 5 minut se к reakční směsi přidá dalších 1,26 ml (9 mmol) triethylaminu a po 20 minutách dalšího míchání reakční směsi se tato ve vakuu odpaří. Krystalický zbytek získaný po odpaření se rozetře s 20 ml ethylalkoholu, D6chá se stát přes noc v ledničce a potom se odfiltruje. Tímto ZDŮsobem se získá 3,30 g Z-Glp-Abu-Pro-N^, což odpovídá 82 % teoretického výtěžku.
T. t. = 175 až 176 °Cj
Rf C3) = 0,2β;
= -99 = -99,6° (c « 1, kyselina octová).
Stupeň 4
L-pyroglutamyl-L-alfa-aminoburyryl-L-prolinamid
2,67 g (6 mmol) Z-Glp-Abu-Pro-NH2 se rozpustí ve 100 ml kyseliny octové, к získanému roztoku se přidá 0,5 g 10 % paladiového katalyzátoru na aktivním uhlí a do reakční směsi se po dobu jedné hodiny zavádí plynný vodík. Po ukončení hydrogenace se katalyzátor odfiltruje, filtrát se odpaří a zbytek po odpaření se rozetře s diethyletherem. Tímto způsobem získaný amorfní surový produkt (1,82 g) se rozpustí ve vodě, roztok se vyčeří pomocí aktivního uhlí a po odfiltrování aktivního uhlí se čirý roztok lyofilisuje. Získá se takto 1,70 g Glp-Abu-Pro-NHg» co^ odpovídá 91 % teoretického ýýtěžku .
= -102,5° (c= 1, kyselina octová).
239907 14
Příklad 7
L-pyroglutamyl-L~alfa-aminodekanoyl- L-prolinamid
Stuoeň 1
L-alfa-aminodekanoy1-L-pro1inámidhydro chlorid
1,37 g (12 mmol) H-Pro-XH2 a 2»72 g .(16 mmol) BOC-Ada-OPKP se rozpustí ve 20 ml dimethylformámidu a po pětiminutovém stání se roztok ve vakuu odpaří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se rozpustí v 50 ml chloroformu, tento roztok se protřepe nejprve třikrát vždy 10 ml 1N roztoku kyseliny chlorovodíkové ve vodě, potom rovněž třikrát 1N vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a koir čně dvakrát vždy 10 ml vody, potom se tento roztok vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a nakonec se odpaří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovítá kapalina se rozpustí ve 3 ml ethylesteru kyseliny octové a tento roztok se smísí s 5 ml 6N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové. Po jednohodinovém stání se reakční směs zředí diethyletherem, vyloučená sraženina se odfiltruje a ve vakuu se za pomoci bezvodého hydroxidu sodného vysuší· Tímto způsobem se získá 1,75 g H-Ada-Ργο-ΝΗ2· HCL) což odpovídá 91 % teoretického výtěžku, vztaženo na BOC-Ada-OPFP; Rf (3>= 0,11.
Stupeň 2 .Benzyloxylarbonyl-L-pyroglutamyl-Lr-alfa-aminodekanoyl-b-prolinamid
1,75 g (5,5 mmol) H-Ada-Pro-NHg. HCL a 2,58 g (6 mmol) Z-Glp-OPFP ве rozpustí ve 300 ml dimethylformamidu a tento roztok se smísí s 0,77 ml (5,5 mmol) triethylaminu. Po uplynutí 5 minut se přidá к reakční směsi dalších 0,77 ml (5,5 mmol)triethylaminu a po dalších 20 minutách míchání se reakční směs ve vakuu odpaří. Zbytek získaný po odpaření se rozpustí v 50 ml chloroformu, roztok se protřepe třikrát vždy 20 ml 1N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom rovněž třikrát 20 ml 1N vodného roztoku hydrogen uhličitanu sodného a nakonec dvakrát vždy 20 ml vody, potom se tento roztok vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a odpaří se. Jako zbytek po odpaření získaná zpěnčná olejovitá kapalina se rozetře s diethyletherem a získaná gelovitá suspenze se nechá stát po dobu 2 hodin v ledničce. Po této době se sraženina odfiltruje a vysuší. Tímto způsobem získaný surový produkt (2,61 g) se překrystalizuje z ethylesteru kyseliny octové a získá se 2,45 g Z-Glp-Ada-Pro-NH2, co^ odpovídá 84 % teoretického výtěžku.
I. t. = 103 až 105 °C;
Rf (2> = 0,19»
ИЬ» x -63,7° (c= 1, kyselina octová);
Analýza pro C28H40°6N4 ^mo1· hmotnost 528,65):
vypočteno: C 63,62 % H 7,63 % N 10,60 %
Zjištěno: C 63,24 % H 7,81 % N 10,57 %·
Stupeň 3 1гфуго<1лЛату1-Ь-а^а-атЬ^екапоу1-Ь-рго11пап^
1,9 g (3,6 mmol) Z-Glp-Ada-Pro-NHg se rozpustí ve 40 ml kyseliny ocbové, к tomuto roztoku se přidá 0,2 g 10% paladiového katalyzátoru na aktivním uhlí a do reakční směsi se po dobu jeden a půl hodiny zavádí plynný vodík. Po ukončení hydrogenace se katalyzátor odfiltruje, filtrát se odpaří a zbytek po odpaření se rozpustí ve vodě. Vodný roztok se vyčeří pomocí aktivního uhlí a po přefiltrování se čirý roztok odpaří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se rozpustí ve 30 ml chloroformu, roztok se vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a odpaří. Napěněný amorfní pevný zbytek se rozetře s dietbyletherem, odfiltruje a vysuší. Tímto způsobem se získá 1,20 g Glp-Ada-Pro-NH2,.což představuje 82 % teoretického výtěžku.
