DE2917000A1

DE2917000A1 - Antibiotische neplanocine, verfahren zu ihrer herstellung und diese verbindungen enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE2917000A1
Application number: DE19792917000
Authority: DE
Inventors: Naoki Muto; Masaru Otani; Masatoshi Tsujino; Satoshi Yaginuma
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1978-05-25
Filing date: 1979-04-26
Publication date: 1979-11-29
Also published as: DK177079A; NL182231B; FR2426688A1; ES480384A1; FR2426688B1; MX5788E; DE2917000C2; IT1115245B; DK149313B; SE7903672L; CA1128882A; NL182231C; SE443576B; NL7903318A; HU192741B; SU906388A3; DK149313C; GB2021582A; GB2021582B; CH641804A5

Description

PATENTANWÄLTE

DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · D R.-l NG. AN N EKÄTE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/787077-79 7078 · TELEX O5-212156 kpat d

TELEGRAMM KRAUSPATENT

2150 WK/rm

TOYO JOZO KABUSHIKI KAISHA Tagata / Japan

Antibiotische Neplanocine, Verfahren zu ihrer Herstellung und. diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel

909848/0567

Beschreibung

Die Erfindung betrifft neue antibiotische Neplanocine mit Hemmwirkung auf pflanzenpathogene Mikroorganismen und mit einer Antitumoraktivitat. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel. Die Erfindung betrifft insbesondere neue antibiotische Neplanocine und ein Herstellungsverfahren, bei dem man neplanocinerzeugende Actinonyceten Ampullarieila sp. A 11079 FERIi-P Nr. 4494 in einem Nährmedium kultiviert und daraus die neuen antiobiotischen Neplanocine isoliert. Die Erfindung betrifft weiterhin Neplanocin-D-derivate, die sich von Neplanocin D ableiten, und ihre chemische Synthese.

Die neuen Neplanocinantibiotika gemäß der Erfindung best hen aus Neplanocin-A, -C, -D und dessen Derivaten, -B und -F.

Neplanocin A ist eine schwach basische Substanz mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenscliaften:

(1) Elementaranalyse:

gefunden: C 49,96% H 5,00% N 26,4390 berechnet: C 50,19% H 4,97% N 26,60%.

(2) Molekulargewicht (errechnet aus der massenspektroskopischen Analyse): 263

(3) Molekularformel: C

(4) Schmelzpunkt (bestimmt durch thermische Analyse): 216⁰C

(5) spezifische Drehung: [a]^° = -157° (c = 0,45%, H₂O)

909848/0567

(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum: (14 ^"/ml)

in HpO: gemäß Figur 1

Λ*~)ίΖ~Ζ *-λ mm ΤΡ¹/** £ Γ\ Ο 4

ν««-* ⁼ ^O^ Xu U · Ά* ⁼⁼ DUtj I

bei pH 3: X_m„_v = 261 mn , e2* = 566,4 HicuX / ι cm

bei pH 10: A_rriov = 263 mu , El^„_m = 595,0.

(7) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr): gemäß Figur 2.

Absorptionsbanden bei 3360, 3200, 2920, 1640, 1600, 1570, 1480, 1415, 1370, 1330, 1300, 1250, 1205, 1160, 1115, 1080, 1050, 1005, 910, 850, 790, 730 cm"¹.

(8) Kernmagnetisches Resonanzspektrum: gemäß Figur 3 (interner Standard DSS in Deuteriumdimethylsulfoxid, 100 MHz).

(9) Löslichkeit:

Löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid,

Essigsäure und wäßriges Aceton.

Unlöslich: Äthylacetat, Chloroform, Benzol, Hexan.

(10) Farbreaktionen:

positiv: Entfärbung von Kaliumi3rmanganat, Peröodatoxidation und Anisaldehyd.

negativ: Eisen(III)-chlorid, Ninhydrin, Anilinphthalat, Molisch und Fehling.

(11) Natur: schwach basisch

(12) Farbe: weiße nadeiförmige Kristalle

(13) Rf-Wert (Silicagel, Tokyo Kasei Co., Silicagel f):

n-Butanol: Essigsäure : Wasser (6 : 1 : 1); Rf = 0,36 n-Butanol : konzentriertes Ammoniak : Wasser (10 : 0,5 1 2){ Rf » 0,27

909848/0567

/IO

n-Propanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak :

Wasser (10 : 1 : 1); Rf = 0,41

Aceton : Wasser (10 : 1); Rf = 0,34

Äthylacetat : Methanol : Wasser (10 : 2 : 1); Rf

0,21

Chloroform : Methanol : Essigsäure (10 : 2 : 1);

Rf = 0,17.

(14) Chemische Struktur:

HO-H₂C -χ ;

Vr

OH OH

Die biologischen Eigenschaften von Neplanocin A sind wie folgt:

(1) Wachstumshemmende Aktivität auf pflanzenpathogene Pilze:

Eine 100 )f/ml-Lösung von Neplanocin A auf eine Agarplatte von Helminthosporium oryzae M 0306 zeigt eine Hemmzone mit einem Durchmesser von 18,9 mm.

(2) Antitumoraktivitat:
Mausleukämie-L-1210-Tumorzellen (10 Zellen) wurden

9098A8/0567

^r4i

Intraperitoneal in Mäuse inokuliert. Ein Tag nach der Transplantation wurde Neplanocin A (jeweils 0,16 mg/kg, 0,32 mg/kg, 0,63 mg/kg, 1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg bzw. 5,0 mg/kg) intraperitoneal einmal täglich über einen " Zeitraum von 5 Tagen verabreicht. 10 Mäuse in der Kontrollgruppe und 7 Mäuse in jeder Gruppe der behandelten Tiere wurden verwendet. Die Ergebnisse sind in der Figur 4 dargestellt«, Nach 15-tägiger Beobachtung war die durchschnittliche Überlebenszeit, ausgedrückt in Tagen, für die Kontrollgruppe 7,4 Tage. Die Verlängerung der Lebenszeit im Vergleich zu der Kontrollgruppe wurde bei den Gruppen, die das Arzneimittel erhalten hatten, beobachtet. Die Verlängerung der Lebenszeit betrug 158# bei 0,16 mg/kg, 170% bei 0,32 mg/kg und bei den Gruppen mit 2,5 mg/kg und 5 mg/kg wurden keine Todesfälle beobachtet.

Erhebliche lebensverlängernde Effekte wie bei L-1210 wurden auch bei Mäusen mit Ehrlich-As cite stumor, Sarcoma-180, und P-388-Leukämie und bei Ratten mit Yoshida-Sarcoma beobachtet, als diese das Neplanocin A erhielten.

(3) Akute Toxizität:

LD₅₀: 13,7 mg/kg (i.p., Mäuse)

Bei intraperitonealer Verabreichung über 14 Tage mit 5 mg/kg/Tag wurden keine Todesfälle beobachtet.

Anwendung und Dosierung:

Zur Therapie von akuter Leukämie wird das Arzneimittel intravenös in einer Dosis von 5 bis 20 mg/Tag, gelöst in physiologischer Kochsalzlösung, einmal am Tag über einen Zeitraum

909848/0567

von 7 Tagen verabreicht. Das Neplanocin A wird auch wirksam zur Therapie von chronischer Leukämie, gastroenteralen Carcinomen, pulmonären Carcinomen, Uteruskrebs, Brustkrebs und maligner lymphatischer Leukämie verwendet.

