Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des wasserlöslichen Anti biotikums A 10 073, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man den Actinomyceten-Stamm A 10 073 oder eine Mutation dieses Stammes in einer Nährlösung züchtet und hierauf das Antibiotikum A 10 073 aus der Nährlösung isoliert.
Das Antibiotikum Grisonomycin entsteht bei der Kultur eines neuen Actinomyceten-Stammes, der aus einer bei Bergün, Kanton Graubünden, Schweiz, ge sammelten Erdprobe isoliert worden ist und der in unseren: Laboratorien sowie in der Eidig. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, unter der BezeichnunQ A 10 073 aufbewahrt wird.
Der Act.inomyceten-Stamm A<B>10</B> 073 gehört zur Art Streptomyces griseus.. Er bildet ein gelblich-grün- lichgraues Luftmycel. Die Sporenketten sind unregel mässig verzweigt und bilden keine Spiralen. Die ein zelner Sporen sind glatt. Wird der Organismus auf peptonhaltigen Nährböden kultiviert, so kann keine schwarzbraune melanoide Verfärbung beobachtet wer den. Das Wachstum ist relativ wenig temperatur abhängig, sowohl bei 18 als auch bei 40 entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 32 .
Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum von Streptomyces griseus A 10 073 auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedüen 1-7 sowie 10 wurden nach W. Linden bein, Arch. Mikrobiol. <I>17,</I> 361 (1952) hergestellt.
1. Synthetischer Agar: Wachstum anfangs dünn, schleierartig und hellgelb, später runzelig und hell braun bis kupferrot. Luftmycel sammetig, hellgelb bis grünlichgrau.
2. Synthetische Lösung: Sediment, Flocken, mäch- weiss. Pellikula anfangs gelblich, nach 9 Tagen röt- lichbraun. Luftmycel sammetig, weissgrau. 3. Glukosie-Agar: Wachstum spärlich, dünn, schleierartig, hellgelb.
4. Glukose-Asparagin-Agar: Wachstum dünn, schleierartig, hellgelb. Luftmycel mehlig bestäubt, hellgelb.
5. Caliciusnmalat Agar: Wachstum schleierartig, hellbraun. Luftmycel sammetig, hellgelb bis grünlich grau. Substrat kastanienbraun.
6. Gellatinestich (18 ): Wachstum oberflächlich, schleierartig, brännlichgelb, Substrat rötlichbraun. Verflüssigung nach 18 Tagen 0,8-1,2 cif.
7. Stärkeplatte: Wachstum dünn, schleierartig, farblos bis hellgelb. Luftmycel wenig entwickelt, hell gelb. Substrat graublau. Hydrolyse nach 14 Tagen 1,6 cm.
8. Kartoffeln.: Wachstum schleierartig, hellbraun bis weissgrau. Luftmycel spärlich, hellgelb bis. grün- lichgrau. Substrat hellbraun.
9. Karotten: Wachstum sehr langsam, hellgelb. 10. Lackmusmilich: Pellikula hellbraun. Luftmycel sammetig, farblos :bis hellgelb, zuletzt grünl'ichgrau. Substrat rot. Langsame Koagulation und Hydrolyse.
Die wichtigsten Merkmale des Stammes A 10 073 stimmen mit denjenigen von Streptomyces griseus (Krainsky) Waksman überein, so d'ass er vorläufig dieser Art zugezählt wird.
Es ist bekannt, dass einige Vertreter der Ar Strepto@myces griseus Antibiotika produzieren" so Streptomycin (Waksman S. A., StreptoMycini, Verlag Williams and Wilkins., 1949) Rhodomycetin (Shock- man G. und Waksman S.
A., Antibiotics and Chemo- therapy, 1, 68-75 [1951]), Actidion (Leach B. B., Ford H. J. und Whi fer A. J., J. A. C. S. 69, 474 [1947]), Candicidin (Lechevaker H., Acker R. F., Corke C. T., Haenseler C. M. und Waksman S. A., Mycologia 45, 155-171 [1953]); Grisein (Reynolds D.
M. und Waksman S. A., J. Bacteriol. 55, 739-752 [1948] und Streptocin (Waksman S. A., Harris D. A., Kupferberg A. B., Singher H. O. und Styles H., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. <I>70,</I> 308-312 [1949]).
Es wird weiter unten .gezeigt, dass sich das neue Antibiotikum Grisonomycin in charakteristischer Weise von diesen bereits bekannten Antibiotika unterscheidet.
Zur Herstellung des Antibiotikums A 10 073 kön nen auch Varianten, wie sie z. B. durch Selektionie- rung oder Mutation, insbesondere unter der Einwir- kung von Ultraviolett oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen gewonnen werden, Verwendung finden.
Der Streptomyceten-Stamm A 10 073 kann z. B. in wässriger, Kohlehydrate, stickstoffhaltige Verbin- dungen sowie anorganische Salze enthaltender Nähr- lösung aerob,
also beispielsweise in ruhender Ober- flächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schüt teln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüt- telflaschen oder den bekannten Fermentern gezüch tet werden. Als. Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 40 .
Eine wesentliche antibiotische Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 11/2 Tagen.
Als Kohlenstoffquelle kommen zum Beispiel Kohlehydrate, wie Glykose, Saccharose, Lak- tose, Mannit, Stärke sowie Glycerin, in Frage.
Als stickstoffhaltige Nährstoffe und gegebenenfalls wachs tumsfördernde Stoffe seien genannt: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, was serlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen der Alko- holherstellung, von Hefe, Bohnen,
insbesondere der Soyapflanze, von Samen, beispielsweise der Baum- wollpflanze usw., aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. Von anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sul fate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten.