Bf (4) = 0,55;
= -66,2° (с = 1, kyselina octová)·
Příklad 8
L-pyroglutamyl-L-cyklohexylalanyl-v-prolinamid
Stupeň 1 tercbutyloxykarbony1-L- cyklohexylalanln-p ent a fluorfenyl ester
9,04 g (20 mmol) BOC-Cha-OH. DCHA se rozmíchá v 80 ml diethyletheru a vytvořená suspenze se smísí s 20 ml 2N roztoku kyseliny chlorovodíkové ve vodě. Reakční směs se protřepává až do rozpuštění pevné fáze, potom a· diethyletherová fáze oddělí, protřepe se nejprve 20 al 2N vodného roztoku kyseliny sírové a potom 20 ml vody, vysuSí se pomocí bezvodého síranu vá• penatého a odpaří se. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kaoalina (5,7 g) se rozpustí ve 30 ml ethyleateru kyseliny octové, tento roztok ee smísí s 3,7 g (20 mmol) FFPOH, směs se ochladí na teplotu maximálně 5°C a potom se smísí se 4,12 g (20 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu. Reakční směs se při této teplotě míchá po dobu jedné hodiny, potom se vyloučená dicyklohexylmočovina odfiltruje, filtrát se odpaří a jako zbytek po odoaření získaná olejovitá kapalina se rozpustí ve 30 ml n-hexanu. Tento roztok se ponechá stát po dobu jedné hodiny v ledničce, při tom vyloučená dicyklohexylmočovina se opět odfiltruje a filtrát se zředí 70 ml n-hexanu. Tento zředěný roztok se protřepe nejprve pětkrát vždy 40 ml 1N roztoku hydrogen uhličitanu sodného ve vodě a potom dvakrát vždy 40 ml vody, potom se tento roztok vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a odpaří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina při stání krystalizuje. Tímto způsobem se získá 8,48 g BOC-Cha-OPFP, což odpovídá 97 % teoretického výtěžku.
T. t. = 75 až 77 °C;
Rf = 0,88;
Analýza pro ^20^24^1^5 ^mo1· hmotnost 437,41):
vypočteno: C 54,92 % H 6,53 % N 3,20 % F 21,72 % zjištěno : C 54,67 % H 5,66 % N 3,11 % F 21,43 %.
Stupeň 2
L-cyklohexylalenyl-L-prolinamidhydrochlorid
2,28 g (20 mmol) H-Pro-IíH^ a 4,37 g (10 mmol) BOC-Cha-OPFP se rozpustí ve 40 ml dimethylformamidu a po pětiminutovém stání reakčního roztoku se tento ve vekuu odpaří. Jako zby* tek po odpaření získaná olejovitá kapalina se roupustí v 80 ml chloroformu, tento roztok se protřepe nejprve třikrát vždy 20 ml IN vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom rovněž třikrát vždy 20 ml IN vodného roztoku hydrogen uhličitanu sodného a nakonec jednou 20 ml vody, potom se tento roztok vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a odpaří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se rozpustí v 8 ml ethylesteru kyseliny octové, smísí se s 10 ml 5N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové a po uplynutí jedné hodiny se reakční směs zředí diethyletherem. Při tom vyloučená sraženina se odfiltruje a ve vakuu se vysuší za pomocí bezvodého hydroxidu sodného. Tímto způsobem se získá 2,98 g H-Cha-Pro-NHg HCL, což odpovídá 97 % teoretického výtěžku, vztaženo na BOC-Cha-OPFP;
= 0,33
Stupeň 3
Ber.zyloxykerbonyl-L-pyroglutamyl-L-cyklohexyl-alanyl-prolinamid
2,43 g (8 mmol) H-Cha-Pro-NN2. a 3,60 g (8,4 mmol) Z-Glp-OPFP se rozpustí ve 25 ml dimethylformamidu a tento roztok se smísí s 1,12 ml (8 mmol) triethylaminu. Po uplynutí
239907 16 minut se к reakčnímu roztoku přidá dalších 1,12 ml (8 mmol)tricethylaminu a po dalších 20 minutách míchání se reakční směs ve vakuu odpaří. Zbytek po odpaření se rozpustí v 80 ml chloroformu, tento roztok se protřepe nejprve třikrát vždy 20 ml 1N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom rovněž třikrát vždy 20 ml 1N roztoku hydrogen uhličitanu sodného ve vodě a konečně jednou 20 ml vody, potom se roztok vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a odpaří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se přivede pomocí diethyletheru ke krystalizaci. Tímto způsobem získaný surový orodukt (3,88 g) se překrystelizuje ze 30 ml ethylesteru kyseliny octové a získá se 3,32 g Ž-glp-Cha-Pro-NH2, což odpovídá 81 % teoretického výtěžku.
