DE3248358A1 - (amido)-n-substituiertes bleomycin und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

(amido)-n-substituiertes bleomycin und verfahren zu dessen herstellung

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DE3248358A1 DE19823248358 DE3248358A DE3248358A1 DE 3248358 A1 DE3248358 A1 DE 3248358A1 DE 19823248358 DE19823248358 DE 19823248358 DE 3248358 A DE3248358 A DE 3248358A DE 3248358 A1 DE3248358 A1 DE 3248358A1
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Description

Me Erfindung betrifft neue (Amido)-li-substituierte Bleomycine, Salze davon und ein Verfahren zu deren Herstellung.
Bleomycin ist eine Familie carcinostatischer antibiotischer Substanzen, die 1966 von Umezawa, einem der vorliegenden Erfinder, und Mitarbeitern gefunden wurde (Journal of Antibiotics, 19A, Seite 200 (1966). Es wird durch Streptomyces verticillus, einem Actinomyceten, erzeugt und ist ein basisches wasserlösliches Glycopeptid, das zur leichten Chelatbildung mit einem Atom zweiwertigem Kupfer geeignet ist. In üblicher Kultur werden 16 Mitglieder der Bleomycin-Familie erzeugt und jeweils isoliert (z. B. Umezawa et a*l., Journal of Antibiotics, 19A, Seite 210 (1966)). Von diesen Bleomycinen werden A,., Ap» Ar, B2 und Desmethyl-A^ gegenwärtig weitverbreitet in der Form eines kupferfreien Gemische (das im folgenden als Bleomycin-Komplex bezeichnet wird) klinisch zur Krebstherapie verwendet; insbesondere werden sie erfolgreich bei der Behandlung von schwammartigem Zellkarzinom als Hauptgebiet, Hautkrebs, Kopf- und Nackenkrebs, Lungenkrebs und malignem Lymphom verwendet. Verschiedene Bleomycine werden auch in der US-PS 3 922 262 und US-PS Ee 30 451 beschrieben.
Die Bleomycine werden allgemein in Kupfer enthaltender Form bei der üblichen Fermentierung erzeugt. Die kupferfreie Form erhält man durch Entfernen des Kupfers aus der Kupfer enthaltenden Form. Der hier verwendete Ausdruck "Bleomycin" umfaßt sowohl die Kupfer enthaltenden als auch die kupferfreien Formen, falls nicht anders angegeben.
Die Bleomycine werden dargestellt durch die allgemeine
Formel (II):
ORIGINAL INSPECTED
CONH
CE N A
vc ch nh I
worin E ein endständiger Aminrest des Bleomycins ist; und das chelierte Kupfer für dem Pail der Kupfer enthaltenden Form weggelassen ist.
Es wurde jedoch gefunden, daß die Bleomycine durch Einwirkung eines Bleomycin desaktivierenden Enzyms inaktiviert werden (das im folgenden als inaktivierendes Enzym bezeichnet wird); Umezawa et al., Journal of Antibiotics, Bd. 27, Seite 4-19 (1974). Darüber hinaus wurde gefunden, daß die Bleomycine relativ wenig in der Haut und der Lunge inaktiviert werden, wo sie eine hohe Wirksamkeit entfalten, während sie leicht im Magen inaktiviert werden, wo angenommen wurde, daß sie keine Wirkung aufweisen
und daß dieses Inaktivierungsphanomen weniger ausgeprägt in dem schwammartigen Zellkarcinom der Maus als im Sarkom der Maus ist, die "beide durch 20-Methylcholanthren induziert werden (Umezawa et al., Journal of Antibiotics, Bd. 25, Seite 409 (1972); Bd. 27, Seite 419 0974)).
Darüber hinaus wurde gefunden, daß die Bleomycin inaktivierende Wirkung durch das schwammartige Zellkarcinom des menschlichen Kopfes und Nackens bzw. Halses erfolgt, insbesondere durch solche des kleindifferenzierten Typs, wobei angenommen wurde, daß die Bleomycine hiergegen nicht so wirksam sind (Müller et al., Cancer, Bd. 40, Seite 2787 (1977))-
Aus den vorstehenden Berichten ist ersichtlich, daß Bleomycine nicht geeignet sind, ausreichend wirksam gegen Karzinome zu sein, die ein Bleomycin inaktivierendes Enzym mit hoher Wirksamkeit enthalten. Dies stellt einen der Gründe für das Bedürfnis einer weiteren Verbesserung der Bleomycine dar. Im Eahmen der Erfindung wurde in Betracht gezogen, daß, wenn es möglich ist ein Bleomycin derivat bereitzustellen, das einer enzymatischen Inaktivierung schwer zugänglich ist, es möglich würde, beispielsweise Kopf-und Nacken-bzw. Halskrebs, ösophaguskrebs, Lungenkrebs und schwammartige Zellkarzinome in anderen Gebieten wirksamer zu behandeln und solche Adenokarzinome wie Magenkrebs, die auf die Behandlung mit üblichen Bleomycinen nicht ansprechen, zu behandeln. Im Eahmen dieser Untersuchung wurde gefunden, daß die Bleomycine in geringerem Ausmaß desaktiviert werden, wenn ein Substituent (-X) am Stickstoffatom in der Amidbindung der Partialstruktur, 2,3-Diaminopropanamid
(-NH-CH2-CH-COIiH2), der Bleomycine eingeführt wird. Hierauf basiert die Erfindung.
Ein erstes Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung neuer Bleomycine, die schwer durch das inaktivierende Enzym inaktiviert werden, sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung bereitzustellen.
ORIGINAL INSPECTEE)
-13-
Andere Ziele bzw. Gegenstände und.Vorteile der Erfindung sind aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.
Erfindungsgemäß werden (Amido)-N-substituierte Bleomycine oder Salze davon, Zwischenprodukte zu deren Herstellung und ein Verfahren zu deren Herstellung bereitgestellt, wobei diese (Amido)-N-substituierten Bleomycine dargestellt werden durch die allgemeine Formel
CONH0 NH0 10 I 2 ' 2
CH CH2 XIO-NH-X
Ni Π—CO-R
worin BM einen Rest des Bleomycin-Grundgerüsts darstellt; X die Bedeutung hat von (1) einem Alkyl mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen, (2) einem Aminoalkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, (3) einem Kiedrigalkyl mit Substituenten (a) 1 bis 3 Halogenatomen, (b) 1 oder 2 Phenylgruppen,
(c) einer Indolylgruppe, oder (d) einer 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Gruppe, enthaltend ein Sauerstoff-, Schwefel— oder Stickstoffatom (wobei unter den Substituentengruppen die Phenyl- oder IndoIy!gruppen weiter substituiert sein können durch ein Halogenatom oder eine Niedrigalkoxygruppe) , (4-) X,.-(Niedrig)-alkyl /worin X^ die Bedeutung hat von X^ Xo
-N-X, oder -N-Xx 3 »3
Xp ein Wasserstoff atom, ein Niedrigalkyl oder Benzyl ist, X, die Bedeutung hat von (a) einem Niedrigalkyl, (b) einem Phenyl (niedrig)-alkyl, oder (c) einem Mono- oder Di-(niedrig)-alkylamino(niedrig)-alkyl, das substituiert sein
kann durch eine Phenyl- oder Halogenphenylgruppe, X^ die Bedeutung hat von (a) einem Niedrigalkyl oder (b) einem Phenyl(niedrig)-alkyl, (5) Naphthyl, (6) Thiazolyl oder (7) einem N-Phenyl(niedrig)-alkylpiperazinyl; und R einen endständigen Aminorest des Bleomycins darstellt.
Der Best des Bleomycin-Skeletts bzw. -Grundgerüsts, der durch BM dargestellt wird, ist der Teil eines Bleomycinmoleküls, das in die unterbrochenen Linien in der allgemeinen Formel (II) des Bleomycins eingeschlossen ist und sowohl.die Kupfer enthaltende Form als auch die kupferfreie Form umfaßt, falls nicht anders angegeben. Die Niedrigalkyle sind Alkyle mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl,
IQ Isobutyl, n-Pentyl, 3-Methylbutyl, 3-Methylpentyl und n-Hexyl.
Beispiele für einzelne Gruppen, die durch X in der allgemeinen Formel (I) dargestellt werden, sind im folgenden aufgeführt.
(1) Alkyle mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen: Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, η-Butyl, Isobutyl, tert.-Butyl, n-Pentyl, 3-Methylbutyl, Neopentyl, n-Heptyl, 3-Methylpentyl, n-Hexyl, 1,5-Dimethylhexyl, Isohexyl, n-Octyl, n-Decyl, Lauryl, Myristyl, Cetyl und Stearyl.
(2) Aminoalkyle mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen: 2-Aminoethyl, 3-Aminopropyl, 4-Aminobutyl, 6-Aminohexyl, 12-Ami-
30' nododecyl und 4-Amino-4-methyl-i-dimethylpentyl.
(3) Niedrigalkyle mit Substituenten (a) 1 bis 3 Halogenatomen, (b) 1 oder 2 Phenylgruppen, (c) einer Indolylgruppe oder (d) einer 3- oder 6-gliedrigen heterocyclisehen Gruppe enthaltend ein Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatom (wobei unter den Substituentengruppen die Phenyl- oder Indolylgruppe weiter substituiert sein kann durch ein Halogenatom oder eine Niedrigalkoxygruppe):
ORIGINAL INSPECTED
2,2,2-Trifluorethyl, 2,2,2-Trichlorethyl, 2,2-Difluorethyl, 2,2-Dichlorethyl, Benzyl, Diphenylmethyl, 2-Phenylethyl, 2,2-Diphenylethyl, 1-Phenylethyl, 1,2-Diphenylethyl, 3-Phenylpropyl, 2-Phenylisopropyl, 1,3-Diphenylpropyl, 3j3-Eiphenylpropyl, 4-Phenylbutyls 4,4-Diphenyl"butylt Chlorbenzyl, Dichlorbenzyl, Brombenzyl, Methoxybenzyl, Dimethoxybenzyl, Ethoxybenzyl, Methylendioxybenzyl-, Prop-. oxybenzyl, p-Ohloxphenylethyl, p-Methoxyphenylethyl, p-Benzyloxybenzyl, Furylmethyl, 2-Purylethyl, 2-Thiazolylmethyl, 2-Pyrazolylmethyl, 2-Imidazolylmethyl, 4-Imidazolylmethyl^.-2~a?hienylmethyl, 2-Pyridylmethyl, J-Pyridylmethyl, 4-Pyridylmethyl, 3-lD:dolylmethyl, 2-(3-Indolyl)-ethyl, 4-Methoxy-3-indolylmethyli 2-Pyrimidylmethyl, 2-Pyrimidylethyl, 4-Pyrimidylmethyl, 4-Pyrimidylethyl, 2-Piperidylmethyl, 3-Piperidylmethyl, 4-Piperidylmethyl, 2-(2-Piperidyl)-ethyl,2-(3-Piperidyl)-ethyl, 2-(4-Piperidyl)-ethyl, 1-(2-Piperidyl)-ethyl, 1-(3-Piperidyl)-ethyl, 1-(4-Piperidyl)-ethyl, 2-(Piperidino)-ethyl, 2-Piperazylmethyl, 2-(2-Piperazylethyl), 2-(Piperidino)-ethylj 3-Pipe^idinopropyl, 2-(Morpholino)-ethyl, 3-(Morpholino)-propyl, 2-Morpholiny!methyl, 3-Morpholinylmethyl, 2- (Morpholinyl)-ethyl und 3-(Mo3?pb.olinyl)-propyl.
(4) X^(3!iiedrig)-alkyle (worin Xy. die Bedeutung hat von
25 X3 . ' ?2 .
-U-Xp oder -N-X,)% Dimethylamineethyl, Diethylamino-
ethyl, Dipropylamino ethyl, Propyl amino ethyl, Mmethylaminopropyl, Diethylaminopropyl, Dipropylaminopropyl, Propylaminopropyl, Dibutylaminoprop'yl, Butyl aminopropyl, Benzylaminopropyl, 2-Phenylethylaminopropyl, 1-Phenylethylaminopropyl, 3-Phenylpropylaminopropyl, 4-Phenylbutylaminopropyl, Me thylamino ethyl aminopropyl, Ethyl aminopropylaminopropyl, Propylaminopropylaminopropyl, Butylaminopro-5 pylaminopropyl, Έ- (Butylaminopropyl) -Η-methylaminopropyl, Dibutylaminopropylaminopropyl, Pentylaminopropylaminopropyl, Ethylaminobutylaminopropyl, Propylaminobutylaminopropyl, Ethylaminopropylaminobutyl,
Butylaminopropylaminobutyl, Benzylaminoethylaminoethyl, Benzylaminoethylaminopropyl, Benzylaminopropylaminopropyl, Benzylaminobutylaminopropyl, Phenylethylaminopropylaminopropyl, N- (Phenylethylaminopropyl) -N-methylaminopro-Pyl» N-(Chlorbenzylaminopropyl)-N-methylpropyl, N-(Brombenzylaminopropyl) -N-methylpropyl, N- (Chlorphenylethylaminopropyl)-N-methylpropyl, Benzylaminopropyl-Ν,Ν-dimethylaminopropyl, Dibenzylaminopropyl-NjN-diethylaminopropyl und Dibenzylaminopropyl-N-methyl-N-benzylaminopropyl.
(5) Naphthyle: a-Naphthyl und ß-Naphthyl
. (6) Thiazolyle: 2-Thiazolyl, 3-Thiazolyl und ^--Thiazolyl.
(7) N-Phenyl(niedrig)-alkylpiperidyle: N-Benzyl-4-piperidyl, N-Phenylethyl-4-piperidyl, N-Benzyl-J-piperidyl und N-Benzyl-2-piperidyl.
Der endständige Aminorest, der Bleomycine, dargestellt durch E, kann jegliche der substituierten oder unsubstituierten aliphatischen Aminogruppen sein, ist jedoch gewöhnlich eine aliphatische primäre Aminogruppe basischer Natur, dargestellt durch die allgemeine Formel (III)
E2 - E1 - NH - (III)
worin E1 die Bedeutung hat von (1) einer Kette von Alkylengruppen, die ein Stickstoffatom eingelagert zwischen die Alkylengruppen in der Kette aufweisen kann (Beispiele für eine derartige Gruppe sind die dargestellt durch die Formeln -E12-Y1-E1^- und -E12-Y1-E1^-Y2-E14-, worin E12, E1, und E14 Alkylengruppen sind und Y1 und Y2 jeweils eine Gruppe sind -mit der Formel
35 E, K5.
-N- oder -N-
ORIGINAL INSPECTED
-17-
(worin E2 und E.. Wasserstoff atome oder Niedrigalkyle sind,
^ /—L
die Substituenten tragen können)), (2) -N N- oder (3) Phenylen; und E2 jegliche der Gruppen basischer Natur ist (Beispiele für eine solche Gruppe sind die der Formeln E^ E7 EQ NH2
L·, -N-Eo, -N-E,-, -NH-C=NH,
E5
-N
NiT
JL\
■worin E^, wie vorstehend definiert ist; E,-,-"E6 und Jeweils Niedrigalkyl, das einen Substituenten ha"ben kann, sind; und E7 und Eg jeweils ein Wasserstoff atom oder ein Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, das einen Substituenten haben kann, sind). Das Alkylen der vorstehenden Aminogruppe ist eines mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen,, wie beispielsweise
CH-
CH.
-CH2-,
-(CH2J2-, -CH-, -(CH2) 3-, -CH2-CH-, -, -(CH2J6-, und -(CH2J8-,
obwohl die Alkylene mit 2 bis 4- Kohlenstoffatomen am häufigsten verwendet werden. Die Substituenten an den vorstehenden Alkylgruppen umfassen Hydroxyl, Alkoxy (beispielsweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy und Butoxy), Phenyl (das ein oder mehrere Substituenten haben kann, ausgewählt aus Halogen, Cyano, Niedrigalkylen, Benzyloxy und substituierten (z. B. Alkoxy-, Phenoxy- oder Halogen-substituierten) Benzyloxygruppen) und Cycloalkyle mit 5 bis 13 Kohlenstoffatomen.
