DE2649604A1 - Neue antibiotika sf-1771 und sf- 1771-b und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents
Neue antibiotika sf-1771 und sf- 1771-b und verfahren zu ihrer herstellungInfo
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Description
PATENTANWÄLTE
DR.A.VAN DERWERTH DR.FRANZ LEDERER REINER F.MEYER
DIPL-ING. (1934-1974) DiPL-CHEM. DIPL-ING.
8000 MÜNCHEN 80
TELEFON: (089) 472947 TELEX: 524624 LEDER D TELEGR.: LEDERERPATENT
29- Oktober 1976
Meigi Seika Kaisha, Ltd.
Nr. .8, 2-chome, Kyobashi, Chuo-ku, Tokio, Japan
Neue Antibiotika SF-1771 und SE-I771-B und Verfahren zu
ihrer Herstellung
Die Erfindung betrifft eine neue antibiotische Substanz SF-1771» die durch Kultivieren eines neuen Stammes, Streptomyces
toyocaensis S]T-1771i in einem flüssigen Kulturmedium
unter aeroben Bedingungen gebildet wird, und dieses Antibiotikum kann aus der Ifermentationsbrühe durch Behandlung
des Brühenfiltrates mit einem synthetischen, adsorbierenden Harz zur Adsorption der aktiven Verbindung und Eluieren des
Harzes mit wäßrigem Alkohol oder wäßrigem Aceton und anschließende
chromatografische Reinigung isoliert werden.
Die Substanz SF-1771 ist ein kupferhaltiges Antibiotikuni,
das antibakterielle Aktivität gegenüber Escherichia coli, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus und Bacillus subtilis zeigt. Die Entfernung der Kupferkomponente aus der Substanz SF-1771 durch Behandlung
mit Schwefelwasserstoff, einem Alkalimetallsulfid oder
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einem Kupfer chelatieren&en Mittel ergibt die Substanz SF-1771-B
welche keine Kupferkomponente enthält und eine ebenso hohe antibakterielle Aktivität jedoch eine geringere Toxizität
als die Substanz SF-1771 zeigt.
Die Erfindung betrifft daher die beiden neuen Antibiotika,
welche als Substanzen SF-1771 und SF-I771-B bezeichnet werden,
weiterhin die fermentative Herstellung der Substanz SF-1771 und die Herstellung der Substanz SF-1771-B durch chemische
Behandlung der Substanz SF-1771, weiterhin betrifft die Erfindung
die Verwendung der Substanzen SF-1771 und SF-1771-B.
Eine große Vielzahl von pathogenen Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen sind die Verursacher von Krankheiten
bei Menschen, Tieren und Pflanzen. Obwohl eine Anzahl von Antibiotika entwickelt wurde, von denen einige eine hohe antimikrobielle
Aktivität gegenüber einem oder mehreren pathogenen Mikroorganismen zeigen, besteht dennoch ein Bedarf für
wirksamere Mittel zur Bekämpfung zahlreicher durch diese Mikroorganismen bei Menschen, Tieren und Pflanzen hervorgerufener
Krankheiten.
Aufgabe der Erfindung sind neue Antibiotika, die als antibakterielle Mittel für die therapeutische Behandlung von
bakteriellen Infektionen bei Menschen und Tieren und/oder
zur Sterilisation von chirurgischen Materialien und Instrumenten vorteilhaft sind. Weitere Aufgabe der Erfindung ist
ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen Antibiotika.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beschreibung näher erläutert. Es wurden ausgedehnte Untersuchungen unternommen,
um neue und vorteilhafte Antibiotika herzustellen. Als Ergebnis wurde gefunden, daß bei der Kultivierung eines neuen
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Stammes der Art Streptomyces, der aus einer in Tada-u-mi-cho,
Takehara Cita, Hiroshima Prefecture, Japan, gesammelten Bodenprobe
isoliert wurde, in einem Kulturmedium unter aeroben Bedingungen eine eine antibakterielle Aktivität gegenüber
gram-negativen und gram-positiven Bakterien zeigende Substanz gebildet und in der Kultur angesammelt wird. Es war nun
möglich, diese antibakterielle Substanz aus der Kultur zu isolieren und sie zu reinigen. Als Ergebnis der chemischen,
physikalischen und mikrobiellen Eigenschaften dieser isolierten Substanz wurde bestätigt, daß diese antibiotisch wirkende
Substanz ein neues Antibiotikum ist, das sich von jedem der bekannten Antibiotika unterscheidet. Dieses neue Antibiotikum
wurde daher als Substanz Sl-I771 bezeichnet.
Die Erfindung betrifft daher in ihrer ersten Ausführungsform
als neues und vorteilhaftes Antibiotikum die Substanz SF-1771,
eine blaugefärbte Verbindung in Form eines amorphen Pulvers, das basisch ist, in Wasser löslich ist und eine antibakteriell
Aktivität zeigt. Das Hydrochlorid verfärbt sich langsam bei 18$ C nach braun und zersetzt sich bei 208 C unter Schäumen,
das Hydrochlorid ist in Wasser leicht löslich, löslich in Methan, gering löslich in Äthanol und Butanol jedoch unlöslich
in den anderen organischen Lösungsmitteln. Das HydroChlorid
ist positiv bei den Reaktionen mit Ninhydrinreagens,
Ehrlich-Reagens, Kaliumpermanganatreagens, Greig-Leiback-Reagens und es ist negativ bei der Reaktion mit Sakaguchi-Reagens.
Das Hydroehlorid zeigt ein Molekulargewicht von etwa 1600, bestimmt nach der Barger-Methode und ergibt bei der
Elementaranalyse: C = 38,70 %, H = 5,42 %, H =" 13,03 %,
0 = 29,62 %, S =3,62 %, Cl = 6,07 % und Cu = 3,53 % (gemessen
durch Atomabsorptionsspektroskopie). Das Hydroehlorid zeigt charakteristische Absorütionsspitzen bei 248 nm (E^ =
146) und bei 282-284 nm (E^ = 106) im UV-Absorptionsspektrum
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in Wasser und es zeigt charakteristische Absorptionsbanden,
wie sie in der Fig. 2 der Zeichnung gezeigt sind, bei dem
IR-Absorptionsspektrum als Tablette in Kaliumbromid. Die
Erfindung betrifft weiterhin ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz der Substanz SF-1771-
Beispiele von pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzen
der erfindungsgemäßen Substanz SF-1771 umfassen das Hydrochlorid,
Sulfat, Nitrat, Phosphat, Acetat, Maleat, Fumarat, Succinat, Tartrat, Oxalat, Citrat, Methansulfonat, Xthansulfonat
und dergleichen.
Weiterhin wurde gefunden, daß die in dem Holekül der Substanz
SF-I77I vorhandene Kupferkomponente, wenn die Substanz SF-I771
mit Schwefelwasserstoff oder einem Alkalimetallsulfid wie
Natriumsulfid in Lösung in Wasser behandelt wird, hieraus in Form von Kupfersulfid entfernt wird, so daß eine weitere
neue Substanz gebildet wird, welche die Kupferkomponente nicht
enthält, jedoch eine ebenso hohe antibakterielle Aktivität mit geringerer Toxizität als die Substanz SF-1771 selbst
zeigt. Es wurde gefunden, daß die Substanz SF-I77I-B ebenfalls
eine Antitumoraktivität aufweist. Diese neue Substanz wurde als Substanz SF-1771-B bezeichnet.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform betrifft die Erfindung daher als neues und vorteilhaftes Antibiotikum die Substanz
SF-177I-B, eine farblose oder schwach gelb gefärbte Verbindung
in Form eines amorphen Pulvers, welches basisch ist, in Wasser löslich ist und eine antibakterielle Aktivität und
eine Antitumoraktivität zeigt. Das Hydrochlorid hiervon
verfärbt sich bei Ί80 C langsam nach braun und zersetzt
sich bei 212 0C unter Schäumen. Das Hydrochloiid ist in Wasser
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leicht loslich, löslich in Methanol, gering löslich in
Äthanol und Butanol jedoch unlöslich in den anderen organischen
Lösungsmitteln· Das Hydrochlorid ist bei den Reaktionen
mit Hinhydrinreagens, Ehrlich-Reagens, Kaliumpermanganatreagens
und Greig-Leiback-Reagens positiv, und es ist bei der Reaktion mit Sakaguchi-Reagens negativ. Das Hydrochlorid
zeigt ein Molekulargewicht von etwa 160.0, gemessen nach der Barger-Methode und eine spezifische, optische Drehung
^0 °
0 = -18,4° (C=I, H2O). Das Hydrochlorid der Substanz
zeigt eine Elementaranalyse von: C = 41,36 %, H = 5,53 %»
N = 14,19 #, S » 3,64 % und 0 = 28,93 %. Das Hydrochlorid
zeigt eine charakteristische Absorptionsspitze bei 288-290 nm
(E'' = 84) im UV-Absorptionsspektrum, aufgelöst in Wasser,
und es zeigt charakteristische Absorptionsbanden, wie sie in der Fig. 5 der Zeichnung gezeigt sind, im IR-Absorptionsspektrum
in Tablettenform in Kaliumbromid, weiterhin zeigt es ein Absorptionsspektrum der protonenmagnetischen Resonanz,
wie es in Fig. 6 der Zeichnung wiedergegeben ist, aufgelöst in Deuterowasser. Die Erfindung betrifft weiterhin ein pharmazeutisch
annehmbares Säureadditionssalz der Substanz SF-I77I-B. ' -
Beispiele für pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze
der Substanz SF-1771-B sind die gleichen, wie sie zuvor für
die erfindungsgemäße Substanz SF-1771 beschrieben wurde.
Diese Säureadditionssalze der Substanz SF-1771-B wie auch
der Substanz SF-1771 können durch Umsetzung der Substanz SF-I771-B oder der Substanz SF-I771 in Form der freien Base
mit einer pharmazeutisch annehmbaren Säure wie Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure oder Essigsäure
in Lösung in Wasser bei Umgebungstemperatur in bekannter Weise hergestellt werden.
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Im folgenden wird auf die Zeichnung Bezug genommen. In der Zeichnung sind:
Fig. 1 ein U"V-A"bsorpt ions Spektrum des Hydro chlorides der
Substanz SF-Wl in Wasser.
Fig. 2 ein IE-Ab Sorptionsspektrum, des Hydro chlorides der
Substanz SF-1771 in Tablettenform in Kaliumbromid.
Fig. 3 Muster der Gradientenelution der Substanz SF-1771
und hiermit in Beziehung gesetzte Antibiotika bei der Chromatografie auf einem Ionenaustauscher-gelfiltrationsmittel
(CH-Sephadex C-25) (H+) im "Vergleich
zu dem Elutionsmuster von Ammoniumformiat.
Fig. 4 ein UV-Absorptionsspektrum des Hydrochlorids der
Substanz SF-1771-B in Wasser.
Fig. 5 ein IR-Absorptionsspektrum des Hydrochlorids der
Substanz SF-1771-B als Tablette in Kaliumbromid.
Fig. 6 ein Absorptionsspektrum der protonenmagnetischen Resonanz des Hydrochlorids der Substanz SF-1771-B
in Deuterowasser, gemessen bei 100 HHz.