T. t. = 165 až 166 °C;
Rf (2) = 0,17;
Ж25= -67,3° (c = 1, kyselina octová);
Analýza pro С27^36°6^4 ^mo1· hmotnost 512,61):
vypočteno; C 63,26 % H 7,08 % N 10,93 % zjištěno: C 63,15% H 7,04 % N10,91%.
Stupeň 4
L-pyroglutamyl-L-cyklohexylalenyl-L-prolinamid
3,07 g (6 mmol) Z-Glp-Cha-Pro-NH2 se rozpustí v 60 ml ethylalkoholu, do tohoto roztoku se přidá 0,6 g 10% paladiového katalyzátoru na aktivním uhlí a po dobu 2 hodin se do reakčního roztoku zavádí plynný vodík. Po ukončení hydrogenace se katalyzátor odfiltruje, filtrát se odpaří a zbytek po odpaření se rozetře s diethyletherem. Tímto způsobem se získá 2,Ý5 g amorfního, pevného Glp-Cha-Pro-NH2, což odpovídá 95 % teoretického výtěžku. Rf (4) = 0,50;
E^J d2^ = -70,9° (c = 1, kyselina octová).
Příklad 9
L-oyroglutaEiyl-L-threonyl-L-Drolinamid
Stupeň 1
O-benzyl-L-threonyl-L-prolinamidhydrobhJ arid
1,43 g (12,5 mmol) H-Pro-i^ e 2,98 g (6,27 mmol) BOC-Thr(Bzl)-OPFP se rozpustí ve 20 ml dimethylformamidu a po pětiminutovém stání se reakční roztok ve vakuu odpaří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se rozpustí ve 30 ml chloroformu, tento roztok se protřepe nejprve dvakrát vždy 10 ml 1N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové a potom třikrát vždy 10 ml 1N vodného roztoku hydrogen uhličitanu sodného, potom se roztok vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a odpaří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se rozpustí ve 4 ml ethylesteru kyseliny octové a smísí se s 5 ml 5N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové. Po jednohodinovém stání reakčního roztoku se tento zředí diethyletherem, při tom vzniklá sraženina se odfiltruje a ve vakuu se vysuší za pomoci bezvodého hydroxidu sodného. Tímto způsobem se získá 2,06 g H-Thr(Bzl)-Pro-NH2. HCL, což odpovídá 95 % teoretického výtěžku;
Rf (4) = 0,40.
Stupeň 2
Benzyloxykarbonyl-L-pyroglutamyl-L-O-benzyl-threonyl-L-orolinamid
2,05 g (6 mmol) H-Thr(Bzl-Pro-NH2. HCL a 2,69 g (6,27 mmol) Z-Glp-OPFP se rozpustí ve 21 ml dimethylformamidu, tento roztok se po kapkách smísí s 0,84 ml (6 mmol) triethýl17 239907 aminu a po pětiminutovém stáni reakční se přidá dalších 0,84 ml (6 mmml) trietlyrlaminu. Po dvacetiminutovém míchání této reakční směsi se ve vakuu odpaří a zbytek po odpaření se rozpustí v 50 ml chlorofoímu. Tento roztok se protřepe nejprve dvakrát vždy 10 ml 1N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát vždy 10 ml IN vodného roztoku hydrogen uhličitanu sodného, nakonec se vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a odpaař. Jako zbytek po odpařeni získaná olejovitá kapalina se zpracuje fiettyletheeeo a ochladí, přičemž produkt ztuhne v amorfním stavu. Tímto způsobem získaný surový produkt (2,76 g) se rozpustí v ethylesteru kyseliny octové a roztok se vyčeří aktivním uhlím. Po odfiltrování aktivního uhlí se filtrát odpaří a zbylý pevný amoí^i^ií zpěněný zbytek se rozetře s diettyletterem. Tímto způsobem se získá 2,47 g Z-Glp-ThrCBzD-Pro-N^» c°ž odpovídá 75 % teoretikkého výtěžku. .
Stupeň 3
Lrpyroglutamol“^threonyl-L-pr°lnnaoid
2,04 g (3,7 mimi) Z-Glp-Th^BzD-PooNH se rozpuutí ve 40 ml kyseliny octové, k tomuto roztoku se přidá 0,4 g 10% paladiového katalyzátoru na aktivním uhLí a po dobu 4 hodin se do reakčního roztoku zavádí plynný vodík. Po ukončení hydrogenace se katalyzátor odffltruje, filtrát se odpaří a zbytek po odpaření se rozetře s fiettylethereo. Tímto způsobem získaný amoofní surový produkt (1,31 g) se nanese na sloupec obsahnuící 30 g silikagelu (velikost částic v rozmezí 0,063 až 0,2 mm) a eluuje se směsí rozpouštědel (3). Eluční frakce °bsahtSíií čistý produkt se spojí a odppří a jako zbytek po odpaření získaný surový produkt se zpracuje ^ethyl-etherem. Tímto způsobem se získá 0,72 g G^-Tto-ProNHg, což odpovídá 59,5 % teoretického výtěžku.
