DE2649604A1

DE2649604A1 - Neue antibiotika sf-1771 und sf- 1771-b und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2649604A1
Application number: DE19762649604
Authority: DE
Inventors: Shigeharu Inoue; Michio Kojima; Taro Niida; Kazunori Ohba; Shoji Omoto; Takashi Shomura; Kunikazu Totsukawa; Takashi Tsuruoka; Hiroshi Watanabe; Kanagawa Yokohama
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1975-10-29
Filing date: 1976-10-29
Publication date: 1977-05-05
Also published as: GB1540466A; FR2361906B1; FR2361906A1; CA1082626A; DE2649604C2

Description

PATENTANWÄLTE

DR.A.VAN DERWERTH DR.FRANZ LEDERER REINER F.MEYER

DIPL-ING. (1934-1974) DiPL-CHEM. DIPL-ING.

8000 MÜNCHEN 80

LUCILE-GRAHN-STRASSE22

TELEFON: (089) 472947 TELEX: 524624 LEDER D TELEGR.: LEDERERPATENT

29- Oktober 1976

Meigi Seika Kaisha, Ltd.

Nr. .8, 2-chome, Kyobashi, Chuo-ku, Tokio, Japan

Neue Antibiotika SF-1771 und SE-I771-B und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft eine neue antibiotische Substanz SF-1771» die durch Kultivieren eines neuen Stammes, Streptomyces toyocaensis S]T-1771i in einem flüssigen Kulturmedium unter aeroben Bedingungen gebildet wird, und dieses Antibiotikum kann aus der Ifermentationsbrühe durch Behandlung des Brühenfiltrates mit einem synthetischen, adsorbierenden Harz zur Adsorption der aktiven Verbindung und Eluieren des Harzes mit wäßrigem Alkohol oder wäßrigem Aceton und anschließende chromatografische Reinigung isoliert werden.

Die Substanz SF-1771 ist ein kupferhaltiges Antibiotikuni, das antibakterielle Aktivität gegenüber Escherichia coli, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus und Bacillus subtilis zeigt. Die Entfernung der Kupferkomponente aus der Substanz SF-1771 durch Behandlung mit Schwefelwasserstoff, einem Alkalimetallsulfid oder

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einem Kupfer chelatieren&en Mittel ergibt die Substanz SF-1771-B welche keine Kupferkomponente enthält und eine ebenso hohe antibakterielle Aktivität jedoch eine geringere Toxizität als die Substanz SF-1771 zeigt.

Die Erfindung betrifft daher die beiden neuen Antibiotika, welche als Substanzen SF-1771 und SF-I771-B bezeichnet werden, weiterhin die fermentative Herstellung der Substanz SF-1771 und die Herstellung der Substanz SF-1771-B durch chemische Behandlung der Substanz SF-1771, weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der Substanzen SF-1771 und SF-1771-B.

Eine große Vielzahl von pathogenen Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen sind die Verursacher von Krankheiten bei Menschen, Tieren und Pflanzen. Obwohl eine Anzahl von Antibiotika entwickelt wurde, von denen einige eine hohe antimikrobielle Aktivität gegenüber einem oder mehreren pathogenen Mikroorganismen zeigen, besteht dennoch ein Bedarf für wirksamere Mittel zur Bekämpfung zahlreicher durch diese Mikroorganismen bei Menschen, Tieren und Pflanzen hervorgerufener Krankheiten.

Aufgabe der Erfindung sind neue Antibiotika, die als antibakterielle Mittel für die therapeutische Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Menschen und Tieren und/oder zur Sterilisation von chirurgischen Materialien und Instrumenten vorteilhaft sind. Weitere Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen Antibiotika.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beschreibung näher erläutert. Es wurden ausgedehnte Untersuchungen unternommen, um neue und vorteilhafte Antibiotika herzustellen. Als Ergebnis wurde gefunden, daß bei der Kultivierung eines neuen

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Stammes der Art Streptomyces, der aus einer in Tada-u-mi-cho, Takehara Cita, Hiroshima Prefecture, Japan, gesammelten Bodenprobe isoliert wurde, in einem Kulturmedium unter aeroben Bedingungen eine eine antibakterielle Aktivität gegenüber gram-negativen und gram-positiven Bakterien zeigende Substanz gebildet und in der Kultur angesammelt wird. Es war nun möglich, diese antibakterielle Substanz aus der Kultur zu isolieren und sie zu reinigen. Als Ergebnis der chemischen, physikalischen und mikrobiellen Eigenschaften dieser isolierten Substanz wurde bestätigt, daß diese antibiotisch wirkende Substanz ein neues Antibiotikum ist, das sich von jedem der bekannten Antibiotika unterscheidet. Dieses neue Antibiotikum wurde daher als Substanz Sl-I771 bezeichnet.

Die Erfindung betrifft daher in ihrer ersten Ausführungsform als neues und vorteilhaftes Antibiotikum die Substanz SF-1771, eine blaugefärbte Verbindung in Form eines amorphen Pulvers, das basisch ist, in Wasser löslich ist und eine antibakteriell Aktivität zeigt. Das Hydrochlorid verfärbt sich langsam bei 18$ C nach braun und zersetzt sich bei 208 C unter Schäumen, das Hydrochlorid ist in Wasser leicht löslich, löslich in Methan, gering löslich in Äthanol und Butanol jedoch unlöslich in den anderen organischen Lösungsmitteln. Das HydroChlorid ist positiv bei den Reaktionen mit Ninhydrinreagens, Ehrlich-Reagens, Kaliumpermanganatreagens, Greig-Leiback-Reagens und es ist negativ bei der Reaktion mit Sakaguchi-Reagens. Das Hydroehlorid zeigt ein Molekulargewicht von etwa 1600, bestimmt nach der Barger-Methode und ergibt bei der Elementaranalyse: C = 38,70 %, H = 5,42 %, H =" 13,03 %, 0 = 29,62 %, S =3,62 %, Cl = 6,07 % und Cu = 3,53 % (gemessen durch Atomabsorptionsspektroskopie). Das Hydroehlorid zeigt charakteristische Absorütionsspitzen bei 248 nm (E^ = 146) und bei 282-284 nm (E^ = 106) im UV-Absorptionsspektrum

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in Wasser und es zeigt charakteristische Absorptionsbanden, wie sie in der Fig. 2 der Zeichnung gezeigt sind, bei dem IR-Absorptionsspektrum als Tablette in Kaliumbromid. Die Erfindung betrifft weiterhin ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz der Substanz SF-1771-

Beispiele von pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzen der erfindungsgemäßen Substanz SF-1771 umfassen das Hydrochlorid, Sulfat, Nitrat, Phosphat, Acetat, Maleat, Fumarat, Succinat, Tartrat, Oxalat, Citrat, Methansulfonat, Xthansulfonat und dergleichen.

Weiterhin wurde gefunden, daß die in dem Holekül der Substanz SF-I77I vorhandene Kupferkomponente, wenn die Substanz SF-I771 mit Schwefelwasserstoff oder einem Alkalimetallsulfid wie Natriumsulfid in Lösung in Wasser behandelt wird, hieraus in Form von Kupfersulfid entfernt wird, so daß eine weitere neue Substanz gebildet wird, welche die Kupferkomponente nicht enthält, jedoch eine ebenso hohe antibakterielle Aktivität mit geringerer Toxizität als die Substanz SF-1771 selbst zeigt. Es wurde gefunden, daß die Substanz SF-I77I-B ebenfalls eine Antitumoraktivität aufweist. Diese neue Substanz wurde als Substanz SF-1771-B bezeichnet.

Gemäß einer zweiten Ausführungsform betrifft die Erfindung daher als neues und vorteilhaftes Antibiotikum die Substanz SF-177I-B, eine farblose oder schwach gelb gefärbte Verbindung in Form eines amorphen Pulvers, welches basisch ist, in Wasser löslich ist und eine antibakterielle Aktivität und eine Antitumoraktivität zeigt. Das Hydrochlorid hiervon verfärbt sich bei Ί80 C langsam nach braun und zersetzt sich bei 212 ⁰C unter Schäumen. Das Hydrochloiid ist in Wasser

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leicht loslich, löslich in Methanol, gering löslich in Äthanol und Butanol jedoch unlöslich in den anderen organischen Lösungsmitteln· Das Hydrochlorid ist bei den Reaktionen mit Hinhydrinreagens, Ehrlich-Reagens, Kaliumpermanganatreagens und Greig-Leiback-Reagens positiv, und es ist bei der Reaktion mit Sakaguchi-Reagens negativ. Das Hydrochlorid zeigt ein Molekulargewicht von etwa 160.0, gemessen nach der Barger-Methode und eine spezifische, optische Drehung ^⁰ °

⁰ = -18,4° (C=I, H₂O). Das Hydrochlorid der Substanz zeigt eine Elementaranalyse von: C = 41,36 %, H = 5,53 %» N = 14,19 #, S » 3,64 % und 0 = 28,93 %. Das Hydrochlorid zeigt eine charakteristische Absorptionsspitze bei 288-290 nm (E'' = 84) im UV-Absorptionsspektrum, aufgelöst in Wasser, und es zeigt charakteristische Absorptionsbanden, wie sie in der Fig. 5 der Zeichnung gezeigt sind, im IR-Absorptionsspektrum in Tablettenform in Kaliumbromid, weiterhin zeigt es ein Absorptionsspektrum der protonenmagnetischen Resonanz, wie es in Fig. 6 der Zeichnung wiedergegeben ist, aufgelöst in Deuterowasser. Die Erfindung betrifft weiterhin ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz der Substanz SF-I77I-B. ' -

Beispiele für pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze der Substanz SF-1771-B sind die gleichen, wie sie zuvor für die erfindungsgemäße Substanz SF-1771 beschrieben wurde.

Diese Säureadditionssalze der Substanz SF-1771-B wie auch der Substanz SF-1771 können durch Umsetzung der Substanz SF-I771-B oder der Substanz SF-I771 in Form der freien Base mit einer pharmazeutisch annehmbaren Säure wie Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure oder Essigsäure in Lösung in Wasser bei Umgebungstemperatur in bekannter Weise hergestellt werden.

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Im folgenden wird auf die Zeichnung Bezug genommen. In der Zeichnung sind:

Fig. 1 ein U"V-A"bsorpt ions Spektrum des Hydro chlorides der Substanz SF-Wl in Wasser.

Fig. 2 ein IE-Ab Sorptionsspektrum, des Hydro chlorides der Substanz SF-1771 in Tablettenform in Kaliumbromid.

Fig. 3 Muster der Gradientenelution der Substanz SF-1771 und hiermit in Beziehung gesetzte Antibiotika bei der Chromatografie auf einem Ionenaustauscher-gelfiltrationsmittel (CH-Sephadex C-25) (H⁺) im "Vergleich zu dem Elutionsmuster von Ammoniumformiat.

