CS236868B2 - Processing of(amide)n-substituted bleomycine - Google Patents

Description

bleomycinový komplex) široce používaný v oblasti terapie rakoviny. Podrobněji — bleomyciny jsou s úspěchem · používány při léčení především sguamosního buněčného· . karcinomu, dále pak rakoviny kůže, · hlavy a krku, rakoviny · plic a maligního lymphomu. Různé bleomyciny jsou popsány také v USA patentu 3 922 262 · a · v obnoveném oatentu 30· 451.

Bleomyciny, které obsahují atom mědi, se obvykle vyrábějí fermentací. Bleomyciny, které neobsahují atom mědi, se vyrábějí odstraněním atomu mědi z bleomycinů, které atom mědi obsahují. Termín „bleomycin“ jak je zde používán, znamená obě formy, jak s atomem mědi, tak i bez atomu mědi, aniž by to bylo specifikováno.

Bleomyciny jsou sloučeniny obecného vzorce II

НО чХ ¹

Ο^^ΝΗ- I (Ц)

I kde - R znamená koncový aminový zbytek bleomycinu. Jestliže obecný vzorec II má znamenat formu, která Obsahuje atom mědi, pak komplexně vázaný atom mědi je v obecném vzorci II vynechán.

Bylo však zjištěno, že bleomyciny jsou inaktivovány působením bleomycin-inaktivujícího enzymu [dále zde bude stručně označován jako inaktivující enzym; Umezawa- a spol.: Journal of Antibiotics 27, 419 (1974)].

Dále bylo zjištěno, že bleomyciny jsou relativně méně inaktivovány v kůži a v plicích, kde vykazují vysokou účinnost. Naproti tomu v žaludku se snadno inaktivují. V žaludku nevykazují žádnou účinnost. Tato· inaktivace je u myší méně výrazná u squamosního buněčného karcinomu než u sarkomu; -oba případy byly vyvolány· 20-methylcholanthrenem [Umezawa a spol.: Journal of Antibiotics 25, 409- (1972), 27, 419 (1974)]. Dále bylo nalezeno, že squamosní buněčný karcinom na hlavě a na krku u člověka vykazuje bleomycin-inhibující účinek, zvláště typy s malou diferenciací. Tyto typy byly považovány za typy, na něž bleomyciny nejsou - tak účinné [Mueller a spol.: Cancer 40, 2787 (1977)].

Jak lze snadno ze shora uvedeného výčtu vidět, bleomyciny nejsou schopné vykazovat dostatečnou účinnost na ty karcinomy, které obsahují bleomycin-inhibující enzym o vysoké účinnosti. To je jeden z důvodů, který ukazuje na potřebu dalšího zlepšování bleomycinů. Autoři tohoto vynálezu uvažovali následujícím způsobem: kdyby bylo možné objevit také bleomycinové deriváty, které by byly těžko přístupné enzymatické inaktivaci, pak by bylo možné efektivněji léčit například rakovinu krku - - a hlavy, rakovinu jícnu, rakovinu plic a squamosní buněčné karcinomy i jinde a dále ty -adenokarcinomy, jako například rakovinu žaludku, které neodpovídají na léčení konvenčními bleomyciny.

Z tohoto- hlediska podnikli autoři tohoto vynálezu rozsáhlou studii. Výsledkem- studie je zjištění, že bleomyciny jsou méně inaktivovány tehdy, kdy na atom dusíku v amidové -skupině 2,3-diaminopropanamidového seskupení (—NH—СНэ—CH—CONHž)

I

NH2 bleomycinu je zaveden substituent (—X). Toto zjištění je základem· vynálezu. Primárním- předmětem- tohoto vynálezu je nalezení nových bleomycinů, které jsou těžko inaktivovatelné inaktivujícími enzymy a nalezení způsobu výroby takových nových bleomycinů.

Další výhody tohoto vynálezu jsou zřejmé z následujícího popisu.

Podle tohoto vynálezu byly nalezeny (amido)N’Substituované bleomyciny nebo- jejich soli, meziprodukty pro jejich výrobu a způsob jejich výroby. Shora uvedené (amido)N-substituované bleomyciny jsou sloučeniny obecného vzorce I

kde

BM znamená zbytek bleomycinového skeletu,

X znamená 1. alkylovou skupinu s 1 až 18 atomy uhlíku, 2. aminoalkylovou skupinu s 1 až 12 atomy uhlíku, 3. alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, která je substituována 1 až 3 atomy halogenu, b) jednou nebo dvěma fenylovými skupinami, které mohou být substituovány atomem halogenu, cj indolylovou skupinou, která může být substituována ' alkoxyskupinou · s 1 až 4 atomy uhlíku, d) furylovou skupinou, pyridylovou skupinou, thiazolylovou skupinou nebo piperidylovou skupinou, 4. Xi— [Ci_₆] alkylovou skupinu, kde Xi znamená skupinu

X2

I —N--X3 nebo

X2 —N-Xs I

X4 kde Xz znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy · uhlíku nebo benzylovou skupinu, X3 znamená a) alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, b) fenylalkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku · nebo

c) mono- nebo d--(Ci_₆)alkylamino(Ci..₆)alkylovou skupinu, která může být - substituována fenylovou nebo halogenfenylovou skupinou, X4 znamená a) (Ci_6)alkylovou skupinu nebo bj fenyl(Ci_6)alkylovou skupinu,

5. naftylovou nebo 6. N-fenyl(Ci_₆)-alkylpiperidylovou skupinu a

R znamená 1-fenylethylaininopropylarninovou, butylaminopropylaminovou skupinu nebo skupinu obecného- vzorce

Z —NH— (CH2)3-A—(CH2 js\

Z kde A znamená skupinu obecného vzorce \

Z

Rio —N—

Z

Rio l\ —N + — IZ Ril \

kde

Z

Rio znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 \ atomy uhlíku,

Z

Rit znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 \ atomy uhlíku nebo· benzylovou skupinu a

Z

B znamená skupinu obecného· vzorce \

Z

R13 \

z —N—Ru \

kde

Z

R12 znamená fenylalkylovou skupinu s 1 Z až ·6 atomy uhlíku v alkylu, která může být na fenylové skupině substituována jedním nebo· více a) atomy halogenu, bj kyanoskupinami nebo cj benzyloxyskupinami, nebo znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, která je substituována cykloalkylovou skupinou s 5 až 13 atomy· uhlíku, a

Z

R13 znamená atom vodíku nebo benzylovou Z skupinu, která může být substituována 1 nebo 2 benzyl-oxyskupmami.

Část bleomycinového skeletu BM je ta část molekuly bleomycinu, která je v obecném vzorci II bleomycinů ohraničena · čárkovaně. Tato část zahrnuje jak formu, která obsahuje atom mědi, tak i formu, která jej neobsahuje, pokud není uvedeno jinak. Alkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku znamenají například methylovou, ethylovou, propylovou, isopropylovou, butylovou, isobutylovou, pentylovou, 3-methyl-butylovou, 3-meth-l-penlylovou a hexylcvou skupinu.

Příklady jednotlivých skupin X v obecném vzorci bleomycinů jsou následující skupiny:

nebo

1. alkylové skupiny s 1 až 13 atomy uhlíku: methylová, ethylová, propylová, isopropylová,.

butylová, isobutylová, terc.butylová, pentylová,

3-methblbutolová, neopentylová, heptylová,

З-шеШу^еп^^ё, hexylová,

1,5-dimethylhexyl.ová, isohexylová, oktylová, decylová, laurylová, muгistylovά, cetylová a stearylová skupina,

2. aminoalkylové skupiny s 1 až 12 atomy uhlíku:

2- aminoethylová,

3- aminoуroуylovά,

4- aminobutylová, 6-aminohexylová, 12-aminodeculovά a 4mmino'-4mmthyl·l-di'methulуentutolá skupina,

3. alkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhllku, které jsou substituovány a) 1 až 3 atomy halogenu, b) 1 až 2 fenylovými skupinami, c) ind□lulovou skupinou nebo· d) furylovou, pyridylovOu, thiazolulovou nebo уiуeridulolou skupinou [z těchto substituentů může být fenylová skupina substituována atomem. halogenu a indolylolá skupina alkoxyskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku):

2.2.2- trinuorethylová,

2₁2.2- trichloгethy]L·ová,

2.2- difluorethelová,

2.2- dichlorethylová, benzylová, difenulmeteytová,

2- fenylethytová,

2.2- difenylethylová,

1- fenulethutolá,

1.2- difenytethulová,

3- fenylprуpyl·O'Vá,

2- fenulisoproуyl·olá,

1.3- difenulpropylová,

3.3- difenylуroуylová,

4- fenylbutyloivá,

4.4- difenylbutylová, chlorbenzylová, dichlorbenzulová, brombenzylová, methoxybenzylová, dimethoxybenzylová, ethoxybenzylová, methytendioxybenzylová, уropoxybenzytová, у-chtoгfenulethulolá, у-meth·oxyfenulethulová, p-benzyloxybenzylová, furylmethytolá, 2-fuгylethulo^,vá, 2-thiazolutmeteulová,

2- уyridylmethutΩlá,

3- puгidylmethylová, 4’pyrídyl'methylová,

3- mdolulmethu^olá, 2- (3-ind o 1 yl) ethylová,

4- meteoxy-34ndolylInethutov4,

2- piуeridylmethulol4,

3- уiу^гidulmethulol4,

4- .уiperidytmethyl·olά, 2- (2-y iy oř i d у 1) ethylová,

2- ( 3-y iy ericiy j ethylová,

2- (4-y íp (^ridyl jethylová,

1- ^-ρϊρθΓΐίίΙγΙ) ethylová, ,l-( 3-pýy eridyl j ethylová,

1- (4--^ i^^ ť^ridyl jethulov4 skupina.

Xi—(Ci—CeJ-alkylové skupiny, kde Xi znamená skupinu obecného vzorce

X3 — N—X2 nebo

X.2 —N—X3 :

I

Xi dimethulaminoethylol4, dieteulammoethulol4, dipropylaminoeteulol4, уroуulaminoethulol4, dimethylaminoуrΌуulov4, diethulaminoугoуylol4, dipropylaIшnoуropyl11v4, угoуulaminoугopylol4, dibutylaminoyгoyy1oιv4, butulamm.oprc)уulol4, benzylaminopropylová,

2- fenuleteylaminoуropulov4, 1-fe e^^^^l^thylaminopropylová,

3- fenulуroуytaminoугopylovά,

4- fenulbutylammoproуulová, methylamшoethylaminoуropulová, ethylaminoугoуytammoуroуulová, уro.pulaminoproуulaminoуropylol4, butylaminoproуutamlnoуropylová,

N- (butylaminoуг opyl) iN-methulammOi propylová, dibutulaminoуroуylaminoproуulová, уentulaminoуroуulaml·noуroуulolá, ethylaminobutylaminoуropul0lá, уroуylaminobutulaminoуroуulová, ethylaminoуroуylammobutylolá, bututaminoуroуylaminobutylolá, benzulammoeteulaminoethulΌl4, benzulaminoethutaminoproуutov4, benzylaminoугoуylaminoyroyy1oιvá, benzylammobutytaminopropylová,

236368 fenylethylaminopropylaminopropylová, N-(fenylethylaminopropyl]-N-methyl· aminopropylová,

N-(chlorbenzylaminopřopyl)-N-methylpropylová,

N-(brombenzylaminopropyl]-N-methylpropylová,

N-( chlorf enylethylami-nopropyl )-N-methylpropylová, benzylaminopropyl-N,N-dimethylaminopropylová, dibenzylaminopropyl-N,N-diethylaminopropylová a dibenzylaminopropyl-N-methyl-N-benzylaminopropylová skupina.

5. Naftylové skupiny:

α-naftylová a β-naftylová skupina.

6. N-fenyl(Ci_₆)alkylpiperidylové skupiny:

N-benzyl-4-piperidylová,

N-fenylethyI-4-piperidylová,

N-benzyl-3-piperidylová a

N-benzyl-2-piperidylová skupina.

Zbytek R znamená 1-fenylethylaminopropylaminovou skupinu nebo butylaminopr-opylaminovou skupinu, nebo· skupinu obecného vzorce z z — NH-- (СНз)з— А—(СНз)з— в \ \ v němž /

A znamená skupinu obecného vzorce \

z

Rin !\ — N— nebo

Z

Rio l\ — N ⁺ — IZ

Rii \

kde

Z

Rio znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 \

atomy uhlíku a z

Rn znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 \

atomy uhlíku nebo benzylovou skupinu, a

Z

В znamená skupinu obecného vzorce \

Z R13 \

Z —N—R12 \

kde

Z

R,'2 znamená fenylalkylovou skupinu s 1 \ až 6 atomy uhlíku v alkylu, která může být na své fenylové skupině substituována jedním nebo více a) atomy haloganu, b) kyanoskupinami nebo c) benzyloxyskupinami, nebo znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku substituovanou cykloalkylovou skupinou s 5 až 13 atomy uhlíku, a z

R13 znamená atom vodíku nebo benzylo\ vou skupinu, která může být substituována jednou nebo dvěma benzyloxyskupinami.

Tyto sloučeniny jsou žádoucí pro svoji relativně nízkou pulmonální (plicní) toxicitu. Ve shora uvedených vzorcích mezi alkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku patří methylová, ethylová a butylová skupina. Mezi fenylalkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylu patří benzylová, 2-fenylethylová, 1-fenylethylová, 3-fenylpropylová, 2,2-difenylethylová a dibenzylmethylová skupina. Mezi femylalkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, které mohou být substituovány, patří například 2-p-chlorfenylethylová, p-chlorbenzylová, o-chlorbenzylová, m-chlorbenzylová, l-(p-chlorfenyl) ethylová, op-dichlorbenzylová, m,p-dichlorbenzylová, p-brombenzylová, p-fluorbenzylová, pentylfluorbenzylová, m-trifluormethylbenzylová, p-kyanobenzylová, m,p-dibenzyloxybenzylová skupina. Mezi alkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku substituované cykloalkylovou skupinou s 5 až 13 atomy uhlíku patří cyklopentylmethylová, cyklohexylmethylcvá, cykl-oheptylmethylová, cyklooktylmethylová, cykloundekanylmethylová a 2-cykl-ohexylethylová skupina.

Kombinace skupin X a R, které mají zvláště nízkou pulmonární toxicitu, jsou následující:

(Amído)N-substituované bleomyciny, v nichž

X znamená isopropylovou, (S)-l-fenylethylovou, diethylamino-l-methylbutylovou, dibutylaminopropylovou nebo butylaminopropylaminopropylaminovou skupinu a

R znamená

1-fenylethylaminovou nebo

N-alkyl s 1 až 6 atomy uhlíku-N-(halogenbenzylaminopr opyl) aminopropylaminovou skupinu, jejich soli, (amido )-N-substituované bleomyciny, v nichž X znamená alkylovou skupinu se 3 až 8 atomy uhlíku,

l.S-dimethylhexylovou, benzylovou,

1-fenylethylaminopropelovoo, dibutylaml·nopropelovou, butelaminopropylamlnoρroρylovou, N-methy 1-N-benzyl-N- (dibenzylaminopropyl Jaminopropylovou nebo

N-methyl-N- (halogenf enelethelaminopropeljaminopropelovool skupinu, a R znamená

N-methyl-N- (halogenf enelethelaminopropyy) aminopropylaminovou,

N-methy l-N-benzyl-M- (dibenzylaminopropy^ aminopropylaminovou,

N-methyl-N-[bis· (m,p-dibenzyloxybenzyl )a-minopropyl] aminopropylaminovou,

N-methyl-N-methyl-N-(dibenzylamino· propyl Jaminopropylaminovou,

N-ethyl-N-ethyl-N- (dibenzelaminopr opyl j aminopropelaminovoo,

N-methyl-N- (cyklooktylmethylaminopropeljaminopropylammovou nebo

N-methyl-N- (kyanobenzylaminopropyl)aminopropelaminovou skupinu, a jejich soli.

