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Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues, wasserlösliches, basische Eigenschaften aufweisendes Antibiotikum, das im folgenden mit Lemacidin bezeichnet wird, seine Komponenten Bl, B2 und BS, ihre Salze sowie pharmazeutische Präparate, welche diese Verbindungen enthalten, und Verfahren zur Herstellung dieser Substanzen und Substanzgemische.
Das Antibiotikum Lemacidin entsteht bei der Kultur eines Actinomyceten der Art Streptomyces venezuelae Ehrlich et al.. Stamm A 9692. Dieser Stamm wurde aus einer bei Roche, Kanton Waadt (Schweiz) gesammelten Bodenprobe isoliert und wird in unseren Laboratorien sowie in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter dieser Bezeichnung aufbewahrt.
Streptomyces venezuelae A 9692 bildet ein rosa bis zimtbraunes Luftmycel und trägt Konidienketten, die ein typisches Merkmal der Gattung Streptomyces darstellen. Die Sporenketten sind steif, gerade oder leicht gewellt ; Spiral-oder Quirlbildung konnte nie beobachtet werden. Die einzelnen Sporen sind glatt.
Es wird kein auffallendes Exopigment gebildet. Peptonhaltige Medien werden schwarzbraun melanoid verfärbt. Das Wachstum ist relativ wenig temperaturabhängig, sowohl bei 180 als auch bei 400 entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 320.
Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum des Stammes A 9692 auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien 1 - 7 und 10 werden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. 17,361 (1952) hergestellt.
1) Synthetischer Agar : Wachstum dünn, schleierartig, hellgelb, Luftmycel sammetig, blasskarmin.
2) Synthetische Lösung : Wachstum spärlich. Sediment, Flocken, hellgelb.
3) Glukose-Agar : Wachstum dünn, schleierartig, hellbraun. Luftmycel fehlt. Substrat dunkelbraun.
4) Glukose-Asparagin-Agar : Wachstum dünn, schleierartig, hellbraun. Luftmycel sammetig, anfangs kreideweiss, später zimtbraun.
5) Calciummalat-Agar : Wachstum spärlich, punktförmig, hellgelb. Luftmycel schneeweiss.
ss) Gelatinestich (180) : Wachstum oberflächlich, schleierartig, hellbraun. Substrat dunkelbraun. Verflüssigung nach 14 Tagen 1, 5 cm.
7) Stärkeplatte : Wachstum dünn, schleierartig, hellgelb. Luftmycel anfangs schneeweiss, später blasskarmin. Hydrolyse nach 10 Tagen 0, 9-1, 2 cm.
8) Kartoffeln : Wachstum sehr üppig, anfangs schleierartig und hellgelb, später runzelig und hellbraun. Luftmycel zimtbraun. Substrat dunkelbraun.
9) Karotten : Wachstum sehr spärlich, punktförmig, hellgelb. Luftmycel fehlt.
10) Lackmusmilch : Wachstum gut, Pellikula hellgelb. Substrat blau. Peptonisierung langsam. Koagu- lation gut.
Die morphologischen und physiologischen Merkmale des Stammes A 9692 sind diejenigen der Art Streptomyces venezuelae Ehrlich et al. Es ist bekannt, dass Streptomyces venezuelae ein Antibiotikum, nämlich das Chloromycetin, produziert (Ehrlich J., Barth Q. R., Smith R. M., Joslyn D. A. und Burkholder P. R., Science 106,417 [1947]). Dieses unterscheidet sich vom neuen Antibiotikum Lemacidin schon dadurch, dass es, im Gegensatz zu diesem, mittels organischen Lösungsmitteln aus dem Kulturfiltrat extrahiert werden kann und überdies keine basischen Eigenschaften besitzt.
Die vorliegende Erfindung ist, was die Herstellung des Antibiotikums Lemacidin anbelangt, nicht
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auf die Verwendung des Streptomyces venezuelae A 9692 oder anderer der Beschreibung entsprechender Stämme beschränkt, sondern betrifft auch die Verwendung von Varianten dieser Organismen, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett-oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen gewonnen werden.
Zur Erzeugung des Antibiotikums Lemacidin wird ein die Eigenschaften von Streptomyces venezuelae A 9692 aufweisender Streptomyceten-Stamm, in wässeriger, eine Kohlenstoff-und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthaltender Nährlösung aerob gezüchtet, bis diese eine wesentliche antibiotische Wirkung zeigt, und das Antibiotikum Lemacidin hierauf isoliert.
Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentem. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 400. Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 1 In-5 Tagen.
Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kommen z. B. Glukose, Saccharose, Laktose, Stärke, Mannit sowie Glyzerin in-Frage. Als stickstoffhaltige Nährstoffe und gegebenenfalls wachstumsfördernde Stoffe seien genannt : Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte wie Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destilla- tionsruckständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Soyapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze usw., aber auch Nitrate. Von andern anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten.
Das gemäss der vorliegenden Erfindung herstellbare Antibiotikum Lemacidin ist ein wasserlöslicher Stoff, der nach papierchromatographischen Untersuchungen aus etwa drei, wahrscheinlich nahe verwandten Verbindungen besteht. Es ist in organischen Lösungsmitteln, vor allem Lipoidlösungsmitteln, volkom- men unlöslich. Das Antibiotikum ist basisch und bildet Salze, die zum Teil, z. B. das Hydrochlorid, in gewissen organischen Lösungsmitteln, wie niederen aliphatischen Alkoholen, löslich sind. Das Antibiotitikum findet sich bei der Züchtung in wässerigen Medien fast vollständig in der Nährlösung, während das von dieser abgetrennte Mycel praktisch keine antibiotische Aktivität aufweist.
Gemäss diesen Eigenschaften kann man zwecks Gewinnung des Antibiotikums Lemacidin aus einer Kulturlösung dieses nicht mit organischen Lösungsmitteln extrahieren. Es lässt sich ihr dagegen bei neutraler oder schwach alkalischer Reaktion mit Adsorptionsmitteln entziehen und aus den Adsorbaten mit sau- ren, zweckmässig ein PH unter 4 aufweisenden Elutionsflüssigkeiten extrahieren. Als Adsorptionsmittel kommen einerseits Aktivkohle, z. B. Norit, anderseits Kationenaustauscher, namentlich solche, die Carb- oxylgruppen enthalten, wie z. B. das im Handel befindliche Austauscherharz AmberliteIRC-50, in Frage.
Wird Aktivkohle als Adsorptionsmittel verwendet, so eignen sich als Elutionsflüssigkeiten sowohl saure wässerige Lösungen als auch Säuren enthaltende, mit Wasser mischbare Lösungsmittel, wie niedere aliphatische Alkohole und Ketone. Eine Mischung von gleichen Volumenteilen Methanol und In-Ameisensäure hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen. Da ausser dem Antibiotikum von der Aktivkohle noch grössere Mengen, zum Teil gefärbte Verunreinigungen aus der Kulturlösung adsorbiert werden, wäscht man die Adsorptionskolonne vor der Elution des Antibiotikums bei sonst unveränderten Bedingungen vorteilhaft mit Äthanol, wobei ein grosser Teil der Begleitstoffe entfernt, das Antibiotikum jedoch nicht extrahiert wird.