Fig. 4 ein UV-Absorptionsspektrum des Hydrochlorids der Substanz SF-1771-B in Wasser.

Fig. 5 ein IR-Absorptionsspektrum des Hydrochlorids der Substanz SF-1771-B als Tablette in Kaliumbromid.

Fig. 6 ein Absorptionsspektrum der protonenmagnetischen Resonanz des Hydrochlorids der Substanz SF-1771-B in Deuterowasser, gemessen bei 100 HHz.

Das Hydrochlorid der Substanz SF-1771 zeigt die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:

(1) Aussehen: blau gefärbtes, amorphes Pulver

(2) Zersetzungstemperatür: Verfärbung nach braun erfolgt langsam bei 185 °C und die Zersetzung tritt bei 208 ⁰C unter Schäumen auf.

(3) Elementaranalyse: Das Hydrochlorid der Substanz SF-1771 enthält die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Kupfer und Chlor und ergibt bei der Analyse folgendes Ergebnis: C = 38,70 %, H = 5,42 %, Ή =

13,03 %, 0 = 29,62 %, S = 3,62 %, Cl = 6,07 % und Cu = 3,53 (gemessen durch Atomabsorptionsspektroskopie).

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KK

(4) UV-Absorptionsspektrum: Das UV-Spektrum des Hydro Chlorids der Substanz SF-1771> gemessen in wäßriger Lösung, ist in der Fig. 1 dargestellt und zeigt Absorptionsspitzen

bei 248 um (E^ = 146) und bei 282-284 mi (E^ = 106).

(5) IE-ÄbsοrptionsSpektrum: Das IH-Spektrum des Hydrochloride der Substanz SI¹-1771 i-ⁿ Form der Kaliumbromidtablette ist in der Fig. 2 dargestellt.

(6) Molekulargewicht: Das Molekulargewicht beträgt etwa 1600, gemessen nach der Barger-Methode, und es wird angenommen, daß ein einzelnes Kupferatom pro Molekül der Substanz SF-1771 vorhanden ist.

(7) Löslichkeit: leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol, gering löslich in Äthanol und Butanol, jedoch unlöslich in den anderen organischen Lösungsmitteln.

(8) Farbreaktion: positiv gegenüber Ninhydrin-* Ehrlich-, Kaliumpermanganat- und Greig-Leiback-Reagenzien; negativ gegenüber Sakaguchi-Eeagens.

(9) Stabilität: stabil in neutralen und sauren Medien, jedoch relativ instabil in alkalischen Medien.

(10) Rf-Wert: Bei der Dünnschichtchromatografie auf Kieselerde (Kieselgel 60 Fp₁-^ von Merck Co., Deutschland) ergibt das Hydrochlorid der Substanz SF-1771 einen einzelnen Fleck bei den in der folgenden Tabelle I gezeigten Rf-Werten.

Tabelle I

Entwicklerlösungsmittel

Propylalkohol-Pyridin-Essigsäure-

Wasser (15:10:3:12 in Volumen) 0,76

Methanol-10 %iges wäßriges Ammonium-

acetat-10 %iges wäßriges Ammoniak

(10:9:1 in Volumen) . 0,57

10 %iges wäßriges Ammoniumacetat-Methanol (1:1 in Volumen) 0,68

10 %iges wäßriges Ammoniumacetat-Methanol (1:2 in Volumen) 0,54

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(11) Ef-Wert: Bei der Papierchromatografie (aufsteigende Methode) erscheint der einzelne Fleck bei den in der folgenden Tabelle II angegebenen Rf-Werten:

Tabelle II

wassergesättigtes n-Butanol O

3 %iges wäßriges Ammoniumehlorid

(in Gewicht) 0,71

Phenol-Wasser (3:1 in Volumen) 0,69

Aceton-Wasser (1:1 in Volumen) 0,09

n-Butanol-Methanol-Wasser

(4:1:2 in Volumen) 0,06

B en ζ ο1-Methano1

(4:1 in Volumen) 0,02

Wasser 0,07

(12) Optische Drehung: Die Bestimmung der spezifischen, optischen Drehung ist mit der D-Strahlung als Folge der blauen Färbung der Lösung des Hydrochlorides der Substanz SF-1771 unmöglich.

(13) Elutionsmuster: Die Fig. 3 zeigt die Muster der Gradientenelution des Hydrochlorides der Substanz SF-1771 und hiermit in Beziehung gesetzter Antibiotika bei der Elution aus einem Ionenaustauscher-gelfiltrationsmittel (CM-Sephadex G-25 von Pharmacia Co., Schweden) in der H⁺- Forrn, entwickelt mit 0 bis 1,0 M Ammoniumformiat als Elutionsmittel. Jedes Eluat wurde als 5-ml-Fraktion gesammelt, und die optische Dichte jeder Fraktion wurde bestimmt. Der Unterschied zwischen den bestimmten Werten der optischen Dichte jeder Fraktion und des gemessenen Wertes der optischen Dichte des reinen Elutionsmittels wurde als Werte AOD auf der Ordinate, bezogen auf die Nummer des Röhrchens für gede Fraktion, aufgetragen auf der Abszisse, wie in der Fig. 3 dargestellt, aufgetragen.

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Die mit der erfindungsgemäßen Substanz in Beziehung gesetzten, untersuchten Antibiotika waren Bleomycine, Victomycin und Platomycin A und B für Vergleichszwecke. Aus diesen Elutionsmustern ist ersichtlich, daß das Hydrochlorid der Substanz SF-1771 später als Bleomycin Jedoch etwas schneller als Bleomycin B^,, Victomycin und Platomycin A eluiert wird.

Die erfindungsgemäße Substanz SF-I771 zeigt ein antibakteriel les Spektrum, wie es in der folgenden Tabelle III angegeben ist. Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) der Substanz SF-1771 gegenüber verschiedenen Mikroorganismen wurden nach der bekannten Brühenverdünnungsmethode derart bestimmt, daß die Bestimmung nach einer bei 37 °C während 18 Stunden durchgeführten Inkubation unter Verwendung eines Herzinfusionsagars als Inkubationsmedium durchgeführt wurde.

Tabelle III

Antibakterielles Spektrum der Substanz SF-1771 Testmikroorganismen MIC (ng/ml)

Escherichia coli 0,39

Escherichia coli K-12-R 0,39

Salmonella typhi ·* 0,2

Pseudomonas aeruginosa 25

Staphylococcus aureus 209P 3,12

Bacillus subtilis FC1-219 1,56

Vie sich aus den Ergebnissen der Tabelle III entnehmen läßt, zeigt die erfindungsgemäße Substanz SF-I771 eine hohe antibakterielle Aktivität gegenüber gram-positiven und gram-negativen

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λΗ

Bakterien, wobei sie eine bemerkenswert hohe antibakterielle Aktivität gegenüber den gram-negativen Bakterien aufweist.

Weiterhin wurde gefunden, daß die Substanz SF-I771 ebenfalls eine Antipilzaktivität gegenüber verschiedenen Pilzen zeigt. Die minimalen Hemmkonzentrationen der Substanz SF-1771 gegenüber verschiedenen Pilzen wurden nach der bekannten Brülienverdünnungsmethode in der Weise bestimmt, daß die Bestimmung nach der Durchführung der Inkubation bei 28 ⁰C während drei Tagen unter Verwendung eines Sabouraud-glucoseagars als Inknbationsmedium durchgeführt wurde. Für Trichophyton asteroides und JLspergillus fumigatus war die Inkubationszeit jedoch fünf Tage. Das Antipilzspektrum. der Substanz SF-1771 ist in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

AntipilζSpektrum der Substanz SF-1771 Testorganismen HIC (ug/ml)

Candida albicans > 100

Candida krusei 12,5

Candida parapsilosis 50

Candida stellatoidea 100

Candida tropicalis > 100

Cryptococcus albidus 0,78

Cryptococcus laurentii 6,25

Cryptococcus neoformans 30I 0,78

Cryptococcus terreus 0,78

Cryptococcus uniguttulatus 3,13

Pichia spartinae 12,5

Saccharomyces cerevisiae __ 12,5

Trichophyton asteroides 6,25

Aspergillus fuaiigatus 1,56

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Weiterhin wurde gefunden, daß die Substanz SF-1771 zur Behandlung von Trichophytonsinfektionen bei Tieren wirksam ist. So wurden sechs Gruppen von Testtieren, wobei jede Gruppe aus zehn Meerschweinchen vom Hartley-Stamm (männlich, erxirachsen, Gewicht 310-400 g) bestand, mit Trichophyton asteroides in solcher Weise geimpft, daß der Pelz von vier Bereichen der Haut auf dem Rücken eines jeden Tieres weggeschnitten wurde, daß diese Hautflächen mit Sandpapier abgerieben wurden und dann hierauf eine wäßrige Suspension des Hycels von Trichophyton asteroides aufgetragen, wurde. Zwei Tage nach dem Impfen wurde eine Lösung von 1 Gew.-% der Substanz SF-I771 in Äthanol auf die beimpften Hautbereiche einmal am Tag während neun Tagen zur therapeutischen Behandlung der Trichophyton-Infektion aufgebracht. Bei der KontroIlgruppe der Testtiere wurde lediglich wäßriges 70 %iges Äthanol auf die beimpften Hautbereiche in der gleichen Weise wie zuvor aufgetragen. Hach dieser Behandlung wurden die Tiere getötet und aus den so behandelten Hautflächen wurden drei Stücke (3x3 mm) der Haut ausgeschnitten, diese wurden anschließend auf einer Platte von Agarkulturmedium bei 27 ⁰C für drei Tage inkubiert. Die mikroskopische Betrachtung zeigte, daß kein Wachstum des Pilzes auf allen Hautstücken beobachtet werden konnte, welche aus den mit der erfindungsgemäßen Substanz SF-1771 behandelten Hautflächen ausgeschnitten worden waren, während das Wachstum des Pilzes auf praktisch allen Hautstücken beobachtet werden konnte, die aus den Hautflächen der lediglich mit dem wäßrigen Äthanol behandelten Kontrolltieren ausgeschnitten worden waren.

Zur Bestimmung der akuten Toxizität der Substanz SF-1771 wurden Lösungen, welche 6,25 mg - 50 mg der Substanz SF-1771 pro 0,2 ml isotonischer NatriumchloridlÖsung enthielten, intravenös mit einer Dosis von 0,2 ml pro Maus bei mehreren

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Gruppen von Mäusen inj'iziert, wobei j"ede Gruppe aus fünf. Mäusen vom ICR-Stamm (männlich, erwachsen, Gewicht im Durchschnitt 20 g) bestand.