Jako příklady sloučenin podle tohoto vynálezu lze uvést sloučeniny· uvedené v -tabulce 1. V tabulce 1 ,,BLM“ v názvu sloučeniny znamená „bleomycin“ a sloučenina obecného vzorce I je označena jako „název R (aminový zbyteknamidojN-Jnázev X]-BLM“.

TABULKA 1

Slouče- Název sloučeniny nina č.

2- (4‘-imidazolyl) ethylamino- (amido) N- [ m-ethyl ] -BLM

2- (4‘-imidazo lyl) ethy lamino- (amido) N- [ ethyl ] -BLM

2- (4‘-imidazolyl ) ethylamino- (amido) N- [ isopropyl ] -BLM

2- (4‘-imidazoly 1) ethylamino- (amido) N-[ benzyl ] -BLM

2- (4‘-imidazolyl ) ethylen^no»· (amido ) N-[ - 3- ((S)-T-f enyle thyl) - aminopr opyl ] -BLM

2- (4‘-imidazoly 1) ethylamin^o- (amido j N- [ 2-aminoethyl ] -BLM

7- 4-guanidinobutylamino- (amido) N- [ isopropyl ] -BLM

4-guanidinobutylamino- (amido) N-[ T,6‘-dimethylheptel ] -BLM

4-guanidinobutylamino-(amido) N-[2‘,2‘,2‘-trifluorethel]·BLM

10i 4-guanidinobutylamino- (amido) N -[ oktyl ]-BLM

4-guanidinobutylamino -(amido) № [·3-((S)-l·-fenylethyl- jamrno- propylj-BLM

121 4-guanidinobueylam.ino- (amido J N - [ 3 - (dlbutylamino }pr opy 1 ] -BLM

4guanidinobutelaminO’- (amido) -N- [ lauryl j -BLM

4-guanidinobutylamino- (amido) N- [ benzyl ] -BLM

15- 4-guanidinobutylamino- (amido) N- [ dif enylmethyl ] -BLM

16- 4--^ua^idinobuty'lami^o- (amido-) N- [ l‘,2‘-dif enylethyl j -BLM

17- 4-guanidinobutylamino- [ amido )N-(j^JIlaffye J-BLM

4-guanidinobutylamino-(amido )N-[2-furylmethyl]-BLM

4-guanidinobutylamino<- (amido·) N- [ 3-p yridylmethyl ] -BLM

4-guanidinobutylamino-( amido )N-[·thiazolelmethyl]·BLM

3- ((S)-l‘-f enylethy!) aminopr opylamino- (amido) N- (isopropyy) -

BLM

3- ((S))l‘-f enylethyy) aminopr opylamino- (amido )N-[ 3- ((S)-

-l‘-f eny leehy i ) amínopropyl ] -BLM •2'3 3- ((S)-r-f enylethyl - aminoρropylamino- (amido )N- [ benzyl) -BLM

3- ((S)-l‘-fenylethyl) aminopropylamino- (amido) N- [ -p-chlor- benzyI]-BLM

3- ((S)-l‘-f enylethy lamino) propylaminoij amido·) N- [ stear yl ] -

-BLM

3- ((S)-l‘-f enylethylamino) propylamino- (amido) N- [ lauryl ] -

-BLM

3- ((S)-l‘-f enylethylamino) propylamino- (amido) N- [ oktyl ] -

-BLM ' ' ’

Zkratka dh-MMA dH-MEA dH-IPA dH-BA dH-PEP dH-EDA dB2-IPA dB2-DHA dB2-TFEA dB2-OCT dB2-PEP dB2-BPA dB2-LAA dB2-BA dB2-ADPM dB2-DPE

ÚB2-NA dB2-FFA dB2-AMⁱPY dB2-ATZ dPEP-IPA dPEP-PEP dPEP-BA dPEP-CBA dPEP-STE dPEP-LAA dPEP-OCT

236888

Název sloučeniny

Zkratka

Sloučenina č.

'28

3- ((S)-l‘-f enylethylamino Jpropylamino- [ amido) N-[ 5-methoxyindol-3-ylethyl] BLM

3- ((S)-l‘-fenyIethylamino ] propylamino- (amido) N- [ 12-aminododekanyl]-BLM

3- ((S)-l‘-f enylethylamino ] propylamino- (amido) N-[ l‘,2‘-difenylethyl]-BLM

3-((S)-l‘-fenylethylamino) propylamino-(amido ]N-[difenyl- m ethyl]-BLM

3- ((S)-l‘-f enylethylamino )propylamino-( amido) N-[1,6-ďimethy lhepty 1 ] -BLM

3-((S)-l‘-fenylethylamino) propylamino-(amido )N-[ 2-(1-piperazinyl) ethyl ] -BLM

3-[(S)-l‘-f enylethylamino) propylamino-(amido )N-[ 3-dibutylamino) propyl) -BLM

3-((S)-l‘-fenylethylamino) propylamino-(amido )N-[N-benzylpiperidin-4-yl J-BLM

3-{(S)-l‘-fenylethylamino)propylamino-( amido )N-[4-diethylamino-l-methylbutyl) -BLM

3- [ N-methyl-N- (3-butylaminopropyl) amino ] propylamino-

- (amido) N-( isopropyl ] -BLM

3-[ N-methyl-N-( 3-butylaminopropyl) amino ] propylamimo-

- (amido) N-f3- [ N-methyl-N- (3-butylaminopropyl) amino ] propyl(-BLM

3-{N-methyl-N-[3-(p-chIorbenzyl)aminopropyl]amino]-propylamino-(amido )N-[3-((S)-l‘-fenylethyl) amino Jpropyl]· -BLM

3-{N-methyl-N-[ 3-(p-chlorbenzyl )aminopropyl]amino]propylamino-(amido)N-[ oktyl J-BLM

3-{N-methyl-N-[ 3-(p-chlorbenzyl )aminopropyl]amino!propylamino-(amido )N-[ 1.2-difenylethyl ]-BLM

3-jN-methyl-N-[ 3-(p-chlorbenzyl) aminopropyl Jamino}propylamino- (amido) N- [ 1,5-dimethylhexyl ] -BLM

3-{N-methyl-N- [ 3- (2-(p-chlorf eny l)ethyl) aminopr opyl ] amino}propylamino-( amido )N-[3-((S)-l*-f enylethyl laminopropyl ]-BLM

3-íN-methyl-N-[3-(2-(p-chlorfenyl)ethyl)aminopropyl]amlnolpropylamino- (amido) N- [ oktyl ] -BLM

3-!N-methyl-N-[ 3- (2-(p-chlorf enyl)ethyl Jaminopropyl ] amino)propylamino-( amido )N-|3-[ N-methyl-N- (3-(2-/p-chlorf enyl/ethyl)aminopropyl)amino]propyl]-BLM

3-]N-methy l-N-[3-( 2-(p-chlorfenyl)ethyl laminopropyl Jamino]propylamino- (amido) N-[ 3-dibutylamino Jpropyl ] -BLM 3-]N-methyl-N-benzyl-N-[ 3-( dibenzylamino Jpropyl Jamino]pr opylamino- (amido) N- [ 3- ((S)-l‘-f enylethyl) aminopr opyl ] -BLM

3-|N-methyl-N-benzyl-N- [ 3- (dibenzylamino Jpropyl ] amino}propy lamino- (amido) N-[ oktyl ] -BLM

3-'N-methyl-N-benzyl-N-[3-(dibenzylammo]propyl]aminoSpropylamino- (amido )N-{3-[ N-methyl-N-benzyl-N- (3-(dibenzylamino)pr opyl) amino ] propy ll-BLM

3-|N-methyl-N-benzyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino|propylamino-(amido) N-{3-[ N-methyl-N- (3-butylaminopropyl) ]aminopropyl|-BLM

3-|N-methyl-N-benzyl-N- [ 3-( dibenzylamino) propyl ] amino}pr opylamino- (amido) N- [ benzy I ] -BLM

3-|N,N-dimethyl-N-[ 3- (dibenzylaminojpropyl ] amino|propylamino- (amido) N [ 3- ((S)-l‘-fenyl) aminopropyl ] -BLM

3-|N,N-dimethy l-N-[ 3- (dibenzylamino) propyl ] aminojpropylamino- (amido) N- [ oktyl ] -BLM

3-!N,N-dimethyl-N-[ 3- (dibenzylamino Jpropyl ] aminojpropylamino-(amido )N-[3-(dibutylamino jpropyl]-BLM

3-|N,N-diethyl-N-[3-( dibenzylamino Jpropyl ]amino]propylamino- (amido j N- [ 3- ((S)-l‘-f enylethyl) aminopropyl ] -BLM dPEP-MTA dPEP-DAD dPEP-DPE dPEP-ADPM dPEP-DHA dPEP-APZ dPEP-BPA dPEP-ABP dPEP-ADP dBAPP-IPA dBAPP-BAPP dMCLBZ-PEP dMCLBZ-OKT dMGLBZ-DPE dMCLBZ-DHA dMCLPE-PEP dMCLPE-OCT dMCLPE MCLPE dMCLPE-BPA dMTBZ-PEP dMTBZ-OCT dMTBZ-MTBZ dMTBZ-BAPP dMTBZ-BA dMMDBZ-PEP dMMDBZ-PEP dMMDBZ-OCT dMMDBZ-BPA dEEDBZ-PEP

2368G3

Slouče- Název sloučeniny nina č.

5B 3-{N,N-diethyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino|propy-amino- (amido) N- [ oktyl ] -BLM

3-{N,N-dlethyl-N- [3- (dibenzylamíno). propyl jaminojpropyl- amino- (amido) N- [ 3- (dibuty lamino) propyl) -BLM

3 [ [N-methyl-N- [ 3- (cyklooktylmethylamino) propyl ] amino)- propylamino-(amido) N- [ 3- (dibutylamino) propyl ] -BLM

3-[N-methyl-N- [ 3- (cyklooktylmethylamino) propyl ] amino}- pr opylamino- (amido) N- [ oktyl ] -BLM

3^-p^--^4et h^y’ 1-N- [ 3- (cyklooktylmethy 1) aininopropyl ] amrnoj- pϊ9pylaminol(amido )N-[ 3-((S)-r-fenylethylamino) propyl ]-BLM

3-^í ₍N~methyl-N- [ 3- (p-kyanobenzylamino) propy 1 ] aminojpropylamino- (amido) N- [ 3- (dibutylamino (propyl ] -BLM

3-[N-methyl-N-[ 3-(p-kyanobenzylamino) propyl ]amino|- pr opylamino-(amido )N-[ oktyl--BLM

3-{N-methyl-N- [ 3- (p-kyanobenzylamino) propyl ] amino|pr opyl- amino-(amido )N-[ 3-((S)-l‘-fenylethylamino) pro.pyl-~BLM

3-fN-rnethyl-N- [ 3-bis (m,p-dibenzyloxybenzyl) aminopropyl ] - aminojpr opylamino- (amido) N- [ 3- ((S)-l‘-f enylethyl) aminopropyipBLM

3-{N-meth.yI-N- [ 3-bis (m.p-dibenzyloxybenzyl) aminopropyl ] - aminojpropylamino- (amido) N- [ oktyl ] -BLM

Zkrátka dEEDBZ-OCT dEEDBZ-BPA dMCO-BPA dMCO-OCT dMCO-PEP dMCNBZ-BPA dMCNBZOCT dMCNBZ-PEP dMDDBZOBZ-PEP dMDDBZOBZ-OCT

Uvedené sloučeniny obecného vzorce I se vyrábějí dále popsaným způsobem.

Sloučenina následujícího obecného vzorce VI nebo reaktivní derivát její karboxylové skupiny se nechá zkondenzovat s aminem (popsaným později):

C0NH_{2 n}h₂ \^^NH\^C0-X_o

(VI) v němž

BM má dříve uvedený význam,

R_o znamená 1-fenylethylaminopropylaminovou, butylaminopropylaminovou skupinu nebo skupinu obecného vzorce

Z /

-^NH- ( CHž) 3-A- (CH2) 5-B \ \ kde /

A znamená skupinu obecného vzorce \

Z Rio l\ nebo

Z

Rro l\ —N⁺ —

I Z

Ru.

\ kde

Z

Rio znamená alkyl s 1 až 6 atomy uhlíku a \

Z

Rn znamená alkyl s 1 až 6 atomy· uhlíku \ nebo benzylovou skupinu a

Z

B znamená skupinu obecného vzorce \

Z Rl3 \

Z —N—R12 \

kde

Z

R12 znamená fenylalkylovou skupinu s 1 \ až 6 atomy uhlíku v alkylu, která může být —N—

36 86 8 na -fenylové skupině substituována jedním nebo více atomy halogenu, kyanoskupinami nebo benzyloxyskupinami, nebo znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku substituovanou cykloalkylovou skupinou s 5 až 13- atomy uhlíku a /

R13 znamená atom vodíku nebo- benzylo\ vou - skupinu, která - může být substituována jednou nebo - dvěma benzyloxyskupinami, a

X_o znamená hydroxylovou skupinu nebo reaktivní - derivát karboxylové skupiny, nechá kondenzovat s aminem obecného vzorce

HžN—X kde X má výše uvedený význam, a je-li to žádoucí, odstraní se z kondenzačního produktu měď -a je-li to žádoucí, převedou se získané sloučeniny na své farmaceuticky přijatelné soli.

Kondenzace sloučeniny s aminem se - provádí známým postupem používaným pro tvorbu peptidové- vazby, zvláště takovým postupem, - - který je používán v chemii peptidů. - Sloučenina se - nechá zreagovat s aminem za přítomnosti- aktivačních činidel karboxylové skupiny,- která jsou používána v chemii - peptidů. Sloučenina -obecného vzorce I se získá reakcí aminu obecného vzorce VII - nebo- VIII s reaktivním derivátem karboxylové skupiny sloučeniny obecného vzorce VI. -Deriváty jsou například derivát získaný reakcí aktivačního -činidla karboxylové skupiny a - - sloučeniny - obecného vzorce VI nebo 3-amiiio-.proxj у testeru karboxylové skupiny sloučeniny -obecného vzorce VI. Jako příklady -aktivačních činidel mohou být uvedeny: 6-chlor-l-p-chlorbenzensuffonyl-oxybenzotriazol, N'’ethyl5-fenylisooxazolium-3‘-sufolnát, N-terc.butyh5-me'thyl-isooxazolium-chloristan, N-ethoxykarbonyl-2-ethoxy-l,2-dihydrochinolin (FEDQ), di-p-mirofenylsulfit, trl-p-nitrofenyl-fosfit, p--n^1^]ro:fe^ny:^1^jrichloracetát, dicyklohexylkarbodiimid (DCC), l-ethyW-^-dimethylaminopr opyl) kar bodiimid, 1-cyklohexyl-3- ( 2-m-orf olinoethyl j karb.odiimid, difenylkarbodiimid, di-p-tolylkarbodiimid, diisopropylkarbodiimid, difenylfosforazidát (DPPA) a diethylfosforkyanidát (DEPC).

Jako příklady reaktivních derivátů karboxylové skupiny sloučenin obecného vzorce VI lze uvést reaktivní deriváty, které se získají reakcí shora uvedených aktivačních činidel s karboxylovou skupinou, reaktivní deriváty karboxylové skupiny, které se získají společným použitím aktivačních a kondenzačních činidel a kondenzačních aditiv (přísad), jako je například p-nitrofenol, -o,p-dinitrofenol, pe-ntachiorfenol, 2_í4,5-trichl·orfet nol, pentafluorfenol, - N-hydroxysukcinimid, 1-hydroxybenzotriazol, N-hydroxyt5-n0·r·boЦt aen^-2,3“(^i^]^iarboximid, - 3-aminopropylester karboxylové skupiny - obecného vzorce IV a monosubstituované 3-aminopropyles'tery, jako je - například 3-acetylaminopropylester, 3-sukcmylammopropylester, 3-benzoylammopropylester, - 3-benzylá.mínopropykster, 3-p-toluensulf onylaminopropylester, 3 - (2,4-dh nitrofeoyljaminopropylesteu, 3-(3,5-dimethyl-3-oxocyklohexen-l-yl) aminopropylester, 3-(terc.butoxy-karbonyl) aniinopro)pylester -a 3-(salicyliden)iminopropylester.