Neplanocin A kann in Form eines physiologisch annehmbaren Salzes einer Mineralsäure oder einer organischen Säure, beispielsweise als Hydrochlorid, Acetat, Tartrat, Citrat oder Succinat, verwendet werden.

Neplanocin C ist eine schwach basische Substanz mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

(1) Elementaranalyse:

gefunden: C 47,5956 H 4,64% N 25,10% berechnet: C 47,31% H 4,66% N 25,09%

(2) Molekulargewicht (berechnet aus der massenspektroskopischen Analyse): 279 (Tetraacetylneplanocin C: 447)

(3) Molekularformel: C₁₁H₁₃N₅O^

(4) Schmelzpunkt: (bestimmt durch thermische Analyse): 226°C (Zers.)

(5) spezifische Drehung: [a]j-¹ = -43,6° (c = 0,67%, H₂O)

(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum: (16 y-/ml)

in H₂O: *_max = 263 m^ , E^_cm = 538,9 (gemäß Figur 5) bei _PH 3: *_max = 259 nyi, E^ = 510,8 bei pH 10: λ^ . 263 mjx _t β}*^ = 534,4.

909848/0567

(7) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr): gemäß Figur 6.

Absorptionsbanden bei 3450 bis 3100, 2920, 2740, 2680, 1680, 1630, 1600, 1560, 1500, 1460, 1420, 1380, 1360, 1330, 1300, 1240, 1200, 1170, 1100, 1050, 1020, 960, 920, 900, 880, 83O, 780, 720, 680 cm"¹.

(8) Kernmagnetisches Resonanzspektrum: gemäß Figur 7

(interner Standard DSS, in Deuteriumdimethylsulfoxid, 100 MHz).

(9) Löslichkeit:

Löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid Unlöslich: Äthylacetat, Chloroform, Benzol, Hexan.

(10) Farbreaktion:

positiv: Entfärbung von Kaliumpermanganat, Perjodat und Tollens.

negativ: Eisen(III)-chlorid, Ninhydrin, Anisaldehyd und Molisch.

(11) Natur: schwach basisch

(12) Farbe: weiß (farblose, plättchenförmige Kristalle)

(13) Rf-Wert (Silicagel-Fleckenfilm, Tokyo Kasei Co., Silicagel f):

n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6 : 1 : 1); Rf =

0,33

n-Butanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak :

Wasser (10 : 0,5 : 2); Rf - 0,19

n-Propanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak :

Wasser (10 : 1 M))Rf" 0,30

9098A8/0567

Aceton : Wasser (10 : 1); Rf = 0,43

Äthylacetat : Methanol : Wasser (10 : 2 t 1)j Rf

0,27

Chloroform : Methanol : Essigsäure (10 : 2 : 1);

Rf = 0,20

(14) Chemische Struktur:

HO-H₂C

OM OH

Die biologischen Eigenschaften von Neplanocin C sind wie folgt:

(1) Wachstumshemmende Aktivität auf pflanzenpathogene Pilze:

100 >r/n»l-Lösung, Durchmesser der Papierscheibe 7 mm; Helminthosporium oryzae M 0306: 31,4 mm (Hemmzone) Cladosporium herbarum M 4278: 14,0 mm (Hemmzone) Alternaria kikuchiana M 4588: 12,0 mm (Hemmzone)

(2) Akute Toxizität:

LD₅₀: 55 mg/kg (i.p., Mäuse)

Neplanocin C kann in Form eines physiologisch annehmbaren Salzes einer Mineralsäure oder organischen Säure, z.B. als

909848/0567

Hydrochloric!, Acetat, Tartrat, Citrat oder Succinat, verwen det werden.

(3) Antitumoraktivität:

Neplanocin C hemmt vollständig das Wachstum einer Mausleukä mie-Zellkultur von L-5178Y bei einer Konzentration von 0,8 in vitro.

Neplanocin C hat einen lebensverlängernden Effekt von 131% bei B/K (behandelt/Kontrolle) gegen Mausleukämie L-1210, wenn es intraperitoneal mit einer Dosis von 10 mg/kg verabreicht wird.

Neplanocin D hat die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

(1) Elementaranalyse: C 49,7096, H 4,6496, N 21,20%

(2) Molekulargewicht (errechnet aus der massenspektroskopischen Analyse): 264

(3) Molekularformel: α^Η^Ν^Ο^

(4) Schmelzpunkt: 236 bis 237°C

(5) spezifische Drehung: [α]²,³ = -145° (c = 0,6%, H₂O)

(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum:,

in Wasser: gemäß Figur 8, A_max « 251 m^i, E^_cm = in saurem Wasser: ^_max - 251 mp ^i cm ⁼ ^⁵-⁵

in alkalischem Wasser: ^_max = 256 mu , E^_cm =

9098A8/0567

(7) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr): gemäß Figur 9·

Absorptionsbanden bei 3420 bis 3120, 2940 bis 2880, 1680, 1580, 1545, 1510, 1440, 1390, 1305, 1210, 1110, 1075, 1040, 1000, 990, 975, 900, 845, 780 cm"¹

(8) NMR-Spektrum: gemäß Figur 10

(interner Standard DSS, in Deuteriumdimethylsulfoxid, 100 MHz)

(9) Löslichkeit:

Löslich: Wasser, Dirnethylsulfoxid, Dimethylformamid,

Essigsäure und Pyridin

Unlöslich: Äthylacetat, Chloroform, Benzol und Hexan

(10) Farbreaktion:

positiv: Entfärbung von Kaliumpermanganat und Perjo-

datoxidation

negativ: Ninhydrin, Fehling und Eisen(III)-Chlorid.

(11) Farbe: weiße nadeiförmige Kristalle

(12) Rf-Wert (Silicagel, Tokyo Kasei Co., Silicagel f):

n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6 : 1 : 1), Rf =

0,27

n-Butanol t konzentriertes wäßriges Ammoniak :

Wasser (10 : 0,5 : 2); Rf = 0,07

n-Propanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak :

Wasser (10 J 1 ι 1); Rf = 0,18

Aceton : Wasser (10 : 1); Rf .= 0,33

(13) Chemische Struktur:

909848/0567

HO-H₂C

OH OH

Die akute Toxizität von Neplanocin D ist wie folgt :

Keine Todesfälle wurden bei einer intraperitonealen Verabreichung von 100 mg/kg Neplanocin D an Mäusen festgestellt.

Neplanocin B hat die folgenden physikalisch-chemischen Eigen schaften:

(1) Elementaranalyse: C 47,44%, H 4,63%, N 25,07%

(2) Molekulargewicht (errechnet aus der massenspektroskopischen Analyse): 279

(3) Molekularformel: C₁₁H₁₃N₅O^

(4) Schmelzpunkt: 269 bis 272°C (Zers.K

(5) spezifische Drehung: Ca sulfoxid)

JJ

-3,5°(c = 1,0%, Dimethyl-

909848/0567

(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum:

in H₂O: gemäß Figir11, λ^ = 262 mu , E^_cm = 530,4 in saurem Wasser: X_n^_3x - 259 mil, E.j _cffl = 506,7 (ein Tropfen von 0,1N-HCl)
in alkalischem Wasser: A_mQ„ » 263 mμ , eJ^V, = 522,2

ΙΠαΛ / I CIU

(ein Tropfen von 0,1N-NaOH)

(7) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr): gemäß Figur 12

Absorptionsbanden bei 3380, 3280, 3100, 2920, 2880·, 2740, 1700, 1610, 1570, 1520, 1480, 1420, 1380, 1350, 1300, 1250, 1220, 1170, 1160, 1100, 1080, 1030, 1020, 980, 970, 870, 840, 790, 730, 710 cm"¹

