Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des wasserlöslichen Anti biotikums A 10 073, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man den Actinomyceten-Stamm A 10 073 oder eine Mutation dieses Stammes in einer Nährlösung züchtet und hierauf das Antibiotikum A 10 073 aus der Nährlösung isoliert.
Das Antibiotikum Grisonomycin entsteht bei der Kultur eines neuen Actinomyceten-Stammes, der aus einer bei Bergün, Kanton Graubünden, Schweiz, ge sammelten Erdprobe isoliert worden ist und der in unseren: Laboratorien sowie in der Eidig. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, unter der BezeichnunQ A 10 073 aufbewahrt wird.
Der Act.inomyceten-Stamm A<B>10</B> 073 gehört zur Art Streptomyces griseus.. Er bildet ein gelblich-grün- lichgraues Luftmycel. Die Sporenketten sind unregel mässig verzweigt und bilden keine Spiralen. Die ein zelner Sporen sind glatt. Wird der Organismus auf peptonhaltigen Nährböden kultiviert, so kann keine schwarzbraune melanoide Verfärbung beobachtet wer den. Das Wachstum ist relativ wenig temperatur abhängig, sowohl bei 18 als auch bei 40 entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 32 .
Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum von Streptomyces griseus A 10 073 auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedüen 1-7 sowie 10 wurden nach W. Linden bein, Arch. Mikrobiol. <I>17,</I> 361 (1952) hergestellt.
1. Synthetischer Agar: Wachstum anfangs dünn, schleierartig und hellgelb, später runzelig und hell braun bis kupferrot. Luftmycel sammetig, hellgelb bis grünlichgrau.
2. Synthetische Lösung: Sediment, Flocken, mäch- weiss. Pellikula anfangs gelblich, nach 9 Tagen röt- lichbraun. Luftmycel sammetig, weissgrau. 3. Glukosie-Agar: Wachstum spärlich, dünn, schleierartig, hellgelb.
4. Glukose-Asparagin-Agar: Wachstum dünn, schleierartig, hellgelb. Luftmycel mehlig bestäubt, hellgelb.
5. Caliciusnmalat Agar: Wachstum schleierartig, hellbraun. Luftmycel sammetig, hellgelb bis grünlich grau. Substrat kastanienbraun.
6. Gellatinestich (18 ): Wachstum oberflächlich, schleierartig, brännlichgelb, Substrat rötlichbraun. Verflüssigung nach 18 Tagen 0,8-1,2 cif.
7. Stärkeplatte: Wachstum dünn, schleierartig, farblos bis hellgelb. Luftmycel wenig entwickelt, hell gelb. Substrat graublau. Hydrolyse nach 14 Tagen 1,6 cm.
8. Kartoffeln.: Wachstum schleierartig, hellbraun bis weissgrau. Luftmycel spärlich, hellgelb bis. grün- lichgrau. Substrat hellbraun.
9. Karotten: Wachstum sehr langsam, hellgelb. 10. Lackmusmilich: Pellikula hellbraun. Luftmycel sammetig, farblos :bis hellgelb, zuletzt grünl'ichgrau. Substrat rot. Langsame Koagulation und Hydrolyse.
Die wichtigsten Merkmale des Stammes A 10 073 stimmen mit denjenigen von Streptomyces griseus (Krainsky) Waksman überein, so d'ass er vorläufig dieser Art zugezählt wird.
Es ist bekannt, dass einige Vertreter der Ar Strepto@myces griseus Antibiotika produzieren" so Streptomycin (Waksman S. A., StreptoMycini, Verlag Williams and Wilkins., 1949) Rhodomycetin (Shock- man G. und Waksman S.
A., Antibiotics and Chemo- therapy, 1, 68-75 [1951]), Actidion (Leach B. B., Ford H. J. und Whi fer A. J., J. A. C. S. 69, 474 [1947]), Candicidin (Lechevaker H., Acker R. F., Corke C. T., Haenseler C. M. und Waksman S. A., Mycologia 45, 155-171 [1953]); Grisein (Reynolds D.
M. und Waksman S. A., J. Bacteriol. 55, 739-752 [1948] und Streptocin (Waksman S. A., Harris D. A., Kupferberg A. B., Singher H. O. und Styles H., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. <I>70,</I> 308-312 [1949]).
Es wird weiter unten .gezeigt, dass sich das neue Antibiotikum Grisonomycin in charakteristischer Weise von diesen bereits bekannten Antibiotika unterscheidet.
Zur Herstellung des Antibiotikums A 10 073 kön nen auch Varianten, wie sie z. B. durch Selektionie- rung oder Mutation, insbesondere unter der Einwir- kung von Ultraviolett oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen gewonnen werden, Verwendung finden.
Der Streptomyceten-Stamm A 10 073 kann z. B. in wässriger, Kohlehydrate, stickstoffhaltige Verbin- dungen sowie anorganische Salze enthaltender Nähr- lösung aerob,
also beispielsweise in ruhender Ober- flächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schüt teln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüt- telflaschen oder den bekannten Fermentern gezüch tet werden. Als. Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 40 .
Eine wesentliche antibiotische Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 11/2 Tagen.
Als Kohlenstoffquelle kommen zum Beispiel Kohlehydrate, wie Glykose, Saccharose, Lak- tose, Mannit, Stärke sowie Glycerin, in Frage.
Als stickstoffhaltige Nährstoffe und gegebenenfalls wachs tumsfördernde Stoffe seien genannt: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, was serlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen der Alko- holherstellung, von Hefe, Bohnen,
insbesondere der Soyapflanze, von Samen, beispielsweise der Baum- wollpflanze usw., aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. Von anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sul fate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten.
Zur Isolierung des Antibiotikums A 10 073 die nen z. B. folgende Verfahren: Man trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge des Antibiotikums im Kulturfiltrat gefunden wird.
Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen des Anti biotikums am Mycel adsorbiert Es ist daher vorteil haft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich Wasser und wässrige organische Lösungsmittel, z. B. wässriges Methanol.
Das Antibiotikum Grisonomycin ist eine wasser lösliche Substanz, die in organischen Lösungsmitteln, insbesondere in Lipoidlösungsmitteln, unlöslich ist.
Es lässt sich bei neutralen pH weder aus Kulturfil- traten noch aus angereicherten Lösungen mit den für die Isolierung basischer hydrophiler Antibiotika üb lichen Fällungsmitteln, wie z. B. Pikrinsäure, Am- moniumreineckat, Helianthin, Pikrolonsäure, ausfül len.
Gemäss seinem Verhalten bei der elektrometri- schen Titration, bei der Elektrophorese auf dem Pa pier und bei der Ad@orption an Ionenaustauschern, handelt es sich möglicherweise um einen amphoteren Stoff mit überwiegend basischen Eigenschaften.
Gemäss diesen Eigenschaften sind zur Gewinnung des Antibiotikums A<B>10073</B> aus dem Kulturfiltrat und zu seiner Reinigung verschiedene Methoden ge eignet, die einzeln oder in Kombination miteinander angewandt werden können. So können verschiedene Adsorptionsmittel verwendet werden, z. B.
Aktiv kohlen, wie Norit (Markenprodukt), aktivierte Erden, wie Aluminiumoxyd, Fullererde oder Floridin, Harzadsorber, wie Asmit (Markenprodukt).
Die Affinität des Antibiotikums Grisonomycin ist ins besondere zu Norit über einen weiten; pH Bereich und zu Asmit in neutralem und alkalischem pH- Bereich sehr gross. Weiter kann das Antibiotikum Gri- sonomycin aus dem Kulturfiltrat oder wässrigen Lö- sungen auch durch stark saure Ionenaustauscher, z. B.
Dowex 50 (Markenprodukt), adsorbiert werden. Die Elution der Adsorbate erfolgt zweckmässig mit Gemischen von Wasser und organischen Lösungs mitteln, z. B. binären Gemischen von Wasser mit einem mit Wasser mischbaren organischen. Lösungs- mittel, wie z.
B. Wasser-Methanol, Wasser-Aceton, Wasser-Alkohol, Wasser-Propanol, Wasser-Pyridin oder aber Mehrkomponenten-Systemen, wie von Was ser mit einem mit Wasser nicht mischbaren organi schen Lösungsmittel und einem oder mehreren mit Wasser mischbaren, als Mischungsvermittler dienen den" organischen Lösungsmitteln, wie z.
B. Butanol Methanol-Wasser, Butanol-Pyrid'in-Methanol-Wasser, Phenol-Methanol-Wasser. Diese zur Elution dienen den Lösungsmittelgemische können mit oder ohne Zusatz von anorganischen oder organischen Säuren, z. B. Salzsäure, Schwefelsäure, Ameisensäure, Essig säure, oder mit oder ohne Zusatz von basischen Mit teln, z. B. Ammoniak, niederen! aliphatischen Aminen, angewendet werden.
Bei der Verwendung von Norit als Adsorptionsmittel haben sich Gemische von Bu- tanol-Methanol-Wasser im Volumenverhältnis von 2 : 1 : 2, von Butanol-Methanol-PyridinWasser im Volumenverhältnis von. 2 : 1 : 1 : 2 oder von Alkohol Wasser im Volumenverhältnis von 3 : 2 zur Elution des Antibiotikums. als besonders geeignet erwiesen.
Ad'sorbate an Asmit-Phenolharz werden vorzugsweise mit einem Gemisch von Methanol-Wasser-ln Salz säure im Volumenverhältnis von 75:15: 10 und solche an den erwähnten Ionenaustauschern zweck mässigerweise mit basischen Mitteln, z. B. mit wäss- rigen: Lösungen von Ammoniak, eluiert.