Kondenzace se obvykle provádí v rozpouštědle. Rozpouštědlem - může být jakékoliv rozpouštědlo, které neovlivňuje -reakci. S výhodou se používá polární rozpouštědlo, které rozpouští sloučeninu obecného vzorce VI, která še používá jako výchozí materiál. Příklady takových rozpouštědel - jsou voda, diméthylformamid, dimethylacetamid, acetonitrn a jejich směsi. Molární -poměr aminu obecného vzorce VII nebo- VIII ke sloučeninám- obecného vzorce VI je -obvykle asi 0,5 až 20, -s výhodou 1 až 10. - Ačkoliv reakční teplota závisí na typu rozpouštědla a rna dalších podmínkách, obvykle se pohybuje mezi — 15 až 45 c-G, s výhodou —10 -až 30 °C. Reakční doba je 1 až 70- hodin. Způsob podle tohoto vynálezu je níže popsán podrobněji.

•Sloučenina obecného- vzorce VI, která - obsahuje atom mědi, a — jestliže je to· nutné — shora uvedená přísada se rozpustí ve vodě, dimethylformamidu, - acetonitrilu nebo v jejich - směsi. Za míchání při teplotě —5 až 15 °C se k roztoku přidá shora uvedené aktivační činidlo. Jestliže je to nutné, pH směsise upraví na - pH vhodné pro aktivaci anorganickou kyselinou nebo bází, jako- je například kyselina chlorovodíková nebo hydroxid - sodný, - nebo organickou bází, jako je například · tuiethyiamio nebo- N-methyl-morfolin. Ke směsi se pak přidá aminová složka jako taková nebo v roztoku s upraveným pH. Výsledná směs še - míchá. Jestliže je to nutné, pak se pH -upraví podobným způsobem jako shora - uvedeno. V míchání se pokračuje 1 -až 70 hodin. Vyrobí se žádaná sloučenina podle tohoto vynálezu.

Takto - vzniklý derivát se isoluje následujícím způsobem. K reakční směsi se přidá organické rozpouštědlo, - jako např. aceton nebo ether. Žádaný produkt se tím vysráží. Sraženina se rozpustí v destilované vodě, pH se upraví na 6 a roztok se odsolí projitím kolonou adsoupt1voí pryskyřice, jako- je například AmberlifR XAD-2 (Rohm and H-aas Co.) v destilované vodě. Žádaný produkt se adsorbuje na pryskyřici. Kolona so promývá destilovanou vodou, aby se ord^-tranila sůl. Pak se eluuje okyseleným vodným methanolem, jako je například směs 0,02 N kyseliny chlorovodíkové a methanolu (1:4 objemovým dílům). Frakce, které mají absorpční - maximum kolem vlnové délky 290 nm, se spojí. Spojené - frakce se zneutralizují Dowexem(R) 44 - (anex OH-typu firmy Dow Chemicál Co.), zahustí za sníženého tlaku a lyofilizují. Získá se surový prášek ďerivá236868 tu. V některých případech se -odsolovací stupeň může vynechat. Roztok sraženiny v destilované vodě se pak přímo podrobí druhému stupni zpracování.

V druhém stupni se roztok surového prášku v destilované vodě nechá projít kolonou naplněnou CM-Sephadexem^R C-25 (Na+-typ, Pharmacia Fine Chemicals Co.), která se ekvilibruje pufrovacím roztokem· 0,05 M kyseliny octové a octainu sodného (pH 4,5). Žádaný produkt se adsorbuje. Adsorbovaná fáze se pak eluuje technikou lineárního koncentračního gradientu. Tato- technika spočívá v tom, že se ke shora uvedenému pufrovacímu roztoku . kontinuálně přidává chlorid sodný až se koncentrace chloridu sodného postupně zvýší na 1,0 M. Nezr-eagované reakční složky a vedlejší produkty se eluují dříve než žádaný produkt. Lze je proto oddělit pomocí detekce na ultrafialovém, absorpčním monitoru. Jestliže frakce žádaného· produktu jsou i nadále znečištěny, chromatografie se zopakuje, aby se všechny nečistoty odstranily.

Místo shora uvedené chromatografie lze použít jiný způsob chromatografického čištění za využití například adsorptivní pryskyřice Amberlitu(R) XAD-2. Vodný roztok surového produktu se nechá projít kolonou pryskyřice v pufru, jako je například 1% vodný roztok octanu amonného. Žádaný produkt se adsorbuje. Adsorbovaná fáze se eluuje technikou lineárního koncentračního gradientu, a to tak, že se methanol kontinuálně přidává k pufru, takže koncentrace methanolu se postupně zvyšuje. . Protože nezreagované složky se z kolony eluují dříve a hlavní vedlejší produkty později, lze je oddělit za použití ultrafialového monitoru. Jestliže jsou žádané frakce- znečištěny, nečistoty lze úplně odstranit opakováním chromatografie.

Oba shora uvedené typy chromatografie se provádí každý sám nebo· postupně jeden po druhém. Vyčištěná frakce, která obsahuje žádaný produkt, se odsolí na adsorptivní pryskyřici, jako je například AmberlifR) XAD-2, a pak se lyofilizuje. Získá se modrý amorfní prášek (amido)N-substituovaného bleomycinu, který - obsahuje atom mědi. Sloučenina, která neobsahuje atom- mědi, se získává ze sloučeniny, která obsahuje atom- mědi, známým způsobem, jako je například způsob používající EDTA popsaný v japonské patenové publikaci č. 31 875/77. Příklad postupu, kterým se odstraňuje měď, je popsán níže.

Produkt, který obsahuje měď, se rozpustí v destilované vodě. Výsledný roztok se nechá projít kolonou Amberlitu(R) XAD-2 vydestilované vodě. Produkt, který -obsahuje měď, se adsorbuje. Pryskyřice se pak promyje vodným roztokem, který obsahuje chlorid sodný a 5 % disodné soli ethylendiaminotetraoctové kyseliny (stručně EDTA. . 2Na). Ion mědi se odstraní účinkem EDTA . . 2Na. Na pryskyřici zůstane adsorbován (amido)N-substituovaný bleomycin, který ne obsahuje měď. Pryskyřice se pak promyje roztokem chloridu sodného, aby se -odstranila EDTA . 2Na, pak destilovanou vodou a konečně okyseleným vodným- methanolem, jako je například směs 0,02 M vodné kyseliny chlorovodíkové a methanolu (1:4 - objemovým dílům). Získají se tak frakce, které vykazují absorpční maximum kolem 290 nm. Dowexem(R) 44 (OH-typ, Dow Chemical Co.) se pH spojených frakcí upraví na 6,0. Spojené frakce se zahustí a lyofilizují. Získá se bílý amorfní prášek hydrochloridu (amido)N-substituovaného bleomycinu, který neobsahuje měď. Jestliže se místo chloridu sodného a vodné kyseliny chlorovodíkové použije síran sodný a vodná kyselina sírová, pak se vyrobí síran. Použitím příslušné soli a kyseliny v elučním stupni lze tedy získat žádanou sůl. Jako- příklady solí, které lze získat podle tohoto* způsobu, mohou být uvedeny vedle hydrochloridů a síranů také octany, víuany, citrany, maleinany a mléčnany.

(Arnido)N-substituovaný bleomycin připravený- jak shora uvedenou hydrolýzou působením 6N vodné -kyseliny chlorovodíkové při 105 °C po dobu dvaceti - hodin dává vedle aminu R—H a X—NHg nebo v některých případech rozkladného produktu shora uvedeného- aminu rozkladné produkty obvyklé pro bleomyciny, například L-tbreonin, jSamino-jj^--(^-ainiiic^--DH<krí)í^xy^-5-nmtth^ll3yrimidin^-2-yl)propionovou kyselinu, 4-amino-3-hydroxy-2-mnthyl-,pentanovou kyselinu, //-hydroxy-L-histidin, a 2‘-(2-aminoethyl)-2,4‘-bithiazol-4-karboxylovou kyselinu. Tento fakt podporuje názor, že chemická struktura (amido)N-substituováného bleomycinu je taková, jak je shora uvedeno v -obecném vzorci I.

Jestliže se jako- výchozí materiál používají sloučeniny obecného vzorce VI, v němž Xo znamená hydroxylovou skupinu a Ro znamená terminální aminový zbytek bleomycinů, získá se deamidobleomycin (obsahující atom mědi) obecného vzorce VI-1

CONHz NHo

(VH )kde BM a R znamenají jak shora uvedeno.

Vyrábí se hydrolýzou bleomycinů (neobsahujících měď] obecného vzorce II inaktivujícím enzymem z krys nebo isolovaným- z hovězích nebo vepřových jater.

Tak například hovězí játra sa homogenizuzjí ve fosforečnanovém pufru. Pak se centrifugují při 8000 otáčkách za minutu. Dialýzou supernatantu ve fosforečnanovém pufru se získá roztok surového enzymu. K tomuto roztoku - enzymu se přidá roztok bleomycinu ve fosforečnanovém pufru. Směs se nechá reagovat 5 až 48 hodin při 37 °C. Protein se z reakční směsi odstraní vhodným způsobem. Protein lze odstranit například tak, že se přidá trichloroctová kyselina (stručně TCA), a to až do koncentrace asi 5 - %. Vysráží se tak protein. Sraženina se odstraní centrifugací, promyje se třikrát 5^l0/o TCA roztokem a promývací vody se spojí s reakční směsí. Reakční směs, která již neobsahuje protein, se zneutralizuje a smíchá s nadbytkem octanu mědi. Žádaný produkt se tak převede na komplex s mědí. Odsolení se provede tak, že se komplex mědi nechá projít kolonou adsorptivní pryskyřice Dowex^⁵ HP 40 v destilované vodě. Žádaný produkt se adsorbuje na koloně. Soli - se vymyjí destilovanou vodou. Adsorbovaná fáze se eluuje 0,02N kyselinou chlorovodíkovou v methanolu (1:4 objemovým dílům]. Frakce, které vykazují absorpční maximum kolem 290 nm, se spojí. Spojené frakce se zneutralizují anexem Dowex⁰⁰ 44 (OH-typ, Dow Chemical Co.), zahustí se za sníženého tlaku a lyofilizují. Výsledný prášek se - rozpustí v destilované vodě. , Roztok se nechá projít kolonou CM-Sephadexu^¹ C-25 (Na⁺-typ, Pharmacia Fine Chemicals Co.), která byla ekvilibrována pufrem 0,05 M kyseliny octové s octanem sodným o pH 4,5. Žádaný produkt se adsorbuje. Adsorbovaná fáze se eluuje technikou lineárního· koncentračního gradientu, při kterém se ke shora uvedenému pufru kontinuálně přidává chlorid sodný tak, aby se koncentrace sodíku zvýšila až na 1,0 M. Modré frakce eluátu, které · obsahují žádaný produkt, se spojí, -odsolí ha Dianionu⁽w HP 40 shora popsaným -odsolovacím způsobem a lyofilizují. Získá se modrý amorfní prášek dρamidobleomycinů, které obsahují měď.

Jestliže se jako- výchozí materiály používají sloučeniny obecného vzorce VI, v němž Xo znamená skupinu — NH—X (X znamená jak shora uvedeno) a Ro znamená hydroxylovou skupinu, pak obecný vzorec' VI přechází na obecný - vzorec VI—2 (amido)Nsubstituované bleomycinové kyseliny

v němž BM znamená jak shora uvedeno. Příklady způsobu syntézy této kyseliny jsou uvedeny níže.

Známá sloučenina bleomycin Bz se působením shora uvedeného inaktivujícího enzymu převede na deamidobleomycin Bž, tj. deamidobleomycln obecného vzorce VI, v němž Ro znamená agmantin. Tento· deamidobleomycin se nechá zreagovat jak shora popsáno s aminem obecného vzorce VII za vzniku (amido)N-substituovaného bleomycinu B2, v němž Ro znamená agmantin. Výsledná sloučenina se hydrolyzuje známým houbovitým myceliem (například IFO - 8502, uloženým v Institute for Fermentation v Osace, Japonsko). Získá se tak žádaný produkt.

Deamidobleomycinová kyselina ' obecného vzorce VI-3 conh₂ nh₂

(Vf-3 i je výchozím materiálem obecného vzorce VI, v němž jak Xo, tak Ro znamenají hydroxylové- skupiny. Vyrábí se hydrolýzou známé bleomycinové kyseliny - (viz USA patent č. 3 886 133) působením shora uvedeného inaktivujícího enzymu. Lze ji získat také hydrolýzou deamidobleomycinu Bz obecného vzorce VI-1, v němž R znamená agmantin, za použití shora uvedené kultury houby.

Jako -příklady -aminů obecného· vzorce VII lze uvést například -methylamin, -ethylamin, propylamin, isopropylamin, butylamin, isobutylamin, terobutylamin, pentylamin, 3-methylbutylamin, neopentylamin, heptylamin, 3-methylpentylamin, hexylamin, l^-dimethylhexylamin, isohexylamin, oktylamin, decylamin, laurylamin, myristylamin, cety!amin, stearylamin, 2-aminoethylami.n, 3-aminopropylamin, 4-aminobutylamin, -6-aminohpxylamin, 12-aminododecylamin, 4-ашто-4-methyl-l-dimethylpentylamin, 2,2,2-trifluorethylamin, - 2,2,2-trichlorethylamin, 2,2-difluorethylamin, 2,2-dic hlorethylamin, - benzylamin, difenylmethylamin, 2-fenylethylamin, 2,2-difenylethylamin, 1-fenylethylamín,

1.2- difenylethylamin, 3-fenylpropylamin, 2-fenylisopropylamin, 1,3-difenylpropylamin,

3.3- difenylpropylamin, 4-fenylbutylamin, 4,4-difenylbutylamin, chlorbenzylamin, dichlorbenzylamin, brombenzylamin, methoxybenzylamin, dimethoxýbenzylamin, рШп’ХуЬ©пzylamin, methylendioxybenzylamin, propoxybenzylamín, p-chlorfenylethylamin, p-methoxyfenylethylamin, p-benzy!oxybpnzylamin_}

3 6-868 furylmethylamin, 2-furylethy-lamin, 2-thiazolylmethylamin, 2-pyrazolylmethylamin, 2-inidazolylmethylamin, 4--midazolylmethylamin,

2-thienylmethylamin, 2-.pyridylmethylamin, 3-pyridylmethylamin, 4-pyridylmethylamin, ind-olylmelhylamio, indolylethylamin, 4-methoxyindolylmethylamin, 2-pyrinidylnethylamln, 2-pyrimidylethylamin,

4-pyrimidylmethalamin,

4-pyrimidylhthylamin,

2- piperidylmethylami.n,

3- piyeoidylnethylanin,

4- piperidylmythylymin₁

2- (2-p ři^ť^rii^j^t ) elhy lamin,

2- (3-pi,peridyl ] ethylamin,

2- (^:4-pi-pee id yl) ethylamin,

1- (2-p řyer id yt ) ethylamin,

1- (3-piperidyl j ethylamin,

1- (4-pjp^i^id у i) ethylamin,

2- (pip-eridino ) ethylamin,

2-pip erazylmelhylanm,

2- (2-yiperazylethyl) amin,

2- ('piperidino) ethylamin,

3- pipyridlmo.propylamin,

2- (morf olino) ethylamin,

3- (norfolioo) propylamin,

2- moгfol(mylmethylymim,

3- morfolimylmethylymim,

2- (mo rfo linyl) ythylanio,

3- (morf olioyl) yropylaшm, din-otyylanimoytyylanm, diethylaniooelhylanio, dipropylym(noethylymm, propylyminoethylym(n, d(methylammopropylamia, diethylym(mopropylymin, diyropylyшinoyroyylaшio, propylaninoyropylanm, dibutylym.inopropylymin, butylymlnopropylym(n, bynzyla·ш(ooproyylaшm,

