SE443576B - Antibiotiska neplanociner och forfarande for framstellning av dem genom odling av ampullariella sp a 11079 nrrl 11451 - Google Patents

Description

7903672-9 10 15 20 25 30 MW 263 nm, 151% = 602,1 1 cm vid 6114/6666 s: 71 m = 261 mn, 51% = 566,4 1 cm 1% 1 cm vid pH-varde 10: kmqx = 263 nm, s = 595,0 (7) Infrurödobsorptionsspekfrum (KBr): visas i Fíg.2.

Abmrpfionsrmnd 17160360, 3200, 2920, 1640, 1600, 1570, 1480, 1415, 1370, 1330, 1300, 1250, 1205, 1160, 1115, 1080, 1050, 1005, 910, 850, 790, 730 61151. (8) Körnspínnresononsspektrum: visat i fíg.3 (ínre.stondord DSS, i Deuterium dímefylsulfoxid, 100 Hz). (9) Löslíghet: Löslígf i vatten, dimefylsulfoxíd, dímetylformamíd, üftíksyro och vattenhultigt oceton.

Olöslígt: etylocetot,.kloroform, benzen, hexon. (10) Förgreoktioner: Positiv: avfärgning av kclíumpermonganut, períodotoxídatíon och onísoldehyd.

Negufív: jörn(III)kloríd,nínhydrín, unílínftulot, Molisch och Fehlíng. (11) Natur: svagt basískt. (12)) Färg: Vito nålkrístuller. , (13) R,-värde (kíselsyragel, Tokyo Kusei Co., kíselsyrugel . f): n-bufonol: öffíksyrczvoften (6:1:1); Rf-värde = 0,36 n-butunol: koncentrerad vattenlösning av ommoníokzvatten (10:0,5:2); Rf~vörde = 0,27 n-propunol: koncenfrerud vottenlösníng ov ommoniukzvntten (10:1:1); Rf-värde = 0,41 10 15 20 25 30 7903672-9 acetonzvatten (10:1); Rf-värde = 0,34 efylacetatzmetanol:vaffen (10:2:1); Rf-värde = 0,21 kloroformzmetanol:öttíksyra (l0:2:1) ; RF-värde = 0,17 (14) Kemisk struktur: _ NH, N k, N Ho-Hzc H ' OH OH 'De biologiska egenskaperna av neplanocin Å ör följande. (1) Tíllvöxtinhiberande aktivitet på växtpatogena svampar; 100 ug/ml lösning av neplanocin A på en agarplatta med Helminthosporium oryzae M 0306 visar en ínhibitíonszon på 18,9 mm i diameter. (2) Anfi-tumörakrivitet: Murin leukemi L-1210 tumörceller (106 celler) ínokulerades intra- perironealt på mus och en dag.efter transplanrationen , neplano- cin A (vardera 0,16 mg/kg, 0,32 mg/kg, 0,63 mg/kg, 1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg och 5,0 mg/kg respektive) admínísrrerades infraperíro- nealf en gång om dagen under 5 dagar. 10 möss i en kontroll- grupp på 7 möss_i varje behandlad grupp användes. Resulraten vi- sas i fig.4. Efter 15 dagars observation var medelöverlevnads- tiden för kontrollgruppen 7,4 dagar. Förlängning av livslängden 7903672-9 10 15 20 25 30 jämfört med kontrollgruppen observerades för de läkemedelsbe- handlade grupperna, dvs 158 % för 0,16 mg/kg, 170% för 0,32 mg/kg, ingen mortalitet observerades för 2,5 mg/kg och 5 mg/kg.-grupper- HG, Liksom för L-1210 observerades remarkabla förlängningar av livslängden mot Ehrlich ascites-tumör, Sarcoma-180, P-388 leukemi- bärande möss och rått-Yoshida sarcoma när mässan administrera- des neplanocin A. (3) Akut toxícitet: LD50:13,7 mg/kg.(i.p. ,mus) Ingen mortalitet observerades vid administration intraperitoneellt under 14 dagar med 5 mg/kg/dag.

Föreskrifter och doser: För terapi av akut leukemi skall läkemedlet administreras intra- venöst i en dosform av från 5-20,mg/dag upplöst i fysiologisk koksaltlösning en gång om dagen under 7 dagar. Neplanocin A är också effektivt för terapi av kronisk leukemi, gastroentero carcinom, pulmcnärt carcinom, uterin cancer, cancer mammae och malign lymfatisk leukemi.

Neplanocin A kan användas i form av ett fysiologiskt acceptabelt salt av en mineralsyra eller en organisk syra, såsom hydroklorid- en, acetatet, tartratet, citratet eller succinatet.

Neplanocin C är en svagt basisk substans med följande fysiologiskt kemiska egenskaper. (1) Elementäranalys: 10 15 20 25 30 7903672-9 Erhållet: C; 47,59% H; 4,64 X N; 25,10% Beräknat: C; 47,311 H; 4,66% N; 25,09 X (2) Molekylvikt (beräknat ur masspektral ana1ys): 279 [fetruacetyl neplanocín C: 447] (3) Molekylformel : C11H]3N504 (4) Smöltpunkt: (bestämd gènom termisk onalys): 22ó°C (sönderdeln.) (5) specifik vr13ning= [6]21 = _43,6° (6= 0,67%, H20) (6) Ultrnvioleff absorpfíogsspekfrumz (16/ug/ml) i H20§')\ max = 263 nm, E1% = 538,9 (visad i fíg.5) 1 cm vid pH-värde 3:>\m0x= 259 nm, E1% 510,8 1 cm vid pH_v3rd6 10=Å m6x=263 nm, 51% 534,4 1 cm (7) Infrarött ußšorptíonsspektrum (KBr): visat i fig.6.

Ab56rp116nsb6nd vid 3450-3100, 2920, 2740, 2630, 1630, 1630, 1600, 1560, 1500, 1460, 1420, 1330, 1360, 1330, 1300, 1240, 1200, 1170, 1100, 1050, 1020, 960, 920, 900, 330, 330, 730, 720, 630 6m'1. (8) Kürnspínnresonansspektrum: visat 1 fig.7. (inre standard DSS í Deuterium dimefylsulfoxíd, 100 MHz). (9) Solubilífefz 4 Löslig 1 vatfen, dímetylsulfoxid, dímetylformamíd.

Olöslíg: etylacefai, kloroform, bensen, hexan. (10) Förgreaktíon: Positiv avfärgning av kalíumpermanganot, periodat och Tollens.