Das Hydrochlorid der Substanz SF-1771 zeigt die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:
(1) Aussehen: blau gefärbtes, amorphes Pulver
(2) Zersetzungstemperatür: Verfärbung nach braun erfolgt
langsam bei 185 °C und die Zersetzung tritt bei 208 0C
unter Schäumen auf.
(3) Elementaranalyse: Das Hydrochlorid der Substanz SF-1771 enthält die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff,
Sauerstoff, Schwefel, Kupfer und Chlor und ergibt bei der Analyse folgendes Ergebnis: C = 38,70 %, H = 5,42 %, Ή =
13,03 %, 0 = 29,62 %, S = 3,62 %, Cl = 6,07 % und Cu = 3,53
(gemessen durch Atomabsorptionsspektroskopie).
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KK
(4) UV-Absorptionsspektrum: Das UV-Spektrum des Hydro Chlorids
der Substanz SF-1771> gemessen in wäßriger Lösung, ist
in der Fig. 1 dargestellt und zeigt Absorptionsspitzen
bei 248 um (E^ = 146) und bei 282-284 mi (E^ = 106).
(5) IE-ÄbsοrptionsSpektrum: Das IH-Spektrum des Hydrochloride
der Substanz SI1-1771 i-n Form der Kaliumbromidtablette ist
in der Fig. 2 dargestellt.
(6) Molekulargewicht: Das Molekulargewicht beträgt etwa 1600, gemessen nach der Barger-Methode, und es wird angenommen,
daß ein einzelnes Kupferatom pro Molekül der Substanz SF-1771 vorhanden ist.
(7) Löslichkeit: leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol, gering löslich in Äthanol und Butanol, jedoch
unlöslich in den anderen organischen Lösungsmitteln.
(8) Farbreaktion: positiv gegenüber Ninhydrin-* Ehrlich-,
Kaliumpermanganat- und Greig-Leiback-Reagenzien; negativ
gegenüber Sakaguchi-Eeagens.
(9) Stabilität: stabil in neutralen und sauren Medien,
jedoch relativ instabil in alkalischen Medien.
(10) Rf-Wert: Bei der Dünnschichtchromatografie auf Kieselerde (Kieselgel 60 Fp1-^ von Merck Co., Deutschland)
ergibt das Hydrochlorid der Substanz SF-1771 einen einzelnen
Fleck bei den in der folgenden Tabelle I gezeigten Rf-Werten.
Entwicklerlösungsmittel
Propylalkohol-Pyridin-Essigsäure-
Wasser (15:10:3:12 in Volumen) 0,76
Methanol-10 %iges wäßriges Ammonium-
acetat-10 %iges wäßriges Ammoniak
(10:9:1 in Volumen) . 0,57
10 %iges wäßriges Ammoniumacetat-Methanol (1:1 in Volumen) 0,68
10 %iges wäßriges Ammoniumacetat-Methanol (1:2 in Volumen) 0,54
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(11) Ef-Wert: Bei der Papierchromatografie (aufsteigende
Methode) erscheint der einzelne Fleck bei den in der folgenden Tabelle II angegebenen Rf-Werten:
wassergesättigtes n-Butanol O
3 %iges wäßriges Ammoniumehlorid
(in Gewicht) 0,71
Phenol-Wasser (3:1 in Volumen) 0,69
Aceton-Wasser (1:1 in Volumen) 0,09
n-Butanol-Methanol-Wasser
(4:1:2 in Volumen) 0,06
B en ζ ο1-Methano1
(4:1 in Volumen) 0,02
Wasser 0,07
(12) Optische Drehung: Die Bestimmung der spezifischen, optischen Drehung ist mit der D-Strahlung als Folge
der blauen Färbung der Lösung des Hydrochlorides der
Substanz SF-1771 unmöglich.
(13) Elutionsmuster: Die Fig. 3 zeigt die Muster der Gradientenelution
des Hydrochlorides der Substanz SF-1771 und hiermit in Beziehung gesetzter Antibiotika bei der Elution
aus einem Ionenaustauscher-gelfiltrationsmittel (CM-Sephadex
G-25 von Pharmacia Co., Schweden) in der H+- Forrn, entwickelt mit 0 bis 1,0 M Ammoniumformiat als
Elutionsmittel. Jedes Eluat wurde als 5-ml-Fraktion
gesammelt, und die optische Dichte jeder Fraktion wurde
bestimmt. Der Unterschied zwischen den bestimmten Werten der optischen Dichte jeder Fraktion und des gemessenen
Wertes der optischen Dichte des reinen Elutionsmittels wurde als Werte AOD auf der Ordinate, bezogen auf die
Nummer des Röhrchens für gede Fraktion, aufgetragen auf
der Abszisse, wie in der Fig. 3 dargestellt, aufgetragen.
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Die mit der erfindungsgemäßen Substanz in Beziehung gesetzten, untersuchten Antibiotika waren Bleomycine,
Victomycin und Platomycin A und B für Vergleichszwecke. Aus diesen Elutionsmustern ist ersichtlich, daß das
Hydrochlorid der Substanz SF-1771 später als Bleomycin
Jedoch etwas schneller als Bleomycin B^,, Victomycin und
Platomycin A eluiert wird.
Die erfindungsgemäße Substanz SF-I771 zeigt ein antibakteriel
les Spektrum, wie es in der folgenden Tabelle III angegeben ist. Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) der Substanz
SF-1771 gegenüber verschiedenen Mikroorganismen wurden nach der bekannten Brühenverdünnungsmethode derart bestimmt, daß
die Bestimmung nach einer bei 37 °C während 18 Stunden durchgeführten
Inkubation unter Verwendung eines Herzinfusionsagars
als Inkubationsmedium durchgeführt wurde.
Antibakterielles Spektrum der Substanz SF-1771 Testmikroorganismen MIC (ng/ml)
Escherichia coli 0,39
Escherichia coli K-12-R 0,39
Salmonella typhi ·* 0,2
Pseudomonas aeruginosa 25
Staphylococcus aureus 209P 3,12
Bacillus subtilis FC1-219 1,56
Vie sich aus den Ergebnissen der Tabelle III entnehmen läßt, zeigt die erfindungsgemäße Substanz SF-I771 eine hohe antibakterielle Aktivität gegenüber gram-positiven und gram-negativen
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λΗ
Bakterien, wobei sie eine bemerkenswert hohe antibakterielle
Aktivität gegenüber den gram-negativen Bakterien aufweist.
Weiterhin wurde gefunden, daß die Substanz SF-I771 ebenfalls
eine Antipilzaktivität gegenüber verschiedenen Pilzen zeigt. Die minimalen Hemmkonzentrationen der Substanz SF-1771 gegenüber
verschiedenen Pilzen wurden nach der bekannten Brülienverdünnungsmethode
in der Weise bestimmt, daß die Bestimmung nach der Durchführung der Inkubation bei 28 0C während drei
Tagen unter Verwendung eines Sabouraud-glucoseagars als Inknbationsmedium durchgeführt wurde. Für Trichophyton
asteroides und JLspergillus fumigatus war die Inkubationszeit
jedoch fünf Tage. Das Antipilzspektrum. der Substanz SF-1771 ist in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt.
AntipilζSpektrum der Substanz SF-1771
Testorganismen HIC (ug/ml)
Candida albicans > 100
Candida krusei 12,5
Candida parapsilosis 50
Candida stellatoidea 100
Candida tropicalis > 100
Cryptococcus albidus 0,78
Cryptococcus laurentii 6,25
Cryptococcus neoformans 30I 0,78
Cryptococcus terreus 0,78
Cryptococcus uniguttulatus 3,13
Pichia spartinae 12,5
Saccharomyces cerevisiae __ 12,5
Trichophyton asteroides 6,25
Aspergillus fuaiigatus 1,56
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Weiterhin wurde gefunden, daß die Substanz SF-1771 zur Behandlung von Trichophytonsinfektionen bei Tieren wirksam
ist. So wurden sechs Gruppen von Testtieren, wobei jede Gruppe aus zehn Meerschweinchen vom Hartley-Stamm (männlich,
erxirachsen, Gewicht 310-400 g) bestand, mit Trichophyton
asteroides in solcher Weise geimpft, daß der Pelz von vier
Bereichen der Haut auf dem Rücken eines jeden Tieres weggeschnitten
wurde, daß diese Hautflächen mit Sandpapier abgerieben wurden und dann hierauf eine wäßrige Suspension
des Hycels von Trichophyton asteroides aufgetragen, wurde. Zwei
Tage nach dem Impfen wurde eine Lösung von 1 Gew.-% der Substanz SF-I771 in Äthanol auf die beimpften Hautbereiche einmal
am Tag während neun Tagen zur therapeutischen Behandlung der Trichophyton-Infektion aufgebracht. Bei der KontroIlgruppe
der Testtiere wurde lediglich wäßriges 70 %iges Äthanol auf
die beimpften Hautbereiche in der gleichen Weise wie zuvor aufgetragen. Hach dieser Behandlung wurden die Tiere getötet
und aus den so behandelten Hautflächen wurden drei Stücke (3x3 mm) der Haut ausgeschnitten, diese wurden anschließend
auf einer Platte von Agarkulturmedium bei 27 0C für drei
Tage inkubiert. Die mikroskopische Betrachtung zeigte, daß kein Wachstum des Pilzes auf allen Hautstücken beobachtet
werden konnte, welche aus den mit der erfindungsgemäßen Substanz SF-1771 behandelten Hautflächen ausgeschnitten worden
waren, während das Wachstum des Pilzes auf praktisch allen Hautstücken beobachtet werden konnte, die aus den Hautflächen
der lediglich mit dem wäßrigen Äthanol behandelten Kontrolltieren ausgeschnitten worden waren.
Zur Bestimmung der akuten Toxizität der Substanz SF-1771 wurden Lösungen, welche 6,25 mg - 50 mg der Substanz SF-1771
pro 0,2 ml isotonischer NatriumchloridlÖsung enthielten,
intravenös mit einer Dosis von 0,2 ml pro Maus bei mehreren
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Gruppen von Mäusen inj'iziert, wobei j"ede Gruppe aus fünf.
Mäusen vom ICR-Stamm (männlich, erwachsen, Gewicht im Durchschnitt 20 g) bestand.
Sieben Tage nach dieser intravenösen Injektion wurde bestimmt, daß die Prozentsätze der Anzahl der toten Mäuse, bezogen auf
die Gesamtanzahl der untersuchten Mäuse, 100 %, 100 %, 60 %
und 20 °/o bei den Dosiswerten von 50 mg/kg, 25 mg/kg, 12,5 mg/kg
bzw. 6,25 mg/kg der Substanz SF-1771 pro Maus lagen. Es kann daher nicht gesagt werden, daß die Substanz SF-1771 nichttoxisch ist, j'edoch ist sie dennoch zur Sterilisation von
chirurgischen Materialien und Instrumenten wie auch von anderen Einrichtungen, Apparaturen und Stellen, welche steril
gehalten werden sollen, vorteilhaft. Die Substanz SF-1771 kann ebenfalls als antibakterielles Mittel für externe Anwendungen
verwendet v/erden. Für diese Zwecke kann die Substanz SF-1771 is- Form einer wäßrigen Lösung formuliert werden,
welche 0,01 bis 0,1 Gew.-% der Substanz SF-1771 oder eines Säureadditionssalzes hiervon enthält.