2- fenylethylyminopropylymm,

1-fen ylethylyminopropylamin,

3- fenylpropylymimopropylym(n,

4- fenylbutylamimopгopylymim, mythylymin·oethylymino,propylamin, ethylyminopropylyminopropylymin, yrρyylaшinopropylamioopoopylynin, bulylaminopropylaminopropylamal, N- (buty lamrnopropyl) -N-ne thylamino- propylamin, d(butylaшiopyroyylaшinopropylanin, p-emtylym(mopropylaminopropylymin, ethylymlnobutylyminopropylymin, propylyminobutylym.mopropylymi^ιn, ythylamiinoyroyylaminobutylanm, butylaminopropylamino-butylanm, benzylym(nιO'ethylymmoelhylymin, bemzylyminoethylymimoproρylymin, bynzylyminoproρylaminopгopylymin, benzylymmobutylymmopropylamiιn, fenylethylym(nopropylamimopropylym(n, N-(feoylУthylaшlinoproyyl--N-mythylamlmopro'pylym(n,

N- (chlorbenzy laninopr opyl) -N-nothylyminopropylymin,

N- (brombo^ιnzylymmopr opyl) -N-methylammopropylymia,

N- (chlorf enylethylyminopropyl )-N-nethylan(npyroyylan(o, dibenzylУminopr·opyl-N,N-dimelhyl· aminopropylamin, d(benzylymmopropyl-N,N-d(Уlhylyminopropylymin, dibenzylyminoρropy--N-mylhy--N-be^nzylanimoproyylanin, a-nyflylymim, /-noatytanln,

2--hiazplylanio, 3--hiazolylan(n,

4-thlazylammin, N-benzyl-4-yiιpeyidy-lynin, N-fyoylothyl-4-yiyeridylanio, N-benzyl-3-yřyeridylanio у N-benzyl-2-yiyeridylamin.

Žádoucí anioy obecného vzorce VIII jsou ty alifatické primární aminy, které vedle aminové skupiny, která se účastní reakce, myjí ještě bazickou skupinu. Jako příklady takových aminů je možno uvést:

2- anino ethylamin,

3- aшinopropylaшin, 2-dimethylaminoethylamin,

2- diethylaшinoelhylaшin,

3- dimythylaminopropylaш(n, 3·dielhalyminopropalyml·n,

3-( 3-butytaminopropylamino) propylamin, 3- (2-hyyrooyprooyla*mno) př op у lamin, 3-piporininopropammin,

3-( 1-f eoylolhylanioo ^rc^yla-nin,

2- aшinoyropylaшini

3- шethylyшinoyro₁yylaшini 3-butylaшinppropylαш(ni

3- (6-aminohexy lamino) 'propylamin, 3--rimethylyminoyropylyшini 3-(3-dimythylamiιaoyr opylamino )yooyylyшin,

3- (3-aminopooyy lamino) pr opylamin,

3- (.N-methyl-N- (3-aminoyroyyl) anino] propilam-in,

3-yyrrplidmylpooyylaшm, 3-yiyaridinylproyylaшin, 3-mprfoliooproyylanm, 3-yiyoranlnylproyylymin, 3-(4-( 3-amiinopropy t) yiyyo azinyl ] propylanimo-3-( 3-yyrrolidiooylpoppylynino )proyylamin,

3-(3-y iperi(rinyl₁yr oyylaшino-) propylamin, 3- (3-morf olinylyooyylaшmo) yooyylan(Oi 3- (з-hydroxyproyyly]aino) proyy.laшiOi 3- (3-mythooχyroρytamino o ргор у lamin, 3-benzylyminopoopylamini n-aminomethylbenzylamin, paminpmethylbynzylaш(ni

2- cyklopynlylaaňnoytyylaain,

3- cykloУexylУшmo,proyylaшin,

4- cyklohexylaninobutyl-anio, cykloheytylaшinoyooyylyшm, 3-cχklooktylyшinpyo·oyylaшin,

3- [ N-motyyl-3-N- (cykl^ookty^la^ythyl^a^ni^nopr-opyl.) anino jpr opylanin,

3-cyklodekyoylшethylaшiooyooyylaшiOi

3-(N-m ethyl-N- [ 3- (2-p-chlorf onylethylanioo) pr opyl ]yninpjyoopylαniOi

3-{I^-r^É^thyl-N-· [ 3- ( m-p-dibenzyloxybenzyl) aminopr opyl ] aminojpropylamin, 3-N-methylrN-[ ·3-( p-kyanobenzylamino · )propyl ] aminojpropylamin,.

3-{^Nr^m^eiyy^l-^N-[’(-(yyklu^r^^G^e^e^i^i^^^l^^^^;thylamino) propyl) aminojpropylamin,

3-{bJ-mettlyl-N-[ bis (m,p-dibenzyloxybenzyl )aminopropyl ] aminojpropylamin,

3--N,N-dim-etyyl-N-[ 3- (dibenzylamino )propyl Jaminojpropylamin,

3-jN,N-diiethyl-N- [ 3- (dibenzylamino j propyl ] aminojpropylamin,

Β-Ν,ΝνΠβ^υΙ-Ν- [ 3- (N,N-dimetyyl-N-(3--iibenz у^тторго p yllamino) propyl ]- . aminojpropylamin,

3-{N,N-dimethyl-N-[3-(N,N-dimethy--N-(3-cyklooktylmethylammopropypamino')propyl] aminojpropylamin,

3-[ 4- (3-dibenzy!ami)nopropylamino j piperidyljpropylamm a

3-[ 4-(3-c yklΌokty1methylami^ιnopropyl · )piperidyl ] pr opylamin.

Nové sloučeniny, které byly poprvé syntetizovány autory tohoto vynálezu, z aminů obecného· vzorce VIII, jsou sloučeniny následujícího obecného vzorce IX

NHž- (CH^—A — (CH2}3—B‘ (IX] v němž

A‘ znamená skupinu obecného vzorce

Rio‘ — N— nebo

Rio‘

I —N + 3 —

I Ri‘ (kde Rio‘ a . Rn‘ znamenají nezávisle na sobě Ci—Cs . alkylovou skupinu . nebo benzylovou skupinu) a

B‘ znamená di (f enyl-Ci—Сб--1ку1) aminovou, . kyanofenyl-Ci—C6-d1ky1ammovou, Cl—C(e.d1ky1aminovou skupinu substituovanou cykloalkylovou skupinou s 5· az 13 atomy uhlíku nebo bis (dibenzyloxyf eny aminovou skupinu. Tyto sloučeniny se syntetizují hydrolýzou sloučeniny obecného . vzorce X

Y—(CH2)3—A‘— (CH2)3—B‘ (X) (v němž A‘ a B‘ znamenají jak . shora uvedeno, a Y znamená chráněnou amizoskupinu), čímž se .odstraní chránící skupina. I když hydrolýza . .probíhá buď za přítomnosti báze, nebo kyseliny, obvykle je výhodné používat kyselinu, · jako například kyselinu chlorovodíkovou.

Z výchozích · sloučenin. · obecného . vzorce ·X so sloučeniny . · obecného· vzorce XI

Rio‘Ri“ . rI

Y— (CH2 )3r—Nk+ 3 — (C1H2]—N ' I1'

R11‘R13“ (XI) (v · němž Rio‘, ··Rn a Y · znamenají jak shora uvedeno, a R12“·'a R13“ znamenají nezávisle na sobě fenyl-Cl—C6-d1kylovou skupinu) vyrábějí následujícím způsobem.

3-aminopropyl-N,INdil^1kyllзmiιn obecného vzorce -XII

Rio‘

NH2—(CH2)3—N — R11‘ (XII) (v němž Rio‘ a Rii‘ znamenají jak shora uvedeno) · se reduktivně kondenzuje s benzaldehydem nebo fenyl-Ct—Cg-aldehydem. Reakční směs se zalkalizuje. Extrakcí organickým rozpouštědlem se získá N‘,N‘-dibenzylaminopropyl-N,N-dialkylam-in obecného vzorce XIII

Rn‘ R12“

Rio‘—N—(CHž)3—N—R13“ (XIII) (v němž Rio‘, Rn‘, R12“ a R13“ znamenají jak shora - · uvedeno). Výsledný -amin se nechá zreagovat se 3-halogenpropyl--Nchráněným)aminem. Vznikne kvartérní sůl obecného vzorce - XIV

Rio‘R12“

II

Y—(CH2)3—N( + )-(CH2)3—N i-I

R11‘. -R13“ (XIV) v němž Y, Rio‘, Rz‘, R12“ a R13“ znamenají jak shora uvedeno. Kvartérní sůl se zhydrolyzuje za . přítomnosti . kyseliny, například kyseliny . chlorovodíkové (6N), při teplotě v rozmezí od teploty místností do 200 °C, například během 8 hodin při 110 °C. Vedlejší produkty, jako je například kyselina, se odstraní,. . Reakční směs . se zahustí. Získá se hydrochlorid obecného . vzorce XI. Amin obecného vzorce XV, (C.1—Cejalkyl I Y—C^—N-UCHbJs—B“ (XV)

v. němž. . Y znamená , jak .shora uvedeno a B“ znamená di[feny.l-(Ci—C6)aÍky 1 jaminovou, ·p-kkanl)0θnyΓCl—C6)alkyl·aminovou, Ci-Cg236В68

-alkylaminovou skupinu substituovanou cykloalkylovou skupinou s 5 až 11 atomy uhlíku nebo bis[dibenzyloxyfenyl(Ci—Ce)alkyl] aminovou skupinu, se vyrábí acylací bis (3-aminopr opyl) (Ci—Cs) alkylaminu jedním nebo méně ekvivalenty acylačního činidla, jako je například benzoylchlorid, acetylchlorid, anhydrid kyseliny octové, karbobenzoxychlorid, S-terc.butoxykarbonyl-4,6-dimethyl-2-merkaptopyrimidin nebo N-karbethoxyftalimid, za vzniku monoacylovaného derivátu. Výsledný derivát se reduktivně zkondenzuje s jedním ekvivalentem aldehydu (jestliže B“ znamená monosubstituovanou aminoskupinu) nebo se 2 či více, s výhodou 3 až 6 ekvivalenty aldehydu (jestliže B“ znamená disubstituovanou aminoskupinu). Асуlovaná skupina se pak zhydrolyzuje kyselinou chlorovodíkovou.

Fyzikálně-chemické vlastnosti typických (amido )N-substituovaných bleomycinových derivátů podle tohoto vynálezu jsou uvedeny v tabulce 2.

TABULKA 2

Sloučenina č.

Zkratka

UF absorpční maximum formy, která neobsahuje atom mědi nm (E l'°/o/l cm)

TLC⁺¹ formy, která Elektroforéza⁺² forobsahuje atom mědi my, která obsahuje R₍ atom mědi R,_n (R_m alaninu = 1,0)

1	dH-MMA	291	(111)	0,6 2+	0,92
2	dH-MEA	291	(107)	0,75	0,83
3	dH-IPA	291	(105)	0,56+	0,85
4	dH-BA	291	(98)	0,70	0,75
5	dH-PEP	291	(102)	0,68	0,96
'6	dH-EDA	291	(100)	0,45	1,04
7	dB2-IPA	291	(89)	0,53+	0,93
8	ÚB2-DHA	291	(94)	0,76	0,87
9	ÚB2-TFEA	291	(93)	0,50+	0,85
10	dB2-OCT	291	(85)	0,72	0,77
11	dB2-PEP	291	(79)	0,87	1,03
12	ÚB2-BPA	292	(79)	0,87	1,02
13	dB2-LAA	291	(82)	0,43	0,70
14	dB2-BA	291	(78)	0,39 +	0,78
15	dB2-ADPM	291	(89)	0,82	0,76
16	dB2-DPE	291	(81)	0,77	0,76
17	dB2-NA	291	(85)	0,84	0,83
18	dB2-FFA	292	(115)	0,48+	0,82
19	dB2-AMPY	292	(84)	0,47+	1,02
20	ÚB2-ATZ	292	(137)	0,86	0,78
21	dPEP-IPA	291	(94)	0,84	0,87
22	dPEP-PEP	291	(89)	0,77	0,98
23	dPEP-BA	291	(91)	0,78	0,87
24	dPEP-CBA	291	(81)	0,74	0,79
25	dPEP-STE	291	(68)	0,06	0,18
26	dPEP-LAA	291	(83)	0,33	0,75
27	dPEP-OCT	291	(83)	0,61	0,84
28	dPEP-MTA	285	(100)	0,75	0,81
29	dPEP-DAD	291	(94)	0,78	1,02
30	dPEP-DPE	291	(88)	0,65	0,87
31	dPEP-ADPM	291	(85)	0,69	0,87
32	dPEP-DHA	291	(91)	0,63	0,84
33	dPEP-APZ	291	(85)	0,78	1,26
34	dPEPE-BPA	291	(82)	0,73	1,00
35	dPEP-ABP	291	(78)	0,72	1,10
36	dPEP-ADP	291	(75)	0,80	1,06
37	dBAPP-IPA	291	(91)	0,85	1,14
38	dBAPP-BAPP	291	(83)	0,26	1,44
39	dMCLBZ-PEP	289	(90)	0,53	1,16
40	dMCLBZ-OCT	290	(88)	0,50	1,08
41	dMCLBZ-DPE	290	(78)	0,55	1,01
42	dMCLBZ-DHA	290	(80)	0,53	0,90
43	dMCLPE-PEP	290	(79)	0,53	1,04
44	dMCLPE-OCT	290	(85)	0,52	0,96
45	dMCLPE-MCLPE ·	290	(79)	0,25	1,20
46	dMCLPE-BPA	290	(83)	0,60	1,11
47	dMTBZ-PEP	290	(81)	0,38	1,06

238868

Slouče-	Zkratka	UF absorpční maxi-	TLC+1 formy, která	Elektroforéza'''2 for-
nina č.		mum formy, která	obsahuje atom mědi	my, která obsahuje
		neobsahuje atom	Rf	atom mědi Rrn
		mědi		(Rm alaninu = 1,0)
		nm (E 1%/1 cm)

48	dMTBZ-OCT	290	(73)	0,24	0,92
49	dMTBZ-MTBA	290'	(69)	0,15	1,07
50	dMTBZ-BAPP	290	(71)	0,47	0,79
51	dMTBZ-BA	290	(81)	0,48	0,79
52	dMMDBZ-PEP	291	(75)	0,50	1,15
53	dMMDBZ-OCT	291	(76)	0,35	1,01
54	dMMDBZ-BPA	291	(79)	0,49	1,13
55	dEEDBZ-PEP	291	(77)	0,48	1,12
56	dEEDBZ-OCT	291	(78)	0,33	1,00
57	dEEDBZ-BPA	291	(73)	0,48	1,14
58	dMCO-BPA	291	(87)	0,54	1,08
59	dMCO-OCT	291	(83)	0,42	0,96
60	dMCO-PEP	291	(89)	0,53	1,06
61	dMCNBZ-BPA	290'	(81)	0,70	1,10
62	dMCNBZ-OCT	292	(94)	0,59	0,95
63	dMCNBZ-PEP	291	(93)	0,69	1,10
64	dMDDBZOBZ-PEP	285	(74)	0,09	0,93
65	dMDDBZOBZ-OCT	285	(76)	0,04	0,64

Poznámka:

+ 1 „Silanisovaný silikagel 6OF 254^(R)“ (Merck Co.), směs methanol — 6% octan amonný (60 : 40' objemovým dílům) s výjimkou R_{ hodnot označených křížkem, které byly měřeny v jiné směsi (65 : 34 objemovým dílům).

