NL8204943A

NL8204943A - (amido)n-gesubstitueerde bleomycinen, zouten daarvan en werkwijze voor de bereiding daarvan.

Info

Publication number: NL8204943A
Application number: NL8204943A
Authority: NL
Original assignee: Nippon Kayaku Kk
Priority date: 1981-12-29
Filing date: 1982-12-22
Publication date: 1983-07-18
Also published as: BE895498A; JPS58116496A; ES8402597A1; IT8249764A0; AU555182B2; US4500452A; ZA829529B; DE3248358C2; SE8207409D0; CA1246057A; ATA471482A; GB2112390A; HU187835B; CS236868B2; YU43815B; AR241535A1; CH657140A5; SE8207409L; DK576582A; AU9173282A

Description

r \ - 1 -.9 4 (Amido)N-gesubstitueerde bleomycinen, zouten daarvan en werk- ,· wijze voor de bereiding daarvan.

ί De uitvinding heeft betrekking op nieuwe (amido) N-gesubstitueerde bleomycinen, zouten daarvan en een werkwijze voor de bereiding daarvan.

Bleomycine is een familie van carcinostatische 5 antibiotica, die door Umezawa, één van de onderhavige uitvinders, en medewerkers in 1966 is ontdekt^J.of Antibiotics, 19A, blz. 200 (1966)_7-Het wordt bereid door Streptomyces verti-cillus, een Actinomyceet, en is een basisch, wateroplosbaar glycopeptide dat in staat is gemakkelijk één atoom tweewaar-10 dig koper the cheleren.In een gewone kweek worden 16 leden uit de bleomycine familie gevormd en ze zijn ieder geïsoleerd. /”b.v. Umezawa c.s., J.of Antibiotics, 19A, blz.210 (1966jy*Van deze bleomycinen worden A^ A2, A^ en demethyl-A2 tegenwoordig op ruime schaal gebruikt in de vorm van een 15 koper-vrij mengsel(hierin verder aangeduid als blemycine complex) op klinische terreinen van kankertherapie; meer in het bijzonder worden ze met goed gevolg gebruikt bij de behandeling van geschubde cell carcinomen als hoofddoel, huidkanker, hoofd en nek kanker, longkanker, en maligne lymphoma.

20 Verschillende bleomycinen worden ook beschreven in Amerikaans Octrooischrift 3.922.262 en Amerikaans Octrooischrift Re 30.451.

De bleomycinen worden in het algemeen bereid in koper-bevattende vorm bij de gewone fermentatie.De koper-25 vrije vorm wordt verkregen door het koper uit de koper-bevattende vorm te verwijderen.De uitdrukking "bleomycine", zoals hierin gebruikt, omvat zowel de koper-bevattende als de koper-vrije vorm, tenzij specifiek anders vermeld.

De bleomycinen worden weergegeven door de alge-30 mene formule 2, waarin R een eindstandige aminerest van bleomycine is; en het gecheleerde koper is weggelaten in het geval van de koper-bevattende vorm.

Er is echter gevonden, dat de bleomycinen gedes-aktiveerd worden door de werking van een bleomycine desakti-35 verend enzym^ hierin verder aangeduid als desaktiverend enzym; Umezawa c.s., J.of Antibiotics, Vol.27, blz.419(1974)y · 8204943 • * - 2 - CONHn NH.

i 2 I 2

* CH. NH ^ CH

\r / \ \ XCH CH, CONH.

.......-4------........-......' ? : ch3 η o ί N /\

i L Μ i 3 i ii , N-^rf R

i /V J\ /0 HO CH N C , I |l

I H,N T C O CH C CH NH I N-r\S H

i 1 ' I II I li I I ! 11

i CH. N C CH O CH CH. I I

H CH N CH. HO CH. CH, S H

; I i J j , / CH H · / \ '

, Η O η-N I

' ' I H ;

H0CH2 OH H Η I

\ /iM ? ' ! (2) ? H H /C\0^C\

OH g' g CH2OH

H C OH \ I /

COC I 1 I

H0 /\H

;______________5..-./¾_________________;

Er Is verder gevonden, dat de bleomycinen naar verhouding minder gedesaktiveerd worden in de huid en longen terwijl ze gemakkelijk gedesaktiveerd worden in de maag, waar 5 ze naar wordt aangenomen, geen weking uitoefenen en dat een dergelijk desaktiveringsverschijnsel minder uitgesproken is in de geschubde celcarcinomen bij muizen dan in de sarcomen bij muizen, die beiden worden veroorzaakt door 20-methylcho-lanthreen ^Umezawa c.s., J.of Antibiotics, Vol.25, blz.409 10 (1972; Vol. 27, blz .419 (197 4 )_7-Bovendien is gevonden dat de bleomycine-desaktiverende werking optreedt bij de geschubde cel carcinomen aan hoofd en nek bij de mens, in het bijzonder in de gevallen van het lage differentiatie type, waarvoor werd aangenomen dat de bleomycinen niet zo werkzaam waren 15 /Mueller c.s., Cancer, Vol.40, blz. 2787 (1977)_7 ·

Zoals uit de bovenstaande publikaties te begrijpen valt, zijn de bleomycinen niet in staat een voldoende werking uit te oefenen op carcinomen die een bleomycine-des-aktiverend enzym met hoge werking bevatten.Dit is één van de 20 redenen voor de behoefte aan verdere verbetering van bleomy- 8204943 - 3 - cinen.De onderhavige uitvinders overwogen, dat indien het mogelijk zou zijn een bleomycine derivaat te vinden, dat slechts moeizaam toegankelijk zou zijn voor enzymatische desaktivering, het mogelijk zou worden om b.v. hoofd en nek 5 kanker, slokdarm kanker, longkanker en geschubde cel kanker in andere gebieden doelmatiger te behandelen en om die adenocarcinomen, zoals maagkanker, te behandelen, die geen respons geven op de behandeling met gebruikelijke bleomycinen. Uit dit oogpunt hebben de onderhavige uitvinders een uitvoe-10 rige studie gemaakt en als gevolg daarvan hebben ze gevonden dat de bleomycinen in geringere mate gedesaktiveerd worden als een substituent (-X) wordt ingevoerd aan het stikstofatoom in amide-binding aan de deelstruktuur, 2,3-diaminopro-paanamide NH2 van bleomycinen.Deze uitvinding 15 (-nh-ch2-ch-conh2) berust op deze vaststelling.

Het voornaamste doel van deze uitvinding is om nieuwe bleomycinen te verschaffen die moeilijk gedesaktiveerd kunnen worden door het desaktiverende enzym en een werkwijze 20 te verschaffen voor de bereiding daarvan.

Andere doeleinden en voordelen van deze uitvin- . ding blijken uit de onderstaande beschrijving.

Volgens de uitvinding worden (amido)N-gesubsti-tueerde bleomycinen of zouten daarvan verschaft en een werk-25 wijze voor de bereiding daarvan, waarbij de (amido)N-gesub-stitueerde bleomycinen worden weergegeven door de algemene formule 1 C0NHo NH~ i 2 i 2

CH0 ,NH yCH

V \ / \

CH CH2 nC0-NH-X

(1)

N-t-CO-R

BM— waarin BM een groep van het bleomycineskelet voorstelt? X (a) 30 een alkylgroep met 1-18 koolstofatomen, (b) een aminóalkyl-groep met 1-12 koolstofatomen, (c) een korte keten alkylgroep met als substituent (1) 1-3 halogeenatomen, (2) 1 of 2 fenyl- 8204943 - 4 - groepen, (3) een indolylgroep, of (4) een heterocyclische 5- of 6-ring, die een zuurstof-, zwavel- of stikstogatoom bevat (van de substitutiegroepen kunnen de fenyl- of indolylgroep verder gesubstitueerd zijn door een galogeenatoom of 5 een korte keten alkoxygroep), (d) een X^(korte keten) alkyl-groep/waarin een groep X2 X2 -N-X_ of -N-X, , is, J i -3 X4 X2 een waterstofatoom is, X^ (1) een korte keten alkyl, (2) een fenyl(korte keten) alkyl, of (3) een mono- of di-(korte 10 keten)alkylamino(korte keten)alkyl, die gesubstitueerd kan zijn door een fenyl of halogeenfenylgroep, is, X4 (1) een korte keten alkyl of (2) een fenyl(korte keten)alkylgroep is>7 (e) naftyl, (f) thiazolyl, of (g) een N-fenyl(korte keten)alky lpiperazinylgroep voorstelt; en R een eindstandige amino-15 groep van het bleomycine voorstelt.

De groep van het bleomycineskelet dat wordt aangegeven door BM is het gedeelte van een bleomycine molekuul als omsloten door de stippellijnen in formule 2 van bleo-mycinen en omvat zowel de koper-bevattende als de koper-vrije 20 vorm, tenzij specifiek anders vermeld.De korte keten alkyl-groepen zijn alkylgroepen met 1-6 koolstofatomen, zoals methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, n-pen-tyl,_3-methylbutyl7. 3-methylpentyl en n-hexyl.

Voorbeelden van afzonderlijke groepen die worden 25 voorgesteld door X in de algemene formule 1 zijn als volgt: (a) Alkylgroepen met 1-18 koolstofatomen: methyl, ethyl, n-propyl, isoprpyl, n-butyl, isobutyl, tert.butyl, n-pentyl, 3-methylbutyl, neopentyl, n-heptyl, 3-methylpentyl, n-hexyl, 1,5-dimethylhexyl, isohexyl, n-octyl, n-decyl, lau- 30 ryl, myristyl, cetyl en stearyl.

(b) Aminoalkylgroepen met 2-12 koolstofatomen: 2-ami-noethyl, 3-aminopropyl, 4-aminobutyl, 6-aminohexel, 12-amino-dodecyl, en 4-amino-4-methyl-l-dimethylpentyl.

(c) Korte keten alkylgroepen die als substituenten 35 bevatten (1) 1-3 halogeenatomen, (2) 1 of 2 fenylgroepen, (3) een indolylgroep, of (4) een heterocyclische 5- of 6-ring die een zuurstof- zwavel- of stikstofatoom bevat (van de substitutiegroepen kunnen de fenyl of indolylgroep verder gesubstitueerd zijn door een halogeenatoom of een korte keten 8204943 - 5 - alkoxygroep):2,2,2-trifluorethyl, 2,2,2-trichloorethy1, 2,2-difluorethyl, 2,2-dichloorethyl, benzyl, difenylmethyl, 2-fe-nylethyl, 2,2-difenylethyl, 1-fenylethyl, 1,2-difenylethyl, 3-fenylpropyl, 2-fenylisopropyl, 1,3-difenylpropyl, 3,3-dife-5 nylpropyl, 4-fenylbutyl, 4,4-difenylbutyl, chloorbenzyl, dichloorbenzyl, broorabenzyl, methoxybenzyl, dimethoxybenzyl, ethoxybenzyl, methyleendioxybenzyl, propoxybenzyl, p-chloor-fenylethyl, p-methoxyfenylethyl, p-benzoxybenzyl, furylmethyl, 2-furylethyl, 2-thiazolylmethyl, 2-pyrazolylmethyl, 2-imida-10 zolylmethyl, 4-imidazolylmethyl, 2-thienylmethyl, 2-pyridyl-methyl, 3-pyridylmethyl, 4-pyridylmethyl, 3-indolylmethyl, 2-pyrlmidylmethyl, 2-pyrimidylethyl, 4-pyrimidylmethyl, 4-pyrimidylethyl, 2-piperidyljnethyl, 3-piperidylmethyl, 4-pipe-ridylmethyl, 2-(2-piperidyl)-ethyl, 2-(3-piperidyl)-ethyl, 15 2-(4-piperidyl)-ethyl, 1-(2-piperidyl)-ethyl, 1-(3-piperidyl)-ethyl, l-(4-piperidyl)-ethyl, 2-(piperidino)-ethyl, 2-pipera-zylmethyl, 2-(2-piperazyl)-ethyl, 3-piperidinopropyl, 2-morfo-lino-ethyl, 3-morfolino-pröpyl, 2-morfolinylmethyl, 3-morfo-linylmethyl, 2-(morfolinyl)-ethyl en 3-(morfolinyl)-propyl.

20 (d) Χχ-(korte keten)alkylgroepen (waarin Xi een groep ?3 Ï2

-N-X- of -N-X, is): dimethylaminoethyl, diethylaminoethyl, z I J

X^ dipropylaminoethyl , propylaminoethyl, dimethylaminopropyl, diethylaminopropyl, dipropvlaminopropyl, 25 propylaminopropyl, dibutylaminopropyl, butylaminopropyl, benz-ylaminopropyl, 2-fenylethylaminopropyl, 1-fenylethylaminopro-pyl, 3-fenylpropylaminopropyl, 4,fenylbutylaminopropyl, methyl-aminoethylaminopropyl, ethylcuninopropylaminopropyl, propyla-minopropylaminopropyl, butylaminopropylaminopropyl, N-(butyl-30 aminopropyl)-N-methylaminopropyl, dibutylarainopropylaminopro-pyl, pentylaminopropylaminopropyl, ethylaminobutylaminopropyl, propylaminobutylaminopropy1, ethylaminopropylaminopropy1, butylaminopropylaminobutyl, benzylaminoethylaminoethyl, benzylaminoethylaminopropy1, benzylaminoprcpylaminopropy1, 35 benzylaminobutylaminopropyl, fenylethylaminopropylaminopropy1, N-(fenylethylaminopropy1)-N-methylaminopropy1, N-(chloorbenz-ylaminopropyl)-N-methylpropyl, N-(broombenzylaminopropy1)-N-methylpropyl, N-(chloorfenylethylaminopropyl)-N-methylpropyl, 8204943 - 6 - benzylaminopropyl-N,N-dimethylaminopropyl, dibenzylaminopro-pyl-N,N-diethylaminopropyl en dibenzylaminopropyl-N-methyl-N-benzylaminopropyl.

(e) N-Fenyl(korte keten)alkylpiperidylen: N-benzyl- 5 4-piperidyl, N-fenylethyl-4-piperidyl, N-benzyl-3-piperidyl en N-benzyl-2-piperidyl.

De eindstandige amino groep van bleomycinen als weergegeven door R kan iedere gesubstitueerde of ongesubstitueerde alifatische aminogroep zijn, maar is gewoonlijk een 10 primaire alifatische aminogroep met basisch karakter, weergegeven door de algemene formule 3 R2 - R - NH - (3) waarin R1 (1) een keten van alkyleengroepe is die een stikstofatoom tussen alkyleengroepen kunnen bevatten in de keten 15 ^voorbeelden van een dergelijke groep zijn de groepen als weergegeven door de formules "Ri2“Yi“Ri3~ en -Ri2_Yl’"Rl3''Y2” -Rl4-, waarin R12, Ri3 en Ri4 alkyleengroepen zijn en en Y2 ieder een groep zijn met de formule Rg Rg -N- of -N-i R4 20 (waarin Rg en R. waterstofatomen of korte keten alkylgroepen, die substituenten kunnen bevatten, zijn)/, (2) -N N-, of (3) fenyleen; en R2 één van de groepen met basisch karakter is/voorbeelden van een dergelijke groep zijn die als weergegeven door de formule R,, R_ Rn NH_ , (6 ,7 \ 9 I 2 / -S-R5, -N-Rg, -N-Rg, -NH-C=NH, -N | R5

H

25 -iT}, -n/o , -0-R2'HQ ."V ' ^ de bovenstaande betekenis heeft,; R_, R- en Rn ieder een korte do y keten alkylgroep zijn, die een subsituent kan bevatten; en R^ en Rg ieder een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-10 kool- stofatomen zijn, die een substituent kan bevatten?.De alkyleen 30 groep van de bovenstaande aminogroep bevat 1-8 koolstofatomen, zoals b.v. CHL CH- I 3 j 3 -ch2-, -(ch2)2-, -ch-, -(ch2)3-, -ch2-ch-, -(CH2)4-, “(CH2)g-, -(CH2)g- en -(CH2)g-, ofschoon de alkyleengroepen met 2-4 koolstofatomen het meest worden gebruikt.

De substituenten in de bovenstaande alkylgroepen zijn onder 8204943 - 7 - meer hydroxy, alkoxy (b.v. methoxy, ethoxy, ethoxy, propoxy en butoxy), fenyl^ die één of meer substituenten kan bevatten bestaande uit halogenen, cyaan, korte keten alkylgroepen, benzoxygroepen, en gesubstitueerde(b.v. alkoxy-, fenoxy-, of 5 halogeengesubstitueerde) benzoxygroepen7, en cycloalkylgroepen met 5-13 koolstofatomen.

Voorbeelden van de bovenvermelde aminogroepen zijn 2-aminoethylamino, 3-aminopropylamino, 2-dimethylamino-ethylamino, 2-diethylaminoethylamino, 3-diethylaminopropyΙ-ΙΟ amino, 3-diethylaminopropylamino, 3-(3-butylaminopropyl- amino)propylamino, 3- (2-oxypropylamino)propylamino, 3-piperi-dinopropylamino, 3-(l-fenylethylamino)propylamino, 2-amino-propylamino, 3-methylaminopropylamino, 3-butylaminopropylami-no, 3-(6-aminohexylamino)propylamino, 3-trimethylaminopropyl-15 amino,3-(3-dimethylamino)propylamino, 3-(3-aminopropyl)pro-pylamino, 3-^N-methyl-N-(3-aminopropyl) amino7propylamino, 3-pyrrolidinylpropylamino, 3-piperidinylpropylamino, 3-morfo-linopropylamino, 3-piperazinylpropylamino, 3-/3-(3-aminopro-pylpiperazinyl].7propy lamino, 3-(3-pyrrolidinylpropylamino)-20 propylamino, 3-(3-piperidinylpropylamino)propylamino, 3—(3— morfolinylpropylamino)propylamino, 3-(3-oxypropylamino)propylamino, 3-(3-methoxypropylamino)propylamino, 3-benzylamino-propylamino, m-aminomethylbenzylamino, p-aminomethylbenzyla-mino, 2-cyclopentylaminoethylamino, 3-cyclohexylaminopropyla-25 mino, 4-cyclohexylaminobutylamino, cycloheptylaminopropylami-no, 3-cyclooctylaminopropylamino, 3-/N-methyl-N-(3-cyclooc-tylmethylaminopropyl) amino7propylamino, 3-cyclodecanylmethyl-aminopropylamino, 3-^N-methyl-N-/3-(2-chloorfenylethylamino)-propyl7aminp7propylamino,3-/N-methyl-N-/3-(m,p-dibenzoxy-30 benzyl)aminopropyljaminojpropylamino, 3-$ï-methyl-N-^3-(p~cy-aanbenzylaraino)propyl7amino7propylamino, 3-£N-methyl-N-/3--(cycloundecanylmethylamino)propyl7amino7propylamino, 3-^N--methyl-N-/di(m,p-dibenzoxybenzyl)aminopropyl7amino7propylamino, 3-^N,N-dimethyl-N-/1-(dibenzylamino)propyl7amino7propyl-35 amino, 3-j/N,N-diethyl-N-/3-dibenzylaminopropyl)yamino7propyl- amino, 3_Zji,N-dimethyl-N-/3- (N,N-dimethyl-N- (3-dibenzylamino-propyl)amino)propyl7amino7propylamino, 3-^N,N-dimethyl-N-^3--(N,N-dimethyl-N-(3-cyclooctylmethylaminopropyl)amino)propyl7 aminojpropylamino, 3-(3-dibenzylaminopropy1)piperidylj” 40 propylamino, en 3-^4-/3-(cyclooctylmethylamino)propyl7piperi- 8204943 - 8 - dyl^propylamino.