Negafív jörn(III)k1oríd, ninhydrin, anisaldehyd och Nolísch. (11) Natur: svagt basísk. (12) Fürg:vít (färglösa, plana kristaller) 7903672-9 10 15 20 25 30 (13) Rf-värde (kíselsyragel-flückfilm, Tokyo Kaseí Co., kisel- syragel f): I n-butanolz öttíksyra: vatten (6:1:1) ; Rf-värde = 0,33 n~butanol: koncentrerad vattenlösníng av ammoníakzvatten (1o=o,§=2); R,-värde = 0,19 n-propanol: koncentrerad vattenlösning av ammoníakzvatten (10:1:1); Rf-värde = 0,30 aceton: vatten (10:1); Rf-värde = 0,43 efylacefat:metanal:vaften (10:2:1); Rf-värde = 0,27 kloroformzmetanol:üttíksyra (10:2:1); Rf-värde = 0,20 (14) Kemisk Struktur: H0 "O nan-ou eDe biologiska egenskaperna hos neplanocín C är följande: (1) Tillvöxtínhíberande aktivítef på vöxfpafogena svampar: 100 ug/ml lösning, pappersskivor med en diameter av 7 mm; Helmínthosgorium orxzae M 0306: 31,4 mm (ínhíbítíonszon) Cladasgoríum herbarum M 4278: 14,0 mm ( " ") Ålternaria kíkuchíana M 4588: 12,0 mm ( " ") (2)_Akut toxicítet: LD50:55 mg/kg (íntraperifonealt mus) 10 15 20 25 30 7903672-9 Neplonocín C kan användas i form ev fysio1ogískt_ucceptobelt salt av en minerolsyro eller organisk syra, såsom hydroklorid, ocefut, furfraf, cítruf eller succíncf. (3) Anti-tumöruktívífef:_ Neplonocin C inhiberor fullständigt tillväxt av murin leuke- mísk cellkultur av L-5178Y vid koncentrationen av 0,8/ug/ml in vítro.

Neplunocin C har en lívsförlüngonde effekt på 131 1 i T/C (behandlade/konfroll) mot murín leukemi L-1210 när den admini- streras introperitoneolt med en dos av 10 mg/kg.

Neplanocín D har följande fysikalisk?-kemiska egenskaper. (1) Elemenfuronolys: C; 49,701, H; 4,64%, N; 21,201 (2) molekylviktz (beräknat ur mosspektro1onolys): 264 (3) molekylformel: C,,H12N¿04 (4) sma1fpun| (5) Specifík vridning: [a]23 = -145° (c= o,6%, H20) (6) Ulfrovioleft obsorptíogsspektrum: i vatten visat i fíg.8, )\mux=251 nm, E1% = 479 1 cm í sur vatfenlösníng: >\nmx = 251 nm, E]% = 453 1 cm i clkolísk vutten1ösníng:§ max = 256 nm, E1% = 508 1 cm (7) Infraröd ubsorptíonsspekfrum (KBr): visat í fíg.9.

Absorpfíonsbond vid 3420-3120, 2940-2880, 1680, 1580, 1545, 1510, 1440, 1390, 1305, 1210, 1110, 1075, 1040, 1000, 990, 975, 900, 845, 780 cmf1. 79036720-9 10 15 20 25 30 (8) Kärnspinnresonunsspektrum: visat i fig.10. (inre standard DSS, i Deuterium dimetylsulfoxid, 100 MHz) (9) Löslighet: Löslig í vatten, dimetylsulfoxid, dimetylformumid, öttiksyra och pyridin.

Olöslígz efylccetot, kloråform, bensen och hexun. (10) Fürgreoktion: (Positiv: avfärgning av kulíumpermcngunuf och periodat oxidation.

Negativ: ninhydrín, Fehling och jörn(III)klorid. (11) Färg; vita nålkristoller. (12) Rf~vörden (kiselgel, Tokyo Kasei Co., kíselgel f): n-butanol: üttíksyrc:vuften (6:1:1); Rf-värde = 0,27 n-butunol: koncentrerad vuttenlösning ummoniukzvctten (10:O,5:2): Rf~vörde = 0,07 n-proponol: koncenfrerad vctfenlösning, ummoniokzvatten (10:1:1); Rf-vörde = 0,18 ocefonzvutten (10:1); Rf-värde = 0,33 (13) Kemisk struktur: H0 H0 DZH-OH _... <: Nššï . _ N HU Akut toxicitef för neplunocín-D enligt följande.

Ingen död observerades när 100 mg/kg neplonocin D udminisfre- rudes íntruperítoneult.till mus. <7 7903672-9 Hcplanøcín B har följande fysika1isk1-kemiska egenskaper: (1) (2) (3) (H) (5) ucs) (7) Elementäranalysz C N7,hu 1; H 0,63 E; N 25,07 1.

Motvikt: (beräknad ur masspektroanalys) 279.

Molekylformelz Cl1H13N50q.

Smältpunktz 269-272°C (sönderdelning). 2H Optisk vridning: (0<)D = - 3,5 (c = 1,0 ß dimetyl-sulfoxid).

Ultraviolett absorptíonsspektrum: 1 H20: visar 1 fig. 11,1max = 202 mm, 21* = 530,0 i surt vatten: 1 cm (en droppe 0,1N H01) >\max = 259 mm, râæcm = 500,7 - i alkaliskt vatten: 1% (en arappe 0,1 N Naou) Amax = 203 mm, nl cm = 522,2 Infrarödabsorptionsspektrum (KBr): visat i fig. 12.

Absorptionsband vid 3380, 3280, 3100, 2920, 2880, 2700, 1700, 1610, 1570, 1520, 1000, 1020, 1300, 1350, 1300, 1250, 1220, 1170, 1100, 1100, 1000, 1030, 1020, 900, 970, 070, 000, 790, 730, 710 cm' (8) (9) (10) (11) (12) 1 Kärnspínnresonansspektrum: (visas i fig. 13) (inre standard DSS, i deuteríumdimetylsulfoxid, 100 MHz) Löslighet: Löslig: vatten, dimetylsulfoxíd _ Olösligz etylacetat, kloroform, bensen och etyleten.

Färgreaktion1 Lätt positiv: avfärgning av kaliumpermanganat.

Negativ: ninhydrin, Molish och anisaldehyd.

Natur: svagt basisk.