Zur Isolierung des Antibiotikums A 10 073 die nen z. B. folgende Verfahren: Man trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge des Antibiotikums im Kulturfiltrat gefunden wird.
Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen des Anti biotikums am Mycel adsorbiert Es ist daher vorteil haft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich Wasser und wässrige organische Lösungsmittel, z. B. wässriges Methanol.
Das Antibiotikum Grisonomycin ist eine wasser lösliche Substanz, die in organischen Lösungsmitteln, insbesondere in Lipoidlösungsmitteln, unlöslich ist.
Es lässt sich bei neutralen pH weder aus Kulturfil- traten noch aus angereicherten Lösungen mit den für die Isolierung basischer hydrophiler Antibiotika üb lichen Fällungsmitteln, wie z. B. Pikrinsäure, Am- moniumreineckat, Helianthin, Pikrolonsäure, ausfül len.
Gemäss seinem Verhalten bei der elektrometri- schen Titration, bei der Elektrophorese auf dem Pa pier und bei der Ad@orption an Ionenaustauschern, handelt es sich möglicherweise um einen amphoteren Stoff mit überwiegend basischen Eigenschaften.
Gemäss diesen Eigenschaften sind zur Gewinnung des Antibiotikums A<B>10073</B> aus dem Kulturfiltrat und zu seiner Reinigung verschiedene Methoden ge eignet, die einzeln oder in Kombination miteinander angewandt werden können. So können verschiedene Adsorptionsmittel verwendet werden, z. B.
Aktiv kohlen, wie Norit (Markenprodukt), aktivierte Erden, wie Aluminiumoxyd, Fullererde oder Floridin, Harzadsorber, wie Asmit (Markenprodukt).
Die Affinität des Antibiotikums Grisonomycin ist ins besondere zu Norit über einen weiten; pH Bereich und zu Asmit in neutralem und alkalischem pH- Bereich sehr gross. Weiter kann das Antibiotikum Gri- sonomycin aus dem Kulturfiltrat oder wässrigen Lö- sungen auch durch stark saure Ionenaustauscher, z. B.
Dowex 50 (Markenprodukt), adsorbiert werden. Die Elution der Adsorbate erfolgt zweckmässig mit Gemischen von Wasser und organischen Lösungs mitteln, z. B. binären Gemischen von Wasser mit einem mit Wasser mischbaren organischen. Lösungs- mittel, wie z.
B. Wasser-Methanol, Wasser-Aceton, Wasser-Alkohol, Wasser-Propanol, Wasser-Pyridin oder aber Mehrkomponenten-Systemen, wie von Was ser mit einem mit Wasser nicht mischbaren organi schen Lösungsmittel und einem oder mehreren mit Wasser mischbaren, als Mischungsvermittler dienen den" organischen Lösungsmitteln, wie z.
B. Butanol Methanol-Wasser, Butanol-Pyrid'in-Methanol-Wasser, Phenol-Methanol-Wasser. Diese zur Elution dienen den Lösungsmittelgemische können mit oder ohne Zusatz von anorganischen oder organischen Säuren, z. B. Salzsäure, Schwefelsäure, Ameisensäure, Essig säure, oder mit oder ohne Zusatz von basischen Mit teln, z. B. Ammoniak, niederen! aliphatischen Aminen, angewendet werden.
Bei der Verwendung von Norit als Adsorptionsmittel haben sich Gemische von Bu- tanol-Methanol-Wasser im Volumenverhältnis von 2 : 1 : 2, von Butanol-Methanol-PyridinWasser im Volumenverhältnis von. 2 : 1 : 1 : 2 oder von Alkohol Wasser im Volumenverhältnis von 3 : 2 zur Elution des Antibiotikums. als besonders geeignet erwiesen.
Ad'sorbate an Asmit-Phenolharz werden vorzugsweise mit einem Gemisch von Methanol-Wasser-ln Salz säure im Volumenverhältnis von 75:15: 10 und solche an den erwähnten Ionenaustauschern zweck mässigerweise mit basischen Mitteln, z. B. mit wäss- rigen: Lösungen von Ammoniak, eluiert.
Aus den antibiotisch wirksamen Eluaten kann das Antibiotikum durch Entfernung der Lösungsmittel im Vakuum in Form eines Trockenpulvers erhalten werden oder aber inForm einer stark konzentrierten Lösung, aus der das Antibiotikum durch Zusatz der 4-6fachen Volumenmenge von Aceton oder von einem Gemisch von Methanol und Aceton, in Form eines braungelben Pulvers ausgefällt werden kann. Enthält das Elutionsmittel mit Wasser nicht misch bare Lösungsmittel, z.
B. im Falle einer Noritabsorp- tion das erwähnte Gemisch Butanol-Methanol-Wasser (2: 1 : 2), dann kann dieses auch zweckmässigcrweise mit einem weiteren, mit Wasser nicht mischbaren Lö sungsmittel, wie z. B. Äther, Chloroform, Essigester, n-Butylacetat, in solcher Menge versetzt werden, dass sich zwei Phasen bilden.
Das Antibiotikum befindet sich dann fast ausschliesslich in der wässrigen Phase, aus welcher es wiederum entweder durch direktes schonendes Eindampfen zur Trockne oder durch Ein engen zu einer konzentrierten Lösung mit anschlie ssender Fällung in Form eines Pulvers erhalten wird. Enthält das Elutionsmittel Säuren oder Basen, z. B.
im Falle der Asmitabsorption, das erwähnte Gemisch Methanol-Wasser-ln Salzsäure (75: 15: 10), dann ist es vorteilhaft, die im Eluat vorhandene Säure resp. Base vor dem Einengen durch Zugabe von Lauge resp. Säure zu neutralisieren oder aber aus dem Elu- tionsmittel durch Filtration durch einen schwachen Anionenaustauscher, wie Amberlite IR4B (Mar kenprodukt),
bzw. einen schwachen Kationenaustau- scher, wie Amberlite IRC50 (Markenprodukt), zu entfernen, an welchen das Antibiotikum Grisonomy- cin nicht adsorbiert wird.