(8) NMR-Spektrum: gemäß Figur 13

(interner Standard DSS, in Deuteriumdimethylsulfoxid, 100 MHz)

(9) Löslichkeit:

Löslich: Wasser, Dirnethylsulfoxid

Unlöslich: Äthylacetat, Chloroform, Benzol und

Äthyläther

(10) Farbreaktion:

leicht positiv: Entfärbung von Kaliumpermanganat negativ: Ninhydrin, Molisch und Anisaldehyd

(11) Natur: schwach basisch

(12) Farbe: weiß (weiße plattenförmige Kristalle)

(13) Rf-Wert (Silicagel f, Tokyo Kasei Co.):

n-Eutanol : Essigsäure : Wasser (6 : 1 : 1); Rf = 0,4,'i

9098A8/0567

n-Butanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak :

Wasser (10 s 0,5 : 2); Rf = 0,27

n-Propanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak :

Wasser (10 t 1 t 1); Rf =0,41

Aceton : Wasser (10 : 1); Rf = 0,48

(14) Chemische Struktur:

Neplanocin F hat die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

(1) Elementaranalyse: C 48,7496, H 4,8396, N 25,71# (enthält Kristallisationswasser)

(2) Molekulargewicht (errechnet aus der massenspektroskopischen Analyse): 263

(3) Molekularformel: C₁₁H₁₃N₅O₃.1/2H₂O

(4) Schmelzpunkt: 223°C (Zers.)

(5) spezifische Drehung: [aJ^¹ = -6,6' (c ο 0,896,

909848/0567

²⁹¹⁷⁰⁰°

(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum:

in H₂O: gemäß Figur 14, A_ffiax = 263 mn E^_cm = 548,7 in saurem Wasser (ein Tropfen von 0,1N-HCl): λ^_Λν =

■Λ η/ UIaX.

260 nyi, Bj^ = 527,1

in alkalischem Wasser (ein Tropfen von 0,1N-NaOH):

^m = 531,8

(7) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr): gemäß Figur 15

Absorptionsbanden bei 3320, 3210, 2920, 1650, 1610, 1580, 1480, 1420, I38O, 1340, I310, 1270, 1220, 1180, 1110, 1070, 1020, 980, 900, 840, 800, 730 cm"¹

(8) NMR-Spektrum: gemäß Figur 16

(interner Standard DSS, in Deuteriumdimethylsulfoxid, 100 MHz)

(9) Löslichkeit:

Löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid und Essigsäure Unlöslich: Äthylacetat, Chloroform, Benzol und Äthyläther

(10) Farbreaktion:

positiv: Entfärbung von Kaliumpermanganat negativ: Eisen(III)-chlorid, Ninhydrin und Fehling

(11) Natur: schwach basisch

(12) Farbe: weiß (weiße nadeiförmige Kristalle)

(13) Rf-Wert (Silicagel f, Tokyo Kasei Co.):

n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6 : 1 : 1 ); Rf = 0,51

909848/0567

n-Butanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak :

Wasser (10 : 0,5 : 2); Rf = 0,43

n-Propanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak :

Wasser (10 : 1 : 1); Rf * 0,59

Aceton : Wasser (10 : 1); Rf = 0,48

(14) Chemische Struktur:

NH₂

HOH₂C

OH

Die biologischen Eigenschaften von Neplanocin-B und -F sind wie folgt:

(1) Akute Toxizität:

Keine Todesfälle wurden bei intraperitonealer Verabreichung von 100 mg/kg Neplanocin-B oder -F an Mäuse beobachtet.

(2) Zellwachstumshemmende Aktivität:

Das Wachstum einer Maus-Lymphoma-Zell-L-5178Y-KuItür wurde bei einer Konzentration von Neplanocin B 0,8 if/ml bzw. Neplanocin F 20 ^T/ml gehemmt.

909848/05 67

(3) Antitumoraktivität:

Neplanocin B hat einen lebensverlängernden Effekt von 142% bei B/K (behandelt/Kontrolle) gegen Mausleukämie L-1210, wenn es intraperitoneal mit einer Dosis von 50 mg/kg verabreicht wird.

(4) Weitere Aktivität:

Neplanocin B hat eine antidepressive Aktivität.

Ein neplanocinerzeugender Mikroorganismus wurde aus einer Erdprobe isoliert, die in einem Zwiebelfeld in Niigata-ken, Japan, gesammelt worden war. Der Mikroorganismus gehört zur Gattung Ampullariella. Der Stamm wird als Ampullariella sp. A 11079 bezeichnet und er wurde beim Institute for Microbial Industry and Technology, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 4494 hinterlegt.

Ampullariella sp. A 11079 FERM-P Nr. 4494 hat die folgenden taxonomischen Eigenschaften:

(I) Morphologische Eigenschaften:

Auf einem Agarmedium mit anorganischen Salzen und Stärke wurden bei 10-bis 15-tägiger Kultivierung folgende Beobachtungen gemacht (bei 30°C):

Der Stamm A 11079 erzeugt ein gekrümmtes und verzweigtes Substratmycelium mit einem Durchmesser von 0,5 bis 0,8 um und in geringem Maße ein nicht-gereiftes Luftmycelium.

909848/0567

ORIGINAL INSPECTED

Sporangiophoren, die auf dem Substratmycelium wuchsen, hatten Sporenträger. Die Gestalt der Sporenträger war zylindrisch oder flaschenförmig und sie -hatten die Abmessungen 5 bis 15 χ 10 bis 25 um. Viele Sporangiosporen waren in parallelen Ketten mit dem Sporenträger angeordnet. Die Sporangiosporen sind durch ein Büschel von polaren Geißeln in Wasser beweglich und sie sind stabförmig mit den Abmessungen 0,5 bis 1,0 χ 1,0 bis 2,0 ill.

(II) Zusammensetzung von Diaminopimelinsäure:

Diaminopimelinsäure, die durch Gesamtzellenanalyse festgestellt wurde, ist vom Meso- und Hydroxytyp.

(III) Kultivierungseigenschaften auf verschiedenen Medien t

Beobachtungen hinsichtlich der Kultivierungseigenschaften auf verschiedenen Medien bei 30⁰C bei einer 20-tägigen Kultur sind in Tabelle I zusammengestellt. Kein Luftmycelium wurde festgestellt, mit Ausnahme einer geringfügigen BiI- . dung von unreifen Wachs tumsluftmycelien auf Agarmedium mit anorganischen Salzen und Stärke und Hafermehlagarmedium.

Die Angabe der Farbe baut sich auf den Angaben in "Color Harmony Manual", 4. Auflage, 1958, veröffentlich von Container Corporation of America, auf.