Färg: vit (vita flakformiga kristaller). /\ 7903672-9 10 (13) Rf-värde: (kíselgel f , Tokyo Kasei Co.) n-butanolz ättíksyra 2 vatten (6:l:1) Rf_ = 0,N2 n-butanolz konc vattenl. av ammoniak:vatten (l0:0,5:2) Rf = 6,27 n-propanol: konc. vattenlösn. av ammoniakzvatten (l0:1:l) Rf = 9,Hl aceton: vatten (10:l)} Rf = 0,U8 (lä) Strükturforpel NH2 k.. N HO-Hvil OII OH 10 15 20 25 30 79Û3672'9 :Il Neplunocin F hur följande fysikoliskt-kemiska egenskaper. (1) Elemenförunnlysz C; 48,741, H; 4,83fl, N; 25,71¶ (innehål- ler kristullisotionsvotten) (2) Molvikt (beräknad vr m0sspektro1onolys): 268 (s) 11°1e1 (4) smaufpunkf; 22a°c (safiaeraaning) (s) spgcmk vridning; nå' = 8,8 (.~.=0,8z, 820) (6) Ultroviolett obsorptíonsspektrum: _ i H20: visat i fíg.1f, Ä max: 263 nm, E1$cm=548,7 i surf yutten (en droppe av 0,1 N HC1): Å|nux=2ÖO nm, EI; = 52711 i ulkuliskt vatfen (en droppe 0,1 N No0H):Åm0X=2Ö3nh]E: Ücm = 53118 Cm (7) Infrurötf obsorptíonsspektrum (KBr): visat i fíg.15, Absorpfionsbund vid 3320, 3210, 2920, 1650, 1610, 1580, 1480, 1420, 1880, 1840, 1810, 1270, 1220, 1180, 1110, '1070, 1020, 980, 900, 840, 800, 7:10 8.1.4. (8) Körnspínnresonønsspektrum:_visot i fíg.16. (inre standard DSS, i Deuterium dimefy1su1foxid,100.MHz) (9) Löslighetf Löslíg i vatten, dimetylsulfoxid och öttiksyru.

Olöslig i etylocetut, kloroform, bensen och etyleter. (10) Förgreokfíun: Lötf positiv , avfärgning av kuliumpermangunuf.

Negafiv: jörn(III)k1orid, ninhydrin øch Fehlíng. (11) Nufur: svagt bosisk. _ (12) Färg: vit (vita ,p1unu kristaller). (13) Rf-värde (kiselgel f, Tokyo Kcsei Co.): n-buiunolz öttiksyrozvutfen (6:1:1); Rf=0,51 9 n-ßutonolz koncentrerad vattenlösning av nmnoníuk:vutten _ (10:O,5:2); Rf-värde = 0,43 79os672¿9 12 n-prapanol: koncentrerad vattenlösning av ammaníakzvatten (10:1:1); Rf-vörde = 0,59 aceton: vatten (10:1); Rf-värde = 0,48 (IQ) Kemisk struktur: 10 BOHZC 15 Néplanocin-B och*-F har följande. fysikaliskt kemiska egenskaper. (1) Åküt toxicitet: Ingen mortalitet observerades vid intraperitoneal administration till mus på 100 mg/kg av neplanocin-B eller -F. 20 _(2) üelltillvöxtínhiberande aktivitet: Tillväxt av muslymfoma celler L 5178Y kultur inhiberades vid en koncentration av 0,8/ug/hl neplanocin B och 2q/ug/hl neplanocin F. 25 , _ (3) Anti-tumöraktivítet: Neplanocin B hade en livsförlöngande effekt av 1421 i T/C (behandlad/kontroll) mot murin-leukemi L-1210 när den administre- rades intraperitonealt f med en dos av 50 mg/kg. 30 '(4) Annan aktivitet: Neplanocin B har en antidepressiv aktivitet. 10 15 20 25 30 7903672-9 13 Ncplanocin-bildande mikroorganismer isolerade: från ett jord- prov insamlat på ett lökfölt i Niigato-ken, Japan och hör till genus Ampullariella. Stammen betecknas Åmpullariella cp.A 11079 och har deponerats i den permanenta samlingen vid Institute for Microbial Industry and Technology , Japan com FERM-P nr 4494.

Ampullariella sp. A 11079 NRRL l1H51 har följande taxono- miska egenskaper.

(I) Morfologiska egenskaper: Observationer på aorganiskt salt-stärkelse-agarmedium vid 30°C under 10-15 dagars kultur var följande.

Stammen A 11079 gav eü böjt och granat substratmycelium, 0,5-0,8/um i diameter och ett autvecklat luft-mycelium.

Sporongiofor-tillväxt på substrat mycelium hade sporongia och formen has sporangium var cylindrisk eller flaskfarmad och uppmöttes från 5-15 x 10 - 25/um. Många sporangi-sporer var ordnade i parallella kedjor i sporangium. Sporangiesporerna hade en rörlighet genom en knippe polöra flagella i vatten och är stavformade och möter från 0,5 - 1,0 x 1,0 - 2,0/um.

(II) Sammansöttning av diaminopimelinsyra: Diaminopimelinsyra bestämdes vid hel cellanalys i meso- och _ hydroxityp.

(III) Kulturella egenskaper på olika media: Observatianer av kulturella egenskaper på olika media vid 30°C under 20 dagar visas i tabell 1. Inget luftmycelium observerades *x utom en lött bildning av en' icke utvecklad tillväxt av luft- ' 7903672-9 10 15 20 25 mycelium på oorganiska salf-siörkelse-agarmedium och veíemjöls- agarmedium. Ångivanáet av färg baserar sig på definitionen i “Color Harmony Manual", fjärde upplagan, 1958, publicerad av Container Corpora- fion of America.