+ 2 Avicel SF(R) (FMC Co.), směs kyseliny mravenčí -- kyseliny octové — vody (27 : 75 : : 900 objemovým dílům), 800 V, 15 minut.

Biologické vlastnosti, které byly testovány na typických sloučeninách podle tohoto vynálezu, jsou popsány níže.

1. Test rezistence na inaktivující enzym

1. Extrakce inaktivujícího enzymu

Játra krysích samců (Donreyu) se smíchají s dvojnásobnou hmotností 0,067 M fosforečnanového pufru o pH 7. Rozemletím se připraví tkáňová emulze. Výsledná emulze se centrifuguje při 105 000 G (gravitační konstanta) 60 minut. Supernatant se dialyzuje. Výsledná frakce, která obsahuje velké molekuly, se použije jako extrakt inaktivujícího enzymu.

2. Stanovení inaktivační reakce

Κ 1 ml shora uvedeného extraktu se přidá 1 ml roztoku substrátu, který obsahuje 800 μ-g derivátu bleomycinu. Směs se nechá reagovat 40 minut při 37 °C. Část (0,3 ml) reakční směsi se po odstranění proteinů . testuje na zbytkovou aktivitu na Mycobacterium smegmatis ATCC 607. Bleomycin B2 (použitý jako kontrola) vykazuje za stejných podmínek 50'% pokles účinnosti. Výsledky testů jsou uvedeny v tabulce 3. Z výsledků testů je zřejmé, že (amido)N-substituované bleomycinové deriváty podle tohoto vynálezu jsou ve srovnání s bleomyciny méně ovlivněny bleomycin-inaktivujícím enzymem,

2. Antimikrobiální účinnosti na Mycobacterium smegmatis ATCC 607 a na Bacillus subtilis.

Antimikrobiální účinnosti byly testovány na uvedených mikroorganismech razítkovou technikou na agarových plotnách. Účinnost byla stanovována vzhledem k účinnosti standardního vzorku bleomycinu A2 (ve formě, která neobsahuje měď), jehož účinnost je 1000 ^g/mg. Výsledky testu jsou uvedeny v tabulce 3.

3. Účinnost inhibice růstu kultury buněk HeLa S3

Buňky HeLa S3 se naočkují na médium (MEM s 10· % hovězího séra) v plastických Petriho miskách. Dva dny .po naočkování se přidá k médiu testovaný bleomycin. V inkubaci se pokračuje další tři dny. Pak se spočítají buňky. Procentuální inhibice růstu se vypočte podle následující rovnice:

Procentuální inhibice růstu (v %) = = 100 χ (B—A) / (B—C) , kde

A znamená konečný počet buněk třetí den p0^! přidání testovaného vzorku,

B znamená konečný .počet buněk kontrolního vzorku (bez přidání testovaného vzorku) a

C znamená počet buněk v den přidání testovaného vzorku.

IDso [koncentrace způsobující 50% inhibi ci) se vyhodnotí z křivky koncentrace vzorku proti procentuální inhibici.

Výsledky testů získaných podle bodů 1 a 2 jsou uvedeny v tabulce 3.

TABULKA 3

Sloučenina č.

Zkratka

Antimikrobiální účinnost sloučeniny neobsahující měď (pg/mg) na Myco- na bacteriuom Bacillus smegmatis subtilis

Koncentrace sloučeniny neobsahující měď, způsobující 501% inhibici růstu kultury buněk HeLa Ss (IDso) ^g/ml

Rezistence sloučeniny obsahující měď na inaktivující enzym*¹

1	dH-MMA	1447	654	1,2	+ + + +
2	dH-MEA	1 895	767'	0,98	+ + +
3	dH-IPA	2 778	593	0,95	+ + 4- + +
4	dH-BA	6 595	579	1,10	*
5	dH-PEP	9 846	3 772'	1,0	+ + + +
6	dH-EDA	2 396	4 453	1,0	+ + + +
7	dB2-IPA	6 425	1 950'	0,56	4- + + +
8	dB2-DHA	24 880	950'	0,62	+ + +
9	ÚB2-TFEA	3 990	730'	1,03	4- -b
10	dB2-OCT	33 700	1 500	0,34	+
11	ÚB2-PEP	15 729	7 036'	0,71	4-4-4-4-4-
12	ÚB2-BPA	16 438	4 384	0,98·	4-4-4-4-4-
13	dB2-LAA	7 650	660	0,39	4-4-4- +
14	dB2-BA	28 140	1 650:	0,73	+
15	dB2-ADPM	42 320	980'	0,39	+ + + + +
16	dB2-DPE	24 480	520	0,'67·	4-4-4-4-
17i	dB2-NA	33 650	1 295	1,1	±
18	ÚB2-FFA	19 150	1 285'	0,58	±
19	dB2-(AMPY	5 160	1 010	0,83	+ +
20	ÚB2-ATZ	4 870	900	0,73	+ +
21	dPEP-IPA	11 998	962'	0,17	4-4-4-4-
22	dPEP-PEP	28 030	2 800	0,80	4-4-4-4-4-
23	dPEP-BA	38 348	1 380'	0,26	+
24	dPEP-CBA	56 328	1184'	0,28	+
25	dPEP-STE	210	0	4	*
26	dPEP-LAA	3 920	384’	0,40	4-4-4-4-
27	dPEP-OCT	45 100	886	0,36	+ +
28	dPEP-MTA	18 650	586	0,60	4-4-4-4-
29	dPEP-DAD	14 200'	' 5 400’	0,43	+ + + +
30	dPEP-DPE	33 802	190	1,02	4-4-4-4-
31	dPEP-ADPM	54 645'	430	0,56	4-4-4-4-4-
32	dPEP-DHA	39 956	298	0,83	+ +
33	dPEP-APZ	6 359	5 009	1,50	4-4-4-4-
34	dPEP-BPA	26 023	2 843	0,95	4-4-4-4-
35	dPEP-ABP	18 537	2 159'	0,90	4-4-4-4-
36	dPEP-ADP	6 061	3 694'	2,70	4-4-4-4-
37,	dBAPP-IPA	13 210	20 048	0,90	+ 4-4-4-
38	dBAPP-BAPP	5 100	6 60tí	0,79	4- + +
39	dMCLBZ-PEP	14 880'	2 590	0,53	+ + + + +
40	dMCLBZ-OCT	38 200'	1 808	0,43;	+ + +
41	dMCLBZ-DPE	23 342'	521'	0,86	+ + + + +
42	dMCLBZ-DHA	31 834	933'	0,49	+ + + +
43	dMCLPE-PEP	15 593	4 267'	0,37	+ + + + +
44	dMOLPE-OCT	38 750	1898	0,23	+ +
45	dMCLPE-MCLPE	650	270'	0,30	+ + + + +
46	dMCLPE-BPA	31 '690	3690’	0,40	+ + + + +
47	dMTBZ-PEP	5 900	180	2,15	+ + + + +
48	dMTBZ-OCT	2 580'	130	1,75	*
49	dMTBZ-MTBZ	230	1'	11,0	*
50	dMTBZ-BAPP	1 417	376'	2,2	+ + + +
51	dMTBZ-BA	24 461'	410'	0,77	+ + +

Slouče-	Zkratka	Antimikrobiální	Koncentrace slouče-	Rezistence slouče-
nina č.		účinnost sloučeniny	niny neobsahující	niny obsahující měď
		neobsahující měď	med, způsobující	na inaktivující
		(,ug/mg)	50i% inhibici růstu	enzym + 1
		na Myco- na	kultury buněk
		bacteriwm Bacillus	HeLa S3 (IDso)
		smegmatis subtilis	^g/ml

52	dMMDBZ-PEP	21 371	2 372'	0,55	+ + + + 4-
53	dMMDBZOCT	40 703'	585'	0,23	Я-
54	dMMDBZ-BPA	32 633	2 663'	0,80	+ + 4- +
55	dEEDBZ-PEP	20 840	2 150	1,00	+ + + + +
56	dEEDBZ-OCT	41 380'	520'	0,60	*
57	dEEDBZ-BPA	25 924'	1 831'	1,5	+ 4—b +
58	dMCO-BPA	62 418	5 518	0,40	4-4-4-4-
59	dMCO-OCT	65 733	5 473	0,23	4-4-4-
60	dMCO-PEP	54 345	7 273'	0,33	+ + + + +
61	dMCNBZ-BPA	14 730	4 755’	1,10	4- + + +
62	dMCNBZ-OCT	49 270	381	0,28	4+4-
63	dMCNBZ-PEP	21 877	11 056	0,60	+ + + +
64	dMDDBZOBZ-PEP	115	23	0,058	*
65	dMDDBZOBZ-OCT	153	13	0,30	-X-
Poznámka:
+1 Rezistence byla hodnocena inaktivace bleomycinu B? je	jako stupeň 50· %.	inaktivace	za podmínek,	při kterých stupeň

Hodnocení	Stupeň inaktivace
4-	45 % nebo více
+	35 až 44 %
+ +	25 až 34 %
+ + +	15 až 24 %
+ + + +	5 až 14 %
+ + + + +	méně než 5 %
	Nestanoveno kvůli adsorpci na protein enzymu.

4. Pulmonární toxicita (pulmonární fibrosa) u myší

Pro test byly použity ICR myši (samečci, stáří 15 týdnů, 9 myší v každé skupině). Každá myš dostávala denní dávku 5 mg/kg testovaného vzorku intraperitoneální imjekcí, jednou denně, po dobu 10 po sobě následujících dnů. Od ukončení podávání testovaného vzorku byly myši po dobu 5 týdnů pozorovány, potom byly utraceny a pitvou sledován výskyt a stupeň pulmonární fibrosy. Vyhodnocení bylo děláno na základě porovnání počtu testovaných myší trpících pulmonární fibrosou a na základě stupně onemocnění. Výsledky testu jsou uvedeny v tabulce 4.

V tabulce 4 je stupeň onemocnění vyjádřen číselně podle následující stupnice:

Počet bodů

0: žádná fibrosa

1: akumulace exudátu v pulmonární alveoli a fibrose, podobná změna v alveolárním septu

2: fibrosa v několika oblastech

4: roztroušená fibrosa

6: fibrosa na více než dvou třetinách celkové plochy.

,,Poměr“ byl vypočten ze srovnání s ,,bleomycinovým komplexem“.

stupeň celkový počet pulmonármch fibros/celkový počet vzorků (%) poměr

TABULKA 4 sloučenina ¢.

zkratka výskyt počet -myší s pulmonární fibrosou (%)

21	dPEP-IPA	3/8	(38)	5/24	(21)	0,27
22	dPEP-PEP	1/8	(13)	1/21	(4)	0,05
33	dPEP-APZ	5/9	(56)	11/27	(41)	0,44
34	dPEP-BPA	0/8	(0)	0/24	(0)	0
37	dBAPP-IPA	3/9	(33)	13/27	(48)	0,46
38	dBAPP-BAPP	5/7	(71)	7/21	(33)	0,32
39	dMCLBZ-PEP	2/9	(20)	2/27	(7)	0,07
43	dMCLPE-PEP	‘ 0/1	(0)	0/3	(0)	0
45	dMCLPE-MCLPE	0/9	(0)	0/27	(0)	0
47	dMTBZ-PEP	0/8	(0)	0/24	(0)	0
4(8	dMTBZ-OCT	0/8	(0)	0/24	(0)	0
49	dMTBZ-MTBZ	0/3	(0)	0/9	(0)	0
51	dMTBZ-BA	0/8	(0)	0/24	(0)	0
53	dMMDBZ-PEP	0/9	(0)	0/27	(0)	0
52	dMMDBZ-OCT	O/9	(0)	0/27	(0)	0
54	dMMDBZ-BPA	0/9	(0)	0/27	(0)	0
55	dEEDBZ-PEP	0/9	(0)	0/27	(0)	0
56	dEEDBZ-OCT	0/9	(0)	0/27	(0)	0
57	dEEDBZ-BPA	0/9	(0)	0/27	(0)	0
58	dMCO-BPA	0/9	(0)	0/27	(0)	0
59	dMCO-OCT	0/9	(0)	0/27	(0)	0
60	dMCO-PEP	0/9	(0)	0/27	(0)	0
62	dMCNBZ-OCT	0/9	(0)	0/27	(0)	0
64	dMDDBZOBZ-PEP	0/9	(0)	0/27	(0)	0
65	dMDDBZOBZ-OCT	0/9	(0)	0/27	(ϋ)	0

5. LDso u myší stanovením podáváním 10 po sobě následujících dnů.

Myším samečkům (CDFi/SLC, stáří 6 týdnu, 7 myší ve skupině) byly podkožně podávány různé dávky bleomycinových derivá tů jednou denně v 10 po sobě následujících' dnech. Z úmrtnosti během podávání byla Behrens-Kárberovou metodou stanovena LDsd (denní dávka). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 5.

TABULKA 5

sloučenina č.	zkratka	LD50 při podávání během deseti po $obě následujících dnech'
52	dMMDBZ-PEP	13,9
53	dMMDBZ-OCT	15,0
64	dMDDBZOBZ-PEP	více než 81,4
65	dMDDBZOBZ-OCT	více než 75,7

Jak je z předcházejícího popisu zřejmé, sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou rezistentní na bleomycin-inaktivující enzym, mají vysokou účinnost inhibice růstu kultury buněk HeLA S3, mají významnou amtimikrobiální účinnost a mají velmi nízkou pulmonární toxicitu, což jsou positivní fakta pro jejich používání v klinických oblastech.

Jestliže se používají jako léčiva, pak se sloučeniny podle tohoto vynálezu smíchají obvyklým způsobem s excipientem. Léčiva se vyrábějí ve formě injekcí, tablet, mastí, čípků atd. Mezi vhodné excipienty patří voda, cukry, jako například manitol, a další materiály obvykle používané v lékařských prostředcích.

I když dávkování závisí na způsobu podávání, lze uvést, že jednotlivá dávka je 2 až 10 mg na osobu podávaná jednou až čtyřikrát týdně, souhrnná dávka je 2 až 200 mg na osobu za týden.

Vynález je dále ilustrován podrobněji v příkladech, není však na tyto příklady 0mezen.

Příklad 1

Stupeň A

Čerstvá hovězí játra (o hmotnosti 200 g) se homogenizují ve 400 ml 0,05 M fosforeč2 3 6 0 8

3® nanového ,pufru o pH 7,2. Směs se centrifuguje 30' minut při 8000 ot/min. Supernatant se dialyzuje s 0,05 M fosforečnano-vým pudrem. Připraví se tak roztok surového enzymu. К 10 g bleomycinu Вз se .přidá 400 ml roztoku surového enzymu. Směs se nechá zreagovat při 37 °C 24 hodin. К reakční směsi se přidá 40 ml 55% roztoku kyseliny trichloroctové (stručně TCA). Protein se vysráží. Sraženina se oddělí centrifugací a promyje 5% TCA roztokem (třikrát). Supernatant a promýv.ací roztoky se spojí, zneutralizují se roztokem 4 M hydroxidu sodného a smíchají se se 3,2 g (2,4 ekvivalentu bleomycinu) octanu mědi. Vytvoří se komplex mědi se žádaným produktem. Odsolení se provede tak, že se roztok komplexu mědi nechá projít kolonou (o objemu 1 litr) adsorptivní pryskyřice Diaion^(K) HP 40 (Mitsubishi Chemical Co.) v destilované vodě. Žádaný .produkt se naadsorbuje na koloně. Soli se vymyjí 1,5 litru destilované vody. Adsorbovaná fáze se elu.uje 0,02 N kyselinou chlorovodíkovou (vodnou) ve směsi s methanolein (1:4 objemovým dílům). Frakce, které vykazují absorpční maximum kolem vlnové délky 290 nm, se spojí. Spojené frakce se zneutralizují Dowe :em^(R) 44 (OH typ, Dow Chemical Company) a za sníženého tlaku se zahustí. Koncentrát se nechá projít jednolitrovou kolonou CM-Sephadoxu^(R) C-25 (Na ⁺ -typ, Pharmacia Fine Chemicals Co.), která se ekvilibruje 0,05 M kyselinou octo vou ve směsi s octanem sodným (pufг o pH 4,5). Zadaný produkt se adsorbuje na koloně. Adsorbovaná fáze se eluuje technikou lineárního koncentračního gradientu, kdy se ke shora uvedenému pufrovscímu roztoku kontinuálně přidává chlorid sodný, dokud se koncentrace sodíku nezvýší na 1.0 M. Modré frakce, které se eluují při asi 0,3 M koncentraci sodíku, se spojí. Pak se odsolí Diaionem^{R) HP 40 jak shora uvedeno a lyo.filizují se. Získá se tak 8,5 g (ve výtěžku 83 %) modrého amorfního prášku deamidobleomycinu B2, který obsahuje atom mědi.