Als gewenste verbindingen kunnen worden genoemd de verbindingen waarin R een groep 3-/7s)-1'-fenylethyl7amino-propylamino of 3'-(n-butylaminopropyl)aminopropylamino en de 5 verbindingen met een aminerest als weergegeven door formule 4: -NH-(CH2)3-A-(CH2)3-B (4)

Rl0 ?10 /—\ ?10 R10'

waarin A een groep -N- , -N -N N-, of -N ®-(CH0)^,-N

I \_/ I 2 3 I

R11 Rio· Rll' is(waarin R1Q, R^,, R.^,ieder onafhankelijk een korte keten alkyl, benzyl of halogeen-gesubstitueerde benzyl-10 groep is, benzyl of een halogeengesubstitueerd benzylgroep zijn) en B een groep R^3 -N-R12, waarin R^2 (1) een fenyl(korte keten)alkyIgroep, (2) een fenyl(korte keten)alkylgroep met in de fenylkern één of meer substituenten bestaande uit (a) 15 halogenen, (b) korte keten alkylgroepen, (c) korte keten alkoxygroepen, (d) cyaan, (e) trifluormethyl, (f) benzoxy, dat in de fenylkern nog substituenten kan bevatten zoals halogenen alkoxy en fenoxy, (g) di(korte keten)alkylaminogroepen, en (h) fenyl, (3) cyclohexyl, (4) trifenylmethyl, (5) naftyl-20 methyl, (6) furylmethyl, (7) thiofenylmethyl, (8) een korte keten alkylgroep gesubstitueerd door een cycloalkylgroep met 5-13 koolstofatomen of (9) norborneen-2-methylgroep is; en R^3 (1) waterstof, (2) benzyl, of (3) benzyl met in de fenylkern één of meer halogenen of benzoxygroepen als substituent, 25 is.Deze verbindingen zijn gewenst wegens hun betrekkelijk geringe giftigheid voor de longen.In de bovenstaande formules behoren tot de korte keten alkylgroepen methyl, ethyl, en butyl; tot de fenyl(korte keten)alkylgroepen behoren benzyl, 2-fenylethyl, 1-fenylethyl, 3-fenylpropyl, 2,2-difenylethyl 30 en dibenzylmethyl; tot de fenyl(korte keten)alkylgroepen met substituenten in de fenylkern behoden 2-p-chloorfenylethyl, p-chloorbenzyl, o-chloorbenzyl, m-chloorbenzyl, l-(p-chloor-fenyl(ethyl, o,p-dichloorbenzyl, m,p-dichloorbenzyl, p-broom-benzyl, p-fluorbenzyl, pentafluorbenzyl, m-trifluormethyl-35 benzyl, p-methylbenzyl, p-diethylaminobenzyl, p-methoxybenzyl, o,p-dimethoxybenzyl, m,p-dibenzoxybenzyl, p-cyaanbenzyl, en p-fenylbenzyl; en korte keten alkylgroepen, gesubstitueerd door een cycloalkylgroep met 5-11 koolstofatomen zijn onder 8204943 - 9 - meer cyclopentylmethyl, cyclohexylmethyl, cycloheptylmethyl, cyclooctylmethyl, cycloundecanylmethyl en 2-cyclohexylethyl.

Bijzonder wenselijke verbindingen zij de verbindingen met formule 1, waarin R 1-fenylethylaminopropylamino, 5 butylaminopropylamino, of een aminogroep met de algemene formule 5 is -NH-(CH2)3-A1-(CH2)3-B1 (5) R10' ?10' waarin A1 een groep -N- of -N- is (waarin R^q, en R^,

Rll' ieder een korte keten alkyl of benzylgroep zijn) en B een ?13' 10 groep -N-R12, is (waarin Rl2, (U een fenyl(korte keten)alkylgroep, die in de fenylkern één of twee substituenten kan bevatten bestaande uit (a) halogenen, (b) cyaan en (c) benzoxy-groepen, of (2) een korte keten alkylgroep, gesubstitueerd door een cycloalkylgroep met 5-13 koolstofatomen, is; en Rl3, 15 waterstof of een benzylgroep, die één of twee benzoxygroepen als substituenten kan bevatten, is.

De kombinaties van X en R, die een bijzonder geringe giftigheid voor de longen vertonen, zijn als volgt: (AmidoïN-gesubstitueerde bleomycinen waarin X 20 isopropyl, (S)-1-fenylethyl, diethylamino-l-methylbutyl, dibutylaminopropyl, of n-butylaminopropylaminopropylamino is en R 1-fenylethylamino of N-(korte keten)alkyl-N-(halogeen-benzylaminopropyl)aminopropylamino is; zouten daarvan; (amido)N-gesubstitueerde bleomycinen waarin X een alkylgroep 25 met 3-8 koolstofatomen,;1,5-dimethylhexyl, benzyl, 1-fenyl-ethylaminopropyl, di-n-butylaminopropyl, n-butylaminopropyl-aminopropyl, N-methyl-N-Benzyl-N-(dibenzylaminopropyl)amino-propyl, of N-methyl-N-(halogeenfenylethylaminopropyl)amino-propyl is en R N-methyl-N-(halogeenfenylethylaminopropyl)-30 aminopropylamino, N-methyl-N-benzyl-N-(dibenzylaminopropyl)-aminopropylamino, N-methyl-N-^di(m,p-dibenzoxyfenyl)amino-propyl7amj,nopropylamino, N-methyl-N-methyl-N- (dibenzylaminopropyl) aminopropylamino, N-ethyl-N-ethyl-N-(dibenzylaminopropyl) aminopropylamino, N-methyl-N-(cyclooctylmethylamino-35 propyl)aminopropylamino, of N-methyl-N-(cyaanbenzylaminopro-pyl)aminopropylamino is; en zouten daarvan.

8204943 - 10 -

Als voorbeelden van de verbindingen volgens de uitvinding worden de in Tabel A vermelde verbindingen genoemd. In tabel A staat "BLM" in de naam van de verbinding voor bleomycine en de door formule 1 wwergegeven verbinding wordt 5 aangeduid als "betekenis van R(aminorest)-(amido)N-^betekenis van X7- BLM".

8204943 _______ ._.Jf tl ....... ..................

- 11 - O' j «g

5 < ^ W O, < <J 1 W < ¢. N

+j ,< < «c a rtj p4 a fc y

'μ SWArfi W Q H Q E-* O

O 7 "51 M ffl Qi Γτΐ | I I I | | | I I I I · >

u 7* 7* 7 7 | I Μ Π (N N (MINNNNMCMNNN

«5 i k a k k x ia in m ca S22S2SS55S

< ΌΌΌΌ 73¾¾¾¾¾ -0¾¾¾¾¾¾¾¾¾ s a 1 | β

H 3 0 IS

>, £ CQ G Hl si ai -H >1 5 S g ft *

φ 3 I Hl <Ö 0 iJ S

H 03 l\ >, ~ £ « - ö S>, I Hl x: H Cu I S ®

c IS >1 -p >i ~ 's - ö ,J

£ 03 φ Hl -P Φ si Q S Η! 2 ® 'S

J £ I 4-1 >1 Cu 5-1 -P C a >1 Η I Hl α a is. s i λ φ o φ h oqjx β is >, I β) hi J · -p ,c 3 h s i -p i hi ,c

|\ >iBQH (1)£HH >1 3 I'S O 2 IS· ^ jjJ

·—II I Qj ΙΉ^ I O 3 S. m C Η Η H J Hl Β | >! is. o h i i c a S -η φ * „ « * * « * +J 6 r1 j-H | S CO Η I -P μ 4-1 ·Ρ£Ι2^ΧΙΛΑ)7 η α N - Ë IS Φ -Ρ S I 3j3-P0rs-PË>? « j? o e ^ § hi s i a - •PÏÏSÜj'i'S'in

| g 4J m (1) I | >4 rl - ffl Η I I I Ë H >i Ë >, O

SIO W Ifl iw IN ft Ό N I I CSSH’O ^'H'O N

vj 'vj VJ "vj O I ”* IS « I Hl Hl >, I <H >, H (O

2i i i i i μ - - h i co h >i >t c · 5 μ μ 7 £ Z Z Z Z Z & VD CN * ~ O^NQJCMC3>,£ O — λ --- . O * *> -P ^ '-'SCU-I --14-10(4-1

T3OO00 on·* 0 1 | (O φ H - III

Η Η Φ Φ Ό Ό Ό W Η |Ν 10 ΙΗ ΙΗ |Η UQ ΙΦ Η I Ι<Ν Ι£> Ι£*

φ U» gHHHH Η SJ \| \1 \| SI SI sj "'-sj SI SI Si SI SI SI

jq g η E Ë £ ë g I I' I I I II'' ·''''

φ H w 3 3 (d 3 3 Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z IZ

^ c 0ΤΤΤΤ T 0 0 0 0 0 000000000 H G Ο Ο Ο Ο ο Φ Φ Φ Φ Ό 03¾¾¾¾¾¾¾¾

n HCGGG GHH-HHH ^Ti'd‘d-H-H-rHHH

μ gH-H-H-H -H Ë Ë Ë Ë Ë Φ «Ë6SË Ë 3 3 3 3 3 (033333333 > η 3 3 3 3 ιί ν ν 7 τ τ rrrrrrrrr

>ι Η Η Η Η HI I I I I

c λ >ι >i >ι >, >,οοοοο 222222222

3 S> si si si Si XiGGCGG

> (U+J+J+i+J +JHHHHH a-H-HH-rjHHHH

ΙΦΦΦΦ g . -* 3 3 3 3 3 333333333 (O hhhhh£hhhhhh hhhhhhhhh rö >1 >1 >1 >1 >1 1-3 >1 >, >1 >1 >1 >1 >,>1>,>,>1^>1>i>i

Z HHH HHOQH-P-P-P-P-P

oooooio 33333 323322222 ΜΝΝΝΝΙ\ΝΛΛΛΛΛ ΛΛΛΛΛΛΛΛΛ «öiöiöioiöHiröooooosgggoooooo ΦΦΦΦΦ>ιΦ33β3ΰι-30ΰ330ΰΰΰΰ ΗΗ-ΗΗΗΟ,ΗΗΗΗΗ-μΜΗΗΗΗΗΗΗΗΗ ÉË ë S Ë O Ë Φ Φ Φ Φ Φ I ΦΦΦΦΦΦΦΦΦ Η Η Η Η H μ Η Η Η -Η -Η Η IS Η Η -Η Η Η Η Η Η Η I I I I I Oil GGCCCHICCCGGGGCC ..... Ο - 333 3 3>ι333333333 ·* -sr π· *a· G *· 3 3 3 3 3 ft 3 3 3 3 3 3 3 3 3

O' O U OO CnOOOOOOO

I l l l I E l l I l l l μ l l l I I I 1 1 1 (NCNCNCNCN Ιβ N Ί1 <T *»· ^ *T 04τΡ·^,Ί'*3'^Τ*3,·^,τ1'^Γ o, •rl Ό · c μ *HG<HCNH^pin vor-οοσ,ΟΉ (Nn^m^hcomo

JU i—IrH (—I^H^—liHHHfHHCN

μ Φ > 8204943 - 12 - a < < & c ω i< e-< <c Q w (¾ <: N < ft ft (¾

ft |Q < CQ £c < U Eh < ft Q 2 a (¾ 03 Q H

H ft ff) U W G O 2 Ω Q < Q < CQ < < I

I I I 1 I I I 1 I I I I I I I I 04 ft ftftftftftft ftftftftft ft ft ft ft ft h hcliplihww g ω η ω ω ω ω ω ω < ft ftftftftftft ftftftftft ft ft ft ft w 'd 1¾¾¾1¾¾¾ t) fl 13 fl Ό Ό Ό Ό Ό Ό 3 m cq

o ii I

a r I\ i\

G |·5κ HI a HI I I

03 HI >, G >4 — C

I >i G CQ 4-) Η H

l\ I C 4.) I ft >1 Nil s HI H id φ |\ φ G I <0 0 2 G >1 Ο 0 H HI G Η H ^ C ^ CQ N 2 13 φ >, >, Η N >i Φ H 0 1 a c g a c ό c g >ι φ g ft ε ό

l\ I G Ο) 03 G a -H Ο Φ G G M 3 Η (0 H

HI- CQ G I ff) G >. Ό G Φ G Φ G ft Η E

>, h I S-t I CQ X Ο Η Ε Φ ft I ^ >i Φ ft i i\ohii\io CT3HE-H c >i g

HI o >1 HI IN £ -Η I >1 H ft I N 4-) I

GÜ3 >i H }-| >i HI 4-· S“COI H C Φ 0

ft n G fd D >ι Φ <o cn φ ι ή Ό a) H C

Ow £ Ο Φ 3 4-> £ I ** 1W VÖ —' ^ Λ Ό H

Wl φ 1 G <0 O I Γ4-Η*·Ι I 1 I ε M |co lia ID. ICQ IH 10 ILD |H l-H TO |-t I CM ico 12 W «3

\| \J \l \| \J \l \j \J \l \1 \l \l \l \l \l H

II I I I I I I I 1 I I I I I I >1 2 2 222222 22222 2 2 2 ft

0 0 0 0 0 0 0 0 00000 0 0 0 G

ΌΌ 'ΟΌΌΌΌ'Ο Ό'ΟΌΌΌ Ό Ό Τ3 ft * -Η Η Η Η Ή Η Η Η Η Η Η Η Η *Η Η Ή Ι"\ en ε ε εεεεεε εεεεε ε ε ε οι η is ii (β to cd « «ο (β cd co cd co cd co td td c >11 I I I I I I I I I I I I I I ε GOO 000000 00000 O O O td (DCC CGCCCC GGGGG G G C ~

> -Η Ή Η -Η ·Η Η Η Η -Η Η Η Η Η ·Η Η ·Η H

— ε ε ε ε ε ε ε ε ggggg g ε ε >ι

(O (O (O 10 (Ü fO (O (Ö (Ö (Q (O <Ö flJ fö fü (ü CU

Η H rHrHrHfHiHrH rHrHr—IrHrH Ή Ή «H O

>1 >1 >1 >1 >1 >C >1 >1 >1 >1 >1 >1 >1 >1 >1 >1 % rl ft ft ftftftftftft ftftftftft ft ft ft ft φ O O 000000 00000 o o o o

Ggg gggggg ggggg g g g g cd ftfta ftftftftftft d. ft ft ft ft ft ft ft -π E-c O O G O O *—* -—- -—- <—> <—> ' '—' > - ' - ' ·~' ε GGCQGGOOOO 00000 O O O Φ

.H-rCl-HHCGCG GGGGG G G G H

Ë Ë l\ 8 £ Η ·Η Η ·Η ·Η ·Η Η Η ·Η ·Η ·Η ·Η >ι «βΗΐΒίβεεεε εεεεε ε ε ε -g —^ . >, -— td td td td td to td to td td td td 3

HHftHHHi—I Η Η HHHHH i—! * I H G

>1>tO>1>l>l>l>l>1 >1 >1 >1 >1 >t >1 >1 >1 a I

GGMGGGGGG GGGGG G G GGG

GGft4-»GGGGG GGGGG GgG G CQ I

ΦΦΟΦΦΦΦΦΦ φφφφφ Φ G Φ ΦΙΗ HHGHHHHHH HHHHH H ff) H H I''··. ' a >ι>ιΗ>ι>ι>ι>ι>ι>ι3>ι>ι>ι>ι>ι >il >i GGεCGGGCGGCCCGG GI\C G>,2ffl

ΦΦΦΦΦΦΦΦΦίΟΦΦΦΦΦ ΦΗΙΦ Φ G I I

mm-'.GGGGGG I M-fGGGG G>|G G3Hr^

1 I Η I I I I I I l\ I I I I I a I ft I a I G >1 HI

- - >i»_--__ HI - - - - - G - 0 - G - H G >t I—IiHGHiHi—Ii—t I—I >—I >(HiHr-(i—IHCQH $-1 I—I OQ rt >iG ft

I IGI f I I I IGI · I I I * I ft* I IGOJO

φ—— — l\— ^ . ^.G ε G

CQWHWWWWWWOCOCOWWWHIWOWHIWOI ft ww ^www^wwr-jwwwww C —’ >1w 8 12 0 ww^w-w-ww—I ^ I \J Cfi I I φ I I I I I I I I I I 1 I G I ε I I Η I l-rl mnGHroromnHooMHooonH φΗ ton i m I ro\i

ι-H CN Η·<ΐΐΛνθΓ^00 <T\OHCNH ^ 1Λ VO

04CN CN CN IN CN CN CN CNHHCnH CO CO CO CO

8204943 ................................f'\ ' .....

- 13 -

W

CL

U £ Ο. Η SSoqqSo = o « o

ÏnnnnWW W W I I

Cu « ca « « a a R* Ru n n

njjJiJiJiJ iJtJCQCQ

S|ouo|u υ o | |

I I

o 2 c c •Η Ή g s ,

<0 10 I

rH I ιΗ I 0 >1 rv. >i o e I | OU HI Qj G "jj i oio o >ι o -η ε ziGOfil Vi CDU Μ -s

^S3-H G i-i P*s I CL O CL Φ H

0 W g H g Ol S I’S rs p T1 a S S e «o c 3 cn gi o* oi >. o.

Ή tJ H <0 η -HCQG C O C Oi O

6 ‘nl >1 Ή >1 ËJe e5 e 2 α § -Ê CL >. CL <β Γν e 6 -H 6 n'

w 1 o Cl oi'vHiflj mg o & I'S

1 S Ί6> u O U iHI l\ l\ (0 I\ rjs 01 0 J -r CU vu 04 >1 Λ HII ^.1 ΖΓ 'i a Jj

G ffl IN i*S CL Γν ft O >1 >i ^ >u 51 V

-W I 01 0¾ ΓΝ OÏ O L ft 04>1 Oj *^1 _, '§

g |\ G G ol 0 Vu & O p ·£ P

frt f—41 *4 -H C Ή flU O M Ui *P Ui iö J Γ\ h >, I 6,5 6 OCQ, a « a «Η, _ S; g-rS. rv 3 3 £ -5 g g gs § £ ' α

CPOMHI r-HPQI\ Hl g O -H Tj >u 'd nH^U

h l ra >1 >1 1 hi >1 <a ^ £ £ c 6 9 d hi o ia oi ft cli\>i a ~ d. ^ ® ^ ·*< α a ~ >01 GO o Hl CL O H >1 —. —.uu ^ s CL a U G Η P }j >4 o Vu >^ H HVu H hD ^ O 0 ? 1 i §· & o a o 5 ® £ Ê 8 5 ΐ | a | “”s5S5S,§ 5 lïï ï 3 ïft lil

ri!H>iËOQSOH g HG^» — o —» >, (O Η H

>, α (0 I «3 G g <0 >1 O η Η I Η α H g >1 HSo^rv.««Hid ^-.SVr-s-cw c u n c (U O U H rH 1 H g ^ rHSCDlCSC 5S2^Tm

JDVua>i>i>i(OHS>iH'W - Φ 3 Φ I ^ £ d S

Α 040νΛν—>ι3ν{0 I rHU-imULCS — o >1 -Q

EuOGGOGHNCQGI dl Vul Vuw ΜΟΛΛΗ G -Η Φ Μ Φ >i G I Hl l\ O ^ O l\ O I O G Η -P ^

H g Λ ft Λ Λ φ l\ XI HI 0 CO 0 HI 0 in 5 e ? JS T

g (3 VU O VU -P XI HI P >1 H —' H >1 H NJ da. λ d. , Λ §Η0ΰ0ΦΡ>ι0κ£γΛ·0Λΐ Λ « !« £· « Η>,0Η0Η0Λ0Φϋ I 0 0 0 3 Ο Η \J G \j i^XjHgHSO-PHXillHIlOl I I >.101 u-i 3 £ nix; gh Φ43Η a 'ni cl nj q, h Oi-pzl-is

3Λ0—ϋ(ϋΧ:Η0>ιγΐγΐ'-'>ι ΤπΛ- hS

XI I IHIlWO^lélZlZli * "P d. d rn 1 c a >. a I 1 ca4J(N^«»<N4-*rMuJ cn i > h > n c f - £ 2 J Αογογογογφδγο nj^n.

irOl^l^ltMl glOI^I B a \ IC^C l\ m — in φ n 1 in h in h in h in h in I Cp ^ 0 w Φ h 1 I ΜΗΝ«Ν'0ΝθΝ6Ν6ΝΙΖΙ\ΐΌί''ΰ>ι

i2i >ι I co I I I I I φι φ 1 Nj rs I r ιγ I -P

2 I 2 02^2^2^2^2^3 I Hi 2 I 3 I 3 Φ I H I Φ I I I * I - I I I I I in >, I in I in I 10

Η >| H L-l H in Η |H H |H H OH OHSjO.H'^HNJHNJ >, λ >, I >, N >, Nl >, N >1 C >1 G >.1 0 >1 I >1 I >1 I

XJ-PXJ" X! I jD I x; I XJ-HJSHjD 2M£2X33iD3 jj (U-PH4J2-P3-P2-P g-P g+J^a-P^UJ — -P--. φ g φ | φΛφΛφ^Φ (fl Φ (Ο Φ 0 l> Φ 0 00 00

gi e-'ÊogogogHgHg^oig^f^fS

I IZ I ΕΛ 1 Ti I Tl I Ό I >4 I >4 I ·Η G I Η I *H 1 ·η l¾'ί,¾r¾6¾ε¾i¾o¾o¾<

I in I in ι Φ ι (Ο ι Φ I ^'T 7 1 T I T « T

n'vjnNjro'-'n'-'n^'n an an ι ι η ι n η ι οοσ.ΟΗΟιη'ϊΡΐη «xr^oo Γο on 45« >q· 4j< 4^. 4¾. 4j> •’S* 'p 8204943 - 14 - n Pb 0ηΕη<3ΛΕ-·< cq eb ωοοιωοα.