Es wurde ein Vergleich zwischen der Substanz SF-1771 und
bekannten, wasserlöslichen, basischen Antibiotika durchgeführt. Als wasserlösliches basisches Antibiotikum, welches einen
Kupferbestandteil enthält, sind Phleomycin (T. Ikekawa et al.,
"Journal of Antibiotics" Ser. A. Vol. 17, (1964) S. 194-) Bleomycine (H. Umezawa et al., "Journal of Antibiotics",
Ser. A. Vol. 19 (1966), S. 200), Zorbamycin und Zorbonomycin B,C
(A. D. Argoudelis et al., "Journal of Antibiotics" Vol. (1971), S. 543), die Substanzen YA-56-X, YA-56-Y (Y. Ito et
al., "Journal of Antibiotics" Vol. 24 (1971)S S. 727), Victomycin
(T. Hara et al., "Journal of Antibiotics" Vol. 28 (1975),
S. 366), Platomycin A,B (T. ÜTara et al., "Journal of Antibiotics"
Vol. 28 (1975), S. 662), die Substanz SS-70-A (japanische Patentanmeldung 86034/1974) und die Substanz
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SS-7O-B (japanische Patentanmeldung 86035/1974-) bekannt.
Alle diese "bekannten, kupferhaltigen Antibiotika zeigen
zwei Absorptions spit ζ en, d. h. die erste bei 24-3-24-6 nm und
die zweite bei 290-303 nm in ihrem UV-Absorptionsspektren.
Jedoch können Bleomycine und Phleomycin voneinander unterschieden werden und sie können weiterhin von den anderen,
bekannten kupferhaltigen Antibiotika unterschieden werden.
Im Gegensatz dazu zeigt die erfindungsgemäße Substanz SF-1771
die erste Absorptionsspitze bei 248 nm und die zweite bei
282-284 nm in ihrem UV-Absorptionsspektrum, was anzeigt, daß die Lage der Absorptionsspitzen der Substanz SF-1771 von der
Lage der Absorptionsspitzen der zuvor genannten, bekannten, wasserlöslichen und basischen, kupferhaltigen Antibiotika
deutlich verschieden ist. In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, daß die erfindungsgemäße Substanz SF-1771 ein
wasserlösliches und basisches Antibiotikum vom Peptidtyp ist, daß sie sich jedoch von allen bekannten, wasserlöslichen und
basischen, kupferhaltigen Antibiotika, wie sie zuvor genannt
wurden, unterscheidet. Daher ist die Substanz SF-I771 eine
neue, antibiotisch wirkende Verbindung, die von jedem der bekannten Antibiotika vom Bleomycin- und Phleomycintyp verschieden
ist.
Die erfindungsgemäße Substanz SF-I771 kann durch Kultivieren
eines Stammes der Art Streptomyces hergestellt werden, wobei dieser Stamm von den Erfindern zuerst aus einer in Tada-u-mi-cho,
Takehara City, Hiroshima-Prefecture, Japan gesammelten Bodenprobe,
wie zuvor beschrieben, isoliert wurde, und dieser Stamm als Stamm SF-1771 bezeichnet wurde. Das Kultivieren bzw. Züchten
kann unter aeroben Bedingungen in gleicher Weise wie bei der Herstellung von bekannten Antibiotika durch Kultivieren
von bekannten Stämmen der Art Streptomyces durchgeführt werden.
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- -Vr-
Der Stamm SF-177I hat folgende Merkmale:
(I) Morphologische Beobachtung:
Luftmycel wird stark auf Glyzerin-Asparagin-agar, Stärkeagar,
Hafermehlagar, Hefe-Malz-agar und Tyrosinagar gebildet und
die Bildung von Sporen ist häufig. Das Mycel bildet einfüßige Zweige, bildet jedoch keine Quirle.
Das Luftmycel trägt Spiralen an seiner Spitze. Eine Bildung von speziellen Strukturen wie Sclerotium wurde nicht beobachtet.
Die elektronenmikroskopische Beobachtung zeigt, daß die Oberflächenstruktur der Sporen stachelig ist. Die Sporen besitzen
eine elliptische bis ovale Gestalt und messen normalerweise 0,8 -1,1 Mikron mal 1,2 - 1,4 Mikron. Reife Sporenketten mit
mehr als 10 Sporen pro Kette werden, üblicherweise gebildet.
(II) Kulturmerkmale auf verschiedenen Kulturmedien:
Die Kulturmerkmale sind in der folgenden Tabelle V zusammengestellt.
In der folgenden Tabelle beruhen die in eckigen Klammern angegebenen Beschreibungen der Farben auf der Norm
von "Color Harmony Mannual of Container Corporation of America".
Kulturmedium Wachstum, Earbe Luftmycel lösliches
der Rückseite ____^ Pigment
Sucrosenitrat- dünnes Wachstum gering, weiß keines
agar ί§ί!^ΐ2^ ^i§_S£§HzH§i§
Glucose-Aspa- schwach gelb bräunlich keines
ragin-agar _ Sr§u_C3ge2
Glyzerin-Aspa- gutes Wachstum häufig, grau keines
ragin-agar s£kw§£k_gelb £§fe2
Stärkeagar gutes Wachstum, häufig, hell- keines
schwach grau- gelblichlich-gelb
. 5£§^B_£^ii?l
Eafermehlagar gutes Wachstum, häufig, hell- keines
gräulich-gelb gelblichbraun [4-xk]
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Tabelle V (Fortsetzung)
Kulturmedium
Hefe-Malz-agar
Tyrosinagar
Wachstum, Farbe der Rückseite
Luftmycel
lösliches Pigment
gutes Wachstum, baumwollartig keines blaßgelb bis häufig, schwach gelb bräunlich-grau
gutes Wachstum, gräulich-gelb
blaßgrau
[2dcJ
[2dcJ
keines
Anmerkung: Die Inkubatxonstemperatur betrug im allgemeinen
28 C, falls nichts anderes angegeben ist.
(III) Physiologische Eigenschaften:
(1) Temperaturbereich des Wachstums: Der Stamm SF-1771 wächst
in einem Temperaturbereich von 20 - 38 °C auf Hefe-Malzagar
medium.
(2) Verflüssigung von Gelatine: Gelatine wird langsam durch
die Inkubation bei 20 C für 21 oder mehr Tage verflüssigt.
(3) Hydrolyse von Stärke: positiv (bei 28 0C)
(4) Koagulation von Magermilch: negativ (bei 28 0C und 37 °C)
(5) Peptonisierung von Magermilch: positiv (bei ?8 0C und 37 0C
(6) Chromogenität: negativ
(IV) Verwertung von Kohlenstoffquellen (geschätzt in Pridham-Gottlieb-Agarmedium
inkubiert bei 28 0C):
(1) Verwertbar: D-Glucose, D-Fruetose, D-Mannit, I-Inosit.
(2) nicht verwertbar: Sucrose, Bhamnose, Eaffinose, L-Arabinose,
D-XyIose.
Die oben angegebenen Eigenschaften des Stammes wie folgt zusammengefaßt werden.
-I771 können
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Der Stamm SF-1771 gehört zur Art Streptomyces und das Luftmycel
"bildet Spiralen an seiner Spitze und die Oberflächenstruktur der Sporen ist stachelig. Der Stamm SF-1771 zeigt
ein gutes Wachstum auf verschiedenen Kulturmedien, und die Färbung der Rückseite des Wachstums ist blaßgelb bis gräulichgelb und nicht unterscheidungskräftig gefärbt. Das Luftraycel
besitzt eine graue bis braune' farbe und es wird auf keinem
Kulturmedium ein lösliches Pigment gebildet·
Der Stamm S]f-1771 wurde als Streptomyces sp. SF-1771 bezeichnet
und bei der japanischen, öffentlichen Hinterlegungsstelle "Fermentation Research Institute", Chiba city, Japan unter
der Hinterlegungsnummer FERM-P Ur. 3253 (eine Eulturprobe
dieses Stammes wurde von Fermentation Research Institute am 18. 9- 1975 erhalten) und ebenfalls bei der "American Type
Culture Collection", Washington D.C, USA unter der Hummer ATCC 31248 hinterlegt.
Als bekannte Stämme, die dem Stamm SF-1771 ähnlich sind, können Streptomyces toyocaensis3 Streptomyces natalensis, Streptomyces
fasiculatus und Streptomyces alulus genannt werden.
Im Hinblick auf die Beschreibungen im ISP (International Streptomyces Project), worin auf die Aufsätze in "International
Journal of Systematic Bacteriology" Vol. 18 (1968), S. 108-110 und S. 174-176 und Vol. 22 (1972), S. 271-273 und S. 323-326
Bezug genommen wird, können diese vier Stämme von dem Stamm SF-1771 in ihren morphologischen Eigenschaften und KuIturaierkmalen
nicht unterschieden werden. Daher wurde ein unmittelbarer Vergleich zwischen den Typenkulturen dieser vier
bekannten Stämme und dem Stamm SF-1771 durchgeführt. Als Ergebnis
wurde gefunden, daß der Stamm SF-1771 dem Stamm
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Streptomyces toyocaensis unter den zuvor genannten vier Stämmen am nächsten kommt und von den restlichen, drei "bekannten
Stämmen unterscheidbar ist. Ein genauerer Vergleich zeigt, daß der Stamm SF-1771 mit der Typenkultur von Streptomyces
toyocaensis in zahlreichen Eigenschaften koinzidiert, daß er von diesem Stamm jedoch hinsichtlich der in der folgenden
Tabelle Vl angegebenen Merkmale unterscheidbar ist.
Merkmale
Stamm SF-1771
Typenkultur von Streptomyces toyocaensis
Farbe der Rückseite des Vachstums
lösliches Pigment
gräulich-gelb gelb bis bräun-
lich-gelb
keines
blaßgelb
Luftraycel
gebildetes Antibiotikum
baumwollartig,
blaßgrau
blaßgrau
Substanz
SF-1771
SF-1771
gering
{ungenügend)
{ungenügend)
Toyocamycin
Der Stamm SF-1771 koinzidiert daher hinsichtlich seinei* Haupteigenschaften
mit Streptomyces toyocaensis, obwohl eine Unterscheidung bei weniger wichtigen Merkmalen beobachtet wird.
Daher erscheint es vernünftig, daß der Stamm SF-1771 a?s ein neuer Stamm der bekannten Art Streptomyces toyocaensis identifiziert
wird. Daher wird der Stamm SF-1771 jetzt als Streptomyces toyocaensis SF-1771 bezeichnete,
Der Stamm SF-1771 besitzt Eigenschaften, die einer Veränderung unterliegen^ wie dies üblicherweise bei anderen Arten von
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Streptomyces "beobachtet wird. So kann der Stamm SF-1771
"beispielsweise eine "Variante oder Hutante bilden, wenn er
mit verschiedenen Mutagenen wie UV-Strahlungen, Strahlungen aus radioaktiven Stoffen, hochfrequenten, elektromagnetischen
Wellen und Chemikalien behandelt wird. Jede natürliche oder künstliche Variante oder Hutante des Stammes SF-1771 kann
für die Herstellung der Substanz SF-1771 nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren verwendet'werden, vorausgesetzt, daß er die Fähigkeit zur Bildung der erfindungsgemäßen Substanz
-I771 besitzt.