Beispiele für die vorstehend genannten Aminogruppen sind 2-Aminoethylamino, 3-Aminopropylamino, 2-Dimethylaminoethylamino, 2-Methylamino ethylamino, J-Dimethylaminopropylamino, 3-Diethylaminopropylamino, 3-(3-Butylaminopropylamino)-propylamino, 3-(2-Oxypropylamino^propylamino, , 3--Piperidinopropylamino, 3-(1-Phenylethylamino)-propylamino, 2-Aminopropylamino, 3-Methylaminopropylamino, 3-Butylaminopropylamino, 3~(6-Aminohexylamino)-propylamino, 3-T3?iiaethylaminopropylamino, 3- (3-Dimethylaminopropy'lamino)-propylamino, 3~(3-Aminopropylamino)-propylamino, J-/ß-Vleth.jl-K-(3-aminopropyl)-amino7-propylamino, 3-Pyrrolidinylpropylamino, 3-Piperidinylpropylamino, 3-Morpholinopropylamino, 3-Pipei'azinylpropylamino, 3-Z?P-(3-Aminopropylpiperazinyl^-propylamino, 3-(3-Pyrrolidinylpropylamino)-propylamino, 3~(3~i>ipsridinylpropylamino)-propylamino, 3-(3-Morpholinylpropylamino)-propylamino, 3-(3-0xypropylamino)-propylamino, 3-(3-Methoxypropylamino)-propylamino, 3-Benzylaminopropylamino, m-Aminomethylbenzylamino, p-Aminomethylt»enzylamino, 2-Cyclopentylaminoethylamino, 3-Cyclohexylaminopropylamino, 4-Cyclohexylaminobutylamino, Cycloheptylaminopropylamino, 3-Cyclooctylaminopropylamino, 3~ZP-Methyl-N-(3-cyclooctylmethylaminopropyl)~amino7-propylamino, 3-Cyclodecanylmethylaminopropylamino, 3-{N-Methyl-N-/3-(2-p-chlorphenylethylamino)-propyl/-amino] -propylamino, 3- {N-Methyl-H-^J- (m,p-dibenzyloxybenzyl)-aminopropyl7-amino]-propylamino, 3-(N-Me^yI-N-ZJ-(p-cyanobenzylamino)-propyl7~amino} propylamino, 3-1N-Methyl-N-/^-Ccycloundecanylmethylamino)-propyl7'-amino}-propylamino, 3-{N-Methyl-N-//B'is-(m,p-dibenzyloxybenzyl)-aminopropyl7-amino] -propylamino, 3- {N,N-Dimethyl-N-/3-(dibenzylamino)-propyl7-amino5 propylamino, 3- fN ,N-Diethyl-N-/^- (dibenzylaminopropyl^T-amino}-propylamino, 3-\N,N-Dimethy 1-N-^J-(N,N-dimethyl-N-(3-dibenzylaminopropyl)-amino)-propyl7-amino} -propylamino , 3-{N ,N-Dimethyl-N-ZJ-(N,N-dimethyl-N- (3-cycloo ctylmethylaminopropyl) -amino ) -propyl/7- amino} -propylamino .
ORIGINAL
-19-
3-2^-(3-Dibenzylaminopropyl)-piperidy3j7-propylamino und 3-{^~/^- (Cycloo ctylmethylamino ) -propylT-piperidyl} propylamino.
Günstige Verbindungen sind beispielsweise solche,worin R die Bedeutung hat von 3-ZTs)-1 '-Phenylethyl/7-aminopropyl amino oder 3i-(n-Butylaminopropyl)-aminopropylamino und solche mit einem Aminrest, dargestellt durch die Formel (IV):
!0 -MH-.(CH2)3-A -(CRp)3-B (IV)
worin A die Bedeutung hat von
«10 «10.
-N-, -N ®-, -N K-, OG--N ^- (CH-J3-N ^-
flO «10. «10 «10'
1 § m / \ oder
Rll«
(worin R*q» S^q1, K*,, und E..' , die gleich oder verschieden sein können, jeweils ein Niedrigalkyl, Benzyl oder ein Halogen-substituiertes Benzyl sind) und B die Bedeutung hat von E^,
(worin R^p ^e Bedeutung hat von (1) Phenyl(niedrig)-alkyl, (2) einem Phenyl (niedrig)-alkyl mit einem oder
mehreren Substituenten an dem Phenylkern ausgewählt aus (a) Halogenen, (b) Hiedrigalkylen, (c) Ifiedrigalkoxys, (d) Cyano, (e) Trifluormethyl, (f) Benzylyloxy, das an dem Phenylkern Substituenten aufweisen kann wie Halogene, Alkoxy und Phenoxy, (g) Di (niedrig) -alkyl amino gruppen,
30 und (h) Phenyl, (3) Cyclohexyl, (4) Tripheny!methyl,
(5) Faphthylmethyl, (6) iHirylmethyl, (7) Thiophenmethyl, (8) Niedrigalkyl substituiert durch ein Cycloalkyl mit 5 bis 13 Kohlenstoffatomen, oder (9) Norbornen-2-methyl; und IL;, die Bedeutung hat von (1) Wasserstoff, (2) Ben-
35 zyl oder (3) Benzyl mit einem oder mehreren Halogenen
oder Benzyloxygruppen als Substituenten am Phenylkern). Diese Verbindungen sind günstig aufgrund ihrer relativ niedrigen pulmonaren Toxizität. Für die vorstehenden
Formeln gilt "beispielsweise: Niedrigalkyle umfassen Methyl, Ethyl und Butyl; Phenyl(niedrig)-alkyle umfassen Benzyl, 2-Phenylethyl, 1-Phenylethyl, J-Phenylpropyl, 2,2-Diphenylethyl und Dibenzylmethyl; Phenyl(niedrig)-alkyle mit Substituenten an den Phenylkernen umfassen 2-p-Chlorphenylethyl, p-Chlorbenzyl, o-Chlorbenzyl, m-Chlorbenzyl, i-(p-Chlorphenyl)-ethyl, o,p-Dichlorbenzyl, mjp-Dichlorbenzyl, p-Brombenzyl, p-^luorbenzyl, Pentafluorbenzyl, m-G?rifluormethylbenzyl, p-Methylbenzyl, p-Diethylaminobenzyl, p-Methoxybenzyl, o,p-Dimethoxybenzyl, mjp-Dibenzyloxybenzyl, p-Cyanobenzyl und p-Phenylbenzyl; und Niedrigalkyle substituiert durch ein Cycloalkyl mit 5 bis 11 Kohlenstoffatomen umfassen Cyclopentylmethyl, Cyclohexylmethyl, Cycloheptylmethyl, Cyclooctylmethyl, Cycloundecanylmethyl und 2-Cyclohexylethyl.
Besonders günstige Verbindungen sind solche, dargestellt durch die allgemeine Formel (I), worin E 1-Phenylethylaminopropylamino, Butylaminopropylamino oder eine Aminogruppe, dargestellt durch die allgemeine Formel (V)
2312)3-B1 (V)
worin A^, die Bedeutung hat von
-N- oder -N-
(worin E/iq' ^111^ ^H* Oeweils e^-ia· Niedrigalkyl oder Benzyl sind) und Bx, die Bedeutung hat von
(worin S/ip' ^^-e Bedeutung hat von (1) einem Phenyl (niedrig)· alkyl das an dem Phenylkern einen oder mehrere Substituenten aufweisen kann, einschließlich (a) Halogenen, (b) Cyano und (c) der Benzyloxygruppe, oder (2) eines Niedrigalkyl substituiert durch ein Cycloalkyl mit 5 bis
ORIGINAL INSPECTED
. -21-
13 Kohlenstoffatomen; und H^3,1 Wasserstoff oder Benzyl ist, das ein oder zwei Benzyloxygruppen als Substituenten haben kann) bedeutet.
Die Kombinationen von X und E, die eine besonders niedrige pulmonare Toxizität aufweisen, sind im folgenden aufgeführt:
(Amido)-N-substituierte Bleomycine worin X Isopropyl, (S) -1 -Phenylethyl, Diethylamino-1 -methylbutyl, Dibutylaminopropyl oder n-Butylaminopropylaminopropylamino ist und E 1-Phenylethylamino oder H-(Niedrig)-alkyl-N-(halogenbenzylaminopropyl)-aminopropylamino ist; Salze davon; (Amido)-N-substituierte Bleomycine, worin X ein Alkyl mit·3 bis 8 Kohlenstoffatomen, 1,5-Diiaethylhexyl, Benzyl, 1-Phenylethylaminopropyl, Di-n-butylaminopropyl, n-Butylaminopropylaminopropyl, N-Methyl-N-benzyl-N-(dibenzylaminopropyl)-aminopropyl oder N-Methyl-Ii-(halogenphenylethylaminopropyl)-aminopropyl, ist, und E die Bedeutung hat von N-Methyl-N-(halogenphenylethyl-
20 aminopropyl)-aminopropylamino, N-Methyl-N-benzyl-N-
(dibenzylaminopropyl)-aminopropylamino, N-Methyl-N-^Fis-(m,p-dibenzyloxybenzyl)-aminopropyl7-aminopropylamino, N-Methyl-N-methyl-N- (dibenzylaminopropyl) -aminopropylamino, N-Ethyl-N-ethyl-N-(dibenzylaminopropyl)-amino-
25 propylaminoi -N-Methyl-N-(cyclooctylmethylaminopropyl)-
aminopropylamino, oder N-Methyl-lT-(cyanobenzylaminopropyl)-aminopropylamino; und Salze davon.
Als Beispiele für die erfindungsgemäßen Verbindungen können die in der Tabelle I aufgeführten genannt werden. In der Tabelle I bedeutet "BIdU" im Namen der Verbindung "Bleomycin" und die durch die allgemeine Formel (I) bezeichnete Verbindung wird als "Name von E (Aminorest) -(Amido)-N-i/^ame von X7-BLM" bezeichnet. 35
Verbindung
Hr. -		 Name der Verbindung Abkürzung -22
1 2-(4'-Imidazolyl)ethylamino-(amido)N-[methyl]-BLM dH-MMA I
2 ' 2-(4'-Imidazolyl)ethylamino-(amido)N-[ethyl]-BLM, dH-MEA ► *
3 2-(4'-Imidazolyi)ethylamino-(amido)N-[isopropyl]-BLM dH-IPA I · *
ν · e
e « €
B t *
4 2-(4'-Imidazolyl)ethylamino-(amido)N-[benzyl]-BLM dH-BA I · *
If t
5 2-(4'-Imidazolyl)ethylamino-(amido)N-[3-((S)-1·-phenylethyl)-
aminopropyl]-BLM		 dH-PEP S <
C <
cc *
« C «
6 2-(4'-Imidazolyl)ethylamino-(amido)N-[2-aminoethyl]-BLM dH-EDA C * *
e · e
7 4-Guanidinobutylamino-(amido)N-[isopropyI]-BLM· dB2-IPA C C .0
ft * *
« * «:
t C
nt j«
8 4-Guanidinobutylamino-(amido)N-[I',6'-dimethylheptyl]-BLM dB2-DHA • * 1*
< · C
t ««
9 4-Guanidinobutylamino-(amido)N-[2', 2 ', 2 '-trifluoroethyl]-BLM dB2-TFEÄ
10 4-Guanidinobutyiamino-(amido)N-[octyl]-BLM dB2-OCT
11 4-Guanidinobutyiamino-(amido)N-[3-((S)-1'-phenylethyl)amino
propyl] -BLM		 dB2-PEP
12 . 4-Guanidinobutylamino-(amido)N-[3-(di-n-butylamino)propyl]-BLM dB2-BPA
13 4-Guanidinobutylamino-(amido)N-[lauryl]-BLM dB2-LAA
14 4-Guanidinobutylamino-(amido)N-[benzyl]-BLM dB2-BA
C C C C
15 16 17 18 19 20 21
22 23 24
25 26-27
28 29
4-Guanidinobutylamino-(amido)N-[diphenylmethyI]-BLM 4-Guanidinobutylamino-(amido)N-[1',2'-dipheny !ethyl]-BLM 4-Guanidinobutylamino- (amido)N- [ 3-naphtyl] -BLM 4-Guanidinobutylamino-(amido)N-[2-fury!methyl]-BLM' 4-Guanidinobutylamino-(amido)N-[3-pyridylmethyl]-BLM 4-Guanidinobutylamino~(amido)N-[2-thiazolylmethyl]-BLM 3-((S)-I1-'Phenylethyl)aminopropylamino-(amido)N-[isopropylI=BLM
3=((S)-1'-Phenylethyl)aminopropylamino-(amido)N-[3-((S)-1'-phenylethyl)aminopropyl]-BLM
3-((S)-I1-Phenylethyl)aminopropylamino-(amido)N—[benzyl]-BLM
3-((S)-1*-phenylethyl)aminopropylamino-(amido)N-[p-chlorobenzyl]-BLM
3-((S)-I'-Pheny!ethylamino)propylamino-(amido)N-[stearyl]-BLM 3-((S)-I'-phenylethylamino)propylamino-(amido)N-[lauryl]-BLM 3- ((S) -1'•"'Phenylethylamino) propylamino- (amido) N- [octyl J-BLM
3-((S)-l'-Phenylethylamino)propylamino-(amido)N-[5-methoxyindol-3-ylethyl]-BLM
3-((S)-!'-Phenylethylamino)propylamino-(amido)N-[12-amimododecanyl]-BLM
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3- ((S) -l'-Thenylethylamino)propylamino- (amido) N- [I1,2' ^-diphenylethyI]-BLM
3-((S)-l'-'Phenylethylamino) propylamino-(amido)N-[diphenylmethyl]-BLM
3-((S)-I1-'Phenylethylamino)propylamino-(amido)N-[1,6-dimethylheptyI]-BLM
3-((S)-l'-phenylethylamino)propylamino-(amido)N-[2-(1-piperazinyl)ethyl]-BLM
3-((S)-I1-Phenylethylamino)propylamino-(amido)N-[3-(di-nbutylamino)prppyl]-BLM
3-((S)-1'-P-henylethylamino)propylamino-(amido)N-[N-benzylpiperazin-4-yl]-BLM
3-((S)-I'-'Phenylethylamino)propylamino-(amido)N-[4-diethylamino-1-methylbutyl]-BLM
3-[N-Mathy1-N-(3-n-butylaminopropy1)amino]propylamino-(amido)N-[isopropyl]-BLM
3-[N-Methyl-N-(3-nr-butylaminopropyl)amino]propylamino-(amido)N-{3-[N-methyl-N-(3-n-butylaminopropyl)amino]propyl}-BLM
3-{N-^ethyl-N-[3-(p-chlorobenzyl)aminopropyl]amino }-propylamino-(amido)N-[3-(S)-I1-phenylethyl)aminopropyl]-BLM
3-{N-Methyl-N-[3-(p-chlorobenzyl)aminopropyl]amino}-propylamino-(amido)N-[octyl]-BLM
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ι 3"-{N-Methyl~N-[3™(p-chlorobenzyl)aminopropyl]aminojpropylamino-(.amido)N-[1,2-dipheny!ethyl]-BLM
■ 3=.{N-^ethyl-N- [3- (p-chlorobenzyl) aminopropyl] amino}propyI=- amino-(amido)N-[1,5-dimethylhexyl]-BLM
3-{N-hethyl-N-[3-(2-(p-chlorophenyl)ethyl)aminopropyl]amino}-propy!amino-(amido)N-[3-((S)-I'-phenylethyl)aminopropyl]-BLM
i ■ '
3-{N-Methyl-N-[3~(2-(p-chlorophenyl)ethyl)aminopropyl]amino}-
i propylamino-(amido)N-[octyI]-BLM
3~{N-Methyl-N-[3-(2-(p-chlorophenyl)ethyl)aminopropyl]amino}-propylamino(amido)N-{3-[N-methyl~N-[3~(2-(p-chlorophenyl)-ethyl)aminopropyl]amino]propy1}-BLM
3-{N-Methyl-N-[3-(2-(p-chlorophenyl)ethyl)aminopropyl]amino}-propylamino-(amido)N-[3-(di-n-butylamino)propyl]-BLM
3-{N-hJethyl-N-benzyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino}-propylamino-(amido)N-[3-((S)-1'-phenylethyl)aminopropyl]-BLM
3-{N-Hethyl-N-benzyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino}-propylamino-(amido)N-[octyl]-BLM
3-{N-Hethyl-N^benzyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino}-propylamino-(amido)N-{3-{N-methyl-N-benzyl-N-[3-(dibenzylamino) propyl]amino}pröpyl}-BLM
3-{N-Hethyl-Nrrbenzyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino)-propylamino-(amido)N-[3-[N-methyl-N-(3-n-butylaminopropyl)]-aminopropyl]-BLM
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51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61
! 3-{N-Methy-N-benzyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino}-propylamino-(amido)N-[benzyl]-BLM
3-{N,N-Uimethyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino}-propylamino-(amido)N^[3-((S)-1'-phenyl)aminopropyl]-BLM
3-{N,N~Dimethyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino}-: propylamino-(amido)N-[n-octyl]-BLM
3-{N,N-Dimethyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino}-propylamino-(amido)N-[3-(di-n-butylamino)propyl]-BLM '
3-{N,N-2)iethyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino}-propylamino-(amido)N-[3-((S)-I'-phenylethyl)aminopropyl]-BLM
3-{N,N-I)iethyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino}propylamino-(amido)N-[octyI]-BLM
3-{N/N-2)iethyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino}propylamino-(amido)N-[3-(di-n-butylamino)propyl]-BLM
3-{N-hJethyl-N-[3-(cyclooctylmethylamino)propyl]amino}-propylamino-(amido)N-[3-(di-n-butylamino)propyl]-BLM
3- {N-Hethyl-N- [ 3r- (cyclooctylmethylamino) propyl ] amino -(amido) N-[oc ty 1 ]-BLM
3-{N-Msthyl-N-[3-* (cyclooctylmethyl)aminopropyl]amino}-propylamino-(amido)N-[3-((S)-l'-pheny!ethylamino)propylJ-BLM
3-{N-Methy1-N-[3-(p-cyanoben zylamino)propyl]amino}-propylamino-(amido)N-[3-(di-n-butylamino)propyl]-BLM dMTBZ-BA
dMMDBZ-PEP
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65		 3™{N-Methyl-*N-[3-(p-cyanobenzylamino)propyl]amino}propylamino-
(amido)N-[octyl]-BLM
3-{N=Methyl~N~[3-(p-cyanobenzylamino)propyl]aminolpropylamino-
(amido)N-[3-((S)-1'-phenylethy!amino)propyl]-BLM
3-, {N-Hethy1-N-[3-bis(m,p-dibenzyloxybenzy1)aminopropy1]amino)-
propy!amino-(amido)N-[3-((S)-1'-phenylethyl)aminopropyl]-BLM
3-{N-4fethyl-N-[3-bis(mfp-dibenzyloxybenzyl)aminopropyl]amino}-
propylamino-(amido)N-[n-octyl]-BLM		 dMCNBZ-
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PBP
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PEP
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OCT
♦ Λ ί ί * M
Die durch die allgemeine Formel (I) dargestellten erfindungsgemäßen Verbindungen werden wie folgt beschrieben hergestellt.