(IV)_Fysio1ogiska egenskaper: De fysiologiska egenskaperna illustreras nedan. 1) Utnyttjande av kolkëllorz (+: positiv -: negativ) Kolkölla utnytfjande Kolkölla utnyttjande Lparabinas + salicín + D-xylos + D-galaktos D-glukos + glycerol D-frukios + L-sorbas - D-mannos + frehalos + D-mannitol + a-melibios - ínosiiol - D-ribas - L-famnas + maltos + saakaras + melezifos - B-laktos - D-cellobias + paffinos_ - D-sorbitol - - cellulas - dulcitol - sförkelsep + ---- s 1 9 _ ut. wa ^w»mv Hwcox - m^unmv ~caun¶H:m | vomnwwounso »www umcm mmflwv homo mmcmnmz ww . mwwwæs xfip ac Eamvos cosmxoïv W/ wwmcw finwwv naëoß I mmflmumw umnm lfiwwøs fiflww umfiww ammo +om+w:|nox:H0 _ x^~ ac Eawwuë cosuxolv vwmcw Anwwv union I nmumuww. omcm mwwwmzflwvos homo «on+mc|Houoo>Ho , _ _ . nom x^mN ac Eamwøs coemxozv .ñmxxxwv tshßššš 38 .ämåäwcux åfi S? mfiåsfløvw... ba.. +v_.afi.~tw.?...°v_=~w m=«c¶H«mxuu> _ ^onmV . comwc .m«++wE .umv vowumwounfio væmfi ¶wmflm*owmæww»^ocov mono* ommflmw .ufluwuë Hama vom homo +HoE|wwwñ wwmcfl unfios wawflnfiupmv vomumwuuneo Eamvue vom homo m:>umuu>o: _ mmvwws . wwmcm fiumnv vumumwouneo uwmfl omcw lfiuvoë Ham» mmflww homo cæmou>h Aomwv . mwvwws homo om tea wmcohoàïtunfišuv Rakävše.. .än 42:e 23 »om åäzwïifiä twvamflå mwwvwë 1 . +ømc« Aoumv owonHuwn|^nwNv :sann omcm ufiouws wflwu mmfimv uomo c«mouonwo|Houwu>Hø . _ “aims . vwmcw fiouwv omonanmnl ^nwNV :neon ohmmc |~m¶wE fiflwæ mwflww homo cmmouomwomwoxafiø 1.23 mmtæa vømcm Mnmcoaws wmwfi | Aounv Omouflumn ouwø: lfiwwmë Hflma mmflmv homo vouwmclnouoxuom +cwEmMa vmflfinm s:««uu>E~ou«wnan mn mumw Eammcouonm vxm>HH«P Eamwoz ; uowvuë oxmfio wa uøaoxwcmmø ofifiuuavfiox .f flflmnoh u v. .ou n:«xH«3 4 wsomfiwï .^mmß_v ~«_ .uw .H°fl«~*u°m .w XXXX .^ß@@.V .~. .H°~«> .w XXX .flnwmpv vw .NN ..u°m .How .H~@=°««= uxnwfiw .w xx . =»-~u>s°=««°< ~;»= ..<.w .==Emxu=x ,~.~v . «c:«nx«Hwwc ñøpnvfiwcoxa ^o«nvvomum»~mEo1 umcw vom xxxx nomm cwwmux hflnvv tsh߶¶>~x vxkwe Avfimv wumhmwukßsu +«w~ =m=« mmfimw ~H«« m«««»eH@vwe «°m°=«wm «»mfi|=°«@»m um. «c:»nx«Hmwc ^umnv+«> ««uE1^omnv cnnanwmfl omcm . mmfiww xxxx Homo c«wou>P 1 wwmcm Aucmaopnv vownmwuußsu Damm: vom Hfl««.m«v«mEHwvmE koma vxonaxøvnmm mxmamflu 1 ^manv flupmv wnmnmwounsu . caupwflnm vxwfin |^u«nvvomumwuunEn vvmfi oumwc vom HH«« mmævmsfiowme ummo_wxmmuNu ucownum :wš ¶ _ . _ - xfion Hc Eawvuë cusmxozv cnkprfino wxwfin Awcnv N0ao+|^wnmv¶omuwwonnEu umcw mmvwwëfluvms Hawa vom namn w+w:cwm Amßwomnnv _ xñww ac Eamvwë cusmxoïv cnunwfiaw ^wmnvflmEox|^w~nv wumnmwfimcox cmzm mwvawsfiwwwë Hawa woo homo mcomumëm æcvêwfin +m«HmmH E:mHøo>E+uu«mp:w mn mmm» Eammcouønm +xw>~Hwh ESMÜUE 79Û3672~9 .nauow .P Hflmßoh 10 15 20 25 30 "fi 7903672-9 1o_4s°c. 3) Verkan på skummjölk: peptonisering och koogulering positiv. 2) Tillväxt-temperatur : 4) Melaminproduktion: Tyrosín-agarmedium: negativ.

Peptonjöst-jörnagarmedium: positiv. 5) Störkelsehydralys: 6) Cellulósohydrolys: 7) Kaseinhydrolys: positiv. positiv. negativ. 8) Gelatinsmältningz positiv. 9) Tyrosinsönderdelningz negativ. 10) Xantinsönderdelning: negativ. 11) hypoxantinsönderdelning: negativ. 12) H25-bildning: negativ. 13) Nitratreduktion: negativ.

Enligt ovanstöende taxonamiska data där stammen Å 11079 har sporangia uppbörande sporangiofar tillväxt på ett grenat sub- strat-mycelium, cylindriska eller flaskformade sporangiêr, sporangiosparer arrangerade i parallella kedjor i sporangium,- stavformade sporangiosporer med ett knippe polöra flagellum och meso-diamina-pimelinsyra, vilken stam tillhör genus Ampullariel- lg vid genomgång av "key to the genera of family Actínoplana- ceae " i Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 8:e upp- lagan, 1974, sid. 707-708. Därför betecknas denna stam Åmpullariella sp. A 11079.

Enligt föreliggande uppfinning tillhandahålles den nya antibiotiska neplanocin-A, -C, -D samt derivaten därav, -B och -F.

Ett annat ändamål med föreliggande uppfinning är att tillhanda- hålla antibiotika av neplanacin1gruppen}yi1ka är aktiva mot vöxtpatogena svampar, tumörceller och liknande. 7903672-9 10 15 20 25 30 19.

Föreliggande uppfinning heskrives i detalj med hänvisning till bifogade ritningar, dör fig.1 visor ett ultraviolett absorp- tionsspektrum för neplanocin Å, fig.2 visar infraröda absorptions- spektrum för neplanocin A, fig.3 visar körnspinnresonansspektrum för neplanocin A, fig.4 visar effekten av neplanocin A på L~121O leukemi-börande möss, fig.5 visar ultraviolett absorptionsspek- trum för neplanocin C, fig.6 visar infrarödabsorptionsspektrum för neplanocin C, fig.7 visar körnspinnresonansspektrum för neplanocin C, fig.8 visar ultraviolett absorptionsspektrum för neplanocin D, fig.9 visar infrarödabsarptiansspektrum för neplano- cin D, fig.10 visar körnspinnresonansspektrum för neplanocin D, fig.1l visar ultraviolett absorptionsspektrum för neplanocin B, fig.12 visar infrarödabsorptionsspektrum för neplanocin B, fig.13 visar körnspinnresonansspektrum för neplanocin B, fig.14 visar ultraviolett absorptionsspektrum för neplanocin F, fig.15 visar infraröd absorptionsspektrum för neplonocin F och fig.l6 visar körnspinnresonansspektrum för neplanocin F.

Enligt föreliggande uppfinning bildas neplanocinerna vid exempel- vis inokulering av stammen Ampullariella sp. A 11079 NRRL llU5li ett lämpligt nüringsmedium. Odlingen av mikroorganismen kan genomföras på ett antal olika sött, såsom i ett syntetiskt medium eller ett naturligt medium, flytande eller fast kultur.

Vid industriell produktion föredrages ett flytande medium. För_ sammansättning av medium kan användas en assimilerbar kolkö1la,e kvövekölla, oorganiskt salt och andra för antibiotiska neplano- cinbildande mikroorganismer. Exempel på kolköllor ör glukos, sackaros, glycerin, löslig stärkelse, melass och liknande.

Assimilerbaro kvöveköllor ör pepton,-majsstöpvötska, sojabön- pulver, köttextrakt, riskli, kaseinhydrolysat, nitrat, ammonium- salt och liknande. Ett oorganiskt salt, såsom natriumklaridh 10 15 20 25 30 7903672-9 fosfat (kalcium, magnesium, jörn(lI) eller mangan) kan också an- vändas. Anti-skummedel som silikonalja eller sojabönolja kan tillsüttas.