(IV) Physiologische Eigenschaften:

Die physiologischen Eigenschaften sind wie folgt: 1) Verwertung von Kohlenstoff quellen:

909848/0567

(+: positiv, -: negativ) Kohlenstoffquelle Verwertung Kohlenstoffquelle Verwertung

L-Arabinose D-Xylose D-Glucose D-Fructose D-Mannose D-Mannit Inosit L-Rhamnose Saccharose ß-Lactose Raffinose Cellulose Stärke

Salicin D-Galactose Glycerin L-Sorbose Trehalose α-Melibiose D-Ribose Maltose Melezitose D-Cellobiose D-Sorbit Dulcit

909848/0567

Tabelle I - Kultureigenschaften auf verschiedenen Medien

	Medium	*	r	Wachstum Sporen	Farbe des Substratmyceliums	losliches	Pig-	I
		Glucose-Hefe-Extraktagar	träger		ment		.\
	Saccharose-Nitrat-Agar	(Waksman-Medium Nr. 28)*	schlecht wenige	perlrosa (3ca) - hellmelo-	keines		fir
		Glycerin-Nitrat-Agar	bis mittel	nengelb (3ea)			I
		(Waksman-Medium Nr. 1)*	mäßig
	Glucose-Asparagin-Agar	Glucose-Nitrat-Agar	schlecht wenige	bambusfarben (2fb) - perl	keines
		(Waksman-Medium Nr. 1)*	bis mittel	rosa (3ca)
			mäßig
	Glycerin-Asparagin-Agar	schlecht bis	bambusfarben (2fb) - perl	keines
		mittelmä	rosa (3ca)
		ßig keine
	anorganische Salze-Stärke-	gut bis mit	bernsteinfarben(31c) -
* * to	Agar	telmäßig gut	pastellorange (4ic)	keines		K) <D
OO	Tyrosinagar	schlecht keine	hellbernsteinfarben(3ic)	keines
/v\		bis mittel			*«JI
^V		mäßig			O /""^\
O	Hafermehlagar	gut mittel	bernsteinfarben(31c -	keines	O
m			hellmaisgelb(31a)
	Hefe-Malz-Agar	gut bis schlecht	topazfarben(3ne) - bern	hellbern
		mittelmä	steinfarben (3pe)	steinfar
		ßig, leich		ben (3pe)
	te Faltun
	gen
	mittelmäßig keine	zimtfarben(31e)	goldbraun
	bis gut		(3pg-3pi)
	mittelmäßig keine	farblos - bambusfarben(2fb)	keines

	schlecht keine	farblos - bambusfarben(2fb)	keines
	bis mittel
	mäßig

Fortsetzung Tabelle I

to
ο
co
oo
*»
oo

Nährmittelagar schlecht keine

Emerson-Agar
(Waksman-Medium Nr. 28)*

Bermett-Agar
(Waksman-Medium Nr. 30)*

Pepton-Czapeck-Agar
Hefeextrakt-Czapeck-Agar
Tyrosinagar****
Pepton-Hefe-Eisen-Agar

Caseinagar**** gut keine

gut bis keine mittelmäßig

mittelmäßig wenige bis gut

schlecht keine

mittelmäßig keine

bis

schlecht leicht-bernsteinfarben(3ic)-zimtfarben (3Ie)

zimtfarben(31e) - kamelienfarben(3ie)

bernsteinfarben(3pe) - topazfarben(3ne)

leicht bernsteinfarben(3ic) - bernsteinfarben(31c)

bernsteinfarben(31c - 3nc)

leicht lohfarben(3gc) hellbraun(3ec)

leicht bernsteinfarben(3ic)

goldbraun (3pg)

foldbraun 3pg-3pi)

hell-goldbraun C 3pg)

hell-goldbraun (3pg)

keines

nelkenbraun (3pl)

dunkelgewürz braun(4pl)

kamelienfarben(3ie) - zimt- nelkenfarben(31e) braun(3pl)

* Waksman, S.A. "The

** J. Elisha Mitchell

*** J. Virol., 2» ²¹⁰

**** J. Bacteriol.,

Actinomycetes", Band 2, 1961, Seiten 327 bis 334, Wiliams & Wilkins Co. , Sei. Soc, 22» 54 (1963)
(1969)

147 (1955).

2) Wachs turns temperatur: 10 bis 45⁰C

3) Wirkung auf Magermilch: Peptonisierung und Koagulierung positiv

4) Melaninerzeugung: Tyrosinagarmedium; negativ

Pepton-Hefe-Eisen-Agarmedium; positiv

5) Stärkehydrolyse: positiv

6) Cellulosehydrolyse: negativ

7) Caseinhydrolyse: positiv

8) Gelatineverflüssigung: positiv

9) Tyrosinzersetzung: negativ

10) Xanthinzersetzung: negativ

11) Hypoxanthinzersetzung: negativ

12) HgS-Bildungt negativ

13) Nitratreduktion: negativ

Aufgrund der oben angegebenen taxonomischen Werte, denen zufolge der Stamm A 11079 Sporenträger tragende Sporangiophoren, die auf verzweigendem Substratmycelium wachsen, zylindrische oder flaschenförmige Sporenträger, Sporangiosporen, die in parallelen Ketten innerhalb der Sporenträger angeordnet sind, stabförmige Sporangiosporen mit büffeiförmigen polaren Geißeln und Mesodiaminopimelinsäure hat, gehört der Stamm zu der Gattung Ampullarieila, wenn man "key

909848/0567

- -27 -

to the genera of family Actinoplanaceae" in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, 1974, Seiten 707 bis 708, heranzieht. Der Stamm wird daher als Ampullariella sp. A 11079 bezeichnet.

Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 das Ultraviolettabsorptionsspektrum von Neplanocjn A; Fig. 2 das Infrarotabsorptionsspektrum von Neplanocin A; Fig. 3 das NMR-Spektrum von Neplanocin A;

Fig. 4 den Effekt von Neplanocin A auf Mäuse mit L-1210-Leukämie;

Fig. 5 das Ultraviolettabsorptionsspektrum von Neplanocin C; Fig. 6 das Infrarotabsorptionsspektrum von Neplanocin C; Fig. 7 das NMR-Spektrum von Neplanocin C; Fig. 8 das Ultraviolettabsorptionsspektrum von Neplanocin D; Fig. 9 das Infrarotabsorptionsspektrum von Neplanocin D; Fig.10 das NMR-Spektrum von Neplanocin D; Fig.11 das Ultraviolettabsorptionsspektrum von Neplanocin B; Fig. 12 das Infrarotabsorptionsspektrum von Neplanocin B; Fig.13 das NMR-Spektrum von Neplanocin B;

909848/0567

Fig. 14 das Ultraviolettabsorptionsspektrum von Neplanocin F; Fig. 15 das Infrarotabsorptionsspektrum von Neplanocin F und Fig. 16 das NMR-Spektrum von Neplanocin F.

Erfindungsgemäß werden die Neplanocine beispielsweise dadurch hergestellt, daß man einen Stamm Ampullarieila sp. A 11079 FERM-P Nr. 4494 in ein geeignetes Nährmedium inokuliert. Die Kultivierung des Mikroorganismus kann nach einer Anzahl von verschiedenen Wegen, beispielsweise in synthetischen Medien oder natürlichen Medien und als flüssige oder feste Kultur, durchgeführt werden. Bei der technischen Herstellung werden flüssige Medien bevorzugt. Für das Medium können assimilierbare Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und andere Substanzen für die das Neplanocinantibiotikum erzeugenden Mikroorganismen verwendet werden. Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen sind Glucose, Saccharose, Glycerin, lösliche Stärke, Molassen und dergleichen. Assimilierbare Stickstoff quellen, wie z.B. Pepton, Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenpulver, Fleischextrakt, Reiskleie, Caseinhydrolysat, Nitrate, Ammoniumsalze und dergleichen, werden verwendet. Ein anorganisches Salz, wie Natriumchlorid, Phosphate (von Calcium, Magnesium, Eisen(ll) oder Mangan), kann gleichfalls verwendet werden. Ein Antischaummittel, beispielsweise ein Siliconöl oder Sojabohnenöl, kann zugefügt werden.