Sieben Tage nach dieser intravenösen Injektion wurde bestimmt, daß die Prozentsätze der Anzahl der toten Mäuse, bezogen auf die Gesamtanzahl der untersuchten Mäuse, 100 %, 100 %, 60 % und 20 °/o bei den Dosiswerten von 50 mg/kg, 25 mg/kg, 12,5 mg/kg bzw. 6,25 mg/kg der Substanz SF-1771 pro Maus lagen. Es kann daher nicht gesagt werden, daß die Substanz SF-1771 nichttoxisch ist, j'edoch ist sie dennoch zur Sterilisation von chirurgischen Materialien und Instrumenten wie auch von anderen Einrichtungen, Apparaturen und Stellen, welche steril gehalten werden sollen, vorteilhaft. Die Substanz SF-1771 kann ebenfalls als antibakterielles Mittel für externe Anwendungen verwendet v/erden. Für diese Zwecke kann die Substanz SF-1771 is- Form einer wäßrigen Lösung formuliert werden, welche 0,01 bis 0,1 Gew.-% der Substanz SF-1771 oder eines Säureadditionssalzes hiervon enthält.

Es wurde ein Vergleich zwischen der Substanz SF-1771 und bekannten, wasserlöslichen, basischen Antibiotika durchgeführt. Als wasserlösliches basisches Antibiotikum, welches einen Kupferbestandteil enthält, sind Phleomycin (T. Ikekawa et al., "Journal of Antibiotics" Ser. A. Vol. 17, (1964) S. 194-) Bleomycine (H. Umezawa et al., "Journal of Antibiotics", Ser. A. Vol. 19 (1966), S. 200), Zorbamycin und Zorbonomycin B,C (A. D. Argoudelis et al., "Journal of Antibiotics" Vol. (1971), S. 543), die Substanzen YA-56-X, YA-56-Y (Y. Ito et al., "Journal of Antibiotics" Vol. 24 (1971)_S S. 727), Victomycin (T. Hara et al., "Journal of Antibiotics" Vol. 28 (1975), S. 366), Platomycin A,B (T. ÜTara et al., "Journal of Antibiotics" Vol. 28 (1975), S. 662), die Substanz SS-70-A (japanische Patentanmeldung 86034/1974) und die Substanz

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SS-7O-B (japanische Patentanmeldung 86035/1974-) bekannt. Alle diese "bekannten, kupferhaltigen Antibiotika zeigen zwei Absorptions spit ζ en, d. h. die erste bei 24-3-24-6 nm und die zweite bei 290-303 nm in ihrem UV-Absorptionsspektren. Jedoch können Bleomycine und Phleomycin voneinander unterschieden werden und sie können weiterhin von den anderen, bekannten kupferhaltigen Antibiotika unterschieden werden. Im Gegensatz dazu zeigt die erfindungsgemäße Substanz SF-1771 die erste Absorptionsspitze bei 248 nm und die zweite bei 282-284 nm in ihrem UV-Absorptionsspektrum, was anzeigt, daß die Lage der Absorptionsspitzen der Substanz SF-1771 von der Lage der Absorptionsspitzen der zuvor genannten, bekannten, wasserlöslichen und basischen, kupferhaltigen Antibiotika deutlich verschieden ist. In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, daß die erfindungsgemäße Substanz SF-1771 ein wasserlösliches und basisches Antibiotikum vom Peptidtyp ist, daß sie sich jedoch von allen bekannten, wasserlöslichen und basischen, kupferhaltigen Antibiotika, wie sie zuvor genannt wurden, unterscheidet. Daher ist die Substanz SF-I771 eine neue, antibiotisch wirkende Verbindung, die von jedem der bekannten Antibiotika vom Bleomycin- und Phleomycintyp verschieden ist.

Die erfindungsgemäße Substanz SF-I771 kann durch Kultivieren eines Stammes der Art Streptomyces hergestellt werden, wobei dieser Stamm von den Erfindern zuerst aus einer in Tada-u-mi-cho, Takehara City, Hiroshima-Prefecture, Japan gesammelten Bodenprobe, wie zuvor beschrieben, isoliert wurde, und dieser Stamm als Stamm SF-1771 bezeichnet wurde. Das Kultivieren bzw. Züchten kann unter aeroben Bedingungen in gleicher Weise wie bei der Herstellung von bekannten Antibiotika durch Kultivieren von bekannten Stämmen der Art Streptomyces durchgeführt werden.

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- -Vr-

Der Stamm SF-177I hat folgende Merkmale:

(I) Morphologische Beobachtung:

Luftmycel wird stark auf Glyzerin-Asparagin-agar, Stärkeagar, Hafermehlagar, Hefe-Malz-agar und Tyrosinagar gebildet und die Bildung von Sporen ist häufig. Das Mycel bildet einfüßige Zweige, bildet jedoch keine Quirle.

Das Luftmycel trägt Spiralen an seiner Spitze. Eine Bildung von speziellen Strukturen wie Sclerotium wurde nicht beobachtet. Die elektronenmikroskopische Beobachtung zeigt, daß die Oberflächenstruktur der Sporen stachelig ist. Die Sporen besitzen eine elliptische bis ovale Gestalt und messen normalerweise 0,8 -1,1 Mikron mal 1,2 - 1,4 Mikron. Reife Sporenketten mit mehr als 10 Sporen pro Kette werden, üblicherweise gebildet.

(II) Kulturmerkmale auf verschiedenen Kulturmedien:

Die Kulturmerkmale sind in der folgenden Tabelle V zusammengestellt. In der folgenden Tabelle beruhen die in eckigen Klammern angegebenen Beschreibungen der Farben auf der Norm von "Color Harmony Mannual of Container Corporation of America".

Tabelle V

Kulturmedium Wachstum, Earbe Luftmycel lösliches

der Rückseite ____^ Pigment

Sucrosenitrat- dünnes Wachstum gering, weiß keines agar ί§ί!^ΐ2^ ^i§_S£§HzH§i§

Glucose-Aspa- schwach gelb bräunlich keines ragin-agar _ S^r§u_C3ge2

Glyzerin-Aspa- gutes Wachstum häufig, grau keines ragin-agar ^s£kw§£k_gelb £§fe2

Stärkeagar gutes Wachstum, häufig, hell- keines

schwach grau- gelblichlich-gelb . 5£§^B_£^ii?l

Eafermehlagar gutes Wachstum, häufig, hell- keines

gräulich-gelb gelblichbraun [4-xk]

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Tabelle V (Fortsetzung)

Kulturmedium

Hefe-Malz-agar

Tyrosinagar

Wachstum, Farbe der Rückseite

Luftmycel

lösliches Pigment

gutes Wachstum, baumwollartig keines blaßgelb bis häufig, schwach gelb bräunlich-grau

gutes Wachstum, gräulich-gelb

blaßgrau
[2dcJ

keines

Anmerkung: Die Inkubatxonstemperatur betrug im allgemeinen

28 C, falls nichts anderes angegeben ist.

(III) Physiologische Eigenschaften:

(1) Temperaturbereich des Wachstums: Der Stamm SF-1771 wächst in einem Temperaturbereich von 20 - 38 °C auf Hefe-Malzagar medium.

(2) Verflüssigung von Gelatine: Gelatine wird langsam durch die Inkubation bei 20 C für 21 oder mehr Tage verflüssigt.

(3) Hydrolyse von Stärke: positiv (bei 28 ⁰C)

(4) Koagulation von Magermilch: negativ (bei 28 ⁰C und 37 °C)

(5) Peptonisierung von Magermilch: positiv (bei ?8 ⁰C und 37 ⁰C

(6) Chromogenität: negativ

(IV) Verwertung von Kohlenstoffquellen (geschätzt in Pridham-Gottlieb-Agarmedium inkubiert bei 28 ⁰C):

(1) Verwertbar: D-Glucose, D-Fruetose, D-Mannit, I-Inosit.

(2) nicht verwertbar: Sucrose, Bhamnose, Eaffinose, L-Arabinose, D-XyIose.

Die oben angegebenen Eigenschaften des Stammes wie folgt zusammengefaßt werden.

-I771 können

7 0 9 8 18/1122

Der Stamm SF-1771 gehört zur Art Streptomyces und das Luftmycel "bildet Spiralen an seiner Spitze und die Oberflächenstruktur der Sporen ist stachelig. Der Stamm SF-1771 zeigt ein gutes Wachstum auf verschiedenen Kulturmedien, und die Färbung der Rückseite des Wachstums ist blaßgelb bis gräulichgelb und nicht unterscheidungskräftig gefärbt. Das Luftraycel besitzt eine graue bis braune' farbe und es wird auf keinem Kulturmedium ein lösliches Pigment gebildet·

Der Stamm S]f-1771 wurde als Streptomyces sp. SF-1771 bezeichnet und bei der japanischen, öffentlichen Hinterlegungsstelle "Fermentation Research Institute", Chiba city, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Ur. 3253 (eine Eulturprobe dieses Stammes wurde von Fermentation Research Institute am 18. 9- 1975 erhalten) und ebenfalls bei der "American Type Culture Collection", Washington D.C, USA unter der Hummer ATCC 31248 hinterlegt.

Als bekannte Stämme, die dem Stamm SF-1771 ähnlich sind, können Streptomyces toyocaensis₃ Streptomyces natalensis, Streptomyces fasiculatus und Streptomyces alulus genannt werden.

Im Hinblick auf die Beschreibungen im ISP (International Streptomyces Project), worin auf die Aufsätze in "International Journal of Systematic Bacteriology" Vol. 18 (1968), S. 108-110 und S. 174-176 und Vol. 22 (1972), S. 271-273 und S. 323-326 Bezug genommen wird, können diese vier Stämme von dem Stamm SF-1771 in ihren morphologischen Eigenschaften und KuIturaierkmalen nicht unterschieden werden. Daher wurde ein unmittelbarer Vergleich zwischen den Typenkulturen dieser vier bekannten Stämme und dem Stamm SF-1771 durchgeführt. Als Ergebnis wurde gefunden, daß der Stamm SF-1771 dem Stamm

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Streptomyces toyocaensis unter den zuvor genannten vier Stämmen am nächsten kommt und von den restlichen, drei "bekannten Stämmen unterscheidbar ist. Ein genauerer Vergleich zeigt, daß der Stamm SF-1771 mit der Typenkultur von Streptomyces toyocaensis in zahlreichen Eigenschaften koinzidiert, daß er von diesem Stamm jedoch hinsichtlich der in der folgenden Tabelle Vl angegebenen Merkmale unterscheidbar ist.