Das Antibiotikum Grisonomycin ist im weiteren löslich in Phenol und Mischungen von Phenol mit organischen Lösungsmitteln, z. B. Phenol-Chloro- form-Gemischen. Es lässt sich aus wässrigen Lösun gen mit solchen Gemischen extrahieren.
Verteilt man das Antibiotikum zwischen wässrigen Salzsäurelösun.- gen und phenolhaltigen Ch;loroformlösungen, dann kann der Verteilungskoeffizient durch Variieren der Phenolkonzentration in der wässrigen Phase über einen weiten Bereich nach Wunsch eingestellt werden.
Ver steht man unter dem Verteilungskoeffizienten des An tibiotikums das Verhältnis der Konzentration in der organischen Phase zur Konzentration in der wässrigen Phase, dann ergibt es sich, dass der Verteilungskoeffi zient mit steigendem Phenolgehalt zu- und mit stei gendem Salzsäuregehalt abnimmt. Durch eine Kom bination von wenigen Verteilungsoperationen in sol chen Systemen kann eine wesentliche Anreicherung erzielt werden. Aus Phenol-Chloroform-Gemischen kann das Antibiotikum durch Zugabe lypophiler or ganischer Lösungsmittel, wie z. B.
Aceton, Äther oder Petroläther, in Form eines Pulvers ausgefällt werden. Eine weitere Möglichkeit der Isolierung besteht darin, dass man das Antibiotikum aus dem Phenol- Chloroform-Gemisch durch Zugabe solcher Lösungs mittel auf ein Filterhilfsmittel, wie z.
B. Hyflo Super- cel, ausfällt und- den leicht filtrierbaren Rückstand mit den gleichen Lösungsmitteln gut auswäscht. Der auf dem Filterhilfsmittel niedergeschlagene antibio tische Rückstand kann mit einem kleinen Volumen Wasser herausgelöst werden und die derart erhaltene konzentrierte Lösung des. Antibiotikums durch Ge friertrocknung in ein Pulver übergeführt werden.
Schliesslich ist es auch möglich, das Antibiotikum aus der Phenol-Chl;oroform-Lösung nach Zugabe von Äther-Petroläther-Gemischen direkt mit wenig Was ser zurückzuextrahieren. Die Menge des Petroläther- Äther-Gemisches richtet sich dabei nach der Phenol menge.
Die beschriebenen Adsorptions-, Elutions- und Extraktionsverfahren können einzeln oder in Kom- binatio@n miteinander angewandt werden. Besonders geeignet ist ein kombiniertes Verfahren, gemäss wel chem das Antibiotikum zuerst an: Asmit adsorbiert und sodann eluiert wird, worauf eine Adsorption an Norit mit anschliessender Elution folgt.
Das dabei erhaltene Antibiotikumkonzentrat wird hierauf durch einige Verteilungen zwischen Phenol-Chloroform- Lösungen und Salzsäurelösung weiter angereichert.
Die Adsorptions-Elutionsprozesse können im Batch -Verfahren oder an der Säule erfolgen.. Vor gängig der Elution der Adsorbate können die mit dem Antibiotikum belegten Adsorptionsmittel zwecks Ent fernung antibiotisch inaktiver Begleitstoffe mit geeig neten Lösungsmitteln gewaschen werden.
Im Falle des Noritadsorbates haben sich Wasser, 30 % iges Metha- nol und trockenes Aceton als Waschmittel geeignet erwiesen.
Eine Anreicherung des Antibiotikums. Grisono- mycin aus den nach den vorstehend geschilderten Ver fahren gewonnenen Konzentraten kann erfolgen, wenn Lösungen solcher Konzentrate mit Fällungs- mitteln, wie z. B. Pikrinsäure oder Helianthin, ver setzt werden, wobei Begleitstoffe des Antibiotikums, welche zum Teil in vitro ebenfalls antibiotische Wir kung aufweisen,.
ausgefällt werden, während das Anti biotikum selbst in Lösung bleibt. Nach der Abtren nung dieser Fällungen durch Filtration wird das. über schüssige Fällungsmittel aus dem Filtrat durch Pas sage über einen geeigneten Ionenaustauscher wie derum entfernt, im Falle von Helianthin oder Pikrin- säure z.
B. durch Passage über Amberlite IRA400 in der Chlorid'ionenform, worauf das angereicherte Antibiotikum nach den beschriebenen Verfahren aus den Lösungen isoliert werden kann.
Um das Antibiotikum weiter anzureichern, wird es vorzugsweise einer Säuilenadsorptionschromato- graphie unterworfen. Als Ad'sorbentien eignen sich die bereits für das Isolierungsverfahren erwähnten Adsorptonsmittel. Im weiteren lässt sich das Anti biotikum auch an Cellulose chromatographieren. Für die Entwicklung der Chromatogrammc werden die selben Lösungsmittelgemische verwendet,
die für die Elution der Adsorbate in den vorstehend geschüder- bei; Isolierungsverfahren angegeben sind, und zwar in konstanter oder variierender Zusammensetzung.
Ein gutes Anreicherungsverfahren stellt die Säulenchro- matographie an Norit dar, wobei die Aktivkohle vorzugsweise zwecks Erhöhung der Laufgeschwin digkeit des Eluiionsmittelts mit einem Filtrierhilfs- mittel, z.