Für flüssige Kulturen wird vorzugsweise eine Untertauch-Belüftungskultur verwendet. In diesem Falle wird die Kultivierungstemperatur als die optimale Temperatur für Mikroorganismer, ausgewählt und sie beträgt vorzugsweise 25 bis 30⁰C. Die Kultivierungszeit kann von den Bedingungen abhängen und beträgt im allgemeinen 2 bis 4 Tage. Der pH-Wert des Mediums während der Kultivierung wird vorzugsweise bei neutralen oder leicht sauren Bedingungen gehalten.

909848/0 5 67

Die auf diese Weise kultivierten Medien enthalten antibiotische Neplanocine. Die Isolierung der antibiotischen Neplanocine kann durch herkömmliche Isolierungsmaßnahmen oder durch einen Trennprozeß für Mikroorganismen-Metaboliten durchgeführt werden. Da die Neplanocine schwach basische Substanzen sind, können sie durch Adsorption an geeigneten Adsorbentien und anschließende Elution mit einem geeigneten Lösungsmittel isoliert werden. Beispiele für geeignete Adsorbentien sind Aktivkohle, Kationenaustauscherharze, aktives Aluminiumoxid und Kieselgel. Das Elutionslösungsmittel kann anhand des verwendeten Adsorbens ausgewählt werden. Als Beispiele können mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, wie wäßriges Methanol, wäßriges Aceton oder wäßriges Dioxan, oder saure, alkalische oder Salzlösungen genannt werden. Die Neplanocine können weiterhin auf der Grundlage der schwach basischen Natur der Substanzen isoliert und gereinigt werden. So können z.B. die Antibiotika auf einem Kationenaustauscherharz, wie Amberlite IRC-50 (Warenzeichen für ein Produkt von Röhm und Haas Co., USA) oder Dowex 50 (Warenzeichen für ein Produkt von Dow Chem. Co., USA), adsorbiert und durch eine geeignete saure, alkalische oder salzhaltige Lösung eluiert werden.

Eine Kombination aus Adsorbens und Ionenaustauscherharz kann vorzugsweise für die Isolierung, Elution und Reinigung der Antibiotika angewendet werden. So wird z.B. das KuIturfiltrat auf das Kationenaustauscherharz Amberlite IR-120 (Warenzeichen) aufgegeben, um die Antibiotika zu adsorbieren. Es wird mit einer alkalischen Lösung, beispielsweise einer 3»7N-wäßrigen Ammoniaklösung, eluiert, wodurch eine Aktivfraktion erhalten wird. Nachdem ihr pH-Wert auf einen neutralen oder schwach alkalischen Wert eingestellt worden ist, werden die Antibiotika aaf Aktivkohle adsorbiert und anschließend mit

909848/0567

7O?oigem Methanol eluiert. Das Eluat wird auf dem Anionenaustauscherharz Amberlite IRA-41O (Warenzeichen) adsorbiert und es wird erneut mit Wasser eluiert, um die Aktivfraktionen zu sammeln. Die kombinierten Fraktionen werden konzentriert, wodurch ein Rohmaterial erhalten wird. Schließlich werden sie durch Silicagel-Adsorptionschromatographie gereinigt. Eine weitere Reinigung kann durch Umkristallisation erfolgen. Die Reinheit als einzige Substanz kann nachgeprüft werden, wenn die Substanz einen einzigen Schmelzpunkt oder einen einzigen Flecken bei der Papierchromatographie, der Dünnschichtchromatographie und Papierelektrophorese bei Ultraviolettlicht mit 263 mn zeigt.

Neplanocin A kann auch aus Neplanocin D auf dem Wege über Neplanocin-D-derivate wie folgt synthetisiert werden.

Drei Hydroxygruppen im Cyclopentenring des NeplanocinsD werden durch Umsetzung mit Benzoylchlorid geschützt. Eine Hydroxygruppe in der Adeninstruktur von Neplanocin D wird in eine Mercaptogruppe umgewandelt, indem man beispielsweise mit Phosphorpentasulfid umsetzt. Danach wird die Schutzgruppe für die Hydroxygruppe entfernt, wodurch das Neplanocin-D-derivat (III) erhalten wird. Die Methylierung mit Methyljodid liefert das Neplanocin-D-derivat (IV). Das Neplanocin-D-derivat (IV) wird mit methanolischem Ammoniak behandelt, wodurch Neplanocin A erhalten wird.

Weiterhin werden die drei Hydroxygruppen im Cyclopentenring des Neplanocins D zum Schutz acetyliert, indem sie mit Essigsäur eanhydrid umgesetzt werden. Danach wird die genannte Verbindung in das Neplanocin-D-derivat (III) umgewandelt, indem man es mit Thionylchlorid umsetzt. Das Neplanocin-D-derivat (3) kann in das Neplanocin A auf dem Wege über

909848/0567

-X-

das Neplanocin-D-derivat (4) umgewandelt werden, indem mit methanolischem Ammoniak behandelt wird.

Diese Reaktionen können wie folgt dargestellt werden.

OH

*^V>S-N

HOH₂C

OH OH

Neplanocin D

BzOH₂C

OBa

(ID

HOH₂C

OH OH

Neplanocirr D-derivat

(III)

909848/0567

SCH.

CH I

me thano 1 ig chejP Ammonia

._,Neplanocin A

HOH₂C

OH OH

Neplanocin-D-derivat (IV)

OH

Neplanocin D

Essigsäure

anhydrid

SOCl.

AcOH₂C-X^ > \ /

OAC OAc [2] OAc ÖAC

Neplanocin~D~derivat [3]

Neplanocin A

909848/0567

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Neplanocin-D-derivaten sind wie folgt:

Neplanocin-D-derivat (III) (IV)

Molekulargewicht

(errechnet aus der

massenspektroskopi-

schen Analyse) 280 294

Molekularformel	C₁ λ H₁₂N₄0^S	C₁P	H₁₄N₄0,S	7
Schmelzpunkt	260-262⁰C (Zers.)	177	- 178°C	O)
spezifische Drehung	-	[α]	^ = -141,
		(c	= 0,7, H₂
Ultraviolettabsorp	226 m u		222 m η
tionsspektrum (in H₂O)	324 nyi		288 m η
			295 m u

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Beispiel 1

100 ml des wäßrigen Mediums (pH 6,5), enthaltend 2% Glucose, 2% Stärke, Λ% Hefeextrakt, 1% Caseinhydrolysat und 0,2# Calciumcarbonat, wurden in einen 500-ml-Kolben gegeben und 15 min bei 120⁰C sterilisiert. In zwei Kolben mit diesem Medium wurde eine Schleife voll einer Schrägkultur von Ampullarieila sp. A 11079 FERM-P Nr. 4494 inokuliert und es wurde bei 3O⁰C eine Schüttelkultur vorgenommen. Nach 4 Tagen wurde das Kulturmedium in 20 1 des gleichen sterilisierten Mediums, wie oben beschrieben, in einen. 30-1-Standgefäßfermentator gegeben und es wurde bei 30⁰C unter Rühren mit 300 Upm und Belüftung mit 20 l/min 48 h lang kultiviert.

909848/0567

ORIGINAL- INSPECTED

Das so kultivierte Medium wurde in 200 1 eines wäßrigen Mediums (pH 6,5) übertragen, das 4% Glucose, 1% Sojabohnenpulver, 0,4% Fleischextrakt, 0,4% Pepton, 0,1% Hefeextrakt, 0,25% NaCl und 0,1% Calciumcarbonat enthielt. Es wurde 40 h lang T5ei 30°C unter Rühren mit 180 Upra und Belüften mit 130 l/min kultiviert. Die erhaltene Kulturbrühe (etwa 200 l) wurde filtriert und die Mycelien wurden mit Wasser gewaschen. Das FiItrat und das Waschwasser wurden kombiniert, wodurch etwa 140 1 eines klaren Filtrats erhalten wurden (Aktivität mcg/ml als Neplanocin A).