För flytande kulturer kan lämpligen kulturen tillföras luftning under ytan. I detta fall väljas odlingstemperaturen för optimal temperatur hos mikroorganismerna lämpligen till 25-3006. Odlings- tiden beror på villkoren och kan vanligen vara 2-4 dagar. pHfvördet i mediet under odlingen regleras lämpligen genom neutralt eller lött surt tillstånd.

Detpå detta sött odlade mediet innehåller antibiatiska neplana- ciner. Isolering av de antibiatiska neplanocinerna kan utföras genom konventionell isolering eller separationsförfaranden för mikroarganism-metaboliter. Emedan neplanociner är svagt basiska ämnen kan de isoleras genom absorption på lämpliga absorptions- medel, följt av eluering med ett lämpligt lösningsmedel. Exempel på absorptionsmedel är aktivt kol, katjonbytareharts, aktivt alu- miniumhydroxid eller kiselsyragel. Elueringslösningsmedel völjes med detanvënda absorptiansmedlet, exempelvis vattenblandbara or- ganiska lösningsmedel som en vattenhaltig metanol, vattenhaltig aceton eller vattenhaltigt dioxan eller sura, alkaliska lösningar eller saltlösningar.

Vidare kan neplanocinerna isoleras och renas beroende på den svagt -basiska naturen hos ämnena. Antibiotika absorberas exempelvis på katjonbytarharts som Åmberlite IRC-50 (handelsnamnet från Rahm och Haas Co., USA) eller Dowex 50 (handelsnamn från Dow Chem.

' Co.,USA) och elueras med lämpliga sura, alkaliska eller saltlös- ningar. 7903672-9 10 _15 20 25 30 En kombination av absorptionsmedel och jonbytorharts kan lämp- ligen utnyttjas för'isolering, eluering och rening av antibio- tika. Exempelvis kan odlingsfiltrotet överföras till ett katjon- bytarharts Amberlite IR-120 (handelsnamn) för att absorbera antibiotika och elueras med en alkalisk lösning, såsom 3,7 N am- moniaklösning i vatten för erhållande av en aktiv fraktion och sedan pH-värdet justerots till neutralt eller svagt basiskt pH absorberas'antibiotika på aktivt kol följt av eluering med 70% metanol. Elueringsvötskan absorberades på en anjonbytarharts Amberlite IRA-410 och eluerodes åter med vatten för uppsamlande av deloktiva fraktionerna. De sammanslagna fraktionerna koncen- trerades för erhållande av orent material och renades slutligen genom kiselsyragelabsorptionskromatografi. Ytterligare rening erhölls genom omkristallisotion. Renheten som ett enda ömne kan provas genom att följa en amältpunkt eller en fläck på vitt papperskromatografi, tunnskiktskromatografi och papper-elektro- fores med 263 nm ultraviolett ljus.

Neplonocin Å kan syntetiseras ur neplonocin D via neplanocin; D derivat på följande sött.

Tre hydroxigrupper i cyklopentenringen i neplanocin D skyddas ge- nom reaktion med bensoylklorid. En hydroxigrupp i adeninstruk- turen i neplanocin D omvandlas till en merkaptogrupp genom reak- tion med exempelvis fosforpentasulfid, varefter de skyddade groo- perno för hydroxigrupperna avlägsnas , varvid erhålles neplanacin D-derivat (III). Metylering med metyljodid gav neplanocin“D=” i derivat (IV). Neplanocin D derivatet (IV) behandlades med metanolisk ammoniak för bildning av neplanocin A.

Vidare acylerades de tre hydraxigrupperna i cyklopentenringen i 2* 79oå672-9 neplonocín D för off skydda genom reokiion med öiiiksyroonhydrid varefter nömndo förening omvondlodes fill neplonocin D-derivat [3] genom 'àeokfion med iionylklorid. Neplonocin D derívotei [3] kon omvnndlos fill neplonocín Å vio neplonocin D derívofei [4] genom behandling med metonollösning ov ommoniok.

Desso reaktioner kon illustreras på följande sött. ( 7903672-9 22 / N N N N a ~--» § B \N ' benzoyl N \ N BZOHZC (I) su _ n > P z S 5 k N N (III) Rep] anocin D derivat za 7903672-9 Q; 1- _ l Nepïanocln A 3 * meianoliaki ammoniak Hon,o on H Neplanocin D derivat.. ' (IV) (2) ou °¿ u N N N š ___-_» § llcplanocin D --°°"*>' š H H öttik§yra- N N 59512 onhydrid - Ae OH: c Acblizß om' unc om: om: [2] Neplanucin D åeriva-nt. ' ß) >- Ncpïanocïn A 79Û3672~9 10 15 20 25 30 714 Fysikaliska kemiska egenskaper hos neplanocin D derivat ör följande.

I Neplanocin D derivat (III) I (IV) Molvikf _ (beräknad ur masspekfralunalys ) 280 294 flolekylarformel C1]H12N403S C12H14N403S smanpunkf 26o-2 deln.) . 2 - [a]D3 = -141,7 I (c=Û, 7, H20) Specifik_vridning - Ultravioleti absorpfions- 226 nm âââ nm_ Fpektrum (i H20) 324 nm 295 Hm . flm Följande exempel belyser föreliggande uppfinning men ör icke be- grönsande.e Exemgel l 100 ml av efi vattenbaltigt medium (pH-värde 6,5) innehållande glykas 2%, stärkelse 2%, jösfexfraki IX, kaseinhydrolysat IX och kalciumkarbonat 0,21 infördes i en 500 ml kalv och sterilise- rades vid 120°C under 15 minuter. I två kolvar av deffa medium överfördes en full ögla av en snedkulfur av Åmgulluriella sp. Å HÛ79_ NRRL 111451 ning vid 3000. Efter 4 dagar överfördes dei odlade mediet till och inockulerades och adlades under skak- 20 l av samma sferiliserade medium som ovan i en 30 1. odlings- behållare och adlades vid 3009 under omrörning vid 300wvarv/min. 10 15 20 25 30 7903672-9 25 och luftning med 20 l/min. under 48 timmar.

Detta odlade medium överfördes till 200 1. vattenhaltigt me- dium (pH 6,5) innehållande glykos 41, sojabönpulver 11, köttextrakt 0,41, pepton 0,41, jöstextrakt 0,11 , NaCl 0,251 och kalciumkarbonat 0,11 och odlades vid 30°C under omrör- ing med 180 varv/min och luftning med 130 l/min under 40 timmar.