Tabelle VI

Merkmale

Stamm SF-1771

Typenkultur von Streptomyces toyocaensis

Farbe der Rückseite des Vachstums

lösliches Pigment

gräulich-gelb gelb bis bräun-

lich-gelb

keines

blaßgelb

Luftraycel

gebildetes Antibiotikum

baumwollartig,
blaßgrau

Substanz
SF-1771

gering
{ungenügend)

Toyocamycin

Der Stamm SF-1771 koinzidiert daher hinsichtlich seinei* Haupteigenschaften mit Streptomyces toyocaensis, obwohl eine Unterscheidung bei weniger wichtigen Merkmalen beobachtet wird. Daher erscheint es vernünftig, daß der Stamm SF-1771 a?s ein neuer Stamm der bekannten Art Streptomyces toyocaensis identifiziert wird. Daher wird der Stamm SF-1771 jetzt als Streptomyces toyocaensis SF-1771 bezeichnete,

Der Stamm SF-1771 besitzt Eigenschaften, die einer Veränderung unterliegen^ wie dies üblicherweise bei anderen Arten von

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Streptomyces "beobachtet wird. So kann der Stamm SF-1771 "beispielsweise eine "Variante oder Hutante bilden, wenn er mit verschiedenen Mutagenen wie UV-Strahlungen, Strahlungen aus radioaktiven Stoffen, hochfrequenten, elektromagnetischen Wellen und Chemikalien behandelt wird. Jede natürliche oder künstliche Variante oder Hutante des Stammes SF-1771 kann für die Herstellung der Substanz SF-1771 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet'werden, vorausgesetzt, daß er die Fähigkeit zur Bildung der erfindungsgemäßen Substanz -I771 besitzt.

Gemäß einer dritten Ausführungsform betrifft die Erfindung daher ein Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-1771» wobei dieses das Kultivieren eines die Substanz SF-1771 bildenden Stammes der Gattung Streptomyces in einem Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff enthaltenden Kulturmedium unter aeroben Bedingungen für eine ausreichende Zeit zur Bildung und Ansammlung der Substanz SF-1771 in dem Kulturmedium und dann das Gewinnen dieser antibiotischen Substanz aus der Kultur umfaßt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung daher ein Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-1771j wobei Streptomyces toyocaensis SF-1771 sit den Hinterlegungsnummern FESM-P Nr. 5253 oder ATCC Ur. 31243 in einem Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff enthaltenden Kulturmedium unter aeroben Bedingungen für eine ausreichende Zeit zur Bildung und Ansammlung der Substanz SF-1771 in cLem Kulturmedium gezüchtet und dann die Substanz SF-1771 aus der Kultur gewonnen wird.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-1771 kann der die Substanz SF-1771 bildende Stamm und insbesondere der Stamm Streptomyces toyocaensis SF-1771 in

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an sich bekannter Weise unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium gezüchtet werden, welches Nährstoffe, nämlich durch gewöhnliche Mikroorganismen assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff enthalt.

. Als Nährstoffe können beliebige der bekannten Nährsubstanzen verwendet werden, welche üblicherweise bei dem Züchten der bekannten Stämme von Streptomyces verwendet wurden. Beispielsweise sind Glucose, Sucrose (Saccharose), Stärke, Glyzerin, Stärkesirup, Melassen, Sojabohnenöl und dergleichen als Eohlenstoffquelle brauchbar. Sojabohnenmehl, Veizenkeime, Fleischextrakt, Pepton, getrocknete Hefe, Maisquellwasser, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat und dergleichen sind als Stickstoffquelle brauchbar. Gegebenenfalls können anorganische Salze wie Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Phosphate und dergleichen zu dem Kulturmedium zugesetzt werden. Weiterhin können dem Kulturmedium solche organische und anorganische Materialien zugesetzt werden, welche das Wachstum des die Substanz SF-1771 bildenden Stammes unterstützen und die Bildung der Substanz SF-1771 fördern. Zu dem Kulturmedium kann'Kupfersulfat zugesetzt \irerden, jedoch ist die Zugabe einer Kupferverbindung zu dem Kulturmedium nicht unbedingt erforderlich, da eine Spur von Kupfer genügt, welche in natürlicher Weise in den Nährsubstanzen natürlichen Ursprungs, die in dem Kulturmedium verwendet werden, von dem Stamm SF-1771 als Kupferquelle zur Bildung der Substanz SF-1771» das ein kupferhaltiges Antibiotikum ist, verwertet wird.

Als Methode zur Kultivierung des die Substanz SF-1771 bildenden Stammes und insbesondere des Stammes SF-1771 werden vorteilhafterweise die Methode der Flüssigkultivierung und insbesondere der Flüssigkeitstauchkultivierung in ähnlicher Weise wie bei den allgemeinen Verfahrensvxeisen zur "Herstellung von

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it

bekannten Antibiotika angev/andt. Die Kultivierung bzw. das Züchten kann geeigneterweise unter aeroben Bedingungen und bei einer geeigneten Inkubationstemperatur in einem Bereich von 25 ⁰C bis 35 ⁰C durchgeführt werden. Für die technische oder labormäßige Herstellung der Substanz SF-1771 wird es oft bevorzugt, die Kultivierung bei einer Temperatur in der Nähe von 28 ⁰G durchzuführen. Unter diesen Kultivierungsbedingungen erreicht die Konzentration der Substanz SP-1771 in der Kulturbrühe ein Maximum am Ende von 2 bis 8 Tagen der Fermentation, entweder bei einer Schüttelkultivierungsmethode oder bei einer Tankkultivierungstnethode.

Für die Untersuchung der erfindungsgemäßen Substanz SF-1771 kann die folgende Untersuchungsmethode angewandt werden: Als Untersuchungskulturmedium wird ein 0,5 % Folypepton, 0,3 % Fleischextrakt und 1,5 % Agar (pH = 7,0) enthaltendes Medium verwendet. Als Untersuchungsstamm wird Escherichia coli NIHJ verwendet. Bei dieser Untersuchungsmethode kann bei einer Konzentration von 25 bis 5/U-g/ml der Substanz SF-1771 die Beziehung zwischen dem Logarithmus der Konzentration der Substanz SF-1771 "¹¹¹¹CL dem Durchmesser der Hemmzone linear aufgetragen werden, wobei die Hemmzone von 22,0 bis 16,0 mm im Durchmesser, bestimmt nach der Papierscheibenmethode, erhalten wird.

Da die erfindungsgemäße Substanz SF-1771 eine die Kupferkomponente wie zuvor beschrieben enthaltende, wasserlösliche und basische Substanz vom Peptidtyp ist, kann sie üblicherweise aus der Kulturbrühe durch Adsorption auf einem anorganischen Adsorptionsmittel wie Aktivkohle und/oder Aluminiumoxid oder einem synthetischen Adsorptionsharz wie einem schwach sauren lonenaustauscherharz (Amberlite XÄ.D-2,*Diaion EP-20), einem Ionenaustauscher-G-elfiltrationsmittel oder Gelfiltrationsmittel und anschließendes Eluieren von dem Adsorptionsmittel mit Hilfe eines geeigneten Elutionsmittels gewonnen werden.

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Zur Gewinnung und Reinigung der Substanz SF-1771 ist jedoch die folgende Methode am wirksamsten: Die Kulturbrühe wird mit Hilfe eines geeigneten Filtrationshilfsstoffe wie Diatomeenerde zur Entfernung des Mycels und der anderen festen Stoffe filtriert,und das so erhaltene Brühenfiltrat wird durch eine Säule eines synthetischen Adsorptionsharzes, das aus einem mikroporösen Copolymer!sat von Styrol und Divinyl-"benzol "besteht (Amberlite XAD-2, Produkt von Röhm & Haas Co., USA) für die Adsorption der Substanz SF-1771 durchgeschickt. Das Harz wird dann mit Wasser gewaschen und mit einem Elutionsmittel eluiert, das aus wäßrigem Äthanol oder wäßrigem Aceton "besteht und das auf einen sauren pH-Wert (pH = 3,0 "bis 3>5) durch Zuga"be einer Hineralsäure wie Salzsäure oder einer organischen Säure wie Essigsäure eingestellt sein kann. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen und die aktiven Fraktionen werden miteinander vereinigt und gegebenenfalls neutralisiert. Die aktiven Fraktionen werden dann unter vermindertem Druck durch Abdestillieren des organischen Lösungsmittels (des Äthanols oder Acetons) eingeengt. Die erhaltene, konzentrierte Lösung wird durch eine Säule mit einem Ionenaustauscher-Gelfiltrationsmittel in Form eines carboxymethylsubstituierten, vernetzten Dextrangels (CM-Sephadex C-25, Produkt von Pharmacia Co.·, Schweden) durchgeschickt. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und dann mit einer wäßrigen Lösung eines geeigneten Salzes wie einer wäßrigen 0,2 M Natriumchloridlösung eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen, und die aktiven Fraktionen werden miteinander vereinigt und durch Behandlung mit dem zuvor genannten Ionenaustauscherharz (Amberlite X4D-2)' entsalzt. Die entsalzte Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet, wobei ein rohes, die Substanz SF-1771 enthaltendes Pulver erhalten wird. Zur Reinigung dieses Rohpulvers wird dieses Rohpulver in einem -kleinen Volumen Wasser aufgenommen, und die wäßrige Lösung wird einer Säulenchromatografie auf einem aus einem Dextransulf at derivat bestehenden Gel (Sephadex LH-20, Produkt von Pharmacia Co., Schweden) unterworfen, mit Methanol oder einem Mischlösungsmittel

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aus Butanol-Methanol-Wasser (4:1:2 im Volumen) als Elutionsmittel entwickelt. . Das Eluat wird wieder in Fraktionen gesammelt, und die aktiven Fraktionen, welche einen einzigen Fleck der Substanz SF-1771 "bei der Papierchromatografie ergeben, werden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei ein Reinprodukt der Substanz SF-1771 als blau gefärbtes, amorphes Pulver erhalten wird.