Aus dem sauren Eluat lässt sich ein stark angereichertes Präparat des Antibiotikums in Form eines weissen Pulvers gewinnen, indem man das Eluat im Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert, wobei das organische Lösungsmittel sowie die Hauptmenge der Ameisensäure entfernt werden, und hierauf das wässerige Konzentrat, vorteilhaft nach Verdünnung mit 4-5 Volumen Methanol, mit Aceton versetzt, die entstandene Fällung mit diesem Lösungsmittel wäscht und zuletzt trocknet. Da das Kohleeluat, besonders von Kulturen mit Calciumcarbonat enthaltenden Nährlösungen, erhebliche Mengen Ca-Ionen enthält, wird vor der Fällung des Antibiotikums aus dem Konzentrat das Calcium zweckmässig mit Oxalsäure ausgeschieden.
Zur Adsorption des Antibiotikums mit einem Kationenaustauscher wird dieser vorteilhaft in der HForm verwendet. Die Elution erfolgt mit verdünnter wässeriger Säure, gegebenenfalls nach Vorwaschung der Kolonne mit destilliertem Wasser, wobei inaktive Begleitstoffe eliminiert werden. Als Elutionsmittel ist besonders 0, 2n - Salzsäure geeignet. Das Antibiotikum ist im Eluat in Form eines Salzes enthalten. Kationenaustauscher-Eluate können als solche oder nach Konzentrierung im Vakuum, gegebenenfalls nach vorausgehender Neutralisierung, zur Herstellung weiter angereicherter präparate des Antibiotikums dienen.
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Zur Herstellung des reinen Antibiotikums Lemacidin aus durch Kohle- oder Ionenausta. u5cheradsorp- tion vorgereinigten Präparaten versetzt man ihre wässerige, auf ein PH von 6, 5- 7, eingestellte Lösung mit einem zur vollständigen Fällung gerade ausreichenden Volumen einer wässerigen Lösung des Salzes eines Sulfonsäuregruppen enthaltenden Azofarbstoffes und isoliert das entstandene schwerlösliche Farbstoffsalz des Antibiotikums. Verwendet man als Azofarbstoffsalz das unter der Bezeichnung Helianthin oder Orange III im Handel befindliche Natriumsalz der 4'-Dimethylamino-azobenzol-4-sulfonsäure, so scheidet sich das Farbstoffsalz (Helianthat) des Antibiotikums Lemacidin ganz oder teilweise in kristallsierter Form aus.
Das Helianthat des Antibiotikums kann aus Wasser oder Methanol oder Mischungen dieser, aber auch aus Formamid und Wasser umkristallisiert werden. Umkristallisiert stellt es makroskopisch ein rotbraunes Pulver dar. Unter dem Mikroskop betrachtet, bildet es gelbe, unregelmässig geformte geschichtete Plättchen oder auch Nadeln, die bei 202 - 2030 unter Zersetzung schmelzen.
Um das Antibiotikum aus dem Farbstoffsalz zurückzugewinnen, setzt man dieses in wässerigem oder alkoholischem Medium mit dem Salz aus einer anorganischen oder organischen Säure und einer organischen Base um, wobei sich das Salz des Antibiotikums der betreffenden Säure und das Farbstoffsalz der Base bilden. Verwendet man z. B. Triäthylaminsulfat zu dieser Umsetzung und führt sie mit einer wässe- rigen Suspension des Antibiotikum-Helianthates aus, so erhält man das in Wasser lösliche Sulfat des Antibiotikums sowie das unlösliche Helianthat des Triäthylamins. Durch Zusatz von genügend Methanol zur Reaktionslösung geht letzteres in Lösung, während sich das nur in Wasser lösliche, in niederen Alkoholen dagegen vollständig unlösliche Antibiotikum-Sulfat ausscheidet und z. B. mittels Filtration isoliert werden kann.
Die Umsetzung kann aber auch in alkoholischer oder wässerig-alkoholischer Lösung vorgenommen werden, wobei das Sulfat sofort ausfällt und von der Farbstofflösung abgetrennt werden kann. Das so erhaltene Sulfat des Antibiotikums Lemacidin stellt ein farbloses, in Wasser und Formamid leicht losli- ches, in organischen Lösungsmitteln wie Alkoholen und Ketonen dagegen unlösliches Pulver von hoher antibiotischer Wirksamkeit dar.
Aus dem Sulfat kann z. B. das Hydrochlorid des Antibiotikums durch Umsetzung in wässeriger Lösung mit Bariumchlorid und Isolierung aus der von Bariumsulfat befreiten Lösung als kaum gefärbtes, in Wasser sowie Methanol leicht, in Äthanol schwerer lösliches Pulver gewonnen werden. Anderseits ist es auch möglich. das Hydrochlorid direkt aus dem Helianthat des Antibiotikums herzustellen, indem man zur Lösung bzw. Suspension des letzteren in Methanol konzentrierte Salzsäure oder eine Lösung von gasförmiger Salzsäure in Methanol im Überschuss zusetzt, das gebildete Hydrochlorid mit Äther niederschlägt und isoliert.
Um geringe farbige Verunreinigungen aus dem nach diesen Methoden hergestellten Hydrochlorid zu entfernen, filtriert man dessen methanolische Lösung durch eine Kolonne von Aktivkohle, vorzugsweise von Gasruss, wobei das Hydrochlorid nach der Verdampfung des Lösungsmittels aus dem Filtrat als reinweisses Pulver erhalten wird, das sich beim sehr langsamen Verdunsten aus wässeriger oder methanolischer Lösung teilweise in kristalliner Form ausscheidet.
Die Herstellung des Antibiotikums Lemacidin in reiner Form kann auch in der Weise erfolgen, dass dieses aus wässerigen Lösungen mit einer organischen Säure, beispielsweise vom Typus der Pikrinsäure, wie Pikrinsäure selber oder Styphninsäure oder mitPikrolonsäure als schwerlösliches Salz gefällt wird. Das Pikrat und das Styphnat fallen zuerst in flüssiger Form, als ölige Tropfen aus, die beim Stehen bei Raumtemperatur allmählich fest werden ; sie konnten indessen bis jetzt nicht zur Kristallisation gebracht werden.
Im Unterschied dazu kann das Pikrolonat kristallisiert werden. Die gelben, zu Drusen vereinigten unregelmässigen Stäbchen schmelzen nach vorangehendem Sintern unter Zersetzung bei 202OC. Diese schwer- löslichen Salze können durch Behandlung mit Säuren, z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure, in wässerigem Medium oder in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Methanol oder Aceton, in das entsprechende Salz überführt und als solches isoliert werden. Nach diesem Anreicherungsverfahren kann das Antibiotikum z. B. aus dem über das Helianthat gereinigten Sulfat, aber auch aus den Eluaten der Kohle- sowie der Kationenaustauscheradsorbate gewonnen werden.