Kf(4) = 0,16;
= -90,0° (c = 1 > kyselina octová)
Ainlýza aminooyssein: Glu 1,00 (1,00), Thr 0,99 (1,0), Pro 1,03 (1,0)
Příklad 10
L·pyroglutamyS-0--tecbuSyS-L·-seryl-L-pro-lnnamid
Stupeň 1 Otercbutyl-L-seryl-I-pp°olnnamidteoioχalát
8,0 g (70 mmml) H-ProNHg a 15,0 g (34,7 mnol) Z-Ser(B3u--0PFP se rozpuutí ve 120 ml dimettylfoгmamidu, načež se roztok po pětiminuoovém stání ve vakuu odppaí. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se rozpuutí ve 300 ml chloroformu, tento roztok se protřepe nejprve třikrát vždy 80 ml 1N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom rovněž třikrát vždy 80 ml 1N vodného roztoku hydrogen uhličitanu sodného a konečně jednou rovněž 80 ml vody, tento roztok se vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a odppří. Jako zbytek □o odpaření získaná olejovitá kapalina (18 g) se rozpuutí společně se 4,37 g (34,7 minml) dih^^^irátu kyseliny šlavelové ve 300 ml mee^yalkoholu, k tomuto rozthku se přidají 3 g 10% paladiového katalyzátoru na aktivním uhlí a do reakční směsí se po dobu jedné hodiny zavádí plynný vodík. Po ukončení hydrogenace se katalyzátor oddlltruje, filtrát se odpe^í, zbytek po odpaření se rozetře s ettylesteeeo kyseliny octové a ve vakuu se vysuší. Tímto způsobem se získá 10,8 g H-Ser(.'tBu)-Pro-NH2. (C00H)2 ve formě amoofní hygroskonické substance, což odpovídá 90 % teoretcekého výtěžku;
Rf(4) = 0,22.
Stupeň 2
BennySoэψkarbo°nS-Ь-pyгo°luUэπlol-l-ottecibUyS-L·-seryl-L-pr°lnnaoif
239907 ,о
6,43 g (18,5 шпо1) H-Ser(tBu)-Pro-NH2. (C00H)2 а 7,95 g (18,5 mmol) Z-Glp-OPFP se rozpustí v 80 ol dioethylfoomaoidu a tento roztok se smísí s 5,18 ol (37 omol) trietyflaoinu.
.Pi pětioinutovéo stání se reakční soés ve vakuu odpaří a krystalický zbytek se rozetře s a. diettylethereo. Tíoto způsobeo získaný produkt (9,53 g) se potoo překrystalizuje ze 120 ol ooe^tИ·alkltols. Získá se takto 7,70 g Z-61o-Ser(Bu)-ProNH2, což odpovídá 83 % teoretického výtěžku.
T. t. = 226 až 229 °C;
Rf (3) = 0,40;
ÍX7d2 5= 71,6° (c = 1, kyselina octová);
Aialýza pro C25«34O7-4 (ool. hodnost 502t57):
vypočteno; C 59,75 % H 6,82 % N 11,15 % zjištěno: C 59.55% H 6,95 % N 11,09%.
Stupen 3 * ie ρprrllαSa:Iol“coterr .butyJ-X s sryl-Ir-pro-linaoid
4,02 g (8 onoD Z-Glp-Ser(tBu)-ProNH^ se rozpětí ve 160 ol oee^цrlθlkotolu, tento roztok se soísí s 0,8 g 10% palašového katalyzátoru na aktivnío uhlí a po dobu 30 oinut se do reakční so^Eši zavádí plynný vodík. Po ukončení hydrogenace se katalyzátor odfiltruje ' a filtrát se odpří. Jako zbytek po odpařeni získaná olejovitá kapalina se krystalizuje z diettyletteru, krystaly se oddiltrují a vysuší. Tíoto způsobeo se získá 2,50 g Glp-SerCB^-Poo-lH2, což odpovídá 85 % teoretického výtěžku.
T. t. = 186 až 187 °C;
Rf (4) = 0,45; ’ = -60,8° (c = 1, kyselina octová);
Annlýza aoinooysslin: Glu 1,03 (1,0), Ser 1,00 .
(1,0), Pro 1,00 (1,0);
Ainlýza pro c^H^O^ (mol. hodnost 3613,44): vypočteno: C 55,42 % H 7,66 % N 15,21 % zjištěno: C 55,07 % H 7,61 % N 14,94 %.