Eb<CCbOÖCbOffl<EH S ω pa I I I I ι ι Cb u I I INNNNNNCQO

eqNNCQCQCQPaoacQ I I

paöCÜQQQOQQOO

EH^E-tSSSHWWUU

sssssswwwss

UTj'öÏflfl'O'Ofl'ü'd II I I

Ο Γ\ O 0 I

c ol c C o I

H G *H S H C 0 £ H £ P3 E Tj fi

td £ td P3 (d II £ -H

H id Η I H I ο Ο I 1 I ® £ >ι IV >, rs >1 o G G Ο 0 0 H (0 a hi a hi a c η h g . g g >i h Ο >1 0 >i Ο -Η £ £ Η Η H £« >1 MDj lb Oi lb £ td td £ £ £ Ο Λ a o a o ft (d η h id <d td p o

PN P «V P Γ\ H >ι >ι Η Η H 04 P

ol 04 ol ο. οι >) a 04 >1 >1 >i rv Λ

G — GOG 04 0 0 a 04 04 ol K

-HO -HGH 0 P P 0 0 0 G Ol

sc £ H £ P 04 Οι P P £ H G

id -H (d £ (d Cb Γν r*S O4 O4 O4 £ H

ιν £ 1vne.1v i*s 01 01 K S rs rv td E

HI (d HI —s| HI 01 G G 01 P3 01 01 IV <d

>1 H >1 H >, G Η H G pa G G HI IV

04 >-t O4 >1 & -Η E £ Η I Η H >1 HI

On 0O4O £ td td G i\ Ë £ O4 >1 P 0 pop td ιν iv id hi 1¾ td Ο O4 ^ a n) a p O4 iv hi hi iv >, iv iv p ^ o

λ Ou Hl É >1 >1SHI04H| hi 2 Oi 2 P

Η 0 H 0 0 0 >1 Η Οι Oi iG >1 0 Oi 0 G Ό GGG O.CQO Ο P3 Ob P G. Oi ffl Ο B ^

^ -H 'w' -H-H-H Ο I P lb I 0 Oi 0 OIGIO

Η E I E £ £ P IV O4 0|I\ b O b M IN h |\ C

d) id in td td <d a hi ^ —* hi Oi G Oi ft hi E hi -h

|> [—I "\J rH H H >—v Nl 0 0 Nl 1 H - - —' In td >1 E

— >, ι >1 >i >1 ooiC coiOEo ο α h Oi td NS N4JN GOH HOCtdG G 0 >1 Ο η < C I GGG H lb E £ P H -- H d ii ^ Ϊ d) H a) -0 i >i Ο H £3 H H 0 £ 0 0 Λ d P ΌΙΌ >iHN N G >1 -P >1 >1 G H G £

—- n n£G G h n d) n N -H >1 Η H

&η I £3 I — I Gtdtu I) £ C H G G E +J £ >1

in I in 1 in d) — .0 X) td d) >ι Φ d) td U <d -P

V| S \I 2 N X) Η -Η Η Η X) G Λ pQHOHO

11 III H >, Ό Ζ d) >1 H d> H H >, 0 >1 0 5 H SHSSd)G-'i4~-Pdl4bdi Ό-ΡΗ-ΡΟ

I >, I >1 I ι-G I (UIPQI GWI'^S'^OOGHS

H.G h x: h pa in 4b in 1 in χ ι 1 i_a l Xi >ι X) 0 PI

>,+j >ι+ι>,ΐΝηΝΝΝΐιηΗΐηΒΐη ι ο ι >1 m

N d) N d> N IV I - I HI I £ V I VI I \l C G ϋ I

G£ GEGHIZhS>iSI I — I rv I I , 1 ·, > 'V

d) I d) I d) >1 I I I -P I H S W S HI S H in -H In HI

Λ IS pQIS^NH-^HOHO I w I >il G Nl G Nl >1 I VI l V l C>iW>iO>i,~H-'H.pH~|'-'|.p si srs<i)x:'-^-Gix:i>ii>iO>bisiso I in s I in I ΙΛ b v 4J IG +J in i in ί 10 Λ in l in l 10

Η VI PI H Vl Η \l Φ » d) V d) V -P VI -P V -P V H VI H V

>1 ι m >1 ι >ii £ η* £ ι £ ι <ui m ι ® ι >* ι ^ ι

,cs I x!SX!SHZHSHZ-hzhzhSj£Sj£S

<D 0 HI 1 £ Ό EOSOSOSOSOSOSO Ed) Ed!

I Η Οι I Η I Η » Η «ι Η » -Η * H *· *H » ·Η I Η I -H

IS £ 0 IS £ IS £ IS £ IS £ IS £ IS £ IS E {S E JS £ |S £ vi to M vj <d Vi fdvjdVifdVifdVitdVifdvitdvidVfd I'—'Oil'^l'-'I'-'l'— I'—-l^—l'—-1--'I"—'I'— mi ιοοιηιηιηιηιηιηιηιηιηι as θΗ(Νη'3,ΐΓ>'ώ(^οοσι ^ji inLnintntnLnininLnin 8204943 -15- ...................................... ra ' .....

< B* Ou ^ ^

04 o W M N

Ou m o ou g g

Ml I I O O

Οι N N tSl N N

i « ffl m cq ω

O Z Z Z Q Q

y y y 1 i I

ίο Φ Ό Ό Ό Ό

O

c

•Η I I I

6 0 0 0 _ id C C C 12 1 Η -Η i-l 1-1 (\ 3 l\ >1 6 6 6 01« 01

O, id n) <d CIC

0 Η Η Η Ή I . i-l

Vu >i >i >i 6 Hl 6 O- Λ Ou Ö4 <d <d rs o o o i\ ou i\ 01 Vu Vu Vu Hl o Hl c Ou ft ft >1 VU >, •h rs r\ α Ou 04 e ol 01 01 0 0 0 jg 2 c C C S Vu C Vu «N J ^ tU ι-ΐ3θ4·Η04

Cu hi S 6 6 6 rn O 6 O

1—1 >t 1 (ö π) idiccc o Ou I's IV. I's. IM\ j - ·Η > O Hl Hl Hl Hl Hl 6 Η β

Vu Vu >» >1 >1 >1 >1 <d >1 <d o α α α Σ λ S4 94 ·~γ ^ ^

> — Ο Ο Μ Ο OOHU-IH

'-'OVuVuCQVu Vu Vu >1 Φ >1 COuftl 04 Ou Ο4 Ν Η Ν <£ *Η -η··* |\ C3 e o 0 hi o o o <u c <ü . _

>-U <d C C >1 C C C Λ Q) X! S

(ÜHHHO4H Η H >1 Ή >1 J

Λ >1 6 6 O 6 6 6 X I X « AJ ,C <d (d Vu «J rO Η H ft H HHNr-UN I's.

φ >, >, Λ Si >, >, C I fi Hl ÊXJNON NJC(D-1<D>1 h+jccc c -ν» λ en λ «u Q) Q) *H (1) (DOiH'-'tUÜ -P Η Λ g ,0 ΛΗΌ'-'ΌΟ

0>iClÖC C >1 I I II

OCnJHitJ id C ft KH Ou IC

O 4) id >1 <d id <u - 's.i - \|

r-l lw >1 4-) >1 >1 Ή 6 I 6 I

0 1 ocoao \ ^ z z

Si - ΙΛι3ι· I — I -*

Ο Ή Oj I O4CQO4HTUOHO

-'I—C'-'I^IOOO'O

1 — I I I I's I — I Η I H

in w in h in nun to in gw g n ^ si Ό "si >, 'si — \j id 'si id I '— 1 — I -4J I '— I '— I '

ZIZIZOZIZIZI

I in I in l 10 I ih> i ο I 0

r-U 'si r-U 'si r-U 'sj r-1 'vj r-U C H C

>1 I >u I >1 I >1 1 >1 -H Tj ΧΧΖΑΖΔΖΑΖΔ 6 £ 6

UJ-1+J—. 4J —« 4J -s UJ id+J id ΟΟΟΟΦΟΟΟΦΗΦΗ 6^36^36^6^36 >i 6 >i I -Η I Η I Η I *H I Ou I CU

12 6 \z e \Z 6 12 6 IS5 0 (Z 0

Viid'uid^Jid'vjid^sJVu^Vu I -— I —- I — I ’—’ I α I 04 ηιηιηιηιηιηι l~li> ........... ............... 1 ' ..............—— ο n cn η ό* m vo vo ό vo vo vo 8204943 - 16 -

De verbindingen als weergegeven door formule 1 worden op de hieronder beschreven wijze bereid.

Een verbinding met onderstaande formule 6 of een reaktief derivaat van de carboxylgroep daarvan laat men kon- ; 5 denseren met een amine(wordt later beschreven): CONH- NH0

I 2 I

CHn NH .CH

\ / \ / \ XCH CH2 C0“xo (6)

N-η—CO-R

N_TT °

i |-^s H

BM— waarin BM een groep van het bleomycineskelèt voorstelt, Rq > een hydroxygroep of een eindstandige aminogroep van bleomycine voorstelt, een hydroxygroep of een groep met de formule -NH-X voorstelt, waarmee tenminste éën van de groepen Rq en XQ de hydroxygroep is, en X (1) een alkylgroep met 1-18 kool-stofatomen, (2) een aminoalkylgroep met 1-12 koolstofatomen, (3) een korte keten alkylgroep met als substituent (a) 1-3 halogeenatomen, (b) 1 of 2 fenylgroepen, (c) een indolylgroep, of (d) een heterocyclische 5- of 6-ring met een zuurstof, zwavel of stikstofatoom (van de substitutiegroepen kunnen de fenyl of indolylgroep verder gesubstitueerd zijn door een halogeenatoom of een korte keten alkoxygroep), (4) X^-korte keten alkylgroep /“waarin X^ een groep X2 X2 -N-X3 of -N-X3 is, X2 een waterstofatoom, een korte keten alkyl of benzylgroep is, X3 (a) een korte keten alkyl, (b) een fenyl(korte keten) alkyl, of (c) een mono- of di-(korte keten)alkylamino(korte keten)alkylgroep is, welke laatste gesubstitueerd kan zijn door een fenyl- of halogeenfenylgroep, X4 (a) een korte keten alkyl of (b) een fenyKkorte keten) alkylgroep is7f (5) naftyl, (6) thiazolyl of (7) een N-fenyl(korte keten)alkylpipera-zinylgroep is.Als XQ in formule 6 de hydroxygroep is, wordt een amine met formule 7 H2N-X (7) (waarin X de bovenstaande betekenis heeft) gebruikt bij de kondensatie, terwijl als Rq in formule 6 de hydroxygroep is 8204943 ...................................tzi......... ...... ... .....

- 17 - en XQ een groep -NH-X is (waarin X de bovenstaande betekenis heeft), een amine wordt gebruikt met formule 7 H - R (7) (waarin R de bovenstaande betekenis heeft).Zo nodig wordt het 5 kondensatieprodukt ontdaan van het koper teninede een (amido) N-gesubstitueerd bleomycine met formule 1 te verkrijgen.Verder kan desgewenst een zout van het (amido)N-gesubstitueerde bleomycine op gebruikelijke wijze worden bereid.

De kondensatie van een verbinding met formule 6 of 10 een reaktief derivaat van zijn carboxylgroep, met een amine met formule 7 of formule 8 wordt uitgevoerd volgens de bekende methode voor het vormen van een zuur-amide binding, in het bijzonder gebruikt in de peptide chemie.Een verbinding met formule 6 laat men reageren met een amine met formule 7 15 of formule 8 in aanwezigheid van die aktiverende reagentia voor carboxylgroepen, die in de peptide chemie worden gebruikt. In plaats daarvan kan de verbinding met formule 1 worden verkregen door reaktie van een amine met formule 7 of formule 8 met een reaktief derivaat van de carboxylgroep van 20 een verbinding met formule 6.De derivaten zijn b.v. een derivaat verkregen door reaktie van een aktiveringsreagens voor de carboxylgroep en de verbinding met formule 6 of een 3-ami-nopropylester van de carboxylgroep van de verbinding met formule 6.Als voorbeelden van de aktiveringsreagentia kunnen 25 worden genoemd 6-chloor-l-p-chloorbenzeensulfonyl-oxybenzo-triazool, N-ethyl-S-fenylisooxazolium-S'-sulfonaat, N-tert.-butyl-5-methylisooxazoliumperchloraat, N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-ihydrochinoline (FEDQ), di-p-nitrofenylsulfiet, tri-p-nitrofenylfosfiet, p-nitrofenyltrichlooracetaat, dicy-30. eiohexylcarbodiimlde (DCC), l-ethyl-3-(2-morfolinoethyl)carbo-diimide, l-cyclohexyl-3-{2-morfolinoethyl)carbodiimide, dife-nylcarbodiimide, di-p-tolylcarbodiimide, diisopropylcarbodi^ imide, difenylfosforazidaat (DPPA) en diethylfosforocyanidaat (DEPC).

35 Als voorbeelden van de reaktieve derivaten van de carboxylgroep van de verbindingen met formule 6 kunnen worden genoemd reaktieve derivaten verkregen door de reaktie van de bovengenoemde reagentia met de carboxylgroep; reaktieve derivaten van de carboxylgroep verkregen door het gezamenlijk 40 gebruik van de reaktieve reagentia en de kondensatie toevoeg- 8204943 - 18 - seis, zoals b.v. p-nitrofenol, o,p-dinitrofenol, pentachloor-fenol, 2,4,5-trichloorfenol, pentafluorfenol, N-hydroxysuc-cinimide, 1-hydroxybenztriazool, N-hydroxy-5-norborneen-2,3-dicaboximide; 3-aminopropyl ester van de carboxylgroep van 5 de verbinding met formule 4, en monogesubstitueerde 3-aminopropyl esters, zoals b.v. de 3-acetylaminopropyl ester, 3-succinylaminopropyl ester, 3-benzoylaminopropyl ester, 3-benzylaminopropyl ester, 3-p-tolueensulfonylaminopropyl ester, 3-(2,4-dinitrofenyl)aminopropyl ester, 3-(3,5-dimethyl-3-oxo-10 cyclohexen-l-yl)aminopropyl ester, 3-(tert.butoxycarbonyl) aminopropyl ester en 3-(salicylideen)iminopropylester.

De kondensatie wordt in het algemeen uitgevoerd in een oplosmiddel.Het oplosmiddel kan ieder type zijn dat de reaktie niet beïnvloedt, maar het verdient de voorkeur een 15 polair oplosmiddel te gebruiken, dat de verbinding met formule 6, die als uitgangsmateriaal wordt gebruikt, oplost.Voorbeelden van dergelijke oplosmiddelen zijn water, dimethylform-amide, dimethylaceetamide, acetonitril en mengsels daarvan.

De mol.verhouding van het amine met formule 7 of formule 8 20 tot de verbinding met formule 6 bedraagt in het algemeen ongeveer 0,5 tot 20, bij voorkeur 1-10.Ofschoon de reaktietem-peratuur afhangt van de aard van het gebruikte oplosmiddel en andere omstandigheden, is deze toch in het algemeen -15° tot 45°C, bij voorkeur -10° tot 30°C.De reaktieduur bedraagt 1-70 25 uur.De werkwijze volgens de uitvinding wordt hieronder nader beschreven.

De koper-bevattende vorm van de verbinding met formule 6 en zo nodig het hierboven vermelde toevoegsel, worden opgelost in water, dimethylformaldehyde, acetonitril of een 30 mengsel daarvan.Aan de oplossing wordt het bovenvermelde aktiveringsreagens toegevoegd onder roeren bij -5° tot 15°C.

Zo nodig wordt het mengsel ingesteld op een pH die geschikt is voor het aktiveren met een anorganisch zuur of base, zoals zoutzuur of natriumhydroxide, of met een organische base, 35 zoals triethylamine of N-methylmorfoline.Het amine bestanddeel wordt dan als zodanig of in een oplossing met ingestelde pH, toegevoegd aan het mengsel.Het verkregen mengsel wordt geroerd en desgewenst wordt de pH op overeenkomstige wijze als hierboven beschreven ingesteld.Het roeren wordt voortge-40 zet gedurende 1-70 uur waardoor de beoogde verbinding volgens 8204943 — 1. t%—;—: - 19 - de uitvinding wordt verkregen.

Isolatie van het aldus gevormde derivaat geschiedt op de onderstaande manier.Een organisch oplosmiddel zoals aceton of ether wordt aan het reaktiemengsel toegevoegd om het 5 beoogde produkt te laten neerslaan.Het neerslag wordt opgelost in gedestilleerd water, daarna ingesteld op pH 6 en ter ontzouting door een kolom gevoerd, die gepakt is met een adsorberende hars, zoals b.v. Amberlite ® XAD-2 (Rohm en Haas Co.) in gedestilleerd water om adsorptie van het beoogde pro-10 dukt op de hars tot stand te brengen.De kolom wordt gewassen met gedestilleerd water om het zout te verwijderen en geëlu-eerd met een aangezuurde waterige methanol, zoals een mengsel van 1/50 n zoutzuur en methanol (1:4 op vol.basis) om de frakties te verzamelen die een absorptiemaximum hebben in de 15 buurt van een golflengte van 290 nyu.De gekombineerde fraktie wordt geneutraliseerd met Dowex ® 44 (een OH-type anionen uit-wisselingshars van Dow Chemical Co.), daarna geconcentreerd onder verlaagde druk, en gelyofiliseerd ter verkrijging van een ruw poeder van het derivaat.In sommige gevallen kan de 20 ontzoutingstrap achterwege worden gelaten en kan de oplossing van het neerslag in gedestilleerd water rechtstreeks aan de tweede trap van de behandeling worden onderworpen.

In de tweede trap wordt de oplossing van ruw poeder in gedestilleerd water door een kolom gevoerd, die gepakt is 25 met CM-Sephadex ® C-25 (Na+ type; Pharmacia Fine Chemicals Co.), dat in evenwicht is gebracht met een 1/20 molaire azijn zuur-natriumacetaat bufferoplossing (pH 4,5) om adsorptie van het beoogde produkt tot stand te brengen.De geadsorbeerde fase wordt dan geëlueerd met de lineaire concentratiegradient 30 techniek, die wordt uitgevoerd door kontinu natriumchloride toe te voegen aan de bovengenoemde bufferoplossing teneinde de natriumchlorideconcentratie geleidelijk op te voeren tot 1,0 mol.In deze trap vertonen de niet-gereageerde reaktie-deelnemers en de nevenprodukten de neiging om in het begin-35 stadium te worden geëlueerd en kunnen worden afgescheiden met behulp van een u.v.absorptiemonitor.Als de fraktie van het beoogde produkt verontreinigd blijkt te zijn door onzuiverheden, wordt de chromatografie herhaald om alle onzuiverheden te verwijderen.

40 In plaats van de bovenstaande chromatografie kan 8204943 - 20 - een andere methode van chromatografische zuivering worden uitgevoerd door gebruik te maken van b.v, een adsorberende hars Amberlite ® XAD-2.De waterige oplossing van het ruwe produkt wordt door de kolom gevoerd, die gepakt is met de 5 hars in een bufferoplossing, zoals b.v. 1% waterige ammonium-acetaatoplossing om adsorptie van het beoogde produkt tot stand te brengen.De geadsorbeerde fase wordt geëlueerd met de lineaire concentratiegradient techniek, waarin methanol kon-tinu wordt toegevoegd aan de bufferoplossing om de methanol-10 concentratie geleidelijk te verhogen.Daar de niet-gereageerde reaktiedeelnemers de neiging vertonen in het vroege stadium te worden geëlueerd, en de voornaamste nevenprodukten in een later stadium, kunnen deze worden afgescheiden met behulp van een u.v. monitor.Indien de beoogde frakties verontreinigd 15 blijken te zijn door onzuiverheden, kunnen deze laatsten volledig worden verwijderd door de chromatografie te herhalen.

De bovenstaande twee typen chromatografie worden ieder afzonderlijk of in kombinatie uitgevoerd.De gezuiverde fraktie, die het beoogde produkt bevat, wordt ontzout door 20 gebruik te maken van de adsorberende hars, zoals b.v. Amberlite ® XAD-2, en gelyofiliseerd waardoor een blauw, amorf poeder wordt verkregen van een koper-bevattend (amido)N-ge-substitueerd bleomycine.De koper-vrije vorm wordt verkregen volgens een bekende methode, zoals de methode waarin EDTA 25 wordt gebruikt, zoals beschreven in Japanse Octrooipublikatie Nr. 31.875/77.Een voorbeeld van de methode voor het verwijderen van het koper wordt hieronder beschreven.