Ein weiteres kristallisiertes, in Wasser schwerlösliches Salz des Antibiotikums Lemacidin stellt das Reineckat dar, das in unregelmässigen Platten kristallisiert und einen Zersetzungspunkt von 198 bis 2000C aufweist.
Die freie Base des Antibiotikums Lemacidin ist leicht aus ihren Salzen zugänglich, aus dem Sulfat z. B. durch Umsetzung in wässerigem Medium mit Bariumhydroxyd, Neutralisierung des überschüssigen Baryts mit Kohlendioxyd sowie Abtrennung des Bariumkarbonats und-sulfat-Niederschlags und Isolierung der Antibiotikum-Base mittels Gefriertrocknung. Einfacher erfolgt die Herstellung aus den Salzen unter Verwendung eines stark basischen Anionenaustauschers, z. B. der OH-Form des unter der Bezeichnung Dowex-2 im Handel befindlichen Produktes.
Das Antibiotikum Lemacidin ist eine farblose, amorphe Base, die in Wasser und wässerigen Medien
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leicht löslich, in organischen Lösungsmitteln dagegen unlöslich ist. Die wässerige Lösung der Base reagiert alkalisch. Eine 1'%-Lösung eines mittels Ionenaustauscher hergestellten Präparates zeigt ein PH von 8,6.
Mit Säuren bildet das Antibiotikum Lemacidin Salze, von denen z. B. das farblose Sulfat und Hydrochlorid in Wasser sehr leicht löslich sind. Das Hydrochlorid löst sich ausserdem in niederen aliphatischen Alkoholen, besonders in Methanol.
Beim sehr langsamen Verdunsten wässeriger oder methanolischer Lösungen kann das Hydrochlorid des Antibiotikums in kristalliner Form erhalten werden. Es hat folgende Elementarzusammensetzung : C = 37, 3%,
EMI4.1
0%, N=16, 8%, 0=20, 8% (her.), Cl=18, l%, [ (x] p =+24, 4 (c= 1, 0wässerigen als auch in alkoholischen Medien schwer löslich. Aus solchen heiss gesättigten Lösungen scheidet es sich in unter dem Mikroskop gelb gefärbten, unregelmässig geformten, geschichteten Blättchen, auch Nadeln, ab, die nach der Umkristallisation einen Zersetzungspunkt von 202 bis 2030 zeigen.
Andere Salze des Antibiotikums Lemacidin leiten sich ab z. B. von der Essigsäure, Palmitinsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Pantothensäure, Ascorbinsäure oder Aminosäuren, wie Leucin und Methionin.
Das Hydrochlorid des Antibiotikums Lemacidin gibt eine positive Ninhydrin-, schwach positive Biuret- sowie Elson-Morgan-Reaktion, während der Maltol-und Sakaguchi-Test negativ ausfällt. Wie die vergleichende papierchromatographische Untersuchung ergibt, ist es verschieden von den bekannten wasserlöslichen, farblosen, gegen grampositive und gramnegative Bakterien wirksamen Antibiotika.
Das Hydrochlorid des Antibiotikums Lemacidin kann mittels Papierchromatographie in drei, wahrscheinlich nahe verwandte Komponenten Bl, B2 und B3 aufgetrennt werden. Verwendet man z. B. als Lösungsmittelsystem eine Mischung von 3 Teilen Äthanol und 1 Teil Wasser, die 2% Natriumchlorid enthält, und setzt man den Rf-Wert (= RB) der am schnellsten laufenden Komponente B3 (Bezugssubstanz) gleich 1, so ergeben sich für die zwei andern Komponenten B1 und B2 RB-Werte von 0,34 bzw. 0,61.
Das Antibiotikum Lemacidin besitzt eine hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Testorganismen. Verwendet man als Testmethode in vitro Verdünnungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei 370 bebrütet werden, so ergeben sich folgende noch hemmende Konzentrationen :
EMI4.2
<tb>
<tb> Testorganismen <SEP> Hemmende <SEP> Konzentration <SEP> jug/cmS <SEP>
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes. <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 10 <SEP>
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> Penicillin-resistent <SEP> 10
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 10
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 10
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 1
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 1
<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> Streptomycin-resistent <SEP> 10
<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> Chloromycetin-resistent <SEP> 10
<tb> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 10
<tb> Salmonella <SEP> schottmuelleri <SEP> l <SEP>
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 10
<tb>
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EMI5.1
<tb>
<tb> Testorganismen <SEP> Hemmende <SEP> Konzentration <SEP> pg/cmt
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 1
<tb> Klebsiella <SEP> typ.
<SEP> A <SEP> 10
<tb> Pasteurella <SEP> pestis <SEP> 1
<tb> Vibrio <SEP> cholerae <SEP> el <SEP> Tor <SEP> 10
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 10
<tb> Candida <SEP> vulgaris <SEP> 10
<tb> Endomyces <SEP> albicans <SEP> 10
<tb>
In vivo ist das Antibiotikum Lemacidin ebenfalls wirksam. Bei fünfmaliger subkutaner Verabreichung von 1 mg/kg an mit Micrococcus pyogenes var. aureus infizierte Mäuse werden 1000/0 Überlebende beobachtet. Bei gleicher Applikation von 5 mg/kg zeigt sich eine ähnliche Wirkung bei Mäusen, die mit Escherichia coli, ebenso ein Effekt bei solchen, die mit Salmonella typhi murium infiziert sind.
Das Antibiotikum Lemacidin weist zwar eine gewisse Toxizität auf. immerhin wird z. B. die subkutane Applikation von 50 mg Antibiotikum Hydrochlorid/kg von Mäusen verhältnismässig gut vertragen.
Das Sulfat und das Pantothenat sind etwas weniger, das Salz der L (+)-Ascorbinsäure sowie die Salze der Aminosäuren L (-)-Leucin und L (-)-Methionin bedeutend weniger toxisch als das Hydrochlorid.
Das Antibiotikum, seine Komponenten Bl, B2 und B3 und ihre Salze können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.
Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, ohne dass damit eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel 1 : Die Züchtung des Streptomyces A 9692 wird nach dem Submersverfahren durchgeführt. Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser folgende Zusatzstoffe enthält :
EMI5.2
<tb>
<tb> Glyzerin <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Soyamehl <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumnitrat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
Die Nährlösung wird in den Impfkolben oder in den Fermentem während 20 - 30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Die sterilisierte Nährlösung zeigt ein PH von 7, 0 bis 7,5. Die Animpfung erfolgt mit bis zu 100/0 einer teilweise sporulierenden vegetativen Kultur des Organismus.