Eine Verbindung dargestellt durch die folgende Eormel (VI) oder ein reaktives Derivat an der Carboxylgruppe davon läßt man mit einem Amin (das später beschrieben wird) kondensieren:
CONH0 NH0 :
ίο I I !
CH0 NH .CH
Xch2 Xco-xo
15 Miii \ c-" ^x- υ
N I N,
BM
worin BM einen Rest des Bleomycin-Grundgerüsts bzw. -Skeletts darstellt, R eine Hydroxylgruppe oder einen endständigen Aminorest des Bleomycins darstellt, X eine Hydroxylgruppe oder eine Gruppe der Formel -WH-X bedeutet, wobei mindestens eines von R und X die Hydroxyl- ' gruppe bedeutet, und X die Bedeutung hat von (1) einem Alkyl mit 1_bis 18 Kohlenstoffatomen, (2) einem Aminoalkyl mit 1-bis 12 Kohlenstoffatomen, (3) einem Niedrigalkyl mit Substituenteh (a) 1 bis 3 Halogenatomen, (b) 1 oder 2 Phenylgruppen, (c) einer Indolylgruppe oder (d) einer 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Gruppe enthaltend ein Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatom (unter den Substituentengruppen^die Phenyl- oder Indolylgruppe weiter substituiert sein durch ein Halogenatom oder eine Niedrigalkoxygruppe), (4-) X^-Niedrigalkyl (worin X^, die Bedeutung hat von
2 2
oder
ein Wasserstoffatom, ein Niedrigalkyl oder Benzyl ist,
ORIGINAL INSPECTED
β A ft *
-29-
1 X, (a) ein Niedrigalkyl (b) ein Phenyl(niedrig)-alkyl
oder (c) ein Mono- oder Di(niedrig)-alkylamino(niedrig)-alkyl, das substituiert sein kann durch eine Phenyl- oder Halogenphenylgruppe, ist, X^ (a) ein Niedrigalkyl
oder (b) ein Phenyl(niedrig)-alkyl ist), (5) Naphthyl, (6) Thiazolyl oder (7) ein N-Phenyl(niedrig)-alkylpiperazinyl. Wenn X in der Formel (VI) die Hydroxylgruppe ist, wird ein Amin der Formel
10 H2N-X (VII)
(worin X wie vorstehend definiert ist) bei der Kondensation verwendet, während wenn R in der Formel (VI) die Hydroxylgruppe ist und X die Bedeutung hat von -NH-X (worin X wie vorstehend definiert ist) ein Amin der Formel
H-E (VIII)
(worin R wie vorstehend definiert ist) verwendet wird. Falls notwendig, wird das Kondensationsprodukt von dem Kupfer entfernt, um ein (Amido)-N-substituiertes Bleomycin der allgemeinen Formel (I) zu erhalten. Darüber hinaus wird, falls notwendig, ein Salz des (Amido)-N-substituierten Bleomycin in üblicher Weise hergestellt.
25 '
Die Kondensation einer Verbindung der Formel (VI) oder eines reaktiven Derivats seiner Carboxylgruppe mit einem Amin der Formel (VII) oder (VIII)·führt man nach der bekannten Verfahrensweise zur Bildung einer Säureamidbindung, insbesondere der in der Peptidchemie verwendeten, ' . durch. Man läßt eine Verbindung der Formel (VI) mit einem Amin der Formel (VII) oder (VIII) in Anwesenheit von aktivierenden Eeagentien für die Carboxylgruppe, die in der Peptidchemie verwendet werden, reagieren. Alternativ erhält man die Verbindung der Formel (I) durch Reaktion eines Amins der Formel (VII) oder (VIII) mit einem reaktiven Derivat der Carboxylgruppe einer Verbindung der Formel (VI). Die Derivate sind beispielsweise ein Derivat,
erhalten durch Reaktion eines aktivierenden ßeagens für die Carboxylgruppe und der Verbindung der Formel (VI) oder ein 3-Aminopropylester der Carboxylgruppe der Verbindung der Formel (VI). Als Beispiele für die aktivierenden Eeagentien können genannt werden 6-Chlor^i-p-chlorbenzolsulfonyloxybenzotriazol, N-Ethyl-5-phenylisooxazolium~3'-sulf onat, N-tert.-Butyl-5-methylisooxazoliumperchlorat, N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-i ,2-dihydrochinolin (EEDQ), Di-p-nitrophenylsulfit, Tri-p-nitrophenylphosphit, p-Nitrophenyltrichloracetat, Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) , 1-Ethyl-3-(3-cLimethylaminopropyl)-carbodiimid, 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinöethyl)-carbodiimid, Diphenylcarbodiimid, Di-p-tolylcarbodiimid, Diisopropylcarbodiimid> Diphenylphosphorazidat (DPPA) und Diet.hylphosphoro-
15 cyanidat (DEPC).
Als Beispiele für die reaktiven Derivate der Carboxylgruppe der Verbindungen der Formel (VI) können genannt werden die reaktiven Derivate, die erhalten werden durch JReaktion der vorstehenden aktivierenden Eeagentien mit der Carboxylgruppe; die reaktiven Derivate der Carboxylgruppe, erhalten durch gleichzeitige Verwendung der Aktivierungsreagentien und der Kondensationszusätze, wie beispielsweise p-Kitrophenol, ο,ρ-Dinitrophenol, Pentachlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, Pentafluorphenol, N-Hydroxysuccinimid, 1-Hydroxybenzotriazol, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid; 3-Aminopropylester der Carboxylgruppe der Formel (IV) und monosubstituierte 3-Aminopropylester wie beispielsweise 3-Acetylaminopropylester, 3-Succinylaminopropylester, 3-Benzoylaminopropylester, 3-Benzylaminopropylester, 3-p-Toluolsulfonylaminopropylester, 3~(2,A—Dinitrophenyl)-aminopropylester, 3-(3*5~ Dimethyl-3-oxocyclohexen--1-yl)^.aminopropylester, 3-(tert.-Butoxycarbonyl)-aminopropylester und 3-(Salicyliden)-
35 iminopropylester.
Die Kondensation führt man im allgemeinen in einem Lösungsmittel durch. Das Lösungsmittel kann jegliches
ORIGINAL INSPECTED
solcher Lösungsmittel sein, die die Reaktion nicht beeinflussen, vorzugsweise verwendet man jedoch ein polares Lösungsmittel, das die Verbindung der Formel (VI), die als Ausgangsmat.erial verwendet wird, löst. Beispiele für derartige Lösungsmittel sind Wasser, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Acetonitril und Gemische davon. Das Molverhältnis von Amin der Formel (VII) oder (VIII) zur · Verbindung der Formel (VI) beträgt im allgemeinen etwa 0,5 bis 20, vorzugsweise etwa 1 bis 10. Obwohl die Reaktionstemperatur von dem Typ des Lösungsmittels und anderen Bedingungen abhängt, beträgt sie dennoch im allgemeinen -15° bis 4-5 0C, vorzugsweise -10° bis 30 0C. Die Reaktionszeit beträgt 1 bis 70 Stunden. Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden genauer beschrieben.
Die Kupfer enthaltende Form der Verbindung der Formel
(VI) und, falls notwendig, der vorstehend genannte Zusatz werden in Wasser, Dimethylformamid, Acetonitril oder einem Gemisch davon gelöst. Zu der Lösung fügt man das vorstehend genannte Aktivierungsmittel unter -führen bei -5° bis 15 Cr. Falls notwendig wird das Gemisch auf einen für die Aktivierung geeigneten pH-Wert mit einer anorganischen Säure oder Base, wie Chlorwasserstoffsäure oder Natriumhydroxid, oder mit einer organischen Base, wie Triethylamin oder N-Methylmorpholin, eingestellt. Zu dem Gemisch wird anschließend die Aminkomponente als solche oder in einer Lösung mit eingestelltem pH-Wert gefügt. Das resultierende Gemisch wird gerührt und gegebenenfalls wird der pH-Wert in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben eingestellt. Es wird weiter 1 bis 70 Stunden zur Erzielung der gewünschten erfindungsgemäßen Verbindung gerührt.
Das Isolieren des so gebildeten Derivats erfolgt auf folgende Weise. Ein organisches Lösungsmittel wie Aceton oder Ether wird zu dem Reakt ions gemisch zur Ausfällung des gewünschten Produkts gefügt. Die Ausfällung wird in destilliertem Wasser gelöst und anschließend auf den pH-Wert 6 eingestellt und wird zum Zwecke des Entsalzens
,0 ΔΗΟΟΟΟ
durch eine Säule geführt, die mit einem Adsorptionsharz, , wie "beispielsweise Amberlite ^ XAD-2 (Eohm & Haas Co.) gefüllt ist, wobei man sich destillierten Wassers bedient, um eine Adsorption des gewünschten Produkts an dem Harz zu bewirken. Die Säule wird mit destilliertem Wasser zur Entfernung des Salzes gewaschen und mit einem angesäuerten wäßrigen Methanol, wie einem Gemisch von 1/50 η Chlorwasserstoffsäure und Methanol (1 ;4 Vol./Vol.) eluiert, um die Fraktionen mit einem Absorptionsmaximum bei einer
in Wellenlänge von etwa 290 mu bzw. 29Q um zu sammeln. Die kombinierte Fraktion wird mit Dowex*~/44- (ein OH-Typ-Anionenaustauscherharz der Dow Chemical Co.) neutralisiert, anschließend unter verringertem Druck konzentriert und lyophilisiert zur Erzielung eines rohen Pulvers des Derivats. In einigen Fällen kann die Entsalzungsstufe weggelassen werden und die Lösung der Ausfällung in destilliertem Wasser kann direkt der zweiten Behandlungsstufe unterzogen werden.
In der zweiten Stufe wird die Lösung des rohen Pulvers in destilliertenLWasser durch eine Säule geführt, die mit CM-Sephadex ® C-25 (Na+-Typ; Pharmacia Fine Chemicals Co.), gefüllt ist, die ausgeglichen wurde mit 1/20 m Essigsäure-Natriumacetat-Pufferlösung (pH 4-,5), um eine Adsorption des gewünschten Produkts zu bewirken. Die adsorbierte Phase wird anschließend durch die lineare Konzentrations-Gradienten-Technik eluiert, die durchgeführt wird unter kontinuierlichem Zusatz von Natriumchlorid zu der vorstehenden Pufferlösung, um die Natriumchloridkonzentration graduell auf 1,0m anzuheben. Bei dieser Stufe neigen nicht umgesetzte Reaktionskomponenten und Nebenprodukte dazu, in einer früheren Stufe eluiert zu werden und können durch einen Ultraviolett-Absorptions-Monitor abgetrennt werden. Wenn es sich zeigt, daß die Fraktion des gewünschten Produkts durch Verunreinigungen Verunreinigt ist, wird die Chromatografie zur Entfernung der gesamten Verunreinigungen wiederholt.
ORIGINAL INSPECTED
Alternativ kann anstelle der vorstehenden Chromatografie eine andere chromatografische Reinigung unter Anwendung eines Adsorptionsharzes, "beispielsweise Amberlite ^-•'XÄD-2, durchgeführt werden. Die wäßrige Lösung des Rohprodukts wird durch die mit dem Harz gepackte Säule in einer Pufferlösung geleitet, wie beispielsweise 1 % wäßrige Ammoniumacetatlösung, um die Adsorption des gewünschten Produkts zu bewirken. Die adsorbierte Phase wird durch die lineare Konzentrationsgradiententechnik eluiert, bei der
^O Methanol-kontinuierlich zu der Pufferlösung gefügt wird, um die Methanolkonzentration allmählich anzuheben. Da die nicht umgesetzten fieaktionskomponenten dazu neigen in einer früheren Stufe und die Hauptnebenprodukte in einer späteren Stufe eluiert zu werden, können sie unter Anwendung eines Ultraviolett-Monitors abgetrennt werden. Wenn die gewünschten Fraktionen weiter durch Verunreinigungen verunreinigt sind, können diese durch Wiederholen der Chromatografie entfernt werden.
Die vorstehenden beiden Chromatografietypen werden jeweils allein oder in Kombination durchgeführt. Die gereinigte Fraktion, die das gewünschte Produkt enthält, wird durch Anwendung eines Adsorptionsharzes, wie beispielsweise Amberlite^XAD-2, entsalzt und lyophilisiert unter BiI-dung eines blauen amorphen Pulvers eines Kupfer enthaltenden (Amido)-N-substituierten Bleomycins. Die kupferfreie Form erhält man durch Entfernen des Kupfers aus der Kupfer enthaltenden Form in üblicher Weise, wie nach der Methode unter Verwendung von EDTA, wie in der JA-OS Nr. 31875/77 beschrieben. Ein Beispiel für das Verfahren zur Entfernung des Kupfers wird nachstehend beschrieben.
Das Kupfer enthaltende Produkt wird in destilliertem Wasser gelöst und die resultierende Lösung wird durch eine mit Amberlitev-/XAD-2 gepackte Säule in destilliertem Wasser geleitet, um die Adsorption des Kupfer enthaltenden Produkts zu bewirken. Anschließend wird das Harz mit einer wäßrigen Lösung gewaschen, die Natriumchlorid und
5 % des Dinatriumsalzes von Ethylendiamintetraessigsäure (kurz EDTA-2Na) enthältr um das Kupferion durch EDTA*2Na wegzutragen, wobei das kupferfreie (Amino)-N-substituierte Bleomycin adsorbiert an dem Harz zurückbleibt. Das Harz wird anschließend mit einer Natriumchloridlösung zur Entfernung von EDTA*2Na gewaschen, und anschließend mit destilliertem Wasser, und schließlich mit einem angesäuerten wäßrigen Methanol, wie beispielsweise einem 1/50 η wäßrigem Chlorwasserstoffsäure-Methanol (1:4- Vol./ Vol.) Gemisch eluiert, um die Fraktionen zu sammeln, die ein Absorptionsmaximum bei etwa 290 nm b_zw. um aufweisen.
Die kombinierte Fraktion wird mit Dowex ^44- (OH-Typ; Dow Chemical Co.) auf den pH-Wert 6,0 eingestellt, unter verringertem Druck konzentriert und lyophilisiert unter
!5 Bildung eines weißen amorphen Pulvers eines kupferfreien (Amido)-N-substituierten Bleomycin-hydrochlorids. Wenn Natriumsulfat und wäßrige Schwefelsäure anstelle des Natriumchlorids und der wäßrigen Chlorwasserstoffsäure verwendet werden, erhält man ein Sulfat. Auf diese Weise kann jegliches gewünschte Salz durch Wahl des Salzes und der Säure, die bei dem Eluierschritt verwendet werden, erhalten werden. Als Beispiele für Salze, die auf diese Weise erhalten werden, können genannt werden Acetat, Tartrat, Citrat, Maleat und Lactat zusätzlich zu Hydro-
25 chlorid und Sulfat.
Wenn das (Amido)-N-substituierte Bleomycin, das wie vorstehend hergestellt wurde, der Hydrolyse mit 6 η wäßriger Chlorwasserstoffsäure bei 105 C während 20 Stunden unterzogen wird, so stellt man außerdem das Amin R-H und X-NHp oder ein Zersetzungsprodukt dieses Amins in einigen Fällen fest, und solche Zersetzungsprodukte, die Bleomycinen zu eigen sind, einschließlich L-Threonin, ß-Amino-ß-(4~amino-6-carboxy-5-Biethyl-pyrimidin-2-yl)-propionsäure, 4—Amino-J-hydroxy^-methyl-n-pentansaure, ß-Hydroxy-L-histidin, ß-Amino-L-alanin und 2'-(2-Aminoethyl)-2,4-'-bithiazol-4— carbonsäure. Dies trägt zur Stützung bei, daß (Amido)-N-substituiertes Bleomycin
ORIGINAL
-35-
die durch, die vorstehende Formel (I) dargestellte chemische Struktur aufweist.