Die erfindungsgemäße Substanz SF-1771-B, die die zweite Ausführungsform der Erfindung darstellt, kann durch Behandlung der Substanz SF-1771 mit einem geeigneten Mittel, das zur Entfernung der Kupferkomponente aus dein Molekül der Substanz SF-1771 in. der Lage ist, hergestellt werden. Gemäß der vierten Ausführungsform betrifft die Erfindung daher ein Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-1771-3, wobei die Substanz SF-1771 einer Behandlung zur Entfernung der Kupferkomponente aus dem Molekül der Substanz SF-1771 unterworfen wird. Die Behandlung zur Entfernung der Kupferkomponente aus dem Molekül der Substanz SF-1771 kann entweder in einer solchen Weise durchgeführt werden, daß die Substanz SF-1771 in Lösung in Methanol oder einem anderen geeigneten_T inerten, organischen Lösungsmittel mit Schwefelwasserstoff oder einem Alkalimetallsulfid, wie ITatriumsulfid und/oder Kaliumsulfid, für eine ausreichende Zeit zur Entfernung des Kupferbestandteiles aus dem Molekül der Substanz SF-1771 behandelt wird, oder in der Weise, daß die Substanz SF-1771 mit einem Kupfer chelatierenden Mittel wie 8-Hydroxychinolin und/oder Dithizon für eine ausreichende Zeitspanne zur Entfernung des Kupferbestandteiles aus der Substanz SE-1771 behandelt wird. Wenn die Substanz SF-1771 mit dem Kupfer chelatierenden Mittel zur Entfernung der Kupferkomponente hieraus umgesetzt wird, wird es bevorzugt, daß die Substanz SF-1771 in Losung in angesäuertem Wasser mit einer Lösung von Dithizon in Chloroform umgesetzt wird. Diese Reaktion zur Entfernung des Kupferbestandteiles

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aus der Substanz SF-1771 können bei Umgebungstemperatur durchgeführt werden, wobei als Reaktionsmedium Wasser oder ein organisches Lösungsmittel, in welchem die Reagenzien löslich sind und welches gegenüber der Reaktion inert ist, verwendet wird. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-1771-B, wobei die Substanz SF-1771 einer Behandlung mit Schwefelwasserstoff, einem Alkalimetallsulfid oder einem Kupfer chelatierenden Mittel für eine ausreichende Zeitspanne zur Entfernung des Kupferbestandteiles aus dem Molekül der Substanz SF-1771 unterzogen wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren gemäß dieser Ausführungsform zur Herstellung der Substanz SF-1771-B kann nicht nur unter Verwendung der Substanz SF-1771 in isolierter Form eines Rohpulvers oder eines reinen Produktes, wie zuvor beschrieben, als Ausgangsmaterial, das mit einem Mittel zur Entfernung des Kupferbestandteiles behandelt wird, durchgeführt werden, sondern auch unter Verwendung der Fermentationsbrühe, des Brühenfiltrates oder einer rohen Lösung, welche die Substanz SF-1771 hierin aufgelöst enthält, in der Weise durchgeführt werden, daß die Substanz SF-1771 mit Schwefelwasserstoff, einem Alkalimetallsulfid oder einem Kupfer chelatierenden Mittel, während sie noch in der Fermentationsbrühe, dem Brühenfiltrat oder der rohen Lösung vorliegt, behandelt wird. Zur Isolierung der Substanz SF-1771-B aus dem Reaktionsgemisch, in welchem die Substanz SF-1771 niit dein Mittel zur Entfernung des Kupferbestandteiles hieraus behandelt wurde, können solche Methoden angewandt werden, die den zur Gewinnung der Substanz SF-1771 aus der Kultur des die Substanz SF-1771 bildenden Mikroorganismus anwendbaren Methoden ähnlich sind. So kann des Reaktionsgemisch, das aus de'r Behandlung

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der Substanz SF-1771 zur Entfernung der Kupferkomponente hieraus kommt, mit dem zuvor genannten Ionenaustausciierliarz (Amberlite XAD-2) zur Adsorption der Substanz SF-1771-B "behandelt werden, und das adsorbierende Harz kann dann eluiert werden, anschließend kann eine Chromatografie der aktiven Fraktionen des Eluates unter Bildung eines rohen, die Substand SF-1771-B enthaltenden Pulvers durchgeführt werden. Für die weitere Reinigung kann dieses rohe Pulver auf einer Säule aus einem,Gel aus einem Dextransulfatderivat (Sephadex LH-2O)

.synthetischem Harz

oder/(Diaion HP-20) chromatografiert werden, so daß ein Reinprodukt der Substanz SF-1771--B erhalten wird. Die Substanz SF-I771-B ebenso wie die Substanz SF-I771 sind wasserlösliche und basische Antibiotika vom Peptidtyp, und daher kann die Substanz SF-1771-B im allgemeinen mittels einer Reinigungsmethode gereinigt werden, die derjenigen zur Reinigung der Substanz SF-1771 analog ist.

Das Hydrochlorid der Substanz SF-1771-B zeigt die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften, wobei einige dieser Eigenschaften bereits zuvor beschrieben wurden:

(1) Aussehen: farbloses (weiß gefärbtes) bis schwach gelb gefärbtes, amorphes Pulver.

(2) Zersetzungstemperatur: Verfärbung nach braun erfolgt langsam bei 180 ⁰C und die Zersetzung tritt bei 212 ⁰G unter Schäumen auf.

(3) Elementaranalyse: Das Hydrochlorid der Substanz SF-1771-B enthält die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Chlor und ergibt folgendes Analysenergebnis: C = 41,36 %, H = 5,53 %, H = 14,19 %, 0 = 28,93 % und S * 3,64 %.

Ferner wurde festgestellt, daß der Gehalt an Chlor bei der Elementaranalyse 6,12 % betrug, obwohl die Bestimmung des Chlorgehaltes in exakter Weise als Folge der Anwesenheit

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der Schwefelkomponente in dem Molekül nur schwierig durchzuführen war.

(4) TJV-Ab-sorptionsspektrum: Das UV-Spektrum des Hydro chlorides der Substanz SF-1771-B? gemessen in einer wäßrigen Lösung, ist in der Fig. 4 der Zeichnung wiedergegeben und zeigt eine Absorptions spit ze "bei 288-290 nm (E^ = 84).

(5) IR-AbsorptionGspektrum: Das IR-Spektrum des Hydrochlorides der Substanz SF-1771-B, als Tablette in Kaliumbromid, ist in der Fig. 5 der Zeichnung wiedergegeben.

(6) Absorptionsspektrum der protonenmagnetischen Resonanz: Das PMR-Spektrum des Hydrochlorides der Substanz SF-177I-B in Deuteriumoxid ist in der Fig. 6 der Zeichnung wiedergegeben, bestimmt bei 100 MHz.

(7) Molekulargewicht: etwa 1600, gemessen nach der Barger-Methode.

(8) Löslichkeit: leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol, gering löslich in Äthanol und Butanol, jedoch unlöslich in den anderen, organischen Lösungsmitteln.

(9) Farbreaktion: positiv gegenüber Einhjdrin-, Ehrlich-, Kaliumpermanganat- und Greig-Leiback-Reagenzien. Negativ gegenüber Sakaguchi-Reagens.

(10) Stabilität: Stabil in neutralen und sauren Medien, jedoch relativ instabil in alkalischen Medien.

(11) Rf-Wert: Bei der Dünnschichtchromatografie auf Kieselerdegel (Kieselgel 60 Fgszp Produkt von Merck Co. Deutschland), ergibt das Hydrochlorid der Substanz SF-I77I-B einen einzigen Fleck bei den in der folgenden Tabelle VII angegebenen Rf-Werten. Zum Vergleich sind die Rf-Werte für das Hydrochlorid der Substanz SF-1771 ebenfalls in dieser Tabelle VII angegeben.

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Tabelle VII

Ef-Wert

Entwicklerlösungsmittel SF-1771-B Sff-1771

Propylalkohol-Pyridin-Essigsäure-

Wasser (15:10:3:12 in Volumen) 0,76 0,76 Hethanol-10 %iges wäßriges Ammonium-

acetat-10 ?oiges wäßriges Ammoniak

(10:9:1 in Volumen) 0,50 0,57

10 %iges wäßriges Ammoniumacetat-Methanol (1:1 in Volumen) 0,48 0,68

10 %iges wäßriges Ammoniumacetat-Methanol (1:2 in Volumen) 0,38 0

(12) Optische Drehung: Ca3p° = -18,4° (c = 1, H₂O)

Die Substanz SF-1771-B gemäß der zweiten Ausführungsform der Erfindung zeigt ein antibakterielles Spektrum, wie es in der folgenden.Tabeile VIII zusammengestellt ist. Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) dieser Substanz gegenüber verschiedenen Mikroorganismen wurden nach der bekannten Brühenverdünnungsmethode in der Weise bestimmt, daß die Bestimmung nach der Durchführung der Inkubation bei 37 °C während 18 Stunden unter Verwendung einer Herzinfusionsagars als Inkubationsmedium durchgeführt wurde.

Tabelle VIII

Antibakterielles Spektrum der Substanz SF-1771-B Sestmikroorganismen MIC (iig/ml)

Escherichia coli 0,39

Escherichia coli K-12-R 0,39 Salmonella typhi - 0,19

Pseudomonas aeruginosa 50

Staphylococcus aureus 209? 6,25

Bacillus subtilis PCI-219 1,55

Salmonella pullorum 0,39

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Tabelle VIII (Fortsetzung)

Testmikroorganismen MIC (ug/ml)

PastLirella sp. 001 3,12

" "05 1,56

" " 020 1,56

Wie aus den Ergebnissen der Tabelle VIII ersichtlich, zeigt die erfindungsgemäße Substanz SF-1771-B ebenfalls eine antibakterielle Aktivität gegenüber den gram-negativen und grampositiven Bakterien, die im wesentlichen ebenso hoch wie diejenige der Substanz SF-1771 ist.

Pur die Abschätzung der akuten Toxizität der Substanz SF-1771-B wurden Lösungen, welche 6,25 mg bis 50 mg der Substanz SF-1771-B pro 0,2 ml isotonischer Katriumchloridlösung enthielten, intravenös bei einer Dosis von 0,2 ml pro Maus bei mehreren Gruppen von Mäusen, wobei jede Gruppe aus fünf Mäusen vom ICH-Stamm (männlich, erwachsen, Durchschnittsgewicht 20 g) bestand, injiziert. Sieben Tage nach dieser intravenösen Injektion wurde bestimmt, daß die Prozentsätze der Anzahl der toten Pläuse, "bezogen auf die Gesamtanzahl an untersuchten Mäusen, 100 %, 60 %, 0 % und 0 % bei den Dosiswerten von 50 mg/kg, 25 mg/kg, 12,5 mg/kg bzw. 6,25 mg/kg an Substanz SF-1771-B pro Maus lagen. Bei der Dosis von 12,5 mg/kg der Substanz SF-1771-B überlebten alle untersuchten Mäusen nach dem Test, während bei der Dosis von 12,5 mg/kg eine 60 % der Gesamtzahl der Testmäuse entsprechende Anzahl an Mäusen bei Verwendung der Substanz SF-1771 starben, was zeigt, daß die Substanz SF-1771-B im Vergleich zu der Substanz SF-1771 eine signifikant verminderte, akute Toxizität besitzt.

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Die erfindungsgemäße Substanz SF-1771-B wird als au de© Antibiotika vom Bleomycin-Phleomycin-Typ gehörend angesehen. Es ist bekannt, daß Bleomycin durch eine Rohenzymlösung inaktiviert werden kann, welche aus der überstehenden Flüssigkeit besteht, die durch Zentrifugieren eines Rattenleberhomogenates bei 100 000 G erhalten wird.