Gemäß einer dritten Ausführungsform betrifft die Erfindung
daher ein Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-1771» wobei dieses das Kultivieren eines die Substanz SF-1771 bildenden Stammes der Gattung Streptomyces in einem Quellen für
assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff enthaltenden Kulturmedium unter aeroben Bedingungen für eine
ausreichende Zeit zur Bildung und Ansammlung der Substanz SF-1771 in dem Kulturmedium und dann das Gewinnen dieser antibiotischen
Substanz aus der Kultur umfaßt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung daher ein Verfahren
zur Herstellung der Substanz SF-1771j wobei Streptomyces toyocaensis SF-1771 sit den Hinterlegungsnummern FESM-P Nr. 5253
oder ATCC Ur. 31243 in einem Quellen für assimilierbaren
Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff enthaltenden Kulturmedium unter aeroben Bedingungen für eine ausreichende Zeit
zur Bildung und Ansammlung der Substanz SF-1771 in cLem Kulturmedium
gezüchtet und dann die Substanz SF-1771 aus der Kultur gewonnen wird.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-1771 kann der die Substanz SF-1771 bildende Stamm und
insbesondere der Stamm Streptomyces toyocaensis SF-1771 in
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an sich bekannter Weise unter aeroben Bedingungen in einem
Kulturmedium gezüchtet werden, welches Nährstoffe, nämlich durch gewöhnliche Mikroorganismen assimilierbare Quellen für
Kohlenstoff und Stickstoff enthalt.
. Als Nährstoffe können beliebige der bekannten
Nährsubstanzen verwendet werden, welche üblicherweise bei
dem Züchten der bekannten Stämme von Streptomyces verwendet wurden. Beispielsweise sind Glucose, Sucrose (Saccharose),
Stärke, Glyzerin, Stärkesirup, Melassen, Sojabohnenöl und
dergleichen als Eohlenstoffquelle brauchbar. Sojabohnenmehl,
Veizenkeime, Fleischextrakt, Pepton, getrocknete Hefe, Maisquellwasser,
Ammoniumsulfat, Natriumnitrat und dergleichen sind als Stickstoffquelle brauchbar. Gegebenenfalls können
anorganische Salze wie Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid,
Phosphate und dergleichen zu dem Kulturmedium zugesetzt werden. Weiterhin können dem Kulturmedium solche organische
und anorganische Materialien zugesetzt werden, welche das Wachstum des die Substanz SF-1771 bildenden Stammes unterstützen
und die Bildung der Substanz SF-1771 fördern. Zu dem
Kulturmedium kann'Kupfersulfat zugesetzt \irerden, jedoch ist
die Zugabe einer Kupferverbindung zu dem Kulturmedium nicht unbedingt erforderlich, da eine Spur von Kupfer genügt, welche
in natürlicher Weise in den Nährsubstanzen natürlichen Ursprungs,
die in dem Kulturmedium verwendet werden, von dem Stamm SF-1771
als Kupferquelle zur Bildung der Substanz SF-1771» das ein
kupferhaltiges Antibiotikum ist, verwertet wird.
Als Methode zur Kultivierung des die Substanz SF-1771 bildenden
Stammes und insbesondere des Stammes SF-1771 werden vorteilhafterweise die Methode der Flüssigkultivierung und insbesondere
der Flüssigkeitstauchkultivierung in ähnlicher Weise wie bei den allgemeinen Verfahrensvxeisen zur "Herstellung von
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it
bekannten Antibiotika angev/andt. Die Kultivierung bzw. das
Züchten kann geeigneterweise unter aeroben Bedingungen und bei einer geeigneten Inkubationstemperatur in einem Bereich
von 25 0C bis 35 0C durchgeführt werden. Für die technische
oder labormäßige Herstellung der Substanz SF-1771 wird es
oft bevorzugt, die Kultivierung bei einer Temperatur in der Nähe von 28 0G durchzuführen. Unter diesen Kultivierungsbedingungen
erreicht die Konzentration der Substanz SP-1771 in der Kulturbrühe ein Maximum am Ende von 2 bis 8 Tagen der
Fermentation, entweder bei einer Schüttelkultivierungsmethode
oder bei einer Tankkultivierungstnethode.
Für die Untersuchung der erfindungsgemäßen Substanz SF-1771
kann die folgende Untersuchungsmethode angewandt werden: Als Untersuchungskulturmedium wird ein 0,5 % Folypepton, 0,3 %
Fleischextrakt und 1,5 % Agar (pH = 7,0) enthaltendes Medium
verwendet. Als Untersuchungsstamm wird Escherichia coli NIHJ verwendet. Bei dieser Untersuchungsmethode kann bei einer
Konzentration von 25 bis 5/U-g/ml der Substanz SF-1771 die
Beziehung zwischen dem Logarithmus der Konzentration der Substanz SF-1771 "1111CL dem Durchmesser der Hemmzone linear aufgetragen
werden, wobei die Hemmzone von 22,0 bis 16,0 mm im Durchmesser, bestimmt nach der Papierscheibenmethode, erhalten
wird.
Da die erfindungsgemäße Substanz SF-1771 eine die Kupferkomponente
wie zuvor beschrieben enthaltende, wasserlösliche und basische Substanz vom Peptidtyp ist, kann sie üblicherweise
aus der Kulturbrühe durch Adsorption auf einem anorganischen Adsorptionsmittel wie Aktivkohle und/oder Aluminiumoxid
oder einem synthetischen Adsorptionsharz wie einem schwach sauren lonenaustauscherharz (Amberlite XÄ.D-2,*Diaion EP-20),
einem Ionenaustauscher-G-elfiltrationsmittel oder Gelfiltrationsmittel
und anschließendes Eluieren von dem Adsorptionsmittel mit Hilfe eines geeigneten Elutionsmittels gewonnen werden.
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Zur Gewinnung und Reinigung der Substanz SF-1771 ist jedoch
die folgende Methode am wirksamsten: Die Kulturbrühe wird mit Hilfe eines geeigneten Filtrationshilfsstoffe wie
Diatomeenerde zur Entfernung des Mycels und der anderen festen Stoffe filtriert,und das so erhaltene Brühenfiltrat wird
durch eine Säule eines synthetischen Adsorptionsharzes, das aus einem mikroporösen Copolymer!sat von Styrol und Divinyl-"benzol
"besteht (Amberlite XAD-2, Produkt von Röhm & Haas Co.,
USA) für die Adsorption der Substanz SF-1771 durchgeschickt. Das Harz wird dann mit Wasser gewaschen und mit einem Elutionsmittel
eluiert, das aus wäßrigem Äthanol oder wäßrigem Aceton "besteht und das auf einen sauren pH-Wert (pH = 3,0 "bis 3>5)
durch Zuga"be einer Hineralsäure wie Salzsäure oder einer
organischen Säure wie Essigsäure eingestellt sein kann. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen und die aktiven Fraktionen
werden miteinander vereinigt und gegebenenfalls neutralisiert. Die aktiven Fraktionen werden dann unter vermindertem Druck
durch Abdestillieren des organischen Lösungsmittels (des Äthanols oder Acetons) eingeengt. Die erhaltene, konzentrierte
Lösung wird durch eine Säule mit einem Ionenaustauscher-Gelfiltrationsmittel in Form eines carboxymethylsubstituierten,
vernetzten Dextrangels (CM-Sephadex C-25, Produkt von Pharmacia Co.·, Schweden) durchgeschickt. Die Säule wird mit Wasser
gewaschen und dann mit einer wäßrigen Lösung eines geeigneten Salzes wie einer wäßrigen 0,2 M Natriumchloridlösung eluiert.
Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen, und die aktiven Fraktionen werden miteinander vereinigt und durch Behandlung
mit dem zuvor genannten Ionenaustauscherharz (Amberlite X4D-2)'
entsalzt. Die entsalzte Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet, wobei ein rohes, die Substanz
SF-1771 enthaltendes Pulver erhalten wird. Zur Reinigung dieses
Rohpulvers wird dieses Rohpulver in einem -kleinen Volumen
Wasser aufgenommen, und die wäßrige Lösung wird einer Säulenchromatografie auf einem aus einem Dextransulf at derivat
bestehenden Gel (Sephadex LH-20, Produkt von Pharmacia Co., Schweden) unterworfen, mit Methanol oder einem Mischlösungsmittel
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aus Butanol-Methanol-Wasser (4:1:2 im Volumen) als Elutionsmittel
entwickelt. . Das Eluat wird wieder in Fraktionen gesammelt, und die aktiven Fraktionen, welche einen einzigen Fleck
der Substanz SF-1771 "bei der Papierchromatografie ergeben, werden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei
ein Reinprodukt der Substanz SF-1771 als blau gefärbtes, amorphes Pulver erhalten wird.