Příklad 11
XpyroglutamlLDleucyl-L-prolinaoid
Stupeň 1
Terč. butyloxrkaarboyl-D- lθusiniopniafluslrf einrlester
4,62 g (20 rnool) BOC-D-Leu-OH a 4,23 g (22 omol) PFPOH se rozpustí v 50 ol ethylesteru kyseliny octové a tento roztok se za oíchání a chlazení ledeo sd.'í se 4,12 g (20 omol) ficyklohexylkarbofiioifu. ReeJkČní soés se oíchá po dobu jedné hodiny v ledové lázni potoo se vyloučená dicyklohexyloočovina oddiltruje filtrát po odfiltrování této ficyklotexyloočoviny se odppří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se rozpustí ve 100 ol n-hexanu, roztok se ponechá stát po dobu jedné hodiny v ledničce a znovu vyloučená dicyklohexyloočovina se opět oddiltruje. Filtrát se prdřeáe nejprve pětlorát vždy 50 ol 1N roztoku hydrogen uhličitanu sodného ve vodě a potoo dvakrát vždy 50 ol vody, potoo se roztok vysuší pornocí bezvodého síranu sodného a odppří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina přes noc vУcгУlš®řizuje. Tíoto způsobeo se získá 7,0 g BO-D-Xu-OPFP, což odpovídá 88 % teoretického výtěžku.
I. t. = 53 ež 55 °C;
= +31,7° (c = 1, ethylester kyseliny octová);
Analýza pro Ογ^θΝΡ^ (mol. hmotnost 397,55): vypočteno: C 54,39 % H 5,07 % N 3,53 % F 23,91 % zjištěno: C 51,51 % H 4,68 % N 3,66 % F 23,65 %.
Stupeň 2
D-leucyl-D-prolinamidhydrochlorid:
3,42 g (30 mmml) H-Pro-NHg a 60,0 g (15 muml) BCJ-L-Leu-OPFP se rozpustí v 60 ml dine thylformamidu a eo..pětiminuoovém stání se roztok ve vakuu odpaří. Zbytek po odpaření se rozpustí ve 100 ml chloroformu, tento roztok se protřepe nejprve dvalkrát vždy 20 ml IN roztoku kyseliny chlorovodíkové ve vodě, potom třikrát 20 ml IN vodného roztoku hydrogen uhličitanu sodného a nakonec jednou 20 ml vody, roztok se potom vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a odpeří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se rozo^tí ve 10 ml ethylesteru kyseliny octové a k tomuto roztoku se přidá 15 ml 4N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové. Po jedné hodině se reakční směs zředí dithyleth*rem, vyloučená sraženina se odfiltruje a ve vakuu ·se vysuší, za pomoci bezvodého hydroxidu sodného. Tímto způsobem se získá 3,66 g H-D-Leu-Pro-NHg. HCL, což OGoovífá 92,5 % teoretického výtěžku, vztaženo na BO-D-Leu-OPFP;
Rf t4) = 0,26
Stupeň 3
BenzyУoэqrУkabo°nУllLpyyoglutamУ·и—euιcyl-L-prolinвmif
3,66 g (13,9 mmml) H-D-Leu-Pro-NHg-NH. HC1 a 6,43 g (15 mnml) Z-Glp-OPFP se rozoustí v 50 ml ^гоНу^ommamidu a tento roztok se za chlazení leden a za míchání smísí s 1,95 ml (13,9 mmml) trieUyraaminu. Reakční směs se míchá po dobu 5 minut a potom se do ní přidá dalších 1,95 ml (13,9 mmml) trieUylaminu. Po dalších 20 minutách míchání se reakční směs ve vakuu odppaí. Zbytek po odpaření se rozo^tí ve 120 ml chloroformu, roztok se vytřeoe nejprve třikrát vždy 30 ml IN vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom rovněž třikrát vždy 30 ml IN vodného roztoku hydrogen sodného a nakonec jednou 30 ml vody, tento roztok se vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a odppaí. Po odpaření získaná olejovitá kapalina se zpracováním s fietlylelherem přivede ke frystalizaci. Tímto způsobem získaný surový produkt (6 g) se překrystalizuje ze 30 ml ethylalkoholu a získá se 5,48 g Z-Glp-D-Leu-Pro-NHg, což odpovídá 77 % teoretcekého výtěžku.
T. t. = 189 až 194 °C; Rf (3) = 0,48;
= -33,2° (c - 1 tyselina octováK
Stupeň 4
L-o^rDglutammS-D-leucyl-L-prolinamid
3,78 g (8 mami) Z-Glp-D-Leu-Pro-NH^ se rozpětí ve 150 ml methylalkoholu a k tomuto roztoku se přidá 0,8 g 10% palašového katalyzátoru na aktivním uhH, Do reakční směsi se potom zavádí po dobu jedné hodiny plynný vodík. Po ukončení hydrogenace se katalyzátor oddiltruje, filtrát se odpaří a zbytek po odpaření se zpracuje diethyletherem. Tímto způsobem získaný surový produkt (2,5 g) se rozpětí ve vodě, vodný roztok se vyčeří pomocí ak4 tivního uhlí a po odfiltrování aktivního rálí se čirý filtrát lyofilizuje. Tímto způsobem se získá 2,35 g Glp-D-Leu-Pro-NHg» což odpovídá 87 % teoretcekého výtěžku.