Um abzuschätzen, in welchem Ausmaß die Aktivität der er-findungsgemäßen Substanz SF-1771-B in vivo im Tier im Vergleich zu Bleomycin Ap inaktiviert werden kann, wurde der folgende Test durchgeführt:

10 mg der Substanz SF-I771-B als Substrat wurden bei 37 ⁰C mit 2 ml einer Rohenzymlösung (pH = 7₅2) umgesetzt, welche aus Rattenleberhomogenat in der oben beschriebenen Weise hergestellt worden war. Am Ende von Λ Stunde, 3 Stunden, 6 Stunden j 10 Stunden und 24 Stunden nach dem Beginn der enzymatischen Reaktion wurden Proben aus dem Reaktionsgemisch entnommen und auf ihre antibakterielle Potenz gegenüber dem Untersuchungsorganismus, Escherichia coli IfIHJ, untersucht. Die Prozentsätze der zurückbleibenden, antibakteriellen Potenz dieser Proben, bezogen auf die anfängliche, antibakterielle Potenz, bestimmt zu Beginn der Reaktion (Reaktionszeit = 0 Stunden) wurde berechnet. Das Ausmaß der Inaktivierung (%) wurde nach folgender Gleichung berechnet:

(Λ zurückbleibende, antibakterielle Potenz ν ^_ηπ ^ " anfängliche, antibakterielle Potenz ^{; x} ^u

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IX zusammengestellt:

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Substrat

Tabelle IX	Inaktivi erung	20 60	48 . 66	W
	Reaktionszeit (h) 3 6 10		24
Ausmaß der	0 36	72 >94
1
O 24

SF-1771-B

Bleomycin A~
(von Kupfer
"befreites
Derivat)

Aus den Ergebnissen dieser Tabelle IX ist ersichtlich, daß die Substanz SjT-1771-B wesentlich schwieriger durch die enzymatischen Reaktionen als Bleomycin Ap inaktiviert werden kann, so daß die Substanz SF-1771-B bei Tieren in vivo eine viel höhere Aktivität als Bleomycin Ap zeigen kann.

Darüber hinaus wurde gefunden, daß die erfindungsgemäße Substanz SJ?-1771-B eine Hemmaktivität gegenüber dem Wachstum von Zellen von Hella S3 aufweist und eine minimale Degenerierungskonzentration von 3^9 ^ig/ml gegenüber diesen Zellen bei der mikroskopischen Beobachtung nach einer Inkubation bei 37 ⁰C während 48 Stunden zeigt. Darüber hinaus zeigt die Substanz S3T-1771-B eine Antitumoraktivität gegenüber Tumorzellen von Sarcoma. 180. So wurde eine wäßrige Suspension (0,05 nil) von Sarcoma-180-Tumorzellen bei mehreren Gruppen von Mäusen, wobei jede Gruppe aus fünf Mäusen vom ICR-Stamm (männlich, etwa acht Wochen alt) bestand, bei einer Dosierung von 10,4 χ 10 Zellen pro Haus intraperitoneal eingeimpft. 24 Stunden nach der (i.p.) Einimpfung der Tumorzellen wurden 16 mg/kg, 8 mg/kg, 4 mg/kg, 2 mg/kg und 1 mg/kg der Substanz SF-I771-B pro Maus durch intraperitoneale Injektion einmal täglich während drei Tagen gegeben. Zum "Vergleich wurden 40 mg/kg, 20 mg/kg, 10 mg/kg und 5 mg/kg an Bleomycin bei der Vergleichsgruppe der Mäuse in der gleichen Weise wie die Substanz SF-1771-B

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gegeben. In jeder Gruppe wurden fünf mit Tumorzellen geimpfte Mäuse verwendet. Die mittlere Anzahl der uberlebenstage bei den behandelten Mäusen, die prozentuale Zunahme der Lebensspanne (abgekürzt als ILS %) gegenüber den Kontrollmäusen und das Bauchwasservolumen wurden zur Abschätzung der Antitumoraktivität der Substanz SF-1771-B und von Bleomycin gemessen. Der Wert von ILS (%) wurde nach folgender Gleichung berechnet:

mittlere Überlebenstage der behandelten Mäuse mittlere Uberlebenstage der Kontrollmäuse

- 1

χ 100

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle X zusamm.engestellt.

	Tabelle X	Dosis	mittl.	ILS (%)	Bauch	60 Tage
Testverbin	(mg/kg)	Anzahl		wa s ser	über
dung		der		vo lumen	lebende
		Über		(ml)	Mäuse
		lebens-
		tage
	16	8,8	-50	0	0/5
SP_1771-B	8	31,4	78,4	0,1	0/5
	4	36,8	109,1	13,0	0/5
	2	37,2	111,4	19,2	0/5
	1	29,0	64,8	21,8	0/5
	40	4-5,8	160,2	13,0	2/5
Bleomycin	20	36,8	109,1	20,2	0/5
(Vergleichs	10	35,0	98,9	21,4	0/5
verbindung)	5	19,8	12,5	26,4	0/5

Kontrolle

17,6

23,8

0/5

Wie aus der Tabelle X ersichtlich, ergibt die"Dosis von 2 mg/kg an SF-I77I-B den maximalen Wert ILS von 111,4 %, was nahelegt, daß eine optimal wirksame Dosis der Substanz

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SF-1771-3 im Bereich von 2 "bis 4 mg/kg für die therapeutische Behandlung von Sarcoma-180-Tumorzellen (Wasserbauchsucht) tragenden Hausen ist, und daß die Substanz SF-1771-B bei niedrigeren Dosismengen als Bleomycin wirksam ist.

Daher ist die erfindungsgemäße Substanz SF-1771-B als Antifrumormittel in ähnlicher Weise wie Bleomycin anwendbar und kann in den bekannten, pharmazeutischen Formen formuliert und in der gleichen Weise wie Bleomycin appliziert werden.

Im Hinblick auf die antibakterielle Aktivität der Substanz SF-1771 und der Substanz SP-I771-3 betrifft die Erfindung daher ein antibakterielles Mittel, welche die Substanz SF-1771 oder die Substanz SF-1771-B oder Säureaddxtxonssalze hiervon, gegebenenfalls in Kombination mit einem Träger oder einem Verdünnungsmittel hierfür, enthält. Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung daher ein Arzneimittel zur therapeutischen Behandlung eines lebenden Tieres oder von Menschen, die an einem Tumor leiden, wobei das Arzneimittel als aktiven Bestandteil die Substanz SF-1771-B oder ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz hiervon in einer ausreichenden Menge zur Verminderung des Angriffs durch die Tumorzellen in vivo enthält, wobei die aktive Verbindung in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vorliegen kann.

Es sei darauf hingewiesen, daß die verwendeten, tatsächlich bevorzugten Mengen der Substanz SF-1771 und der Substanz SF-1771-B entsprechend der besonderen, formulierten Zusammensetzung, der Applikationsart und dem besonderen Situs und dem besonderen, zu behandelnden Organismus variieren können. Zahlreiche Faktoren, welche die Wirkung des Arzneimittels

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modifizieren, können von dem Fachmann in Bechnung gezogen werden, z. B. Alter, Körpergewicht, Sex, Diät, Applikationszeit, Applikationsweg, Geschwindigkeit der Exkretion, Arzneimittelkonibinationen, Reaktionsempfindlichkeiten und Schwere der Krankheit. Die optimalen Applikationsmengen für eine vorgegebene Zustandskombination können von dem Fachmann unter Anwendung der konventionellen Bestimmungstests für die Dosismenge unter Berücksichtigung der zuvor gegebenen Richtlinien bestimmt werden.

Die Erfindung wird anhand der folgenden, bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

35 1 eines Kulturmediums mit pH = 7>O, welches 4,0 % Saccharose, 1,0 % Soöabohnenöl, 3>0 % Sojabohnenmehl, 2,0 % Weizenkeime, 0,6 % Natriumchlorid und 0,003 % Kupfersulfat enthielt, wurden in einem Standgefäßfermentator mit einem Fassungsvermögen von 50 1 eingegeben und durch Erhitzen sterilisiert. In dieses sterilisierte Kulturmedium wurde eine Saatkultur von Streptomyces toyocaensis, Stamm SF-1771 (identifiziert als FEEM-P Hr. 3253 und als ATCC 31248), die zuvor in einem Schrägagarmedium inkubiert worden war, eingeimpft. Das beimpfte Kulturmedium wurde bei 28 ⁰C während 114 Stunden unter Belüftung und Rühren (Rührgeschwindigkeit 300 Upm) inkubiert.

Die so erhaltene Fermentationsbrühe wurde unter Verwendung von Diatomeenerde als Filtrationshilfsmittel filtriert und es wurden etwa 20 1 Brühenfiltrat aufgefangen. Dieses Brühenfiltrat wurde durch eine Säule von 2 1 adsorbierendem Harz in Form eines synthetischen, adsorbierenden Harzes, das aus einem mikroporösen Copolymerisat aus Styrol und Divinylbenzol bestand

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(Amberlite XÄ.D-2 von Röhm & Haas Co., USA) zur Adsorption der aktiven Substanz durch das Harz geschickt. Das Harz wurde mit 20 1 Wasser gewaschen, dann wurde es mit 10 1 50 %igem wäßrigem Aceton (einem Gemisch aus Aceton-Wasser, 1:1 in Volumen) gewaschen und anschließend mit 50 %igem wäßrigem Aceton (pH = 3» angesäuert durch Zugabe von Salzsäure) zur Herbeiführung der Desorption der aktiven Substanz eluiert.

Das Eluat wurde in Fraktionen von 500 ml aufgefangen, und die aktiven Fraktionen wurden miteinander vereinigt und durch Zugabe von 1 N wäßriger Natriumhydroxidlösung, neutralisiert, hieran schloß sich eine Konzentration unter vermindertem Druck zur Entfernung des Acetons an. Die konzentrierte Lösung wurde dann durch eine Säule von 250 ml eines Gelfiltrationsmittels in Form eines carboxymethylsubstituierten, vernetzten Dextrangels (CM-Sephadex C-25 von Pharmacia Co., Schweden) (H⁺) zur Adsorption der aktiven Substanz geschickt. Die Gelsäule wurde mit 215 1 Wasser und dann mit 0,5 1 einer 0,1 M wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen, anschließend wurde mit 0,2 M wäßrigem Natriumchlorid entwickelt. Das Eluat wurde in Fraktionen von 18 ml aufgefangen, wobei gefunden wurde, daß die Fraktionen 124 bis 198 die aktive Substanz enthielten. Das Gesamtvolumen dieser aktiven Fraktionen betrug ungefähr das zehnfache bis zwölffache des Volumens des Gels bei der Gelfiltration (CM-Sephadex-Gel). Diese aktiven Fraktionen wurden durch eine Säule von 100 ml eines synthetischen, adsorbierenden Harzes in Form eines mikroporösen Copolymerxsates aus Styrol und Diviny!benzol (Diaion HP-20_s Produkt von Mitsubishi Kasei Co., Japan) zur Adsorption der aktiven Substanz durchgeschickt. Das Harz wurde mit 200 1 Wasser gewaschen, anschließend wurde mit 400 ml von 15 %igem wäßrigem Methanol (15 % Methanol in Wasser) zum Entsalzen eluiert und dann mit 500 ml 30 %'igem wäßrigem Methanol (30 % Methanol in V/asser) zur Desorption der aktiven

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Substanz eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 100 ml aufgefangen. Die Fraktionen 1 bis 5> welche die aktive Substanz enthielten, wurden miteinander vereinigt und zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt, um ein grün gefärbtes Rohpulver der Substanz SF-1771 zu erhalten.