B. Hyflo-Supercel oder Celite (Mar- kenprodukt), im Gewichtsverhältnis 1 : 1 bis 1 : 2 verdünnt wird. Weiter ist die Chromabogxaphie an Cellulosesäulen besonders gut zur Anreicherung des Antibiotikums geeignet. Als Elutionsmittel dient in diesem Falle eine Mischung von Butanol-Methanol- Wasser im Volumenverhältnis von 4 : 1 : 2.
Das Antibiotikum Grisonomycin wird so in Form eines antibiotisch hochwirksamen blassgelben Pul vers erhalten, das durch seine Löslichkeitseigenschaf ten durch Papierchromatographie, Elektrophorese so wie durch sein Verhalten gegen Farb- und Fällungs- reagenzien charakterisiert wird. Das Antibiotikum Grisonomycin ist sehr gut löslich in Wasser.
Es löst sich im weiteren: in Mischungen von Wasser und nie deren Alkoholen, in Phenol sowie in Mischungen von Phenol mit organischen Lösungsmitteln. Es ist un löslich in den gebräuchlichen organischen Lösungs mitteln, insbesondere Lipoidlösungsmitteln. Das pa- pierchromatographische Verhalten des Antibioti kums Grisonomycin auf Whatman-Nr. 1-Papier er gibt sich im Vergleich mit Streptomycinsulfat (1), Ristocetin A (2)
und Ristocetin B (3) aus folgender Tabelle:
EMI0004.0022
<U>Rf-Wert</U>
<tb> Lösungsmittelgerrisch
<tb> <U>Grisonomycin <SEP> 1 <SEP> I</U> <SEP> 2 <SEP> I <SEP> 3
<tb> A <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> B <SEP> 0 <SEP> 0,12 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> C <SEP> 0,15 <SEP> 0,25 <SEP> 0,22 <SEP> 0,19
<tb> D <SEP> 0,52 <SEP> 0,61 <SEP> 0,53 <SEP> 0,24
<tb> E <SEP> 5,15 <SEP> 1 <SEP> 5,15 <SEP> 11,4
<tb> F <SEP> 0,65 <SEP> 0,07 <SEP> 0,69 <SEP> 0,69
<tb> G <SEP> 0,92 <SEP> 0,13 <SEP> 0,41 <SEP> 0,25
<tb> H <SEP> 0,90 <SEP> 0,29 <SEP> 0,38 <SEP> 0,17
<tb> <B>1</B> <SEP> 0,11 <SEP> 0,15 <SEP> 0,05 <SEP> j <SEP> 0,
25 A = Butanol mit Wasser gesättigt B = Butanol mit Wasser gesättigt ;
2 % p-Toluol- sulfosäure C = 80%iges wässriges Äthanol, 1,5 % Natrium- chlorid enthaltend auf Whatman-Nr. 4-Papier imprägniert mit 0,95m Natriumsulfat und 0,05m Natriumhydmogensulfat (NaHS04 - H20)
D = 80%iges wässriges Mefthanol, 1,5% Natrium- chlorid enthaltend E = Butanol-Methanol-Wasser 3<B>14:</B> 1 : 2 F = Butanol=Äthanol-Wasser 1 : 1 :
2 G = Wasser, gesättigt mit Methyliso#butylketon H = 75 0/a Wasser + 25 % einer Mischung von 3 Teilen Methanol und 1 Teil Aceton, mit Am moniak auf pH 10,5 gebracht und mit Phos phorsäure auf pH 7,5 zurückgestellt I = sekundäres Butanol, gesättigt mit Wasser + 0,
2 0/0- Trichloressigsäure (Im Falle des Lösungsmittelsystems E handelt es sich um ein Durchlaufchromatogramm. Die angegebe nen Zahlen bedeuten in diesem Falle das.
Verhältnis der Laufstrecke des Antibiotikums zur Laufstrecke von Streptomycinsulfat.) Das Antibiotikum Grisonomycin verhält sich pa- pierchromatographisch ähnlich wie Grisein. Grisein wandert jedoch in den meisten Systemen schneller als Grisonomycin, z. B. im System Butanol-Eisessig-Was- ser (4: 1 : 5) um den Faktor 1,4: im System C um den Faktor 1,3.
Bei der Elektrophorese auf Whatman-Nr. 1-Papier wandert das Antibiotikum Grisonomycin an die Ka- thode, und zwar in einem 0,03-molaren Kalium-Na- trium-Phosphatpuffer von pH 5,5 bei einer Spannung von 110 Volt während 5 Stunden um 4,2 cm. Unter gleichen Bedingungen zeigen Streptomycinsulfat bzw. Ristocetin A bzw. Ristocetin B Wanderungsstrecken von 8,3 bzw. 5,0 bzw. 3,9 cm.
In einem 0,2-molaren Boratpuffer von pH 8,13 wandert das Antibiotikum Grisonomycin unter sonst gleichen Bedingungen um 2,9 cm gegen die Kathode. Streptomycin bzw. die Risto@cetine A und B wandern in diesem Falle um 6,7 bzw. 3,4 cm in der gleichen Richtung.
Das Antibiotikum Grisonomycin gibt aus einer 10%igen wässrigen; neutralen Lösung bei der trop- fenweisen Zugabe einer gesättigten wässrigen Lösung von Pikrinsäure, Ammoniumreineckat, Helianthin oder einer gesättigten Lösung von Pikrolonsäure in 900/eigem Alkohol keine Fällung,
im Falle von He- lianthin höchstens eine schwache Trübung. Negativ sind weiter der Sackagu.chi-, Maltol-, Elson-Morgan-, Biuret- und der Benedict-Test.