Modrý prásek vykazuje absorpční maxima [E 1%/1 cm) .při 242 nm (138) a 291 nm (115) (stanoveno v destilované vodě). Infračervená absorpční maxima (cm¹, měřeno jako KBr pastilka): 3425, 2975, 2940, 1720. 1640, 1575, 1430, 1420, 1400. 1375, 1280, 1260, 1240, 1199, 1140, 1100, 1060, 1020 a 730. Další lyzikálně-chemické vlastnosti jsou uvedeny v tabulce □.

Podobným způsobem jako shora uvedeno, ale s tím, že se použije bleomycin AK—C, 3-[ (S )-ť-fenylethyl¹ aminopropylaminobleomycin, respektive 3-(3-butylamínopropylamino)propylaminobleomycin, se vyrobí deamidobleomycin Аз‘---С, 3-[ (S )-l‘-fenylethylamino ipropylainino-deamidobleomycin, respektive 3-( S-butylaminopropylaminojpropylaminodeamidobleomycin. Fyzikálně-chemické vlastnosti těchto sloučenin jsou uvedeny v tabulce 6.

TABULKA 3

syntetizovaný deamidobleomycin	UF absorpční! maximum formy, která obsahuje atcm mědi nm (E 1 %/l cm)	TLCH formy, která obsahuje atom mědi Rf	elektroforéza+2 formy, která obsahuje atom mědi R:11 fRH) alaninu^l.O)
deamidobleomycin B2:	242'	(138)	0,95	0,72
	292	(И5)	0,64+
deamidobleomycin A?‘—-C	242	.(132)	0,75	0,62
	292	(110)	0.43
3-[ (S)-l‘-fenylethyla.mino !-	242	(147)	0,87	0,67
propyldeamidobleomycin	292	(124)	0.49 H
3-( 3-butylaminopropylamino )-	242	(142)	0.83	1,01
propylaminodeamidobleomycin	292 .	(ИЗ)	0,55 +

Poznámka:

⁺¹ „Silanizovaný silikagel 60F 254^{R)“ (Merck Co.); měřeno ve směsi methanol — 6% roztok octanu amonného (60 : 40 objemovým dílům) s výjimkou R,- hodnot, které jsou označeny „4-“, které byly měřeny v jiné směsi (65:34 objemovým dílům).

⁺² Avicel SF^{R) (FMC Co.); směs kyselina mravenčí — kyselina octová — voda (27 : :75:900 objemovým dílům). 800 V, 15 minut.

Stupeň В

К roztoku 1 g deamidobleomycinu B2. kte rý obsahuje měď, vyrobenému ve stupni A a 1,77 g 1-hvdiOx.ybenzotriazolu (stručně HOBT) v 10 ml dimethylformamidu se za chlazení na 0^CC a za míchání přidá 1,35 g [10 ekvivalentů, bleomycinu) dicyklohexylkarbodiimidu (stručně DCC). P-o pěti minutách se ke směsi přidá 840 ing' (5 ekvivalentů bleomycinu) 3-[ (S)-l‘-fenylethylaminolpropylaminu jako hydrochlorid a 0,72 ml N methylmorfolinu. Výsledná směs se nechá reagovat 16 hodin za teploty místnosti. К reakční směsi se přidá desetinásobný objem acetonu. Žádaný produkt se vysráží. Po promytí acetonem se sraženina rozpustí v destilované vodě. Roztok se nechá projít kolonou [10:0 ml) naplněnou CM-Sephadexem^ÍR) C-25 (Na⁺-typ, Phannacia Fine Chemicals Co.), která se ekvilibruje pufrovacím roztokem 0,05 M kyselina octová — octan sodný o pH 4,5. Produkt se adsorbuje. Adsorbovaná fáze se eluuje technikou lineárního koncentračního gradientu, při které se ke shora uvedenému pufrovanému roztoku kontinuálně přidává chlorid sodný tak dlouho, až se koncentrace sodíku zvýší na 1,0 M.Modré frakce, které byly eluovány koncentrací sodíku asi 0,6 M, se spojí. Spojené frakce se odsolí shora popsaným způsobem za použití Diaionu^(R) HP-40 a lyofilizují. Vyrobí se 880 mg (76i% výtěžek) modrého amorfního prášku (amido)N-!3-[ (S )-l‘-fenylethylamino ] propyl’-bleomycinu B2, který obsahuje atom mědi. Tento bleomycin měl absorpční maxima (E 1%/1 cm) při 243 nm (125) a 292 nm (9'6) (měřeno v destilované vodě). IC absorpce (cm⁴ KBr): 3425, 2975, 2930, 1720, 1640, 1580, 1575, 1550, 1455, 1430, 1400, 1370, 1290, 1240, 1190, 1130, 1095, 1060, 1005, 980, 875 a 760. Další fyzikálně-chemické vlastnosti jsou uvedeny v tabulce 2.

Podobným způsobem, jako shora popsáno, se syntetizují měď obsahující formy (amido )N-substituovaného bleomycinu B2 č. 7 až 20, které jsou uvedeny v tabulce 2, reakcí deamidobleomycinu B2, který obsahuje měď, s aminy, které odpovídají žádaným produktům.

Podobně se syntetizují sloučeniny č. 1, 6, 21 až 38, 64 a 65, které jsou uvedené v tabulce 2, a to reakcí deamidobleomycinu A/— C, 3-[ (S)-l‘-fenylethyl ]aminopropylaminodeamidobleomycinu a 3-(3-butylaminopropylaminojpropylaminodeamidobleomycinu (všechny bleomyciny ve formě, která obsahuje atom mědi) s příslušnými aminy, které odpovídají žádaným produktům.

Stupeň C

Ve 20 ml destilované vody se rozpustí 880 mg sloučeniny obsahující měď, která byla připravena podle stupně B. Odsolení se provede tak, že se roztok nechá .projít lOOml kolonou Ainberlitu^(R) XAD-2 v destilované vodě. Sloučenina, která obsahuje měď, se adsorbuje. Pryskyřice se promyje postupně 300 ml vodného roztoku, který obsahuje chlorid sodný a 5 % EDTA . 2Na, 100 ml 2% vodného roztoku chloridu sodného a 250 ml destilované vody. Pryskyřice se pak eluuje 0,02N kyselinou chlorovodíkovou .a methanolem (směs v- poměru 1 : 4 objemovým dílům). Frakce, které mají absorpční maximum při vlnové délce kolem 290 nm, se spojí. Dowexem 44 (OH typ, Dow Chemical Co.) se pH spojených frakcí upraví na 6,0. Po zahuštění za sníženého tlaku a lyofilizaci se získá 790 mg (93% výtěžek) bílého amorfního prášku měď neobsahujícího hydrochloridu (amido)Ν-·3··| (S j-ť-fonylethylaminoU propylj-bleomycinu B2. UF absorpční maxi mum a [E 1%/1 cm) byly 291 nm a (79). IC absorpční maxima (cm⁴, КВг-.pastilkaj: 3425, 2950, 1720, 1640, 1555, 1450, 1400, 1360, 1320, 1260, 1190, 1060, 880, 910, 805, 770 a 700. Další fyzikálně-chemické vlastnosti jsou uvedeny v tabulce 2.

Příklad 2

Stupeň A

Houbovité mycelium (o hmotnosti 400 g) získané kultivací Fusarium roseum IFO 7189 (uloženo v Institute for Fermentation, Osaka) se homogenizuje ve 4 litrech 0,05 M fosforečnanového pufru o pH 7,5. К homogenizované směsi se přidá roztok 10 g (amido)Ν-·3-[ [S )-l‘-fenylethylamino jpropylj-bleomycinu B2, který obsahuje atom mědi, v 1 litru shora uvedeného fosforečnanového pufru. Směs se nechá reagovat 20 hodin při 37 °C. Reakční směs se smíchá s filtrační přísadou a směs se odsaje. Zbytek se promyje stejným pufrem, jako shora uvedeno. Filtrát s promývacími vodami se nechá projít jednolitrovou kolonou adsorptivní pryskyřice Amberlit^(R) XAD-2 v destilované vodě. Žádaný produkt se adsorbuje. Soli se vymyjí dvěma litry destilované vody. Adsorbovaná fáze se eluuje 50^l% vodným methanolem. Získá se 5 litrů modrého nebo modravě-zeleného produktu. Spojené frakce se zahustí za sníženého tlaku. Koncentrát se rozpustí ve 350 ml 80% methanolu a roztok se nechá projít kolc.nou se 70 ml oxidu hlinitého v 80»% methanolu. Kolona se promyje 100 ml 80% methanolu a pak se eluuje 40i% methanolem. Získá se 350 ml modrých frakcí eluátu. Spojené frakce se za sníženého tlaku zahustí. Koncentrát se rozpustí v destilované vodě a roztok se nechá projít kolonou (o objemu 600 ml) CM-Sephadexu^(R) C-25 (Na⁺ typ, Pharmacia Fine Chemicals Co.), která se ekvilibruje pufrovacím roztokem směsi 0,05 M kyseliny octové s octanem sodným o pH 4,5. Žádaný produkt se adsorbuje 11a pryskyřici. Adsorbovaná fáze se eluuje metodou lineárního koncentračního gradientu, při kterém se ke shora uvedenému pufro.vanému roztoku kontinuálně přidává chlorid sodný tak dlouho, až se koncentrace sodíku zvýší postupně na 1,0 M. Modré frakce, které se eluují při koncentraci sodíku kolem 0,2 M, se spojí, odsolí se za použití Diaionu^(R) HP 40 a lyofilizují. Získá se 7,1 g (79% výtěžek) modrého amorfního prášku (amido)Nj3-[ (Sj-F-fenylethylamino]propyl}-bleomycinové kyseliny, která obsahuje atom mědi. UF absorpční maxima a (E 1%/ /1 cm) měřená v destilované vodě: 245 nm (121) a 293 (119). IC absorpční maxima (cm⁴, KBr pastilky): 3450, 2975, 2940, 1720, 1645, 1580, 1555, 1460, 1370, 1300, 1190, 1140, 1095, 1060, 1005, 980, 880, 765 a 700. Další fyzikálně-chemické vlastnosti jsou uvedeny v tabulce 7,

Podobným způsobem jako shora uvedeno se z (amido JNoktylbleomycinu B2 a (amido ) N- (3-dibutylaminopropyl) bleomy cínu B2 vyrobí (amido )N-oktyl-bleomycinová kyseli na a (amido )N- (3-dihuty lamin opropyl) bleomycinová kyselina. Fyzikálně-chemlckě vlastnosti těchto kyselin jsou uvedeny v tabulce 7.

TABULKA 7

syntetizovaná (amido)N-substituovaná bleomycinová kyselina	UF absorpční maximum formy, ol která obsahuje měď nm (E 1%/1 cm)	TLE и měď jsahující formy Rf	eloktroforéza+2 měď obsahující formy R1T1 [R:|1 alaninu 1,0
[amido )N-|3-[ (S)-l' fenyl-	245	(121)	0,93	0,84
ethylamino jpropyljbleo-	293	(И9)	0,62 1
mycinová kyselina
(amido) N- (3-dibutylamino-	247	(123)	0,93	0,88
p r 0 p у 1) b 1 e 0 m у c i 110 v á kysel ina	294	(123)	0,62 b
(amido )N( oktyl Jbleomycinová	245	(130)	0,79	0,59
kyselina	293	(1281	0,20 1

Poznámka:

Stupeň C ^{+ 1} „Silanizovaný silikagel 60F 254^(R)“ (Merck Co.); měřeno v roztoku směsi methanol — 6% octan aimonný (60 : 40 objemovým dílům) s výjimkou hodnot R_f, které jsou označeny hvězdičkou, které byly měřeny v jiné směsi (65:34 objemovým dílům).

+ ² Avicel SF^(R) (FMC Co.); směs kyselina mravenčí — kyselina octová — voda (27 : :75:900 objemovým dílům), 800 V, 15 minut.

Stupeň В

V 10 ml dimethylformamidu se rozpustí 1,0 g (amido)N-{3-[ (S)-l‘-fenylethylamino 1propyl|-bleomycinové kyseliny, která obsahuje atom mědi, která byla připravena podle stupně A, a 1,71 g HOBT. Podobným způsobem jako shora uvedeno ve stupni В příkladu 1 se za použití 1,31 g DCC nechá shora uvedený roztok zreagovat se 340 mg 3-[ N- (3‘-cyklooktylmethyla'mino) propyl-N-methylaminolpropylaminu. Během tří hodin se vytvoří kondenzační produkt. Podobně jako v příkladu. 1 se reakční směs smíchá s acetonem, potom se vyčistí chromatografií na CM-Sephadexu^(R) a nechá se projít kolonou 100 ml Amberlitu^(R) XAD-2, kde dojde к adsorpci. Adsorbovaná fáze se eluuje technikou lineárního koncentračního gradientu, při které se к 500 ml acetátového pufru o pH 4,5 kontinuálně přidává 500 ml methanolu tak, aby se koncentrace methanolu lineárně zvyšovala. Žádaný produkt se eluuje při koncentraci methanolu kolem 40 až 50 proč. Eluát se odsolí -na koloně (100 ml) Diaionu^w HP 40 shora popsaným způsobem a pak se lyofilizuje. Získá se 980 mg (83% výtěžek) modrého amorfního prášku 3-[N-3‘4cyklooktylamino)propyl-N-methylarnino] propylamino[ amido)N-|3-[ (S )-l‘-fenylethylamino] propyl}-bleomycinu (jako forma, která obsahuje měď).

Ve 22 ml destilované vody se rozpustí 980 mg 3-[N-( Bhcyklooktylmethylamino )propyl-N-methylamino j propylamino-(amido )N-|3-[ (S)-l‘-fenylethyl laminopropyl|bleomycinu. který obsahuje atom mědi, vyrobeného podle stupně B. Roztok se zpracuje s Amberliiem^(R) XAD-2 a 5% vodným roztokem EDTA . 2Na způsobem shora uvedeným v příkladu 1. Odstraní se tak atom mědi. Eluent se lyofilizuje. Získá se 870 mg (92 proč.) bezbarvého amorfního prášku hydrochloridu 3-[N-(3‘-cyklooktylmethylamino)propyl-N-methylamino] propylamino-(amido )N-j3-[ (S)-lkfenylethylaminojpropyl}-bleomycinu, který neobsahuje měď. UF absorpční spektrum a (E 1%,/1 cm) měřeno v destilované vodě: 291 nm a (89). IČ absorpční maxima (cm‘ξ KBr-pastilky): 3400, 2925, 1720, 1650, 1550, 1520, 1480, 1460, 1450, 1405, 1385, 1360, 1320, 1255, 1190, 1130, 1100, 1055, 1020, 980, 960, 880, 805, 760, 725 a 695. Další fyzikálně chemické vlastnosti jsou uvede-ny v tabulce 2.