Beispiel 2

Das im Beispiel 1 erhaltene Filtrat wurde durch eine Säule mit 20 1 Kationenaustauscherharz Amberlite IR-120 (H⁺-Typ) (Warenzeichen) geleitet, um das Material zu adsorbieren. Es wurde mit 100 1 Wasser gewaschen. Die Elution erfolgte mit 3, 7N-wäßrigem Ammoniak und das primäre Eluat (30 1) wurde verworfen. 90 1 des nachfolgenden ELuats wurden gesammelt, durch Zugabe von 6N-HC1 auf einen pH-Wert von 8 eingestellt und sodann durch 4 1 Aktivkohle in einer Säule geleitet. Dann wurde mit Wasser gewaschen und hierauf mit 90 1 einer 70%igen methanolischen Lösung eluiert. Das so erhaltene Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert, wodurch 1,5 1 eines Konzentrats erhalten wurden. Das Konzentrat wurde auf eine Säule mit 10 1 Amberlite IRA-410 (OH""-Typ) aufgegeben und es wurde mit Wasser eluiert. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 4N-HC1 auf 7 eingestellt. Das Eluat wurde im Vakuum konzentriert und das Material wurde unter Abkühlen ausgefällt. Es wurde filtriert, wodurch 41,8 g rohes Neplanocin A (Reinheit etwa 12%) erhalten wurden.

Das rohe Neplanocin A (41,8 g) wurde in einer kleinen Wassermenge aufgelöst und auf 2 1 Silicagel in einer Säule (8,3 χ

909848/0567

4O cm) aufgegeben, die mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : 28^igem wäßrigen Ammoniak : Wasser (10 : 0,2 : 1) gepackt war. Danach wurde mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert. Jeweils 150 ml des Eluats wurden fraktioniert und aktive Fraktionen wurden in den Fraktionen Nr. 24 bis 52 festgestellt. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, im Vakuum konzentriert und unter Abkühlen stehen gelassen.

Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, wodurch 2,6 g rohes kristallines Neplanocin A (Ausbeute 32%) erhalten wurden.

Das rohe Neplanocin A wurde in etwa 60 ml heißem Wasser aufgelöst und bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die ausgefällten weißen nadeiförmigen Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, wodurch 2,01 g Kristalle von Neplanocin A erhalten wurden (Ausbeute 25,2%).

Beispiel 3

Das Filtrat (140 1, Aktivität 300 mcg/ml als Neplanocin C), erhalten bei der gleichen Verfahrensweise wie im Beispiel 1, wurde durch eine Säule mit 20 1 eines Kationenaustauscherharzes Amberlite IR-120 (H⁺-Typ) (Warenzeichen) geleitet, um das Material zu adsorbieren. Es wurde mit etwa 100 1 Wasser gewaschen. Die Elution erfolgte mit 3,7N-wäßrigem Ammoniak, wobei das primäre Eluat (20 l) verworfen wurde. 100 1 des folgenden Eluats wurden gesammelt, durch Zugabe von konzentrierter HCl auf einen pH-Wert von 8 ,eingestellt und sodann durch 4 1 Aktivkohle in einer Säule geleitet. Es wurde mit Wasser gewaschen und sodann mit 70 1 einer 70#igen Methanollösung eluiert. Das erhaltene Eluat wurde bei vermindertem Druck konzentriert, wodurch 1,5 1 eines Konzentrats er-

909848/0567

halten wurden. Dieses Konzentrat wurde gefriergetrocknet, wodurch 83,6 g eines rohen Pulvers erhalten wurden (Reinheit 29,590.

83 g des rohen Pulvers wurden in wassergesättigter n-Butanollösung aufgelöst und auf 2 1 Silicagel in einer Säule (8,3 χ 40 cm) aufgegeben, die mit n-Butanol gepackt war. Danach wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : konzentriertem wäßrigen Ammoniak ; Wasser (10 : 0,2 : 1) eluiert. Jeweils 150 ml des Eluats wurden fraktioniert und Aktivfraktionen wurden in den raktionen Nr. 53 Ms 108 gefunden. Die genannten Aktivfraktionen wurden gesammelt, konzentriert und bei niedriger Temperatur stehen gelassen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, wodurch 18,2 g Neplanocin C in Form von weißen Kristallen erhalten wurden (Reinheit 96%, Ausbeute 41,

Das Produkt wurde in heißem Wasser aufgelöst und bei Raumtemperatur stehen gelassen, wodurch das Neplanocin C in Form von farblosen plättchenformigen Kristallen ausfiel, die abfiltriert wurden. Auf diese Weise wurde reines Neplanocin C erhalten.

Beispiel 4

Das wie im Beispiel 1 erhaltene FiItrat wurde mit 3,6 kg pulverförmiger Aktivkohle versetzt. Nach 40-minütigem Rühren wurde die Aktivkohle durch Filtration gesammelt und gründlich mit Wasser gewaschen. Die Elution erfolgte mit 70%iger Methanollösung. 40 1 Eluat wurde im Vakuum getrocknet, wodurch 80 g rohes Pulver, das Neplanocin D enthielt, erhalten wurden.

909848/0567

Die 80 g rohes Pulver wurden auf 6 1 Silicagel in einer Säule aufgegeben, die mit n-Eropanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak : Wasser (10 : 1 : 1) bepackt war. Danach wurde mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert. Jeweils 600 g des Eluats wurden fraktioniert. Neplanocin D wurde in den Fraktionen Nr. 20 bis 37 festgestellt. Die Aktivfraktionen wurden gesammelt, im Vakuum auf 30 ml konzentriert und unter Kühlen stehen gelassen. Der Rückstand wurde durch Filtration gesammelt, wodurch 460 mg rohes kristallines Neplanocin D erhalten wurden.

Die 460 mg rohe Kristalle wurden in 3 ml heißem Wasser aufgelöst und auf eine Säule von Sephadex G-15 (1850 ml, mit Wasser gepackt) aufgegeben. Sodann wurde mit Wasser eluiert. Jeweils 100 ml des Eluats wurden fraktioniert und die Eluatfraktionen Nr. 15 und 16 (200 ml) wurden gesammelt. Sie wurden bei vermindertem Druck auf 20 ml konzentriert und bei Raumtemperatur stehen gelassen. Es wurden 314 mg ausgefälltes Neplanocin D als weiße nadeiförmige Kristalle erhalten.

Beispiel 5

(1) 376 mg Neplanocin D, gelöst in 10 ml wasserfreiem Pyridin, wurden gründlich bei 55°C gerührt. 0,9 ml Benzotrichlorid wurden tropfenweise zugegeben und es wurde 2 h bei 60 bis 65°C gerührt. Danach wurde die Lösung 2 h bei 40 bis 45°C gehalten und über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. 10 ml Wasser wurden unter Rühren zugesetzt und nach 25 min wurde die Lösung unter vermindertem Druck in einer Abdampf vorrichtung zur Trockene eingedampft. Das getrocknete Material wurde in 30 ml Chloroform aufgelöst, dreimal mit 10 ml 1 N-H^l und zweimal mit IN-Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Danach wurde es zweimal mit 20 ml Wasser gewaschen.