Man inkubiert unter gutem Schüt-
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teln oder Rühren bei 21-2*70, wobei Kulturen in Fermentem mit zirka 1 Volumen steriler Luft pro Volumen Lösung in der Minute belüftet werden ; nach 30 - 50 Stunden Bebrütung hat die Kulturlösung den grössten Hemmwert gegenüber den Testorganismen (B. megatherium, Esch. coli, Candida vulgaris) erreicht. Man unterbricht die Kultur und trennt das nur schwach aktive Mycel sowie andere feste Bestandteile von der das Antibiotikum enthaltenden Lösung mittels Filtration oder Zentrifugation ab, wobei gegebenenfalls der Kulturlösung vor der Filtration etwa 1% eines Filterhilfsmittels, z. B. Hyflo Supercel, zugesetzt wird.
Das PH des Kulturfiltrates ist in der Regel im Vergleich mit der sterilisierten Nährlösung nicht oder nur wenig verändert.
Verwendet man an Stelle der oben angegebenen Nährlösung solche, die pro Liter Leitungswasser die unter a) bis g) angeführten Mischungen von Nährstoffen aufweisen, so erhält man nach analoger Züchtung und Aufarbeitung Kulturfiltrate von ähnlich hoher antibiotische Wirksamkeit. Anstatt durch einen Zusatz von Hyflo Supercel oder eines andern solchen Filterhilfsmittels kann man eine rasche Filtration der Kulturlösung auch dadurch erzielen, dass man diese vor der Filtration mit Salzsäure auf PH 5 und hierauf durch Zugabe einer wässerigen Lösung von Aluminiumsulfat auf eine Konzentration von 0, 5% dieses Salzes einstellt.
Nährstoffmischungen mit folgenden Zusatzstoffen pro Liter Wasser sind ebenfalls geeignet :
EMI6.1
<tb>
<tb> a) <SEP> Glukose <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> Soyamehl <SEP> 40 <SEP> g <SEP>
<tb> Distiller's <SEP> Solubles <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 10 <SEP> g
<tb> b) <SEP> Glukose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Soyamehl <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Corn <SEP> steep <SEP> liquor <SEP> 20 <SEP> g
<tb> (Maisquellwasser)
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5g
<tb> Natriumnitrat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> c) <SEP> Glukose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Pepton <SEP> 5g
<tb> Fleischextrakt <SEP> 3 <SEP> g <SEP>
<tb> (Oxo <SEP> Lab <SEP> Lemco)
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 10 <SEP> g
<tb> d)
<SEP> Glukose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Distiller's <SEP> Solubles <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumnitrat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 10 <SEP> g
<tb> e) <SEP> Mannit <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> Distiller's <SEP> Solubles <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 3 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumnitrat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> f) <SEP> Malzextrakt <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Distiller's <SEP> Solubles <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumnitrat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb>
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EMI7.1
<tb>
<tb> g) <SEP> Laktose <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> Distiller's <SEP> Solubles <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumnitrat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb>
Ein gemäss den obigen Angaben gewonnenes Filtrat bzw.
Zentrifugat einer Kultur des Streptomyces A 9692 weist in der Regel ein PH von 7,0 bis 7, 5 auf. Wenn dies nicht der Fall ist, wird für die folgende Anreicherung des neuen Antibiotikums das PH mit Hilfe von 10n-Natronlauge auf diesen Wert eingestellt. Das schwach alkalische Filtrat wird hierauf zwecks Adsorption des Antibiotikums mit 1% Aktivkohle (Norit) versetzt und die Masse während 1 Stunde mechanisch gerührt, wobei die gesamte antiblotisch wirksame Substanz von der Kohle aufgenommen wird. Letztere wird durch Filtration, vorteilhaft unter Zugabe von etwas Filterhilfsmittel, wie z. B. Hyflo Supercel, von der vollständig inaktiven, fast wasserhellen Lösung abgetrennt.
Ausser dem Antibiotikum werden von der Kohle noch grosse Mengen anderer organischer, antibiotisch unwirksamer Stoffe, vor allem stark gefärbte Abbauprodukte aus der Nährlösung, aber auch anorganische Salze adsorbiert. Diese Begleitstoffe werden vorteilhaft vor der Elution des Antibiotikums aus der Kohle entfernt. Dazu wird die abfiltrierte, noch feuchte Kohlemasse in die 5-fache Menge 95% Äthanol eingetragen und die Suspension 1/2 Stunde gerührt. Die so vorgewaschene Kohle lässt sich durch Filtration leicht von der Waschflüssigkeit abtrennen. Das braun gefärbte Filtrat zeigt keine antibiotische Wirksamkeit.
Die Elution des neuen Antibiotikums erfolgt mit angesäuertem wässerigem Methanol, zweckmässig mit einer Mischung von gleichen Volumteilen Methanol und In-Ameisensäure, wobei auf 1 g Adsorptionsmittel 2 cm S Elutionsflüssigkeit zur Anwendung kommen. Die Suspension wird 1/2 Stunde mechanisch gut gerührt, dann filtriert, worauf der Kohlerückstand noch 3mal in gleicher Weise extrahiert wird.
Die Eluate, von denen nur das erste schwach gelblich gefärbt, die übrigen farblos sind, zeigen die gesamte antibiotische Aktivität. Sie werden vereinigt und im Vakuum bei niedriger Badtemperatur, z. B. bei 40-600, auf 1/100 des ursprünglichen Volumens eingeengt, wobei ausser dem Methanol. und viel Wasser auch der grösste Teil der Ameisensäure entfernt wird. Das PH des gelblich gefärbten, jedoch dünnflüssigen Konzentrats ist in der Regel um 4.
Das Konzentrat enthält, besonders wenn die Kultur nach Absatz 1 oder nach a) bis d) durchgeführt wurde, grössere Mengen Calcium. Man entfernt dieses in Form des schwerlöslichen Oxalats, indem man dem Konzentrat unter Rühren eine 10% wässerige Oxalsäurelösung zusetzt. Die für die vollständige Fällung erforderliche Menge Oxalsäurelösung wird in einem aliquoten Teil genau bestimmt. Für Konzentrate aus Kulturen mit Calciumcarbonat werden in der Regel zwischen 300 - 500 cmS Oxalsäurelösung pro Liter Konzentrat benötigt, entsprechend 3-5 cm ! pro Liter ursprüngliches Kulturfiltrat, während Konzentrate aus Kulturlösungen ohne Calciumcarbonatzusatz weniger erfordern.
Aus dem von Calcium befreiten Konzentrat wird das Antibiotikum in Form eines stark angereicherten, weissen Pulvers gewonnen, indem man das wässerige Konzentrat zunächst mit 4-5 Volumen Methanol verdünnt und hierauf das aktive Material mit 20 Volumen Aceton ausfällt. Der Niederschlag wird abfiltriert, zweimal mit Aceton gewaschen und zuletzt im Vakuum von den Lösungsmittelresten befreit. Man erhält ein reinweisses Pulver, das nahezu die gesamte antibiotische Aktivität des Kulturfiltrates zeigt.