Wenn in der allgemeinen Formel (VI) der als Ausgangsmaterial verwendeten Verbindungen XQ eine Hydroxylgruppe ist und E ein endständiger Aminorest der Bleomycine ist, so erhält man ein Desamidobleomycin (Kupfer enthaltende Form) der Formel
CONH0 NH-
! 2 I 2
0 NH CH
CH CH2 XCO-OH
(VI-I)
N jT CO-R
\S^ H BM- -^H
worin BM und E wie vorstehend definiert sind. Es wird hergestellt durch Hydrolyse von kupferfreien Bleomycinen der allgemeinen Formel (II) mittels eines inaktivierenden Enzyms der Eatte oder dem in gleicher Weise aus Einderoder Schweineleber extrahierten.
Beispielsweise wird Einderleber in einer Phosphatpufferlösung homogenisiert und bei 8000 Upm zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird gegen einen Phosphatpuffer dialysiert, um eine rohe Enzymlösung zu erhalten. Zu dieser Enzymlösung fügt man eine Lösung von Bleomycinen in einem Phosphatpuffer. Man läßt das Gemisch bei 37 °c während 5 ^is 4-8 Stunden reagieren und entfernt das Eeaktionsgemisch aus dem Protein in geeigneter Weise (das Protein kann entfernt werden, beispielsweise durch Zusatz . von Trichloressigsäure, kurz TCA, auf-eine Konzentration von 5 °/° zur Ausfällung des Proteins, Abtrennen der Ausfällung durch Zentrifugieren und Waschen der Ausfällung dreimal mit 5 °/° TCA-Lösung, um die Waschlösungen zu sammeln). Das proteinfreie Gemisch wird neutralisiert, mit
Kupferacetat im Überschuß vermischt, um das gewünschte Produkt in ein Kupferchelat umzuwandeln. Zum Zweck des Entsalzens wird das Kupferchelat durch eine Säule geführt, die mit einem Adsorptionsharz, Dowex^HP 4-0 gepackt ist, wobei man sich destillierten Wassers bedient, um die Adsorption des gewünschten Produkts zu bewirken. Die Salze werden mit destilliertem Wasser weggewaschen und die adsorbierte Phase wird mit einem 1/50 η Chlorwasserstoff säur e-Methanol (1:4· Vol./Vol.) Gemisch eluiert, um Fraktionen zu sammeln, die ein Absorptionsmaximum bei etwa 290 nm bzw. mu zeigen. Die gesammelte Fraktion wird mit einem Anionenaustauscherharz, Dowex ^ 4-4- (OH-Typ; Dow Chemical Co.) neutralisiert,unter verringertem Druck konzentriert und lyophilisiert. Das resultierende Pulver wird in destilliertem Wasser gelöst und durch eine Säule, gepackt mit CM-Sephadex <-) C-25 (Na+-Typ; Pharmacia Fine Chemicals Co.) geleitet, die mit einer 1/20 m Essigsäure-Natriumacetat-Pufferlösung vom pH 4·,5 equilibriert wurde, um die Adsorption zu bewirken. Die adsorbierte Phase wird durch die lineare Konzentrations-Gradienten-Methode eluiert, bei der Natriumchlorid kontinuierlich zu der vorstehenden Pufferlösung gefügt wird, um die Natriumkonzentration allmählich auf 1,0 m zu steigern. Die Eluatfraktionen, die eine blaue Farbe aufweisen, die das gewünschte Produkt enthalten, werden gesammelt,
iRti
durch die Diaionv—7HP-4-0 Entsalzungsmethode, die vorstehend beschrieben wurde, entsalzt und unter Bildung eines blauen amorphen Pulvers von Kupfer enthaltenden Desamidobleomycinen lyophilisiert.
Wenn in der allgemeinen Formel (VI) der als Ausgangsmaterial verwendeten Verbindungen X die Bedeutung von -NH-X (worin X wie vorstehend definiert ist) hat und RQ OH ist, so wird die Formel zu der einer (Amido)-N-substituierten
35 Bleomycinsäure
ORIGINAL INSPECTED
ff * * f»
O «A
CONH
CH0
CH
NH
CH
NH J
CH
CO-NH-X
Π—COOH
(VI-2)
BM-
worin BM wie vorstehend definiert ist. Ein Beispiel für seine Synthesemethode wird im folgenden aufgeführt.
Unter Verwendung des vorstehend erwähnten desaktivierenden Enzyms wird Bleomycin B2, eine bekannte Verbindung, zu Desamidobleomycin B~ umgewandelt, ein Desamidobleomycin der Formel (VI), worin R Agmantin ist. Dieses
Desamidobleomycin wird mit einem Amin der Formel (VII)
wie vorstehend beschrieben umgesetzt, unter Bildung eines (Amido)-U-substituierten Bleomycins Bp, in dem E
Agmantin ist, und die resultierende Verbindung wird hydrolysiert unter Anwendung eines bekannten Fungusmyceliums (beispielsweise IiO 8502, hinterlegt im Institute for
Fermentation, Osaka) unter Bildung des gewünschten Produkts.
Desamidobleomycinsäure, dargestellt durch die Formel
CONH CH2
rr
i2
CH
N-
11
(VI-3)
COOH
ist ein Ausgangsmaterial der allgemeinen Formel (VI), worin sowohl X als auch R Hydroxylgruppen sind. Es wird hergestellt durch Hydrolyse einer bekannten Bleomycinsäure (vgl. US-PS 3 886 133) nii-t dem vorstehend erwähnten inaktivierenden Enzym. Es wird auch erhalten durch Hydrolyse von Desamidobleomycin IU der allgemeinen Formel (VI-1), worin R Agmantin ist, unter Verwendung der vorstehend erwähnten Fungusζeile.
Als Beispiele für die Amine der allgemeinen Formel (VII) können genannt werden Methylamin, Ethylamin, n-Propylamin, Isopropylamin, n-Butylamin, Isobutylamin, tert.-Butylamin, n-Pentylamin, 3-Methylbutylamin, Neopentylamin, n-Heptylamin, 3-Methylpentylamin, n-Hexylamin, 1,5-Dimethylhexylamin, Isohexylamin, n-Octylamin, n-Decylamin, Laurylamin, Myristylamin, Cetylamin, Stearylamin, 2-Aminoethylamin, 3-Aminopropylamin, 4—Aminobutylamin, 6-Aminohexylamin, 12-Aminododecylamin, 4—Amino-4—methyl 1-dimethylpentylamin, 2,2,2-Trifluorethylamin, 2,2,2-Trichlorethylamin, 2,2-Difluorethylamin, 2,2-Dichlorethylamin, Benzylamin, Diphenylmethylamin, 2-Phenylethylamin, 2,2-Diphenyl ethylamin, 1 -Phenylethylamin, 1,2-Diphen'ylethylamin, 3-Piienylpropylamin, 2-Phenylisopropylamin, 1,3-Diphenylpropylamin, 313-Diphenylpropylamin, 4—Phenylbutylamin, 4,4-Diphenylbutylamin, Chlorbenzylamin, Dichlorbenzylamin, Brombenzylamin, Methoxybenzylamin, Dimethoxybenzylamin, Ethoxybenzylamin, Methylendioxybenzylamin, Propoxybenzylamin, p-Chlorphenylethylamin, p-Methoxyphenylethylamin, p-Benzyloxybenzylamin, Furylmethylamin, 2-Furylethylamin, 2-Thiazolylmethylamin, 2-Pyrazolylmethylamin, 2-Imidazolyimethylamin, 4-Imidazolylmethylamin, 2-Thienylmethylamin, 2-Pyridylmethylamin, 3-Pyridylmethylamin, 4~Pyridylmethylamin, Indolylmethylamin, Indolylethylamin, 4-Methoxyindolylmethylamin, 2-Pyrimidylmethylamin, 2-Pyrimidylethylamin, 4-Pyrimidylmethylamin, 4-Pyrimidylethylamin, 2-Piperidylmethylamin, 3-Piperidylmethylamin, 4—Piperidylmethylamin, 2-(2-Piperidyl)-ethylamin, 2-(3-Piperidyl)-ethylamin,
ORIGINAL INSPECTED
2-(4—Piperidyl)-ethylamin, 1-(2-Piperidyl)-ethylamin, 1-(3-Piperidyl)-ethylamin, 1-(4~Piperidyl)-ethylamin, 2-(Piperidino)-ethylamin, 2-Piperazylmethylamin, 2-(2-Piperazylethyl)-amin, 2-(Piperidino)-ethylamin, 5-Piperidinopropylamin, 2-(Morpholino)-ethylamin, 3-(Morpholino)-propylamin, 2-IlorpholinyliQethylamiii, 3-MQrpholinylmetliylamin, 2-(Morpholinyl)-ethylaminr 3-(Morpholinyl)-propylamin, Dimethylaiainoetliylamiii, Diethylaminoethylamin, Dipropylaminoetliylamin, Propylaminoetliylainin, Dimethylaminopropylamin, Diethyl aminopropylamin, Dipropylaminopropylamin, Propylaminopropylamin, Dibutylaminopropylamin, Butylaminopropylamiii, Benzyl aminopropylamin, 2-Phenylethylaminopropylamin, 1-Phenyl ethyl aminopropylamin, 3-Phenylpropylaminopropylamin, 4-Phenylbutylaminopropylamin, Methylaminoethylaminopropylamin, Ethylaminopropylaminopropylamin, Propylaminopropylaminopropylamin, Butylaminopropylaminopropylamin, K-(Butylaminopropyl)-U-methylaminopropylamin, Dibutylaminopropylaminopropylamin, Pentylaminopropylaminopropylamin, Ethylaminobutylaminopropylamin, Propylaminohutylaminopropylamin, Ethylaminöpropylaminobutylamin, Butylaminopropylamino"butylamin, Benzylaminoethylaminoethylamin, Benzylaminoethylaminopropylamin, Benzylaminopropylaminopropylamin, Benzylaminobutylaminopropylamin, Phenylethylaminopropylaminopropylamin, li-(Phenylethylaminopropyl)-N-methylaminopropylamin, N- (Chlorbenzylaminopropyl)-N-methylaminopropylamin, N-(Brombenzylaminopropyl)-N-methylaminopropylamin, N-(Chlorphenylethylaminopropyl) -N-methylaminopropylamin, Dibenzylaminopropyl-NjN-dimethylaminopropylamin, Dibenzylaminopropyl-N^-diethylaminopropylamin, Dibenzylaminopropyl-N-methyl-N-benzylaminopropylamin, a-Naphthylamin, ß-Naphthylamin, 2-Thiazolylamin, 3-Thiazolylamin, 4—Thiazolylamin, N-Benzyl-4—piperidylamin, N-Phenylethyl—4—piperidylamin, N-Benzyl-3-piperidylamin und N-Benzyl-2-pipe-
35 ridylamin.
Günstige Amine der Formel (VIII) sind solche aliphatische primäre Amine, üxe eine basische Gruppe zusätzlich zur
ο c. H u o yj υ
an der !Reaktion teilnehmenden Aminogruppe aufweisen. Als Beispiele für solche Amine können genannt werden 2-Aminoethylamin, 3-Aminopropylamin» 2-Dimethylaminoethylamin, 2-Diethylaminoethylamin, 3-Dimethylaminopropylamin, 3-1)1-ethylaminopropylamin, 3-(3-Butylaminopropylamino)-propylamin, 3~(2-Hydroxypropylamino)-propylamin, 3-I)ipsriciinopropylamin, 3-(i-Phenylethylamino)-propylamin, 2-Aminopropylamin, 3-Methylaminopropylamin, 3-Butylaminopropylamin, 3-(6-Aminohexylamino)-propylamin, 3-Trii'iethylaminopropylamin, 3-(3-Dimethylaminopropylamino)-propylamin, 3-(3-Aminopropylamino)~propylamin, 3-/p-Methyl-N-(3-propyl)-aminoT^-propylamin, 3-i)yT3?olidinylpropylaiiiin, 3-Piperidinylpropylamint 3-Morpholinopropylamin, 3-razinylpropylamin, 3-/^~(3-Aminopropyl)-piperazinyl7-propylamin-3-(3-pyi'i>olidinylpropylamin^-propylamin, 3-(3-Piperidinylpropylamino)-propylamin, 3-(3-propylamino)-propylamin, 3-(3-Hydroxypropylamino)-propylamin, 3-(3-Methoxypropylamino)-propylamin, 3-Benzylaminopropylamin,m-Aminomethylbenzylamin, p-Aminomethylbenzylamin, 2-Cyclopentylaminoethylamin, 3-Cyclohexylaminopropylamin, ^-Cyclohexylaminobutylamin, Cycloheptylaminopropylamin, 3-Cyclooctylaminopropylamin, 3-/^-Methyl-3-U-( cycloo ctylmethylaminopropyl) -aminoT-propylamin, 3-Cyclodecanylmethylaminopropylamin, 3-{N-Methyl-K-^J- (2-p-chlorphenylethylamino)-propyl7-amino}-propylamin, 3--[N-Me^yI-IT-ZJ- (m ,p-di"benzyloxybenzyl)-aminopropyl7-amino} -propylamin, 3-{N-Methyl-H-/3-(p-cyanobenzylamino)-propylT"-amino} -propylamin, 3-{N-Methyl-N-/J- ( cycloundecanylmethylamino )-propyl7~amino- -propylamin, 3~ {N-Methylli-//bis-(m,p-dibenzyloxybenzyl)-aminopropyl7-aminoj- propylamin, 3-{n>N-Dimethyl-H-ZJ- (dibenzylamino)-propyl/-. amino}-propylamin, 3-{N,li-Diethyl-li-/3-(cLibenzylamino)-propyl/7-amino- -propylamin, 3-{N,N-Dimethyl-li-/J-(li,lidimethyl-N-(3-dibenzylaminopropyl)-amino) -propylT-aminoj -. propylamin, 3-{li,N-Dimethyl-N-/3-(N,N-dimethyl-li-(3-cyclo ο ctylmethylaminopropyl)-amino )-propyl7-amino} - propylamin , 3-/F~ ( 3-Dibenzylaminopropylamino ) -piperidylZ-propylamin und 3~Z?^"(3-Cyclooctylmethylaminopropyl)-piperi dyl7-propylamin.
ORIGINAL
Unter den Aminen der allgemeinen Formel (VIII) sind solche, die durch die folgende allgemeine Formel darge stellt werden, neue Verbindungen, die im Rahmen der Er findung erstmals hergestellt werden:
-(OH2),-A1-(CH2)--B1 , (IX) worin A1 die Bedeutung hat von 10 -N- oder -K φ-
(worin K^q' und E11' jeweils ein Niedrigalkyl oder Benzyl sind und B1 die Bedeutung hat von Di^/phenyl (niedrig) alkyl7-amino, Cyanophenyl(niedrig)-alkylamino, Cr /,,-Cycloalkyl-substituiertes-niedrigalkylamino oder Bis-//H"ibenzyloxyphenyl(niedrig)-alkyl7-amino. Diese Verbindungen werden hergestellt durch Hydrolyse der Verbindung, die dargestellt wird durch die allgemeine Formel
Β' (X)
(worin A1 und B1 wie vorstehend definiert sind und Y eine geschützte Aminogruppe darstellt) zur Entfernung der Schutzgruppe; Zwar erfolgt die Hydrolyse in Anwesenheit von entweder einer Säure oder einer Base, jedoch ist eine Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, allgemein bevorzugt.
Von den Ausgangsmaterialien der allgemeinen Formel (X) werden solche, dargestellt durch die allgemeine Formel
Y-(CH0),-N ^- (CH9)--N
35 R · R
Rll
13
(worin E^q' ? -^ή ' VJ1^ Y wie vorstehend definiert sind und
^p E13" Jeweils e^n Kienyl(niedrig)-alkyl sind) auf
folgende Weise hergestellt.
Ein 3-^inopropyl-li,N-dialkylamin der allgemeinen Formel
I10
NH2-(CH2)3-N-R11, (XII)
(worin ^0' unc* EiV w^-e vorstehend definiert sind) wird der reduktiven Kondensation mit Benzaldehyd oder einem Phenyl(niedrig)-aldehyd unterzogen. Das Reaktionsgemische Wird alkalisch gemacht und mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, um ein N1 ,N'-Dibenzylaminopropyl-li,]!!-
15 dialkylamin der allgemeinen Formel
jll |12 R10'-N- (CH2) 3-N-R13" 20
zu erhalten (worin ^q' *' ^11'» •^12" unc^ E1^" w^"e hend definiert sind). Das resultierende Amin wird mit 3-Halogenpropyl-lf-( geschützt es )-amin umgesetzt unter Bildung eines quaternären Salzes der Formel
25 ρ ' R "
10 12
Y- (CH2)3-N ®-(CH2)3-N (XIV)
P ' R "
Rll K13
(worin X, E10'1 E11' ♦ E12" und Ε13" wie VOI>ste]aend defi
niert sind). Das quaternäre Salz wird in Anwesenheit einer Säure, "beispielsweise 6 η Chlorwasserstoffsäure, bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis 200 C, z. B. bei 110 0C während 8 Stunden hydrolysiert. Nach der Entfernung der Nebenprodukte wie einer Säure wird das Eeaktions gemisch konzentriert, um ein Hydrochlorid der Verbindung der Formel (XI) zu ergeben.