Aus den antibiotisch wirksamen Eluaten kann das Antibiotikum durch Entfernung der Lösungsmittel im Vakuum in Form eines Trockenpulvers erhalten werden oder aber inForm einer stark konzentrierten Lösung, aus der das Antibiotikum durch Zusatz der 4-6fachen Volumenmenge von Aceton oder von einem Gemisch von Methanol und Aceton, in Form eines braungelben Pulvers ausgefällt werden kann. Enthält das Elutionsmittel mit Wasser nicht misch bare Lösungsmittel, z.
B. im Falle einer Noritabsorp- tion das erwähnte Gemisch Butanol-Methanol-Wasser (2: 1 : 2), dann kann dieses auch zweckmässigcrweise mit einem weiteren, mit Wasser nicht mischbaren Lö sungsmittel, wie z. B. Äther, Chloroform, Essigester, n-Butylacetat, in solcher Menge versetzt werden, dass sich zwei Phasen bilden.
Das Antibiotikum befindet sich dann fast ausschliesslich in der wässrigen Phase, aus welcher es wiederum entweder durch direktes schonendes Eindampfen zur Trockne oder durch Ein engen zu einer konzentrierten Lösung mit anschlie ssender Fällung in Form eines Pulvers erhalten wird. Enthält das Elutionsmittel Säuren oder Basen, z. B.
im Falle der Asmitabsorption, das erwähnte Gemisch Methanol-Wasser-ln Salzsäure (75: 15: 10), dann ist es vorteilhaft, die im Eluat vorhandene Säure resp. Base vor dem Einengen durch Zugabe von Lauge resp. Säure zu neutralisieren oder aber aus dem Elu- tionsmittel durch Filtration durch einen schwachen Anionenaustauscher, wie Amberlite IR4B (Mar kenprodukt),
bzw. einen schwachen Kationenaustau- scher, wie Amberlite IRC50 (Markenprodukt), zu entfernen, an welchen das Antibiotikum Grisonomy- cin nicht adsorbiert wird.
Das Antibiotikum Grisonomycin ist im weiteren löslich in Phenol und Mischungen von Phenol mit organischen Lösungsmitteln, z. B. Phenol-Chloro- form-Gemischen. Es lässt sich aus wässrigen Lösun gen mit solchen Gemischen extrahieren.
Verteilt man das Antibiotikum zwischen wässrigen Salzsäurelösun.- gen und phenolhaltigen Ch;loroformlösungen, dann kann der Verteilungskoeffizient durch Variieren der Phenolkonzentration in der wässrigen Phase über einen weiten Bereich nach Wunsch eingestellt werden.
Ver steht man unter dem Verteilungskoeffizienten des An tibiotikums das Verhältnis der Konzentration in der organischen Phase zur Konzentration in der wässrigen Phase, dann ergibt es sich, dass der Verteilungskoeffi zient mit steigendem Phenolgehalt zu- und mit stei gendem Salzsäuregehalt abnimmt. Durch eine Kom bination von wenigen Verteilungsoperationen in sol chen Systemen kann eine wesentliche Anreicherung erzielt werden. Aus Phenol-Chloroform-Gemischen kann das Antibiotikum durch Zugabe lypophiler or ganischer Lösungsmittel, wie z. B.
Aceton, Äther oder Petroläther, in Form eines Pulvers ausgefällt werden. Eine weitere Möglichkeit der Isolierung besteht darin, dass man das Antibiotikum aus dem Phenol- Chloroform-Gemisch durch Zugabe solcher Lösungs mittel auf ein Filterhilfsmittel, wie z.
B. Hyflo Super- cel, ausfällt und- den leicht filtrierbaren Rückstand mit den gleichen Lösungsmitteln gut auswäscht. Der auf dem Filterhilfsmittel niedergeschlagene antibio tische Rückstand kann mit einem kleinen Volumen Wasser herausgelöst werden und die derart erhaltene konzentrierte Lösung des. Antibiotikums durch Ge friertrocknung in ein Pulver übergeführt werden.
Schliesslich ist es auch möglich, das Antibiotikum aus der Phenol-Chl;oroform-Lösung nach Zugabe von Äther-Petroläther-Gemischen direkt mit wenig Was ser zurückzuextrahieren. Die Menge des Petroläther- Äther-Gemisches richtet sich dabei nach der Phenol menge.
Die beschriebenen Adsorptions-, Elutions- und Extraktionsverfahren können einzeln oder in Kom- binatio@n miteinander angewandt werden. Besonders geeignet ist ein kombiniertes Verfahren, gemäss wel chem das Antibiotikum zuerst an: Asmit adsorbiert und sodann eluiert wird, worauf eine Adsorption an Norit mit anschliessender Elution folgt.
Das dabei erhaltene Antibiotikumkonzentrat wird hierauf durch einige Verteilungen zwischen Phenol-Chloroform- Lösungen und Salzsäurelösung weiter angereichert.
Die Adsorptions-Elutionsprozesse können im Batch -Verfahren oder an der Säule erfolgen.. Vor gängig der Elution der Adsorbate können die mit dem Antibiotikum belegten Adsorptionsmittel zwecks Ent fernung antibiotisch inaktiver Begleitstoffe mit geeig neten Lösungsmitteln gewaschen werden.
Im Falle des Noritadsorbates haben sich Wasser, 30 % iges Metha- nol und trockenes Aceton als Waschmittel geeignet erwiesen.
Eine Anreicherung des Antibiotikums. Grisono- mycin aus den nach den vorstehend geschilderten Ver fahren gewonnenen Konzentraten kann erfolgen, wenn Lösungen solcher Konzentrate mit Fällungs- mitteln, wie z. B. Pikrinsäure oder Helianthin, ver setzt werden, wobei Begleitstoffe des Antibiotikums, welche zum Teil in vitro ebenfalls antibiotische Wir kung aufweisen,.
ausgefällt werden, während das Anti biotikum selbst in Lösung bleibt. Nach der Abtren nung dieser Fällungen durch Filtration wird das. über schüssige Fällungsmittel aus dem Filtrat durch Pas sage über einen geeigneten Ionenaustauscher wie derum entfernt, im Falle von Helianthin oder Pikrin- säure z.
B. durch Passage über Amberlite IRA400 in der Chlorid'ionenform, worauf das angereicherte Antibiotikum nach den beschriebenen Verfahren aus den Lösungen isoliert werden kann.
Um das Antibiotikum weiter anzureichern, wird es vorzugsweise einer Säuilenadsorptionschromato- graphie unterworfen. Als Ad'sorbentien eignen sich die bereits für das Isolierungsverfahren erwähnten Adsorptonsmittel. Im weiteren lässt sich das Anti biotikum auch an Cellulose chromatographieren. Für die Entwicklung der Chromatogrammc werden die selben Lösungsmittelgemische verwendet,
die für die Elution der Adsorbate in den vorstehend geschüder- bei; Isolierungsverfahren angegeben sind, und zwar in konstanter oder variierender Zusammensetzung.
Ein gutes Anreicherungsverfahren stellt die Säulenchro- matographie an Norit dar, wobei die Aktivkohle vorzugsweise zwecks Erhöhung der Laufgeschwin digkeit des Eluiionsmittelts mit einem Filtrierhilfs- mittel, z.
B. Hyflo-Supercel oder Celite (Mar- kenprodukt), im Gewichtsverhältnis 1 : 1 bis 1 : 2 verdünnt wird. Weiter ist die Chromabogxaphie an Cellulosesäulen besonders gut zur Anreicherung des Antibiotikums geeignet. Als Elutionsmittel dient in diesem Falle eine Mischung von Butanol-Methanol- Wasser im Volumenverhältnis von 4 : 1 : 2.
Das Antibiotikum Grisonomycin wird so in Form eines antibiotisch hochwirksamen blassgelben Pul vers erhalten, das durch seine Löslichkeitseigenschaf ten durch Papierchromatographie, Elektrophorese so wie durch sein Verhalten gegen Farb- und Fällungs- reagenzien charakterisiert wird. Das Antibiotikum Grisonomycin ist sehr gut löslich in Wasser.
Es löst sich im weiteren: in Mischungen von Wasser und nie deren Alkoholen, in Phenol sowie in Mischungen von Phenol mit organischen Lösungsmitteln. Es ist un löslich in den gebräuchlichen organischen Lösungs mitteln, insbesondere Lipoidlösungsmitteln. Das pa- pierchromatographische Verhalten des Antibioti kums Grisonomycin auf Whatman-Nr. 1-Papier er gibt sich im Vergleich mit Streptomycinsulfat (1), Ristocetin A (2)
und Ristocetin B (3) aus folgender Tabelle:
EMI0004.0022
<U>Rf-Wert</U>
<tb> Lösungsmittelgerrisch
<tb> <U>Grisonomycin <SEP> 1 <SEP> I</U> <SEP> 2 <SEP> I <SEP> 3
<tb> A <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> B <SEP> 0 <SEP> 0,12 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> C <SEP> 0,15 <SEP> 0,25 <SEP> 0,22 <SEP> 0,19
<tb> D <SEP> 0,52 <SEP> 0,61 <SEP> 0,53 <SEP> 0,24
<tb> E <SEP> 5,15 <SEP> 1 <SEP> 5,15 <SEP> 11,4
<tb> F <SEP> 0,65 <SEP> 0,07 <SEP> 0,69 <SEP> 0,69
<tb> G <SEP> 0,92 <SEP> 0,13 <SEP> 0,41 <SEP> 0,25
<tb> H <SEP> 0,90 <SEP> 0,29 <SEP> 0,38 <SEP> 0,17
<tb> <B>1</B> <SEP> 0,11 <SEP> 0,15 <SEP> 0,05 <SEP> j <SEP> 0,
25 A = Butanol mit Wasser gesättigt B = Butanol mit Wasser gesättigt ;
2 % p-Toluol- sulfosäure C = 80%iges wässriges Äthanol, 1,5 % Natrium- chlorid enthaltend auf Whatman-Nr. 4-Papier imprägniert mit 0,95m Natriumsulfat und 0,05m Natriumhydmogensulfat (NaHS04 - H20)
D = 80%iges wässriges Mefthanol, 1,5% Natrium- chlorid enthaltend E = Butanol-Methanol-Wasser 3<B>14:</B> 1 : 2 F = Butanol=Äthanol-Wasser 1 : 1 :
2 G = Wasser, gesättigt mit Methyliso#butylketon H = 75 0/a Wasser + 25 % einer Mischung von 3 Teilen Methanol und 1 Teil Aceton, mit Am moniak auf pH 10,5 gebracht und mit Phos phorsäure auf pH 7,5 zurückgestellt I = sekundäres Butanol, gesättigt mit Wasser + 0,
2 0/0- Trichloressigsäure (Im Falle des Lösungsmittelsystems E handelt es sich um ein Durchlaufchromatogramm. Die angegebe nen Zahlen bedeuten in diesem Falle das.