Das Antibiotikum Grisonomycin unterscheidet sich von den ebenfalls von Vertretern der Art Strep- tomyces griseus produzierten Antibiotika Streptomy- cin, Rhodomycetin, Äsidion, Streptocin, Grisein und Candicidin durch seine Löslichkeitseigenschaften, seine Eigenfarbe, die Farbreaktionen und sein papierchro- matographisches Verhalten.
Das Antibiotikum Grisonomycin besitzt eine hohe Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Mikroorganis men. Verwendet man als Testmethode in vitro Ver dünnungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, so ergeben sich bei 2 Stunden Bebrütung bei 37 mit den verschiedenen Testorganismen folgende noch hemmende Konzentrationen.
EMI0005.0001
Hemmende
<tb> Testorganismen <SEP> Konzentration
<tb> ,ag/cms
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var.
<SEP> aureus <SEP> 1
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 1
<tb> Streptococcus <SEP> viridians <SEP> 1
<tb> Corynebacterium <SEP> diphteriae <SEP> 1
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 1
<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> Streptomycin-resistent <SEP> 1
<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> Chloromycetin-resistent <SEP> 1
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 1
<tb> Pseuäomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 1
<tb> Klebsiella <SEP> Typ <SEP> A <SEP> 1
<tb> Pasteurella <SEP> pestis <SEP> 1
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 1
<tb> Endomyces <SEP> albicans <SEP> 1 Wird für die Testierung irr vitro die Plattentest- methode mit Papierrondellen von 6 mm Durchmesser verwendet,
so erhält man mit einer 1 0/eigen Lösung des Antibiotikums Grisonomycin folgende Hemm zonen:
EMI0005.0010
Testorganismen <SEP> Hemmzone
<tb> in <SEP> mm
<tb> Mierococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var <SEP> aureus <SEP> 21
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus
<tb> Penicillin-resistent <SEP> 20
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 18
<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> Streptomycin-resistent <SEP> 18
<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> Chl'oromycetin <SEP> resistent <SEP> 18
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 12
<tb> Klebsiella <SEP> Typ <SEP> A <SEP> 17
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 19 In vivo ist das Antibiotikum Grisonomycin eben falls wirksam.
Bei zweimaliger subkutaner Applika tion von 20 mg/kg an mit Klebsiena Typ A infizierte Mäuse werden 1009/o überlebende beobachtet. Diese Dosen werden von nicht infizierten Mäusen; ohne Schädigung ertragen.
Das Antibiotikum Grisonomycin oder seine Deri vate können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeu- tischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthal ten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Appli kation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindun gen nicht reagieren, wie z. B.
Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche öle, Benzylalkohole, Gummi, Palyalkylenglykole, Vase line, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittel- träger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B.
als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, Cremen, Sup positorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Sus pensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfs- stoffe, wie Koniservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
<I>Beispiel 1</I> Die Züchtung des Streptomyces A 10 073 wird nach dem Submersverfahren durchgeführt. Man ver wendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 20 g Distillers Solubles, 20g Malzextrakt, 1 g Na triumnitrat und 5 g Natriumchlorid enthält. Die Nähr lösung wird in den Impfkolben oder in den Fermen- tern während 20-30 Minuten bei 1 atü sterilisiert.
Die sterilisierte Nährlösung zeigt ein pH von 7,5 bis 8,0. Die Animpfung erfolgt mit Abis zu 10% einer teilweise sporulierenden vegetativen Kultur des Or ganismus..
Man in-kubiert unter gutem Schütteln oder Rühren bei 27 , wobei Kulturen in Fermentern mit etwa 1 Vol. steriler Luft pro Vol. Lösung in der Mi nute belüftet werden:.
Nach 48-120 Stunden Bebrü- tung hat die Kulturlösung den grössten Hemmwert ge genüber den Testorganismen (B. subtilis, Micro- coccus pyogenes, vor.
aureus, Escherichia coli, Kleb- siena) erreicht. Man trennt das Mycel sowie andere feste Bestandteile von der die Hauptmenge des Anti biotikums enthaltenden Lösung mittels Filtration oder Zentrifuaation ab,
wobei ge@gebenenfalls der Kultur- lösung vor der Filtration etwa 1 % eines Filterhilfs- mittels, z. B. Hyflo Supercel, zugesetzt wird.
Die Fil- terrückstände wäscht man mit Wasser und mit wäss- rigem Methanol und vereinigt die Waschflüssigkeiten mit dem antibiotisch wirksamen: Kulturfiltrat.
Verwendet man anstelle der oben angegebenen Nährlösung solche, die pro Liter Leitungswasser die folgenden Nährstoffe enthalten, so erhält man nach analoger Züchtung und Aufarbeitung Kulturfiltrate von ähnlich hoher antibiotischer Wirksamkeit.
EMI0006.0055
a) <SEP> Laktose <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Distillers <SEP> solubles <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Natriumnitrat <SEP> 1 <SEP> g
<tb> b) <SEP> Glukose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Distillers <SEP> solubles <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Natriumnitrat <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 10 <SEP> g
<tb> c) <SEP> Mannit <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Distillers <SEP> solubles <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 3 <SEP> g
<tb> Natriumnitrat <SEP> 1 <SEP> g
<tb> d) <SEP> Glycerin <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Sojamehl <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Natriumnitrat <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 10 <SEP> g
<tb> e)
<SEP> Glukose <SEP> <B>20</B> <SEP> g
<tb> Sojamehl <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Natriumnitrat <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 10 <SEP> <B>g</B> <I>Beispiel 2</I> 7 1 eines nach Beispiel 1 erhaltenen. Kulturfiltra tes werden mit einer Durchlaufgeschwindngkeit von 4 1 pro Stunde durch eine 40 cm hohe Schicht von 700 ml Asmit durchfiltriert. Das Antibiotikum wird dabei vollständig adsorbiert. Nachfolgend wird die Säule bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 7 bis 8 1 pro Stunde mit 2 1 Wasser gewaschen und hierauf
mit einem Gemisch von Methanol-Wasser-In Salz säure im Volumenverhältnis von<B>75: 15:</B> 10 cluiert. Das Elutionsmittel wird in Fraktionen von 1 1 auf- gefangen. Die Fraktionen 2-4, die bis zu 80 % der im Kulturfiltrat vorhandenen antibiotischen Aktivität enthalten, werden vereinigt (etwa 3 1).