ORIGINAL INSPECTED
-43-1 Ein Amin der allgemeinen Formel
Hiedrigalkyl 4)3-B» (XV)
worin X wie vorstehend definiert ist und B" ein
nyl(niedrig)-alkyl/7·-amino, p-Cyanophenyl(niedrig)-alkylamino, C^ ^,i-Cycloalkyl-substituiertes-Niedrigalkylamino
10 oder Bis-/dibenzyloxyph.enyl(niedrig)-alkyl7-amino ist,
wird hergestellt durch Acylieren eines Bis(3-Aminopropyl)-(niedrig)-alkylamins mit einem Äquivalent oder weniger eines Acylierungsmittels, wie beispielsweise Benzoylchlorid, Acetylchlorid, Essigsäureanhydrid, Carbobenzoxy-Chlorid, S-tert.-Butoxycarbonyl—4-,6-dimethyl-2-mercaptopyrimidin oder N-Carbethoxyphthalimid unter Bildung eines monoacrylierten Derivats, Unterziehen des resultierenden Derivats einer reduktiven Kondensation mit einem Äquivalent eines .Aldehyds, wenn B" eine monosubstituierte Aminogruppe ist oder mit zwei oder mehreren, vorzugsweise 3 bis 6, Äquivalenten eines Aldehyds, wenn B" eine disubstituierte Aminogruppe ist, und Hydrolysieren der Acylgruppe mit Chlorwasserstoffsäure.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der typischen (Amido)-N-substituierten Bleomycin-Derivate der Erfindung sind in der Tabelle II angegeben.
Abkürzung Tabelle II • TLC*1 der Cu-
enthaltenden
Form
Rf		 *2
Elektrophorese
der Cu-enthaltenden
Form (Em)
(Em von Alanin =* 1,0)
Verbindung
Nr.		 dH-MMA UV-Absorptionsmaxi-
nn*m der Gu-freien
Porm (nm bzw. mu)
(E 1 %/Λ ' cm) '		 0,62* 0.92
1 dH-MEA 291 (111) 0.75 0.83
2 dH-IPA 291 (107) 0.56* 0.85"
3 dH-BA 291 (105) 0.70 0.75
4 dH-PEP 291 ( 98) 0.68 0.96
5 dH-EDA 291 (102) 0.45 1.04
6 dB2-IPA 291 (100) 0.53* 0.93
7 dB2-DHA 291 ( 89) 0.76 0.87
8 dB2-TFEA 291 ( 94) 0.50* 0.85
9 dB2-OCT 291 ( 93) 0.72 0.77
10 dB2-PEP 291 (85) 0.87 1.03
11 dB2-BPA 291 ( 79) 0.87 1.02
12 dB2-LAA 292 ( 79) 0.43 0.70
13 dB2-BA 291 ( 82) 0.39* 0.78
14 dB2-ADPM 291 ( 78) 0.82 0.76
15 dB2-DPE 291 ( 89) 0.77 0.76
16 dB2-NA 291 ( 81) 0.84 0.83
17 dB2-FFA 291 ( 85) 0.4 8* 0.82
18 292 (115)
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ORfGfNAL INSPECTED
63 dMCNBZ-PEP 291 ( 93) 0.69 1.10
64 dMDDBZOBZ~PEP 285 ( 74) 0.09 0.93
65 dMDDBZOBZ-OCT 285 C 76) 0.04 0.64 .
Anmerkungen:
*1 Dünnschichtchromatografie "Silica Gel 6Oi1 254 Silanised ^" (Merck Co.); Methanol-6 % Ammoniumacetat (60:40 Vol./Vol.) mit Ausnahme der Rf-Werte mit einem Sternchen, die in einem anderen Gemisch (65ί34 Vol./Vol.) gemessen wurden.
*2 Avicel Si1^(FMC Co.); Ameisensäure-Essigsäure-Vasser (27:75:900 Vol./Vol.), 800 V, 15 Minuten.
. CSO
0Z4Ü000
Die biologischen Eigenschaften, bestimmt an typischen erfindungsgemäßen Verbindungen, sind im folgenden aufgeführt.
1. Beständigkeitsuntersuchung gegen inaktivierendes Enzym (1) Extraktion des inaktivierenden Enzyms
Die Leber von männlichen Ratten (Stamm Donryu) wurde mit dem Zweifachen des Gewichts einer 1/15 m Phosphatpufferlösung vom pH 7 vermischt und zur Bereitung einer Gewebeemulsion vermählen. Die resultierende Emulsion wurde bei 105 000 g (Gravitätskonstante) 60 Minuten zentrifugiert. Die überstehende !Flüssigkeit wurde dialysiert und die resultierende große Molekülfraktion wurde als Inaktivierungsenzymextrakt verwendet.
(2) Bestimmung der Inaktivierungsreaktion
Zu 1 ml des vorstehenden Extrakts wurde 1 ml einer Substratlösung gefügt, die 800 meg eines· Bleomycinderivats enthielt. Das Gemisch wurde bei 37 0C für 40 Minuten reagieren gelassen. Ein Anteil von 0,3 ml des Eeaktionsgemischs wurde von Protein befreit und auf die fiestaktivität gegen Mycobacterium smegmatis ATCC 607 untersucht. Unter den gleichen Tes'tbedingungen wurden Bleomycin B^ als Kontrolle verwendet und zeigte eine 50 % Verringerung der Wirksamkeit. Die Testergebnisse sind in der Tabelle III aufgeführt. Aus den Testergebnissen ist im Vergleich mit den Bleomycinen ersichtlich, daß die er- ■ findungsgemäßen (Amido)-N-substituierten Bleomycin-Derivate im allgemeinen durch das Bleomycin-inaktivierende Enzym weniger angegriffen werden.
35 2. Antimikrobielle Aktivitäten gegen Mycobacterium smegmatis ATCC 607 und Bacillus subtilis.
ORIGINAL INSPECTED
Die antimikrobielle Wirksamkeit wurde gegen, die vorste hend erwähnten TestOrganismen nach der Methode eines Agar-Platten-Zylinders bestimmt. Die Aktivität wurde aufgezeichnet unter der Annahme, daß die Aktivität der Standardprobe von Bleomycin A2 (kupferfreie Form) 1000 meg Wirksamkeit/mg beträgt. Die Testergebnisse sind in der Tabelle III aufgeführt.
3· Wachstumsinhibierung von kultivierten HeLa-S^-ZeIlen
HeLa-S^-Zellen wurden in ein Medium (MEM mit 10 % Rinderserum) in einer Kunststoff-Petri-Schale inokuliert. Zwei Tage später wurde Bleomycin zu der Schale gefügt. 15 Nach 3-tägigem Bebrüten wurde die Anzahl der Zellen
gezählt. Der Prozentsatz der Wachstumsinhibierung wurde nach folgender Gleichung berechnet:
Prozentuale Inhibierung (%) = 100 χ (B-A)/(B-C)
worin A die Endanzahl der Zellen nach drei Tagen, beginnend mit der Zugabe der Testprobe, darstellt, B die Endanzahl der Zellen in der Kontrolle ohne Zusatz der Testprobe darstellt, und G die Anzahl der Zellen zum Zeit-
25 punkt des Zusatzes der Testprobe darstellt. Die I^cq
(Konzentration der 50 %igen Inhibierung) wurde aus einer Grafik bewertet, die hergestellt wurde durch Auftrag der Konzentration der Testprobe gegen die prozentuale Inhibierung. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle
30 III aufgeführt.
Tabelle III
2 CO -σ m
Verbin
dung
Nr.		 Abkürzung antimikrobielle Wirksam
keit der Cu-freien Form
(meg Wirksamkeit/mg)		 gegen
Bacillus
subtilis		 50 % Wachstumsinhi-
bierungskonzentra-
tion der Cu-freien
Verbindung gegen
kultivierte HeLa-
S^Zellen (ID50)
(mcg/ml)		 Widerstands
fähigkeit
der Cu-freien
Verbindung
gegen das
inaktivie
rende Enzym
*1
i dH-MMA gegen
Mycob acterium
smegmatis
ATCG 607		 6 54 1.2 ++++
2 dH-MEA 1447' 767 0.98 +++
3 dH-IPA 1895 593 d.95 +++++
4 dH-BA 2778 579 1.10 . +
5 dH-PEP 6595 3772 1.0 ++++
6 dH-EDA 9846 4453 1.0 ++++
7 dB2-IPA 2396 1950 0.56 ++++ ι,
8 dB2-DHA - 6425 950 0/ö2
9 dB2-TFEA 24880 730 1.03 ++
10 dB2-OCT 3990 1500 0.34 +
11 dB2-PEP ■ . 33700 7036 0.71 +++++
12 dB2-BPA 15729 4384 0.98 +++++ '
13 dB2-LAA 16438 660 0.39 ++++
14 dB2-BA 7650 1650 0.73 +
15 dB2«ADPM 28140 980 0.39 +++++
42320
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60 dMCCHPEP 54345 7273 0.33 +++++
61 dMCNBZ-BPA 14730 4755 1.10 ++++
62 dMCNBZ-OCT 49270 381 : 0.28 +++
63 dMCNBZ-PEP 21877 11056 0.60 ++++
• 64 dMDDBZOBZ-PEP 115 23 0.058 *
65 dMDDBZOBZ-OCT 153 ' 13 0.30 *
Anmerkung:
*1 Die Widerstandsfähigkeit wurde als Inaktivierungsgrad unter den Bedingungen unter denen der Inaktivierungsgrad von Bleomycin B2 50 % "beträgt, bewertet.
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Bewertung;
Inaktivierungsgrad: 45 % oder mehr 35 bis 44 % 25 bis 34 % 15 bis 24 % 5 bis 14 % weniger als 5 %
nicht bestimmbar aufgrund der Adsorption an das Enzymprotein
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-54-4. Pulmonare Toxizität (pulmonare i'ibrose) der Maus
Mäuse vom Stamm ICE, männlich, 15 Wochen alt, wurden in Gruppen von neun Tieren verwendet. Jedes Testpräparat wurde durch intraperitoneale Injektion einmal täglich während 10 aufeinanderfolgender Tage in Dosierungen von 5 mg/kg verabreicht. Nach beendeter Verabreichung wurden die Mäuse 5 Wochen unter Beobachtung aufgezogen, anschließend getötet und es wurden Autopsien vorgenommen,
IQ um das Auftreten und den Grad einer pulmonaren Fibröse zu bewerten. Die Bewertung erfolgte durch Vergleich der Anzahl der verabreichten Mäuse, die an pulmonarer I'ibrose litten und dem Grad der Erkrankung. Die Ergebnisse sind in der Tabelle IV aufgeführt. Der Grad wurde nume-
15 risch wie folgt bewertet:
Anzahl der Punkte
0: Keine i'ibrose
1: Akkumulation von Exudat in den Alveolen und von
fibroseartigen Veränderungen im alveolaren Septum.
2; I'ibrose an verschiedenen Stellen.
4·: verbreitete I'ibrose
6: I'ibrose in mehr als zwei Dritteln der Gesamtfläche.
Das "Verhältnis" der Tabelle IV wurde durch Vergleich mit "Bleomycin Komplex" berechnet.
ORIGINAL INSPECTED
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QQQOOO2IQQ WWKIOOUUQQ WWWSSSSSS
ORIGINAL INSPECTED
-57-
5· ^t=Q "bei der Maus, bestimmt durch Verabreichung während 10 aufeinanderfolgender Tage
An männliche Mäuse vom Stamm CDi\/SLC (6 Wochen alt, 7 Tiere pro Gruppe) wurden subkutan verschiedene Dosierungen von Bleomycin-Derivaten einmal täglich während zehn aufeinanderfolgender Tage verabreicht. Aus der Sterblichkeit während des Verabreichungszeitraums wurde die LDj-Q (tägliche Dosis) nach der Methode von Behrens-Kärber bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle V aufgeführt.
Tabelle V
Verbindung Nr.
Abkürzung
n während der Verabrei- ?0
chungsperiode von 10 aufeinanderfolgenden Tagen (mK/kK/Tag) _____
52 dMMDBZ-PEP
53 dMMDBZ-OGT
64 ' dMDDBZOBZ-PEP
65 dMDDBZOBZ-OCT
13,9 15,0
> 81,4
> 75,7
Aus der vorstehenden Beschreibung ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen beständig gegenüber einem Bleomycin-inaktivierenden Enzym sind, eine große VTachstums-inhibierende Wirksamkeit gegen kultivierte HeLa-S^-Zellen aufweisen sowie eine ausgeprägte antimikrobielle Wirksamkeit besitzen und eine sehr geringe pulmonare Toxizität aufweisen, wodurch sie für klinische Anwendungszwecke brauchbar sind.
Bei der Verwendung als Arzneimittel werden die erfindungsgemäßen Verbindungen mit einem Exzipienten üblicherweise vermischt und in .der Form von Injektionen, Tabletten, Salben, Suppositorien usw. bereitet/ Geeignete Exzipienten umfassen Wasser, Zucker, wie Mannit, und andere
Δ 4 8 J b
Materialien, die in medizinischen Präparaten gewöhnlich verwendet werden.
Zwar variieren die Dosierungen in Abhängigkeit von der Verabreichungsform, jedoch wird eine Einzeldosis von 2 bis 10 mg pro Person ein bis viermal wöchentlich verabreicht und die kumulative Dosierung beträgt 2 bis 200 mg/ Person/Woche.
IQ Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Beispiel 1 15 Stufe A
200 g frische Rinderleber wurden in 400 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung vom pH 7>2 homogenisiert und 30 Minuten bei 8000 Upm zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde gegen 0,05 m Phosphatpuffer dialysiert, um eine rohe Enzymlösung zu bereiten. Zu 10 g Bleomycin B~ wurden 400 ml der rohen Enzymlösung gefügt. Das Gemisch konnte 24 Stunden bei 37 0G reagieren. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 40 ml einer 55 °/° Lösung von Trichloressig- säure (kurz TCA) zur Ausfällung des Proteins gefügt. Die Ausfällung wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und dreimal mit 5 °/° TCA-Lösung gewaschen. Die überstehende Flüssigkeit und die Waschflüssigkeiten wurden vereint, mit einer. 4 m Natriumhydroxidlösung neutralisiert und mit 3»2 g (2,4 Äquivalente zu Bleomycin) Kupferacetat vermischt, um ein Kupferchelat des gewünschten Produkts zu bilden. Zum Zwecke der Entsalzung wurde die Kupferchelatlösung durch eine Säule von 11 Volumen, gepackt mit einem Adsorptionsharz, Diaion ^ HP-40 (Mitsubishi Chemical Co.) in destilliertem Wasser geleitet, um die Adsorption des gewünschten Produkts zu bewirken. Nach dem Abwaschen der Salze mit 1,5 1 destilliertem Wasser wurde die adsorbierte Phase mit einem 1/50 η wäßrige
ORIGiNAL INSPEQTED
Chlorwasserstoffsäure-Methanol- (1:4 Vol./Vol.) Gemisch eluiert, um die Fraktionen zu sammeln, die ein Absorptionsmedium "bei einer Wellenlänge von etwa 290 nm bzw. mu zeigten. Die vereinten Fraktionen wurden mit Dowex^44 (OH-Typ; Dow Chemical Co.) neutralisiert und unter verringertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wurde durch eine Säule von 1 1 Volumen, gepackt mit CM-SephadexS^ C-25 (Na+~Typ; Pharmacia Fine Chemicals Go.) geleitet, die mit einer 1/20 m Essigsäure-Natriumacetat-Pufferlösung
!0 vom pH 4,5 equilibriert worden war, um die Adsorption zu bewirken. .Die adsorbierte Phase wurde mittels der linea- . ren Konzentrationsgradientenmethode eluiert, bei der Natriumchlorid kontinuierlich zu der vorstehend erwähnten Pufferlösung gefügt wurde, um allmählich die Natriumkon-
I^ zentration auf 1,0 m zu erhöhen. Die bei einer Natriumkonzentration von etwa 0,5 m eluierten blauen Fraktionen wurden gesammelt, anschließend unter Verwendung von Diaionv-^HP 40, wie vorstehend beschrieben, entsalzt, und lyophilisiert unter Bildung von 8,5 S (83 °/° Ausbeute)
20 eines blauen amorphen Pulvers des Kupfer enthaltenden Desamidobleomycin Bp.