Die Ausbeute beträgt zirka 300 mg pro Liter Kulturfiltrat.
Beispiel 2 : Eine bedeutend stärkere Anreicherung des Antibiotikums Lemacidin als nach der in Beispiel 1 beschriebenen Acetonfällung lässt sich über die Darstellung von dessen kristallisiertem Helianthin-Salz erzielen. Hiezu wird das nachBeispiel1 gewonnenecalciumfreie Konzentrat mit2 Volumen Was- ser verdünnt, das PH der Lösung mit 10n-Natronlauge auf PH 6, 7 - 7, 0 eingestellt und unter kräftigem Rühren und in dünnem Strahl das zur vollständigen Fällung erforderliche Volumen einer nahezu gesättigten wässerigen Lösung von Helianthin, enthaltend 3,5 g Helianthin (Orange III, Natriumsalz der 4'-Dimethylamino-azobenzol-4-sulfonsäure) im Liter, zugegeben, wobei die Fällungslösung vorteilhaft direkt in die Antibiotikumlösung eingeleitet wird.
Das zur vollständigen Fällung benötigte Volumen der Helianthinlösung wird in einem Vorversuch mit einem aliquoten. Teil ermittelt. Es variiert je nach dem Antibiotikumgehalt in der Regel zwischen der 20 - 100fachen Menge des angewendeten, unverdünnten Konzentrats. Das sich bildende Helianthat (Helianthin-Salz des Antibiotikums) fällt zum grössten Teil in kristallisiertem Zustand, in der Form von dünnen Plättchen, auch Nadeln, aus. Man lässt die Fällungslösung einige Stunden bei tiefer Temperatur, um 00, stehen, wobei sich der Niederschlag vollständig absetzt. Hierauf wird die Hauptmenge der klaren überstehenden Lösung durch Dekantieren, der Rest mit Hilfe der
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Zentrifuge vom Niederschlag abgetrennt.
Dieser wird zwecks Waschung einmal mit etwa der gleichen Menge eiskaltem Wasser verrührt und hierauf mit Hilfe der Nutsche isoliert. Die Waschung wird zweimal in gleicher Weise, doch mit Aceton, wiederholt. Das so gewaschene Helianthat des neuen Antibiotikums wird im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt zwischen 100 und 180 mg Helianthat/cmS Konzentrat. Das Trockenprodukt stellt ein rotbraunes Pulver dar ; es ist in Wasser sowie in Methanol ziemlich schwer löslich, leichter dagegen in Formamid, aber unlöslich oder sehr wenig löslich in Lipoidlösungsmitteln, wie Aceton, Äther, Benzol, Chloroform u. a.
Es kann sowohl aus Wasser sowie Methanol, als auch aus Mischungen dieser Lösungsmittel umkristallisiert werden, wobei es in unter dem Mikroskop gelben, unregelmässig geformten, geschichteten Plättchen anfällt, die bei 202 - 2030C unter Zersetzung schmelzen.
Zur Herstellung des Sulfats des neuen Antibiotikums aus dem Helianthat werden z. B. 30 g des Helianthat-Trockenpulvers in 150 ems Wasser suspendiert, zur Suspension 33 cms einer wässerigen, Seligen Lösung von Triäthylaminsulfat zugegeben und die Masse während 1 Stunde gerührt, wobei sie sich durch das sich bildende schwerlösliche Triäthylaminsalz des Helianthins allmählich braunrot verfärbt. Die Umsetzung kann durch Erwärmen erheblich beschleunigt werden. Man versetzt hierauf die Reaktionsmischung mit 20 Volumen Methanol, wobei das Sulfat des Antibiotikums als weisser Niederschlag ausfällt, während das Triäthylamin-Helianthat in Lösung geht.
Das durch Zentrifugation oder Filtration gewonnene Antibiotikum-Sulfat wird durch zweimaliges Umfällen aus Wasser mit Methanol von anhaftendem Farbstoff befreit, zuletzt noch mit reinem Methanol gewaschen und dann getrocknet. Es stellt ein reinweisses, amorphes Pulver dar, das in organischen Lösungsmitteln unlöslich, leicht löslich dagegen in Wasser ist. Die Ausbeute beträgt 5,6 g.
Beispiel 3 : Zwecks Umwandlung des Sulfats in das sowohl in Wasser als auch in Methanol leicht lösliche Hydrochlorid des neuen Antibiotikums wird dieses in der 10-fachen Menge Wasser gelöst und die wässerige Lösung bis zur vollständigen Fällung mit einer 2 0% igen Bariumchloridlösung behandelt, wobei zirka 4 cms je g Sulfat erforderlich sind. Der-Niederschlag von Bariumsulfat wird durch Zentrifugieren entfernt und aus der farblosen überstehenden Lösung das Hydrochlorid mittels Gefriertrocknung isoliert. Es werden so etwas mehr als 1 g Hydrochlorid je g Sulfat gewonnen. Um eine weitere Reinigung des Hydrochlorids zu erzielen, wird dieses in wenig Methanol gelöst, die konzentrierte Lösung auf eine mit Methanol gewaschene Chromatographierkolonne von Gasruss gegossen und mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert.
Der Verdampfungsrückstand des Eluats stellt ein reinweisses, in Methanol sowie in Wasser leicht lösliches Pulver dar, das sich aus diesen Lösungsmitteln beim sehr langsamen Verdunsten teilweise in kristalliner Form ausscheidet.
Anstatt das Hydrochlorid über das Sulfat zu bereiten, lässt sich dieses auch direkt aus dem Helianthat
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hierauf kurz aufgekocht. Nach Entfärbung mit etwas Norit wird filtriert, das wasserhelle Filtrat dann im Vakuum auf etwa 1/4 des ursprünglichen Volumens eingeengt und aus dem Konzentrat das Hydrochlorid mit 10 - 20 Volumen Äther oder Aceton gefällt.
Beispiel 4 : Das nach Beispiel 2 als rohes Sulfat gewonnene Antibiotikum wird über dasPikratwie folgt weiter gereinigt : Zu einer gut gerührten Lösung von 1 g Sulfat in 20 cms Wasser lässt man langsam 130 cms gesättigte wässerige Pikrinsäurelösung zulaufen, welche Menge zur vollständigen Fällung gerade ausreichend ist. Es bildet sich ein öliger Niederschlag, der abzentrifugiert, je einmal mit etwas gesättigter Pikrinsäurelösung und Wasser gewaschen und hierauf im Vakuumexsikkator getrocknet wird, wobei sich das Pikrat in eine feste, jedoch nicht kristallisierte Masse umwandelt. Die Ausbeute beträgt 1, 2 g.
Zur Umwandlung des Pikrats des Antibiotikums in dessen Hydrochlorid löst man ersteres in warmem, mit konzentrierter Salzsäure angesäuertem Methanol und giesst die Lösung in 10 Volumen Äther, wobei das unlösliche Hydrochlorid als weisse Masse ausfällt. Dieses wird von noch anhaftenden Resten Pikrinsäure befreit, indem man es in der zur Lösung erforderlichen Menge kochenden Methanols auflöst und die Ätherfällung wiederholt.