Die im Eluat vorhandene Salzsäure wird mit verdünnter Natron lauge neutralisiert, wobei zuvor die dazu erforderliche Menge Natronlauge durch Titration eines mit Wasser auf das doppelte Volumen verdünnten aliquoten Tei les festgestellt wird:. Die neutrale Lösung wird am Rotationsverdampfer bei 35 C auf 200 ml eingeengt und hierauf durch ein Papierfilter filtriert und mit wenig Wasser nachgewaschen. Durch Gefriertrock nung erhält man aus dem Filtrat das rohe Antibioti kum in Form eines braunen Pulvers. Die Ausbeute beträgt etwa 7 g pro Liter Kulturfiltrat.
<I>Beispiel 3</I> 100 1 des nach Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltra tes werden mit 2 kg Norit während 1 Stunde verrührt, wobei die gesamte antibiotische Aktivität an der Ak tivkohle ads-orbiert wird. Die letztere wird, vorteil haft unter Zugabe eines Filtri-erhil:fsmittels, wie z. B. Hyflo Supercel, abgetrennt und hierauf dreimal mit je 20 1 destilliertem Wasser gewaschen, wobei jedes mal während 30 Minuten mechanisch gerührt und anschliessend filtriert wird. Die Waschlösung ist antibiotisch inaktiv.
Die Kohle wird nachfolgend mit 20 1 einer wässrigen 30%igen Lösung von Alkohol während 30 Minuten. verrührt und durch Filtration wiederum abgetrennt.
Diese Operation wird mixt 20 1 und schliesslich noch mit 10 1 30%igem Alkohol wie- derholt. Die vereinigten wässri- alkoholischen Fil trate enthalten 0,5-0,6 g Trockensubstanz pro Liter mit lediglich geringer antibiotischer Wirksamkeit.
Die Aktivkohle wird nun gleicherweise mit 3 Portio- nen (2 X 20 1, 1 X 101) von 60%igem Alkohol eru- iert. Diese Eluate enthalten eine grosse antibiotische Wirksamkeit. Sie werden vereinigt und im Dünn schichtenverdampfer bei höchstens 30 auf ein kleines Volumen eingeengt.
Die solcherweise erhaltene kon zentrierte wässrige Lösung giesst man in das fünf fache Volumen von Aceton, wobei das Antibiotikum Grisonomycin vorwiegend als Massgelbes Pulver aus gefällt wird. Nach mehrstündigem Stehen bei 0 wird die überstehende Lösung durch Dekantieren vom Rückstand abgetrennt und letzterer mit trockenem Methanol gewaschen. Der verbleibende Rückstand wird im Vakuum gut getrocknet.
Man erhält derart 7-8 g des rohen Antibiotikums Grisonomycin in Form eines Massgelben Pulvers (Fraktion 1) Die ver einigten Aceton- und Methanollösungen enthalten weitere 12-13 g Substanz, welche durch Entfernen der Lösungsmittel im Vakuum isoliert wird. Sie be sitzt eine kleinere spezifische antibiotische Wirksam keit (Fraktion 2).
<I>Beispiel 4</I> 1<B>1</B> eines nach Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates wird mit 15g Norit während 1 Stunde verrührt. Die Aktivkohle wird durch Filtration, vorteilhaft unter Zugabe von Filterhilfsmitteln, wie z. B. Hyflo Super- cel, von der antibiotisch inaktiven Lösung abgetrennt.
Durch halbstündiges Schütteln mit 200 ml Wasser wird die Aktivkohle gewaschen und dann abfiltriert. Gleicherweise wird mit 200 ml 30 /oigem Methanol gewaschen und die Kohle anschliessend auf einer Glas- filternutsche scharf abgesaugt. Die Waschflüssigkeiten sind antibiotisch inaktiv.
Das solcherweise gewaschene Kohleadsorbat wird durch einstündiges Schütteln mit 200 ml einer Mischung von Butanol-Methanol-Was- ser im Volumenverhältnis von 2: 1 : 2 eluiert. Die von der Kohle durch Filtration befreite, dunkel ge- färbte Lösung enthält etwa 70 % der im Kulturfiltrat vorhandenen antibiotischen Aktivität.
Man schüttelt die Lösung mit 100 m1 n-Butylacetat. Die sich dabei ausscheidenden 2 Phasen werden getrennt. Die wäss- rige, dunkel gefärbte Phase von 140 mlenthält prak tisch die gesamte im Eluat vorhandene antibiotische Aktivität und wird anschliessend der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhält das rohe Antibiotikum Gri- sonomycin als dunkelgelbes Pulver. Ausbeute: 0,93 g.
<I>Beispiel 5</I> 15 g eines nach Beispiel 4 erhaltenen, mit Wasser und 30 /oigem Methanol gewaschenen Kohleadsor- bates werden mit 200 m1 einer Mischung von Bu tanol-Methanol-Pyridin-Wasser im Volumenverhältnis von 2: 1 : 1 : 2 während 1 Stunde geschüttelt.