Die erfindungsgemäße Substanz SF-1771-B, die die zweite Ausführungsform
der Erfindung darstellt, kann durch Behandlung der Substanz SF-1771 mit einem geeigneten Mittel, das zur
Entfernung der Kupferkomponente aus dein Molekül der Substanz
SF-1771 in. der Lage ist, hergestellt werden. Gemäß der vierten
Ausführungsform betrifft die Erfindung daher ein Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-1771-3, wobei die Substanz
SF-1771 einer Behandlung zur Entfernung der Kupferkomponente aus dem Molekül der Substanz SF-1771 unterworfen wird. Die
Behandlung zur Entfernung der Kupferkomponente aus dem Molekül
der Substanz SF-1771 kann entweder in einer solchen Weise durchgeführt werden, daß die Substanz SF-1771 in Lösung in
Methanol oder einem anderen geeignetenT inerten, organischen
Lösungsmittel mit Schwefelwasserstoff oder einem Alkalimetallsulfid, wie ITatriumsulfid und/oder Kaliumsulfid, für eine ausreichende
Zeit zur Entfernung des Kupferbestandteiles aus dem Molekül der Substanz SF-1771 behandelt wird, oder in
der Weise, daß die Substanz SF-1771 mit einem Kupfer chelatierenden
Mittel wie 8-Hydroxychinolin und/oder Dithizon für eine ausreichende Zeitspanne zur Entfernung des Kupferbestandteiles
aus der Substanz SE-1771 behandelt wird. Wenn die Substanz SF-1771 mit dem Kupfer chelatierenden Mittel zur
Entfernung der Kupferkomponente hieraus umgesetzt wird, wird
es bevorzugt, daß die Substanz SF-1771 in Losung in angesäuertem
Wasser mit einer Lösung von Dithizon in Chloroform umgesetzt wird. Diese Reaktion zur Entfernung des Kupferbestandteiles
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aus der Substanz SF-1771 können bei Umgebungstemperatur durchgeführt werden, wobei als Reaktionsmedium Wasser oder
ein organisches Lösungsmittel, in welchem die Reagenzien löslich sind und welches gegenüber der Reaktion inert ist,
verwendet wird. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-1771-B, wobei die Substanz SF-1771 einer Behandlung
mit Schwefelwasserstoff, einem Alkalimetallsulfid oder
einem Kupfer chelatierenden Mittel für eine ausreichende Zeitspanne zur Entfernung des Kupferbestandteiles aus dem Molekül
der Substanz SF-1771 unterzogen wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren gemäß dieser Ausführungsform zur Herstellung der Substanz SF-1771-B kann nicht nur unter
Verwendung der Substanz SF-1771 in isolierter Form eines
Rohpulvers oder eines reinen Produktes, wie zuvor beschrieben, als Ausgangsmaterial, das mit einem Mittel zur Entfernung
des Kupferbestandteiles behandelt wird, durchgeführt werden, sondern auch unter Verwendung der Fermentationsbrühe,
des Brühenfiltrates oder einer rohen Lösung, welche die Substanz SF-1771 hierin aufgelöst enthält, in der Weise durchgeführt
werden, daß die Substanz SF-1771 mit Schwefelwasserstoff,
einem Alkalimetallsulfid oder einem Kupfer chelatierenden Mittel, während sie noch in der Fermentationsbrühe,
dem Brühenfiltrat oder der rohen Lösung vorliegt, behandelt wird. Zur Isolierung der Substanz SF-1771-B aus dem Reaktionsgemisch, in welchem die Substanz SF-1771 niit dein Mittel zur
Entfernung des Kupferbestandteiles hieraus behandelt wurde,
können solche Methoden angewandt werden, die den zur Gewinnung der Substanz SF-1771 aus der Kultur des die Substanz
SF-1771 bildenden Mikroorganismus anwendbaren Methoden ähnlich sind. So kann des Reaktionsgemisch, das aus de'r Behandlung
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der Substanz SF-1771 zur Entfernung der Kupferkomponente
hieraus kommt, mit dem zuvor genannten Ionenaustausciierliarz (Amberlite XAD-2) zur Adsorption der Substanz SF-1771-B "behandelt
werden, und das adsorbierende Harz kann dann eluiert werden, anschließend kann eine Chromatografie der aktiven
Fraktionen des Eluates unter Bildung eines rohen, die Substand SF-1771-B enthaltenden Pulvers durchgeführt werden. Für
die weitere Reinigung kann dieses rohe Pulver auf einer Säule aus einem,Gel aus einem Dextransulfatderivat (Sephadex LH-2O)
.synthetischem Harz
oder/(Diaion HP-20) chromatografiert werden, so daß ein Reinprodukt
der Substanz SF-1771--B erhalten wird. Die Substanz SF-I771-B ebenso wie die Substanz SF-I771 sind wasserlösliche
und basische Antibiotika vom Peptidtyp, und daher kann die Substanz SF-1771-B im allgemeinen mittels einer Reinigungsmethode gereinigt werden, die derjenigen zur Reinigung der
Substanz SF-1771 analog ist.
Das Hydrochlorid der Substanz SF-1771-B zeigt die folgenden
physikalischen und chemischen Eigenschaften, wobei einige dieser Eigenschaften bereits zuvor beschrieben wurden:
(1) Aussehen: farbloses (weiß gefärbtes) bis schwach gelb
gefärbtes, amorphes Pulver.
(2) Zersetzungstemperatur: Verfärbung nach braun erfolgt langsam bei 180 0C und die Zersetzung tritt bei 212 0G
unter Schäumen auf.
(3) Elementaranalyse: Das Hydrochlorid der Substanz SF-1771-B enthält die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff,
Sauerstoff, Schwefel und Chlor und ergibt folgendes Analysenergebnis: C = 41,36 %, H = 5,53 %, H = 14,19 %, 0 =
28,93 % und S * 3,64 %.
Ferner wurde festgestellt, daß der Gehalt an Chlor bei
der Elementaranalyse 6,12 % betrug, obwohl die Bestimmung
des Chlorgehaltes in exakter Weise als Folge der Anwesenheit
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der Schwefelkomponente in dem Molekül nur schwierig durchzuführen
war.
(4) TJV-Ab-sorptionsspektrum: Das UV-Spektrum des Hydro chlorides
der Substanz SF-1771-B? gemessen in einer wäßrigen Lösung,
ist in der Fig. 4 der Zeichnung wiedergegeben und zeigt
eine Absorptions spit ze "bei 288-290 nm (E^ = 84).
(5) IR-AbsorptionGspektrum: Das IR-Spektrum des Hydrochlorides
der Substanz SF-1771-B, als Tablette in Kaliumbromid, ist
in der Fig. 5 der Zeichnung wiedergegeben.
(6) Absorptionsspektrum der protonenmagnetischen Resonanz: Das PMR-Spektrum des Hydrochlorides der Substanz SF-177I-B
in Deuteriumoxid ist in der Fig. 6 der Zeichnung wiedergegeben, bestimmt bei 100 MHz.
(7) Molekulargewicht: etwa 1600, gemessen nach der Barger-Methode.
(8) Löslichkeit: leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol,
gering löslich in Äthanol und Butanol, jedoch unlöslich in den anderen, organischen Lösungsmitteln.
(9) Farbreaktion: positiv gegenüber Einhjdrin-, Ehrlich-,
Kaliumpermanganat- und Greig-Leiback-Reagenzien. Negativ gegenüber Sakaguchi-Reagens.
(10) Stabilität: Stabil in neutralen und sauren Medien, jedoch
relativ instabil in alkalischen Medien.
(11) Rf-Wert: Bei der Dünnschichtchromatografie auf Kieselerdegel
(Kieselgel 60 Fgszp Produkt von Merck Co. Deutschland),
ergibt das Hydrochlorid der Substanz SF-I77I-B einen einzigen
Fleck bei den in der folgenden Tabelle VII angegebenen Rf-Werten. Zum Vergleich sind die Rf-Werte für das
Hydrochlorid der Substanz SF-1771 ebenfalls in dieser
Tabelle VII angegeben.
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Ef-Wert
Propylalkohol-Pyridin-Essigsäure-
Wasser (15:10:3:12 in Volumen) 0,76 0,76 Hethanol-10 %iges wäßriges Ammonium-
acetat-10 ?oiges wäßriges Ammoniak
(10:9:1 in Volumen) 0,50 0,57
10 %iges wäßriges Ammoniumacetat-Methanol (1:1 in Volumen) 0,48 0,68
10 %iges wäßriges Ammoniumacetat-Methanol
(1:2 in Volumen) 0,38 0
(12) Optische Drehung: Ca3p° = -18,4° (c = 1, H2O)
Die Substanz SF-1771-B gemäß der zweiten Ausführungsform der
Erfindung zeigt ein antibakterielles Spektrum, wie es in der folgenden.Tabeile VIII zusammengestellt ist. Die minimalen
Hemmkonzentrationen (MIC) dieser Substanz gegenüber verschiedenen
Mikroorganismen wurden nach der bekannten Brühenverdünnungsmethode in der Weise bestimmt, daß die Bestimmung nach
der Durchführung der Inkubation bei 37 °C während 18 Stunden
unter Verwendung einer Herzinfusionsagars als Inkubationsmedium durchgeführt wurde.
Antibakterielles Spektrum der Substanz SF-1771-B
Sestmikroorganismen MIC (iig/ml)
Escherichia coli 0,39
Escherichia coli K-12-R 0,39 Salmonella typhi - 0,19
Pseudomonas aeruginosa 50
Staphylococcus aureus 209? 6,25
Bacillus subtilis PCI-219 1,55
Salmonella pullorum 0,39
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Tabelle VIII (Fortsetzung)
Testmikroorganismen MIC (ug/ml)
PastLirella sp. 001 3,12
" "05 1,56
" " 020 1,56
Wie aus den Ergebnissen der Tabelle VIII ersichtlich, zeigt die erfindungsgemäße Substanz SF-1771-B ebenfalls eine antibakterielle Aktivität gegenüber den gram-negativen und grampositiven Bakterien, die im wesentlichen ebenso hoch wie diejenige
der Substanz SF-1771 ist.
Pur die Abschätzung der akuten Toxizität der Substanz SF-1771-B
wurden Lösungen, welche 6,25 mg bis 50 mg der Substanz SF-1771-B
pro 0,2 ml isotonischer Katriumchloridlösung enthielten,
intravenös bei einer Dosis von 0,2 ml pro Maus bei mehreren Gruppen von Mäusen, wobei jede Gruppe aus fünf Mäusen vom
ICH-Stamm (männlich, erwachsen, Durchschnittsgewicht 20 g)
bestand, injiziert. Sieben Tage nach dieser intravenösen Injektion wurde bestimmt, daß die Prozentsätze der Anzahl
der toten Pläuse, "bezogen auf die Gesamtanzahl an untersuchten Mäusen, 100 %, 60 %, 0 % und 0 % bei den Dosiswerten von
50 mg/kg, 25 mg/kg, 12,5 mg/kg bzw. 6,25 mg/kg an Substanz
SF-1771-B pro Maus lagen. Bei der Dosis von 12,5 mg/kg der
Substanz SF-1771-B überlebten alle untersuchten Mäusen nach
dem Test, während bei der Dosis von 12,5 mg/kg eine 60 % der Gesamtzahl der Testmäuse entsprechende Anzahl an Mäusen
bei Verwendung der Substanz SF-1771 starben, was zeigt, daß die Substanz SF-1771-B im Vergleich zu der Substanz SF-1771
eine signifikant verminderte, akute Toxizität besitzt.
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Die erfindungsgemäße Substanz SF-1771-B wird als au de©
Antibiotika vom Bleomycin-Phleomycin-Typ gehörend angesehen.
Es ist bekannt, daß Bleomycin durch eine Rohenzymlösung inaktiviert
werden kann, welche aus der überstehenden Flüssigkeit besteht, die durch Zentrifugieren eines Rattenleberhomogenates
bei 100 000 G erhalten wird.