Man erhält so etwa 0,6 g reinweisses, pulverförmiges Hydrochlorid.
Beispiel 5 : Anstatt über das bisher nicht kristallisierbare Pikrat kann man das reine Antibioti- kum, z. B. als Hydrochlorid, über das kristallisierte Pikrolonat gewinnen, wobei man wie folgt verfährt :
Man lässt zu einer Lösung von 1, 0 g des nach Beispiel 2 gewonnenen Sulfats in 100 cm* Wasser unter Rühren innert 1 Stunde 700 cms einer konzentrierten wässerigen Lösung von Pikrolonsäure, 2,4 g im Liter enthaltend, zutropfen. Der ausgeschiedene amorphe Niederschlag des Pikrolonats wird abgenutscht und zwecks Kristallisation in 150 cm3 kochendem Wasser aufgelöst und die Lösung heiss filtriert. Aus dem
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Filtrat scheidet sich beim langsamen Abkühlen auf Raumtemperatur das Pikrolonat in teilweise kristallsierter Form aus.
Der Niederschlag wird auf der Nutsche gesammelt, mit wenig eiskaltem Wasser gewa- schen und zwecks Umkristallisation in 100 cms kochendem Wasser aufgelöst Aus der heiss filtrierten Lösung fällt das Pikrolonat nunmehr vollständig in Form feiner, zu Drusen angeordneter, gelber Stäbchen aus, die nach dem Waschen mit wenig kaltem Wasser und Trocknen im Vakuum über Phosphorpentoxyd, nach Sintern einen scharfen Zersetzungspunkt von 2020 aufweisen. Die Ausbeute des zweimal umkristallisierten Pikrolonats beträgt 0,64 g.
Aus dem vorstehend gewonnenen Pikrolonat wird das reine Hydrochlorid erhalten, indem man zur fein verteilten Suspension von 0, 6 g Pikrolonat in 10 cms eiskaltem Methanol unter kräftigem Rühren 0,6 ems einer IOn-Lösung von gasförmigem Chlorwasserstoff in absolutem Methanol portionenweise zugibt und nach der vollständigen Umsetzung das gebildete, teilweise ausgeschiedene Hydrochlorid des Antibiotikums durch Versetzen des Reaktionsgemisches mit 20 Volumen absolutem Äther vollständig ausfällt. Das Hydrochlorid wird abgenutscht, auf der Nutsche einmal mit etwas Äther gewaschen und hierauf zwecks Entfernung von noch anhaftenden Pikrolonsäureresten in 2 cm* Methanol gelöst und erneut mit Äther ausgeschieden und gewaschen.
Das nunmehr reine Hydrochlorid des Antibiotikums stellt nach dem Trocknen im Vakuum ein reinweisses, amorphes Pulver dar. Die Ausbeute ist 0,25 g.
Nach papierchromatographischen Untersuchungen stellt das so erhaltene Hydrochlorid des Antibiotikums Lemacidin ein Gemisch von drei wahrscheinlich nahe verwandten Verbindungen (B1, B2 und B3) dar.
Verwendet man z. B. als Lösungsmittelsystem eine Mischung von 3 Teilen Äthanol und 1 Teil Wasser, die 2% Natriumchlorid enthält, und setzt man den Rr-Wert (= RB) der am schnellsten laufenden Komponente B3 i (Bezugssubstanz) gleich 1, so ergeben sich für die zwei andern Komponenten Bl und B2 RB-Werte von 0, 34 bzw. 0, 61.
Beispiel 6 : Die Darstellung der freien Base des neuen Antibiotikums kann sowohl aus dessen Sulfat mit Bariumhydroxyd als auch unter Verwendung eines schwach basischen Ionenaustauschers erfolgen.
Im ersten Fall versetzt man z. B. eine Lösung von l g des nach Beispiel 2 erhaltenen Sulfats des Antibiotikums in 5 cm* Wasser mit einem geringen Überschuss einer warm gesättigten Lösung von Bariumhydroxyd, d. h. bis die Reaktionsmischung ein pH von etwa 9 aufweist. Man neutralisiert hierauf das überschüssige Bariumhydroxyd sofort, indem man Kohlendioxyd in die Lösung einleitet. Dann wird die Reaktionsmischung zwecks Überführung des gebildeten Bariumbicarbonats einige Minuten im Wasserbad bei 600 gehalten, worauf das ausgefallene Bariumcarbonat zusammen mit dem Bariumsulfat abzentrifugiert wird. Aus der überstehenden, wasserhellen, alkalischen Zentrifugationslösung isoliert man die freie Base des neuen Antibiotikums mittels Gefriertrocknung.
Sie stellt ein weisses, in Wasser mit stark alkalischer Reaktion lösliches, in organischen Lösungsmitteln unlösliches Pulver dar. Ausbeute 0,5 g.
Zur Gewinnung der freien Base mit Hilfe eines schwach basischen Ionenaustauschers wird wie folgt vorgegangen :
Man perkoliert eine etwa 20 wässerige Lösung von 0,2 g des nach Beispiel 2 erhaltenen Rohsulfats des neuen Antibiotikums durch eine Kolonne des schwach basischen Ionenaustauschers Dowex-2, wobei etwa die 30-fache Menge des zuvor mit verdünnter Salzsäure-Wasser-verdünnter Natronlauge-Wasser wiederholt in dieser Reihenfolge gewaschenen Ionenaustauscherharzen angewendet wird. Die mit der Sulfatlösung beschickte Kolonne wird mit Wasser nachgewaschen, wobei die Base leicht eluiert wird. Das Eluat wird zwecks Gewinnung der Base wie zuvor vorteilhaft lyophilisiert. Ausbeute 0, 65 g. Die Base stellt ein weisses, amorphes Pulver dar.
Beispiel 7 : Eine nach Beispiel 1 gewonnene, vom Mycel befreite Kulturlösung des Antibiotikums Lemacidin wird langsam durch eine Kolonne eines schwach sauren, Carboxylgruppen enthaltenden Ionenaustauscherharzes, wie z. B. Amberlite IRC-50, filtriert, wobei je Liter der Antibiotikumlösung 100 g der H-Form des Austauschers angewendet werden und dieDurchflussgeschwindigkeit auf zirka 5 Liter je Stunde eingestellt wird. Das Antibiotikum Lemacidin wird, zusammen mit inaktiven, zum Teil stark braun gefärbten Begleitstoffen adsorbiert ; die abfliessende, ein PH von 3 bis 3,5 aufweisende Lösung hat nur eine sehr geringe antibiotische Wirksamkeit. Man wäscht hierauf die Amberlite-Kolonne mit 1/5 des Volumens der einfiltrierten Kulturlösung destilliertem Wasser nach, wobei ein Teil der inaktiven, gefärbten Begleitstoffe entfernt, das Antibiotikum selber jedoch nicht eluiert wird.