Dies rohe Pulver (320 mg) wurde in 10 ml Wasser aufgenommen und die erhaltene, wäßrige Lösung wurde durch eine Säule von 50 ml des zuvor verwendeten Dextrangels (H ) (Cll-Sephadex C-25, Produkt von Pharmacia Co., Schweden) zur Adsorption der aktiven Substanz geschickt. Das Dextrangel wurde mit 500ml Wasser gewaschen und dann mit 0,15 M wäßriger Natriumchloridlösung entwickelt. Das Eluat wurde in Fraktionen von 18 ml aufgefangen und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 82 bis 122) wurden miteinander vereinigt, wobei das Gesamtvolumen dieser aktiven Fraktionen etwa das dreißigfache des Volumens des Dextrangels betrug, und dann wurden sie wiederum durch eine Säule von 50 ml des synthetischen, adsorbierenden Harzes (Diaion HP-20 von Mitsubishi Easei Co., Japan) zur Adsorption der Substanz SF-I77I durchgeschickt. Nach dem Waschen mit 100 ml Wasser wurde das Harz mit 100 ml V/asser und dann mit 100 ml 15 %igem wäßrigem Methanol zum Entsalzen eluiert und abschließend mit 30 %igem wäßrigem Methanol zur Desorption der Substanz SF-1771 eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 35 ml aufgefangen, und die aktiven Fraktionen, die vom Natriumchloridgehalt befreit waren (Fraktionen 2 bis 7) wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei 42 mg eines grünlich-blau gefärbten, rohen Pulvers der Substanz SF.-1771 (etwa 60 % Reinheit) erhalten wurden.

Diese 42 mg des rohen Pulvers der Substanz SP-I771 wurden in 2 ml 90 %igem //äßrigem Methanol (90 % Methanol in Wasser) aufgenommen, und die erhaltene, wäßrige Lösung wurde auf einer

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Säule von 350 ml eines Gelfiltrationsmittels, "bestehend aus einem Derivat von Dextransulfat (Sephadex LH-20 von Pharmacia Co., Schweden) chromatografiert, mit 90 %igem wäßrigem Methanol entwickelt, wobei 12 ml der blau gefärbten, aktiven Fraktion anfielen. Diese "blau gefärbte Fraktion wurde zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt, wobei ein blau gefärbtes und reines Produkt des Hydrochlorides der Substanz SF-177'i (enthaltend die chelatierte Kupferkomponente) erhalten wurden. Ausbeute = 24 mg.

Beispiel 2

(a) 300 1 eines Kulturmediums (pH = 7,0), welches 4,0 % Saccharose, 1,0 % Sojabohnenöl, 3?0 % Sojabohnenmehl, 2,0 % Weizenkeime, 0,6 % !Natriumchlorid und 0,003 % Kupfersulfat enthielt, wurden in einen Tankfermentator mit einem Fassungsvermögen von 570 1 eingegeben und dann durch Erhitzen sterilisiert. In dieses sterilisierte Kulturmedium wurde eine Kultur des Stammes SF-1771 (FERiI-P ITr. 3253 und ATCC Hr. 31248), die zuvor in einem 0,50 1 Becherfermentator gezüchtet worden war, eingeimpft. Das Inkubieren wurde bei 28 ⁰C für 144 Stunden unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Die Fermentationsbrühe xrarde unter Verwendung von Diatomeenerde als Filtrationshilfsstoff filtriert. Das erhaltene Brühenfiltrat (etwa 190 l) wurde durch eine Säule von 18 1 des in Beispiel 1 verwendeten, synthetischen, adsorbierenden Harzes (Amberlite XAD-2 von Röhm & Haas Co., USA) zur Adsorption der aktiven Substanz filtriert. Das Harz wurde mit 180 1 Wasser und dann mit 40 1 50 %igem wäßrigem Aceton (Aceton-Wasser, 1:1 in Volumen) gewaschen, hieran schloß sich die Elution mit 50 1 50 %igem wäßrigem Aceton (pH = 3, angesäuert durch Zugabe von Salzsäure) an. Das Eluat wurde in Fraktionen von 5 1 aufgefangen, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 3 "bis 9) wurden miteinander vereinigt und durch Zugabe von 1 Ή wäßriger Matriumhydroxidlösung neutralisiert und unter vermindertem Druck durch Abdampfen des Acetons eingeengt.

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MO

Die konzentrierte Lösung wurde durch eine Säule von 1 1 des in Beispiel 1 verwendeten Dextrangelfiltrationsmittels (CM-Sephadex C-25, Produkt von Pharmacia Co., USA) zur Adsorption der aktiven Substanz geschickt. Die Säule wurde mit 5 1 V/asser und dann mit 2 1 0,1 M wäßriger Fatriumchloridlösung gewaschen, anschließend folgte die Entwicklung mit 0,2 M wäßriger Hatriumchloridlösung, so daß die aktive Substanz eluiert wurde. Das Eluat wurde in Fraktionen von 18 ml aufgefangen, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 82 bis 240) wurden durch eine Säule von 1 1 des in Beispiel 1 verwendeten, synthetischen, adsorbierenden Harzes (Diaion HP-20, Produkt von Mitsubishi Easei Co., Japan) zur Adsorption der aktiven Substanz geschickt, diese Earzsäule wurde dann mit 2 1 Wasser zum Entsalzen gewaschen und dann mit 1 1 30 %igem wäßrigem Methanol zur Herbeiführung der Desorption der Substanz SF-1771 eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 500 ml aufgefangen, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 2 bis 5) wurden erneut durch eine Säule von 200 ml des zuvor verwendeten Dextrangelfiltrationsmittels (CM-Sephadex C-25, Produkt von Pharmacia Co., Schweden) zur Adsorption der aktiven Substanz geschickt. Die Gelsäule wurde mit Wasser gewaschen und dann mit 0,2 M wäßriger Hatriumchloridlösung zur Herbeiführung der Desorption der Substanz SF-1771 eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 18 ml gesammelt, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 98 bis 256) wurden durch eine Säule von 600 ml des zuvor verwendeten synthetischen, adsorbierenden Harzes (Diaion HP-20, Produkt von Mitsubishi Kasei Co., Japan) geschickt, danach wurde mit 2 1 Wasser zum Entsalzen gewaschen und anschließend mit 1 1 30 %igem wäßrigem Methanol zur Desorption der Substanz SF-1771 eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 5OO ml gesammelt, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 3 bis 5) wurden miteinander vereinigt, anschließend wurde zur Trockne eingeengt, wobei etwa 3 S eines grün gefärbten, rohen Pulvers der Substanz SF-1771 (Reinheit = 48 %) erhalten wurden.

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Diese 3 g rohes Pulver der Substanz SF-1771 wurden in 7 90 %igem wäßrigem Methanol aufgenommen, und die erhaltene, methanolische Lösung wurde einer Verteilungschromatografie auf einer Säule von 1,5 1 des zuvor verwendeten Dextransulfatgels (Sephadex LH-20, Produkt von Pharmacia Co., Schweden) unter Verwendung eines Mischlösungsmittels aus Butanol-Methanol-Wasser (4:1:2 in Volumen) als Entwicklerlösungsmittel unterworfen. Das Eluat wurde in Fraktionen von 15 ml aufgefangen, und die "blau gefärbten, aktiven Fraktionen (Fraktionen 32 "bis 44·) wurden gesammelt» Diese aktiven Fraktionen wurden miteinander vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt, wobei 1,2 g eines partiell gereinigten Pulvers der Substanz SF-1771 (Reinheit = 90 %) erhalten wurden. Dieses Rohprodukt der Substanz SE-I771 (1,2 g) wurde in 6 ml 90 %igem wäßrigem Methanol aufgenommen, und die so erhaltene Lösung wurde auf einer Säule von 1,2 1 des Dextransulfatgels (Sephadex LH-20) unter Verwendung von 90 %igem wäßrigem Methanol als Entwicklerlösungsmittel chromatografiert. Das Eluat wurde in 16 ml Fraktionen gesammelt, und die blau gefärbten, aktiven Fraktionen (Fraktionen 26 bis 3I) wurden in einem Gesamtvolumen von 98 ml erhalten. Diese aktiven Fraktionen wurden miteinander vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt, wobei ein reines Produkt der Substanz SF-1771 als blau gefärbtes, amorphes Pulver erhalten wurde. Die Ausbeute betrug 1 g.

(b) 150 mg dieser Substanz SF-1771 wurden in 15 ml Methanol aufgelöst, und in die erhaltene, methanolische Lösung wurde gasförmiger Schwefelxiasserstoff eingeleitet, bis die Lösung nicht mehr die blaue Farbe zeigte (etwa 4 Minuten). Während dieses Einleitens lagerte sich ein Niederschlag von Kupfersulfid ab. Der Niederschlag wurde abfiltriert,· und das Filtrat wurde zu einem Volumen von etwa 4 ml unter vermindertem Druck

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eingeengt. Die so erhaltene, konzentrierte Lösung wurde auf einer Säule von 1 1 des Dextransulfatgels (Sephadex LE-20) unter Verwendung von 90 %igera wäßrigem Methanol als Entwicklerlösungsmittel chromatografiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 18 ml gesammelt, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 22 Tois 27) wurden in einem Gesamtvolumen von 112 ml erhalten. Die vereinigten, aktiven Fraktionen wurden im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei ein reines Produkt der Substanz SF-1771-B als weiß gefärbtes, amorphes Pulver erhalten wurde. Ausbeute = 107

Beispiel 3

35 1 eines Kulturmediums (pH = 7₅O), welches 4,0 % Saccharose, 1,0 % Sojabohnenöl, 3*0 % Sogabohnenmehl, 2,0 % ¥eizenkeime,und 0,6 % Natriumchlorid enthielt, wurden in einen Tankfermentator mit einem Fassungsvermögen von 50 1 eingegeben. Bach der Sterilisation des Kulturmediums durch Erhitzen wurde das sterilisierte Kulturmedium mit einer Impfkultur des Stammes SF-1771 (FEBIi-P Kr. 3253 und ATCC 31248), die zuvor inkubiert worden war, beimpft. Die Kultivierung wurde bei 28 ⁰C für 114 Stunden unter Belüften und Rühren durchgeführt. Die Fermentationsbrühe wurde unter Verwendung von Diatomeenerde als Filtrationshilfsmittel filtriert, so daß etwa 20 1 des Brühenfiltrates erhalten wurden.