Den ovan erhållna odlingsvötskan (omkring 200 1.)-filtreraöes och myceliet tvöttodes med vatten. Filtratet och tvöttvattnet sammanslogs varvid erhölls 140 1. klart filtrat (potens 57/ug/ml som neplanocin A).

Exempel 2 Filtratet erhållet i exempel 1 fördes genom en kolonn av 20 l. katjnnbytarharts Åmberlite IR-120 (h+ typ) för att absorbera materialet och tvöttades med 100 l. vatten. Elutionen genomför- des med 3,7 N ammoniak i vattenlösning och det ursprungliga eluat- et kastades (30 1.). 90 liter av det följande eluatet uppsamla-- des, och pH-värdet justerades till 8 genom tillsats av åN HCI och fördes sedan genom 4 1. aktivt kol i en kolonn, tvöttades med vatten, varefter den eluerades med 90 l. 701-ig metanol- lösning. Det Ph detta sött erhållna eluatet koncentrerodes un- der förminskat tryck, varvid erhölls 1,5 l. av ett koncentrat.

Koncentratet överfördes till en kolonn av 10 1. Åmöerlite IRA-410 (0H_ typ) och eluerades med vatten samt justerades till pH-vördet 7 genom tillsats av 4N HCl¿_Éluatet koncentrerades i vakuum, fölldes under kylning och filtrerades , varvid erhölls 41,8 g orent neoplanocin A (rening omkring 12%).

Det arena neoplanocin A (41,8 g) upplöstes i en liten möngd vat- ten och överfördes till 2 l. kiselgelsyra i en kolonn (8,3 x 40 cm) 7905672-9 10 15 20 25 30 26' packad med en lösningsmedelsblandning av n-butanal: 281 ammoniak i vatten: vatten (ïO:0,2:1) och eluerades därefter med samma lösningsmedelsblandning.

Eluatet fraktionerades i fraktioner på 150 ml och aktiva frak- tioner visade sig vara , fraktionerna nr 24-52. Nämnda aktiva fraktioner uppsamlades, kancentrerades i vakuum och tilläts stå under kylning.

Föllningen 'uppsamlades genom filtrering för erhållande av 2,6 g orent kristallint neplanocin Å (utbyte 32%).

Det arena neplanocinet Å upplöstes i omkring 60 ml hett'vatten. och tilläts stå vid rumstemperatur. De utföllda vita nålkristal- lerna uppsamlades genom filtrering , varvid erhölls 2,01 g kristaller av neplanocin Å (utbyte 25,21).

Exemgel 3 Filtratet (140 1., potens 300/ug/ml neplanocin C) , erhållet vid samma förfarande som i exempel 1 fördes-genom en kolonn av 20 l. katjonbytarharts Amberlite IR-120 (H+ typ) att absorbera materialet och tvöttades med omkring 100 1. vatten. Eluering genomfördes med 3,7 N ammaniaklösning i vatten och det primära eluatet kastades (20 1) . 100 liter av det följande eluatet upp- samlades, justerades till pH-vördet 8 genom tillsats av konceh- trerad saltsyra, fick sedan passera genom_fi_l. aktivt kol i en kolonn, tvöttades med vatten och eluerades därefter med 70 1. 70% metanollösning. Det på detta sött erhållna eluatet koncen- trerades under förminskat tryck, varvid erhölls 1,5 1. av ett koncentrat. Detta koncentrat frystorkodes , varvid erhölls 83,6 g av ett orent pulver (renhet 29,5%). 7903672-9 27 83 g av ett orent pulver upplöstes i vatten mättad n-butanol- lösning och överfördes på 2 l. kiselsyragel i en kolonn (8,3 x 40 cm) packad med n-butonol och därefter eluerades det med en lösningsmedelsblandning av n~butanol: koncentrerad 5 ammoniaklösning i vatten , vatten (10:0,2:1). fraktioner på 150 ml eluat uppsamlades och de aktiva fraktionerna visade sig vara fraktionerna 53-108. Nämnda aktiva fraktioner uppsamlades, koncentrerades vid-låg temperatur och tillöts stå. Föllningen uppsamlades genom filtrering, varvid erhölls 18,2 g neplanocin 10 C som vita kristallerfi (renhet 961, utbyte 41,61).

Dessa upplöstes i varmt vatten och tillöts stå vid rumstemperatur för föllning av neplanocin C som förglösa plana kristaller, vil- ka frönfiltrerades , varvid erhölls rent neplanocin C. 15 Exempel 4 Till filtratet som erhölls vid samma förfarande som i exempel 1- sottes 3,6 kg aktivt kolpulver. Efter omröring under 40 minuter uppsamlades det aktiva kolet genom filtrering och tvöttades nog- 20 grant med vatten. Elueringen genomfördes med 701 metanollösning. 40 l. eluat torkades i vakuum , varvid erhölls 80 g av ett orent pulver innehållande neplanocin O. 80 g orent pulver överfördes till 6 liter kiselsyragel i en 25 kolonn packad med n-propanol: koncentrerad ammoniak : vatten _ (10:1:1) och därefter eluerades med samma lösningsmedelsbland- ning.-Fraktioner på 600 g uppsomlades och neplanocin 0 erhölls i fraktionerna 20-37. Nämnda aktiva fraktioner uppsamlades,kon- centrerades i vakuum till 30nñ och tilläts stå under kylning. 1 30 Föllningen uppsamlades genom filtrering och dörvid erhölls 460 mg orent kristallint neplanocin D.' r7903672-9 10 15 20 25 30 28 De efhanno 460 mg omm kfisfqnefne uppxasm i a m1 hm vatten och överfördes till en kolonn Sephadex G-15 (1850 ml, packad med vatten), varefter den eluerades med vatten. Frak- tioner på 100 ml uppsamlades och de uppsamlade eluatfraktioner- na 15-16 (200 ml) koncentrerades under förminskat tryck till 20 ml och fick stå vid rumstemperatur. 314 mg utföllt neplano-_ cin D erhölls som vita nålkristaller.

Exempel 5 (1) 376 mg neplanocin D upplöstes i 10 ml vattenfritt pyridin kfoffigf vid ss°c. 0,9 m1 bens°y1k1°rad f111_ och amrördes sattes droppvis och omrördes under 2 timmar vid 60-65°C.

Dörefter hölls lösningen vid 40-45°C under 2 timmar och tillöts stå över natten vid rumstemperatur. 10 ml vatten tillsattes under omröring och efter 25ninuter torkades lösningen under för- minskat tryck i en indunstare. Det torkade materialet upplöstes i 30 ml kloroform, tvöttodes tre gånger med 10 ml 1 N HCl och två gånger med 1 N natriumvötekarbonatlösning, varefter mate- rialet tvöttades två gånger med 20 ml vatten. Kloroformfasen dehydrerades med vattenfritt magnesiumsulfat och-koncentrerades, varvid erhölls 747 mg av en blekt krömförgad förening (I).