Um dieses aus dem Adsorbat zu gewinnen, schickt man durch die vorgewaschene Kolonne eine wässerige Lösung von. 0, 2n- Salzsäure u. zw. total 1/4 des Volumens der angewendeten Kulturlösung. Das stark saure Eluat wird entweder mit konzentrierter Natronlauge oder mit Hilfe eines basischen Ionenaustauschers neutralisiert. Die so gewonnene Lösung kann als solche oder nach Konzentrierung im Vakuum und bei niedriger Temperatur als Ausgangslösung zur Herstellung weiter angereicherter Präparate des Antibiotikums Lemacidin, z. B. nach den in den Beispielen 2 - 3 oder 4 beschriebenen Verfahren, verwendet werden.
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Beispiel 8 : Das Pantothenat des Antibiotikums Lemacidin kann z. B. aus dem nach Beispiel 2 gewonnenen Sulfat erhalten werden. Man versetzt hiezu die Lösung von 1, 0 g Sulfat in 10 cms Wasser mit
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bildeten Niederschlag von Calciumsulfat ab und lyophilisiert das Filtrat bzw. Zentrifugat oder dampft es im Vakuum zur Trockne ein. Der Trockenrückstand des Pantothenats des Antibiotikums Lemacidin stellt ein weisses, amorphes, in Wasser sehr leicht lösliches Pulver dar.
In ähnlicher Weise können andere Salze des Antibiotikums Lemacidin mit organischen Säuren wie z. B. mit L (+)-Ascorbinsäure oder mit Aminosäuren wie L (-)-Leucin bzw. L (-)-Methionin hergestellt wer- den. Man geht dabei vorteilhaft von der nach Beispiel 6 gewonnenen freien Base des Antibiotikums aus, indem man deren konzentrierte wässerige Lösung mit einer warm gesättigten Lösung der organischen Säure versetzt, wobei z. B. für 1 g Base 1,2 g Ascorbinsäure bzw. 0,9 g Leucin bzw. l, 05 g Methionin an- gewendet werden.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, seiner Komponenten und Salze durch aerobe Züchtung vonStreptomyces-Stämmen in einer wässerigen Nährlösung, die assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffverbindungen, anorganische Salze sowie allenfalls wachstumsfördernde Stoffe enthält, und an- schliessende Isolierung der antibiotisch wirksamen Substanzen nach an sich bekannten Methoden, Auftrennung in Komponenten und Überführung in therapeutisch verwendbare Salze, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces venezuelae A 9692 oder eine Mutation dieses Stammes vorzugsweise submers während 36-120 Stunden bei einer Temperatur zwischen 18 und 400, vorzugsweise bei 21 - 270, züchtet,
hierauf das Antibiotikum Lemacidin aus der Nährlösung abtrennt. weiter reinigt, gegebenenfalls in seine Komponenten Bd B2 und B3 aufteilt und, wenn erwünscht, Salze dieser Verbindungen herstellt.
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Process for the production of a new antibiotic
The present invention relates to a new, water-soluble antibiotic which has basic properties and which is referred to below as lemacidin, its components B1, B2 and BS, their salts and pharmaceutical preparations which contain these compounds, and processes for the production of these substances and substance mixtures.
The antibiotic lemacidin is produced in the culture of an actinomycete of the species Streptomyces venezuelae Ehrlich et al .. Strain A 9692. This strain was isolated from a soil sample collected at Roche, Canton Vaud (Switzerland) and is used in our laboratories and at the Swiss Federal Institute of Technology , Institute for Special Botany, Zurich, kept under this name.
Streptomyces venezuelae A 9692 forms a pink to cinnamon brown aerial mycelium and carries chains of conidia, which are a typical feature of the genus Streptomyces. The spore chains are stiff, straight or slightly wavy; Spirals or whorls could never be observed. The individual spores are smooth.
No conspicuous exo pigment is formed. Peptone-containing media are discolored black-brown melanoid. The growth is relatively little dependent on temperature, both at 180 and 400 the fungus develops well, but the optimum is between 25 and 320.
For further characterization, the growth of strain A 9692 on various nutrient media is described below. The nutrient media 1 - 7 and 10 are according to W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. 17.361 (1952).
1) Synthetic agar: growth thin, veil-like, light yellow, aerial mycelium velvety, pale carmine.
2) Synthetic solution: growth sparse. Sediment, flakes, light yellow.
3) Glucose agar: growth thin, haze-like, light brown. Aerial mycelium is absent. Substrate dark brown.
4) Glucose asparagine agar: growth thin, haze-like, light brown. Air mycelium velvety, initially chalk white, later cinnamon brown.
5) Calcium malate agar: growth sparse, punctiform, light yellow. Aerial mycelium snow white.
ss) Gelatin sting (180): growth superficial, veil-like, light brown. Substrate dark brown. Liquefaction after 14 days 1.5 cm.
7) Starch plate: growth thin, veil-like, light yellow. Aerial mycelium initially snow-white, later pale carmine. Hydrolysis after 10 days 0.9-1.2 cm.
8) Potatoes: Growth very lush, initially veil-like and light yellow, later wrinkled and light brown. Aerial mycelium cinnamon brown. Substrate dark brown.
9) Carrots: growth very sparse, punctiform, light yellow. Aerial mycelium is absent.
10) Litmus milk: growth good, pellicle light yellow. Substrate blue. Peptonization slow. Coagulation good.
The morphological and physiological characteristics of the strain A 9692 are those of the species Streptomyces venezuelae Ehrlich et al. It is known that Streptomyces venezuelae produces an antibiotic, namely chloromycetin (Ehrlich J., Barth Q. R., Smith R. M., Joslyn D. A. and Burkholder P. R., Science 106, 417 [1947]). This differs from the new antibiotic lemacidin in that, in contrast to this, it can be extracted from the culture filtrate using organic solvents and, moreover, has no basic properties.
The present invention is not for the manufacture of the antibiotic lemacidin
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limited to the use of Streptomyces venezuelae A 9692 or other strains corresponding to the description, but also relates to the use of variants of these organisms, as they are e.g. B. by selection or mutation, in particular under the action of ultraviolet or X-rays or of nitrogen mustard oils.
To produce the antibiotic lemacidin, a Streptomyces strain exhibiting the properties of Streptomyces venezuelae A 9692 is cultured aerobically in an aqueous nutrient solution containing a carbon and nitrogen source and inorganic salts until it shows a significant antibiotic effect, and the antibiotic lemacidin is isolated thereon.
The cultivation takes place aerobically, for example in resting surface culture or preferably submerged with shaking or stirring with air or oxygen in shaker flasks or the known fermenters. A suitable temperature is between 18 and 400. The nutrient solution generally shows a significant antibacterial effect after 1 in-5 days.