Durch das Brühenfiltrat wurde gasförmiger Schwefelwasserstoff für etwa 40 Minuten bei Umgebungstemperatur durchgeleitet, danach wurde die Reaktionslösung durch Einblasen von Luft zur Entfernung des überschüssigen Schwefelwasserstoffs aus der Reaktionslösung gespült. Die Lösung wurde dann durch eine Säule von 2 1 des in Beispiel 1 verwendeten, synthetischen, adsorbierenden Harzes (Amberlite jQLD-2, Produkt von Rönm & Haas Co., USA) zur Adsorption der Substanz SF-1771-B geschickt.

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Die Harzsäule wurde mit 20 1 Wasser und dann mit 10 1 50 %igem wäßrigem Aceton gewaschen und schließlich mit 50 %igem wäßrigem Aceton (pH = 3> angesäuert durch Zugabe von Salzsäure) eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 500 ml aufgefangen, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 3 "bis 12) wurden miteinander vereinigt und durch Zugabe von 1 Ή Natriutnhydroxidlösung neutralisiert. Die neutralisierte Lösung wurde unter vermindertem Druck durch Abdestillieren des Acetons eingeengt. Die konzentrierte Lösung wurde dann durch eine Säule von 250 1 des in Beispiel 1 verwendeten, vernetzten Dextrangels (H⁺) (CM-Sephadex C-25> Produkt von Pharmacia Co., Schweden) zur Adsorption der aktiven Substanz durchgeschickt. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und dann mit 0,2 M wäßriger iTatriumchloridlösung zur Desorption der aktiven Substanz eluiert.

Das Eluat wurde in Fraktionen von 18 ml aufgefangen, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 68 bis 126) wurden miteinander vereinigt, anschließend wurde mit 100 ml eines synthetischen, adsorbierenden Harzes (Diaion HP-20, Produkt von Mitsubishi Kasei Co., Japan) zur Adsorption der Substanz SF-1771-^B behandelt. Die Harzsäule wurde mit 300 ml Wasser gewaschen, dann mit 500 ml 60 %igem wäßrigem Methanol zur Desorption der aktiven Substanz eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei 520 mg eines rohen Pulvers der Substanz SF-1771-B erhalten wurden. Dieses rohe Produkt wurde in der gleichen Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, weiter gereinigt, wobei ein reines Produkt der Substanz SF-1771-B erhalten wurde. Ausbeute = 86 mg.

Beispiel 4

Das Hydrochlorid der Substanz SF-I771 (200 mg).wurde in 20 ml 0,2 %iger Natriumsulfidlösung in Wasser aufgelöst und für

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10 Minuten gerührt, bis die blaue Farbe sich zu der dunkelbrauner Farbe des ausgefällten Kupfersulfids umgewandelt hatte. Das ausgefällte Material wurde durch Filtration entfernt und ve CTfO rf en.

Das Filtrat wurde mit 1 M" Salzsäure neutralisiert und auf ein Volumen von 10 ml eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit dem zuvor verwendeten synthetischen, adsorbierenden Harz (Diaion HP-20 Harz) entsalzt.

Die Eluatfraktionen wurden miteinander vereinigt, anschließend wurde zur Trockne eingeengt, wobei etwa 188 mg eines farblosen, rohen Pulvers der Substanz SF-1771-B erhalten wurden.

Beispiel 5

350 mg des Hydrochlorides der Substanz SF-1771 wurden in 30 ml 0,1 Ή Salzsäure aufgelöst und wiederholt mit 0,5 % Dithizon enthaltendem Chloroform extrahiert, bis keine rötlich-violette Färbung mehr zurückblieb.

Nach der Entfernung der Chloroformphase wurde die zurückbleibende, wäßrige Lösung wiederholt mit Chloroform gewaschen. Die wäßrige Lösung wurde mit einem Anionenaustauscherharz (OH") (Amberlite IR-4-5, Produkt von Eöhm & Haas Co., USA) neutralisiert und im Vakuum zur Trockne eingeengt, wobei ein gelbliches Eohpulver (34-2 mg) der Substanz SF-1771-B erhalten wurde. Dieses Produkt der Substanz SF-1771-B (34-2 mg) wurde in 4 ml 90 %igem wäßrigem Methanol aufgenommen, und die so erhaltene Lösung wurde auf einer Säule von 700 ml des zuvor verwendeten Dextransulfatgels (Sephadex LH-20) unter Verwendung von 90 %igem wäßrxgem Methanol als Entwicklerlösungsmittel chromatografiert.

Das Eluat wurde in Fraktionen von 10 ml aufgefangen, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 30 bis 36) wurden zu einem

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Gesamtvolumen von 72 ml vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt, wobei ein reines Produkt der Substanz SF-1771-B als farbloses, amorphes Pulver erhalten wurde. Ausbeute = 287 mg.

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Claims

Patentansprüche

Substanz SF-1771» blau gefärbte Verbindung in Form eines amorphen Pulvers, welches basisch und löslich in Wasser ist und eine antibakterielle Aktivität zeigt, deren Hydrochlorid sich langsam nach braun bei 185 ⁰C verfärbt und sich bei 2Q8 ⁰C unter Schäumen zersetzt, deren Hydrochlorid in Wasser leicht löslich ist, in Methanol löslich ist, in Äthanol und Butanol gering löslich ist, jedoch in den anderen, organischen Lösungsmitteln unlöslich ist, deren Hydrochlorid bei den Reaktionen mit ITinhydrin-Reagens, Ehrlich-Eeagens, Ealiumpermanganatreagens, Greig-Leiback-Reagens positiv ist und bei der Reaktion mit Sakaguchi-Reagens negativ ist, deren Hydrochlorid ein Molekulargewicht von etwa 1600, bestimmt nach der Barger-Methode aufweist und bei der Elementaranalyse folgende Werte ergibt: C = 38,70 %, H = 5,4-2 %, N = 13,03 %, 0 = 29,62 %, S * 3,62 %, Cl = 6,07 % und Cu = 3,53 °/° (gemessen durch Atomabsorptionsspektroskopie), deren Hydrochlorid charakteristischeAbsorptionsspitzen bei 248 nm (E^ = 146) und bei 282-284 um'.(E^_m = 106) im UV-Absorptionsspektrum, aufgelöst in Wasser, zeigt und charakteristische Absorptionsbanden, wie sie in der Fig. 2 der Zeichnung gezeigt sind» im IR-AbsorptionsSpektrum, als Tablette in Kaliumbromid, aufweist, sowie pharmazeutisch · annehmbare Säureadditionssalze der Substanz SF-1771·
2. Substanz SF-1771-B·, eine farblose oder schwach gelb gefärbte Verfindung in Form eines amorphen Pulvers, welche basisch und löslich in Wasser ist und eine antibakterielle Aktivität sowie eine Antitumoraktivität aufweist, der-en Hydrochlorid sich langsam nach braun bei 180 ⁰C verfärbt und sich bei 212 ⁰C unter Schäumen zersetzt, deren Hydrochlorid in Wasser

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leicht löslich, ist, in Methanol löslich ist, in Äthanol und Butanol gering löslich ist, jedoch in den anderen, organischen Lösungsmitteln unlöslich ist, deren Eydrochlorid "bei den Reaktionen mit Ninhydrinreagens, Ehrlich-Reagens, Kaliumpermanganatreagens und G-reig-Leiback-Reagens positiv ist und bei der Reaktion mit Sakaguchi-Reagens negativ ist, deren Hydrochlorid ein Molekulargewicht von etwa 1600, gemessen nach der Barger-Methode, besitzt und eine spezifische optische Drehung von Ca]^⁰ = -18,4° (c = 1, H₂O) aufweist, deren Hydrochlorid bei der Elementaranalyse folgende Werte zeigt: C = 41,36 %, K = 5,53 %, Ii = 14,19 %, S = 3,64 % und 0 = 28,93 %, deren Hydrochlorid eine charakteristische Absorptionsspitze bei 288-290 nm (E 1'° = 84)

'1cni ~ im UV-Absorptionsspektrum, aufgelöst in Wasser, zeigt und charakteristische Absorptionsbanden, wie sie in Fig. 5 der Zeichnung gezeigt sind, im IR-Absorptionsspektrum als Tablette in Kaliumbromid zeigt und weiterhin ein Absorptionsspektrum bei der protonenmagnetischen Resonanz, wie es in der Fig. 6 der Zeichnung dargestellt ist, aufgelöst in Deutero-Wasser aufweist, sowie pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze der Substanz SF-I77I-B.
3. Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-1771 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein die Substanz SF-1771 bildender Stamm der Gattung Streptomyces in einem Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff enthaltenden Kulturmedium unter aeroben Bedingungen für eine ausreichende Zeit zur Bildung und Ansammlung der Substanz SF-1771' ic dem Kulturmedium gezüchtet wird und dann die antibiotische Substanz aus der Kultur gewonnen wird.

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4. Verfahren nach Anspruch 3> dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Streptomyces toyocaensis SF-1771> hinterlegt als FEEM-F Hr. 3253 oder ATCC Nr. 31248, kultiviert wird.
5· Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-177I-B nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz SF-1771 einer Behandlung zur Entfernung des Kupferbestandteiles aus dem Molekül der Substanz SF-1771 unterworfen wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5? dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz SF-1771 oiit Schwef eli^asserstoff, einem Alkalimetallsulfid oder einem Kupfer chelatierenden Mittel für eine ausreichende Zeit zur Entfernung des Kupferbestandteiles aus dem Molekül der Substanz SIf-I771 behandelt wird.
7· Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz SF-1771 in Lösung in Methanol mit Schwefelwasserstoff durch Einleiten von gasförmigem Schwefelwasserstoff in die Lösung umgesetzt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die noch in dem Filtrat der Fermentationsbrühe des die Substanz SF.-1771 produzierenden Mikroorganismus vorliegende Substanz SF-1771 mit Schwefelwasserstoff durch Einleiten von gasförmigem Schwefelwasserstoff in das Filtrat der Fermentationsbrühe, welches die Substanz SF-1771 enthält, umgesetzt wird.
9. Antibakterielles Mittel, enthaltend die Substanz SF-1771 nach Anspruch 1 oder die Substanz SF-1771-^B nach Anspruch 2, oder ein Säureadditionssalz der Substanz SF-1771 oder der Substanz SF-1771-B, gegebenenfalls in Kombination mit einem Träger oder einem Verdünnungsmittel.

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10. Arzneimittel zur therapeutischen Behandlung eines lebenden Tieres oder von Menschen, welche an Tumor leiden, dadurch gekennzeichnet, daß es als aktiven Inhaltsstoff die Substanz SlF-1771-B oder ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz hiervon nach Anspruch 2 in einer ausreichenden Menge zur Reduzierung des Angriffes durch die Tumorzellen in vivo enthält, wobei die aktive, als Inhaltsstoff vorliegende Verbindung in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vorliegt.

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