Verhältnis der Laufstrecke des Antibiotikums zur Laufstrecke von Streptomycinsulfat.) Das Antibiotikum Grisonomycin verhält sich pa- pierchromatographisch ähnlich wie Grisein. Grisein wandert jedoch in den meisten Systemen schneller als Grisonomycin, z. B. im System Butanol-Eisessig-Was- ser (4: 1 : 5) um den Faktor 1,4: im System C um den Faktor 1,3.
Bei der Elektrophorese auf Whatman-Nr. 1-Papier wandert das Antibiotikum Grisonomycin an die Ka- thode, und zwar in einem 0,03-molaren Kalium-Na- trium-Phosphatpuffer von pH 5,5 bei einer Spannung von 110 Volt während 5 Stunden um 4,2 cm. Unter gleichen Bedingungen zeigen Streptomycinsulfat bzw. Ristocetin A bzw. Ristocetin B Wanderungsstrecken von 8,3 bzw. 5,0 bzw. 3,9 cm.
In einem 0,2-molaren Boratpuffer von pH 8,13 wandert das Antibiotikum Grisonomycin unter sonst gleichen Bedingungen um 2,9 cm gegen die Kathode. Streptomycin bzw. die Risto@cetine A und B wandern in diesem Falle um 6,7 bzw. 3,4 cm in der gleichen Richtung.
Das Antibiotikum Grisonomycin gibt aus einer 10%igen wässrigen; neutralen Lösung bei der trop- fenweisen Zugabe einer gesättigten wässrigen Lösung von Pikrinsäure, Ammoniumreineckat, Helianthin oder einer gesättigten Lösung von Pikrolonsäure in 900/eigem Alkohol keine Fällung,
im Falle von He- lianthin höchstens eine schwache Trübung. Negativ sind weiter der Sackagu.chi-, Maltol-, Elson-Morgan-, Biuret- und der Benedict-Test.
Das Antibiotikum Grisonomycin unterscheidet sich von den ebenfalls von Vertretern der Art Strep- tomyces griseus produzierten Antibiotika Streptomy- cin, Rhodomycetin, Äsidion, Streptocin, Grisein und Candicidin durch seine Löslichkeitseigenschaften, seine Eigenfarbe, die Farbreaktionen und sein papierchro- matographisches Verhalten.
Das Antibiotikum Grisonomycin besitzt eine hohe Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Mikroorganis men. Verwendet man als Testmethode in vitro Ver dünnungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, so ergeben sich bei 2 Stunden Bebrütung bei 37 mit den verschiedenen Testorganismen folgende noch hemmende Konzentrationen.
EMI0005.0001
Hemmende
<tb> Testorganismen <SEP> Konzentration
<tb> ,ag/cms
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var.
<SEP> aureus <SEP> 1
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 1
<tb> Streptococcus <SEP> viridians <SEP> 1
<tb> Corynebacterium <SEP> diphteriae <SEP> 1
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 1
<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> Streptomycin-resistent <SEP> 1
<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> Chloromycetin-resistent <SEP> 1
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 1
<tb> Pseuäomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 1
<tb> Klebsiella <SEP> Typ <SEP> A <SEP> 1
<tb> Pasteurella <SEP> pestis <SEP> 1
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 1
<tb> Endomyces <SEP> albicans <SEP> 1 Wird für die Testierung irr vitro die Plattentest- methode mit Papierrondellen von 6 mm Durchmesser verwendet,
so erhält man mit einer 1 0/eigen Lösung des Antibiotikums Grisonomycin folgende Hemm zonen:
EMI0005.0010
Testorganismen <SEP> Hemmzone
<tb> in <SEP> mm
<tb> Mierococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var <SEP> aureus <SEP> 21
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus
<tb> Penicillin-resistent <SEP> 20
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 18
<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> Streptomycin-resistent <SEP> 18
<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> Chl'oromycetin <SEP> resistent <SEP> 18
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 12
<tb> Klebsiella <SEP> Typ <SEP> A <SEP> 17
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 19 In vivo ist das Antibiotikum Grisonomycin eben falls wirksam.
Bei zweimaliger subkutaner Applika tion von 20 mg/kg an mit Klebsiena Typ A infizierte Mäuse werden 1009/o überlebende beobachtet. Diese Dosen werden von nicht infizierten Mäusen; ohne Schädigung ertragen.
Das Antibiotikum Grisonomycin oder seine Deri vate können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeu- tischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthal ten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Appli kation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindun gen nicht reagieren, wie z. B.
Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche öle, Benzylalkohole, Gummi, Palyalkylenglykole, Vase line, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittel- träger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B.
als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, Cremen, Sup positorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Sus pensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfs- stoffe, wie Koniservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
<I>Beispiel 1</I> Die Züchtung des Streptomyces A 10 073 wird nach dem Submersverfahren durchgeführt. Man ver wendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 20 g Distillers Solubles, 20g Malzextrakt, 1 g Na triumnitrat und 5 g Natriumchlorid enthält. Die Nähr lösung wird in den Impfkolben oder in den Fermen- tern während 20-30 Minuten bei 1 atü sterilisiert.
Die sterilisierte Nährlösung zeigt ein pH von 7,5 bis 8,0. Die Animpfung erfolgt mit Abis zu 10% einer teilweise sporulierenden vegetativen Kultur des Or ganismus..
Man in-kubiert unter gutem Schütteln oder Rühren bei 27 , wobei Kulturen in Fermentern mit etwa 1 Vol. steriler Luft pro Vol. Lösung in der Mi nute belüftet werden:.
Nach 48-120 Stunden Bebrü- tung hat die Kulturlösung den grössten Hemmwert ge genüber den Testorganismen (B. subtilis, Micro- coccus pyogenes, vor.
aureus, Escherichia coli, Kleb- siena) erreicht. Man trennt das Mycel sowie andere feste Bestandteile von der die Hauptmenge des Anti biotikums enthaltenden Lösung mittels Filtration oder Zentrifuaation ab,
wobei ge@gebenenfalls der Kultur- lösung vor der Filtration etwa 1 % eines Filterhilfs- mittels, z. B. Hyflo Supercel, zugesetzt wird.
Die Fil- terrückstände wäscht man mit Wasser und mit wäss- rigem Methanol und vereinigt die Waschflüssigkeiten mit dem antibiotisch wirksamen: Kulturfiltrat.
Verwendet man anstelle der oben angegebenen Nährlösung solche, die pro Liter Leitungswasser die folgenden Nährstoffe enthalten, so erhält man nach analoger Züchtung und Aufarbeitung Kulturfiltrate von ähnlich hoher antibiotischer Wirksamkeit.
EMI0006.0055
a) <SEP> Laktose <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Distillers <SEP> solubles <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Natriumnitrat <SEP> 1 <SEP> g
<tb> b) <SEP> Glukose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Distillers <SEP> solubles <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Natriumnitrat <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 10 <SEP> g
<tb> c) <SEP> Mannit <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Distillers <SEP> solubles <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 3 <SEP> g
<tb> Natriumnitrat <SEP> 1 <SEP> g
<tb> d) <SEP> Glycerin <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Sojamehl <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Natriumnitrat <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 10 <SEP> g
<tb> e)
<SEP> Glukose <SEP> <B>20</B> <SEP> g
<tb> Sojamehl <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Natriumnitrat <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 10 <SEP> <B>g</B> <I>Beispiel 2</I> 7 1 eines nach Beispiel 1 erhaltenen. Kulturfiltra tes werden mit einer Durchlaufgeschwindngkeit von 4 1 pro Stunde durch eine 40 cm hohe Schicht von 700 ml Asmit durchfiltriert. Das Antibiotikum wird dabei vollständig adsorbiert. Nachfolgend wird die Säule bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 7 bis 8 1 pro Stunde mit 2 1 Wasser gewaschen und hierauf
mit einem Gemisch von Methanol-Wasser-In Salz säure im Volumenverhältnis von<B>75: 15:</B> 10 cluiert. Das Elutionsmittel wird in Fraktionen von 1 1 auf- gefangen. Die Fraktionen 2-4, die bis zu 80 % der im Kulturfiltrat vorhandenen antibiotischen Aktivität enthalten, werden vereinigt (etwa 3 1).
Die im Eluat vorhandene Salzsäure wird mit verdünnter Natron lauge neutralisiert, wobei zuvor die dazu erforderliche Menge Natronlauge durch Titration eines mit Wasser auf das doppelte Volumen verdünnten aliquoten Tei les festgestellt wird:. Die neutrale Lösung wird am Rotationsverdampfer bei 35 C auf 200 ml eingeengt und hierauf durch ein Papierfilter filtriert und mit wenig Wasser nachgewaschen. Durch Gefriertrock nung erhält man aus dem Filtrat das rohe Antibioti kum in Form eines braunen Pulvers. Die Ausbeute beträgt etwa 7 g pro Liter Kulturfiltrat.