R <4) = 0,48;
Id ' = -83,3° (c = 1, kyselina octová)
239907 Příklad 12
L-pyroglutamyl-b-leucyl-Ir-prolinethylamid Stupen 1
L-leucyl-Lr-prolin-ethylamidhydrochlorid
1,67 g (7,2 mmol) H-oro-NH-Et. (COOH)2 se rozmíchá ve 20 ml ethylesteru kyseliny octové a tato suspenze se smísí se 2,0 ml (14,4 mmol) triethylaminu a 2,38 g (6 mmol) BOC-Leu-OPFP. Po pěti minutách se reakční směs protřepe nejprve třikrát vždy 5 ml 1N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom rovněž třikrát vždy 5 ml 1N vodného roztoku hydrogen uhličitanu sodného a nakonec jednou 5 mlvody potom se tento roztok vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a odpaří· Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se zpracuje 10 ml 5N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové, po uplynutí 20 minut se reakční směs zředí diethyletherem, vyloučená sraženina se odfiltruje а те vakuu se vysuší za pomoci bezvodého hydroxidu sodného· Tímto způsobem se získá 1,46 hygroskopického H-LeuPro-NH-Et. HC1, což odpovídá 83 % teoretického výtěžku, vztaženo na BOC-Leu-OPFP. Rf (4) . 0,43.
Stupeň 2
Benzylokykarbonyl-L-pyroglutamyl-L-leucyl-L-prolinamid
1,17 g (4 mmol) H-Leu-Pro-NH-Et. ИС1 a 1,72 g (4 mmol) Z-Glp-OPFP se rozpustí v 5 ml dimethylformamidu a získaný roztok se smísí s 0,56 ml(4 mmol) triethylaminu. Po uplynutí pěti minut se do reakční směsi přidá dalších 0,56 ml (4 mmol) triethyleminu a reakční směs se ve vakuu odpaří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se rozpustí ve 40 ml chloroformu, roztok se protřepe nejprve dvakrát vždy 10 ml 1N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát vždy 1C ml 1N vodného roztoku hydrogen uhličitanu sodného a nakonec jednou 10 ml vody, tento roztok se vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a odpaří. Zbytek po odpaření se rozetře s n-hexanem a odfiltruje. Tímto způsobem se získá 1,61 g amorfního Z-Glp-Leu-Pro-NH-Et, což odpovídá 80,5 % teoretického výtěžku. r/3) = 0,50;
LAJq^ s -89,0° (c « 1, kyselina octová).
Stupeň 3
L-pyroglutamyl-L-leucyl-L-prolinethylamid
1,07 g (2,14 mmol) Z-Glp-Leu-Pro-NH-Et se rozpustí ve 30 ml vody, do roztoku se přidá 0,25 g 10% paladiového katalyzátoru na aktivním uhlí a do reakční směsi se po dobu jeden a půl hodiny zavádí plynný vodík. Po ukončení hydrogenace se katalyzátor odfiltruje, filtrát se odpaří, olejovítý zbytek se rozpustí ve 20 ml chloroformu, tento roztok se vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a odpaří. Po zpěnění ztuhlý zbytek se rozetře se směsí diethyletheru n-hexanu a tímto způsobem se získá 0,52 g Glp-Leu-Pro-NH-Et, éož odpovídá 66 % teoretického výtěžku. В<4) = 0,57;
- -94f5° (c = 1, kyselina octová).
Příklad 13
L-pyroglutamyl-L-leucyl-L-prolin-n-decylamid
Stupeň 1
Benayloxykerbonyl-L-prolin-n-decylamid
5,0 g (20 mmol) Z-Pro-CH se rozpustí v 50 ml dimethylformamidu, к tomuto roztoku se přidá 2,8 ml (20 mmol) triethylaminu a reakční směs se ochladí na teplotu -10 ' °C. Fři této teplotě se za míchání přidá nejprve po kapkách 2,8 ml (21,5 mmol) izobutylesteru kyseliny chlormravenčí 8 po 10 minutách se do reakční směsi rovněž po kaokách ořidá 4,4 ml (22 mmol) n-decylominu. Po ukončení přídavku se reakční směs míchá nejprve po dobu 30 minut při teplotě G °C a potom . po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Získaná suspenze se odfiltruje, filtrát se odpaří a zbytek po odpaření se rozpustí ve 1 CO ml ethylesteru kyseliny octové. Tento roztok se protřepe nejprve pětkrát vždy 50 ml 1N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom dvakrát vždy 50 ml 11N 1N vodného roztoku hydrogen uhličitanu sodného a konečně jednou 50 ml vody, ootom se roztok vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a odpaří. Jako zbytek po odoaření získaná olejovitá kapalina se Dřivede ke krystalizaci zkracováním s n-hexamem, Tímto způsobem se získá 5,43 g Ζ-Ργο-ΝΗ-CjθΗ^, což odoovídá 70 % teoretického výtěžku.
T. t. = 7e až 80 °C;
Rf<2) = 0^5.