909848/0567

³⁹ 291700Q

Die Chloroformschicht wurde mit wasserfreiem Magnesiumsulfat entwässert und konzentriert, wodurch 747 mg einer hellcremefarbenen Verbindung (I) erhalten wurden (Ausbeute 91%).

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Verbindung (I) sind wie folgt:

[α]]Ρ = -199° (c = 0,6, Methanol)

Molekularformel: ^C32^H24^N4°7
Molekulargewicht: 576 (Massenspektrum) Schmelzpunkt: 116 bis 117°C
Ultraviolettabsorptionsspektrum: \____ = 232 mii,

E I/O rjr\t.

Rf-Wert (Chloroform : Methanol = 10 : 1); Rf = 0,53

(2) 735 mg der oben erhaltenen Verbindung (I) und 1,0736 g Phosphorpentasulfid, gelöst in 19 ml Pyridin, wurden gründlich miteinander verrührt. Es wurden tropfenweise 0,19 ml Wasser zugesetzt. Nach 4-stündigem Erhitzen am Rückfluß wurde das Reaktionsgemisch abgekühlt und im Vakuum konzentriert, wodurch ein braunes öliges Material erhalten wurde. Dieses ölige Material wurde in siedendes Wasser unter Rühren gegossen. Es wurde 30 min lang weitergerührt, wodurch eine gelbliche Substanz erhalten wurde. Diese wurde filtriert, um den Niederschlag zu sammeln, mit einem Gemisch aus Äthanol : Äther (1:1) gewaschen, mit Äther weiter gewaschen und getrocknet, wodurch 561 mg der Verbindung (II) (Ausbeute 74,3%) erhalten wurden.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Verbindung (II) waren wie folgt:

β -286,9 (c = 0,6, CHCl₃)

909848/0567

Molekularformel: ^C32^H24^N4°6^S Molekulargewicht: 592

Schmelzpunkt: 235 bis 239°C (Zersetzung unter Schaumbildung)

UV-Spektrum (in Methanol): 232 mil (E^_1n = 858,5)

/ 1 cm

323 H₇I (E^_cm = 327,5) Rf-Wert (Chloroform : Methanol =10:1);Rf=0,82

(3) 525 mg der unter (2) erhaltenen Verbindung (II) wurden in 31 ml wasserfreiem Methanol aufgelöst. 0,62 ml frisch-hergestellte 2N-Lösung vonNatriummethylat in Methanol wurden zugesetzt und es wurde 2 h lang unter Rühren am Rückfluß erhitzt, um die Benzoylgruppe zu entfernen.

Nach dem Abdestillieren des Methanols wurden etwa 50 ml Wasser zugesetzt und der pH-Wert wurde durch Zugabe von Essigsäure auf 7|5 eingestellt. Die Lösung wurde zweimal mit 20 ml Äthylacetat extrahiert und die wäßrige Schicht wurde konzentriert, wodurch Neplanocin-D-derivat (III) in Form von nadeiförmigen Kristallen erhalten wurde. Die Umkristallisation erfolgte aus heißem Wasser, wobei 110 mg Neplanocin-D-derivat (III) erhalten wurden (Ausbeute 44,3%).

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Neplanocin-D-derivats (III) sind wie folgt:

spezifische Drehung: wegen Meßschwankungen unmöglich

zu messen
\ Molekularformel: Ο^Η^Ν^Ο^ Molekulargewicht: 280 (Massenspektrum) Schmelzpunkt: 260 bis 262°C (Zers.) UV-Spektrum in H₂O: 226 mil (E^^_cm » 388,6)

324 nyi (E^^% _cm = 968,0)

Rf-Wert (Propanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak : Wasser =10 : 1 : 1); Rf = 0,21.

909848/0567

Beispiel 6

Zu 37 mg Neplanocin-D-derivat (III), erhalten im Beispiel 5, gelöst in 0,3 ml 0,4N-NaOH, wurden 0,009 ml Methyljodid gegeben. Es wurde 10 min lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurden 0,05 ml 0,4N-NaOH zugesetzt und es wurden weitere 0,009 ml Methyljodid zugegeben. Dann wurde erneut geschüttelt und bei Raumtemperatur stehen gelassen. Zu dieser Lösung wurden 10 ml Wasser gegeben und das Gemisch wurde im Vakuum auf 2 ml konzentriert. Es wurde auf eine Säule von Sephadex G-15 (1,4 χ 49 cm) aufgegeben. Die Elution erfolgte mit Wasser, wobei jeweils 3 g Eluat fraktioniert wurden. Die Fraktionen Nr. 17 bis 19 wurden gesammelt, konzentriert und abgekühlt, wodurch 35 mg kristallines Neplanocin-D-derivat (IV) erlalten wurden (Ausbeute

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Neplanocin-D-derivat (IV) sind wie folgt:

O3d³ = -141,7 (c = 0,7, H₂O)
Molekularformel: Oj ₂H-j 4N^O₃S
Molekulargewicht: 294 (Massenspektrum) Schmelzpunkt: 177 bis 178⁰C
UV-Spektrum in Wasser: 222 mn (E^_cm = 415,8)

288 mp (E^_cm = 676,3) 295 mu (E^_cm = 670,7)

Rf-Wert (Propanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak Wasser = 10 : 1 : 1); Rf » 0,42.

Beispiel 7

Synthese von Neplanocin A aus Neplanocin-D-derivat (IV):

909848/0567

50 mg des gemäß Beispiel 6 erhaltenen Neplanocin-D-derivats (IV), gelöst in 1,5 ml methanolischem Ammoniak (O⁰C-Sattigung), wurden in ein verschlossenes Rohr eingegeben und 7 h auf 146 bis 148°C erhitzt. Nach Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurde der Rückstand in 3 ml heißem Wasser aufgelöst und sodann abgekühlt, wodurch 33 mg Neplanocin A in Form von nadeiförmigen Kristallen erhalten wurden (Ausbeute 74?6).

Beispiel 8

(1) Zu 1,14 g Neplanocin D, gelöst in 12 ml wasserfreiem Pyridin, wurde 1 ml Essigsäureanhydrid gegeben und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. 30 ml η-Hexan wurden zugesetzt und das Gemisch wurde in Eiswasser gekühlt, wodurch 1 g der Verbindung (2) in Form von Kristallen erhalten wurde.

(2) 1g der Verbindung (2) wurde zu 25 ml einer Chloroformlösung gegeben, die 0,8 ml Thionylchlorid und 0,4 ml Dimethylformamid enthielt. Das Gemisch wurde 3 h bei Raumtemperatur am Rückfluß erhitzt. Das Chloroform wurde unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde unter Rühren in 100 ml Eiswasser gegossen. Die Extraktion erfolgte mit 100 ml Chloroform. Es wurde mit NaHCO^ und Wasser gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Das Neplanocin-D-derivat (3) wurde nach dem Trocknen im Vakuum erhalten.

Beispiel 9

Herstellung von Neplanocin A aus Neplanocin-D-derivat (3):

Das Neplanocin-D-derivat (3), erhalten im Beispiel 8, wurde in ein verschlossenes Stahlrohr gegeben. Es wurden 35 ml

909848/0567

gesättigte methanolische Ammoniaklösung zugegeben und es wurde 5 h lang bei 100⁰C umgesetzt. Nach dem Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum zur Trockene eingedampft, wodurch ein kristallines Pulver erhalten wurde, das durch Säulenchromatographie mit Silicagel gereinigt wurde, wodurch 286 mg Neplanocin A erhalten wurden.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften sind mit denjenigen von Neplanocin A, erhalten im Beispiel 7» identisch.