(Ufbyfe 91%) . _ Fysikalisk-kemiska egenskaper hos föreningen (I) var följande.d [a]â3 = -199° (c=0,6, metanol) Molekylformel: C32H24N407 Holvikt: 576 (masspektrum) sma1+punkf= 116-117°c.

Ultraviolett absorptionsspektrum: max = 232 nm, E11 = 704 R?-vörde (kloroform:metanol=10:1); Rf-vörde = 0,53.1 om 10 15 20 25 30 7903672-9 29 (2) 735 mg av en förening (I) erhöllen ovan (1) och l,0736 g fosforpentasulfid upplöstes i 19 ml pyridin och omrördes nog- grant , varefter 0,19 ml vatten tillsattes droppvis. Efter åter- flödeskokning under 4 timmar och med omröring kyldes reak- tionsblandningen och koncentrerade: i vakuum, varvid erhölls ett brunt oljigt material. Detta oljiga material slogs i kokan- de vatten och amrördes ytterligare under 30 minuter, varvid erhölls ek gulaktigt'ömne. Detta filtrerades för uppsamling' av föllningen, tvöttades med en blandning av etanol:eter (lzl) och tvöttades ytterligare med eter och torkades, varvid erhölls 561 mg av en förening (Il). (Utbyte 74,31).

Fysikaliskt-kemiska egenskaper av föreningen (II) ör följande. (423 = _2863 (c-o,«s, cHc13) M°1få| Holekylvikt: 592 Smöltpunkt: 235 - 239°C (sönderdelning under skumning) Ultravialettspektrum (i metanol): 232 nm (filxcm = 327,5) Rf-vörde (kloroform:metanol=l0:]); Rf-vörde = 0,82 (3) 525 mg av en förening (II) erhöllen ovan (2) upplöstes i 31 ml vattenfri metanol. 0,62 ml nyframstölld 2 N lösning av natriummetylat i metanol tillsattes och kokades under återflöde i 2 timmar för att avlögsna bensoylgruppen.

Efter avdestillering av metanolen tillsattes omkring 50 ml vat- ten och pH-vördet justerades till 7,5 genom tillsats av ättik- syra. Lösningen extraherades två gånger med 20 ml etylacetat och koncentreratian av vattenfasen ledde till bildning av nepla- nocin D derivat (III) som nålkristaller. Omkristallisationen skedde ur hett vatten, varvid erhölls 110 mg neplanocin D deri-I 7903672-9 10 15 20 25 30 30 vat (III) (utbyte 44,31).

Fysikaliskt-kemiska egenskaper hos neplanacin D derivat (III) ör följande.

Specifik vridning: omöjlig att möta beroende på variationer under mätningen.

Molekylformel: C11Hï2N403S Malvikt: 280 (masspektrum) sma1fpunkf= 2eo-262°c (sanae=ae1n.) UV-spektrum i H20: 226 nm,(E:%cm = 388,6) a24'fim, (s'% = 968,0) 1 cm Rf-värde (propanol: koncentrerad ammoniak i vatten:vatten= 10 : 1 : 1); Rf-värde = 0,21 Exempel 6 Till 37 mg neplanocin D derivat (III)erhållet enligt exempel 5 upplöst i 0,3 ml av 0,4 N Na0H tillsattes 0,009 ml metyljodid och skakades vid rumstemperatur under 10 minuter. Därefter till- sattes 0,05 ml av 0,4 N Na0H och ytterligare 0,009 ml metyl- jodid, varefter de åter skakades och tilläts stå vid rumstempe- ratur. Till denna lösning tillsattes 10 ml vatten, varefter bland- ningen koncentrerades i vakuum till 2 ml och överfördes till _ en Sephadex G-15 kolonn (1,4 x 49 cm) . Kolonnen eluerodes med vatten och fraktioner på 3 g eluat uppsamlades. Fraktionerna 17-19 sammanslags, koncentrerades och kyldes , varvid erhölls 35 mg kristallin neplanocin D derivat (IV) (utbyte 901).

Fysikaliskt-kemiska egenskaper av neplanocin D derivat (IV) är följande. 10 15 20 25 30 7903672-9 3] [u]23 D = -141,7 (e=o,7, H20) Malekylformelz C12H]4N403S Halekylvikt: 294 (masspektrum) sma11punk1= 177-17a°c UV-spektrum i vatten: 222 nm, (Elx = 415,8) 1 cm 288 nm, (E11 = 678,3) 1 cm 1% 295 nm (E = 670,7) 1 cm Rf-värde (propanolz koncentrerad ammoniak i vatten: vatten= 10:1:1); Rf-värde = 0,42 Exempel 7 Syntes av neplanocin A ur neplanacin D derivat (IV) 50 mg neplanocin D derivat (IV) erhållet med samma förfarande som beskrevs i exempel 6 upplöstes i 1,5 ml metonolisk ammoniak - (OOQ möttnad) och överfördes till-iñtslutet rör och upphettades till 146-148°C under 7 timmar. Efter avlägsnande av lösnings- medlet vid reducerat tryck, upplöstes återstoden i 3 ml hett vatten, varefter den kyldés och 33 mg neplonocin A erhölls som nålkristaller (utbyte 741), axemEe1 s ' ' * I _ (1) Till 1,Mg neplanocin D upplöst i 12 ml vattenfritt pyridin tillsattes 1 ml öttiksyraanhydrid och blandningen tillöts stå vid rumstemperatur över natten; 30 ml n-hexan tillsattes och blandningen kyldes på is-vatten, varvid erhölls 1 g av före- ningen [2] som kristaller. 7903672-9 10 15 20 25 30 32 (2) 1 g av föreningen [2] upplöstes i 25 ml kloroformlösning in- nehållande 0,8 ml tionylklorid och 0,4 ml dimetylformamid och kokades under återflöde vid rumstemperatur i tre timmar. Kloro- form avdestillerades under förminskat tryck. Återstoden slogs i 100 ml is-vatten under omröring. Extroktion skedde med 100 ml klorofarm, tvöttades med natriumvötekarbanat och vatten och torkning med natriumsulfat. Neplanocin D derivat (3) erhölls efter torkning i vakuum.

Exempel 9 Framstüllning av neplanocin A ur neplanocin D derivat [3].

Till neplanocin D derivat [3],erhållet i exempel 8 sattes i det slutna stålröret 35 ml av en mättad metanolisk ammoniak och reaktionen fick ske vid 100°C under 5 timmar. Efter kylning torkades reoktionsblandningen i vakuum, varvid erhölls ett krístallint pulver, vilket renades genom kiselgelkolonnkromato- grafi , varvid erhölls 286 mg neplanocin Å.

Fysikaliskt-kemiska egenskaper var identiska med de hos neplano- cin A erhållna i exempel 7.