Het koper-bevattende produkt wordt opgelost in gedestilleerd water en de verkregen oplossing wordt door een 30 kolom gevoerd, die gepakt is met Amberlite XAD-2 in gedestilleerd water om adsorptie van het koper-bevattende produkt tot stand te brengen.De hars wordt dan gewassen met een waterige oplossing die natriumchloride en 5% dinatriumzout van ethyleendiaminetetraazijnzuur(afgekort EDTA.2Na) bevat, om 35 het koperion door EDTA.2Na af te voeren waarbij het koper-vrije (amido)N-gesubstitueerde bleomycine geadsorbeerd op de hars achterblijft.De hars wordt dan gewassen met een natrium-chlorideoplossing om EDTA.2Na te verwijderen, daarna met gedestilleerd water en tenslotte geëlueerd met een aangezuurde 40 waterige methanol, zoals b.v. een 1/50 n waterig zoutzuur - 8204943 _·........JU»___ . - . — _ ..... ...... ......· - 21 - methanol (1:4 op vol.basis) mengsel om de frakties te verzamelen die een absörptiemaximum hebben van omstreeks 290 mp.

De gekombineerde frakties worden ingesteld op pH 6,0 met Dowex ® 44 (OH type? Dow Chemical Co.), geconcentreerd onder 5 verlaagde druk en gelyofiliseerd waardoor een wit, amorf poeder wordt verkregen van een koper-vrij (amido)N-gesubsti-tueerd bleomycinehydrochloride.Als natriumsulfaat en waterig zwavelzuur worden gebruikt inplaats van het natriumchloride en waterig zoutzuur, wordt een sulfaat verkregen.Zo kan 10 ieder gewenst zout worden verkregen door de keuze van zout en zuur in de elutietrap.Als voorbeelden van zouten die op een dergelijke wijze zijn verkregen kunnen worden genoemd acetaat tartraat, citraat, maleaat en lactaat naast het hydrochloride en sulfaat.

15 Als het op bovenbeschreven wijze bereide (amido)N- gesubstitueerde bleomycine wordt onderworpen aan hydrolyse met 6 n waterig zoutzuur bij 105°C gedurende 20 uur, worden behalve het amine R-H en X-N^ of een ontledingsprodukt van dat amine, in sommige gevallen de ontledingsprodukten aange-20 troffen die gebruikelijk zijn voor bleomycine, waaronder L-threonine, β-aminoft-(4-amino-6-carboxy-5-methylpyrimidin-2-yl)propionzuur, 4-amino-3-hydroxy-2-methyl-n-pentaanzuur, β -hydroxy-L-histidine,(3 -amino-L-alanine en 2'-(2-amino-ethyl)-2,4'-bithiazool-4-carbonzuur.Dit feit is een ondersteu 25 ning dat het (amido)N-gesubstitueerde bleomycine de chemische struktuur heeft als weergegeven door formule 1.

In formule 6 van verbinding die als uitgangsmateriaal worden gebruikt, wordt, als XQ een hydroxygroep is en R een eindstandige aminogroep van belon nmycinen is, een deami-30 dobleomycine (koper-bevattende vorm) verkregen met formule 6a CONH- NH- i 2 i 2

CH, NH CH-CO-OH

\2 / \ / CH CH- (6a)

N--rj-CO-R

N-Π-Jk

S

waarin BM en R de eerder vermelde betekenis hebben.Het wordt bereid door hydrolyse van koper-vrije bleomycinen met formu- 8204943 - 22 - le 2 met een desaktiverénd enzym van de rat of het op overeenkomstige wijze geëxtraheerde uit runder- of varkenslever.

Zo wordt b.v. een runderlever gehomogeniseerd in een fosfaatbufferoplossing en gecentrifugeerd bij 3000 rpm.

5 De bovenstaande vloeistof wordt gedialyseerd tegen een fos-faatbuffer om een ruwe enzymoplossing te verkrijgen.Aan deze enzymoplossing wordt een bleomycineoplossing in een fosfaat-buffer toegevoegd.Het mengsel laat men 5-48 uur bij 37°C reageren en het reaktiemengsel wordt met geschikte methoden 10 ontdaan van eiwit /""het eiwit kan b.v. worden verwijderd door trichloorazijnzuur (afgekort TCA) tot een concentratie van 5% toe te voegen om het eiwit neer te slaan, het neerslag af te scheiden door centrifugeren en het neerslag drie maal te wassen met een 5% TCA-oplossing om de wassingen te verzame-15 Ien7-Het eiwit-vrije mengsel wordt geneutraliseerd, gemengd met overmaat koperacetaat om het beoogde produkt om te zetteh in een koper-chelaat.Ter ontzouting wordt het koper-chelaat door een kolom gevoerd, die gepakt is mét een adsorberende hars, Dowex ® HP 40, in gedestilleerd water om adsorptie van 20 het beoogde produkt tot stand te brengen.De zouten worden weggewassen met gedestilleerd water en de geadsorbeerde fase wordt geëlueerd met een ï/50 n zoutzuur - methanol (1:4 op vol.basis) mengsel om frakties te verzamelen die een absorb-tie maximum van omstreeks 290 πνα hebben.De verzamelde frak- 25 ties worden geneutraliseerd met een anionen uitwisselings- iR' hars, Dowex 44 (OH type, Dow Chemical Co.), onder verlaagde druk geconcentreerd en gelyofiliseerd.Het verkregen poeder wordt opgelost in gedestilleerd water en door een kolom ge-voerd die gepakt is met CM-Sephadex ^ C-25 (Na type;Pharma-30 cia Fine Chemicals Co.), die in evenwicht zijn gebracht met een 1/20 azijnzuur-natriumacetaatbuffer oplossing met pH 4,5 om adsorptie tot stand te brengen.De geadsorbeerde fase wordt geëlueerd met de lineaire concentratiegradient methode waarin natriumchloride kontinu wordt toegevoegd aan boven-35 staande bufferoplossing om de natriumconcentratie geleidelijk te verhogen tot 1,0 mol.De eluaatfrakties, blauw van kleur, die het beoogde produkt bevatten, worden verzameld, ontzout met de Diaion ® HP 40 ontzoutingsmethode, zoals boven beschreven, en gelyofiliseerd waardoor een blauw, amorf poeder 40 van koperbevattende deamidobleomycinen wordt verkregen.

i 8204943 - 23 -

Als XQ een groep -NH-X is, waarin X de bovenstaan de betekenis heeft, en RQ een OH-groep is in formule 6 van de als uitgangsmaterialen gebruikte verbindingen, wordt de formule die van een (amido)N-gesubstitueerd bleomycinezuur: 5 CONH, NH0 I 2 I 2

CH0 NH .CH

V2 / \ /\

CH >CH2 CO-NH-X

(6b)

N-n—COOH

rr1^ waarin BM de bovenstaande betekenis heeft.Een voorbeeld van de werkwijze voor de synthese daarvan wordt hieronder vermeld.

Met gebruikmaking van het bovengenoemde desakti-10 verende enzym wordt bleomycine B2, een bekende verbinding, omgezet in deamidobleomycine B2 een deamidobleomycine met formule 6 waarin RQ agmantine is.Dit deamidobleomycine laat men reagéren met een amine met formule 7 zoals hierboven beschreven om een (amido)N-gesubstitueerd bleomycine B2 te vor-15 men waarin Rq agmantine is, waarna de verkregen verbinding wordt gehydrolyseerd door gebruik van een bekend schimmel-mycelium ^b.v. IFO 8502, gedeponeerd bij het Institute for Fermentation, Osaka7waardoor het beoogde produkt wordt verkregen.

20 Deamidobleomycinezuur, weergegeven door formule 6c: CONH, NH, I 2 I 2

CH, NH CH

^ / \ / \

nCH CH, COOH

1 (6c)

N-pp COOH

is een uitgangsmateriaal met formule 6 waarin beide groepen XQ en Rq hydroxygroepen zijn.Het wordt gevormd door een bekend bleomycinezuur (zie Amerikaans Octrooischrift 3.886.133) 25 te hydrolyseren met het bovengenoemde desaktiverende enzym.

Het wordt ook verkregen door hydrolyseren van deamidobleomy- 8204943 - 24 - cine B2 met formule 6a, waarin R agmantine is, door de bovengenoemde schimmelcel te gebruiken.

Als voorbeelden van de aminen met formule 7 kunnen worden genoemd methylamine, ethylamine, n-propylamine, 5 isopropylamine, n-butylamine, isobutylamine, tert.butylamine, n-pentylamine, 3-methylbutylamine, neopentylamine, n-heptyl-amine, 3-methylpentylamine, n-hexylamine, 1,5-dimethylhexyl-amine, isohexylamine, n-octylamine, n-decylamine, laurylamine, myristylamine, cetylamine, stearylamine, 2-aminoethylamine, 10 3-aminopropylamine, 4-amino|>utylamine, 61aminohexylamine, 12-aminododecylamine, 4-amino-4-methyl-l-dimethylpentylamine, 2,2,2-trifluorethylamine, 2,2,2-trichloorethylamine, 2,2-di-fluorethylamine, 2,2-dichloorethylamine, benzylamine, dife-nylmethylamine, 2-fenylethylamine, 2,2-difenylethylamine, 15 1-fenylethylamine, 1,2-difenylethylamine, 3-fenylpropylamine, 2-fenylisopropylamine, 1,3-difenylpropylamine, 3,3-difenyl-propylamine, 4-fenylbutylamine, 4,4-difenylbutylamine, chloorbenzylamine, dichloorbenzylamine, broombenzylamine, methoxybenzylamine, dimethoxybenzylamine, ethoxybenzylamine, 20 methyleendioxybenzylamine, propoxybenzylamine, p-chloorfenyl-ethylamine, p-methoxyfenylethylamine, p-benzoxybenzylamine, furylmethylamine, 2-furylethylamine, 2-thiazolylmethylamine, 2-pyrazolylmethylamine, 2-imidazolylmethylamine, 4-imidazo-lylmethylamine, 2-thienylmethylamine, 2-pyridylmethylamine, 25 3-pyridylmethylamine, 4-pyridylmethylamine, indolylmethyl-amine, indolylethylamine, 4-methoxyindolylmethylamine, 2- pyrimidylmethylamine, 2-pyrimidylethylamine, 4-pyrimidyl-methylamine, 4-pyrimidylethylamine, 2-piperidylmethylamine, 3- piperidylmethylamine, 4-piperidylmethylamine, 2-(2-piperi-30 dyl)ethylamine, 2-(3-piperidyl)ethylamine, 2-(4-piperidyl)- ethylamine, 1-(2-piperidyl)ethylamine, 1-(4-piperidyl)ethylamine, 2-(piperidine)ethylamine, 2-piperazylmethylamine, 2- (2-piperazylethyl)amine, 2-(piperidino)ethylamine, 3-pipe-ridionpropylamine, 2-(morfolino)ethylamine, 3-(morfolino)pro- 35 pylamine, 2-morfolinylmethylamine, 2-(norfolinyl) ethylamine, 3- (morfolinyl)propylamine, dimethylaminoethylamine, diethyl-aminoethylamine, dipropylaminoethylamine, propylaminoethyl-amine, dimethylaminopropylamine diethylaminopropylamine, dipropylaminopropylamine, propylaminopropylamine, dibutyl- 40 aminopropylamine, butylaminopropylamine, benzylaminopropyl- 8204943 Γ7__________:..x.*s .......

- 25 - amine, 2-fenylethylaminopropylamine, 1-fenylethylaminopropy1-amine, 3-fenylpropylaminopropylamine, 4-fehylbutylaminopro-pylamine, methylaminoethylaminopropylamine, ethylaminopropyl-aminopropylamine, propylaminopropylaminopropylamine, butyl-5 aminopropylaminopropylamine, N-(butylaminopropy1)-N-methyl-aminopropylamine, dibutylaminopropylaminopropylamine, pentyl-aminopropylaminopropylamine, ethylaminobutylaminopropylamine, propylaminobutylaminopropylamine, ethylaminopropylaminobutyl-amine, butylaminopropylaminobutylamine, benzylaminoethylamino 10 ethylamine, benzylaminoethylaminopropylamine, benzylaminopropy laminopropylamine, benzylaminobutylaminopropylamine, fenyl-ethylaminopropylaminopropylamine, N-(fenylethylaminopropyl)-N-methylaminopropylamine, N-(chloorbenzylaminopropyl)-N-methylaminopropylamine, N-{broombenzylaminopropyl)-N-methyl-15 aminopropylamine, N- (chloorfenylethylêiminopropyl)-N-methyl-aminopropylamine, dibenzylauninopropyl-N,N-dimethylaminopro-pylamine, dibenzylaminopropyl-N,N-diethylaminopropylamine, dibenzylaminopropy1-N-methy1-N-benzylaminopropylamine, ct-naftylamine, β -naftylamine, 2-thiazolylamine, 3-thiazol-20 ylamine, 4-thiazolylamine, N-benzyl-4-piperidylamine, N-fe-nylethyl-4-piperidylamine, N-benzyl-3-piperidylamine, en N-benzyl-2-piperidylamine.

Gewenste aminen met formule 8 zijn die alifati-sche primaire aminen, die ee basische groep bevatten naast 25 de aminogroep die aan de reaktie deelneemt.Als voorbeelden van dergelijke aminen kunnen worden genoemd 2-aminoethylamine 3-aminopropylamine, 2-dimethylaminoethylamine, 2-diethylami-noethylamine, 3-dimethylaminopropylamine, 3-diethylaminopro-pylamine, 3-(3-butylaminopropylamino)propylamine, 3-(2-hydro-30 xypropylamino)propylamine, 3- piperidinopropylamine, 3-(l-fe-nylethylamino)propylamine, 2-aminopropylamine, 3-methylamino-propylamine, 3-butylaminopropylamine, 3-(6-aminohexylamino)-propylamine, 3-trimethylaminopropylamine, 3-(3-dimethylamino-propylamino)propylamine, 3-(3-aminopropylamino)propylamine, 35; 3-^N-methyl-N-(3-aminopropy1)amino7propylamine, 3-pyrrolidi-nylpropylamine, 3-piperidinylpropylamine, 3-morfolinopropyl-amine, 3-piperazinylpropylamine, 3-/4-(3-aminopropy1)pipera-zinyl7propylamine, 3-(3-pyrrolidinylpropylamino)propylamine, 3-(3-piperidinylpropylamino)propylamine, 3-(3-morfolinyl-40 propylamino)propylamine, 3-(3-hydroxypropylamino)propylamine, 8204943 - 26- 3-(3-methoxypropylamino)propylamine, 3-benzy land, nopropyl amine, m-aminométhylbenzylamine,p-aminomethylbenzylamine, 2-cyclo-pentylaminoethylamine, 3-cyclohexylaminopropylamine, 4-cyclo-hexylaminobutylamine, cycloheptylaminopropylamine, 3-cyclo-5 octylaminopropylamine, 3-/N-methyl-3-N-(cyclooctylmethylamino-propyl)amino7propylamine, 3-cyclododecanylmethylaminopropyl-amine, 3-/N-methyl-N-/3-(2-p-chloorfenylethylamino) prop^l/-amino^propylamine, 3-/N-methyl-N-/3-(m,p-dibenzoxybenzyl)ami-nopropyl7amino^propylamine, 3-/N-methyl-N-/3- (p-cyaanbenzylami-10 no)propyl7amino^propylamine, 3-/N-methyl-N-/3-(cycloundecanyl-methylamino)propyl7amino/propylamine, 3-/N-methyl-N-/di(m,p-dibenzoxybenzyl)aminopropyl7amino7propylamine, 3-/N,N-dimethyl -N-/3-(dibenzylamino)propyl7amino/propylamine, 3-/N,N-diethyl--N-/3-(dibenzylamino)propyl7amino7propylamine, 3-/N,N-dimethyl 15 -N-/3-(N,N-dimethyl-N-(3-dibenzylaminopropyl)amino)propyl7-amino^propylamine, 3-/N,N-dimethyl-N-/3-(N,N-dimethyl-N-(3-cy-clooctylmethylaminopropyl)amino)propyl7araino^propylamine, 3-/4-(3-dibenzylaminopropylamino)piperidyl7propylamine, en 3-/4-(3-cyclooctylmethylaminopropyl)piperidyl7propylamine.

20 Van de aminen met formule 8 zijn de door de onder staande formule weergegeven verbindingen nieuwe verbindingen, die voor het eerst door de uitvinders gesynthetiseerd zijn: NH2-(CH2)3-A'-(CH2)3-B' (9) *10’ ^ waarin A' een groep -N- of -N - voorstelt, waarin Rio' en

Rll' 25 i ieder een korte keten alkyl of benzylgroep zijn en B' di/fenyl(korte keten)alkyl7amino, cyaanfenyl(korte keten)alk-ylamino,cycloalkyl(met 5-13 koolstofatomen)-gesubstitueerde korte keten alkylamino of di-/dibenzoxyfenyl(korte keten)-alkyl7aminogroep is.Deze verbindingen worden gesynthetiseerd 30 door hydrolyse van de verbinding als weergegeven door formule 10: Y-(CH2)3-A'-(CH2)3-B' (10) waarin A' en B' de bovengenoemde betekenis hebben en Y een beschermde aminogroep is, om de beschermende groep te verwijderen. Ofschoon de hydrolyse plaats vindt in aanwezigheid van 35 hetzij een zuur of een base, wordt in het algemeen toch de voorkeur gegeven aan een zuur zoals zoutzuur.

Van de uitgangsmaterialen met formule 10 worden 8204943 ~ . ...................................i*l ......... ..........-...... .....-......... .

- 27 - de verbindingen met formule 11: R10' R12" ï-(CH2)3-N©-(CH2)3-N (11) rii· Ri3" waarin RlQi, R1JL, en Y de bovenstaande betekenis hebben en R12" en Rl3" ie(*er een fenyl(korte keten)alkylgroep zijn, 5 op de volgende wijze bereid.

Een 3-aminopropyl-N,N-dialkylamine met formule 12: R10' NH2-(CH2)3-N-R11, (12) waarin R1Q, en R^, de bovenstaande betekenis hebben, wordt onderworpen aan reduktieve kondensatie met benzaldehyde of 10 een fenyl(korte keten)aldehyde.Het reaktiemengsel wordt alkalisch gemaakt en geëxtraheerd met een organisch oplosmiddel om een N',N'-dibenzylaminopropyl-N,N-dialkylamine te verkrijgen met formule 13: R. η , R,*·, f 11' 112 R10I-N-(CH2)3-N-R13„ (13) 15 waarin R1QI, Rj^, , Ri2" en R13" bovenstaande betekenis hebben.Het verkregen amine laat men reageren met 3-halogeen-propyl-N-(beschermd)amine om een quaternaiiir zout te vormen met formule 14: flO' fl2" Y-(CH2)3-N (CH2)3-N (14)

Rll' R13” 20 waarin Y, R1Q,, R11(, R12»' Ri3M de bovenstaande betekenis hebben.Het quaternaire zout wordt gehydrolyseerd in aanwezigheid van een zuur, b.v. 6 n zoutzuur gedurende 8 uur bij een temperatuur van kamertemperatuur tot 200°C, b.v. bij 110°C.Na verwijdering van nevenprodukten zoals een zuur, wordt het 25 reaktiemengsel geconcentreerd waardoor een hydrochloride wordt verkregen van een verbinding met formule 11.

Een amine met formule 15: korte keten alkyl Y-(CH2)3-N-(CH2)3-B" (15) 30 waarin Y de bovenstaande betekenis heeft en B" een di/fenyl-(korte keten)alkyl7amino, p-cyaanfenyl(korte keten)alkylamino, cycloalkyl(met 5-11 koolstofatomen)-gesubstitueerd korte keten alkylamino, of di^dibenzoxyfenyl(korte keten)alkyl7amino is, wordt bereid door een di(3-aminopropyl)(korte keten)alkylamine 35 te acyleren met één equivalent of minder van een acylerings- 8204943 - 28 - « middel zoals b.v. benzoylchloride, acetylchloride, azijnzuur- anhydride, carbobenzoxychloride, S-ter.butoxycarbonyl-4,6-dimethyl-2-mercaptopyrimidine, or N-carbethoxyftaalimide om een monogeacyleerd derivaat te vormen, waarna het verkregen 5 derivaat wordt onderworpen aan reduktieve kondensatie met één equivalent aldehyde als B" een monogesubtitueerde amino-groep is of met twee of meer, bij voorkeur 3-6, equivalenten van een aldehyde als B" een digesubstitueerde aminogroep is, en de acylgroep wordt met zoutzuur gehydrolyseerd.

10 De fysisch-chemische eigenschappen van de karakte ristieke (amido)N-gesubstitueerde bleomycinederivaten volgens de uitvinding zijn zoals weergegeven in Tabel B.