Beispiel 10

Das FiItrat (140 1, Aktivität etwa 50 mcg/ml als Neplanocin B), erhalten nach der Verfahrensweise des Beispiels 1, wurde durch eine Säule mit 20 1 Kationenaustauscherharz Amberlite IR-120 (H⁺-Typ) geleitet, um das Material zu adsorbieren. Es wurde mit etwa 100 1 Wasser gewaschen. Die Elution erfolgte mit 3,7N-wäßrigem Ammoniak, wobei das primäre KLuat (30 l) verworfen wurde. 90 1 des folgenden Eluats wurden gesammelt, mit 6N-HC1 auf einen pH-Wert von 8 eingestellt und sodann auf eine Säule mit 4 1 Aktivkohle aufgegeben. Es wurde mit Wasser gewaschen und danach mit 90 1 70^igem wäßrigen Methanol eluiert. Das so erhaltene Eluat wurde konzentriert, wodurch 500 ml eines Konzentrats erhalten wurden, das bei niedriger Temperatur stehen gelassen wurde, um das Material auszufällen. Der Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet, wodurch rohes Neplanocin B erhalten wurde (5,1 g, Reinheit etwa Ausbeute

Beispiel 11

Neplanocin B, erhalten im Beispiel 10, (5,1 g) wurde auf eine Säule mit Silicagel (8,3 χ 40 cm, 2 l) aufgegeben, die

909848/0567

mit einem Gemisch aus Aceton : Wasser (10 : 0,5) bepackt war. Es wurde mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert. Jeweils 80 g des Eluats wurden fraktioniert und die Fraktionen Nr. 16 bis 24 wurden kombiniert. Die Aktivfraktionen wurden bei niedriger Temperatur stehen gelassen, wodurch Neplanocin B in Form von weißen plättchenförmigen Kristallen ausfiel. Es wurden 2,57 g kristallines Neplanocin B erhalten (Ausbeute 32,8%).

Beispiel 12

Die Kultivierung wurde wie im Beispiel 1 durchgeführt, wodurch etwa 200 1 Kulturmasse erhalten wurden. Diese wurde filtriert und die Zellen wurden mit Wasser gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser wurden kombiniert, wodurch 140 erhalten wurden (Aktivität etwa 1,5 mcg/ml).

Die Lösung wurde durch eine Säule mit 20 1 Kationenaustauscherharz Amberlite IR-120 (H⁺-Typ) geleitet, um das Material zu adsorbieren. Es wurde mit etwa 100 1 Wasser gewaschen. Die Elution erfolgte mit 3,7N-wäßrigem Ammoniak, wobei das primäre Eluat (30 l) verworfen wurde. 90 1 des folgenden Eluats wurden gesammelt. Es wurde durch Zugabe von 6N-HC1 auf einen pH-Wert von 8 eingestellt und sodann wurde die Lösung auf eine Säule mit 4 1 Aktivkohle aufgegeben. Es wurde mit Wasser gewaschen und sodann mit 90 1 70&Lgem wäßrigem Methanol eluiert. Das so erhaltene Eluat wurde konzentriert, wodurch 500 ml eines Konzentrats erhalten wurden, das gefriergetrocknet wurde, wodurch 31»2 g rohes Neplanocin F erhalten wurden (Reinheit etwa 0,5?Q.

Beispiel 13

Rohes Pulver von Neplanocin F, erhalten im Beispiel 12, (31,2 g)

909848/0567

wurde auf eine Säule von Silicagel (800 ml) aufgegeben, die mit einem Gemisch aus n-Butanol : 28^iges wäßriges Ammoniak : Wasser (10 : 0,2 : 1) bepackt war. Sodann wurde mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert. Jeweils 150 ml des Eluats wurden fraktioniert und die Fraktionen Nr. 5 bis 10 wurden kombiniert. Das erhaltene Gemisch wurde im Vakuum konzentriert. Das Konzentrat wurde auf eine Silicagelsäule (240 ml) aufgegeben, die zuvor mit einer Mischlösung aus Chloroform : Methanol : Essigsäure (10 : 2 : 0,2) bepackt worden war. Es wurde mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert, wobei jeweils 20 g der Fraktion fraktioniert wurden. Die Fraktionen Nr. 67 bis 120 wurden kombiniert, konzentriert und getrocknet, wodurch rohe Kristalle von Neplanocin F (108 mg, Ausbeute 51%) erhalten wurden.

Beispiel 14

Rohe Kristalle von Neplanocin F (108 mg), erhalten im Beispiel 13» wurden auf eine Säule von Sephadex G-15 (186 ml) aufgegeben, die mit Wasser bepackt war. Es wurde mit Wasser eluiert. Jeweils 10 g der Fraktion wurden fraktioniert und die Fraktionen Nr. 22 bis 27 wurden gesammelt, kombiniert und auf 5 ml konzentriert. Die erhaltene Lösung wurde in einem kalten Raum stehen gelassen, um das Neplanocin F in Form von weißen nadeiförmigen Kristallen auszufällen. Der Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet, wodurch kristallines Neplanocin F (87 mg) erhalten wurde (Ausbeute

Ende der Beschreibung.

909848/0567

Claims

-S-

Patentanspruch e

/ 1/ Antibiotische Neplanocine der allgemeinen Formel:

worin X für NH₂, -OH, -SH, -SCH₃ oder Cl steht, R für ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe für eine -OH-Gruppe

Y
steht und Z eine Gruppe R0"H₂ ^c-\ ) , worin Y für -0- oder

eine Valenzbindung steht und R für ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe für die -OH-Gruppe stehi^ oder eine Gruppe

OH

, worin Y für -0- oder eine Valenzbindung HOH₂C

steht, bedeutet.

Naplanocin A mit der Formel!

909848/0567 ORIGINAL INSPECTED

291700Q

NH.

HOH₂O

OH OH

3. Neplanocin C mit der Formel:

HO-H,

OH OH

4. Neplanocin D mit der Formel:

OH

HOH₂C

OH OH

9098A8/0567

291700Q

5. Neplanocin-D-derivat mit der Formel:

SH

HO-H jj C

OH OH

6. Neplanocin-D-derivat mit der Formel:

SCH.

HOH₈C

OH OH

7. Neplanocin-D-derivat mit der Formelt

9098A8/0567

AcOH₂C

QAC OAC

worin Ac für eine Acetylgruppe steht.

8. Neplanocin B mit der Formel:

HOH,

QH

9. Neplanocin F mit der Formel:

OH

HOH₂C

909848/0567

10. Verfahren zur Herstellung von Neplanocinen der Formel;

worin X für NH₂ oder -OH steht und Z eine Gruppe ^H0"^H2^C

oder eine Gruppe _{unu r} /'^& , worin Y für -0- oder eine

Valenzbindung steht, bedeutet, dadurch gekennzeichnet , daß man einen neplanocinerzeugenden
Mikroorganismus der Gattung Ampullariella in einem Nährmedium kultiviert, welches Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff und eine anorganische Substanz enthält, und daß man Neplanocin-A, -C, -D, -B und -F aus der Kulturmasse isoliert.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß man als neplanocinerzeugenden Mikroorganismus Ampullarilla sp. A 11079 FERM-P Nr. 4494 verwendet.

909848/0567

- 6 - 291700Q

12. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet , daß es neben üblichen Hilfs- und Trägerstoffen wenigstens ein Neplanocin nach Anspruch 1 enthält.

909848/0567 ORIGINAL INSPECTED