Um abzuschätzen, in welchem Ausmaß die Aktivität der er-findungsgemäßen
Substanz SF-1771-B in vivo im Tier im Vergleich zu Bleomycin Ap inaktiviert werden kann, wurde der folgende
Test durchgeführt:
10 mg der Substanz SF-I771-B als Substrat wurden bei 37 0C
mit 2 ml einer Rohenzymlösung (pH = 752) umgesetzt, welche
aus Rattenleberhomogenat in der oben beschriebenen Weise hergestellt
worden war. Am Ende von Λ Stunde, 3 Stunden, 6 Stunden j 10 Stunden und 24 Stunden nach dem Beginn der enzymatischen
Reaktion wurden Proben aus dem Reaktionsgemisch entnommen und auf ihre antibakterielle Potenz gegenüber dem Untersuchungsorganismus,
Escherichia coli IfIHJ, untersucht. Die Prozentsätze der zurückbleibenden, antibakteriellen Potenz
dieser Proben, bezogen auf die anfängliche, antibakterielle Potenz, bestimmt zu Beginn der Reaktion (Reaktionszeit =
0 Stunden) wurde berechnet. Das Ausmaß der Inaktivierung (%) wurde nach folgender Gleichung berechnet:
(Λ zurückbleibende, antibakterielle Potenz ν ^ηπ
^ " anfängliche, antibakterielle Potenz ; x u
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IX zusammengestellt:
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Substrat
Tabelle IX | Inaktivi erung | 20 60 |
48 . 66 |
W |
Reaktionszeit (h) 3 6 10 |
24 | |||
Ausmaß der | 0 36 |
72 >94 |
||
1 | ||||
O 24 |
||||
SF-1771-B
Bleomycin A~
(von Kupfer
"befreites
Derivat)
(von Kupfer
"befreites
Derivat)
Aus den Ergebnissen dieser Tabelle IX ist ersichtlich, daß die Substanz SjT-1771-B wesentlich schwieriger durch die enzymatischen
Reaktionen als Bleomycin Ap inaktiviert werden kann,
so daß die Substanz SF-1771-B bei Tieren in vivo eine viel
höhere Aktivität als Bleomycin Ap zeigen kann.
Darüber hinaus wurde gefunden, daß die erfindungsgemäße Substanz SJ?-1771-B eine Hemmaktivität gegenüber dem Wachstum
von Zellen von Hella S3 aufweist und eine minimale Degenerierungskonzentration von 3^9 ^ig/ml gegenüber diesen Zellen bei
der mikroskopischen Beobachtung nach einer Inkubation bei 37 0C während 48 Stunden zeigt. Darüber hinaus zeigt die Substanz
S3T-1771-B eine Antitumoraktivität gegenüber Tumorzellen
von Sarcoma. 180. So wurde eine wäßrige Suspension (0,05 nil)
von Sarcoma-180-Tumorzellen bei mehreren Gruppen von Mäusen,
wobei jede Gruppe aus fünf Mäusen vom ICR-Stamm (männlich,
etwa acht Wochen alt) bestand, bei einer Dosierung von 10,4 χ 10 Zellen pro Haus intraperitoneal eingeimpft. 24 Stunden
nach der (i.p.) Einimpfung der Tumorzellen wurden 16 mg/kg, 8 mg/kg, 4 mg/kg, 2 mg/kg und 1 mg/kg der Substanz SF-I771-B
pro Maus durch intraperitoneale Injektion einmal täglich während
drei Tagen gegeben. Zum "Vergleich wurden 40 mg/kg, 20 mg/kg, 10 mg/kg und 5 mg/kg an Bleomycin bei der Vergleichsgruppe
der Mäuse in der gleichen Weise wie die Substanz SF-1771-B
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gegeben. In jeder Gruppe wurden fünf mit Tumorzellen geimpfte
Mäuse verwendet. Die mittlere Anzahl der uberlebenstage bei
den behandelten Mäusen, die prozentuale Zunahme der Lebensspanne (abgekürzt als ILS %) gegenüber den Kontrollmäusen und
das Bauchwasservolumen wurden zur Abschätzung der Antitumoraktivität
der Substanz SF-1771-B und von Bleomycin gemessen. Der Wert von ILS (%) wurde nach folgender Gleichung berechnet:
mittlere Überlebenstage der behandelten Mäuse mittlere Uberlebenstage der Kontrollmäuse
- 1
χ 100
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle X zusamm.engestellt.
Tabelle X | Dosis | mittl. | ILS (%) | Bauch | 60 Tage | |
Testverbin | (mg/kg) | Anzahl | wa s ser | über | ||
dung | der | vo lumen | lebende | |||
Über | (ml) | Mäuse | ||||
lebens- | ||||||
tage | ||||||
16 | 8,8 | -50 | 0 | 0/5 | ||
SP_1771-B | 8 | 31,4 | 78,4 | 0,1 | 0/5 | |
4 | 36,8 | 109,1 | 13,0 | 0/5 | ||
2 | 37,2 | 111,4 | 19,2 | 0/5 | ||
1 | 29,0 | 64,8 | 21,8 | 0/5 | ||
40 | 4-5,8 | 160,2 | 13,0 | 2/5 | ||
Bleomycin | 20 | 36,8 | 109,1 | 20,2 | 0/5 | |
(Vergleichs | 10 | 35,0 | 98,9 | 21,4 | 0/5 | |
verbindung) | 5 | 19,8 | 12,5 | 26,4 | 0/5 | |
Kontrolle
17,6
23,8
0/5
Wie aus der Tabelle X ersichtlich, ergibt die"Dosis von
2 mg/kg an SF-I77I-B den maximalen Wert ILS von 111,4 %,
was nahelegt, daß eine optimal wirksame Dosis der Substanz
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SF-1771-3 im Bereich von 2 "bis 4 mg/kg für die therapeutische
Behandlung von Sarcoma-180-Tumorzellen (Wasserbauchsucht)
tragenden Hausen ist, und daß die Substanz SF-1771-B bei niedrigeren Dosismengen als Bleomycin wirksam ist.
Daher ist die erfindungsgemäße Substanz SF-1771-B als Antifrumormittel
in ähnlicher Weise wie Bleomycin anwendbar und kann in den bekannten, pharmazeutischen Formen formuliert und
in der gleichen Weise wie Bleomycin appliziert werden.
Im Hinblick auf die antibakterielle Aktivität der Substanz
SF-1771 und der Substanz SP-I771-3 betrifft die Erfindung daher
ein antibakterielles Mittel, welche die Substanz SF-1771
oder die Substanz SF-1771-B oder Säureaddxtxonssalze hiervon, gegebenenfalls in Kombination mit einem Träger oder einem
Verdünnungsmittel hierfür, enthält. Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung daher ein Arzneimittel
zur therapeutischen Behandlung eines lebenden Tieres oder von
Menschen, die an einem Tumor leiden, wobei das Arzneimittel als aktiven Bestandteil die Substanz SF-1771-B oder ein pharmazeutisch
annehmbares Säureadditionssalz hiervon in einer ausreichenden
Menge zur Verminderung des Angriffs durch die Tumorzellen
in vivo enthält, wobei die aktive Verbindung in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vorliegen
kann.
Es sei darauf hingewiesen, daß die verwendeten, tatsächlich bevorzugten Mengen der Substanz SF-1771 und der Substanz
SF-1771-B entsprechend der besonderen, formulierten Zusammensetzung, der Applikationsart und dem besonderen Situs und
dem besonderen, zu behandelnden Organismus variieren können. Zahlreiche Faktoren, welche die Wirkung des Arzneimittels
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modifizieren, können von dem Fachmann in Bechnung gezogen
werden, z. B. Alter, Körpergewicht, Sex, Diät, Applikationszeit, Applikationsweg, Geschwindigkeit der Exkretion, Arzneimittelkonibinationen,
Reaktionsempfindlichkeiten und Schwere der Krankheit. Die optimalen Applikationsmengen für eine vorgegebene
Zustandskombination können von dem Fachmann unter Anwendung der konventionellen Bestimmungstests für die Dosismenge
unter Berücksichtigung der zuvor gegebenen Richtlinien bestimmt werden.
Die Erfindung wird anhand der folgenden, bevorzugten Ausführungsformen
und Beispiele näher erläutert.
35 1 eines Kulturmediums mit pH = 7>O, welches 4,0 % Saccharose,
1,0 % Soöabohnenöl, 3>0 % Sojabohnenmehl, 2,0 % Weizenkeime,
0,6 % Natriumchlorid und 0,003 % Kupfersulfat enthielt, wurden in einem Standgefäßfermentator mit einem Fassungsvermögen
von 50 1 eingegeben und durch Erhitzen sterilisiert. In dieses
sterilisierte Kulturmedium wurde eine Saatkultur von Streptomyces toyocaensis, Stamm SF-1771 (identifiziert als FEEM-P
Hr. 3253 und als ATCC 31248), die zuvor in einem Schrägagarmedium
inkubiert worden war, eingeimpft. Das beimpfte Kulturmedium wurde bei 28 0C während 114 Stunden unter Belüftung
und Rühren (Rührgeschwindigkeit 300 Upm) inkubiert.
Die so erhaltene Fermentationsbrühe wurde unter Verwendung von Diatomeenerde als Filtrationshilfsmittel filtriert und es wurden
etwa 20 1 Brühenfiltrat aufgefangen. Dieses Brühenfiltrat wurde durch eine Säule von 2 1 adsorbierendem Harz in Form
eines synthetischen, adsorbierenden Harzes, das aus einem mikroporösen Copolymerisat aus Styrol und Divinylbenzol bestand
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(Amberlite XÄ.D-2 von Röhm & Haas Co., USA) zur Adsorption
der aktiven Substanz durch das Harz geschickt. Das Harz wurde mit 20 1 Wasser gewaschen, dann wurde es mit 10 1 50 %igem
wäßrigem Aceton (einem Gemisch aus Aceton-Wasser, 1:1 in
Volumen) gewaschen und anschließend mit 50 %igem wäßrigem
Aceton (pH = 3» angesäuert durch Zugabe von Salzsäure) zur
Herbeiführung der Desorption der aktiven Substanz eluiert.
Das Eluat wurde in Fraktionen von 500 ml aufgefangen, und die
aktiven Fraktionen wurden miteinander vereinigt und durch Zugabe von 1 N wäßriger Natriumhydroxidlösung, neutralisiert,
hieran schloß sich eine Konzentration unter vermindertem Druck zur Entfernung des Acetons an. Die konzentrierte Lösung wurde
dann durch eine Säule von 250 ml eines Gelfiltrationsmittels
in Form eines carboxymethylsubstituierten, vernetzten Dextrangels (CM-Sephadex C-25 von Pharmacia Co., Schweden) (H+) zur
Adsorption der aktiven Substanz geschickt. Die Gelsäule wurde mit 215 1 Wasser und dann mit 0,5 1 einer 0,1 M wäßrigen
Natriumchloridlösung gewaschen, anschließend wurde mit 0,2 M
wäßrigem Natriumchlorid entwickelt. Das Eluat wurde in Fraktionen von 18 ml aufgefangen, wobei gefunden wurde, daß die Fraktionen
124 bis 198 die aktive Substanz enthielten. Das Gesamtvolumen
dieser aktiven Fraktionen betrug ungefähr das zehnfache bis zwölffache des Volumens des Gels bei der Gelfiltration (CM-Sephadex-Gel).
Diese aktiven Fraktionen wurden durch eine Säule von 100 ml eines synthetischen, adsorbierenden Harzes
in Form eines mikroporösen Copolymerxsates aus Styrol und Diviny!benzol (Diaion HP-20s Produkt von Mitsubishi Kasei Co.,
Japan) zur Adsorption der aktiven Substanz durchgeschickt. Das Harz wurde mit 200 1 Wasser gewaschen, anschließend wurde mit
400 ml von 15 %igem wäßrigem Methanol (15 % Methanol in Wasser)
zum Entsalzen eluiert und dann mit 500 ml 30 %'igem wäßrigem
Methanol (30 % Methanol in V/asser) zur Desorption der aktiven
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Substanz eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 100 ml
aufgefangen. Die Fraktionen 1 bis 5> welche die aktive Substanz
enthielten, wurden miteinander vereinigt und zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt, um ein grün gefärbtes
Rohpulver der Substanz SF-1771 zu erhalten.