Das blaue Pulver zeigte Absorptionsmaxima (E 1 %/1 cm) bei 242 nm bzw. mu (138) und 291 nm bzw. mu (115), be-
stimmt in destilliertem Wasser. Die Infrarot-Absorptionsmaxima (Wellenzahl, cm" ) wurden in der KBr-Tablette gemessen und betrugen 3^25, 2975, 2940, 1720, 1640, 1575* 1460, 1420, 1400, 1375, 1280, 1260, 1240, 1190, 1140, 1100, 1060, 1020, 760. Andere physikalisch-chemische
30 Eigenschaften sind in der Tabelle VI aufgeführt.
In gleicher Weise wie vorstehend beschrieben wurden unter Verwendung von Bleomycin A2*-C, 3-((S)-I'-Phenylethyl)-aminopropylaminobleomycin und 3-(3-&-Bu'tylsminoproPyla-mino)-propylaminobleomycin erhalten, Desamidobleomycin Ap'-C, 3~( (S)-1 l-Phenylethylamino)-propylamino-desamido-bleomycin und 3-(3-n-Butylaminopropylamino)-propylaminodesamidobleomycin. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser Verbindungen sind in der Tabelle VI aufgeführt.
co
ca ο
to απ
fco
ο
Oi
Tabelle VI
hergestelltes Desamidobleomycin
UV-Absorptions- TLC Elektrophorese maximum der Cu- der Cu ent- der· Cu enthaltenenthaltenden haltenden den Form, Em Form nm (bzw.mu) Form, (Em von Alanin
f-W Λ ΟΖ/ΐ-ττΛ / T)-P
(E 1 %/icm)
Ef
■ 1,0)
Desamidobleomycin
Desamidobleomycin Ap'-C
24-2 (138) 0,95 0,72
292 (115) 0,64 *
24-2 (132) · 0,75 0,62
292 (110) 0,4-6 *
242 (14-7) 0,87 0,67
292 (124·) 0,4-0 *
24-2 (14-2) 0,83 1,01
292 (118) 0,55 *
-I1-Phenylethylamino)-propyldesamidobleomycin
3-(3-n-Butylaminopropylamino)-propylamino-desamidobleomycin
Anmerkung
*1 Dünnschichtchromatografie "Silica Gel 6OF 254- SilanisedVE? " (Merck Co.) gemessen in Methanol-6 % Ammoniumäcetatlösung-Gemisch (60:4-0 Vol./Vol.) mit Ausnahme der Ef-Werte mit einem Sternchen, die in einem anderen Gemisch (65i34- Vol./Vol.) gemessen wurden.
*2 "Avicel SF ®· (FMC Co.); Ameisensäure-Essigsäure-Wasser (27:75ϊ9ΟΟ Vol./Vol.); 800 V, 15 Minuten
-61-1 Stufe B
Zu einer Lösung von 1 g Kupfer enthaltenden Desamidobleomycin Bp, erhalten in der Stufe A und 1,77 g 1-Hydroxy- · benzotriazol (kurz HOBT) in 10 ml Dimethylformamid wurden • unter Kühlen bei 0 0C und Rühren 1,35 g (10 Äquivalente bezogen auf Bleomycin) Dicyclohexylcarbodiimid (kurz DCC) gefügt. 5 Minuten später wurden zu dem Gemisch 840 mg (50 Äquivalente bezogen auf Bleomycin) 3-((S)-I'-Phenyl-
O ethylamino)-propylaminhydrochlorid und 0,72 ml N-Methyl— amorpholin-gefügt. Das resultierende Gemisch wurde unter Rühren 16 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Zu dem Reaktionsgemisch wurde das zehnfache, bezogen auf das Volumen, an Aceton zur Ausfällung des gewünschten Produkts gefügt. Nach sorgfältigem Vaschen mit Aceton wurde die Ausfällung in destilliertem Wasser gelöst und durch
R eine Säule von 100 ml Volumen, gepackt mit CM-Sephadex C-25 (Na+-TyP; Pharmacia Pine Chemicals Co.), geleitet, die mit 1/20 m Essigsäure-Natriumacetat-Pufferlösung vom pH 4-»5> equilibriert worden war, um die Adsorption zu bewirken. Die adsorbierte Phase wurde nach der linearen Konzentrationsgradientenmethode eluiert, bei der Natriumchlorid kontinuierlich zu der vorstehenden Pufferlösung gefügt wurde, um allmählich die Natriumkonzentration auf 1,0m zu erhöhen. Die bei einer Natriumkonzentration von etwa 0,6 m eluierten blauen Fraktionen wurden gesammelt. Die vereinte Fraktion wurde entsalzt unter Verwendung von 100 ml Diaion ^ HP-40, wie vorstehend beschrieben, und lyophilisiert unter Bildung von 880 mg (76 % Ausbeute)
30 eines blauen amorphen Pulvers von Kupfer enthaltendem
Amido (N)-/J-( (S)-1' -phenylethylamino)-propyl7-bleomycin-B2. •Es zeigte Absorptionsmaxima (E 1 %/1 cm) bei 243 nm bzw. mu. (125) und 292 nm bzw. mn (96), gemessen in destillier-"
—1 tem Wasser. Die IR-Absorption (Wellenzahl, cm )· gemes-
35 sen als KBr-Tablette, betrug 3425, 2975, 2930, 1720,
1640, 1580, 1575, 1550, 1455, 1430, 1400, 1370, 1290, 1240, 1190, 1130, IO95, 1060, 1005, 980, 875, 760. Andere physikalisch-chemische Eigenschaften sind in der Tabelle II aufgeführt.
In gleicher Weise wie vorstehend beschrieben wurden die Kupfer enthaltenden Formen von (Amido)-N-substituiertem Bleomycin I^, Nr. 7 bis 20, gezeigt in der Tabelle II, hergestellt durch Reaktion des Kupfer enthaltenden Desamidobleomycin I^ mit Aminen, entsprechend den beabsichtigten Produkten.
In gleicher Weise wurden die Verbindungen Nr. 1, 6, 21-38, 64- und 65ϊ die in der Tabelle II gezeigt sind, hergestellt IQ durch Reaktion von Desamidobleomycin A-'-C, 3-((S)-I1-Phenylethyl)-aminopropylamino-desamidobleomycin und 3-(3-n-Butylaminopropylamino)-propylamino-desamidobleomycin (jedes Desamidobleomycin in der Kupfer enthaltenden Form) mit Aminen, die den gewünschten Produkten entsprachen.
Stufe C
In 20 ml destilliertem Wasser wurden 880 mg der Kupfer enthaltenden Verbindung, erhalten in der Stufe B, gelöst.
Zur Entsalzung wurde die Lösung durch si116 Säule von
100 ml Volumen, gepackt mit Amberlite ^ XAD-2 in destilliertem Wasser, geleitet, um die Adsorption der Kupfer enthaltenden Verbindung zu bewirken. Das Harz wurde nacheinander mit 300 ml einer wäßrigen Lösung, die Natrium-Chlorid und 5 % EDTA*2Na enthielt, 100 ml 2 % wäßrige Natriumchloridlösung und 250 ml destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wurde das Harz mit einem 1/50 η Chlorwasserstoffsäure-Methanol- (1/4- Vol./Vol.) Gemisch eluiert, um die Fraktionen zu sammeln, die ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 290 nm bzw. mu zeigten. Die vereinte Fraktion wurde mit Dowex 4-4- (OH-Typ; Dow Chemical Co.) auf den pH-Wert 6,0 eingestellt und anschließend unter verringertem Druck konzentriert und lyophilisiert Unter Bildung von 790 mg (93 % Ausbeu-
35 te) eines weißen amorphen Pulvers von kupferfreiem
(Amido ) -Έ-/3- ( (S)-1' -Phenylethylamino)-propyl7-bleomycin-Bo-hydrochlorid. Das UV-AbSorptionsmaximum bzw. (E 1 %/ 1 cm) betrugen 291 nm bzw. mu bzw. (79)· Die
ORIQiNALiNSPECTED
Ifi-Absorptionsmaxima (Wellenzahl, cm ), gemessen an der KBB-Tablette lagen bei 3425, 2950, 1720, 164-0, 1555, 14-50, 1400, 1360, 1320, 1260, 1190, 1060, 880, 910, 805, 770 und 700·' Andere physikalisch-chemische Eigenschaften
5 sind in der Tabelle II aufgeführt.
Beispiel 2
Stufe A
400 g Fungusmycel, erhalten durch Kultivieren von Fusarium roseum Ii1O 7189, hinterlegt · im Institute for Fermentation, Osaka, wurden in 4 ml einer 1/20 m Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,5 homogenisiert. Zu dem homogenisierten Gemisch wurde eine Lösung von 10 g Kupfer enthaltendem (Amido )-K-i/J-( (S)-1' -Phenylethylamino)-propyl7-'bleomycin-Bo in 1 Liter der gleichen Phosphatpufferlösung, wie vorstehend verwendet, gefügt. Das Gemisch wurde 20 Stunden bei 37 0G umgesetzt. Das Keaktionsgemisch wurde mit einer Filterhilfe vermischt und durch Absaugen filtriert. Der Rückstand wurde mit der gleichen Pufferlösung, wie vorstehend verwendet, gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten wurden vereint und durch eine Säule _ geleitet, die mit 1 1 eines Adsorptionsharzes Amberlite^ XÄ.D-2 in destilliertem Wasser gepackt war, um die Adsorption des gewünschten Produkts zu bewirken. Nach dem Wegwaschen der Salze mit 2 1 destilliertem Wasser wurde die adsorbierte Phase mit 50 % wäßrigem Methanol eluiert, um 5 1 blaue oder bläulich-grüne Fraktionen zu sammeln. Die vereinte Fraktion wurde unter verringertem Druck konzentriert, anschließend in 350 ml 80 % Methanol gelöst und durch eine Säule geleitet, die mit 70 ml Aluminiumoxid in 80 % Methanol gepackt war. Die Säule wurde mit 100 ml 80 % Methanol gewaschen und mit 40 % Methanol entwickelt, um 350 ml der blauen Eluatfraktionen zu sammeln. Die vereinte Fraktion wurde unter verringertem Druck konzentriert, anschließend in destilliertem Wasser gelöst und durch eine Säule mit einem Volumen von 600 ml, gepackt
-64-
mit CM-Sephadex R C-25 (Na+-Typ; Pharmacia Eine Chemicals Co.) geleitet, die mit einer 1/20 m Essigsäure-Natriumacetat-Puff erlösung vom pH-Wert 4,5 equilibriert war, um die Adsorption des gewünschten Produkts zu bewirken. Die adsorbierte Phase wurde mittels der linearen Konzentrationsgradientenmethode eluiert, wobei Natriumchlorid kontinuierlich zu der vorstehenden Pufferlösung gefügt wurde, um allmählich die Natriumkonzentration auf 1,0 m zu steigern. Die bei einer Natriumkonzentration von etwa
10 0,2 m eluierten blauen Fraktionen wurden gesammelt,
schließend..unter Verwendung von Diaion BP-40 entsalzt und lyophilisiert unter Bildung von 7,1 S (79 % Ausbeute) eines blauen amorphen Pulvers von Kupfer enthaltender (Amido)-N-/J-((S)-1'-Phenylethylamino)-propyl7-bleomycinsäure. Die UV-Absorptionsmaxima und (E 1 %/i cm), gemessen in destilliertem Wasser, betrugen 245 nm bzw. mu.
(121) bzw. 293 nm bzw. mu (119). Die IR-Absorptionsmaxima
—1
(Wellenzahl, cm ), gemessen an KBr-Tabletten, lagen bei 3450, 2975, 2940, 1720, 1645, 1580, 1555, 1460, 137O, I3OO, 1190, 1140, 1095, 1060, IOO5, 980, 880, 765 und 7OO. Andere physikalisch-chemische Eigenschaften sind in der Tabelle VII aufgeführt.
In gleicher Weise wie vorstehend beschrieben wurden (Amido)-N-n-Octyl-bleomycinsäure und (Amido)-N-(3-Dibütylaminopropyl)-bleomycinsäure erhalten aus (Amido)-N-n-Octylbleomycin-Bo bzw. (Amido)-N-(3-Dibutylaminopropyl)-bleomycin-B2· Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser Säuren sind in der Tabelle VII aufgeführt. 30
ORIGINAL INSPECTED
co
σι
co ο
to ο
Tabelle VII )- UV-Absorptions
maximum der Cu-
enthaltenden
Form, nm bzw.
mu (E 1 %/Λ cm)		 (121)
(119)		 TLG*1 der
Cu=-enthal
tenden Form
Ef		 Elektrophorese
der Cu-enthal
tenden Form, Em
(Em von Alanin
= 1,0)
hergestellte (Amido)-lT-substituierte
Bleomycinsäure		 (Amido)N-(3-dibutylaminopropyl)bleomycin -
säure		 , 245
293		 (123)
(123)		 0.93
0.62*		 0.84
-(Amido.) N- [3- ((S) -1' -phenylethylamino
propyl]bleomycin säure		 (Amido)N-(octyI) bleomycin -
säure		 247
294		 (130)
(128)		 0.93
0.62*		 0V88
245
293		 • 0.79
0,20*		 0.59
cn
Y1
Anmerkung: *1 Dünnschichtchromatografie "Silica Gel 6OE 254 Silanised ®' (Merck Co.); gemessen in Methanol-6 % Ammoniumacetatlösung-Gemisch (60:40 Vol./Vol.) mit Ausnahme der Ef-Werte mit einem Sternchen, die in einem anderen Gemisch (65534 Vol./Vol.) gemessen wurden ;
*2 "Avicel SF ©» (PMC CO.); Ameisensäure-Essigsäure-Wasser (27:75:900 Vol./ Vol.); 800 V, 15 Minuten
1 Stufe B
In 10 ml DUE1 wurden 1,0 g Cu-enthaltende (.Amido)-H-^jT-((S)-I '-Phenylethylamino)-propyl7'-'bleomycinsäure, hergestellt in der Stufe A, und 1,71 g HOBT gelöst. In gleicher Weise wie in der Stufe B des Beispiels 1 konnte unter Verwendung von 1,31 g DGC die Lösung mit J4-0 mg 3-/N-(3'-Cycloo ctylmethylamino)-propyl—N~methylamino7-propylamin während 3 Stunden unter Bildung eines Konden-
jQ sationsprodukts reagieren. Wie im Beispiel 1 wurde das Eeaktionsgemisch mit Aceton behandelt* anschließend durch Chromatografie an CM-rSephadex ^ gereinigt und durch eine Säule von 100 ml Amberlite^XAD-2 zur Bewirkung der Adsorption geleitet. Die adsorbierte Phase wurde mittels
•^5 der linearen Konzentrationsgradientenmethode eluiert, wobei 500 ml Methanol kontinuierlich zu 500 ml einer Acetatpufferlösung vom pH-Wert 4-, 5 gefügt wurden, um die Methanolkonzentration linear zu steigern. Das gewünschte Produkt wurde bei einer Methanolkonzentration von 4-0 bis 50 % eluiert. Das Eluat wurde entsalzt unter Verwendung einer Säule (100 ml) von Diaion ^ HP-4-0, wie vorstehend beschrieben, und lyophilisiert unter Bildung von 980 mg (83 % Ausbeute) eines blauen amorphen Pulvers von 3-/ß-3' -(Cyclooctylamino)-propyl-li-methylamino7*-propylamino-(amid ο ) -N-^T- ( (S)-1' -phenyl ethylamino )-propyl7-bleomyc in (Kupfer enthaltende Form).
Stufe C
In 22 ml destilliertem Wasser wurden 980 mg Kupfer ent- . haltendes 3-/Ή-(3'-Cyclooctylmethylamino)-propyl-li-methylamino7-propylamino-( amido )-K-/J-( (S)-1' -phenyl ethyl) aminopropylT-bleomycin, hergestellt in der Stufe B, gelöst. Die Lösung wurde wie im Beispiel 1 der Behandlung zur Entfernungvon Kupfer unterzogen, unter Verwendung von Amberlite® XAD-2 und einer 5 % wäßrigen EDTA*2Na-Lösung. Der Abstrom aus der Säule wurde lyophilisiert unter Bildung von 870 mg (92 % Ausbeute) eines farblosen
ORfGfNAL INSPECTED
amorphen Pulvers von kupferfreiem 3-/N-(3'-Cyclooctyl-
methylamino )-propyl-N-methylamino7-propylamino- ( amido)-. K-/J-((S)-1 '-plienyletliylamino)-propyl7-bleomycinhydrochlorid. Das UV-Absorptionsmaximum und (E 1 %/1 cm), gemessen in destilliertem Wasser, lagen bei 291 nm bzw. mu bzw. (89). Die IE-Absorptionsmaxima (Wellenzahl, cm ), gemessen als KBr-Tablette, lagen bei 3400, 2925, 1720, 1650, 1550, 1520, 1480, 1460, 1450, 1405, 1385, 1360, 1320, 1255, 1190, 1130, 1100, 1055, 1020, 980, 960, 880, 805, 760, 725 und 695· Andere physikalisch-chemische Eigenschaften sind in der Tabelle II aufgeführt.
In gleicher Weise wie vorstehend beschrieben wurden die kupferfreien Formen der Verbindungen Hr. 20 bis 63, gezeigt in der Tabelle II, aus den entsprechenden Ausgangsmaterialien erhalten.