<I>Beispiel 3</I> 100 1 des nach Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltra tes werden mit 2 kg Norit während 1 Stunde verrührt, wobei die gesamte antibiotische Aktivität an der Ak tivkohle ads-orbiert wird. Die letztere wird, vorteil haft unter Zugabe eines Filtri-erhil:fsmittels, wie z. B. Hyflo Supercel, abgetrennt und hierauf dreimal mit je 20 1 destilliertem Wasser gewaschen, wobei jedes mal während 30 Minuten mechanisch gerührt und anschliessend filtriert wird. Die Waschlösung ist antibiotisch inaktiv.
Die Kohle wird nachfolgend mit 20 1 einer wässrigen 30%igen Lösung von Alkohol während 30 Minuten. verrührt und durch Filtration wiederum abgetrennt.
Diese Operation wird mixt 20 1 und schliesslich noch mit 10 1 30%igem Alkohol wie- derholt. Die vereinigten wässri- alkoholischen Fil trate enthalten 0,5-0,6 g Trockensubstanz pro Liter mit lediglich geringer antibiotischer Wirksamkeit.
Die Aktivkohle wird nun gleicherweise mit 3 Portio- nen (2 X 20 1, 1 X 101) von 60%igem Alkohol eru- iert. Diese Eluate enthalten eine grosse antibiotische Wirksamkeit. Sie werden vereinigt und im Dünn schichtenverdampfer bei höchstens 30 auf ein kleines Volumen eingeengt.
Die solcherweise erhaltene kon zentrierte wässrige Lösung giesst man in das fünf fache Volumen von Aceton, wobei das Antibiotikum Grisonomycin vorwiegend als Massgelbes Pulver aus gefällt wird. Nach mehrstündigem Stehen bei 0 wird die überstehende Lösung durch Dekantieren vom Rückstand abgetrennt und letzterer mit trockenem Methanol gewaschen. Der verbleibende Rückstand wird im Vakuum gut getrocknet.
Man erhält derart 7-8 g des rohen Antibiotikums Grisonomycin in Form eines Massgelben Pulvers (Fraktion 1) Die ver einigten Aceton- und Methanollösungen enthalten weitere 12-13 g Substanz, welche durch Entfernen der Lösungsmittel im Vakuum isoliert wird. Sie be sitzt eine kleinere spezifische antibiotische Wirksam keit (Fraktion 2).
<I>Beispiel 4</I> 1<B>1</B> eines nach Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates wird mit 15g Norit während 1 Stunde verrührt. Die Aktivkohle wird durch Filtration, vorteilhaft unter Zugabe von Filterhilfsmitteln, wie z. B. Hyflo Super- cel, von der antibiotisch inaktiven Lösung abgetrennt.
Durch halbstündiges Schütteln mit 200 ml Wasser wird die Aktivkohle gewaschen und dann abfiltriert. Gleicherweise wird mit 200 ml 30 /oigem Methanol gewaschen und die Kohle anschliessend auf einer Glas- filternutsche scharf abgesaugt. Die Waschflüssigkeiten sind antibiotisch inaktiv.
Das solcherweise gewaschene Kohleadsorbat wird durch einstündiges Schütteln mit 200 ml einer Mischung von Butanol-Methanol-Was- ser im Volumenverhältnis von 2: 1 : 2 eluiert. Die von der Kohle durch Filtration befreite, dunkel ge- färbte Lösung enthält etwa 70 % der im Kulturfiltrat vorhandenen antibiotischen Aktivität.
Man schüttelt die Lösung mit 100 m1 n-Butylacetat. Die sich dabei ausscheidenden 2 Phasen werden getrennt. Die wäss- rige, dunkel gefärbte Phase von 140 mlenthält prak tisch die gesamte im Eluat vorhandene antibiotische Aktivität und wird anschliessend der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhält das rohe Antibiotikum Gri- sonomycin als dunkelgelbes Pulver. Ausbeute: 0,93 g.
<I>Beispiel 5</I> 15 g eines nach Beispiel 4 erhaltenen, mit Wasser und 30 /oigem Methanol gewaschenen Kohleadsor- bates werden mit 200 m1 einer Mischung von Bu tanol-Methanol-Pyridin-Wasser im Volumenverhältnis von 2: 1 : 1 : 2 während 1 Stunde geschüttelt.
Das durch Filtration über einer Glasfilternutsche von der Kohle befreite dunkel gefärbte Eluat enthält bis zu 80 % der im Kulturfiltrat vorhandenen antibiotischen Aktivität. Die Lösung wird mit 100 ml n-Butylace- tat geschüttelt.
Die dabei ausgeschiedene, die anti biotische Aktivität enthaltende wüssrige Phase von etwa 110 ml wird am Rotationsverdampfer bei 35 auf ein kleines Volumen eingeengt. Aus dieser kon zentrierten Lösung erhält man das rohe Antibioti kum Grisonomycin durch Gefriertrocknung in Form von 1,01g eines braungelben Pulvers.
<I>Beispiel 6</I> 5 g eines nach Beispiel 3 erhaltenen Antibioti- kumkonzentrates (Fraktion 2) werden an einer 5,5 cm hohen Säule einer Mischung von 10 g Norit und 20g Hyflo Supercel chromatographiert, wobei die Substanz in Form einer l0o/oigen wässrigen Lösung auf die Säule aufgetragen wird.
Es werden Fraktio nen zu ?. Liter aufgefangen:. Die Fraktionen 1-6, die mit Wasser eluiert werden, werden eingedampft und enthalten 4,3 g antibiotisch inaktives Material. Aus den Fraktionen 7-10, die mit 10 % igem Alkohol eluiert werden, erhält man 155 mg Trockensubstanz, die ebenfalls antibiotisch unwirksam ist.
Die Frak tionen 11-14, eluiert mit 301/oigem Alkohol., und die Fraktion 15, eluiert mit 2 1 60 19/o igem Alkohol, enthalten zusammen 140 mg des angereicherten Anti biotikums Grisonomycin, das aus den Lösungen durch Einengen am Rotationsverdampfer bei 35 und durch anschliessende Gefriertrocknung in Form eines beigen Pulvers erhalten wird.
Beispiel <I>7</I> 10 g eines nach Beispiel 3 erhaltenen Antibioti- kumkonzentrates (Fraktion 2) werden in 100 ml Was ser gelöst und mit 5 g kristallinem Helianthin (Orange<B>111,</B> Natriumsaliz der 4'-Dimethylamino-azo- benzol4-sulfonsäure) versetzt.
Die Aufschlemmung wird während 1 Stunde am Vibromischer stark ge- rührt und hierauf über 10g Hyflo Supercel filtriert. Das Filtrat wird vom überschüssigen Helianthin mit tels einer Passage durch 50 ml Amberlite IRA400 in der Chlorid'ionenform befreit.
Man wäscht den Ioncn- austauscher mit 200 ml Wasser und engt das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Filtrat am Vakuum bei 35 auf ein kleines Volumen ein. Aus der konzentrier ten Lösung erhält man das gegenüber dem Ausgangs material angereicherte Antibiotikum durch Gefrier trocknung in Form; eines Pulvers (6 g). Das im ab filtrierten Rückstand befindliche Helianthatgelnisch enthält in kleiner Menge einen antibiotisch wirksamen Stoff, dessen biologisches Wirkungsspektrum sich von jenem des Antibiotikums Gris.onomycin unter scheidet.
<I>Beispiel 8</I> 8,1 g eines nach Beispiel 3 erhaltenen Antibioti- kumpräparates (Fraktion 1) werden an 647 g asche- freiem Cellulosepulver Whatman Standard Grade chromatographiert. Zu diesem Zweck wird das Cel- lulosepullver portionenweise in eine Glassäule ein gefüllt und mit einem .genau in die Säule hineinpas senden Stöpsel aus rostfreiem Stahl möglichst stark eingepresst,
so dass jeweils etwa 5 cm hohe Schichten entstehen. Es resultiert dabei eine homogene Cellu- losesäule von 70 cm Höhe und 5,5 cm Durchmesser. Diese wird während 2 X 24 Stunden bei einer Durch- laufgeschwind-igkeit von 70 ml pro Stunde mit einem Gemisch von Butanol-MethanolWasser im Volumen- verhältnis 4:
1 :2 gewaschen. Die zu chromato- graphierende Substanz wird in 100 ml Wasser gelöst und mit 50 ml Methanol sowie 50 ml Butanol ver setzt.
Bevor diese Lösung auf die Säule aufgebracht werden kann, wird die Säule akklimatisiert , das heisst, es werden auf die Säule kleine Portionen des Gemisches Butanol-Methanol-Wasser mit abnehmen dem Butanolgehalt derart aufgetragen, dass man eine neue Portion unter Vermeidung von Turbulenz ge rade dann aufträgt, wenn die vorangehende Portion ganz in die Cellulose eingesickert ist.
Es werden da bei 20 ml Butanol-Methanol:-Was:s,er-Gemisch 3:1:2, 20 ml Gemisch 2:1:2 und 20 ml Gemisch 1 : 1 : 2 aufgetragen. Anschliessend lässt man die 200 ml der Lösung in die Säule einsickern und beginnt dann, kleine Portionen des Gemisches Butanol-Methanol-Wasser mit ansteigen dem Butanolgehalt aufzubringen. Man verwendet dazu 10 -ml des, Gemisches, 11/" : 1 : 2, 20 ml; des Gemisches 2 : 1 : 2 und 20 ml des Gemisches 3 : 1 : 2.
Hierauf wird die Säule mit dem Gemisch 4 : 1 : 2 ent wickelt. Es werden Fraktionen zu 135-140 ml. auf gefangen. Jede antibiotisch aktive Fraktion versetzt man mit 50 ml Äther und schüttelt sie dreimal mit 20 ml Wasser aus. Die vereinigten wässrgen Phasen werden mit 50 ml Äther durch Ausschütteln ge waschen und anschliessend durch Gefriertrocknung in Form eines Beigen Pulvers erhalten. Die Fraktionen 7-26 enthalten antibiotisch wirksames Material, wo bei das Aktivitätsmaximum in den Fraktionen 11-20 vorhanden ist.