Dies rohe Pulver (320 mg) wurde in 10 ml Wasser aufgenommen
und die erhaltene, wäßrige Lösung wurde durch eine Säule von 50 ml des zuvor verwendeten Dextrangels (H ) (Cll-Sephadex C-25,
Produkt von Pharmacia Co., Schweden) zur Adsorption der aktiven Substanz geschickt. Das Dextrangel wurde mit 500ml Wasser
gewaschen und dann mit 0,15 M wäßriger Natriumchloridlösung entwickelt. Das Eluat wurde in Fraktionen von 18 ml aufgefangen
und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 82 bis 122) wurden miteinander vereinigt, wobei das Gesamtvolumen dieser aktiven
Fraktionen etwa das dreißigfache des Volumens des Dextrangels betrug, und dann wurden sie wiederum durch eine Säule von
50 ml des synthetischen, adsorbierenden Harzes (Diaion HP-20 von Mitsubishi Easei Co., Japan) zur Adsorption der Substanz
SF-I77I durchgeschickt. Nach dem Waschen mit 100 ml Wasser
wurde das Harz mit 100 ml V/asser und dann mit 100 ml 15 %igem
wäßrigem Methanol zum Entsalzen eluiert und abschließend mit 30 %igem wäßrigem Methanol zur Desorption der Substanz SF-1771
eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 35 ml aufgefangen,
und die aktiven Fraktionen, die vom Natriumchloridgehalt befreit waren (Fraktionen 2 bis 7) wurden miteinander vereinigt
und zur Trockne eingeengt, wobei 42 mg eines grünlich-blau
gefärbten, rohen Pulvers der Substanz SF.-1771 (etwa 60 %
Reinheit) erhalten wurden.
Diese 42 mg des rohen Pulvers der Substanz SP-I771 wurden in
2 ml 90 %igem //äßrigem Methanol (90 % Methanol in Wasser)
aufgenommen, und die erhaltene, wäßrige Lösung wurde auf einer
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Säule von 350 ml eines Gelfiltrationsmittels, "bestehend aus
einem Derivat von Dextransulfat (Sephadex LH-20 von Pharmacia
Co., Schweden) chromatografiert, mit 90 %igem wäßrigem Methanol
entwickelt, wobei 12 ml der blau gefärbten, aktiven Fraktion anfielen. Diese "blau gefärbte Fraktion wurde zur
Trockne unter vermindertem Druck eingeengt, wobei ein blau gefärbtes und reines Produkt des Hydrochlorides der Substanz
SF-177'i (enthaltend die chelatierte Kupferkomponente) erhalten
wurden. Ausbeute = 24 mg.
(a) 300 1 eines Kulturmediums (pH = 7,0), welches 4,0 %
Saccharose, 1,0 % Sojabohnenöl, 3?0 % Sojabohnenmehl, 2,0 %
Weizenkeime, 0,6 % !Natriumchlorid und 0,003 % Kupfersulfat
enthielt, wurden in einen Tankfermentator mit einem Fassungsvermögen
von 570 1 eingegeben und dann durch Erhitzen sterilisiert.
In dieses sterilisierte Kulturmedium wurde eine Kultur des Stammes SF-1771 (FERiI-P ITr. 3253 und ATCC Hr. 31248),
die zuvor in einem 0,50 1 Becherfermentator gezüchtet worden war, eingeimpft. Das Inkubieren wurde bei 28 0C für 144 Stunden
unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Die Fermentationsbrühe xrarde unter Verwendung von Diatomeenerde als Filtrationshilfsstoff
filtriert. Das erhaltene Brühenfiltrat (etwa 190 l) wurde durch eine Säule von 18 1 des in Beispiel 1 verwendeten,
synthetischen, adsorbierenden Harzes (Amberlite XAD-2 von Röhm
& Haas Co., USA) zur Adsorption der aktiven Substanz filtriert. Das Harz wurde mit 180 1 Wasser und dann mit 40 1 50 %igem
wäßrigem Aceton (Aceton-Wasser, 1:1 in Volumen) gewaschen, hieran schloß sich die Elution mit 50 1 50 %igem wäßrigem
Aceton (pH = 3, angesäuert durch Zugabe von Salzsäure) an. Das Eluat wurde in Fraktionen von 5 1 aufgefangen, und die
aktiven Fraktionen (Fraktionen 3 "bis 9) wurden miteinander vereinigt und durch Zugabe von 1 Ή wäßriger Matriumhydroxidlösung
neutralisiert und unter vermindertem Druck durch Abdampfen des Acetons eingeengt.
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MO
Die konzentrierte Lösung wurde durch eine Säule von 1 1 des in Beispiel 1 verwendeten Dextrangelfiltrationsmittels (CM-Sephadex
C-25, Produkt von Pharmacia Co., USA) zur Adsorption der aktiven Substanz geschickt. Die Säule wurde
mit 5 1 V/asser und dann mit 2 1 0,1 M wäßriger Fatriumchloridlösung
gewaschen, anschließend folgte die Entwicklung mit 0,2 M wäßriger Hatriumchloridlösung, so daß die aktive Substanz
eluiert wurde. Das Eluat wurde in Fraktionen von 18 ml aufgefangen, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 82 bis 240)
wurden durch eine Säule von 1 1 des in Beispiel 1 verwendeten, synthetischen, adsorbierenden Harzes (Diaion HP-20, Produkt
von Mitsubishi Easei Co., Japan) zur Adsorption der aktiven Substanz geschickt, diese Earzsäule wurde dann mit 2 1 Wasser
zum Entsalzen gewaschen und dann mit 1 1 30 %igem wäßrigem
Methanol zur Herbeiführung der Desorption der Substanz SF-1771
eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 500 ml aufgefangen, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 2 bis 5) wurden erneut
durch eine Säule von 200 ml des zuvor verwendeten Dextrangelfiltrationsmittels
(CM-Sephadex C-25, Produkt von Pharmacia Co., Schweden) zur Adsorption der aktiven Substanz geschickt. Die
Gelsäule wurde mit Wasser gewaschen und dann mit 0,2 M wäßriger Hatriumchloridlösung zur Herbeiführung der Desorption
der Substanz SF-1771 eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen
von 18 ml gesammelt, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 98 bis 256) wurden durch eine Säule von 600 ml des zuvor
verwendeten synthetischen, adsorbierenden Harzes (Diaion HP-20, Produkt von Mitsubishi Kasei Co., Japan) geschickt, danach
wurde mit 2 1 Wasser zum Entsalzen gewaschen und anschließend mit 1 1 30 %igem wäßrigem Methanol zur Desorption der Substanz
SF-1771 eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 5OO ml gesammelt, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 3
bis 5) wurden miteinander vereinigt, anschließend wurde zur Trockne eingeengt, wobei etwa 3 S eines grün gefärbten, rohen
Pulvers der Substanz SF-1771 (Reinheit = 48 %) erhalten
wurden.
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Diese 3 g rohes Pulver der Substanz SF-1771 wurden in 7
90 %igem wäßrigem Methanol aufgenommen, und die erhaltene,
methanolische Lösung wurde einer Verteilungschromatografie auf einer Säule von 1,5 1 des zuvor verwendeten Dextransulfatgels
(Sephadex LH-20, Produkt von Pharmacia Co., Schweden) unter Verwendung eines Mischlösungsmittels aus Butanol-Methanol-Wasser
(4:1:2 in Volumen) als Entwicklerlösungsmittel unterworfen. Das Eluat wurde in Fraktionen von 15 ml aufgefangen,
und die "blau gefärbten, aktiven Fraktionen (Fraktionen 32 "bis 44·) wurden gesammelt» Diese aktiven Fraktionen wurden
miteinander vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt, wobei 1,2 g eines partiell gereinigten Pulvers der Substanz
SF-1771 (Reinheit = 90 %) erhalten wurden. Dieses Rohprodukt
der Substanz SE-I771 (1,2 g) wurde in 6 ml 90 %igem wäßrigem
Methanol aufgenommen, und die so erhaltene Lösung wurde auf einer Säule von 1,2 1 des Dextransulfatgels (Sephadex LH-20)
unter Verwendung von 90 %igem wäßrigem Methanol als Entwicklerlösungsmittel
chromatografiert. Das Eluat wurde in 16 ml
Fraktionen gesammelt, und die blau gefärbten, aktiven Fraktionen (Fraktionen 26 bis 3I) wurden in einem Gesamtvolumen von 98 ml
erhalten. Diese aktiven Fraktionen wurden miteinander vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt, wobei ein reines Produkt
der Substanz SF-1771 als blau gefärbtes, amorphes Pulver erhalten
wurde. Die Ausbeute betrug 1 g.
(b) 150 mg dieser Substanz SF-1771 wurden in 15 ml Methanol
aufgelöst, und in die erhaltene, methanolische Lösung wurde gasförmiger Schwefelxiasserstoff eingeleitet, bis die Lösung
nicht mehr die blaue Farbe zeigte (etwa 4 Minuten). Während dieses Einleitens lagerte sich ein Niederschlag von Kupfersulfid
ab. Der Niederschlag wurde abfiltriert,· und das Filtrat wurde zu einem Volumen von etwa 4 ml unter vermindertem Druck
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eingeengt. Die so erhaltene, konzentrierte Lösung wurde auf
einer Säule von 1 1 des Dextransulfatgels (Sephadex LE-20) unter Verwendung von 90 %igera wäßrigem Methanol als Entwicklerlösungsmittel
chromatografiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 18 ml gesammelt, und die aktiven Fraktionen
(Fraktionen 22 Tois 27) wurden in einem Gesamtvolumen von
112 ml erhalten. Die vereinigten, aktiven Fraktionen wurden im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei ein reines Produkt
der Substanz SF-1771-B als weiß gefärbtes, amorphes Pulver
erhalten wurde. Ausbeute = 107
35 1 eines Kulturmediums (pH = 75O), welches 4,0 % Saccharose,
1,0 % Sojabohnenöl, 3*0 % Sogabohnenmehl, 2,0 % ¥eizenkeime,und
0,6 % Natriumchlorid enthielt, wurden in einen Tankfermentator
mit einem Fassungsvermögen von 50 1 eingegeben. Bach der Sterilisation
des Kulturmediums durch Erhitzen wurde das sterilisierte Kulturmedium mit einer Impfkultur des Stammes SF-1771
(FEBIi-P Kr. 3253 und ATCC 31248), die zuvor inkubiert worden
war, beimpft. Die Kultivierung wurde bei 28 0C für 114 Stunden
unter Belüften und Rühren durchgeführt. Die Fermentationsbrühe wurde unter Verwendung von Diatomeenerde als Filtrationshilfsmittel
filtriert, so daß etwa 20 1 des Brühenfiltrates
erhalten wurden.