Exemgel 10 Filtratet (140 1, potens omkring 50/ug/ml som neplanocin B erhål- let vid samma förfarande som i exempel 1 fördes genom en kolonn innehållande 20 1 katjonbytarharts Amberlite IR-120 (H+typ) för absorption av materialet och tvöttades med omkring 100 l vatten. Eluering genomfördes med 3,7 N ommoniakvatten och det första eluatet (30 1.) kastades. 90 l. av det följande eluatet uppsomlades, pH-vördet justerades till 8 genom till- sats 6 N HCI, varefter eluatet överfördes på en kolonn inne- 10 15 20 25 30 7903672-9 3 3 hållande 4 1, aktivt kol, tvöttodes med vatten, elucrodcs dör- efter med 90 l. av en 701-ig vattenlösning av metanol. Dd på så sött erhållna eluatet koncentrerades till 500 ml koncentrat, vilket tilläts stå vid låg temperatur för föllning av materialet.

Föllníngen uppsamlades och torkades varvid erhölls orent neplano- cin B (5,1 g, renhet omkring 601, utbyte 442).

Exempel 11 Neplanocin B erhållet enligt exempel 10 (5,1 g) överfördes till en kolonn kiselsyragel (8,3 x 40 cm, 2 1.) packad med en bland- ning av acetonzvatten (10:0,5) och eluerades med samma lösnings- medelsblandning. Eluatet uppsamlades i fraktioner på 80 g och fraktionerna 16-24 sammanslogs. Nämnda aktiva fraktioner tilläts stå vid låg temperatur för utföllning av neplanocin B som vita plana kristaller. 2,57 9 kristallin neplanocin B erhölls. (Ut- syfe 32,81). ' Ekempel 12 Odlingen genomfördes på det sött som angavs i exempel 1 , var- vid erhölls en odlingsmassa på omkring 200 1. vilken filtrera- des och cellerna tvöttades med vatten. Filtratet och tvöttvatt- net sammanslogs till 140 1. (potens omkring 1,5/ug/ml).

Lösningen fördes genom en kolann innehållande 20 l katjonbytar- hurts Amberlite IR-120 (H+ typ) för absorption av materialet och tvöttades med omkring 100 1, vatten. Elutionen genomfördes med 3,7 N ammoniak i vattenlösning och det första eluatet (30 1.) kastades. 90 1. av följande eluat uppsamlades, I justerades till pH-värdet 8 genom tillsats av 6 N HC1, och överfördes till en kolonn innehållande 4 1. aktivt kol, tvöttades med vatten och elaerades därefter med 90 l. 7OX-ig vattenlösning av metanol. 7903672-9 5 10 15 20 25 314 Det på så sött erhållna eluatet kancentrerades, varvid erhölls 500 ml av ett koncentrat, vilket frystorkades, varvid erhölls 31,2 g_av en aren neplanacin F (renhet omkring O,5X).

Exempel 13 Orent pulver av neplanocin F erhållet i exempel 12 (31,2 g) över- fördes till en kalann kiselsyragel (800 ml) packad med en blandninå av n-butanal: 28%-ig ammaniók°i vattenlösning; vatten (10:0,2:1) och eluerades med samma lösningsmedelsblandning.

Fraktianer på 150 ml uppsamlades och sammanslogs , varvid frak- tionerna 5-10 koncentrerades i vakuum. Kancentratet överfördes till en kiselsyragelkolann (240 ml) , packad med en blandad lös- ning av klaroformzmetanal:öttiksyra (10:2:O,2) och eluerades med samma lösningsmedelsblandning varvid fraktioner på 20 g uppsamlades. Fraktionerna 67-120 sammanfördes och koncentrera- des och tarkades , varvid erhölls arena kristaller av neplano- C15 r (108 mg, ufbyfe 511).

Exempel 14 I _ Orena kristaller av neplanacin F (108 mg) erhållna enligt exempel '13 överfördes till en kolonn innehållande Sephadex G-15 (186 ml) packad med vatten och eluerades med vatten. Fraktioner på 10 g uppsamlades och fraktíonerna 22-27 sammanslogs och koncentre- rades till 5 ml 3 varefter de fick stå vid rumstemperatur för utföllning av neplanocin F som vita nålkrístaller. Föllningen ' filtrerades och torkades, varvid erhölls kristallint nepla ~ F. (87 mgflmaed ett ufbyfe på 41%).

Claims (2)

1. _ 7903672-9 P A T E N T K R A V 1, Antibiotiska neplanociner k ä n n e t e c k n a d e av följande formel: x Nš Lšn N r z \ 'R där X betecknar NH2,-OH, -SH,-SCH3 eller Cl, där R betecknar väte eller en skyddande grupp för hydroxigrupper och där Z betecknar gruppen Y R0'H ZC 'R där Y betecknar -O- eller en valensbindning och där R beteck- nar väte eller en skyddande grupp för en hydroxígrupp eller en grupp: OH Honzc f i vilken Y betecknar -O- eller en valensbindning.

2. Neplanocin A enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av följande formel: NB , 2 IN n > kn N 301120 OH ofl 7903672-9 343 3. Neplanocin C enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av följande formel: - NH; L§}J N 0 HD-HZC 1 OH ßH H. Neplanocin D enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av följande formel: OH tš _//N N - H Honan _ _ on oH 5. Neplanocln D-derivat enllgt krav l, k ä n n e - t e c k n a d av följande formel: SH N ' Ešu N Hb-Bzc Oli OH 3:1 7903672-9 E. Neplanocín D-derivat enligt krav l, k ä n n e t e c k - n a d av följande formel: 3333 N . N > _ Ešfl N uoflzc ' OH QB 7. Neplanocin D-derivat enligt krav 1, k ä n n e t e c k - n a d av följande formel 9 N _ N > b' n AcOH2c 0Ac(Mc där Ae betecknar en acetylgrupp. 8. Neplanocín B enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av följande formel: NM Ná¿;m:$> se H . HOH2 0 OH 7903672-9 gg 9. Neplanocin F enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av följande formel: wmz f, F' I N$ k" N OH HOHZC H 10. Förfarande för framställning av neplanociner enligt krav l med formeln: X “in f'\'\ ou ' där X betecknar NH2 eller -OH och där Z betecknar gruppen Y H0-H OH zc Hon c ïï 0" 2 JJ eller en grupp ~> i vilken Y betecknar -O- eller en valensbindníng, k ä n n e t e c k n a t av att en neplanocinproducerande mikroorganísm, Amgullariella sp. A 11079 NRRL l1U5lodlas i ett näríngsmedium bestående av en assímilerbar kolkälla och en assímilerbar kvävekälla och oorganiska ämnen, varefter neplanocin -A, -C, -D, -B och -F isoleras ur odlingsmassan. 830119 CHE/EW