Stupeň 2
L-prolin-n-decylaminhemioxalát ,
5,0 g (12,9 mmol) Z-Pro-NH-Cj θΗ., a 2,02 g (16 mmol) diliydrátu kyseliny štavelóvé se rozpustí ve 100 ml methylalkoholu, k tomuto roztoku se přidá 0,8 g 10% paladiového katalyzátoru ne aktivním uhlí a po dobu -2 hodin se do reakčního roztoku zavádí vodík. Po ukončení hydrogensce se reakční směs zahřeje, katalyzátor se odstraní odfiltrováním a filtrát se odpaří. Po odpaření získaný krystalický zbytek se rozetře s diethyletherem a odfiltruje. Získá se tímto způsobem 3,9 g H-Pro-NH-C|θΗ2) (COOH)2, což odpovídá 88 % teoretického výtěžku. T. t. = 152 až 154 °C;
= 0,16;
Stupeň 3
L-leucyl-L-orolin-n-decylamidhydrochlorid
3,44 g (10 mmol) H-Pro-ÍUH-CC qH2j. (COOH)g a 2,0 g (5 mmol) BGC-Leu-OPFP se rozpustí ve 30 ml dimethylformamidu a tento roztok se smísí s 2,8 ml (20 mmol) triethylaminu. Po pětiminutovém stání reakční směsi se teto odpaří a jako zbytek oo odpaření získaná olejovitá kapalina se rozpustí v 50 ml n-hexenu. Takte získaný roztok se protřepe nejprve pětkrát vždy 30 ml 1N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát vždy 30 ml 1N vodného roztoku hydrogen uhličitanu sodného s konečně jednou 30 ml vody, potom se vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a odpaří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapálina se rozpůstí v 10 ml 5N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové, tento roztok se nechá stát po dobu 30 minut a potom se odpaří. Ve vakuu vypěněný amorfní zbytek se rozetře s n-hexanem, odfiltruje a ve vakuu se vysuší za oomoci bezvodého hydroxidu sodného. Tímto způsobem se získá 1,05 g H-Leu-Pro-NHi-Cj θΗ21. HC1, což odpovídá 60 % teoretického výtěžku, vztaženo na BOC-Leu-OPFP; Rf i‘-i) = 0,17.
Stupeň 4 Benzylexykarbenyl-I-·pyroglutamyl-I--leucyl-I--prolin-n-decylamid
1,03 g (2,55 mmol) H-leu-Pro-NH-CjqJjl’ hCl se rozpustí v 10 ml dimethylformamidu a tento roztok se smísí s 0,36 ml (2,55 mmol) triethylaminu a 1,1 g (2,55 mmol) Z-Glp-OPFP. Reakční směs se míchá po dobu 5 minut, potom se přidá dalších 0,36 ml (2,55 mmol) triethylaminu a po dalších 20 minutách míchání se reakční směs ve vakuu odpaří. Zbytek po odoaření se rozpustí ve 20 ml chloroformu, získaný roztok se protřepe pětkrát nejdříve vždy 10 ml 1N roztoku kyseliny chlorovodíkové ve vodě, potom třikrát vždy 10 ml 1N vodného roztoku hydrogen uhličitanu sodného a nakonec jednou 10 ml vody, tento roztok se vysuší pomocí bezvodého sí22
2j?9o7 sodného p. nakonec se odpaří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se zpmco/ání.7i s cietnyleLherera přivede ke krystalizsci a odfiltruje se. Tímto způsobem se zísKá 1,22 g Z-Glp-beu-Pro-MH-C1ύΗ22> což odpovídá 78 % teoretického výtěžku.
Ϊ. t. --- 108 až 109 °C;
= 0,50;
- -74,5° íc = 1, kyselině octová);
Analýza pro ^34^52^6^4 ^mo1· hmotnost 612,82): vypočteno: C 66,64 % H 8,55 % N 9,14 % zjištěno; C 66,43 % H 8,84 % N % 13 %.
Stupeň 5 b-pyroglutamyl-L-ieucyl-L-prolin-n-decylamid
I, 22 g (2 mmol) Z-Glp-Leu-Pro-NH-CθΗ2ι se rozpustí ve 30 ml methylalkoholu, к tomuto roztOKU re přidá 0,2 g 10$ paladiového katalyzátoru na aktivním uhlí a po dobu 30 minut se do reakční směsi zavádí plynný vodík. Po ukončení hydrogenace se katalyzátor odfiltruje, filtrát se odpaří a jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se zpracováním s n-hexanem přivede ke krystBlizaci. Tímto způsobem získaný surový produkt (0,85 g) se překrystalizuje ze 4 ml ethylesteru kyseliny octové a získá se 0,74 g Glp-Leu-Pro-NH-Cj θΗ2|, což odpovídí 77 % teoretického výtěžku.