Diese werden vereinigt und man er hält 1,45 g des angereicherten Antibiotikums Griso- nomycin.
<I>Beispiel 9</I> 780 mg eines nach Beispiel 8 erhaltenen angerei cherten Antibiotikumkonzentrates werden an 154 g aschefreiem Cellulosepulver Whatman Standard Grade chromatographiert. Gemäss der in Beispiel 8 angegebenen Vorschrift erhält man in einem Chro- matogrammrohr von 3 cm innerem Durchmesser eine Cellulosesäule von 62 cm Höhe.
Diese wird während 4 X 24 Stunden bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 20 ml pro Stunde mit einem Gemisch von. Bu- tanol-Methanoli-Wasser im Volumenverhältnis von 4 : 1 : 2 gewaschen. Die Substanz wird in 5 ml Wasser gelöst und mit 2,5 ml Methanol und 4 ml Butanol versetzt. Die Säule wird vor dem Auftragen der Lö sung wie in Beispiel 8 angegeben akklimatisiert , und zwar mit 2 ml Gemisch 3 : 1 : 2, mit 2 ml Ge misch 2: 1 : 2 und schliesslich mit 2 ml Gemisch <B>1,6:</B> 1 : 2.
Hierauf wird die Lösung aufgetragen und die Cellulosesäule mit 2 ml-Portionen der Butanol- Methanol-Wasser-Gemische 2:1:2, 21/2:1:2, 3 : 1 : 2 und 3 1/2 : 1 : 2 beschickt. Nachfolgend wird die Säule mit dem Gemisch 4 : 1 : 2 bei einer konstan ten Temperatur von 25 entwickelt. Es werden Frak tionen zu je 40 ml aufgefangen. Die antibiotisch ak tiven Fraktionen 14-33 werden einzeln mit 50 ml Äther-Chloroform (4: 1) geschüttelt. Die dabei ab geschiedene wässrige Phase, welche die antibiotische Aktivität enthält, wird abgetrennt und die organische Phase zweimal mit 5 ml Wasser nachgeschüttelt.
Die vereinigten wässrigen Phasen (etwa 20 ml) werden mit 20 ml Äther-Chloroform (4: 1) gewaschen und durch Gefriertrocknung in Massgelbe Pulver über geführt. Die Fraktionen 19-21 sind antibiotisch am stärksten wirksam. Sie werden vereinigt und man er hält insgesamt 75 mg des reinen Antibiotikums Gri- sonomycin, das, verglichen mit dem im Kulturfiltrat vorhandenen Material, eine etwa 300fache antibio tische Wirksamkeit besitzt. Das reine Antibiotikum Grisonomycin löst sich sehr leicht in Wasser.
Es ist schwer bis unlöslich in organischen Lösungsmitteln, insbesondere Lipoidlösungsmitteln. Es verhält sich papierchromatographisch einheitlich in den Lösungs- mittelgemischen A-I (vergleiche Tabelle in der Be schreibung) und unterscheidet sich in diesen Systemen auch von anderen bekannten wasserlöslichen Anti biotika, wie z.
B. Streptomycin, Neomycin, Risto- cetin A und B und Viomycin. Das Antibiotikum Gri- sonomycin lässt sich aus neutralen konzentrierten wässrigen Lösungen mit Pikrinsäure, Helianthin, Am- moniumreineckat und Pikrolonsäure nicht ausfällen. Es wird aus solchen Lösungen von schwach sauren oder schwach basischen Ionenaustauschern nicht ad sorbiert.
Es gibt keine Farbreaktion nach Sackaguchi, Ehrlich, Bened'ict und Elson-Morgan. Die Biuret- reaktion ist negativ.
<I>Beispiel 10</I> 10 g eines nach Beispiel 4 erhaltenen Antibioti- kumpräparates werden in 100 ml Wasser gelöst und mit 5n Salzsäure auf einen pH-Wert von annähernd 1 eingestellt. Diese Lösung wird zweimal mit<B>100</B> ml einer Mischung von: 100 g Phenol in 100 ml Chloro form ausgeschüttelt. Der organische Extrakt enthält nur wenig antibiotische Aktivität und wird verwor fen.
Die wässrige Lösung wird durch Zugabe von festem Kaliumbicarbonat auf pH 6,5 gebracht und in 3 Portionen mit insgesamt 150 ml einer Lösung von 300 g Phenol in 1 Liter Chloroform extrahiert. Das wässrige Raffinat wird verworfen.
Den Phenol-ChJoro- formextrakt filtriert man durch eine kleine Schicht von Celite und extrahiert das, Filtrat dreimal mit 20 ml 1/10n Salzsäure. Der Salzsäureextrakt, in dem sich das Antibiotikum befindet, wird auf pH 2 eirn- gestellt und in 6 Portionen mit insgesamt 100 ml eines Gemisches von 100 g Phenol in 100 ml Chloroform extrahiert.
Der Phenolextrakt wird erneut durch Celite filtriert, mit 50 ml Wasser, 300 ml Äther und 300, ml Petroläther versetzt und gut geschüttelt. Nach dem Abtrennen der wässrigen Phase wird die organische Phase mehrmals mit kleinen Portionen Wasser nach gewaschen. Die vereinigten wässrigen Phasen werden zwecks Entfernung des Phenols mehrmals mit Äther geschüttelt und hierauf lyophilisiert. Man erhält 85 mg eines Beigen Pulvers von hoher antibiotischer Wirksamkeit.
Process for producing a new antibiotic The present invention relates to a process for producing the water-soluble anti-biotic A 10 073, which is characterized in that the actinomycete strain A 10 073 or a mutation of this strain is grown in a nutrient solution and then the antibiotic A 10 073 isolated from the nutrient solution.
The antibiotic grisonomycin is produced during the culture of a new actinomycete strain, which was isolated from a soil sample collected near Bergün, Canton of Graubünden, Switzerland and which is in our laboratories and in the Eidig. Technical University, Institute for Special Botany, under the designation A 10 073.
The Act.inomyceten strain A <B> 10 </B> 073 belongs to the species Streptomyces griseus .. It forms a yellowish-greenish-gray aerial mycelium. The spore chains are irregularly branched and do not form spirals. The individual spores are smooth. If the organism is cultivated on peptone-containing culture media, no black-brown melanoid discoloration can be observed. Growth is relatively little dependent on temperature, the fungus develops well at both 18 and 40, but the optimum is between 25 and 32.
For further characterization, the growth of Streptomyces griseus A 10 073 on various nutrient media is described below. The nutrient media 1-7 and 10 were according to W. Linden bein, Arch. Mikrobiol. <I> 17, </I> 361 (1952).
1. Synthetic agar: initially thin, veil-like and light yellow, later wrinkled and light brown to copper-red. Air mycelium velvety, light yellow to greenish gray.
2. Synthetic solution: sediment, flakes, off-white. Pellicle initially yellowish, after 9 days reddish brown. Velvety aerial mycelium, white-gray. 3. Glucose agar: growth sparse, thin, veil-like, light yellow.
4. Glucose asparagine agar: growth thin, haze-like, light yellow. Aerial mycelium floury, light yellow.
5. Calicius malate agar: growth veil-like, light brown. Aerial mycelium velvety, light yellow to greenish gray. Substrate chestnut brown.
6. Gellatin tint (18): growth superficial, veil-like, burnt-yellow, substrate reddish-brown. Liquefaction after 18 days 0.8-1.2 cif.
7. Starch plate: growth thin, veil-like, colorless to light yellow. Aerial mycelium poorly developed, light yellow. Substrate gray-blue. Hydrolysis after 14 days 1.6 cm.
8. Potatoes .: growth like a veil, light brown to white-gray. Aerial mycelium sparse, light yellow to. greenish gray. Substrate light brown.
9. Carrots: very slow growth, light yellow. 10. Litmus milk: pellicle light brown. Air mycelium velvety, colorless: to light yellow, finally greenish gray. Substrate red. Slow coagulation and hydrolysis.
The most important characteristics of the strain A 10 073 agree with those of Streptomyces griseus (Krainsky) Waksman, so that it is provisionally included in this species.
It is known that some representatives of the Ar Strepto @ myces griseus produce antibiotics "so streptomycin (Waksman S.A., StreptoMycini, Verlag Williams and Wilkins., 1949) Rhodomycetin (Shockman G. and Waksman S.
A., Antibiotics and Chemotherapy, 1, 68-75 [1951]), Actidion (Leach BB, Ford HJ and Whi fer AJ, JACS 69, 474 [1947]), candicidin (Lechevaker H., Acker RF, Corke CT, Haenseler CM and Waksman SA, Mycologia 45, 155-171 [1953]); Grisein (Reynolds D.
M. and Waksman S.A., J. Bacteriol. 55, 739-752 [1948] and streptocin (Waksman SA, Harris DA, Kupferberg AB, Singher HO and Styles H., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. <I> 70, </I> 308-312 [ 1949]).
It will be shown below that the new antibiotic grisonomycin differs in a characteristic way from these already known antibiotics.
For the production of the antibiotic A 10 073 can NEN variants such as. B. be obtained by selection or mutation, in particular under the action of ultraviolet or X-rays or nitrogen mustard oils, can be used.
The Streptomycete strain A 10 073 can, for. B. in aqueous, carbohydrates, nitrogenous compounds and inorganic salts containing nutrient solution aerobic,
that is, for example, in resting surface culture or preferably submerged with shaking or stirring with air or oxygen in shaker bottles or the known fermenters. When. A suitable temperature is between 18 and 40.
The nutrient solution generally shows a significant antibiotic effect after 11/2 days.
Carbohydrates such as glycose, sucrose, lactose, mannitol, starch and glycerine can be used as a carbon source.