Podobným způsobem jako shora uvedeno se vyrábějí sloučeniny č. 20 až 63 uvedené v tabulce 2, které neobsahují měď, z odpovídajících výchozích látek.

Příklad 3

Stupeň A

Podobným způsobem jako v příkladu 2 se

1,5 g měď Obsahujícího deamidobleomycinu B2, který byl vyroben podle příkladu 1, smíchá s homogenizovanou směsí 60 g kultury mycelia Fusariu-m roseism a 750 ml 0,05 M fosforečnanového pufru o pH 7,5. Směs se nechá reagovat 21 hodin při 37 ^CC. Reakční směs se zpracuje jako v příkladu 2. Pak se nechá projít kolonou (o objemu 500 ml) Amberlitu XAD^(R)-2. Žádaná sloučenina se ad236868 sorbuje. Kolona se promyje 750 ml destilované vody a eluuje se směsí vody s methanolem (4:1). Zelené frakce (celkem 750 mililitrů) se spojí a zahustí za sníženého tlaku. Koncentrát se nechá projít kolonou (o objemu · 60 ml) CM-Sephadexu(^R) C-25 (Na* typ, Pharmacia Fine Chemicals Co.), která se ekvilibruje 0,05 M kyselinou octovou ve směsi s octanem sodným o pH 4,5. Kolona se promyje destilovanou vodou. Modré frakce eluátu (celkem 80 ml) se spojí. Po opakované chromatografií na CM-Sephadexu(R) se vyčištěné modré frakce zahustí a nechají projít kolonou (o objemu 1 litr) Sephadexu(R⁾ LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals Co.) ve směsi vody s methanolem (1:4). Kolona se eluuje směsí vody s methanolem (1 : 4). Modré frakce se spojí. Spojené modré frakce se zahustí za sníženého tlaku a lyofilizují. Získá se 890 mg (87% výtěžek) modrého amorfního· prášku deamidobleomycinové kyseliny, která obsahuje atom mědi.

UF absorpční . maximum a (E 1%/1 cm): 254 nm (143) a 292 (144) nm (měřeno v destilované vodě).

IC absorpční maxima (cmý KBr-pastilky): 3450, 2975, 2940, 1720, 1640, 1560, 1465, 1420, 1380, · 1280, 1190, 1140, 1100, 1060, 1020, 990, 880, 810 a 775.

Za podmínek, které jsou uvedeny v tabulce 7. byla hodnota R_f při chromatografií· na tenké vrstvě 0,91+ a hodnota R_E1 při elektroforéze 0,49.

Stupeň B

V 5 ml dimethylformamidu .se rozpustí 500 mg měď · obsahující sloučeniny získané podle stupně A a 2010 mg 1ÍOBT. Výsledný roztok se kondenzuje se 3-[(S)-l‘-fenylethylaminolpropylaminpm 21 hodin stejně jako· v příkladu 1 za použití 770 mg DCC. Podobně jako· v příkladu 2 se reakční směs zpracuje s acetonem, vyčistí chromatografií na CM-Sse:)hadexu(R) a na Amberlitu(^R> XAD-2, odsolí Diaionem(^R) HP-40· a lyofilizuje. Získá se 280 mg (42% výtěžek) modrého amorfního prášku 3-[ (S)-l‘-fenylethylamino ] propylamino- (amido·) N-{3- [ (S) -l‘-fenylethylamino]propyl}-bleomycinu ve formě, která obsahuje atom mědi.

Podobným způsobem jako shora popsáno se za použití 3-(3-butylaminopropylamino)propylaminu a N-[N-(3-aminopropyl)-N-methylaminopropyl ] -N- [ 2- (p-chlor f enyl) ethyl) aminu získá 3-(3--u^u^t^;^.aminopropylammo)propylamino-(amido-)N[[3(('3-butylammopropylaminojprrpyl]-blpomycin, respektive 3-JN-3- [ 2- (p-chlorf enyl) ethylamino ] propyl-N-methylamino]propylammo> (amido ) N-(3-[ 2- (p-chlorf enyl) ethylamino ] propyl-N-methylaminoprOpylj-bleomycin.

Stupeň C

V 8 .ml destilované vody se rozpustí 280 miligramů měď obsahujícího 3-[ (S)-l‘-fenylethylaminr ] propylamino- (amido) N-{3- [ (S)-l‘-fenylethyl ] aminopo opy^e^icmu, který se vyrobí podle stupně B. Roztok se zpracuje tak, aby se odstranila měď, a to způsobem .podle příkladu 1 za použití Amberlitu(R) XAD-2 a 5% vodného roztoku EDTA. . 2 Na. Eluent z kolony se lyofilizuje. Získá se 250· mg (92% výtěžek) bílého amorfního prášku 3-[ (S)-l‘-fenylethylamino]fenylamino-(amido')N^-^j3-[ (S)-l‘-fenyiethylamino]propyl}-bleomycinu.

IC absorpční maxima (Qm-t, měřeno jako KBr-pastilky):

3370, 2975, 2940, 1715, 1660, 1565, 1500, 1455, 1385, 1320, 1255, 1190, 1140, 1100, 1060, 1020, 970, 920, 880, 805, 760, 730· a 695.

Další fyzikálně-chemické vlastnosti jsou uvedeny v· tabulce 2.

Podobným způsobem jako shora uvedeno se další sloučeniny uvedené ve stupni B převedou na formu, která neobsahuje atom mědi. Fyzikálně-chemické vlastnosti těchto sloučenin jsou uvedeny v tabulce 2.

Příklad 4

Roztok 10,22 g 3’aminopropyldimethylaminu ve 100 ml methanolu se zneutralizuje 12 ml ledové kyseliny octové. Ke směsi se přidá 100 g benzaldehydu. K míchané směsi se přidá po částech 8,38 g kyanohydridrbrritanu sodného. Směs se nechá reagovat 16 hodin za teploty místnosti. pH reakční směsi se · upraví na 1 koncentrovanou kyselinu chlorovodíkovou; methanol se · za sníženého tlaku oddestOu^. Odparek se · vytřepe mezi 200· ml vody a 200 ml chloroformu. Vodná vrstva se oddělí a extrahuje 200 mililitry chloroformu. Oddělí se tak benzaldehyd. pH vodné vrstvy se upraví přidáním hydroxidu sodného na 12 a vodná vrstva se pak extrahuje dvakrát 200 ml chloroformu. Chloroformový extrakt se vysuší nad síranem sodným. R^í^^pť^i^ištědlo se· odstraní oddestilováním za sníženého tlaku. Získá se 26 g (92!% výtěžek] [3-(N,J^--^ii^e^tl^^^lc^i^imo)pr opyl ] -dibenzy laminu.

Shora získaný amin se rozpustí ve 100· ml acetonitrilu. K míchanému roztoku se přikape roztok 22,25 g N-(3-brompropyl)ftalimidu ve 100 ml acptrnitrilu. Směs se míchá 18 hodin za teploty místnosti, dokud je přítomen halogenid, což se sleduje chromatografií na tenké vrstvě. Acetonitril se z reakční směsi odstraní ^destilováním za sníženého· tlaku. Zbytek se rozpustí ve 200· ml 6 N kyseliny chlorovodíkové a hydrolyzuje se zahříváním na 110 °C po dobu 8 hodin. Roztok se zhydrolyzovaným produktem ochladí, vysrážená kyselina ftalová se od straní odfiltrováním a roztok se odpaří do sucha. Odparek se rozpustí v destilované vodě a roztok se nechá projít kolonou iontoměniče Dowex^(N)-l (Cl-ty.p, objem 279 ml). Eluent se odpaří do sucha za sníženého tlaku. Získá se 43,7 g trihydrochloridu N{3-[N-( 3-aminopropyl )-N,N-dimethylaminojpropyljdibenzylaminu.

iH-NMR spektrum této sloučeniny (měřeno v deuterované vodě) má následující signály δ (ppm):

2, až 2,7 (4H, m),

2,9 až 3,8 (8H, m),

3,3 (6H, s),

4.6 (4H, m),

7.7 (10H, s), (kde m, respektive s v závorkách znamenají multiplet, respektive singlet). Tyto signály jsou v souhlase se shora uvedenou strukturou. Dálší fyzikáLně-chemické vlastnosti jsou uvedeny v tabulce 8.

Podobným způsobem jako shora uvedeno se získá trihydrochlorid N-{3-[N-( 3-aminopropyl )-N,N-diethylaminojpropyl]dibenzylaminu, jestliže se jako výchozí sloučenina použije 3-aminopropyldiethylaimin. Fyzikálně-chemické vlastnosti jsou uvedeny v tabulce 8.

Příklad 5

Ve 180 ml vody se rozpustí 150 g bis(3-aminopropyljmethylaminu. Pak se přidá 53 g triethylaminu. К roztoku, který se chladí v ledu a míchá, se po částech přidá roztok 83 g (1/3 ekvivalentu) 4,6-dimethyl-2-terc.butoxykarbonylthiopyrimidinu ve 200 mililitrech dioxanu. Směs se nechá reagovat 5 hodin za teploty místnosti. Z reakční směsi se odežene dioxan a triethylamin destilací za sníženého tlaku. Přidáním 6 N kyseliny chlorovodíkové se pH odparku upraví na 2. Po promytí chloroformem se pH vodné vrstvy upraví na 13,5 hydroxidem sodným a vrstva se extrahuje chloroformem. Chloroformová vrstva se vysuší nad síranem sodným. Rozpouštědlo· se za sníženého tlaku oddestiluje. Získá se 60 g (24% výtěžek) (3-terc.butoxykarbonylaminopropyl)-( 3-aminopropyl )-methylaminu (BOC-APMP).

Ve 130 ml methanolu se rozpustí shora získaný BOC-APMP. К roztoku, který se chladí v ledu a míchá, se přidá 69 g (2 ekvivalenty) cyklooktankarboxaldehydu a roztok 10 gramů kyanohydridoboritanu sodného (NaBHsCN) ve 20 ml methanolu. Směs se míchá 24 hodiny za teploty místnosti. Po ukončení reakce se к reakční směsi přidá 30 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové, aby se rozložil nadbytek redukčního činidla a aby se odstranila terc.butoxyskupina. Methanol se odežene oddestilováním za sníženého tlaku. Odparek se smíchá se 400 ml vody, extrahuje se 300 ml chloroformu (aby se odstranil zbylý aldehyd), pH vodné vrstvy se upraví .na 13,5 přidáním hydroxidu sodného a roztok se extrahuje dvakrát 200 ml chloroformu. Chloroformová vrstva, která obsahuje žádaný produkt, se vysuší nad síranem sodným. Chloroform se odežene oddestilováním za sníženého tlaku. Odparek se smíchá se 100 ml destilované vody a s 50 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Odpařením do sucha se získá 66 g (71% výtěžek) N-{3- [ N (3-aminopropyl) -N-methylamino ] propyljcyklooktylaminu jako trihydrochlorid.

^]H~NMR spektrum shora uvedeného produktu (v deuterované vodě) vykazuje následující signály ό (ppm):

1,2 až 2,3 (15H, m),

2,0 až 2,8 (4H, m),

3,0 až 3,9 (10Ή, m),

3,25 (3H, s), (kde mas znamenají jak shora uvedeno).

Tyto signály jsou v souhlase se shora uvedenou strukturou sloučeniny. Další fyzikálně-chemické vlastnosti jsou uvedeny v tabulce 8.

Podobným způsobem jako shora uvedeno se z p-kyanobenzaldehydu a p-chlorfenylacetaldehydu získá trihydrochlorid N-{3-[N-(3-aminopropyl)-N-methylamino ] propylj-p-kyanobe.nzylaminu (81% výtěžek) a trihydrochlorid N-[3-[N-( 3-aminopropyl )-N-methylamino ] propyl}-2- (p-chlorf enyl) ethylaminu [51 % výtěžek). Další fyzikálně-chemické vlastnosti těchto sloučenin jsou uvedeny v tabulce 8.

Příklad 6

Roztok 14,90 g BOC-APMP (který se získá podle prvého stupně příkladu 5) ve 300 ml methanolu se ledovou kyselinou octovou upraví tak, aby jeho· pH bylo ·6,4. К tomuto roztoku, který je chlazen v ledu, se přidá 77,30 g (4 ekvivalenty) 3,4-dibenzyloxybenzaldehydu a pak 5,0 g NaBH3CN. Směs se nechá ohřát na teplotu místnosti. Pak se míchá 96 hodin. Methanol se za sníženého tlaku oddestiluje. Odparek se zředí 200· ml vody (destilovaná) a extrahuje se chloroformem (dvakrát 200 ml). Chloroformové vrstvy se spojí, vysuší nad síranem sodným a zahustí na objem 100 ml. Tento roztok se nechá projít kolonou silikagelu (o objemu 1200 ml). Eluuje se zpočátku chloroformem, takže se žádaná sloučenina adsorbuje na koloně. Adsorbovaná fáze se pak eluuje směsí chloroformu s metha.nolem, přičemž koncentrace methanolu se postupně zvyšuje. Žádaný produkt se z kolony vymývá při koncentraci chloroformu к methanolu 97 : 3. Eluované frakce, které obsahují žádaný produkt, se spojí a zahustí za sníženého tlaku. Získá se 31,43 g 14N-(3-terc.butoxykarbony laminopr opyl ] N-methy lamino ] -3- [ bis(3,4-dibenzyloxybenzyl)amino]propanu jakq olej. K roztoku oleje v 78,6 ml dichlormethanu, který· se chladí ledem a míchá, se přidá 78,6 ml trifluoroctové kyseliny (TFA) po kapkách během 30 minut. Směs se nechá reagovat 1,5 hodiny při teplotě 0 ^C|C. Teplota lázně se pak zvýší na 25 °C. Rozpouštědlo· se za sníženého tlaku oddestiluje. Odparek se smíchá s 200· ml destilované vody a 50 ml 5 N vodného roztoku hydroxidu sodného. Směs se extrahuje 500 ml chloroformu. Získá se 3-;IN[l^-mePhyl-N-(3^t'bis(m,p-dibenzyloxybenzyljaminopropyl) amino .jjpropylaminu (stručně MDD-ami.nj. Vodná vrstva se opět extrahuje chloroformem (100 ml). Chloroformové vrstvy se spojí, vysuší nad síranem, sodným a chloroform se odežene za sníženého tlaku. Získá se 26,30 g surového oleje MDD-aminu. Vyčistění se provede chromatografií na koloně Aniberlitu^(R) XAD-2 (o objemu 2000 ml) následujícím způsobem. Surový olej se rozpustí v 75 ml methanolu. Roztok se smíchá se 750 ml 4% vodného roztoku · octanu draselného a 2% vodného roz toku kyseliny octové (v poměru 1:1) (pufr). Výsledná suspenze se nechá projít shora uvedenou kolonou. Žádaný produkt se adsorbuje na koloně. Shora uvedený pufrovaný roztok se nechá protékat kolonou. K pufru se přidává methanol tak, aby se jeho koncentrace postupně zvyšovala. Žádaný produkt se eluuje z kolony při vzájemném poměru methanolu k pufru 15 : 85. Frakce, které obsahují žádaný produkt (MDD-amín), se spojí, methanol se za sníženého tlaku oddestllujs, pH roztoku se upraví na 13 přidáním 5 N vodného roztoku hydroxidu sodného a výsledný roztok se extrahuje třikrát 300 ml dávkami chloroformu. Chloroformové vrstvy se spojí, vysuší nad síranem sodným, chloroform se oddestiluje za sníženého tlaku a zbytek se vysuší nad kysličníkem fosforečným. Získá se 21,08 g (46,2% výtěžek) olejovitého MDD-aminu. (volná báze). Fyzikádmě-chemcké vlastnosti jsou uvedeny v tabulce 8.