Das durch Filtration über einer Glasfilternutsche von der Kohle befreite dunkel gefärbte Eluat enthält bis zu 80 % der im Kulturfiltrat vorhandenen antibiotischen Aktivität. Die Lösung wird mit 100 ml n-Butylace- tat geschüttelt.
Die dabei ausgeschiedene, die anti biotische Aktivität enthaltende wüssrige Phase von etwa 110 ml wird am Rotationsverdampfer bei 35 auf ein kleines Volumen eingeengt. Aus dieser kon zentrierten Lösung erhält man das rohe Antibioti kum Grisonomycin durch Gefriertrocknung in Form von 1,01g eines braungelben Pulvers.
<I>Beispiel 6</I> 5 g eines nach Beispiel 3 erhaltenen Antibioti- kumkonzentrates (Fraktion 2) werden an einer 5,5 cm hohen Säule einer Mischung von 10 g Norit und 20g Hyflo Supercel chromatographiert, wobei die Substanz in Form einer l0o/oigen wässrigen Lösung auf die Säule aufgetragen wird.
Es werden Fraktio nen zu ?. Liter aufgefangen:. Die Fraktionen 1-6, die mit Wasser eluiert werden, werden eingedampft und enthalten 4,3 g antibiotisch inaktives Material. Aus den Fraktionen 7-10, die mit 10 % igem Alkohol eluiert werden, erhält man 155 mg Trockensubstanz, die ebenfalls antibiotisch unwirksam ist.
Die Frak tionen 11-14, eluiert mit 301/oigem Alkohol., und die Fraktion 15, eluiert mit 2 1 60 19/o igem Alkohol, enthalten zusammen 140 mg des angereicherten Anti biotikums Grisonomycin, das aus den Lösungen durch Einengen am Rotationsverdampfer bei 35 und durch anschliessende Gefriertrocknung in Form eines beigen Pulvers erhalten wird.
Beispiel <I>7</I> 10 g eines nach Beispiel 3 erhaltenen Antibioti- kumkonzentrates (Fraktion 2) werden in 100 ml Was ser gelöst und mit 5 g kristallinem Helianthin (Orange<B>111,</B> Natriumsaliz der 4'-Dimethylamino-azo- benzol4-sulfonsäure) versetzt.
Die Aufschlemmung wird während 1 Stunde am Vibromischer stark ge- rührt und hierauf über 10g Hyflo Supercel filtriert. Das Filtrat wird vom überschüssigen Helianthin mit tels einer Passage durch 50 ml Amberlite IRA400 in der Chlorid'ionenform befreit.
Man wäscht den Ioncn- austauscher mit 200 ml Wasser und engt das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Filtrat am Vakuum bei 35 auf ein kleines Volumen ein. Aus der konzentrier ten Lösung erhält man das gegenüber dem Ausgangs material angereicherte Antibiotikum durch Gefrier trocknung in Form; eines Pulvers (6 g). Das im ab filtrierten Rückstand befindliche Helianthatgelnisch enthält in kleiner Menge einen antibiotisch wirksamen Stoff, dessen biologisches Wirkungsspektrum sich von jenem des Antibiotikums Gris.onomycin unter scheidet.
<I>Beispiel 8</I> 8,1 g eines nach Beispiel 3 erhaltenen Antibioti- kumpräparates (Fraktion 1) werden an 647 g asche- freiem Cellulosepulver Whatman Standard Grade chromatographiert. Zu diesem Zweck wird das Cel- lulosepullver portionenweise in eine Glassäule ein gefüllt und mit einem .genau in die Säule hineinpas senden Stöpsel aus rostfreiem Stahl möglichst stark eingepresst,
so dass jeweils etwa 5 cm hohe Schichten entstehen. Es resultiert dabei eine homogene Cellu- losesäule von 70 cm Höhe und 5,5 cm Durchmesser. Diese wird während 2 X 24 Stunden bei einer Durch- laufgeschwind-igkeit von 70 ml pro Stunde mit einem Gemisch von Butanol-MethanolWasser im Volumen- verhältnis 4:
1 :2 gewaschen. Die zu chromato- graphierende Substanz wird in 100 ml Wasser gelöst und mit 50 ml Methanol sowie 50 ml Butanol ver setzt.
Bevor diese Lösung auf die Säule aufgebracht werden kann, wird die Säule akklimatisiert , das heisst, es werden auf die Säule kleine Portionen des Gemisches Butanol-Methanol-Wasser mit abnehmen dem Butanolgehalt derart aufgetragen, dass man eine neue Portion unter Vermeidung von Turbulenz ge rade dann aufträgt, wenn die vorangehende Portion ganz in die Cellulose eingesickert ist.
Es werden da bei 20 ml Butanol-Methanol:-Was:s,er-Gemisch 3:1:2, 20 ml Gemisch 2:1:2 und 20 ml Gemisch 1 : 1 : 2 aufgetragen. Anschliessend lässt man die 200 ml der Lösung in die Säule einsickern und beginnt dann, kleine Portionen des Gemisches Butanol-Methanol-Wasser mit ansteigen dem Butanolgehalt aufzubringen. Man verwendet dazu 10 -ml des, Gemisches, 11/" : 1 : 2, 20 ml; des Gemisches 2 : 1 : 2 und 20 ml des Gemisches 3 : 1 : 2.
Hierauf wird die Säule mit dem Gemisch 4 : 1 : 2 ent wickelt. Es werden Fraktionen zu 135-140 ml. auf gefangen. Jede antibiotisch aktive Fraktion versetzt man mit 50 ml Äther und schüttelt sie dreimal mit 20 ml Wasser aus. Die vereinigten wässrgen Phasen werden mit 50 ml Äther durch Ausschütteln ge waschen und anschliessend durch Gefriertrocknung in Form eines Beigen Pulvers erhalten. Die Fraktionen 7-26 enthalten antibiotisch wirksames Material, wo bei das Aktivitätsmaximum in den Fraktionen 11-20 vorhanden ist.