8204943 ........................... ....-Γ*Τ - 29 - Ο «Β r—i

II

φ

φ C

Ν 13 ·γ4

* C C

Φ Φ φ 44 Η Μ -Ρ Φ φ Φ ΟΦ Φ 040110100-^000-100-0-104000^^000040400 *ηΛ > σ\ οο οο γ- σι ο oiracor'-ocDr'^r-r-r-ooaoor- 2 3 ε ΟΟΟΟΟγ-ΙΟΟΟΟ'-ΙΉΟΟΟΟΟΟιΗΟ nu -δ X Ε'-' Φ C U _ Η Φ 0 Ë W > > « φ Ό Ü φ C 4.) Φ 4-1 * * * * * (Η <ί) OS 0410^0001000^0040-1^00^040-^000-^0 ΊΚΛβ «,ο-mr-vo^ino-inr-oooo^oicor-oo^^oo J ij Ο οοοοοοοοοοοοοοοοοοοο ε-< ο > __________-_ (Β ---- ή ε -ρ Φ Φ Η Ε Λ -Η C Ο ϋ φ 44 Φ > Η Éi Λ> \ — — λ — ^ — ~ o c ·ηπ Hr'ilffltNom'fniiiO'OiNfflmHi/iinvr' wa-H MOOOOOOcnocoo't^oor^QOoocor^ooro J3gM« — w w w w w — dwC.

p-(r-jr-ïrHi—ΙίΜ»Ηι-Η^-Ι(-4Γ4Ή»ΗίΗΉιΗ040404 S (β 1 3 010101010101010100010010101010100101

Dgui 040404040404<NCN040404CM04 04 04fiJ04CMCNCll ? < s >< μ SwfKCiyQHQHOftca^tnrtJQïsCM'i'i o SSHCQftWIllllllll11111 y III I I 104 04 04 04 04 04 04 04 040404040404

Cn

C

H

Ό fi · H ü n c 1-10401^10)101--0000^0401^141101--0000

<D

> 8204943 - 30 - (''ΟΟΓ-σιΟΟίη^-ΗΓΜΓ-Γ'^νΰΟΟΟ^^ΟΟΟ-ΗΟ^Ο

oooioor^rHr'OoaaooooooocNo-nOM^rHoo^ocM

ΟΟΟΟΟΟΟΟρΗΟΟΟΗτΗρΗιΗιΗιΗγΗρΗγ-ΙΟιΗΟ

Dl Η .

o >

^i^rr^oo'srvofnrHtncoLncnnooncNOtnvonoLnnncN

3)cor^r't^Oi'r>^or^rv''^^o^t^,r^[^°oco(Nlu^Li1LOlf'LnLi^ -000000000000000000000000 D3 <H ________________————————— ......... ' ......-1.-...1 ..........

tt) Λ

(O

E-i ^.σΐι_ιΙΗοοηοηο'!3'οοιηρΗΐτ)(ΝθθΐΤ)ΓΗηοαοοοοσ\ΐο ooooovocoooooooooooocor^t^criQOooor'Oor^oo

rH

Γ-tl—It—Ir—Ιι-Η^ΉΙΩίΗιΗΓ-|i—liHrHΙΉΉ1--1·—I O O O O O O

(ΤιΟΟ^οσιΟ'σ^Λ^σ'σισισΝ^σΝσ^σ'σ'οοσιοσΝσιο ΝΝ(ΊΝΝΝΝ(Ί(ΊΝ('ΙΟΙΙ'ΙΝ(ΊΝΝ(ΜΝ!Ν(ΝΜΜ(Ί

ft ft H C ft ÊH

2 Ci^WUOISWO

CWCE-i'iaW&rfJNrfJOOOrfJOOaQOO ftlxlCCQ^So&HriJ^OIBOOfflQHmi I l lil ΗΟΟυΜΟΟΣΙΟΟ^Ο^Λ^^ I I £ £ K ? I I I I I I I I I I I I I I I iD-iOOfflOfflOiO-i

ftftftftftftftftftftftftfcftftftftftjJJJJJJ

iaCL|&qpL|PL|HMWWWWMWWWW<<OUUyuy ΌΌ'Ο'ΟΌ'Ο'Ο'ϋ'ΰΌΌΌ'ΟΌ'ΟΌΌΌΌ'Ο'αΌ'ϋΌ rHCNro'^pLnor'OOooi-HCNroO'Lnvor'CXDCTiOi-icNrnTr CN<NCMfNCNOJCN(NfMOOmfnO(^rOror)0-q''q'’^^'=i 8204943 .................................. ' /*! .......

- 31 - co Η

(O

A

Λ W

• ·<Η Η 01 Ο Φ > Λ

Ou Η Ο Ο > ο α .. ο ο w η •U ..

Φ ΙΛ Φ νο ρ ^ φ υ η π) Φ Ε οι 3 cn Η β

OHWMr'(]\winHnoiO'fffl«^ioinon'f SS £Νρ-ιοσ>θΓ'Γ'·-)θΗι-(θ'-ιοσιθΉ<τ>·Ησινο OB

,ΠΗΗΟγΗΟΟΗΗΗΗΗΗΗΟγ-ΙΗΟΉΟΟ EM

ία Φ oip Ό Φ G I Φ ιΗ 0 c C Φ . Ο Φ Μ U τι (ULnoco^Lnr^ooomo^oorooo^cNroo^^^^ >M^fo{NH^,TrLnn'f^n^in^inp'inyDoo λ <1) w Ο $»| ΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟ Μ Μ CQ Φ Φ ® S -Ρ Η w «

Π · C

Ta « φ ^ φ οι -Ρ 0<1ίηΗ<τισΐΉι-(ΐηνοσίνοοοηΓ'ίτισιΉ’5Γη’α,νο β Ε Γ'.οοαΟΓ'νοΓ'αΟΓ'Γ'-Γ-Γ-'Γ'Γ'ΟΟοοοοοοσ'ισΝΓ-'Γ'- Φ ι-t β ΟΟΟΟΟΟΟ1—I >—I ι—Ιι—I γΗ ΗΙΗI ιΗI Ή Ο ίΝ >ΙΙΛΙΠ 03Ό ITi(Tia>CTi<J\<riC^iT'iT' iT><Ti<Ti<^Cr\0\<Ti<^0>CTiCDCD Μ ΝΝΝΝΝΙΜΝΙΝΜΝΝΝΝίΝίΊίΊΝΝΝΝΝ "Ί* Π3 ιλ m ^ CM j ω Μ U 1¾ ϊ · λ] βι Ο Ο 0S β PI < C ft λ Εη < & ΕΗ < < &Η Ο* I I VO Φ u ft ft η m ft w u ft ω y ft OjUmnn , p gtawu^i<i=Cftomftom<<BftffiOftcQg ^ o | I IftOSCQffll I ι ι ι IftCJWI I IOO ΦΟΕ WWI ι ι ι INNNNNNCQOftNNNNN U > Φ ftftNeONNNCQCQPQPQCQCQI I ICQCQCQCQCQ JPlpaCQmCQftQQQQQQOOOZZZQQ Φ cjuHBBEHEHSSSwwwuuyyyuQü o ^ c SSSSSSSSsSWWWSSSSSSSS j ^ ΌΌΏ'αΌΌΌ'αΌΌΌΌΌΌΌΌ'σ'οΤίΌ'σ Ή Φ Ό •Η Λ Μ Ui Φ Φ _____—- = Λ £ ^4 * ·« ιη^ι^β»θΗ(Ν(η'Γΐη^>οοσ\θΗ(Ν(η'Γ^ -Ρ ddd'f'fi/iLni/ii/iininiiimi/ii/i'iuwifl'flw Ο Ο ζ j 8204943 - 32 -

Tabel B (vervolg)

£ R

Noot: 2 Avicel SF (FMC Co.); mierezuur-azijnzuur-water (27:75:900 op vol.basis), 800 V, 15 min.

De biologische eigenschappen zoals gemeten aan de 5 karakteristieke verbindingen volgens de uitvinding worden hieronder beschreven.

1. Resistentietest tegen desaktiverend enzym.

(1) Extractie van desaktiverende enzym.

De lever van Donryu stam manlijke ratten werd gemengd 10 met twee keer het gewicht aan een 1/15 molaire fosfaatbuffer-oplossing met pH 7 en gemalen om een weefselemulsie te bereiden.De verkregen emulsie werd gecentrifugeerd bij 105.000 g (zwaartekrachtkonstante) gedurende 60 min.De bovenstaande vloeistof werd gedialyseerd en de verkregen grote molecuul 15 fraktie werd gebruikt als een desaktiverend-enzym extrakt.

(2) Bepaling van desaktiverende reaktie.

Aan 1 ml van het bovengenoemde extrakt werd 1 ml .van een substraat oplossing toegevoegd, die 800 mcg van een bleomycinederivaat bevatte.Het mengsel liet men 40 min. bij 20 37?C. reageren.Een deel (0,3 ml) van het reaktiemengsel werd van eiwit ontdaan en getest op de resterende werking tegen Mycobacterium smegmatis ATCC 607.Onder dezelfde omstandigheden vertoonde bleomycine B2/ dat als kontrole werd gebruikt, 50% afname in werking.De testresultaten zijn weergegeven in Tabel 25 C.Zoals uit de testresultaten blijkt, worden de (amido)N-ge-substitueerde bleomycinederivaten volgens de uitvinding in vergelijking met bleomycine n in het algemeen minder beïnvloed door het bleomycine-desaktiverende enzym.

2. Antibacterieële werkingen tegen Mycobacterium smegmatis 30 ATCC 607 en Bacillus subtilis.

De antibacterieële werking werd getest tegen de in de aanhef genoemde testorganismen met de methode van de agar plaatcilinder.De werking werd vastgelegd in de aanname dat de werking van een standaardmonster van bleomycine A2 35 (koper-vrije vorm) 1,000 mcg potentie/mg bedraagt.De testresultaten waren zoals weergegeven in Tabel C.

3. Groeibelemmerende werking tegen gekweekte HeLa cellen.

HeLa cellen werden geënt in een medium (MEM met 10% runderserum) dat in een kunststof Petri-schaal zat.Twee 8204943 - 33 - dagen later werd een bleomycine aan de schaal toegevoegd.Na drie dagen kweken werd het aantal cellen geteld.Het percentage groeibelemmering werd berekend aan de hand van de volgende vergelijking: 5 percentage belemmering (5) = 100 x (B-A)/(B-C), waarin A het eindaantal cellen na drie dagen volgend op het toevoegen van het testmonster is, B het eindaantal cellen in de kontrole zonder toevoeging van het testmonster is, en C het aantal cellen ten tijde van het toevoegen van het test-10 monster is.ID5Q (concentratie van 50% inhibitie) werd geschat uit de grafiek die gemaakt werd door de concentratie van het testmonster uit te zetten tegen het percentage belemmering.

De verkregen resultaten waren als weergegeven in Tabel C.

8204943 - 34 -

G G Η CD T3 P G G (D

(0 -H > > Λ Ή P +> a) a) x •H > (0

-P W

G CD CD + + + + 0) τιΌ h + + + + + + + + + + -P -H * + + + + + + + + + + + + cn p G g + + + + + + + + + + +,++,, •H > CD + + + + + + + + + + + + + + + + +1 +

to I ijl N

CD G Cl) G

(Ü U + <D ___ ΓΟ a) cn Ό to g cpj a) c cu p -he

0) GO g (0 G CD E > -r( -U

a) λ x H O) P CD CD -H CD CD O Λ -P > £ in O j<Q oo in o vocNPO'tfi-icocnntnr^ oo •HS-lCDCDHH (Ν^σίΓ-ίΟΟιΛνΟΟηΓ^σίΜΓ^ΜνΟΉΐΛ <U 4j -i—1 Ον·-' £ "' *· *·

OG-H G\ rHOO^r-irHOOrHOOOOOOO^O

P CD P G CD tn

cn Ü > CD Ή U

dp G I tr»·—I 6

O O G CD CD

in a a + ο cd tn rnicni

+> G GI-HI

U ,14 -H iHIrHI

5-) Ό G I—11-hi ςτΓ'Ποτιηιηοοοο'Ό'νοοοοιηιη

η CD G Φ -hi-Pi inyoo'ir'-r-'inininmococovoinoocNtyiCO

CD jj ·Η σι οώι vor^minr^’d'cncnr^inonusujcTiincNCN

£i W,Q <D tOIGl n'Tr-t i-ir-T >h ή ή to p -N fflirai

Eh CD CD CP___ ___— + > g scd \ gi

CD CD CD GI

Η -ΓΛ -P -HI

P -H x PI

(DPP (Diem -P > CD PI-HIt'' Ü I + OI-PIO _ to g w (Oicoiuo Γ'ΐηοοιηιηνοιηοοοσιίχιοοοοοο a u Gi^lgl Tp<yvr'cyi'!P<Ti<NoocnocNmin'^rcNoomm •η cg <D OIOIU ·<ί'οοΓ~ιηοο(+'+οοσΐΓ^Γ-'·^,νθΓΗοο·<ι,ν£>Ή 4j c O CnuicDlU r-Hi-)OJ'Ocnmvo'<3,nnmmr^oocN^rm<ji G to £ <D XglE-t cm m-Hi-H cm ht cn m -h

< > ^ fH Si tnK

tr> c < s -π <<caEHpHC<<c+W'< +j <;<,< ft<0(a:ix)Uwa.<<QPHCii) P S[i]ft<WQHQE)OfcBJB|l<Q2li(

0 SSHCQfUWI I I I I I I I I I I I

I I I I I ICNCNCNCNCNCNCNCNCNCNCNCN 14-1 ffiBKSBKWfflfflfflfflfflfflfflBCOfflffl rij -¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾ σ'

C

Ή Ό G · o G rHCNro-^rmvni^ooaiO'HCNro'+in'jor^oo

iH pH »H rH pH pH pH Ή pH

Q) > 8204943 ___________________________________ - ... fo ..... - - 35 - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + K + + + + + + + + + + + + + + + + + n rt i' o w co oioooooNiornomooocrimniecr» 00 h oo n in η'ΜΦ'ίΟΐΑοοιησιΦΓ'ΦΓ'ΐη'»®'»

-OOOOOO^OOOOrHOO-HOOCMOOOOOO

(7> o > ^oooNOO^o^J,1>ouDOOoaDcrimcTi-ircooooo--Hrn <D ^ o o oo ao οοοοοοοοΛησ*θΝ*ιησ\Ν·ο<η©θΝοη >οσισ>οοηΗ ηοοίΛΝ’-ΗΝ'ΟΝοοοΗΐοο'Λΐηοοιησι rH ON >H rH ID mCNCNMOVOCNr-l

CN

u

rH

Q) --- —...................................—......................-.......................................-..................................................................—.......

Λ (β

Eh oooooooooooooocNin^<yif’r>r-^oooocN'3' vor'tTiooN’ONr-irNOLnooN'LnincNm'xi^ooooN'fn -HcocnonmfNChrHiofNoouDcnrooinofN m oo on on oo m n* »Η oo oo ui οοιηοΟΝ’οοΝ'σίίοιοοοιοοηιη^οοοοΗ r-t on on in η h on in ro on μ h m on on

Oh Oh Eh W

, 2 <0hWU0hK

>h ca ίζΜ<ΕΗ<α«θΗ<Νι<θΗθ4θΗΐ<ί:αΗθαα

OHNOHWrtJfflEHtfUEHrtJOHQKOHOHOQQHffll I | I SEHHOH0auWi4O2QQ<<a<CQrt:i<l INNNN <<IIIIIIIIIIIIIIIIOhOh(D(OCQPQ

1 I ΟηΟηΟηΟηΟηΟηΟηΟηΟηΟηΟιΟιΟηΟηΟηΟηΟηΟη>-3ι·3ι-3ι-3

CNONWWWMWWlxlWMWixlWIxlWWHroCCUUUU

CQCQOhOhOhO<OhPhOhOhOhOhOhOhOhO<OhOhCQCQ2222 OOraO,aro,ü,aröOröraT3T),t>,crd,o,OT3,öO'O,o ΟΤ(Ο^ΗθΝ(ν)Ν,ΐηΐί>Γ'ΟΟσιΟ ·ΗΟΝΓΟΝ·ΐηΐί5Γ^ΟΟ<Τ(ΟΉΟΝ HN(N(NNN(N(NNNNfOOl(O(*lfl0Onflnn^V« 8204943 - 36 - + + + + + + + + + + + + + ++ ++ ++ + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + *« + + + * + + * + + + + + + + *<* 00 t'-noomm r- m ro o o o oroooooooino oocMro'ri-fr'.ocMr-LncNcoo'£>inM,<Mror-(CM<>oopo * tak hk N h.

00 OOCNrHrHCMOOOOiHOiHOOOr-IOO-OO

iH

Cn 1+ ............ 1 11 i*i^ιι I 1 1 0 > u

CD

> ''-’[''OOoooO'-tvoorginrooO'HOommLn iHvjonn νοσίΓ'σίοοη r-i-tr'iTtvcincNcor-ir-t^mcoLficM —i O cn co cm ^ r-i —I corproin^ai-finoom'S'CMr'mo 'O'rH co cn cm cm h lo in r·» ·<* «η

H rH

<D

Λ (d

Eh - cooooooor'i-ii-icocMoO'i'ooninooi^-tnco ONLntncTiOoocoiHvor^ocM'a'cocM iHcoTrcor^r'i-iin inc^u3voo^tncM,q,,M,cor'VooofO<Ti'M,r^cor'CMoOr-(H un oo ih in cm ι-ΐ'Μ·ιΗθ?Μθ’-ΗΐηοΜΐη<«ι,Ί,σ’*Ή

f-iro CO CMOJ'^ClN'JiNWiflUlH^tM

ft

Η M U

1¾ ft o

ft Eh J < N ft ft Eh ril ft Eh < I< E-I 04 I I

HUUftftEiffltti (3 U ft H U ft ft U W N N

ftOsmwuEnöjrtifiiOcQaiOmcE-tcuffiOftmcQ

1 I I I ft O 2 CQ Μ 1 I I I I I ft U Η I I IOO

HHPlIWI I I I INNNNtSJNCqOftNNtSJCsliSl ftftftftNNNNNCQOaCQCQfflftl I i ca m m <n ca

JJJJaamCQPQCQQQQQQQOOOSlZlSQQ UUUCJEhEh&hEhEh222I3I3W(JUUUUUQQ

222222222222ωωω22222222 T3ro,ororart!rö,a'ü,ora,d,üro,a,ordOOrö'd'drd oo'+mvor^oo(TiO'HCMcorpir)\or^oo<TiOiHCMro^pin ^^^<Φ^^Ρ^ιηΐπιίΐιηιΛΛΐηιηιηι/ΐΰΐΰΐο«« 8204943 - 37 -

Tabel C (vervolg)

Noot: *1 De resistentie werd beoofcdeeld op basis van de mate van desaktivering onder de omstandigheden waaronder de mate van desaktivering van bleomycine B2 50% is.

5 Beoordeling Mate van desaktivering ± 45% of meer + 35-44% ++ 25-34% +++ 15-24% 10 ++++ 5-14% +++++ minder dan 5% * niet bepaalbaar wegens de ad- ' !.; sorptie aan enzymeiwit.

4. Giftigheid voor de longen(longfibrose) bij muizen.

15 ICR stam muizen (manlijk, 15 weken oud) werden in groepen van 9 gebruikt.Ieder testpreparaat werd door intrape-ritonale injektie eens per dag gedurende 10 opeenvolgende dagen in een dosisverhouding van 5mg/kg toegediend.Na voltooiing van de toediening werden de muizen gedurende 5 weken onder 20 observatie gekweekt, daarna afgemaakt en aan autopsie onderworpen om het voorkomen en de mate van longfibrose te onderzoeken. De beoordeling geschiedde door vergelijking van het aantal behandelde muizen dat lijdt aan longfibrose en de mate van de ziekte.De resultaten waren zoals weergegeven in Tabel 25 D.De mate werd numeriek beoordeeld op de volgende wijze:

Aantal punten 0: Geen fibrose 1: Opeenhoping van exudaat in alveolus en fibrose- achtige verandering in alveolaire septum.

30 2: Fibrose in verschillende gebieden.

4: Verspreide fibrose.

6: Fibrose in meer dan twee-derde van het totale gebied.

De "verhouding” in Tabel D werd berekend door vergelijking met 35 "Bleomycine Complex".