TABULKA 8

Syntetizovaný amin	IC (cm-1, KBr)	1H-NMR+1 (ppm) (60 MHz, D20)	R +2 14 ni	R( +3
trihydrochlori N-	3425, 2975, 2750, 2600, 2000,	2,0 až 2,7 (4H, m)	1,32	0,72
-{3- [ N- (3-aminopro-	1640, 1600, 1480, 1460, 1320,	2,9 až 3,8 (8H, m)
pyl)-N|N-di'methyl-	1350, 1300, 1220, 1190, 1160,	3,3 (6H, s)
aminojpropyljdi-	1120, 1060, 1030, 960, 920,	4.6 (4H, m)
benzylaminu	850, 700	7.7 (10H, s]
trihydrochlorid N-{3-	3425, 2975. 2750, 2600, 2000,	1,4 (6H, t)	1,64	0,81
-[N-(3-aminopro-	1600, 1480, 1450, 1400, 1200,	1.9 až 2,6 (4H, m)
pyl^NjN-diethyl-	1180, 1160, 1120, 1080, 1050,	4.7 (4H, s)
aminojpropyl}-	1020, 990, 960, 900, 800, 740,	7.7 (10H, s)
dibenzylaminu	680
trihydrochlorid N-{3-	3425, 2950, 2875, 2775, 2700,	1,2 až 2,3 (15H, m)	. 1,77	0,30
-(N-(3-amínopro-	2050, 1600, 1480, 1300, 1200,	2,0 až 2,8 (4H, m)
pyl)-N-methylami-	1170, 1140, 1070, 990, 970, 950,	3,0 až 3,9 (10H, m)
nolpropyl)cyklo-	850, 770
oktylmethylaminu
trihydrochlorid N-(3-	3425, 2975 ,2800, 2750, 2675,	2.0 až 2,7 (4H, m)	1,86	0,38
-[N-(3-aminopro-	2250, 2000, 1960, 1840, 1700,	3,0 až 3,8 (8H, m)
pyl)-N-methyl-	1600, 1520, 1300, 1220, 1170,	3,1 (3H, s)
aminojpropylj-fp-	1120, 1060, 1030, 990, 970, 900,	4,5 (2H, s)
-kyanobenzyl)-	860, 830, 760	7,7 až 8,1 (4H, m)
aminu
trihydrochlorid N-{3-	3425, 2975, 2800, 2650, 2500,	2.1 až 2,8 (4H, m)	1,78	0,27
-[N-(3-ammopro-	2000, 1600, 1500, 1460, 1410,	2,9 až 3,9 (12H, m)
pyl)-N-methyl-	1310, 1200, 1160, 1100, 1070,	3.2 (3H, s)
ammo^ropyl-g-	1027. 960, 860, 810, 760, 720,	7,4 až 7,8 (4H, m)
-(p-chlorfenyl)-	650

ethylaminu

3 S 8 Б 8

Syntetizovaný amin	IC (cm1,	KBr)	1H-NMR+1 (ppm) Rin +2 (60 MHz, D20)	Rf +3
3-{N-[N-methyl-N-(3- -bis(m,p-dibenzyloxybenzylamino)pnopyljaminojjpropylamin	690, 730, 790, 805, 850, 905, 1020, 1085, 1130, 1160, 1195, 1220, 12-65, 1380, 1425, 1455, 1510, 1590, 1610, 1650, 1760;·. 1815, 1880, 1960, 2800, 2870; 2940, 3040, 3075, 3375, 3660	1.2 až 1,9 (6H. m) 0,78 1.2 až 1,9 (6H, m) 2,0 až 2,9 (11H, m) 3,43 (4H, s) 5,16 (8H, s) 6,6 až 7,7 (26 H, m)	0,24+1

Poznámka:

^{+ ΐ} m, t a s v závorkách znamená multiplet, triplet, respektive singlet.

^{H 2} Relativní pohyblivost (jestliže relativní pohyblivost alaininu je 1,0] při elektrcforéze na tenké vrstvě [Avicel SR^(K) (FMC Co.), směs kyselina mravenčí — kyselina octová — voda v poměru 27 : 75 : 900 objemovým dílům, 800 V, 6 minut i.

+³ Chromatografie na tenké vrstvě: silikagel 60F 254 (Merck Co.), směs methanol — 10'% vodný roztok octanu amonného — 16% vodný roztok amoniaku (v poměru 1: : 1 : 1 objemovému dílu), ninhydrimová barevná reakce.

Směs methanol — 10% vodný roztok octanu amonného — 10% vodný amoniak (10 : : 1 : 1 objemovému dílu).

Claims (10)

1-f enylethylamino. propyl, di-n-butylaminopropyl, n-butylaminopropylaminopropyl, N-methyl-N-benzyl-N-( dibenzylaminopropyljaminopropyl, nebo

N-methyl-N-(halogenfenylethylaminopropyl) aminopropyl a R znamená

N-methyl-N- (halogenf enylethylaminopropyl) aminopropylaminovou, N-methyl-N-be.nzy 1-N- (dibenzylaminopropyl) -aminopropylaminovou, N-methyl-N-[ bis (m,p-dibenzyloxybenzyl)-aminopropyl ] aminopropylaminovou, N,N-dimethyl-N-( dibenzylaminopropyl)a m in o p r o p у la m in o vo u, N,N-diethyl-N-( dibenzylaminopropyl )aminopropylaminovou,

N-methyl-N-(cyklooktylmethylaminopropyl)aminopropylammovou, nebo

N-methyl-N- (kyanobenzylaminopropyl )aminopropylaminovou skupinu a získané sloučeniny se popřípadě převedou na své soli.

¹ i iN I kde

BM znamená zbytek bleomycinového skeletu,

X znamená alkylovou skupinu s 1 až 18 atomy uhlíku, aminoalkylovou skupinu s 1 až 12 atomy uhlíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku substituovanou 1 až 3 atomy halogenu, 1 nebo 2 fenylovými skupinami, které mohou být substituovány atomem halogenu, indolylovou skupinou, která může být substituována alkoxyskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, furylovou skupinou, pyridylovou skupinou, thiazolylovou skupinou nebo piperidylnvou skupinou, Xi-(Ci—Сб)а1kylovou skupinu, kde Xi znamená skupinu obecného vzorce

Xz —N—Хз

Xz

I —N—Хз

I

X4 až 6 atomy uhlíku, fenylalkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylu nebo mononebo di( Cj. _6) alkylamino (Cj _₆) alkylovou skupinu, která může být substituována fenylovou nebo halogenfenylovou skupinou, Xd znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo fenyUCj-Jalkylovou skupinu, naftylovou skupinu nebo N-fenyl(Ci_₆)alkyl piperidylovou skupinu a

R znamená l-fenylethylaminopropylaminovou skupinu, butylaminopropylaminovou skupinu nebo —NH — (СН2)з—A‘ — (CH2>-B‘ kde

A‘ znamená nebo

IW

I —N-—

Rď

I —NKi Rl?

kde Rio znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku a Rif znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo benzyl, a B‘ znamená skupinu obecného· vzorce

Rď — N-Rď kde Ri2‘ znamená fenyl(Ci_₆)alkylovou skupinu, která může být na fenylová skupině substituována jedním nebo více atomy halogenu, kyanoskupinami nebo benzyloxyskupinami, nebo znamená Ci ^alkylovou skupinu substituovanou cykloalkylovou skupinou s 5 až 13 atomy uhlíku a R13 znamená atom

X2 znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo benzylovou skupinu, Хз znamená alkylovou skupinu s 1 vodíku nebo benzylovou skupinu, která může být substituována jednou nebo dvěma benzyloxyskupinami, nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí, vyznačující se tím, že se sloučenina obecného· vzorce VI (VI) kde BM má výše uvedený význam, R_o znamená 1-fenylethylaminopropylaminovou, butylaminopropylaminovou skupinu nebo skupinu obecného vzorce —NH— (СН;₂)з— A‘— (СН2)з—B‘ kde A‘ znamená skupinu obecného vzorce

Rio‘

I —N— nebo

Rio‘ —Ν'¹' — i

Rn‘ kde Rio‘ znamená C^alkyl a Rn‘ znamená Ci_.₆alkylovou nebo benzylovou skupinu a B‘ znamená skupinu obecného vzorce

Rl3^£ —N—Rď kde Rď znamená fenyl( Cl _₆) alkylovou skupinu, která může být na fenylové skupině substituována jedním nebo více atomy halogenu, kyanoskupinami nebo benzyloxyskupinami, nebo znamená Ci_₆alkylovou skupinu substituovanou cykloalkylovou skupinou s 5 až 13 atomy uhlíku a Rď znamená atom vodíku nebo benzylovou skupinu, která může být substituována jednou nebo dvěma benzyloxyskupinami, a

X_o znamená hydroxylovou skupinu nebo reaktivní derivát karboxylové skupiny, nechá kondenzovat s aminem obecného vzorce do )N-substituovaných bleomycinů obecného vzorce I, vyznačující se tím, že se použije odpovídajícím způsobem substituovaných výchozích sloučenin, za vzniku (amido)N-substituovaných bleomycinů, kde X znamená alkylovou skupinu se 3 až 12 atomy uhlíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, která je substituována 1 až 3 halogenovými atomy, jednou nebo dvěma fenylovými skupinami, methoxyindolylovou skupinou, nebo furylovou skupinou, a dále znamená pyridylovou, thiazolylovou nebo piperidylovou skupinu a ostatní substituenty mají dříve uvedený význam.

1. Způsob přípravy (amido)N-substituovaných bleomycinů obecného vzorce I

CONH^

Clb A^h^co-nh-x

AI-к | N--- _N _ CO-/?

2. Způsob podle bodu 1 pro přípravu (ami236868

N- (C_} _ Jalkyl-N-f enyl- (C i _ ₆) alkyl-N- [ dif emy 1(C| _ β) alkylaminoj C_t _ _G) alkyl ] amino(C₁__ó]alkylovou skupinu, a ostatní obecné symboly mají dříve uvedený význam a získané sloučeniny se popřípadě převedou na své soli.

3. Způsob podle bodu 1 pro přípravu (amido]N-substituoivaných bleomycinů obecného vzorce I, vyznačující se tím, že se použije odpovídajícím způsobem substituovaných sloučenin za vzniku (amido)N-substituovaných bleomycinů, kde X znamená alkylovou skupinu se 3 až 9 atomy uhlíku, trihalogen(Ci„_ó)alkyl, aminoalkyl se 2 až 12 atomy uhlíku, fenyl, Ci^alkyl, halogenfenyl(Ci__óJalkyl, difenylf Ci _ó) alkyl, methoxyindolyl, pyr^dyl (Ci__ó)alkyl, piperidyl(Cj_₆)alkyl, Xi-(Ci __ó)alkyl, kde Xi znamená skupinu obecného vzorce

X2

I —N-Xs •nebo

X?

—N—Хз

X4 kde X₂ znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo benzylovou skupinu, Хз znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, fenyl(Ci_₆)alkylovou skupinu nebo mono- nebo di(Ci_₆)alkylamino(C[_₆)alkylovou skupinu, která mýže být substituována fenylovou nebo halogenfenylovou skupinou a Xd znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo fenyl(Cj-_Ó)alkylovou skupinu, dále znamená thiazolylQvou nebo N-fenyl(Ci__ó)alkylpiperazinylovou skupinu, a ostatní obecné symboly mají výše uvedený význam.

4. Způsob podle bodu 1 pro přípravu (amido)N-substituovaných bleomycinů obecného vzorce I, nebo jejich solí, vyznačující se tím, že se použije odpovídajícím způsobem substituovaných výchozích sloučenin, za vzniku (amido) N-substituovaných bleomycinů, kde Xi(Ci_₆)alkylová skupina znamená mono- nebo diíCj-pJalkylamino-fCi-Gjalkylamino(Ci___ó)alkylovou skupinu, fenyl (Ci _₆)alkylamino( Ci _₆) alkylovou skupinu, di(Ci__ó)al'kylamino( Ci_₆)alkylovou skupinu,

N- [ halogenf enyl (Ci _₆) alkylamino (C_ó-1)alkyl]-N-(Cl _₆)alkylamino(C₁_₆) alkylovou skupinu, nebo

H₂N—X kde X má výše uvedený význam, a je-li to žádoucí, odstraní se měď ze získaného kondenzačního produktu a popřípadě se získaná sloučenina převede na svoji farmaceuticky přijatelnou sůl.

5. Způsob podle bodu 1 pro přípravu (amido )N-substituovaných bleomycinů obecného vzorce I, nebo jejich solí, vyznačující se tím, že se použije odpovídajícím způsobem substituovaných výchozích sloučenin za vzniku (amido )N-substituovaných bleomycinů, kde X znamená alkylovou skupinu se 3 až 10 atomy uhlíku, be.nzyl,

6. Způsob podle bodu 1 pro přípravu (amido ]N-substituovaných bleomycinů obecného vzorce I, nebo jejich solí, vyznačující se tím, že se použije odpovídajícím způsobem substituovaných výchozích sloučenin, kde X znamená isopropyl, n-oktyl, 1-fenylethylaminopropyl, diethylamino-l-methylbutyl .nebo dibutylaminopropylaminopropyl a R znamená 3{N,N-dimethyl-N- [ 3- (dibenzylamino·) propyl ]amino}propylaminoskup inu nebo 3-{N-methyl-N-[3‘-bis(m,p-dibenzyloxybenzyl jaminopropyl ] aminojpropylaminovou skupinu a získané sloučeniny se popřípadě převedou .na své soli.

7. Způsob podle bodu 1 pro přípravu (amido JNsubstituo váných bleomycinů obecného vzorce I, nebo jejich solí, vyznačující se tím, že se použije příslušným způsobem substituovaných výchozích sloučenin za vzniku (amido )N-substituovaných bleomycinů, ve kterých R znamená 3-[N,N-dimethyl-N-[3-(dibenzylamino Jpropyl]-amino},propylaminoskupinu а X znamená 3-[ (SJ-T-fenylethyl]aminopropylovou skupinu, a získané sloučeniny se popřípadě převedou na své soli.

8. Způsob podle bodu 1 pro přípravu (amido )N-substituovamých bleomycinů obecného vzorce I nebo jejich solí, vyznačující se tím, že se použije odpovídajícím způsobem substituovaných výchozích sloučenin za vzniku sloučenin obecného vzorce uvedeného v bodě 1, kde R znamená 3-(N-methyl-N-[SLbisfmjD-dibenzyloxybenzyl) aminopropyl JaminoJpropylaminovou skupinu а X znamená 3-[ (S)-r-fenylethyl]aminopropylovou skupinu a získané sloučeniny se popřípadě převedou na své soli.

9. Způsob podle bodu 1 pro přípravu (amido )N-substituo váných bleomycinů obecného vzorce I nebo jejich solí, vyznačující se tím, že se použije odpovídajícím způsobem substituovaných výchozích sloučenin za vzniku (amido}N-substituováných bleomycinů, kde R znamená 3-{N,N-dimethyl-N-[3-(dibenzylaminojpropyl]-amino-jpropylaminovou skupinu а X znamená n-oktyl a získané sloučeniny se popřípadě převedou na své soli.

10. Způsob podle bodu 1 pro přípravu (amido]N-substituovaných bleomycinů obecného vzorce I nebo· jejich solí, ivyznačující se tím, že se použije odpovídajícím způsobem substituovaných výchozích sloučenin za vzniku (amido) N-substituovaných bleomycinů, kde R znamená 3-{N-methyl-N-[3‘-bis(m,p-dibenzyloxy benzyl) aminopropyl ] amino|propylaminovou skupinu a ostatní substituenty mají výše uvedený význam, a získané sloučeniny se popřípadě převedou na své soli.