Diese werden vereinigt und man er hält 1,45 g des angereicherten Antibiotikums Griso- nomycin.
<I>Beispiel 9</I> 780 mg eines nach Beispiel 8 erhaltenen angerei cherten Antibiotikumkonzentrates werden an 154 g aschefreiem Cellulosepulver Whatman Standard Grade chromatographiert. Gemäss der in Beispiel 8 angegebenen Vorschrift erhält man in einem Chro- matogrammrohr von 3 cm innerem Durchmesser eine Cellulosesäule von 62 cm Höhe.
Diese wird während 4 X 24 Stunden bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 20 ml pro Stunde mit einem Gemisch von. Bu- tanol-Methanoli-Wasser im Volumenverhältnis von 4 : 1 : 2 gewaschen. Die Substanz wird in 5 ml Wasser gelöst und mit 2,5 ml Methanol und 4 ml Butanol versetzt. Die Säule wird vor dem Auftragen der Lö sung wie in Beispiel 8 angegeben akklimatisiert , und zwar mit 2 ml Gemisch 3 : 1 : 2, mit 2 ml Ge misch 2: 1 : 2 und schliesslich mit 2 ml Gemisch <B>1,6:</B> 1 : 2.
Hierauf wird die Lösung aufgetragen und die Cellulosesäule mit 2 ml-Portionen der Butanol- Methanol-Wasser-Gemische 2:1:2, 21/2:1:2, 3 : 1 : 2 und 3 1/2 : 1 : 2 beschickt. Nachfolgend wird die Säule mit dem Gemisch 4 : 1 : 2 bei einer konstan ten Temperatur von 25 entwickelt. Es werden Frak tionen zu je 40 ml aufgefangen. Die antibiotisch ak tiven Fraktionen 14-33 werden einzeln mit 50 ml Äther-Chloroform (4: 1) geschüttelt. Die dabei ab geschiedene wässrige Phase, welche die antibiotische Aktivität enthält, wird abgetrennt und die organische Phase zweimal mit 5 ml Wasser nachgeschüttelt.
Die vereinigten wässrigen Phasen (etwa 20 ml) werden mit 20 ml Äther-Chloroform (4: 1) gewaschen und durch Gefriertrocknung in Massgelbe Pulver über geführt. Die Fraktionen 19-21 sind antibiotisch am stärksten wirksam. Sie werden vereinigt und man er hält insgesamt 75 mg des reinen Antibiotikums Gri- sonomycin, das, verglichen mit dem im Kulturfiltrat vorhandenen Material, eine etwa 300fache antibio tische Wirksamkeit besitzt. Das reine Antibiotikum Grisonomycin löst sich sehr leicht in Wasser.
Es ist schwer bis unlöslich in organischen Lösungsmitteln, insbesondere Lipoidlösungsmitteln. Es verhält sich papierchromatographisch einheitlich in den Lösungs- mittelgemischen A-I (vergleiche Tabelle in der Be schreibung) und unterscheidet sich in diesen Systemen auch von anderen bekannten wasserlöslichen Anti biotika, wie z.
B. Streptomycin, Neomycin, Risto- cetin A und B und Viomycin. Das Antibiotikum Gri- sonomycin lässt sich aus neutralen konzentrierten wässrigen Lösungen mit Pikrinsäure, Helianthin, Am- moniumreineckat und Pikrolonsäure nicht ausfällen. Es wird aus solchen Lösungen von schwach sauren oder schwach basischen Ionenaustauschern nicht ad sorbiert.
Es gibt keine Farbreaktion nach Sackaguchi, Ehrlich, Bened'ict und Elson-Morgan. Die Biuret- reaktion ist negativ.
<I>Beispiel 10</I> 10 g eines nach Beispiel 4 erhaltenen Antibioti- kumpräparates werden in 100 ml Wasser gelöst und mit 5n Salzsäure auf einen pH-Wert von annähernd 1 eingestellt. Diese Lösung wird zweimal mit<B>100</B> ml einer Mischung von: 100 g Phenol in 100 ml Chloro form ausgeschüttelt. Der organische Extrakt enthält nur wenig antibiotische Aktivität und wird verwor fen.
Die wässrige Lösung wird durch Zugabe von festem Kaliumbicarbonat auf pH 6,5 gebracht und in 3 Portionen mit insgesamt 150 ml einer Lösung von 300 g Phenol in 1 Liter Chloroform extrahiert. Das wässrige Raffinat wird verworfen.
Den Phenol-ChJoro- formextrakt filtriert man durch eine kleine Schicht von Celite und extrahiert das, Filtrat dreimal mit 20 ml 1/10n Salzsäure. Der Salzsäureextrakt, in dem sich das Antibiotikum befindet, wird auf pH 2 eirn- gestellt und in 6 Portionen mit insgesamt 100 ml eines Gemisches von 100 g Phenol in 100 ml Chloroform extrahiert.
Der Phenolextrakt wird erneut durch Celite filtriert, mit 50 ml Wasser, 300 ml Äther und 300, ml Petroläther versetzt und gut geschüttelt. Nach dem Abtrennen der wässrigen Phase wird die organische Phase mehrmals mit kleinen Portionen Wasser nach gewaschen. Die vereinigten wässrigen Phasen werden zwecks Entfernung des Phenols mehrmals mit Äther geschüttelt und hierauf lyophilisiert. Man erhält 85 mg eines Beigen Pulvers von hoher antibiotischer Wirksamkeit.