8204943 - 38 - in £ •Η 1¾ r- in ^ 10 cn Γ" 0 fM o η o Q ^ ^ s *»«»«· £1 oooooooooooooooooooo £

<D

> \ 03 cC '—' 4-) -U -- - £ £ id id (did -«ΐ'Γ-ΐΓ^'ϊΡ'ΗΓ^ΓΟΓ^^^Γσι^ρ^'Γ^Γ'Ρ'Γ^Γ'Γ'

CN CN CN CN IN CN CN CN CN CN <NCNCN<NIN<NIN<N

(DO) ΝΝ\\\\\\\Ν·Ν\\\\\ΝΝ.Ν\ i-ih irii-iiHonr'CNooooooooooooo

ld (Ö rH H

+J 4J - 0 0 E-t +>

Q -U

CD

η ε <u -Q £

E-l Nil) OOrOiXiOm-HOOOOOOOOOOOOOO

•h in m r-t in r> t"· cn S J3<*> Ο Ή ·Η ' X ld M-ι U -U Φ O £ £ οοιοσιοοσ^Γ'ίηΜσιοοοοΓΟοοσισισισισισισ·

O id O

><γΗ fOiHinoromcNooooooooooooo

W

Cu

(li pil £< N

iji rtJCUWWUOjHCQ WWOjWUP^ c caiNi<ai<:ai042WUEHi<ai&iCQfii003< •h eu&qcL,£nHPQi i ïcuoscQi i i i i 'B; +> h cu < « i iN&awi ι i i n n n n n n co

u I I I I fcfcfflfcftNNNNfPtllfflfllIlffl I

o ftfUft^PnftHli^i-imiameQQQQQQQO

X ΗΗΗΙϊ1ι<<υθυΕ-'|2Ε-ι&Η§§2ωΗΗυ in (ai&iCu^cQpasssssssssswiaws <! 'ΰ'Ο’ΌΌΌΌ'ΰ'ΌΌ'ϋ'Ο'ΰΌΌ'ΟΌΌ'Φ'ΌΌ

Cn £

«H

£ · -h!-i r-icNon'<i'rv'0O<?i(v5mr~0O(Ti'-icN(Y,)'3'invDP'00

XjC cN<Nnmcnfnn>iP'a,'3''<i,'q,LnLnintjnir)LnLnLn £

<D

8204943 — r~~..,......:.......... ......._.r?i .......... ............· .....

- 39 - ο ο ο ο ο tuf Ο) ν*) ν*^ [-- Γ- Ρ- Γ* P-

Cn (Μ Μ Ν Ν Μ

Η Ν Ν Ν Ν S

Ο ο Ο Ο Ο ο > 1-1 φ £ α ---—

—I

φ Λ «5 ο ο ο ο ο σι α> (Τι <τι \ Ν Ν S Ν Ο Ο Ο Ο Ο CU ^ w υ cu ο

Eh I 1 υ Ν Ν

Η CU Ο CQ 0Q

υ ω ι Ο ο ο Λ Ν Ν Ν 1 I CQ ΡΊ £0

Ο Ο 2 α Q

υ υ ο α α 2 2 2 2 2 Ό Ό Ό Ό Ό U1 Ο Ν ♦ ιΛ ιΛ VO « Ό W3 8204943 - 40 - 5. LD5q ki-lj muizen, zoals bepaald door toediening gedurende 10 opeenvolgende dagen.

CDFj/SLC stam manlijke muizen (6 weken oud, 7 per groep) kregen subcutaan verschillende doses bleomucinederiva- ; 5 ten eens per dag gedurende 10 opeenvolgende dagen toegediend.

Uit de mortaliteit gedurende de toedieningsperiode werd de LDjjq (dagelijkse dosis) bepaald met de methode van Behrens--Karber.De resultaten waren zoals weergegeven in Tabel E.

_Tabel E_ 10 Verbinding Afkorting LDso tijdens toedienings- nr. periode van 10 opeenvol gende dagen.

(mg/kg/dag) 52 dMMDBZ-PEP 13,9 15 53 dMMDBZ-OCT 15,0 64 dMDDBZOBZ-PEP >81,4 65 dMDDBZOBZ-OCT >75,7 ~ '

Zoals blijkt uit de bovenstaande beschrijving zijn de verbindingen volgens de uitvinding resistent tegen een 20 bleomycine-desaktiverend enzym, hebben een hoge groei-belemme-rende werking tegen gekweekte HeLa cellen alsmede een uitgesproken antibacterieële werking, en hebben een zeer geringe giftigheid voor de longen, hetgeen een positieve aanbeveling is voor hun bruikbaarheid op klinische gebieden.

25 Bij gebruik als geneesmiddel worden de verbindingen volgens de uitvinding vermengd met een excipient op gebruikelijke wijze en bereid in de vorm van injekties, tabletten, zalven, zetpillen enz.Geschikte excipienten zijn onder meer water, suikers, zoals mannitol, en andere materialen de 30 gewoonlijk worden toegepast in farmaceutische preparaten.

Ofschoon de dosis varieert afhankelijk van de toedieningsvorm, wordt een afzonderlijke dosis van 2-10 mg per persoon êën tot vier keer per week toegediend, zodat de totale dosis 2-200 mg/persoon/week bedraagt.

35 De uitvinding wordt hieronder nader toegelicht aan de hand van Voorbeelden, maar de uitvinding is daartoe niet beperkt.

8204943 - 41 -

Voorbeeld I

Trap A

Verse runderlever met een gewicht van 200 g werd gehomogeniseerd in 400 ml 0,05 molaire fosfaatbufferoplossing 5 met pH 7,2 en gecentrifugeerd bij 8000 rpm gedurende 30 min. De bovenstaande vloeistof werd gedialyseerd tegen 0,05 molair fosfaatbuffer om een ruwe enzymoplossing te bereiden.Aan 10 g bleomycine werden 400 ml van de ruwe enzymoplossing toegevoegd. Het mengsel liet men 24 uur bij 37°C reageren.Aan het 10 reaktiemengsel werden 40 ml 55% oplossing van trichloorazijn-zuur (afgekort TCA) toegevoegd om het eiwit neer te slaan.Het neerslag werd door centrifugeren afgescheiden en drie keer gewassen met 5% TCA-oplossing.De bovenstaande vloeistof en de wassingen werden gekombineerd, geneutraliseerd met een 4 mo-15 laire natriumhydroxideoplossing, en vermengd met 3,2 g (2,4 equivalenten op bleomycine) koperacetaat om een koper-jchelaat van het beoogde produkt te vormen.Om te ontzouten werd de koper-chelaatoplossing door een kolom gevoerd met een volume van 1 1, gepakt met een adsorberende hars Diaion ® HP 40 20 (Mitsubishi Chemical Co.) in gedestilleerd water, om de adsorptie van het beoogde produkt tot stand te brengen.Na wegwassen van de zouten met 1,5 1 gedestilleerd water werd de geadsorbeerde fase geëlueerd met een 1/50 n waterig zoutzuur--methanol 01ï4 op vol.basis) mengsel om de frakties te ver-25 zamelen, die een absorptiemaximum vertonen bij een golflengte van omstreeks 290 mp.De gekombineerde frakties werden geneutraliseerd met Dowex ® 44 (OH-type, Dow Chemical Co.) en geconcentreerd onder verlaagde druk.Het concentraat werd gevoerd door een kolom met een volume van 1 1, gepakt met 30 CM-Sephadex ® C-25 (Na+-type, Pharmacia Fine Chemicals Co.), die in evenwicht was gebracht met een 1/20 molaire azijnzuur--natriumacetaat bufferoplossing met pH 4,5, om adsorptie tot stand te brengen.De geadsorbeerde fase werd geëlueerd met de lineaire concentratiegradient methode waarin natriumchloride 35 kontinu werd toegevoegd aan de bovengenoemde bufferoplossing om de natriumconcentraie geleidelijk op te voeren tot 1,0 molair.De bij een natriumconcentratie van 0,3 molair geëlueerde blauwe frakties werden verzameld, daarna ontzout met gebruik van Diaion ^ HP 40 zoals boven beschreven, en gelyofiliseerd 40 waardoor 8,5 g(83% opbrengst) werden verkregen van een blauw 8204943 - 42 - amorf poeder van koper-bevattend deamidobleomycine B2·

Het blauwe poeder vertoonde absorptiemaxima (E 1%/ 1 cm) bij 242 χαμ (138) en 291 mp (115) , bepaald in gedestilleerd water. De infrarood absorptiemaxima (in golf getal, cm *) 5 gemeten in KBr-tablet, waren: 3425, 2975, 2940, 1720, 1640, 1575, 1460, 1420, 1400, 1375, 1280 1260, 1240, 1190, 1140, 1100, 1060, 1020, 760.Andere fysisch-chemische eigenschappen waren zoals vermeld in Tabel F.

Op een overeenkomstige wijze als hierboven beschre-10 ven werden, door uit te gaan van bleomycine A2,-C, 3—((S)— -1'-fenylethyl)aminopropylaminobleomycine, en 3-(3-n-butyla-minopropylamino)propylaminobleomycine, respektievelijk deamidobleomycine A2,-C, 3-((S)-1'-fenylethylamino)propylami-noldeamidobleomycine, en 3-(3-n-butylaminopropylamino)propyl-15 amino-deamidobleomycine verkregen.De fysisch-chemische eigenschappen van deze verbindingen waren zoals vermeld in .Tabel F.

Trap B

Aan een oplossing van 1 g koper-bevattend deamidobleomycine B2, verkregen in trap A, en 1,77 g 1-hydroxybenzo-20 triazool (afgekort HOBT) in 10 ml dimethylformamide, werden, onder koelen op 0°C en onder roeren, 1,35 g (10 equivalenten op bleomycine) dicyclohexylcarbodiimide (afgekort DCC) toegevoegd.Vijf minuten daarna werden aan het mengsel 840 mg (5 equivalenten op bleomycine) 3-((S)-1'-fenylethylamino)-25 propylamine hydrochloride en 0,72 ml N-methylmorfoline toegevoegd. Het verkregen mengsel liet men 16 uur onder roeren bij kamertemperatuur reageren.Aan het reaktiemengsel werd het tienvoudige volume aceton toegevoegd om het beoogde produkt neer te slaan.Na grondig wassen met aceton werd het neerslag 30 opgelost in gedestilleerd water en gevoerd door een kolom met ift een volume van 100 ml,gepakt met CM-Sephadex ^ C-25 (Na type, Pharmacia Fine Chemicals Co.), die in evenwicht was gebracht met een 1/20 molaire azijnzuur-natriumacetaat bufferoplossing met pH 4,5 om adsorptie tot stand te brengen.De geadsorbeerde 35 fase werd geëlueerd volgens de lineaire concentratiegradient methode waarin natriumchloride kontinu werd toegevoegd om de natriumconcentratie geleidelijk op te voeren tot 1,0 molair.

De blauwe frakties die bij een natriumconcentratie van omstreeks 0,6 molair elueerden, werden verzameld.De gekombineer 40 de frakties werden ontzout met gebruik van 100 ml Diaion ® HP

8204943 ______l______________________ „ ...... .... ...1.·’'*·· .......- ....

- 43 - μ

iB

Φ 4J

NB fi m HK C <0 μ φ > — 2 y? <d -p _ ° IV, ω 4-> β » 3 Φ

Hl IJBH 'd Γ μ > ^" ζ ^ O 0) II Q ® ιμ n g g 4-> — O i (2 Φ cn cn r- η βω ω

μ 0 C r- VO vo o (0 -H

-p u ·*ή »»«.*· fi ω

<£ Ê C O O O H <#> φ <B

Hl C h ld vo <D Λ

h e o h I ,. J

ω > > ra -· -P r} ______- 0 Φ 0 --- C 6 > Φ Φ «o x: fi o·

c tw -P Φ · O

I φ pi Φ Ό —

H 0 P ΊΚ 4K Ί< Ή S Ijj M O

* π P » m in « Γ' o nm <B -p o id g ff, a r' oo ·ί* oom C id in cn

Hl K H ·· - +J 0 Γ"

Φ P > CN

I β β o ^ 3 5 φ 0 ft

Cn > 0 P - ~ η) > s oom (no r» ν οο Φ •HC ϋ ΓΟΗ ΓΟΗ "Τ 04 Ν' Η ·~ Φ Ν* -Ρ 4-1 (Β φ Η ΗΗ ΗΗ ΗΗ ΗΗ — >C0 (Β ρ c <#> ο 2 £ ΰ 0 β Φ Η CJ X Ρ ω 0 -Ρ λ W 2 β 4-1 £3 *Q 0

«•Hid'' N CN MN DN (SN 0 Η N

X> ^r<3\ σ\ t οι σ\ P — Φ C

g(B φ a (MM CN CN CN CN CN CN Φ CO CO TO

e _q 3 S Ή θ' Ή

a, '-'cnCN

(0 φ (Β

(—4 ^ ' m *0 β I

fl) · M

Ρη o Ό > Ό N

^ G Φ 0 Φ

•H co ft (Β P

S «HO (D

<0 fi C -H

Η (Β O φ β >, H xr Φ I ft Ή ·· H 0 W O fi — >, P VO H · ft ft N· — 0

o — m CU

p o CN Η Φ

CP β φ Ό U

(D — -rl ft Μ P S

β OË o £T> Φ ft · rd-H C CB co 0 5 fi

po υ·Η^ Φ -P

Φ >1 I S >1 <P Ë fi <® Ë φ Ë - ÏB ft Φ Φ cn o cn cn H 0 o Cn 4-i h ό

ΗΦ PQ < >1 P e Φ W H

i \ _j Jr* Q, m *H E

φ2 Φ φ "ρφοφ οωφΗ- £0 fi fi φ c c c h cn σ> φ >

jjrrt Η τ4 ΗΗ·Η·γ4Η0 O

β-Η Ü O >ι O β ü Η Η φ HO

>, Ë So >i 3>,iB>icnft-H>o to S β β Φ β ή Ë sOOCoo φφ 0 0 m 0 >i 0 UB φ Φ I Φ 4J Φ

Η Η “ H 0 H

A A h A A A -ρ 2 0 0 I 0 I O * * Τ3 Φ - Β C Β Η ·Η W Ή I -Η ·· β β w g γο ε -ρ (0 (Β -—' (Β —' (0 0 φ φ I Φ I Φ 0 Q Q (Ί Β Ο Β 2 8204943 - 44 - -40 als boven beschreven, en gelyofiliseerd waardoor 880 mg (76% opbrengst) werden verkregen van een blauw, amorf poeder van koper-bevattend amido(N) -/3- ((S)-1'-fenylethylami.no) pro-pyl7~bleomycine B2*Dit vertoonde absorptiemaxima (E 1%/1 cm) 5 bij 243 mu (125) en 292 πιμ (96) , gemeten in gedestilleerd water.De IR absorptie (in golfgetal, cm gemeten in KBr-tablet, was 3425, 2975, 2930, 1720, 1640, 1580, 1575, 1550, 1455, 1430, 1400, 1370, 1290, 1240, 1190, 1130, 1095, 980, 875, 760.Andere fysich-chemische eigenschappen waren als 10 weergegeven in Tabel B.

Op overeenkomstige wijze als boven beschreven werden koper-bevattende vormen van (amido)N-gesubstitueerde bleomy-cinen B2 nrs.7-20 als weergegeven in Tabel B gesynthetiseerd door reaktie van koper-bevattend deamidobleomycine B2 met 15 aminen die overeenkomen met de beoogde produkten.

Opdergelijke wijze werden de verbindingen nrs_. 1, .6, 21-38, 64 en 65 als vermeld in Tabel B gesynthetiseerd door reaktie van deamidobleomycine A2,-C, 3-((S)-1'-fenylethyl)-aminopropylamino-deamidobleomycine, en 3-(3-n-butylaminopro-20 pylamino)propylamino-deamidobleomycine (ieder deamidobleo mycine in koper-bevattende vorm) met aminen die overeenkomen met de beoogde produkten.

Trap C

In 20 ml gedestilleerd water werden 880 mg van de 25 in Trap B verkregen koper-bevattende verbinding opgelost.Ter ontzouting werd de oplossing gevoerd door een kolom met een volume van 100 ml, gepakt met Amberlite ® XAD-2 in gedestilleerd water, teneinde adsorptie van de koper-bevattende verbinding tot stand te brengen.De hars werd achtereenvolgens 30 gewassen met 300 ml van een natriumchloride en 5% EDTA.2Na bevattende waterige oplossing, 100 ml 2% waterige natrium-chlorideoplossing, en 250 ml gedestilleerd water.De hars werd daarna geëlueerd met een 1/50 n zoutzuur-methanol (1:4 op vol.basis) mengsel om de frakties, die een absorptiemaximum 35 vertonen bij een golflengte van omstreeks-290 mu, te verzamelen. De gekorabineerde frakties werden ingesteld op pH 6,0 met Dowex 44 (OH type, Dow Chemical Co.), daarna geconcentreerd onder verlaagde druk, en gelyofiliseerd waardoor 790 mg (93% opbrengst) werden verkregen van een wit,amorf poeder van 40 koper-vrij (amido)N-/3-((S)-1'-fenylethylamino)propyl7bleo- 8204943 - 45 - mycine hydrochloride.UV absorptiemaximum en (E 1%/1 cm) waren respektievelijk 291 ιημ en (79).IR absorptiemaxima (in -1 golfgetal, cm ), gemeten in KBr-tablet waren 3425, 2950, 1720, 1640, 1555, 1450, 1400, 1360, 1320, 1260, 1190, 1060, 5 880, 910, 805, 770 en 700.Andere fysisch-chemische eigenschappen waren zoals vermeld in Tabel B.

Voorbeeld II

Trap A

Schimmel mycelium met een gewicht van 400 g, verkre-10 gen door kweken van Fusarium roseum IFO 7189, gedeponeerd in het Institute for Fermentation, Osaka, werd gehomogeniseerd in 4 ml van een 1/20 molaire fosfaatbuffer oplossing met pH

7,5.Aan het gehomogeniseerde mengsel werd een oplossing van 10 g koper-bevattend (amido)N-/3-((S)-1'-fenylethylamino)-15 propyl7“bleomycine B2 in 1 1 van dezelfde fosfaatbuffer oplossing als boven gebruikt, toegevoegd.Men liét het mengsel 20 uur bij 37°C reageren.Het reaktiemengsel werd vermengd met een filtreerhulpmiddel en afgezogen op een afzuigfilter.Het residu werd gewassen met delzelfde bufferoplossing als boven 20 gebruikt.Het filtraat en de wassingen werden gekombineerd en gevoerd door een kolom die gepakt is met 1 1 van een adsorberende hars Amberlite ® XAD-2 in gedestilleerd water teneinde adsorptie van het beoogde produkt tot stand te brengen.Na wegwassen van de zouten met 2 1 gedestilleerd water werd de 25 geadsorbeerde fase geëlueerd met 50% waterige methanol om 5 1 te verzamelen aan blauwe of blauwgroene frakties.De gecombineerde frakties werden onder verlaagde druk geconcentreerd, daarna opgelost in 350 ml 80% methanol, en gevoerd door een kolom gepakt met 70 ml aluminiumoxide in 80% methanol, en 30 ontwikkeld met 40% methanol waardoor 350 ml aan blauwe eluaat frakties werden verzameld.De gekombineerde frakties werden onder verlaagde druk geconcentreerd, daarna opgelost in gedestilleerd water en gevoerd door een kolom met een volume van 600 ml, gepakt met CM-Sephadex w C-25 (Na type, Pharmacia 35 Fine Chemicals Co.), die in evenwicht was gebracht met een 1/20 molaire azijnzuur-natriumacetaatbuffer oplossing met pH 4,5, teneinde adsorptie van het beoogde produkt tot stand te brengen.De geadsorbeerde fase werd geëlueerd met de lineaire concentratiegradient methode waarin natriumchloride kon-40 tinu werd toegevoegd om de natriumconcentratie geleidelijk te 8204943 - 46 - verhogen tot 1,0 molair.De bij een natriumconcentratie van omstreeks 0,2 molair eluerende blauwe frakties werden verzaag) meld, daarna ontzout met gebruik van Diaion ^ HP 40, en gelyo-filiseerd waardoor 7,1 g (79% opbrengst) werden verkregen van 5 een blauw, amorf poeder van koper-bevattend (amido)N-/3-((S)-1'-fenylethylamino)propyl7-bleomycinezuur.UV absorptiemaxima en (E 1%/1 cm), gemeten in gedestilleerd water waren respek-tievelijk 245 πιμ (121) en 293 mu (119) .IR absorptiemaxima (in golfgetal, cm 1), gemeten in KBr-tablet, waren 3450, 2975, 10 2940, 1720, 1645, 1580, 1555, 1460, 1370, 1300, 1190, 1140, 1095, 1060, 1005, 980, 880, 765, en 700.Andere fysisch-chemi-sche eigenschappen waren zoals weergegeven in Tabel G.