Nitrogen-containing nutrients and possibly growth-promoting substances are: amino acids, peptides and proteins and their breakdown products, such as peptone or tryptone, and also meat extracts, soluble parts of cereal grains such as corn and wheat, distillation residues from alcohol production, yeast, beans ,
in particular of the soya plant, of seeds, for example the cotton plant, etc., but also ammonium salts and nitrates. Of other inorganic salts, the nutrient solution can contain, for example, chlorides, carbonates, sulphates of alkalis, alkaline earths, magnesium, iron, zinc and manganese.
To isolate the antibiotic A 10 073 the nen z. B. the following procedures: The mycelium is separated from the culture filtrate, after which the main amount of the antibiotic is found in the culture filtrate.
However, significant amounts of the antibiotic remain adsorbed on the mycelium. It is therefore advantageous to wash the latter out thoroughly. Water and aqueous organic solvents, e.g. B. aqueous methanol.
The antibiotic grisonomycin is a water-soluble substance that is insoluble in organic solvents, especially lipoid solvents.
At neutral pH it can neither be obtained from culture filtrates nor from enriched solutions with the usual precipitants for isolating basic hydrophilic antibiotics, such as. B. picric acid, ammonium pure nectar, helianthin, picrolonic acid, fill len.
According to its behavior in electrometric titration, in electrophoresis on paper and in adsorption to ion exchangers, it is possibly an amphoteric substance with predominantly basic properties.
According to these properties, various methods that can be used individually or in combination are suitable for obtaining antibiotic A 10073 from the culture filtrate and for purifying it. Various adsorbents can be used, e.g. B.
Active carbon such as Norit (branded product), activated earths such as aluminum oxide, fuller's earth or floridine, resin adsorbers such as Asmit (branded product).
The affinity of the antibiotic grisonomycin in particular to Norit is over a wide; pH range and very large for Asmit in neutral and alkaline pH range. The antibiotic grisonomycin can also be removed from the culture filtrate or aqueous solutions by means of strongly acidic ion exchangers, e.g. B.
Dowex 50 (branded product). The elution of the adsorbates is conveniently carried out with mixtures of water and organic solvents, eg. B. binary mixtures of water with a water-miscible organic. Solvents such as
B. water-methanol, water-acetone, water-alcohol, water-propanol, water-pyridine or multicomponent systems, such as water with a water-immiscible organic solvent and one or more miscible with water, as a mixing agent serve the "organic solvents such.
B. butanol-methanol-water, butanol-pyrid'in-methanol-water, phenol-methanol-water. These are used for elution the solvent mixtures can with or without the addition of inorganic or organic acids, eg. B. hydrochloric acid, sulfuric acid, formic acid, acetic acid, or with or without the addition of basic means with, z. B. Ammonia, lower! aliphatic amines.
When using Norit as an adsorbent, mixtures of butanol-methanol-water in a volume ratio of 2: 1: 2 and of butanol-methanol-pyridine-water in a volume ratio of. 2: 1: 1: 2 or alcohol water in a volume ratio of 3: 2 to elute the antibiotic. proved to be particularly suitable.
Ad'sorbates on asmitic phenolic resin are preferably mixed with a mixture of methanol-water-ln hydrochloric acid in a volume ratio of 75:15: 10 and those on the ion exchangers mentioned are conveniently with basic agents, e.g. B. with aqueous: solutions of ammonia, eluted.
The antibiotic can be obtained from the antibiotic eluates by removing the solvents in vacuo in the form of a dry powder or in the form of a highly concentrated solution, from which the antibiotic can be obtained by adding 4-6 times the volume of acetone or a mixture of methanol and acetone, can be precipitated in the form of a brown-yellow powder. If the eluent contains solvents that are immiscible with water, e.g.
B. in the case of norit absorption the mentioned mixture of butanol-methanol-water (2: 1: 2), then this can also expediently with another water-immiscible solvent, such as B. ether, chloroform, ethyl acetate, n-butyl acetate, are added in such an amount that two phases are formed.
The antibiotic is then almost exclusively in the aqueous phase, from which it is in turn obtained either by direct gentle evaporation to dryness or by narrowing it to a concentrated solution with subsequent precipitation in the form of a powder. If the eluent contains acids or bases, e.g. B.
in the case of asmitic absorption, the above-mentioned mixture of methanol-water-ln hydrochloric acid (75: 15: 10), then it is advantageous to use the acid or the acid present in the eluate. Base before concentration by adding lye, respectively. Neutralize acid or from the eluent by filtration through a weak anion exchanger, such as Amberlite IR4B (branded product),
or to remove a weak cation exchanger, such as Amberlite IRC50 (branded product), on which the antibiotic grisonomycin is not adsorbed.
The antibiotic grisonomycin is further soluble in phenol and mixtures of phenol with organic solvents, e.g. B. phenol-chloroform mixtures. It can be extracted from aqueous solutions with such mixtures.
If the antibiotic is distributed between aqueous hydrochloric acid solutions and phenol-containing chloroform solutions, the distribution coefficient can be adjusted as desired by varying the phenol concentration in the aqueous phase over a wide range.
If one understands by the distribution coefficient of the antibiotic the ratio of the concentration in the organic phase to the concentration in the aqueous phase, then the result is that the distribution coefficient increases with increasing phenol content and decreases with increasing hydrochloric acid content. A substantial enrichment can be achieved through a combination of a few distribution operations in such systems. The antibiotic can be obtained from phenol-chloroform mixtures by adding lypophilic organic solvents such as. B.
Acetone, ether or petroleum ether, can be precipitated in the form of a powder. Another possibility of isolation is that the antibiotic from the phenol-chloroform mixture by adding such a solvent medium to a filter aid, such as.
B. Hyflo Super- cel, precipitates and the easily filterable residue was washed out well with the same solvents. The antibiotic residue deposited on the filter aid can be dissolved out with a small volume of water and the concentrated solution of the antibiotic obtained in this way can be converted into a powder by freeze-drying.
Finally, it is also possible to extract the antibiotic from the phenol-chloroform solution directly with a little water after adding a mixture of ether and petroleum ether. The amount of petroleum ether-ether mixture depends on the amount of phenol.
The adsorption, elution and extraction processes described can be used individually or in combination with one another. A combined method is particularly suitable, according to which the antibiotic is first adsorbed on: Asmit and then eluted, followed by adsorption on Norit with subsequent elution.
The antibiotic concentrate obtained in this way is then further enriched by some distributions between phenol-chloroform solutions and hydrochloric acid solution.
The adsorption-elution processes can be carried out in a batch process or on the column. Before the adsorbates are eluted, the adsorbents coated with the antibiotic can be washed with suitable solvents for the purpose of removing antibiotic inactive substances.
In the case of noritadsorbate, water, 30% methanol and dry acetone have proven suitable as detergents.
A fortification of the antibiotic. Grisonomycin from the concentrates obtained by the process described above can take place if solutions of such concentrates with precipitants, such as. B. picric acid or helianthin, ver sets, with accompanying substances of the antibiotic, some of which also have antibiotic We effect in vitro.
be precipitated while the antibiotic itself remains in solution. After these precipitates have been separated off by filtration, the excess precipitant is removed from the filtrate by means of a suitable ion exchanger, such as in the case of helianthin or picric acid.
B. by passage over Amberlite IRA400 in the Chlorid'ionenform, whereupon the enriched antibiotic can be isolated from the solutions by the methods described.
In order to enrich the antibiotic further, it is preferably subjected to column adsorption chromatography. The adsorbents already mentioned for the isolation process are suitable as adsorbents. The antibiotic can also be chromatographed on cellulose. The same solvent mixtures are used to develop the chromatograms
those for the elution of the adsorbates in the abovementioned fragments; Isolation procedures are given, in constant or varying composition.
Column chromatography on Norit is a good enrichment method, whereby the activated carbon is preferably added with a filter aid, eg a filter aid, to increase the running speed of the eluent.
B. Hyflo-Supercel or Celite (branded product) is diluted in a weight ratio of 1: 1 to 1: 2. Furthermore, the chromabogxaphy on cellulose columns is particularly suitable for the enrichment of the antibiotic. In this case, a mixture of butanol-methanol-water in a volume ratio of 4: 1: 2 serves as the eluent.
The antibiotic grisonomycin is obtained in the form of an antibiotic highly effective pale yellow powder, which is characterized by its solubility properties through paper chromatography, electrophoresis and its behavior towards coloring and precipitation reagents. The antibiotic grisonomycin is very soluble in water.
It also dissolves: in mixtures of water and never their alcohols, in phenol and in mixtures of phenol with organic solvents. It is insoluble in common organic solvents, especially lipoid solvents. The paper chromatographic behavior of the antibiotic grisonomycin on Whatman no. 1 paper compares with streptomycin sulfate (1), ristocetin A (2)
and ristocetin B (3) from the following table:
EMI0004.0022
<U> Rf value </U>
<tb> Solvent Gerrisch
<tb> <U> Grisonomycin <SEP> 1 <SEP> I </U> <SEP> 2 <SEP> I <SEP> 3
<tb> A <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> B <SEP> 0 <SEP> 0.12 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> C <SEP> 0.15 <SEP> 0.25 <SEP> 0.22 <SEP> 0.19
<tb> D <SEP> 0.52 <SEP> 0.61 <SEP> 0.53 <SEP> 0.24
<tb> E <SEP> 5.15 <SEP> 1 <SEP> 5.15 <SEP> 11.4
<tb> F <SEP> 0.65 <SEP> 0.07 <SEP> 0.69 <SEP> 0.69
<tb> G <SEP> 0.92 <SEP> 0.13 <SEP> 0.41 <SEP> 0.25
<tb> H <SEP> 0.90 <SEP> 0.29 <SEP> 0.38 <SEP> 0.17
<tb> <B> 1 </B> <SEP> 0.11 <SEP> 0.15 <SEP> 0.05 <SEP> j <SEP> 0,
25 A = butanol saturated with water B = butanol saturated with water;
2% p-toluenesulfonic acid C = 80% aqueous ethanol, containing 1.5% sodium chloride on Whatman no. 4-paper impregnated with 0.95m sodium sulfate and 0.05m sodium hydrogen sulfate (NaHS04 - H20)
D = 80% aqueous methanol, containing 1.5% sodium chloride E = butanol-methanol-water 3 <B> 14: </B> 1: 2 F = butanol = ethanol-water 1: 1:
2 G = water, saturated with methyl iso # butyl ketone H = 75 0 / a water + 25% of a mixture of 3 parts of methanol and 1 part of acetone, brought to pH 10.5 with ammonia and adjusted to pH 7.5 with phosphoric acid I = secondary butanol, saturated with water + 0,
2 0/0 trichloroacetic acid (In the case of the solvent system E it is a continuous chromatogram. In this case, the numbers given mean that.