T. t. = 140 až 141 °C;
Rf (4) = 0,76 ;
Wd2’ - -71,3° (c = 1, kyselina octová);
Analýza aminokyselin: Glu 0,97 (1,0), Leu 1,00 (1,0), Pro 1,01 (1,0).
e
Příklad 14
L~pyroglutamyl-L-leucyl-L-prolin-(2-dimethyl-aminoethyl)amid
II, 43 g (130 mmol) BOC-Pro-OPFP se rozpustí ve 100 ml diethyletheru a tento roztok se smísí se 6,54 ml (60 mmol) Μ,Ν-dimethylaminoethylaminu. Takto získaný roztok se nechá stát po dobu 10 minut, potom se třikrát vytřepe vždy 30 ml vody, vodné fáze se spojí a přídavkem pevného uhličitanu sodného s pH tohoto vodného roztoku nastaví na hodnotu 10. Potom se tento roztok extrahuje čtyřikrát vždy 20 ml ethylesteru kyseliny octové. Oddělené organické fáze se spojí, promyjí se 20 ml vody, potom se vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a odpa- ří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina krystalizuje při stání. Uvedeným způsobem se získá 6,71 g BOC-Pro-KH-CH2-CH2-N(CHj)2, což odpovídá 78,5 % teoretického výtěžku; Rf (4> = 0,29.
Stupeň 2 L-leucyl-L-orolin-(2-dimethylaminoethyl)-amiddihydrochlorid
6,71 g (23,5 mmol) ВОС-Рго-1<Н-СН2-СН2-М(СНз)2 se zpracovává se 30 ml 5N roztoku,kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové po dobu 30 minut a potom se reakční směs odpaří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se vyjme do 50 ml chloroformu a smísí se 2,8 ml (20 mmol) triethylaminu. Takto získaný čirý roztok se smísí se 6,74 g (17 mmol) BOC-Leu-OPFP a po jédné hodině míchání se po kapkách к tomuto reakčnímu roztoku přidá dalších 2,8 ml (20 mmol) triethylaminu. Tato směs se nechá stát přes noc a příští den se odpaří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se rozpustí v 50 ml vody, hodnota pH roztoku se přídavkem pevného uhličitanu sodného upraví na 10 a chráněný dipeptid se z vodné fáze vyextra-’ huje ethylesterem kyseliny octové. Oddělená ethylesterová fáze se vysuší pomocí bezvodého síranu vápenatého a odpaří se . Jako zbytek 00 odpaření získaná olejovitá kapalina se zpracovává po dobu jedné hodiny 5N roztokem kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové, potom se reakční směs odpař! a zbytek po odpaření se rozetře s diethyletherem. Po odfiltrování se amoofní a silně hygroskopický Drodukt vysuší ve vakuu za pomoci bezvodého hydroxidu sodného. Popsaným způsobem se získá 4,5 g H-Ieu-Pro-NH-CH2cHH2-N(CH))g. Ht-1 (12,1 ипоЦ; Rf(4) = 0,05.
Stupeň '3
L-pyroglutamd-Lleucyl-I^prolin- (S-dimethyl-aminoethyl) amid
2,6 g (7 mml) H-Leu-PrO“NH-CH)-CH2-N(CHH)2. HC1 se rozpustí ve 30 ml dimethylformamidu a tento roztok se s 1,96 ml (14 odoI) trietyilaminu. Vyloučená sraženina se oddiltru)e a iiltrát se po kapkách a za míchání a chlazení ledem přidá k roztoku 3,29 g (7,7 mimi) Z-GIp-OPFP v 10 ml dim^thyl^i^om^e^midu· Po ukončení přídavku se reakční směs nechá stát pp dobu 4 hodin a potom se ve vakuu o^í^pO^í. Jako zbytek získaná olejovitá kapalina se rozpuutí v 50 ml vody, roztok se ofyselí koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na pH 3 a protřele se třikrát vždy 20 ml eti^e steru kyseliny octové. Potom se hodnota pH vodného roztoku nastaví přídavkem pevného uhličitanu sodného na hodnotu 10 a alkalický roztok se pětkrát extrahuje vždy 30 ml ethyle^t^u kyseliny octové. Organické fáze se spojí, vysuší se pomocí bezvodého síranu sodného a potom se odppaí. Tímto způsobem získaný olejovitý chráněný dipeptid (3,05 g; 5,6 ошо1) se rozpustí v 60 ml vody, do tohoto roztoku se přidá 5,6 ml 1N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové a 0,6 g 10% paladiového katalyzátoru na aktivním uilí a do této reakční soOsí se po dobu 30 minut zavádí plynný vodík. Po ukončení hydroginace se katalyzátor σά^Ι^η)^ filtrát se odpaří a jako zbytek po odpařeni získaná olejov^á kapalina se roz^us^ ve s°^í^^ 50 ml chloroforou a 20 ml 1N vrán^o rozeto hydrogen Uili^tanu sodného. Organická a vodná fáze se oddděí, chloroformová fáze se vysuší pomocí bezvodého síranu sodného a odppří. Zbytek po odpaření se rozetře s n-hexanem a oddiltruje. Popsaným způsobem se získá amdfní surový produkt (2,0 g), tento se rozpustí ve vodě, vodný roztok se v^čeří pomocí aktivního ulhLí a po odfiltrování se ^оГШхц)^ Tímto způsobem se získá 1,72 g Glp-^L^e^u^-^jroc^NHíC^Hg-^CHg-NCC^^), což odpovídá 60 % teoretického výtěžku. r(4) = 0,06' = -71,7° (c = 1, kyselina octová);
Ainlýza aminolyssiin; Glu 1,02 (1,0), Leu 1,00 (1,0), Pro 1,03 (1,0).