Op een overeenkomstige wijze als hierboven beschreven werden (amido)N-n-octyl-bleomycinezuur en (amido)N-(3-15 dibutylaminopropyl)-bleomycinezuur verkregen uit respektieve-lijk (amido)N-n-octylbleomycine B2 en (amido)N-(3-dibutylami-nopropyl)-bleomycine B2.De fysisch-chemische eigenschappen van deze zuren waren als weergegeven in Tabel G.

Trap B

20 In 10 ml DMF werden 110 g Cu-bevattend (amido)N-/3- -((S)-1'-fenylethylamino)propyl7-bleomycinezuur, bereid in

Trap A, en 1,71 g HOBT opgelost.Op een overeenkomstige wijze als in Trap B in Voorbeeld I, liet men, met gebruik.van 1,31 g DCC, de bovenstaande oplossing reageren met 340 mg 3-/N- 25 (3'-cyclooctylmethylamino)propyl-N-methylaming7propylamine gedurende 3 uur om een kondensatieprodukt te vormen.Net als in Voorbeeld I werd het reaktiemengsel behandeld met aceton, & daarna gezuiverd met CM-Sephadex chromatografie, en gevoerd door een kolom van 100 ml met Amberlite w XAD-2 om adsorptie 30 tot stand te brengen.De geadsorbeerde fase werd geëlueerd met de lineaire concentratiegradient methode, waarin 500 ml methanol kontinu werden toegevoegd aan 500 ml van een acetaatbuf-der oplossing met pH 4,5 om de methanolconcentratie lineair te verhogen.Het beoogde produkt werd geëlueerd bij een metha- 35 nolconcentratie van 40-50%.Het eluaat werd ontzout met ge- © bruik van een kolom (100 ml) Diaion HP 40, zoals boven beschreven en gelyofiliseerd waardoor 980 mg (83% opbrengst) werden verkregen van een blauw, amorf poeder van 3-/N-3'-(cy-clooctylamino)propyl-M-methylamino7propylamino-(amido)N-/3-40 ((S)-l'-fenylethylamino)propyl7-bleomycine(Cu-bevattende vorm) 8204943 —~"7-“31 . f *». .. .

- 47 - Φ (NOC HK C <0 Φ > — i <U -U o g _

»+*6 > 5 S

0) (fl tt Η -Η Φ μ > ^ *· ® σ\ ca) 0 Φ II oo oo ιλ o

03 Λ g % % - § -P

αιδοίο o o sa) μ c c « s · « +J CJ -H τ

«*< g C <#> C W W

(U IC M (0 'fiimo ΗΙβΟΗ 172-° “>>“ 0ΟΛΗ

...... .....................— C (β · O

aJ 5 <-) > φ 5 iw > a -δ φ os o C <w 6 & ΙΦΡ5 * * * 3 4j n cn n <n on o CO o h u+J s ® w σ»νο r- <N -η O σ\ K cgg»*».**» >m·· η β > μ o o oo oo C ·· m θ(ΟΦθ φ φ ir> t" Ε-ι>Λ> -Ρ > o ·· ^ OH'- Γ-

.. ................——- g φ (N

«. φ £ H — I g tP Φ Φ C C — Λ M U .......

UOS'-'—' ---- — ·' Ö1 Φ

Φ > o η σ> η n o oo — - C -P

HC CN Η (N (N η Μ · — Φ Φ 4J Φ φ Η Η H HH Hf-I O 0) S 3

Oi>OV'ww ^ U-H I

u c <*> w μ μ

ΟΕφπ ,Χ <0 Φ C

CD B -P o Λ -o c ja ë p M in n r- τ in <*) μ · c n

nj-a ij'' h <Ti <f w ^ σ\ φΗΐΰ C

X> (N CN (N (N (N (N SO Tl > <o φ c. w > £ a g η g Φ n snort

U _ o I

n £ Φ ·· C N

φ φ ra o Φ Φ η φ h vo -P μ 3 i c w Φ Φ

4J (0 g H

H 0 Η Η φ g 4J β Η Φ t7> μη cn m n g , B> c - 3 Φ f-. *r C Φ W Η Η μ if) Φ Ό 0 φ >i >i c <n ε μ u tr> Λ A C 0)

1 Η 0 Ν Cn (J| 3 U

ζ φ μ φ c 2 ^ Η & C ο Η Φ fe ·

ο >Ί Ο Η VO 01 Η *— C

Ό C C 0 2 ^ λ>\ s Η φ μ Η >1 ΗΟ ©ε s meg ε φ η - Φ I 3 α5 Ο ΰ ft Φ h Λ — - Ν Η φ Ο -η W Η η φ >1 Η (0 -Ρ -Ρ Τ3 I C -Ρ Λ Ο (0 Φ ' μ μ — Η Ρ — Η Λ μ Φ > Φ3 ωοΛ ή η +J μ ο Φ3 — >, Η μ >ι ηφφ-ηο WN w ε Ό 3 -Ρ 0) U -Ρ > Ο ΗΦ 10 ICO sidwCoo 4-) C in φ η Ν 0 φ Η SI η - φ - Λ ο I Λ I C I Η ™ 4-1 >1 ΖΙΖ-ΗΖ H « c ε — ι\ — ο -- >1 0 ο HI 0 >« 0 II) φ Ό >1 Ό S Ό φ η η α, η ο ·μ -ρ υ ja ε ο ε φ η ο ι«3 μ 15 η < ο — ft ~ Λ w ζ 8204943 - 48 -

Trap C

In 22 ml gedestilleerd water werden 980 mg koper-be-vattend 3-/N-(3'-cyclooctylmethylamino)propyl-N-methylaming7-propylamino-(amido)N-/3-((S)-1'-fenylethyl)aminopropyl7-bleo-5 mycine, bereid in Trap B, opgelost.De oplossing werd onderworpen aan de behandeling ter verwijdering van koper, zoals

R

in Voorbeeld I, met gebruik van Amberlite XAD-2 en een 5% waterige EDTA.2Na oplossing.De effluent uit de kolom werd gelyofiliseerd waardoor 870 mg (92% opbrengst) werden verkre-10 gen van een kleurloos poeder van koper-vrij 3-/N-(3'-cyclooctylmethylamino) propyl-N-methylamino7propylamino-(amido)N-/3-((S)-11-fenylethylamino)propyl7-bleomycine hydrochloride. UV absorptiemaximum en (E 1%/1 cm), gemeten in gedestilleerd water, waren respektievelijk 291 mp en (89).IR absorptiemaxi-15 ma (in golfgetal, cm”1) gemeten in KBr-tablet, waren 3400, 2925, 1720, 1650, 1550, 1520, 1480, 1460, 1450, 1405, .1385, 1360, 1320, 1255, 1190, 1130, 1100, 1055, 1020, 980, 960, 880, 805, 760, 725 en 695.Andere fysisch-chemische eigenschappen waren als weergegeven in Tabel B.

20 Op een overeenkomstige wijze als hierboven beschre ven werden de koper-vrije vormen van de verbindingen nrs. 20-63, vermeld in Tabel B, verkregen uit de overeenkomstige uitgangsmaterialen.

Voorbeeld III

25 Trap A

Op een overeenkomstige wijze als beschreven in Voorbeeld II werden 1,5 g van het koper-bevattende deamidobleo-mycine B2, bereid in Voorbeeld I, gemengd met een gehomogeniseerd mengsel van 60 g gekweekt mycelium van Fusarium roseum 30 en 750 ml van een 1/20 molaire fosfaatbuffer oplossing met pH 7,5.Men liet het mengsel 21 uur bij 37°C reageren.Het reaktiemengsel werd behandeld zoals in Voorbeeld II en ge-voerd door een kolom (volume 5oo ml) van Amberlite XAD-2 om adsorptie van de beoogde stof tot stand te brengen.De 35 kolom werd gewassen met 750 ml gedestilleerd water en geëlu-eerd met eem water-methanol (4:1) mengsel om groene frakties te verzamelen (in totaal 750 ml), die onder verlaagde druk werden geconcentreerd.Het concentraat werd door een kolom gevoerd met een volume van 60 ml, gepakt met CM-Sephadex ® 40 C-25 (Na+ type, Pharmacia Fine Chemicals Co.), die in even- 8204943 - 49 - wicht was gebracht met een 1/20 molaire azijnziiur-natriumace-taat bufferoplossing met pH 4,5.De kolom werd gewassen met gedestilleerd water en de uitlopende blauwe frakties (in totaal 80 ml) werden verzameld.Na herhalen van de CM-Sephadex ® 5 chromatografie werd de gezuiverde blauwe fraktie geconcentreerd en gevoerd door eem kolom met een volume van 1 1, ge-pakt met Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals Co.) in een water-methanol (1:4) mengsel.De kolom werd ontwikkeld met een water-methanol (1:4) mengsel om blauwe frakties te ver-10 zamelen.De gekombineerde blauwe frakties werden onder verlaagde druk geconcentreerd en gelyofiliseerd waardoor 890 mg (87% opbrengst) werden verkregen van een blauw, amorf poeder van koper-bevattend deamidobleomycinezuur.UV absorptiemaximum an (E 1%/1 cm), gemeten in gedestilleerd water, waren respek-15 tievelijk 254 mp (143) en 292 mp (144).IR absorptiemaxima (in golfgetal, cm”1) , gemeten in KBr-tablet, waren 3450,. 2975, 2940, 1720, 1640, 1560, 1465, 1420, 1380, 1280, 1190, 1140, 1100, 1060, 1020, 990, 880, 810, em 775.Onder de omstandigheden als vermeld in Tabel G was de Rf waarde in dunne laag 20 chromatografie (TLC) 0,91* en de Rm waarde bij elektroforese was 0,49.

Trap B.

In 5 ml dimethylformamide werden 500 mg van de in Trap A verkregen koper-bevattende verbinding en 2,010 mg HOBT 25 opgelost.De verkregen oplossing en 3-((S)-1'-fenylethylamino) propylamine werde onderworpen aan kondensatie gedurende 21 uur, zoals in Voorbeeld I, met gebruik van 770 mg DCC.Op o-vereenkomstige wijze als in Voorbeeld II, werd het reaktie-mengsel behandeld met aceton, gezuiverd met CM-Sephadex ^ 30 chromatografie en Amberlite ® XAD-2 chromatografie, ontzout door gebrui van Diaion ** HP-40, en gelyofiliseerd, waardoor 280 mg (42% opbrengst) van een blauw amorf poeder van koper-bevattend 3-((S)-l'-fenylethylamino)propylamino-(amido)N-/3-((S)-i*-fenylethylamino)propyl7-bleomycine werden verkregen.

35 Op een wijze overeenkomen met de hierboven beschre vene werden 3-(3-n-butylaminopropylamino)propylamino-(amido) N-/3-(3-n-butylaminopropylamino)propyl7-bleomycine en 3-/N- /3- /2-(p-chloorfenyl)ethylamino7propyl-N-methylamino/propyl- : # amino-(amido)N-/3-(2-(p-chloorfenyl)ethylamino)propyl-N-meth-40 ylaminopropyl7”bleomycine verkregen door gebruik van respek- 8204943 - 50 - tievelijk 3-(3-n-butylaminopropylamino)propylamine en N-/N-(3-aminopropyl)-N-methylaminopropyl7“N-/2-(p-chloorfenyl)-ethyl7amine.

Trap C.

5 In 8 ml gedestilleerd water werden 280 mg van het in

Trap B verkregen koper-bevattende 3-((S)-1'-fenylethylamino)-propylamino-(amido)N-/3-((S)-1'-fenylethyl)aminopropyl7"bleo-mycine opgelost.De oplossing werd onderworpen aan de behandeling ter verwijdering van koper, zoals in Voorbeeld I, met 10 gebruik van Amberlite ® XAD-2 en 5% waterige EDTA.2Na oplossing.De effluent uit de kolom werd gelyofiliseerd waardoor 250 mg (92% opbrengst) werden verkregen van een wit, amorf poeder van koper-vrij 3-((S)-1'-fenylethylamino)fenylamino-(amido)N-/3-((S)-1'-fenylethylamino)propyl7-bleomycine.IR 15 absorbtiemaxima (golfgetal, cm *), gemeten in KBr tablet, waren 3370, 2975, 2940, 1715, 1660, 1565, 1500, 1455,..1335, 1320, 1255, 1190, 1140, 1100, 1060, 1020, 970, 920, 880, 805, 760, 730, en 695.Andere fysisch-chemische eigenschappen waren zoals vermeld in Tabel B.

20 Op een overeenkomstige wijze als hierboven beschre- venrwerden andere verbindingen als opgesomd in Trap B ieder omgezet in de koper-vrije vorm.De fysisch-chemische eigenschappen van deze verbindingen waren als vermeld in Tabel B.

Voorbeeld IV

25 Een oplossing van 10,22 g 3-aminopropyldimethylamine in 100 ml methanol werd geneutraliseerd met 12 ml ijsazijn en gemengd met 100 g benzaldehyde.Aan het geroerde mengsel werden in gedeelten 8,38 g natriumcyaanboorhydride toegevoegd. ; Het mengsel liet men 16 uur bij kamertemperatuur reageren.Het 30 reaktiemengsel werd ingesteld op pH 1 met geconcentreerd zoutzuur en van methanol ontdaan door destillatie bij verlaagde druk.Het residu werd behandeld met 200 ml water en 200 ml chloroform.De waterige laag werd afgescheiden en geëxtraheerd met 200 ml chloroform om het benzaldehyde te verwijde-35 ren.De waterige laag werd met natriumhydroxide ingesteld op pH 12 en twee keer met 200 ml chloroform geëxtraheerd.Het chloroformextrakt werd gedroogd boven natriumsulfaat en door destillatie bij verlaagde druk ontdaan van het oplosmiddel, waardoor 26 g (92% opbrengst) werden verkregen van /3-(N,N-40 dimethylamino)propyl7“dibenzylamine.

8204943 - 51 -

Het hierboven verkregen amine werd opgelost in 100 ml acetonitril.Aan de geroerde oplossing werd druppelsgewijs een oplossing van 22,25 g N-(3-broompropyl)-ftaalimide in 100 ml acetonitril toegevoegd.Het mengsel werd 18 uur bij 5 kamertemperatuur geroerd tot het halogenide was verdwenen, zoals werd vastgesteld met dunne laag chromatografie.Het reaktiemengsel werd door destillatie onder verlaagde druk ontdaan van het acetonitril.Het residu werd opgelost in 200 ml 6 n zoutzuur en gehydroliseerd door 8 uur verhitten op 10 ll0°C.De hydrolyzaat oplossing werd afgekoeld, door filtreren ontdaan van het neergeslagen ftaalzuur, tot droog ingedampt, opgelost in gedestilleerd water en gevoerd door een kolom β van een ionenuitwisselingshars Dowex -1 (Cl type, volume 279 ml).De effluent werd tot droog ingedampt onder verlaagde 15 druk waardoor 43,7 g N-/3-/N-(3-aminopropyl)-N,N-dimethylami-ng7propyl/dibenzylamide trihydrochloride werden verkregen.Het k.m.r.spektrum van deze verbinding, bepaald in zwaar water, vertoonde de volgende signalen: S (ppm) = 2,0 - 2,7, 4H (m) ; 2,9 - 3,8, 8H (m) ; 3,3, 6H (s) ; • 20 4,6, 4H (m); 7,7., 10H (s) (waarin m en s tussen haakjes staan voor respektietielijk multiplet en singulet) .Deze signalen zijn indicatief voor de bovenvermelde chemische struktuur. Andere fysisch-chemische eigenschappen waren als vermeld in Tabel H.

25 Op een overeenkomstige wijze als de boven beschre vene werd N-/3-/N-(3-aminopropyl)-Ν,Ν-diethylamino7propyiy-dibenzylamine trihydrochloride verkregen uit 3-aminopropyl-diethylamine, dat als uitgansmateriaal werd gebruikt.De fysisch-chemische eigenschappen waren als vermeld in Tabel H.

30 Voorbeeld V

In 180 ml water werden 150 g di-(3-aminopropyl)meth-ylamine, gevolgd door 53 g triethylamine, opgelost.Onder koelen met ijs en onder roeren werd aan de oplossing in gedeelten een oplossing van 83 g (1/3 equivalent) 4,6-dimethyl-2-35 tert.butoxycarbonylthiopyrimidine in 200 ml dioxan toegevoegd. Men liet het mengsel 5 uur bij kamertemperatuur reageren.Het reaktiemengsel werd door destillatie onder verlaagde druk ontdaan van het dioxan en triethylamine.Het residu werd ingesteld op pH 2 met 6 n zoutzuur en gewassen met chloroform.De 40 waterige laag werd met natriumhydroxide ingesteld op pH 13,5 8204943 - 52 - en geëxtraheerd met chloroform.De chloroformlaag werd gedroogd boven natriumsulfaat en door destillatie onder verlaagde druk ontdaan van het oplosmiddel waardoor 60 g (24% opbrengst) (3-tert.butoxycarbonylaminopropyl)-(3-aminopropyl)-5 methylamine (BOC-APMP) werden verkregen.

In 130 ml methanol werd het bovenverkregen BOC-APMP opgelost.Onder koelen in ijs en onder roeren werden aan de oplossing 69 g (2 equivalenten) cyclooctaancarbaldehyde en een oplossing van 10 g natriumcyaanboorhydride (NaBH^CN) in 10 20 ml methanol, toegevoegd.Het mengsel werd 24 uur bij kamertemperatuur geroerd.Na voltooiing van de reaktie werden 30 ml 6 n zoutzuur aan het reaktiemengsel toegevoegd om overmaat reduktiemiddel te ontleden alsmede om de tert.butoxygroep te verwijderen.Het mengsel werd door destillatie bij verlaagde 15 druk ontdaan van de methanol, vermengd met 400 ml gedestilleerd water, en geëxtraheerd met 300 ml chloroform om.„het resterende aldehyde te verwijderen.De waterige laag werd ingesteld op pH 13,5 met natriumhydroxide en twee keer met 200 ml chloroform geëxtraheerd.De chloroformlaag, die het beoogde 20 produkt bevatte, werd gedroogd boven natriumsulfaar en door destillatie onder verlaagde druk ontdaan van de chloroform.

Het residu werd gemengd met 100 ml gedestilleerd water en 50 ml geconcentreerd zoutzuur en tot droog ingedampt, waardoor 66 g (71% opbrengst) N-/3-^N-(3-aminopropyl)-N-methylamino7-25 propylicyclooctylamine trihydrochloride werden verkregen.

K.m.r. spektrum van het bovenstaande produkt, bepaald in zwaar water, vertoonde de volgende signalen: i(ppm)= 1,2-2,3, 15H (m); 2,0 - 2,8, 4H (m); 3,0 - 3,9, 10H (m) ; 3,25, 3H (s) (waarin m en s de bovenstaande betekenis hebben). 30 Deze signalen wijzen op de chemische struktuur van de verbinding zoals boven gegeven.Andere fysisch-chemische eigenschappen waren zoals vermeld in Tabel H.

Op een overeenkomstige wijze als hierboven beschreven werden N-/3-/N-(3-aminopropyl)-N-methylamino7propyl^-p-35 cyaanbenzylamine trihydrochloride (81% opbrengst) en N-/3-^N-(3-aminopropyl)-N-methylamino7propyl7-2-(p-chloorfenyl)-ethylamine trihydrochloride (51% opbrengst) verkregen uit respektievelijk p-cyaanbenzaldehyde en p-chloorfenylaceetal-dehyde.De fysisch-chemische eigenschappen van deze verbindin-40 gen waren zoals vermeld in Tabel H.

8204943 ......; ’ ................................ .. T-*m·.

- 53 -

Voorbeeld VI

Een oplossing van 14,90 g BOC-APMP, verkregen in de eerste trap van Voorbeeld V in 300 ml methanol werd met ijs-azijn ingesteld op een pH 6,4.Aan de in ijs gekoelde oplos-5 sing werden 77,30 g (4 equivalenten) 3,4-dibenzoxybenzaldehyde, gevolgd door 5,0 g NaBH^CN, toegevoegd.Het mengsel werd op kamertemperatuur gebracht, dan 96 uur geroerd, en door destillatie onder verlaagde druk ontdaan van de methanol.Het residu werd verdund met 200 ml gedestilleerd water en twee 10 keer geëxtraheerd met steeds 200 ml chloroform.De chloroform lagen werden gekombineerd, gedroogd boven natriumsulfaat, geconcentreerd tot 100 ml, en gevoerd door een siliciumdioxide gel kolom met een volume van 1200 ml, die van tevoren gewassen was met chloroform, teneinde adsorptie van de beoogde 15 verbinding op de kolom tot stand te brengen.De geadsorbeerde fase werd geëlueerd met een chloroform-methanol mengsel-ter* wijl de methanolconcentratie stapsgewijze werd verhoogd.Het beoogde produkt werd geëlueerd in het stadium waarin de verhouding van chloroform tot methanol op 97:3 was gekomen.De 20 eluaat frakties die het beoogde produkt bevatten, werden gekombineerd en onder verlaagde druk geconcentreerd waardoor 31,43 g l-/N-(tert.butoxycarbonylaminopropyl)-N-methylamino7--3-/di-(3,4-dibenzoxybenzyl) amino/propaan'vwefden vefckregen in de vorm van een olie.Aan een oplossing van de olie in 78,6 ml 25 dichloormethaan werden onder koelen in ijs en onder roeren 78,6 ml trifluorazijnzuur (TFA) druppelsgewijze toegevoegd in een tijdsbestek van 30 min.Men liet het mengsel 1,5 uur bij 0°C reageren.De bad-temperatuur werd toen verhoogd op 25°C en het oplosmiiddel werd onder verlaagde druk afgedestilleerd.