Ratio of the distance traveled by the antibiotic to the distance traveled by streptomycin sulfate.) The antibiotic grisonomycin behaves similarly to grisein in terms of paper chromatography. However, grisein migrates faster than grisonomycin in most systems, e.g. B. in the system butanol-glacial acetic acid-water (4: 1: 5) by a factor of 1.4: in system C by a factor of 1.3.
When electrophoresed to Whatman no. 1 paper, the antibiotic grisonomycin migrates to the cathode in a 0.03 molar potassium-sodium-phosphate buffer of pH 5.5 at a voltage of 110 volts for 5 hours by 4.2 cm. Under the same conditions, streptomycin sulfate and ristocetin A and ristocetin B show migration distances of 8.3 and 5.0 and 3.9 cm, respectively.
In a 0.2 molar borate buffer of pH 8.13, the antibiotic grisonomycin migrates 2.9 cm towards the cathode under otherwise identical conditions. Streptomycin or the ristocetins A and B migrate in this case by 6.7 and 3.4 cm in the same direction.
The antibiotic grisonomycin gives out from a 10% aqueous; neutral solution with the dropwise addition of a saturated aqueous solution of picric acid, ammonium pure naculate, helianthin or a saturated solution of picrolonic acid in 900% alcohol no precipitation,
in the case of helianthin, at most a slight cloudiness. The Sackagu.chi, Maltol, Elson-Morgan, Biuret and Benedict tests are also negative.
The antibiotic grisonomycin differs from the antibiotics streptomycin, rhodomycetin, aesidion, streptocin, grisein and candicidin also produced by representatives of the species Streptomyces griseus in its solubility properties, its own color, the color reactions and its paper chromatographic behavior.
The antibiotic grisonomycin is highly effective against various microorganisms. If the in vitro dilution series (powers of ten) in glucose broth is used as a test method, the following inhibitory concentrations result after 2 hours of incubation at 37 with the various test organisms.
EMI0005.0001
Inhibitory
<tb> test organisms <SEP> concentration
<tb>, ag / cms
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var.
<SEP> aureus <SEP> 1
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 1
<tb> Streptococcus <SEP> viridians <SEP> 1
<tb> Corynebacterium <SEP> diphteriae <SEP> 1
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 1
<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> streptomycin-resistant <SEP> 1
<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> chloromycetin-resistant <SEP> 1
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 1
<tb> Pseuäomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 1
<tb> Klebsiella <SEP> Type <SEP> A <SEP> 1
<tb> Pasteurella <SEP> pestis <SEP> 1
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 1
<tb> Endomyces <SEP> albicans <SEP> 1 If the plate test method with paper discs with a diameter of 6 mm is used for testing in vitro,
the following inhibition zones are obtained with a 1 0 / own solution of the antibiotic grisonomycin:
EMI0005.0010
Test organisms <SEP> inhibition zone
<tb> in <SEP> mm
<tb> Mierococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var <SEP> aureus <SEP> 21
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus
<tb> Penicillin-resistant <SEP> 20
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 18
<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> streptomycin-resistant <SEP> 18
<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> Chl'oromycetin <SEP> resistant <SEP> 18
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 12
<tb> Klebsiella <SEP> Type <SEP> A <SEP> 17
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 19 The antibiotic grisonomycin is also effective in vivo.
After two subcutaneous applications of 20 mg / kg to mice infected with Klebsiena type A, 1009 / o survivors were observed. These doses are from uninfected mice; endure without harm.
The antibiotic grisonomycin or its Deri derivatives can be used as a remedy, e.g. B. in the form of pharmaceutical preparations, use. These contain the compounds mentioned in a mixture with a pharmaceutical, organic or inorganic carrier material suitable for enteral, parenteral or local application. For the same substances come into question that do not react with the new compounds conditions, such as. B.
Gelatine, milk sugar, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohol, gum, palyalkylene glycols, vase line, cholesterol or other known drug carriers. The pharmaceutical preparations can e.g. B.
as tablets, coated tablets, powders, ointments, creams, sup positorien or in liquid form as solutions, suspensions or emulsions. If necessary, they are sterilized and / or contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers. They can also contain other therapeutically valuable substances.
<I> Example 1 </I> The cultivation of Streptomyces A 10 073 is carried out according to the submerged method. A nutrient solution is used which contains 20 g of distillers solubles, 20 g of malt extract, 1 g of sodium nitrate and 5 g of sodium chloride per liter of tap water. The nutrient solution is sterilized in the inoculation flask or in the fermenters for 20-30 minutes at 1 atm.
The sterilized nutrient solution shows a pH of 7.5 to 8.0. Inoculation takes place with Abis to 10% of a partially sporulating vegetative culture of the organism.
Incubate with good shaking or stirring at 27, with cultures in fermenters being aerated every minute with about 1 volume of sterile air per volume of solution :.
After 48-120 hours of incubation, the culture solution has the greatest inhibitory value against the test organisms (B. subtilis, Micrococcus pyogenes).
aureus, Escherichia coli, Kleb- siena). The mycelium and other solid components are separated from the solution containing the majority of the antibiotic by means of filtration or centrifugation,
where appropriate, about 1% of a filter aid, e.g. B. Hyflo Supercel is added.
The filter residues are washed with water and with aqueous methanol and the washing liquids are combined with the antibiotic: culture filtrate.
If, instead of the nutrient solution given above, those containing the following nutrients per liter of tap water are used, culture filtrates of similarly high antibiotic effectiveness are obtained after analogous cultivation and processing.
EMI0006.0055
a) <SEP> lactose <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Distillers <SEP> solubles <SEP> 20 <SEP> g
<tb> sodium chloride <SEP> 5 <SEP> g
<tb> sodium nitrate <SEP> 1 <SEP> g
<tb> b) <SEP> glucose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Distillers <SEP> solubles <SEP> 10 <SEP> g
<tb> sodium chloride <SEP> 5 <SEP> g
<tb> sodium nitrate <SEP> 1 <SEP> g
<tb> calcium carbonate <SEP> 10 <SEP> g
<tb> c) <SEP> Mannitol <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Distillers <SEP> solubles <SEP> 20 <SEP> g
<tb> sodium chloride <SEP> 3 <SEP> g
<tb> sodium nitrate <SEP> 1 <SEP> g
<tb> d) <SEP> Glycerin <SEP> 20 <SEP> g
<tb> soy flour <SEP> 10 <SEP> g
<tb> sodium chloride <SEP> 5 <SEP> g
<tb> sodium nitrate <SEP> 1 <SEP> g
<tb> calcium carbonate <SEP> 10 <SEP> g
<tb> e)
<SEP> Glucose <SEP> <B> 20 </B> <SEP> g
<tb> soy flour <SEP> 10 <SEP> g
<tb> sodium chloride <SEP> 5 <SEP> g
<tb> sodium nitrate <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Calcium carbonate <SEP> 10 <SEP> <B> g </B> <I> Example 2 </I> 7 1 of one obtained according to Example 1. Kulturfiltra tes are filtered through a 40 cm high layer of 700 ml Asmit at a flow rate of 4 liters per hour. The antibiotic is completely adsorbed. The column is then washed with 2 liters of water at a flow rate of 7 to 8 liters per hour and then washed
with a mixture of methanol-water-in hydrochloric acid in a volume ratio of <B> 75: 15: </B> 10. The eluent is collected in fractions of 1 liter. Fractions 2-4, which contain up to 80% of the antibiotic activity present in the culture filtrate, are combined (about 3 liters).
The hydrochloric acid present in the eluate is neutralized with dilute sodium hydroxide solution, whereby the required amount of sodium hydroxide solution is determined beforehand by titration of an aliquot part diluted with water to double the volume :. The neutral solution is concentrated to 200 ml on a rotary evaporator at 35 ° C. and then filtered through a paper filter and washed with a little water. The crude Antibioti kum in the form of a brown powder is obtained from the filtrate by freeze-drying. The yield is about 7 g per liter of culture filtrate.
<I> Example 3 </I> 100 l of the culture filter obtained according to Example 1 are stirred with 2 kg of Norit for 1 hour, the entire antibiotic activity being adsorbed on the activated carbon. The latter is, advantageously with the addition of a Filtri-erhil: fsmittel such. B. Hyflo Supercel, separated and then washed three times with 20 l of distilled water each time, each time being mechanically stirred for 30 minutes and then filtered. The washing solution is antibiotic inactive.
The charcoal is then mixed with 20 l of an aqueous 30% solution of alcohol for 30 minutes. stirred and again separated off by filtration.
This operation is mixed with 20 liters and then repeated with 10 liters of 30% alcohol. The combined aqueous alcoholic filtrates contain 0.5-0.6 g of dry matter per liter with only low antibiotic activity.
The activated charcoal is now determined in the same way with 3 servings (2 X 20 1, 1 X 101) of 60% alcohol. These eluates contain great antibiotic activity. They are combined and concentrated to a small volume in a thin film evaporator at a maximum of 30.