Durch das Brühenfiltrat wurde gasförmiger Schwefelwasserstoff
für etwa 40 Minuten bei Umgebungstemperatur durchgeleitet, danach wurde die Reaktionslösung durch Einblasen von Luft
zur Entfernung des überschüssigen Schwefelwasserstoffs aus
der Reaktionslösung gespült. Die Lösung wurde dann durch eine Säule von 2 1 des in Beispiel 1 verwendeten, synthetischen,
adsorbierenden Harzes (Amberlite jQLD-2, Produkt von Rönm &
Haas Co., USA) zur Adsorption der Substanz SF-1771-B geschickt.
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Die Harzsäule wurde mit 20 1 Wasser und dann mit 10 1 50 %igem
wäßrigem Aceton gewaschen und schließlich mit 50 %igem wäßrigem
Aceton (pH = 3> angesäuert durch Zugabe von Salzsäure)
eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 500 ml aufgefangen,
und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 3 "bis 12) wurden miteinander
vereinigt und durch Zugabe von 1 Ή Natriutnhydroxidlösung
neutralisiert. Die neutralisierte Lösung wurde unter vermindertem Druck durch Abdestillieren des Acetons eingeengt.
Die konzentrierte Lösung wurde dann durch eine Säule von 250 1
des in Beispiel 1 verwendeten, vernetzten Dextrangels (H+)
(CM-Sephadex C-25> Produkt von Pharmacia Co., Schweden) zur Adsorption der aktiven Substanz durchgeschickt. Die Säule
wurde mit Wasser gewaschen und dann mit 0,2 M wäßriger iTatriumchloridlösung
zur Desorption der aktiven Substanz eluiert.
Das Eluat wurde in Fraktionen von 18 ml aufgefangen, und die
aktiven Fraktionen (Fraktionen 68 bis 126) wurden miteinander vereinigt, anschließend wurde mit 100 ml eines synthetischen,
adsorbierenden Harzes (Diaion HP-20, Produkt von Mitsubishi Kasei Co., Japan) zur Adsorption der Substanz SF-1771-^B behandelt.
Die Harzsäule wurde mit 300 ml Wasser gewaschen, dann mit 500 ml 60 %igem wäßrigem Methanol zur Desorption der
aktiven Substanz eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei
520 mg eines rohen Pulvers der Substanz SF-1771-B erhalten wurden. Dieses rohe Produkt wurde in der gleichen Weise, wie
in Beispiel 2 beschrieben, weiter gereinigt, wobei ein reines Produkt der Substanz SF-1771-B erhalten wurde. Ausbeute = 86 mg.
Das Hydrochlorid der Substanz SF-I771 (200 mg).wurde in 20 ml
0,2 %iger Natriumsulfidlösung in Wasser aufgelöst und für
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10 Minuten gerührt, bis die blaue Farbe sich zu der dunkelbrauner Farbe des ausgefällten Kupfersulfids umgewandelt hatte.
Das ausgefällte Material wurde durch Filtration entfernt und ve CTfO rf en.
Das Filtrat wurde mit 1 M" Salzsäure neutralisiert und auf ein
Volumen von 10 ml eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit dem zuvor verwendeten synthetischen, adsorbierenden Harz
(Diaion HP-20 Harz) entsalzt.
Die Eluatfraktionen wurden miteinander vereinigt, anschließend
wurde zur Trockne eingeengt, wobei etwa 188 mg eines farblosen, rohen Pulvers der Substanz SF-1771-B erhalten wurden.
350 mg des Hydrochlorides der Substanz SF-1771 wurden in 30 ml
0,1 Ή Salzsäure aufgelöst und wiederholt mit 0,5 % Dithizon
enthaltendem Chloroform extrahiert, bis keine rötlich-violette Färbung mehr zurückblieb.
Nach der Entfernung der Chloroformphase wurde die zurückbleibende,
wäßrige Lösung wiederholt mit Chloroform gewaschen. Die wäßrige Lösung wurde mit einem Anionenaustauscherharz (OH")
(Amberlite IR-4-5, Produkt von Eöhm & Haas Co., USA) neutralisiert
und im Vakuum zur Trockne eingeengt, wobei ein gelbliches Eohpulver (34-2 mg) der Substanz SF-1771-B erhalten wurde. Dieses
Produkt der Substanz SF-1771-B (34-2 mg) wurde in 4 ml 90 %igem
wäßrigem Methanol aufgenommen, und die so erhaltene Lösung wurde auf einer Säule von 700 ml des zuvor verwendeten Dextransulfatgels
(Sephadex LH-20) unter Verwendung von 90 %igem
wäßrxgem Methanol als Entwicklerlösungsmittel chromatografiert.
Das Eluat wurde in Fraktionen von 10 ml aufgefangen, und die
aktiven Fraktionen (Fraktionen 30 bis 36) wurden zu einem
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Gesamtvolumen von 72 ml vereinigt und im Vakuum zur Trockne
eingeengt, wobei ein reines Produkt der Substanz SF-1771-B
als farbloses, amorphes Pulver erhalten wurde. Ausbeute =
287 mg.
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Claims (10)
- PatentansprücheSubstanz SF-1771» blau gefärbte Verbindung in Form eines amorphen Pulvers, welches basisch und löslich in Wasser ist und eine antibakterielle Aktivität zeigt, deren Hydrochlorid sich langsam nach braun bei 185 0C verfärbt und sich bei 2Q8 0C unter Schäumen zersetzt, deren Hydrochlorid in Wasser leicht löslich ist, in Methanol löslich ist, in Äthanol und Butanol gering löslich ist, jedoch in den anderen, organischen Lösungsmitteln unlöslich ist, deren Hydrochlorid bei den Reaktionen mit ITinhydrin-Reagens, Ehrlich-Eeagens, Ealiumpermanganatreagens, Greig-Leiback-Reagens positiv ist und bei der Reaktion mit Sakaguchi-Reagens negativ ist, deren Hydrochlorid ein Molekulargewicht von etwa 1600, bestimmt nach der Barger-Methode aufweist und bei der Elementaranalyse folgende Werte ergibt: C = 38,70 %, H = 5,4-2 %, N = 13,03 %, 0 = 29,62 %, S * 3,62 %, Cl = 6,07 % und Cu = 3,53 °/° (gemessen durch Atomabsorptionsspektroskopie), deren Hydrochlorid charakteristischeAbsorptionsspitzen bei 248 nm (E^ = 146) und bei 282-284 um'.(E^m = 106) im UV-Absorptionsspektrum, aufgelöst in Wasser, zeigt und charakteristische Absorptionsbanden, wie sie in der Fig. 2 der Zeichnung gezeigt sind» im IR-AbsorptionsSpektrum, als Tablette in Kaliumbromid, aufweist, sowie pharmazeutisch · annehmbare Säureadditionssalze der Substanz SF-1771·
- 2. Substanz SF-1771-B·, eine farblose oder schwach gelb gefärbte Verfindung in Form eines amorphen Pulvers, welche basisch und löslich in Wasser ist und eine antibakterielle Aktivität sowie eine Antitumoraktivität aufweist, der-en Hydrochlorid sich langsam nach braun bei 180 0C verfärbt und sich bei 212 0C unter Schäumen zersetzt, deren Hydrochlorid in Wasser709818/1122leicht löslich, ist, in Methanol löslich ist, in Äthanol und Butanol gering löslich ist, jedoch in den anderen, organischen Lösungsmitteln unlöslich ist, deren Eydrochlorid "bei den Reaktionen mit Ninhydrinreagens, Ehrlich-Reagens, Kaliumpermanganatreagens und G-reig-Leiback-Reagens positiv ist und bei der Reaktion mit Sakaguchi-Reagens negativ ist, deren Hydrochlorid ein Molekulargewicht von etwa 1600, gemessen nach der Barger-Methode, besitzt und eine spezifische optische Drehung von Ca]^0 = -18,4° (c = 1, H2O) aufweist, deren Hydrochlorid bei der Elementaranalyse folgende Werte zeigt: C = 41,36 %, K = 5,53 %, Ii = 14,19 %, S = 3,64 % und 0 = 28,93 %, deren Hydrochlorid eine charakteristische Absorptionsspitze bei 288-290 nm (E 1'° = 84)'1cni ~ im UV-Absorptionsspektrum, aufgelöst in Wasser, zeigt und charakteristische Absorptionsbanden, wie sie in Fig. 5 der Zeichnung gezeigt sind, im IR-Absorptionsspektrum als Tablette in Kaliumbromid zeigt und weiterhin ein Absorptionsspektrum bei der protonenmagnetischen Resonanz, wie es in der Fig. 6 der Zeichnung dargestellt ist, aufgelöst in Deutero-Wasser aufweist, sowie pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze der Substanz SF-I77I-B.
- 3. Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-1771 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein die Substanz SF-1771 bildender Stamm der Gattung Streptomyces in einem Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff enthaltenden Kulturmedium unter aeroben Bedingungen für eine ausreichende Zeit zur Bildung und Ansammlung der Substanz SF-1771' ic dem Kulturmedium gezüchtet wird und dann die antibiotische Substanz aus der Kultur gewonnen wird.709818/1122
- 4. Verfahren nach Anspruch 3> dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Streptomyces toyocaensis SF-1771> hinterlegt als FEEM-F Hr. 3253 oder ATCC Nr. 31248, kultiviert wird.
- 5· Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-177I-B nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz SF-1771 einer Behandlung zur Entfernung des Kupferbestandteiles aus dem Molekül der Substanz SF-1771 unterworfen wird.
- 6. Verfahren nach Anspruch 5? dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz SF-1771 oiit Schwef eli^asserstoff, einem Alkalimetallsulfid oder einem Kupfer chelatierenden Mittel für eine ausreichende Zeit zur Entfernung des Kupferbestandteiles aus dem Molekül der Substanz SIf-I771 behandelt wird.
- 7· Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz SF-1771 in Lösung in Methanol mit Schwefelwasserstoff durch Einleiten von gasförmigem Schwefelwasserstoff in die Lösung umgesetzt wird.
- 8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die noch in dem Filtrat der Fermentationsbrühe des die Substanz SF.-1771 produzierenden Mikroorganismus vorliegende Substanz SF-1771 mit Schwefelwasserstoff durch Einleiten von gasförmigem Schwefelwasserstoff in das Filtrat der Fermentationsbrühe, welches die Substanz SF-1771 enthält, umgesetzt wird.
- 9. Antibakterielles Mittel, enthaltend die Substanz SF-1771 nach Anspruch 1 oder die Substanz SF-1771-B nach Anspruch 2, oder ein Säureadditionssalz der Substanz SF-1771 oder der Substanz SF-1771-B, gegebenenfalls in Kombination mit einem Träger oder einem Verdünnungsmittel.7 0 9 8 18/1122
- 10. Arzneimittel zur therapeutischen Behandlung eines lebenden Tieres oder von Menschen, welche an Tumor leiden, dadurch gekennzeichnet, daß es als aktiven Inhaltsstoff die Substanz SlF-1771-B oder ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz hiervon nach Anspruch 2 in einer ausreichenden Menge zur Reduzierung des Angriffes durch die Tumorzellen in vivo enthält, wobei die aktive, als Inhaltsstoff vorliegende Verbindung in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vorliegt.709818/1122
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