30 Het residu werd gemengd met 200 ml gedestilleerd water en 50 ml 5 n waterige natriumhydroxideoplossing, en geëxtraheerd met 500 ml chloroform om 3-/N-/N-methyl-N-/3'-di-(m,p-dibenz- oxybenzyl)aminopropyl7aminoy7ProPylamine (afgekort MDD-amine) te verzamelen.De waterige laag werd opnieuw geëxtraheerd met 35 100 ml chloroform.De chloroformlagen werden gekombineerd, gedroogd boven natriumsulfaat, en onder verlaagde druk van chloroform ontdaan waardoor 26,30 g MDD-amine als een ruwe olie werden verkregen.Ter zuivering werd de ruwe olie onderworpen

Sb aan Amberlite v XAD-2 (volume van 2000 ml) kolomchromatogra-40 fie, die op de volgende maniet werd uitgevoerd.De ruwe olie 8204943 - 54 - werd opgelost in 75 ml methanol an de oplossing werd gemengd met 750 ml van een 4% waterige kaliumacetaatoplossing - 2% waterig azijnzuur(1:1) bufferoplossing.De verkregen suspensie werd door de genoemde kolom gevoerd om het beoogde produkt te 5 adsorberen op de kolom.De genoemde bufferoplossing liet men door de kolom vloeien en methanol werd aan de buffer toegevoegd teneinde de methanolconcentratie stapsgewijze te verhogen. Het beoogde produkt (MDD-amine) bleek te worden geëlueerd als de verhouding van buffer tot methanol 15:85 werd.De frak-10 tie die het beoogde produkt bevatte, werd door destillatie onder verlaagde druk ontdaan van de methanol, daarna ingesteld op pH 13 met 5 n waterige natriumhydroxideoplossing, en drie keer met steeds 300 ml chloroform geëxtraheerd.De chloro-formlagen werden gekombineerd, gedroogd boven natriumsulfaat, 15 door destillatie onder verlaagde druk ontdaan van de chloroform, en gedroogd boven fosforpentoxide, waardoor 21,0.8 _g (46,2% opbrengst) MDD-amine (vrije base) te verschaffen in de vorm van een olie.De fysisch-chemische eigenschappen waren als vermeld in Tabel H.

8204943 t - 55 -

ff) CN iH

Μ Γ* 00 π Ιμ η ^ pcj o o o <n «n -«r r> K ro vo r- g * ' ·* *» .g rH *H Ή —. *6 ”β ö) *6 "ra -P g ra ra 6 6 S £

**^ ^ "*"* K

ft Q ffi ® W Z K KXffiK inECOK

Q. tr 00 ic <T o ID 'f Ί1 O r4 4* H CO

--— % H H

n [v. oo ιο n oo <n ,Η K » » - » * * •KgcMtn <n n n n (¾ soil I 1 1 1 ,n 2 lO ^

'—o φ η r^ <f W 1^ r> CN O O CN

^ » ·*»* * * » * CN CN Π ’t Γ' r4 iH H* n- '—I CN CO O") k « > k » » * ' * * * * * 00000 o o o o o m o o o o oo o cn cn otniocNO oo h· m

ΙΟ t}> ro ,-4 (Tl VO ^ i-4 O 00 (" Ν' Ή (T

CNr4i-4i-4 <Nr4r4r4 (\|i-4i-4 +j ooooo ooooo m o o o —»<D m o m Φ in mooooino r* o r* η» r4 ι-t r> ίο η η oi r> ”<3· r4 o <t co β η oi

ΚΙΛ<Νι-4γ4γ4 CN «Η i-4 Ή CN Η H

g (0 ^ Q |J * (¾¾%¾¾ **··**> <u — | m o o o o o mooooo ooooo n h r-^mwno i" o o oo io oo m m o er r-' (0 Pi CQ <r m *r h o r* Ol io in o 3l ie <r o cn <r r-- E4 H Ui (Ni-4(Hr4r4 (N H 4 4 N N 4 ^ ^ ^ ^ % ^ H ^ ^ ^ ^ ^ mooooo mooooo m o o o o CNOiomiom cnoocnct^t cNoor'in TJI o 'T <N O 00 N* O N1 r-H (T Γ' ΤΓ 0*1 o co mCNi-4r4r4 Μ Π 4 4 C") (N >-4 i-4

Z

* I

z z ii

1 - ZO

Z I H

φ Η I II -»0 C >1 I 0 0 H >1

•H ft H HIM >i U I

g 0ΗΌ >i *Ν Ό ft I H

(13 M >i >i ft H >i O'SM

ft ft λ o >1 λ £ h +> Ό 00-H MftH ft>i

M C Μ M ft 0 M o α II

φ -H ft -P C Η -P G 0 C

φ g IV H ft H P -H

ra S oi « £ n « g ft g o Η ICC Cd 01 C <« IV cd Ό

4J Η Η -Η I C Η I 01 H -H

CU «ge Η H g mC>,M

x; icdcd wg(o '-•ήλο

4-1 |2 Η H (U I Cd Η φ I g +* H

C VI >1 >1 Ό IZ H >1 T3 12 Cd O Λ >1 ΙΛΝΗ VI >ί N -H VJ H g 0 en rn-MCM I Λ C Μ l>iH0

m ΙΦΦ0 m 4J Φ. . 0 m Λ >i M

O V g Λ Η ν,ΦΛΗ V -P -P T3 ΙΗΗΛ ΙΗΗΛ I O 0 >i Z'O'OO ΖΌΌ0 Z Ê 0 Λ 8204943 - 56 - rp Μ oo r- ^ e cn cn · » * o o o e oo oo 00 Γ- P' K K k

f—f rH O

"e Ίλ 'm 'e ë ë ë ë ë ë ë ë ë ^ ^ ^ ^ ~ e ^ w as cn

E E E K E E cn E K E h E E E

H* CO E CN rr ^ h E H1 e μ ·<3· 00 cn r-· co «η co σ> co cn o r·

%. *» ** ** ·«. *. N

CN E 00 CN E P"~ rH CN p·» l ( t lit tl l

CO E

O O rH LD P' rt fll (S CN O H E

»>, K V >k s ^ ^ s ·· ^ ^ ^ ^ cm ro n ^ Is· cn cn ro Γ·*- r-tcNcom^ k, k. K ^ k k k k, ^ k k» V k, k» k, k,

O O O O O O O O O P~ O LD E O LD O O O

LD E CN CN Γ» E LD O O CN E O 00 CN U") Lfl E

Ρ^σιΕΉσιΓ' E E CN O P"· 00 O CN 'T E 0Ί O

,_. CN I—I i-H i—I CN rH rH rH i—IrHi—(i—(r-IE

tn I—) k k k k k. k. k k, k k k k k k k k k k

O O O O O O O O O O O O OOLOEOOOO

> ooop'cnn o o h f" h ono\(nhiio^«

S-) 00 O E —I <n 00 CO E E O CO P'OHH'EOOcnE

(DCNCN-HiH CNr-IrHiH rH «Η Η Η H CN E

> W k k H k ^ k k k k k k kkkkkkkk

EOOOOO LD O O O O O OEOOOEOE

E Γ' LD O CN E E Γ'' O H O E LP) ΕΟΕΟΟΟΗΓ^Γ'

31 O) I— CN O E CTiO^Pi-IEE t^-cnrHEincOCOE

rH CN CN Ή —I rH (N N Η H rH rH r-l i—I CN E

<D

C\ k k k k k k k k k k k k kkkkkkkk

Π3 E LD O O O O EOOOOO OOOEOOOE

Eh CN P"» ^ O E O CN O E E E CN ΟΕΕΕΗΕΟΓ'

Η1 E 00 E O O H* Lf> ^ rH ΟΊ t'' EErHCNEr^EO

E CN E H rH E CN rH rH rHrHrHrHCNE

1 I

i o i α <d

E Jh ZO) * G

I Ό IC g -H

«-« I >1 -N -rj "" g rH a El η I g -rl I Π3

>t *— -H >ï CN (0 Ό o iH

Cu I iH α I η I C >1 0\4-l 0 \ >1 IE -H ft

}H rH U H c \lgO

CU >1 CU CU rH -P I Π3 P

0 cu c o & i \ gans ga>iSH >1 n o

dj t\ cd l\ G O ECG

| 01 rH I 01 Φ rH -P CU Ή EC>1 ECUHE t (0

1 g C O I g 0 -H I K I

IZ <U Ό IZ <d 0 P Z0\|

\ΙιΗΕ·Η \|rHrHO \NrH

1 >i C P 1 >1 E >i I C >1 ΕΕΠ30 E E U E Z <U Λ \ E (β rH \E|-H \E0

I d) >1 E I CU CU P I -Η P

Z g O 0 Zg-'+J ΕΌΛ 8204943 .................................. ..........— f·*.». . ..............

- 57 -

Tabel H (vervolg) N. Noot:*l s, t en m tussen haakjes staan voor respektievelijk singulet, triplet en multiplet.

*2 Relatieve mobiliteit als die van alanine 1,0 is in 5 de dunne laag elektroforese /Avicel SF ®(FMC Co.), mierezuur-azijnzuur-water (27:75:900 op vol.basis), 800 V, 6 min^· *3 Dunne laag chromatografie: Silica gel 60F 254 (Merck , Co.), methanol-10% waterige ammoniumacetaatoplossing-10 -10% waterige ammoniak (1:1:1 op vol.basis), 800 V, 6 min.7· *4 Methanol-10% waterige ammoniumacetaatoplossing-10% waterige ammoniak (10:1:1 op vol.basis).

8204943

Claims

10 -N-X,, of -N-X0 is, X0 een waterstofatoom, een korte keten -.4. alkyl- of benzylgroep is, X3 (a) een korte keten alkylgroep, (b) een fenyl(korte keten)alkylgroep, of (c) een mono- of di-(korte keten)alkylamino(korte keten)-alkylgroep, die gesubstitueerd kan zijn door een fenyl of 15 halogeenfenylgroep, is en X^ (a) een korte keten alkylgroëp of (b) een fenyl(korte keten)alkylgroep, een thiazolylgroep, of een N-fenyl(korte keten)alkylpiperazinylgroep is. 4. (Amido)N-gesubstitueerd bleomycine of een zout daarvan volgens conclusie 1, m e t het kenmerk, dat 20 de (korte keten)alkylgroep een mono- of di-(korte keten)-alkylamino(korte keten)alkylamino(korte keten)alkylgroep, een fenyl(korte keten)alkylamino(korte keten)alkylgroep, een di-(korte keten)alkylamino(korte keten)alkylgroep, een N-/halo-geenfenyl(korte keten)alkylamino(korte keten)alkyl7-N-(korte 25 keten)alkylamino(korte keten)alkylgroep, of een N-(korte keten) alkyl-N-feny- (korte keten)alkyl-N-/difenyl(korte keten)-alkylamino(korte keten)alkyl7amino(korte keten)alkylgroep is. 5. (Amido)N-gesubstitueerd bleomycine of een zout daarvan volgens conclusie l,met het kenmerk, dat 30. een alifatische primaire aminogroep met een basische groep is. 6. (Amido)N-gesubstitueerd bleomycine of een zout daarvan volgens conclusie 5,met het kenmerk, dat de alifatische primaire aminogroep de 1-fenylethylaminopro-35 pylaminogroep, butylaminopropylaminogroep of een groep met de formule -NH-(CH2)3-A'-(CH2)3-B' is, in welke laatste 8204943 - 60 - flO' R10' A' een groep -N- of -N +- is, (waarin RlQ, een korte keten Rll' alkylgroep en R.^, een korte keten alkyl- of benzylgroep is) en B' een groep R, ,, i 3 -n-Ri2, is, waarin R^i een fenyl(korte 5 keten)alkylgroep is, die in zijn fenylkern êën of meer halo-geenatomen, cyaangroepen of benzoxygroepen kan bevatten, of een korte keten alkylgroep, gesubstitueerd door een cycloal-kylgroep met 5-13 koolstofatomen is, en R^i een waterstofatoom of een benzylgroep , die door 1 of 2 benzoxygroepen 10 gesubstitueerd kan zijn, is. 7. (Amido)N-gesubstitueerd bleomycine of een zout daarvan volgens conclusie l,met het kenmerk ,dat X een isopropyl, 1-fenylethylaminopropyl, diethylamino-i-methylbutyl, of dibutylaminopropylgroep is, en R een 1-fenyl-15 ethylaminopropylamino, een N-(korte keten)alkyl-N-(halogeen-benzylaminopropyl)aminopropylamino, of n-butylaminopropylami-nopropylaminogroep is. 8. (Amido)N-gesubstitueerd bleomycine of een zout daarvan volgens conclusie 1, m e t het kenmerk, dat 20. een alkylgroep met 3-10 koolstofatomen, benzyl, 1-fenyleth-ylaminopropyl, di-n-butylaminopropyl, n-butylaminopropylami-nopropyl, N-methyl-N-benzyl-N-(dibenzylaminopropyl)aminopro-pyl, of N-methyl-N-(halogeenfenylethylaminopropyl)aminopropyl is en R staat voor N-methyl-N-(halogeenfenylethylaminopropyl)-25 aminopropylamino, N-methyl-N-benzyl-N-(dibenzylaminopropyl)-aminopropylamino, N-methyl-N-/di-(m,p-dibenzoxybenzyl)aminpro-pyl7aminopropylamino, N,N-dimethyl-N-(dibenzylaminopropyl)-aminopropylamino, N,N-diethyl-N-(dibenzylaminopropyl)aminopropylamino, N-methyl-N-(cyclooctylmethylaminopropyl)amino-30 propylamino, of N-methyl-N-(cyaanbenzylaminopropyl)aminopropylamino. 9. 3-/N,N-dimethyl-N-/3-(dibenzylamino)propyl7anino/-propylamino-(amido)N-/3-((S)-1'-fenylethyl)aminopropyl/-bleo-mycine of een zout daarvan. 8204943 ; ~" ... v.v~ - "-· f ** - 61 - 10. 3-/N-methy—N-^5 '-di- (m,p-dibenzoxybenzyl) amino- r> propyl7amino/propylamino- (amido)N-/3- ((S) -1 '-fenylethyl) - aminopropyl7bleomycine of een zout daarvan. 11. 3-/N,N-dimethyl-N-^3-(dibenzylamino)propyl7amino/-5 propylamino-(amido)N-octylbleomycine. 12. 3-/N-methy1-N-/3'-di(m,p-dibenzoxybenzy1)aminopro-pyl7amino7propylamino-(amido}N-octylbleomycine.

13. Werkwijze voor de bereiding van (amido)N-gesubstitu-eerde bleomycinen, met het kenmerk, dat men een 10 (amido)N-gesubstitueerd bleomycine met formule CONH- NHL I 2 I 2 CH- -NH -CH < / \ / \ CH CH2 CO-NH-X N-π—CO-R of een zout daarvan, waarin BM een groep van het bleomycine-skelet is; X (1) een alkylgroep met 1-18 koolstofatomen, (2) een aminoalkylgroep met 1-12 koolstofatomen, (3) een korte 15 keten alkylgroep met als substituent (a) 1-3 halogeenatomen, (b) 1 of 2 fenylgroepen, (c) een indolylgroep, of (d) een heterocyclische 5- of 6-ring met een zuurstof, zwavel of stikstofatoom (van de substitutiegroepen kunnen de fenyl of indolylgroep verder gesubstitueerd zijn met een halogeenatoom 20 of een korte keten alkoxygroep) , (4) X^korte keten alkylgroep, waarin X^^ een groep X2 X2 -N-X. of -N-X-, is, Xn een water-J I J 2. X4 stofatoom, een korte keten alkyl- of benzylgroep is, (a) een korte keten alkylgroep, (b) een fenyl(korte keten)alkyl-25 groep, of (c) een mono- of di-(korte keten)alkylamino(korte keten)alkylgroep , die gesubstitueerd kan zijn door een fenyl of halogeenfenylgroep, is; X4 (a) een korte keten alkylgroep of (b) een fenyl(korte keten)alkylgroep is, (5) naftyl, (6) thiazolyl og (7)een N-fenyl(korte keten)alkylpiperazinyl-30 groep is,; en R een aminogroep, overeenkomend met de eind-standige aminogroep van bleomycine, bereidt, doordat men een 8204943 - 62 - verbinding met de formule C0NHo NH- i 2 i 2 CH0 .NH . CH. 'k / \ / \ CH CH,, 00-ΧΛ

2 O N-η-CO-R frnrJCr, ° BM- waarin BM de bovenstaande betekenis heeft, RQ een hydroxygroep of een eindstandige aminogroep van bleomycine voorstelt, en 5 XQ een hydroxygroep of een groep met de formule -NH-X voorstelt, waarin X de bovenstaande betekenis heeft, vooropgesteld, dat tenminste ëën van de groepen Rq and XQ een hydroxygroep is; of een reaktief derivaat van de carboxylgroep daarvan laat kondenseren met (a) een amine met de formule 10 h2n-x waarin X de bovenstaande betekenis heeft, als Rq in de bovenstaande formule een hydroxygroep is, of met (b) een amine met de formule H-R waarin R de bovenstaande betekenis heeft, als R, in de o 15 bovenstaande formule een hydroxygroep is en XQ een groep -NH-X is, waarin X de bovenstaande betekenis heeft, en desgewenst het koper uit het gevormde kondensatieprodukt verwijdert. 14. (Amido)N-gesubstitueerd bleomycinezuur met de onder staande formule of een zout daarvan:

20 CONH- NH~ i i CH0 ,NH „CH ^ / \ / \ nCH CH2 co-nh-x N-π— COOH waarin BM een groep van het bleomycineskelet voorstelt; X (1) een alkylgroep met 1-18 koolstofatomen, (2) een amino-alkylgroep met 1-12 koolstofatomen, (3) een korte keten alkyl groep met als substituent (a) 1-3 halogeenatomen, (b) 1 of 2 25 fenylgroepen, (c) een indolylgroep, of (d) een heterocyclische 5- of 6-ring, die een zuurstof, zwavel of stikstofatoom 8204943 - 63 - (van de substitutiegroepen kunnen de fenyl of indolylgroep - verder gesubstitueerd zijn door een halgeenatoom of een korte keten alkoxygroep), (4) een X^-(korte keten)alkylgroep, waarin een groep X2 X2

5 -N-X3 of “N-X3 is, X2 een waterstof- atoom, een korte keten alkyl- of benzylgroep is, X3 (a) een korte keten alkyl, (b) een fenyl(korte keten)alkyl, of (c) een mono- of di-(korte keten)alkylamino(korte keten)alkylgroep die gesubstitueerd kan zijn door een fenyl- of halogeenfenyΙ-ΙΟ groep, is; X4 (a) een korte keten alkylgroep of (b) een fenyl-(korte keten)alkylgroep, is; (5) een naftylgroep, (6) een thiazolylgroep of (7) een N-fenyl(korte keten)alkylpiperazin-ylgroep is.

15. Deamidobleomycinezuur of een zout daarvan met de for- 15 mule CONH- NH- I 2 I 2 CH-, -NH VCH N? / \ / \ nch ch2 cooh N-h-COOH ίΓΧ N--1Γ— waarin BM een groep van het bleomycineskelet voorstelt, of een zout daarvan.

16. Amine met de formule 20 nh2-(ch2)3-a*-(ch2)3-b· waarin A' een groep R1QI R1Q, -N- of -N- voorstelt, waarin R10' en Rll' R11( ieder een korte keten alkyl- of benzylgroep voorstellen, en B' een di-^/fenyl (korte keten)alkyl7amino, een cyaanfenyl-25 (korte keten)alkylamino, een cycloalkyl(met 5-13 koolstofato-men)-gesubstitueerd (korte keten)alkylamino, of een dibenzoxy-fenyl(korte keten)alkylaminogroep is. 8204943