The concentrated aqueous solution obtained in this way is poured into five times the volume of acetone, the antibiotic grisonomycin predominantly being precipitated as a massy yellow powder. After standing at 0 for several hours, the supernatant solution is separated off from the residue by decanting and the residue is washed with dry methanol. The remaining residue is dried thoroughly in vacuo.
This gives 7-8 g of the crude antibiotic grisonomycin in the form of a mass yellow powder (fraction 1). The combined acetone and methanol solutions contain a further 12-13 g of substance, which is isolated by removing the solvent in vacuo. It has a smaller specific antibiotic activity (fraction 2).
<I> Example 4 </I> 1 <B> 1 </B> of a culture filtrate obtained according to Example 1 is stirred with 15 g of Norit for 1 hour. The activated carbon is filtered, advantageously with the addition of filter aids, such as. B. Hyflo Supercel, separated from the antibiotic inactive solution.
The activated charcoal is washed by shaking with 200 ml of water for half an hour and then filtered off. It is washed in the same way with 200 ml of 30% methanol and the charcoal is then sucked off sharply on a glass suction filter. The washing liquids are antibiotically inactive.
The carbon adsorbate washed in this way is eluted by shaking for one hour with 200 ml of a mixture of butanol-methanol-water in a volume ratio of 2: 1: 2. The dark colored solution freed from the charcoal by filtration contains about 70% of the antibiotic activity present in the culture filtrate.
The solution is shaken with 100 ml of n-butyl acetate. The two phases that are separated out are separated. The aqueous, dark-colored phase of 140 ml contains practically all of the antibiotic activity present in the eluate and is then subjected to freeze-drying. The raw antibiotic grisonomycin is obtained as a dark yellow powder. Yield: 0.93 g.
<I> Example 5 </I> 15 g of a carbon adsorbate obtained according to Example 4 and washed with water and 30% methanol are mixed with 200 ml of a mixture of butanol-methanol-pyridine-water in a volume ratio of 2: 1: Shaken 1: 2 for 1 hour.
The dark colored eluate freed from the charcoal by filtration through a glass suction filter contains up to 80% of the antibiotic activity present in the culture filtrate. The solution is shaken with 100 ml of n-butyl acetate.
The excreted aqueous phase of about 110 ml containing the anti-biotic activity is concentrated to a small volume on a rotary evaporator at 35. The crude antibiotic grisonomycin is obtained from this concentrated solution by freeze-drying in the form of 1.01 g of a brown-yellow powder.
<I> Example 6 </I> 5 g of an antibiotic concentrate obtained according to Example 3 (fraction 2) are chromatographed on a 5.5 cm high column of a mixture of 10 g Norit and 20 g Hyflo Supercel, the substance being in the form of a 10% aqueous solution is applied to the column.
There are fractions too? Liters collected :. Fractions 1-6, which are eluted with water, are evaporated and contain 4.3 g of antibiotic inactive material. From fractions 7-10, which are eluted with 10% alcohol, 155 mg of dry substance are obtained, which is likewise ineffective in terms of antibiotics.
Fractions 11-14, eluted with 301% alcohol., And Fraction 15, eluted with 2 1 60 19% alcohol, together contain 140 mg of the enriched antibiotic grisonomycin, which is obtained from the solutions by concentrating on a rotary evaporator 35 and is obtained by subsequent freeze-drying in the form of a beige powder.
Example <I> 7 </I> 10 g of an antibiotic concentrate obtained according to Example 3 (fraction 2) are dissolved in 100 ml of water and mixed with 5 g of crystalline helianthin (orange 111, sodium salt of the 4 '-Dimethylamino-azobenzene4-sulfonic acid).
The slurry is stirred vigorously for 1 hour on a vibromixer and then filtered through 10 g of Hyflo Supercel. The filtrate is freed from excess helianthin by means of a passage through 50 ml Amberlite IRA400 in the chloride ion form.
The ion exchanger is washed with 200 ml of water and the filtrate combined with the washing liquid is concentrated in vacuo at 35 to a small volume. The concentrated antibiotic is obtained from the concentrated solution compared to the starting material by freeze-drying in the form; a powder (6 g). The Helianthatgelnisch contained in the filtered residue contains a small amount of an antibiotic substance whose biological spectrum of activity differs from that of the antibiotic Gris.onomycin.
<I> Example 8 </I> 8.1 g of an antibiotic preparation obtained according to Example 3 (fraction 1) are chromatographed on 647 g of ash-free Whatman Standard Grade cellulose powder. For this purpose, the cellulose powder is poured into a glass column in portions and pressed in as hard as possible with a stainless steel plug that fits exactly into the column.
so that each layer is about 5 cm high. The result is a homogeneous cellulose column 70 cm high and 5.5 cm in diameter. This is done for 2 x 24 hours at a flow rate of 70 ml per hour with a mixture of butanol-methanol-water in a volume ratio of 4:
Washed 1: 2. The substance to be chromatographed is dissolved in 100 ml of water and mixed with 50 ml of methanol and 50 ml of butanol.
Before this solution can be applied to the column, the column is acclimatized, that is, small portions of the butanol-methanol-water mixture with decreasing butanol content are applied to the column in such a way that a new portion is straight ahead while avoiding turbulence then applies when the previous portion has completely seeped into the cellulose.
There are applied there with 20 ml of butanol-methanol: what: s, he mixture 3: 1: 2, 20 ml mixture 2: 1: 2 and 20 ml mixture 1: 1: 2. Then the 200 ml of the solution is allowed to seep into the column and then small portions of the butanol-methanol-water mixture are started to be applied with increasing butanol content. To this end, 10 ml of the "mixture" 11 / ": 1: 2, 20 ml; the mixture 2: 1: 2 and 20 ml of the mixture 3: 1: 2 are used.
The column is then developed with the mixture 4: 1: 2. Fractions of 135-140 ml. Are collected. Each antibiotic active fraction is mixed with 50 ml of ether and shaken out three times with 20 ml of water. The combined aqueous phases are washed by shaking with 50 ml of ether and then obtained in the form of a beige powder by freeze-drying. Fractions 7-26 contain antibiotic material, where the maximum activity is present in fractions 11-20.
These are combined and you get 1.45 g of the enriched antibiotic grisonomycin.
<I> Example 9 </I> 780 mg of an enriched antibiotic concentrate obtained according to Example 8 are chromatographed on 154 g of Whatman Standard Grade ashless cellulose powder. According to the procedure given in Example 8, a cellulose column 62 cm high is obtained in a chromatogram tube with an internal diameter of 3 cm.
This is for 4 x 24 hours at a flow rate of 20 ml per hour with a mixture of. Washed butanol-methanoli-water in a volume ratio of 4: 1: 2. The substance is dissolved in 5 ml of water, and 2.5 ml of methanol and 4 ml of butanol are added. Before applying the solution, the column is acclimatized as indicated in Example 8, with 2 ml of mixture 3: 1: 2, with 2 ml of mixture 2: 1: 2 and finally with 2 ml of mixture <B> 1.6 : </B> 1: 2.
The solution is then applied and the cellulose column is charged with 2 ml portions of the butanol-methanol-water mixtures 2: 1: 2, 21/2: 1: 2, 3: 1: 2 and 3 1/2: 1: 2 . The column is then developed with the 4: 1: 2 mixture at a constant temperature of 25. Fractions of 40 ml each are collected. The antibiotic active fractions 14-33 are shaken individually with 50 ml of ether-chloroform (4: 1). The aqueous phase separated out, which contains the antibiotic activity, is separated off and the organic phase is shaken twice with 5 ml of water.
The combined aqueous phases (approx. 20 ml) are washed with 20 ml of ether-chloroform (4: 1) and transferred to mass yellow powder by freeze-drying. Fractions 19-21 are the most effective antibiotics. They are combined and you get a total of 75 mg of the pure antibiotic grisonomycin, which, compared to the material present in the culture filtrate, has an antibiotic activity that is about 300 times higher. The pure antibiotic grisonomycin dissolves very easily in water.
It is sparingly to insoluble in organic solvents, especially lipoid solvents. In terms of paper chromatography, it behaves uniformly in the solvent mixtures A-I (see table in the description) and also differs in these systems from other known water-soluble antibiotics, such as.
B. streptomycin, neomycin, ristocetin A and B and viomycin. The antibiotic grisomycin cannot be precipitated from neutral, concentrated aqueous solutions with picric acid, helianthin, ammonium pure naculate and picrolonic acid. It is not adsorbed from such solutions by weakly acidic or weakly basic ion exchangers.
There is no color reaction according to Sackaguchi, Ehrlich, Bened'ict and Elson-Morgan. The biuret reaction is negative.
<I> Example 10 </I> 10 g of an antibiotic preparation obtained according to Example 4 are dissolved in 100 ml of water and adjusted to a pH of approximately 1 with 5N hydrochloric acid. This solution is extracted twice with <B> 100 </B> ml of a mixture of: 100 g of phenol in 100 ml of chloroform. The organic extract contains little antibiotic activity and is discarded.
The aqueous solution is brought to pH 6.5 by adding solid potassium bicarbonate and extracted in 3 portions with a total of 150 ml of a solution of 300 g of phenol in 1 liter of chloroform. The aqueous raffinate is discarded.
The phenol chloroform extract is filtered through a small layer of Celite and the filtrate is extracted three times with 20 ml of 1/10 N hydrochloric acid. The hydrochloric acid extract, in which the antibiotic is located, is adjusted to pH 2 and extracted in 6 portions with a total of 100 ml of a mixture of 100 g of phenol in 100 ml of chloroform.
The phenol extract is filtered again through Celite, mixed with 50 ml of water, 300 ml of ether and 300 ml of petroleum ether and shaken well. After the aqueous phase has been separated off, the organic phase is washed several times with small portions of water. The combined aqueous phases are shaken several times with ether to remove the phenol and then lyophilized. 85 mg of a beige powder of high antibiotic activity are obtained.