Beispiel 3 20 Stufe A
In gleicher Weise wie in Beispiel 2 beschrieben wurden 1,5 g des Kupfer enthaltenden Desamidobleomycin-B2, hergestellt im Beispiel 1, mit einem homogenisierten Gemisch von 60 g kultiviertem Mycelium von Fusarium roseum und 750 ml einer 1/20 m Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,5 vermischt. Das Gemisch konnte 21 Stunden bei 37 °G reagieren. Das Eeaktionsgemisch wurde wie im Beispiel 2 behandelt und durch eine Säule von 500 ml Volumen von
30 Amberlite ^XAD^ geleitet, um die Adsorption der
gewünschten Substanz zu bewirken. Die Säule wurde mit 75O ml destilliertem Wasser gewaschen und mit einem Wasser-Methanol- (4:1) Gemisch eluiert, um insgesamt 750 ml grüne Fraktionen zu sammeln, die unter.verringertem Druck
35 konzentriert wurden. Das Konzentrat wurde durch eine
Säule von 60 ml Volumen, gepackt mit CM-Sephadex C-25 (Na+-Typ; Pharmacia Fine Chemicals Co.) geleitet, die equilibriert worden war mit einer 1/20 m Essigsäure-
O/1HOOÜO
Natriumacetat-Pufferlösung vom pH-Wert 4-,5. Die Säule wurde mit destilliertem Wasser gewaschen und die abströmenden blauen Fraktionen von insgesamt 80 ml wurden gesammelt. Nach Wiederholen der Chromatografie an CM-Sephadex^wurde die gereinigte blaue Fraktion konzentriert und durch eine^Säule mit einem Volumen von 1 1, gepackt mit. Sephadex ^LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals Co.) in einem Wasser-Methanol- (1:4-) Gemisch geleitet. Die Säule wurde mit einem Wasser-Methanol- (1:4-) Gemisch zur Sammlung blauer Fraktionen entwickelt. Die vereinte blaue Fraktion wurde unter verringertem Druck konzentriert und lyophilisiert unter Bildung von 890 mg (87 % Ausbeute) eines blauen amorphen Pulvers von Kupfer enthaltender Desamidobleomycinsäure. Das UV-Absorptionsmaximum und (E 1 %/i cm), gemessen in destilliertem Wasser, betrug 254· nm bzw. mn (14-3) bzw. 292 nm bzw. nni (144-).
f —1 N
Die IR-Absorptionsmaxima (Wellenzahl, cm ;, gemessen als KBr-Tablette, lagen bei 34-50, 2975, 294Ό, 1720, 164-0, 1560, 1465,1420, 1380, 1280, 1190, 114-0, 1100, 1060, 1020, 990, 880, 810 und 775. Unter den in der Tabelle VII gezeigten Bedingungen betrugen der Rf-Wert bei der Dünnschichtchromatografie 0,91* und der Rm-Wert bei der Elektrophorese 0,4-9.
25 Stufe B ■ ·
In 5 i&l Dimethylformamid wurden 500 mg Kupfer enthaltende Verbindung, erhalten in Stufe A, und 2010 mg HOBT gelöst. Die resultierende Lösung und 3-((S)-1'-Phenylethylamino)-propylamin wurden 21 Stunden, wie im Beispiel 1, unter Verwendung von 770 mg DCC kondensiert. In gleicher Weise wie im Beispiel 2 wurde das Reaktionsgemisch mit Aceton behandelt, durch Chromatografie an CM-Sephadex und Chromatografie an Amberlite ^XAD-2 gereinigt, unter Verwendung von Diaion^HP-4-0 entsalzt und lyophilisiert unter Bildung von 280 mg (4-2 % Ausbeute) eines blauen amorphen Pulvers von Kupfer enthaltendem 3-((S)-1'-Phenylethylamino)-propylamino-(amido)-Ή-/β-((S)-I'-phenyl ethylamino )-propylJ7-bleomycin.
ORIGINAL INSPECTED
l In gleicher Weise wie vorstehend beschrieben wurden
3- ( 2-n-Butylaminopropylamino ) -propylamine- ( amido ) -ΪΤ-/3-(3-n-butylaminopropylamino)-propyl7-"bleomycin und 3-|*N- Z>-/2- (p-Chlorphenyl)-ethylamino7-propyl-li-methylaminoj; propylamino-( BmIdO)-N-/^"-(2-(p-chlorphenyl)-et;hylamino)-propyl-H-methylaminopropylT-bleomycin erhalten unter.Verwendung von 3-(3-n-Butylaminopropylamino)-propylamin bzw. lT-/S-(3-Aminopropyl)-li-methylaminopropy]Jr-H-(/2~-(pchlorphenyl)-ät hyl7-amin.
Stufe C
In 8 ml destilliertem Wasser wurden 280 mg Kupfer enthaltendes 3-((S)-1 '-Phenylethylamino)-propylamino-(amido)-N-/J-C(S)-I'-phenylethyl)-aminopropyl7--bleomycini erhalten in Stufe B, gelöst. Die Lösung wurde einer Behandlung zur Entfernung von Kupfer, wie im Beispiel 1, unterzogen unter Verwendung von Amberlite ^7 XAD-2 und 5 °/° wäßriger EDTA' 2Na-Losung. Der Abstrom aus der Kolonne wurde lyophilisiert unter Bildung von 250 mg (92 % Ausbeute) eines weißen amorphen Pulvers des kupferfreien 3-((S)-1'-Phenylethylamino)-phenylamino-(amido)-R-^5-( (S)-1' -phenylethylamino)-propyl7-bleomycins. Die IE-Absorptionsmaxima (Weilenzahl, cm" ), gemessen als KBr-Tablette, lagen bei
25 3370, 2975, 2940, 1715, 1660, 1565, 1500, 1455, 1385,
1320, 1255, 1190, 1140, 1100, 1060, 1020, 970, 920, 880, 805, 760, 730 und 695· Andere physikalisch-chemische Eigenschaften sind in der Tabelle II aufgeführt.
In gleicher Weise wie vorstehend beschrieben wirden andere Verbindungen, die in der Stufe B aufgeführt sind, jeweils in die kupferfreie lOrm umgewandelt. Die physikalischchemischen Eigenschaften dieser Verbindungen sind in der Tabelle II aufgeführt. ■
Beispiel 4
Eine Lösung von 10,22 g 3-AmiE-opropyldimethylamin in
iOO ml Methanol wurde mit 12 ml Eisessig neutralisiert und mit 100 g Benzaldehyd vermischt. Zu dem gerührten Gemisch wurden portionsweise 8,38 g Natriumcyanborhydrid gefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 16 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 eingestellt und das Methanol wurde durch Destillieren unter verringertem Druck abgezogen. Der Rückstand wurde mit 200 ml Wasser und 200 ml Chloroform behandelt. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt und mit 200 ml Chloroform zur Entfernung des Benzaldehyds extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde mit Natriumhydroxid auf den pH-Wert 12 eingestellt und zweimal mit 200 ml Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wurde über Natrium- IQ sulfat getrocknet und von dem Lösungsmittel durch Destillieren unter verringertem Druck befreit unter Bildung von 26 g (92 % Ausbeute) von ^-(Ν,Ν-Dimethylamino)-propyl7-dibenzylamin.
Das vorstehend erhaltene Amin wurde in 100 ml Acetonitril gelöst. Zu der gerührten Lösung wurde, tropfenweise eine Lösung von 22,25 S N-(3-Brompropyl)-phthalimid in 100 ml Acetonitril gefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden gerührt, bis das Halogenid verschwunden war, was sich durch Dünnschichtchromatografie bestätigte. Das Reaktionsgemisch wurde von dem Acetonitril durch Destillieren unter verringertem Druck befreit. Der Rückstand wurde in 200 ml 6 η Chlorwasserstoffsäure gelöst und durch Erwärmen während 8 Stunden bei 110 0C hydroIysiert. Die Hydrolysatlösung wurde gekühlt, von der ausgefällten Phthalsäure durch Filtrieren befreit, zur Trockene verdampft, in destilliertem Wasser gelöst und durch eine Säule eines Ionenaustauscherharzes Dowex^-I (Cl-Typ; 279 ml Volumen) geleitet. Der Abstrom wurde unter uverringertem Druck zur Trockene verdampft unter Bildung von 4-3,7 g N-^3-ZF~(3~-Aminopropyl)-N,H-dimethylamino/'-propylj'-dibenzylamin-trihydrochlorid. Das PMR-Spektrum dieser Verbindung, bestimmt in schwerem Wasser, zeigte folgende Signale:
ORIGINAL INSPECTED
<5(ppm) = 2,0 - 2,7, 4-H (m). 2,9 - 3,8, 8H.(m); 3,3, 6H (s); 4,6, 4-H (m); 7,7, 10H (s) (worin m und s in den Klammern Multiplett bzw. Singulett bedeuten). Diese Signale zeigten die vorstehend angegebene chemische · Struktur an. Andere physikalisch-chemische Eigenschaften sind in der Tabelle VIII aufgeführt.
In gleicher Weise wie vorstehend beschrieben wurde N- ^5-2^-(3-Aminopropyl)-N,K:-diethylamino7-propyl} -dibenzylamin-trihydrochlorid aus 3-Aminopropyldiethylamin als Ausgangsmaterial erhalten. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften sind in der Tabelle VIII aufgeführt.
Beispiel 5
In 180 ml Wasser wurden 150 g Bis-(3-aminopropyl)-methylamin und anschließend 53 g Triethylamin gelöst. Zu der Lösung wurde unter Kühlen in Eis und Rühren tropfenweise eine Lösung von 83 g (1/3 Äquivalent) 4-,6-Dimethyl-2-tert.-butoxycarbonylthiopyrimidin in 200 ml Dioxan gefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 5 Stunden reagieren gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde von dem Dioxan und Triethylamin durch Destillieren unter verringertem Druck befreit. Der Rückstand wurde mit 6 η Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 2 eingestellt und mit Chloroform gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde mit Natriumhydroxid auf den pH-Wert 13,5 eingestellt und mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformschicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und von dem Lösungsmittel durch Destillieren unter verringertem Druck befreit unter Bildung von 60 g (24 % Ausbeute) (3-tert.-Butoxycarbonylaminopropyl)-(3-aminopropyl)-methylamin (BOC-APMP).
In 130 ml Methanol wurde das vorstehend erhaltene BOC-APMP gelöst. Zu der Lösung wurden unter Kühlen in Eis und Rühren 69 g (2 Äquivalente) Cycloöctancarboxyaldehyd und eine Lösung von 10 g Natriumcyanborhydrid (NaBH-,CN) in 20 ml Methanol gefügt. Das Gemisch wurde bei
Raumtemperatur 24 Stunden gerührt. Nach beendeter Reaktion wurden 30 ml 6 η Chlorwasserstoffsäure zu dem Reaktionsgemisch gefügt, um überschüssiges Reduktionsmittel zu zersetzen sowie die tert.-Butoxygruppe zu entfernen. Das Gemisch wurde von dem Methanol durch Destillieren unter verringertem Druck, vermischt mit 400 ml destilliertem Wasser, befreit und mit 300 ml Chloroform zur Entfernung des restlichen Aldehyds extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde mit Natriumhydroxid auf den pH-Wert 13,5 eingestellt und zweimal mit 200 ml Chloroform extrahiert. Die Chloroformschicht, die das gewünschte Produkt enthielt , wurde über Natriumsulfat getrocknet und von dem Chloroform durch Destillieren unter verringertem Druck befreit. Der Rückstand wurde mit 100 ml destilliertem Wasser und 50 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure vermischt und zur Trockene verdampft unter Bildung von 66 g (71 % Ausbeute) N-{3-Z^~(3-Amino'propyl)-N-methylamino7-propyl^ -cyclooctylamin-trihydrochlorid.
Das PMR-Spektrum des vorstehenden Produkts, bestimmt in schwerem Wasser, zeigte folgende Signale: o(ppm) « 1,2 2,3, 15H (m); 2,0 - 2,8, 4H (m); 3,0 - 3,9, 1OH (m); 3,25, 3H (s) (worin m und s wie vorstehend definiert sind).
Diese Signale zeigen die chemische Struktur der Verbindung, wie vorstehend angegeben, an. Andere physikalischchemische Eigenschaften sind in der Tabelle VIII aufgeführt .
In gleicher Weise wie vorstehend beschrieben wurden N-{3-ZN-(3-Aminopropyl)-N-methylamino7-propylj-p-cyanobenzylamin-trihydrochlorid (81 % Ausbeute) und N-j3~ZP~ (3-Aminopropyl)-N-methylamino7-propyl^ -2-(p-chlorphenyl)-ethylamin-trihydrochlorid (51 % Ausbeute) erhalten aus p-Cyanbenzaldehyd bzw. p-Chlorphenylacetaldehyd. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser Verbindungen sind in der Tabelle VIII angegeben.
ORIGINAL INSPECTED
-73-1 Beispiel 6
Eine Lösung von 14/90 g BOC-APMP/ erhalten in der ersten Stufe von Beispiel 5/ in 300 ml Methanol, wurde mit Eisessig auf den pH-Wert 6,4 eingestellt. Zu der in Eis gekühlten Lösung wurden 77,30 g (4 Äquivalente) 3,4-Dibenzyloxybenzaldehyd und anschließend 5,0 g NaBH3CN gefügt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur gebracht und anschließend 96 Stunden gerührt und das Methanol wurde durch Destillieren unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mit 200 ml destilliertem Wasser verdünnt und zweimal mit jeweils 200 ml Chloroform extrahiert. Die Chloroformschichten wurden vereint, über Natriumsulfat getrocknet, auf 100 ml konzentriert und durch eine Säule von Siliziumdioxidgel von 1200 ml VoIumen geleitet, die vorher mit Chloroform gewaschen worden war, um eine Adsorption der gewünschten Verbindung an der Säule zu bewirken. Die adsorbierte Phase wurde mit einem Chloroform-Methanol-Gemisch eluiert, während die Methanolkonzentration stufenweise gesteigert wurde. Das gewünschte Produkt wurde in der Stufe eluiert, bei der das Chloroformzu-Methanol-Verhältnis 97:3 erreichte. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Eluatfraktionen wurden vereint und unter verringertem Druck konzentriert unter Erzielung von 31,43 g 1 -/N-(3-tert.-Butoxycarbonylaminopropyl)-N-methyl-
25 ami no/-3-/bis-'(3, 4-dibenzyloxybenzyl) -amino7-propan in
öliger Form. Zu einer Lösung des Öls in 7 8,6 ml Methylenchlorid wurden unter Kühlen in Eis und Rühren 78,6 ml Triifluoressigsäure (TFA) tropfenweise während 30 Minuten gefügt. Das Gemisch konnte 1,5 Stunden bei 0 0C reagieren.
Anschließend wurde die Badtemperatur auf 25 DC angehoben und das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde mit 2 00 ml destilliertem Wasser und 50 ml 5 η wäßriger Natriumhydroxidlösung vermischt und mit 500 ml Chloroform extrahiert zur Gewinnung
35 von 3—^N-^N-Methyl-N-ZS'-bis-(m,p-dibenzyloxybenzyl)-
aminopropyl/-amino}}-propylamin (kurz MDD-Amin). Die wäßrige Schicht wurde erneut mit 100 ml Chloroform extrahiert. Die Chloroformschichten wurden vereint, über Natriumsulfat
getrocknet und das Chloroform wurde unter verringertem Druck abgezogen unter Bildung von 26,30 g eines rohen Öls von MDD-Amin. Zum Zweck der Reinigung wurde das rohe öl einer Säulenchromatografie an Amberlite ®^XAD-2 (2000 ml Volumen) unterzogen, die auf folgende Weise durchgeführt wurde. Das rohe öl wurde in 75 ml Methanol gelöst und die Lösung wurde mit 750 ml einer 4 % wäßrigen Kaliumacetatlösung-2 % wäßrigen Essigsäure (1:1) Pufferlösung vermischt. Die resultierende Suspension wurde durch die Säule geleitet, um das gewünschte Produkt an der Säule zu adsorbieren. Die Pufferlösung wurde· durch die Säule fließen gelassen und Methanol wurde zu dem Puffer gefügt, so daß die Methanolkonzentration stufenweise anstieg. Es zeigte sich, daß das gewünschte Produkt (MDD-Amin) eluiert wurde, wenn das Puffer-ζ u-Methanol-Verhältnis 15:85 betrug. Die Fraktion, die das gewünschte Produkt enthielt, wurde von dem Methanol durch Destillieren unter verringertem Druck abgezogen, anschließend mit 5 η wäßriger Natriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 13 eingestellt und dreimal mit jeweils 300 ml Chloroform extrahiert.
Die Chloroformschichten wurden vereint, über Natriumsulfat getrocknet, das Chloroform wurde durch Destillieren unter verringertem Druck entfernt und es wurde über Phosphorpentoxid getrocknet unter Bildung von 21,08 g (46,2 % Ausbeute) MDD-Amin (freie Base) in der Form eines Öles. Die physika-Iisch-chemischen Eigenschaften sind in der Tabelle VIII aufgeführt.
ORIGINAL INSPECTED
Tabelle VIII
hergestelltes Amin • N-{3-[N-(3-Aminopropyl)-N-
methylamino]propyl}=cyclo»
octylmethylamin — tri-
hydrochlorid		 3425,
2000,
1460,		 IR (cm"1)
(KBr-Tablette)		 , 2750,
, 1600,
, 1350,		 2600,
1480,
1300,		 *1
PMR X
(60 MHz		 2.7
3.8		 (ppm)
, D20)		 (m)
(m)
(S)		 *2
Rm Δ 		Bf *3 I
N-{3-[N-(3-Aminopropyl)-N/N-
dimethylamino]propyl}-
dibenzylamin - trihydro-
chlorid ;		 1220, 2975
1640
1420		 , 1160, 1120, 2.0 -
2;9 -
3.3		 4H
8H
6H		 Cm) 1.32 0. 72
1060, 1190 t 960, 920, 4.6 4H (s) • *
850, 1030 7.7 1OH * >
* *
»9 Λ
3425, 700 , 2750, 2600, (t) 9
> i
• 2000,
1400,
1120,		 2975 , 1480,
, 1180,
/ 1050,		 1450,
1160,
1020,		 1.4 2.6 6H Cm)
(S)
Cs)		 > * >
3 S
1 > J
N-{3- [N- (3-Minopropyl)-N,N-
diethylamino]propyl}-
dibenzylamin — trihydro-
chlorid .		 990, 1600
1200
1080		 , 900, 800, 1.9 -
4.7
7.7		 4H
4H
1OH		 1.64 0. 81
740, 960
3425, •680 , 2875, 2775, 2.3 (m)
2700,
1300,
1070,		 2950 , 1600,
, 1170,
, 970,		 1480,
1140,
950,		 1.2 - 2.8
3.9		 15H (m)
(m)
(m)
850, 2050
1200
990		 2.0 -
3.0· -
3.25		 4H
1OH
3H		 1.77 o.. 30
4
3
1
5
770 S
N-(3- [N- (3-Aitiinopropyl) -*N-methylamino]propyl}-(pcyanobenzyl) amin — trihydror Chlorid
N- { 3- [N- (3->\minopropy 1) -N-inethylamino ] propyl}-2-(p-chlorophenyl) ethylamine trihydrochlorid
3-{N-{N-flethyl-N-[3-bis(m,pdibenzyloxybenzyl)aminopropyl]amino}}propylamin
3425,
2675,
1840,·
1300,
1060,
900,
2975, 2250, 1700, 1220, 1030, 860,
2800,
2000,
1600,
1170,
990,
830,
2750,
1960,
1520,
1120,
970,
760
3425,
2500,
1460,
1160,
960,
720,
2975,
2000,
14Q.0,
1100,
860,
650
2800, 1600, 1310, 1070, 810,
2650, 1500, 1200, 1027, 760,
690,
850,
1130,
1265,
1510,
1760,
2800,
3075,
730, 905, 1160, 1380, 1590, 1815, 2870, 3375,
790, 1020, 1195, 1425, 1610, 1880, 2940, 3660
805, 1085, 1220, 1455, 1650, I960, 3040,
2,0 - 2.7 4H (m)
3.0 - 3.8 8H (m)
3.1 3H (s) 4.5 2H (s) 7.;7 - 8.1 4H (to)
1.86
0.38
2.1 - 2.8 4H (m) 2,9 - 3.9 12H(m)
3.2 3H (s) 7.4 - 7,8 4H (m)
1.78
0.27
1.2 - 1.9 6H (m) 2.0 - 2.9 HHW 3.43 4H (s) 5.16 8H (s) 6.6 - 7.7 26H(m)
0.78
0.24
-77-1 Anmerkung:
*1 s, t und m in Klammern bedeuten Singulett, Triplett bzw. Multiplett
*2 Relative Mobilität in der Dünnschicht-Elektrophorese, wenn die von Alanin 1,0 beträgt (Avicel SF (FMC Co.), Ameisensäure-Essigsäure-Wasser (27:75:900 Vol./Vol.), 800 V, 6 Minuten).
*3 Dünnschichtchromatografie: Silica Gel 6OF 25 4 (Merck Co.), Methanol-10 % wäßrige Ammoniumacetat1ösung-10 % wäßriges Ammoniak (1:1:1 Vol./Vol.), Ninhydrin-Farbreaktion.
IQ *4 Methanol-10 % wäßrige Ammoniumacetatlösung-TO % wäßriges Ammoniak (10:1:1 Vol. /Vol.)

Claims (1)

  1. 324B358
    10 NIPPOH KAYIiOJ KABUSHIKI KAISHA
    2-1, Marunouchi-i-chome, Chiyoda-ku Tokyo / Japan
    T 53 764-
    15 (Amido)-N-substituiertes Bleomycin und Verfahren zu dessen Herstellung
    Patentansprüche
    1.) (Amido)-N-substituiertes Bleomycin dargestellt durch die folgende allgemeine Formel oder ein Salz davon:
    CONH
    NH
    NH,
    I '
    .CH,
    CH
    CO-NH-X
    CO-R
    32ΛΒ358
    worin BM einen Rest des Bleomycin-Grundgerüsts darstellt; X (1) Alkyl mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen, (2) Aminoalkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, (3) Niedrigalkyl mit Substituenten (a) 1 bis 3 Halogenatomen, (b) 1 oder 2 Phenylgruppen, (c) einer Indolylgruppe, oder (d) einer 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Gruppe mit einem Sauerstoff-, Schwefeloder Stickstoffatom (wobei unter den Substituentengruppen die Phenyl- oder Indolylgruppe weiter durch ein Halogenatom oder eine Hiedrigalkoxygruppe substituiert sein kann),
    (4) X/j-(Niedrig)-alkyl (worin X,- die Bedeutung hatvon X2 ?2
    15 -N-X, oder -N-X
    Xo ein Wasserstoffatom, Hiedrigalkyl oder Benzyl ist, X, (a) Kiedrigalkyl (b) Phenyl(niedrig)-alkyl, oder (c) Mono- oder Di-(niedrig)-alkylamino(niedrig)-alkyl ist, das substituiert sein kann durch eine Phenyl- oder Halogenphenylgruppe,. X,. (a) Uiedrigalkyl oder
    istr*"
    (b) Phenyl(niedrig)-alkyl»; (5) Haphthyl, (6) Thiazolyl, oder (7) U-Phenyl(niedrig)-alkylpiperazinyl ist; und E einen endständigen Aminorest des Bleomycins darstellt.
    25 '
    2. (Amido)-U-substituiertes Bleomycin oder ein Salz davon nach Anspruch 1, worin X aus der allgemeinen Formel Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen oder Niedrigalkyl ist mit Substituenten (a) 1 bis 3 Halogenatomen,
    (b) 1 oder 2 Phenylgruppen, (c) einer Indolylgruppe, oder (d) einer 5~ oder 6-gliedrigen heterocyclischen Gruppe enthaltend ein Schwefel- oder Stickstoffatom (wobei unter den Substituentengruppen die Phenyl- oder Indolylgruppe weiter substituiert sein kann durch
    35 ein Halogenatom oder eine Niedrigalkoxygruppe).
    (Amido)-U-substituiertes Bleomycin oder ein Salz davon nach Anspruch 1, worin X in der allgemeinen Formel Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, Trihalogen-(niedrig)-alkyl, Aminoalkyl mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, Phenylniedrigalkyl, Halogenphenyl(niedrig)-alkyl, Diphenyl(niedrig)-alkyl, Methoxyindolyl, Pyridyl (niedrig) -alkyl, Piperazinyl(niedrig)-alkyl, X^- (Niedrig)-alkyl,fworin X,- die Bedeutung hat von
    in -N-X, oder -Ii-X-,
    Xp ein Wasserstoffatom, Niedrigalkyl oder Benzyl ist, X3. (a) Uiedrigalkyl, (b) Phenyl (niedrig)-alkyl, oder (c) Mono- oder Di-(niedrig)-alkylamino(niedrig)alkyl, das substituiert sein kann durch eine Phenyl- oder Halogenphenylgruppe ist, und X^, (a) Medrigalkyl oder (b) Phenyl(niedrig)alkyl istj, Thiazolyl oder N-Phenyl-(niedrig)-alkylpiperazinyl bedeutet.
    M-. (Amido)-K—substituiertes Bleomycin oder ein Salz davon nach Anspruch 1, worin X/.-(Medrig)-alkyl Mono- oder Di-(niedrig)-alkylamino(niedrig)-alkylamino(niedrig)· alkyl, Phenyl(niedrig)-alkylamino(niedrig)-alkyl, Di(niedrig)-alkylamino(niedrig)-alkyl, K-^1ialogenphenyl (niedrig)-alkylamino (niedrig)-alkyl7-]!i-(niedrig)-alkylamino(niedrig)-alkyl, oder N-(Niedrig)-alkyl-N-phenyl(niedrig)-alkyl-N-^H"iphenyl (niedrig)-alkylamino-(niedrig)-alkyl/r-amino (niedrig)-alkyl ist.
    5. (Amido)-N-substituiertes Bleomycin oder ein Salz davon nach Anspruch 1, worin R eine aliphatische primäre Aminogruppe mit einer basischen Gruppe ist.
    6. (Amido)-N-substituiertes Bleomycin oder ein Salz davon nach Anspruch 5s worin die aliphatische primäre Aminogruppe die I-Phenylethylaminopropylaminogruppe, Butylaminopro^ylaminogruppe oder eine Gruppe der Formel
    -IiH(CH2),-A1 -(CH2)^B1 4.worin A1 die Bedeutung hat von E10 1 R10'
    -N- oder -N *-
    (worin E^0 1 Niedrigalkyl und H^1 Niedrigalkyl oder
    Benzyl ist) und B1 die Bedeutung hat von
    /worin ILo1 Phenyl(niedrig)-alkyl ist, das an seiner Phenylgruppe eines oder mehrere von (a) Halogenatomen, (b) Cyanogruppen, oder (c) Benzyloxygruppen haben kann, oder Niedrigalkyl substituiert durch eine Cycloalkylgruppe mit 5 bis 13 Kohlenstoffatomen ist; und E,' ein Wasserstoffatom oder die Benzylgruppe ist, die durch ein oder zwei Benzyloxygruppen substituiert sein kannT^jist. s-»t*
    7· (Amido)-N-substituiertes Bleomycin oder ein Salz davon nach Anspruch 1, worin X Isopropyl, 1-Phenylethylaminopropyl, Diethylamino-1-methylbutyl, oder Dibutylaminopropyl ist und E 1-Phenylethylaminopropylamino, N- (Niedrig)-alkyl-N-(halogenbenzylaminoprop'yl)-aminopropylamino oder n-Butylaminopropylaminopropylamino ist.
    8. (Amido)-N-substituiertes Bleomycin oder ein Salz davon nach Anspruch 1, worin X Alkyl mit 3 bis 10 Koh-
    30 lenstoffatomen, Benzyl, 1-Phenylethylaminopropyl,
    Di-n-butylaminopropyl, n-Butylaminopropylaminopropyl, N-Methyl-N-benzyl-N-(dibenzylaminopropyl)-aminopropyl oder N.-Methyl-N-(halogenphenylethylaminopropyl)-aminopropylVund E N-Methyl-N-(halogenphenylethylaminopropyl)-aminopropylamino, N-Methyl-N-benzyl-N-(dibenzylaminopropyl )-aminopropylamino, N-Methyl-N-^/blsimjpdibenzyloxybenzyl)-aminopropyl7r-aminopropylamino, N,N-Dimethyl-N-(dibenzylaminopropyl)-aminopropylamino,
    ORIGINAL INSPECTED
    13 ,N-Diethyl-N-(dibenzylaminapropyl)-aminopropylamino, H-Methyl-Ιϊ- ( cycloo ctylmethylaminopropyl) - aminopropylamino oder li-Methyl-lT-(cyanobenzylaminopropyl)-aminopropylamino ist.
    9· 3-
    propylamino- ( amido )-N-/3-( (S) -1'-phenylethyl)-aminopropylT-bleomycin oder ein Salz davon.
    10. 3—{N-Methyl-li-^l-bis(m,p-dibenzyloxybenzyl)-ami] propyl]7-amino} -propylamino- ( amido ) -Έ-/£- ((S)-I' -phenyl ethyl)-aminopropyl7'-bleomyein oder ein Salz davon.
    . 3-{NiSr-Dimethyl-H-/J-(dibenzylamino)-propyil7-amino3· ■ propylamino-(amido)-]J-octylbleomycin.
    15
    12. 3-{N-I
    propyl7-aminopropyl amino- ( amido ) -U-o ctylbleomycin.
    ^5· Verfahren zur Herstellung eines (Amido)-li-substituierten Bleomycins, dargestellt durch die allgemeine Formel:
    25
    CO-R
    30
    35
    oder eines Salzes davon, worin BM ein Rest des Bleomycin-Grundgerüsts ist; X (1) Alkyl mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen, (2) Aminoalkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, (3) Niedrigalkyl mit Substituenten (a) 1 bis 3 Halogenatomen, (b) 1 oder 2 Phenyl gruppen, (c) einer Indolylgruppe oder (d) einer 5- oder
    -ο6-gliedrigen heterocyclischen Gruppe, die ein Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatom enthält (wobei unter den Substituentengruppen die Phenyl- oder Indo lylgruppe weiter substituiert sein kann durch ein Halogenatom oder eine Medrigalkoxygruppe), (4-) X--Medrigalkyl ^wbrin 3L die Bedeutung hat von
    -N-X
    oder -K-
    ist
    Xo ein Wasserstoffatom, Niedrigalkyl oder Benzyl ist, Χ., (a) Miedrigalkyl, (b)-Phenyl(niedrig)-alkyl, oder (c) Mono- oder Di(niedrig)-alkylamino(niedrig)-alkyl, das substituiert sein kann durch eine Phenyl- oder Halogenphenylgruppe, ist, X. (a) Miedrigalkyl oder (b) Phenyl(niedrig)-alkyl ist7, (5) Haphthyl, (6) Thiazolyl oder (7) N-Phenyl(niedrig)-alkylpiperazinyl, und E eine Aminogruppe entsprechend dem endständigen Aminbrest des Bleomycins darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung, dargestellt durch die allgemeine Formel
    CONH
    CH
    NH
    \
    N-
    CH
    -CO-R
    (worin BM wie vorstehend definiert ist, RQ eine Hydroxylgruppe oder einen endständigen Aminorest von Bleomycin darstellt, und X eine Hydroxylgruppe oder eine Gruppe der Formel -3ÜH-X bedeutet, worin X wie vorstehend definiert ist, vorausgesetzt, daß zumindest eines von E und XQ die Hydroxylgruppe bedeutet) oder ein reaktives Derivat der Carboxylgruppe davon,
    ORIGINAL INSPECTHD
    kondensiert mit (a) einem Amin der Formel
    HoN - X
    (worin X wie vorstehend definiert ist), wenn EQ in der vorstellenden Formel eine Hydroxylgruppe darstellt, oder mit (b) einem Amin der Formel
    H-E
    (worin..E wie vorstehend definiert ist), wenn E^
    vorstehenden Formel eine Hydroxylgruppe darstellt, und X die Bedeutung von -NH-X hat (worin X wie vor stehend definiert ist), und, falls notwendig, das Kupfer von dem resultierenden Kondensationsprodukt entfernt.
    14·. (Amido)-li-substituierte Bleomycinsäure, dargestellt durch die folgende Formel oder ein Salz davon
    20 ι
    CONH0 - NH0
    f 2 i 2
    CH0 NH CH
    XH CH„ XO-NH-X
    25 · N π COOH
    N"
    worin BM einen Eest des Bleomycin-Grundgerüsts darstellt; X die Bedeutung hat von (1) Alkyl mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen, (2) Aminoalkyl mit 1 bis Λ2 Kohlenstoffatomen, (3) Niedrigalkyl mit Substituenten (a) 1 bis 3 Halogenatomen, (b) 1 oder 2 Phenylgruppen, (c) einer Indolylgruppe oder (d) einer 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Gruppe, enthaltend ein Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatom (wobei unter den Substituentengruppen die Phenyl- oder Indolylgruppe weiter substituiert sein kann durch ein
    • O β «
    -8-
    Halogenatom oder eine Niedrigalkoxygruppe), (4) X--(Niedrig)-alkyl, /νοτχη X^ die Bedeutung hat von
    -N-X,
    oder -N-]
    X2 ein Wasserstoffatom, Niedrigalkyl oder Benzyl ist, X, (a) Niedrigalkyl, (t>) Phenyl (niedrig)-alkyl oder (c) Mono- oder Di-(niedrig)-alkylamino(niedrig)-alkyl, das substituiert sein kann durch eine Phenyl- oder Halogenphenylgruppe, ist, X^ (a) Niedrigalkyl oder (b) Phenyl(niedrig)-alkyl "bedeutet/, (5) Naphthyl, (6) Thiazolyl oder (7) N-Phenyl(niedrig)-alkylpipera-" zinyl.
    15· Desamidobleomycinsäure oder ein Salz davon, dargestellt durch die Formel
    CONH0 ,2 CH2
    CH
    NH
    NH
    CH
    COOH
    •COOH
    (worin BM einen ßest des Bleomycin-Grundgerüsts darstellt) oder ein Salz davon.
    16. Amin dargestellt durch die allgemeine lOrmel
    worin A1 die Bedeutung hat von
    -N- oder -N-
    3246358
    (worin H^ 0' und E^' Jeweils Niedrigalkyl oder Benzyl bedeuten) und B1 die Bedeutung hat von Di-^phenyl-(niedrig)-alkyl/-amino, Cyanophenyl(niedrig)-alkylamino, C,- ^^-Cycloalkyl-substituiertes (Niedrig)-alkylamino oder Dibenzyloxyphenyl(niedrig)-alkylamino.
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