As assimilable carbon sources come e.g. B. glucose, sucrose, lactose, starch, mannitol and glycerine in question. Nitrogen-containing nutrients and possibly growth-promoting substances are: Amino acids, peptides and proteins and their breakdown products such as peptone or tryptone, also meat extracts, water-soluble parts of cereal grains such as corn and wheat, of distillation residues from alcohol production, of yeast, beans, in particular Soya plant, from seeds, for example the cotton plant, etc., but also nitrates. The nutrient solution can contain other inorganic salts, for example, chlorides, carbonates, sulphates of alkalis, alkaline earths, magnesium, iron, zinc and manganese.
The antibiotic lemacidin which can be prepared according to the present invention is a water-soluble substance which, according to paper chromatographic investigations, consists of about three, probably closely related compounds. It is completely insoluble in organic solvents, especially lipoid solvents. The antibiotic is basic and forms salts which, in part, e.g. B. the hydrochloride, are soluble in certain organic solvents such as lower aliphatic alcohols. During cultivation in aqueous media, the antibiotic is almost completely found in the nutrient solution, while the mycelium separated from it has practically no antibiotic activity.
According to these properties, the antibiotic lemacidin cannot be extracted from a culture solution with organic solvents in order to obtain it. On the other hand, it can be withdrawn from it in a neutral or weakly alkaline reaction with adsorbents and extracted from the adsorbates with acidic elution liquids, suitably with a pH below 4. On the one hand, activated carbon, e.g. B. Norit, on the other hand, cation exchangers, namely those that contain carboxyl groups, such as. B. the commercially available exchange resin AmberliteIRC-50, in question.
If activated charcoal is used as the adsorbent, suitable elution liquids are acidic aqueous solutions as well as acids-containing, water-miscible solvents, such as lower aliphatic alcohols and ketones. A mixture of equal parts by volume of methanol and in-formic acid has proven to be particularly advantageous. Since, in addition to the antibiotic, the activated charcoal also adsorbs larger amounts, some of which are colored, impurities from the culture solution, the adsorption column is washed with ethanol before the antibiotic is eluted, with otherwise unchanged conditions, whereby a large part of the accompanying substances is removed, but the antibiotic is not is extracted.
A highly enriched preparation of the antibiotic in the form of a white powder can be obtained from the acidic eluate by concentrating the eluate in a vacuum to a small volume, removing the organic solvent and most of the formic acid, and then the aqueous concentrate, advantageously after dilution with 4-5 volumes of methanol, mixed with acetone, the resulting precipitate is washed with this solvent and finally dried. Since the coal eluate, especially from cultures with nutrient solutions containing calcium carbonate, contains considerable amounts of calcium ions, the calcium is expediently excreted from the concentrate with oxalic acid before the antibiotic is precipitated.
In order to adsorb the antibiotic with a cation exchanger, this is advantageously used in the H form. Elution takes place with dilute aqueous acid, if necessary after prewashing the column with distilled water, with inactive accompanying substances being eliminated. A particularly suitable eluant is 0.2N hydrochloric acid. The antibiotic is contained in the eluate in the form of a salt. Cation exchanger eluates can be used as such or after concentration in vacuo, if necessary after prior neutralization, for the production of further enriched preparations of the antibiotic.
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For the production of the pure antibiotic Lemacidin from carbon or ion exchange. Preparations that have been pre-cleaned by adsorption are mixed with their aqueous solution, adjusted to a pH of 6.5-7, with just enough volume of an aqueous solution of the salt of an azo dye containing sulfonic acid groups for complete precipitation, and the resulting poorly soluble dye salt of the antibiotic is isolated. If the azo dye salt used is the sodium salt of 4'-dimethylamino-azobenzene-4-sulfonic acid, which is commercially available under the name Helianthin or Orange III, the dye salt (helianthat) of the antibiotic lemacidin is entirely or partially precipitated in crystallized form.
The heliantate of the antibiotic can be recrystallized from water or methanol or mixtures of these, but also from formamide and water. When recrystallized, it is macroscopically a red-brown powder. When viewed under the microscope, it forms yellow, irregularly shaped, layered platelets or needles that melt at 202-2030 with decomposition.
To recover the antibiotic from the dye salt, it is reacted in an aqueous or alcoholic medium with the salt of an inorganic or organic acid and an organic base, the salt of the antibiotic of the acid in question and the dye salt of the base being formed. If you use z. B. triethylamine sulfate to this reaction and carries it out with an aqueous suspension of the antibiotic helianthate, the water-soluble sulfate of the antibiotic and the insoluble heliantate of triethylamine are obtained. By adding enough methanol to the reaction solution, the latter goes into solution, while the antibiotic sulfate, which is only soluble in water but completely insoluble in lower alcohols, is precipitated and z. B. can be isolated by filtration.
The reaction can, however, also be carried out in an alcoholic or aqueous-alcoholic solution, the sulfate precipitating out immediately and being able to be separated off from the dye solution. The sulfate of the antibiotic lemacidin obtained in this way is a colorless powder that is easily soluble in water and formamide, but insoluble in organic solvents such as alcohols and ketones and has a high level of antibiotic activity.
From the sulfate z. B. the hydrochloride of the antibiotic can be obtained by reacting in aqueous solution with barium chloride and isolation from the barium sulfate-free solution as a hardly colored powder that is easily soluble in water and methanol and less soluble in ethanol. On the other hand, it is also possible. to prepare the hydrochloride directly from the helianthat of the antibiotic by adding concentrated hydrochloric acid or a solution of gaseous hydrochloric acid in methanol in excess to the solution or suspension of the latter in methanol, precipitating the hydrochloride formed with ether and isolating it.
In order to remove minor colored impurities from the hydrochloride produced by these methods, its methanolic solution is filtered through a column of activated carbon, preferably carbon black, the hydrochloride being obtained as a pure white powder after evaporation of the solvent from the filtrate slow evaporation from aqueous or methanolic solution partially precipitates in crystalline form.
The production of the antibiotic lemacidin in pure form can also take place in such a way that it is precipitated from aqueous solutions with an organic acid, for example of the picric acid type, such as picric acid itself or styphnic acid or with picrolonic acid as a sparingly soluble salt. The picrate and styphnate precipitate first in liquid form, as oily drops, which gradually solidify on standing at room temperature; however, they have not yet been able to crystallize.
In contrast to this, the picrolonate can be crystallized. The yellow, irregular rods combined to form drusen melt after previous sintering with decomposition at 202 ° C. These sparingly soluble salts can be treated with acids, e.g. B. hydrochloric acid or sulfuric acid, in an aqueous medium or in a water-miscible organic solvent such as methanol or acetone, converted into the corresponding salt and isolated as such. After this enrichment process, the antibiotic can e.g. B. from the sulfate purified via the heliantate, but also from the eluates of the carbon and cation exchange adsorbates.
Another crystallized salt of the antibiotic lemacidin, which is sparingly soluble in water, is Reineckat, which crystallizes in irregular plates and has a decomposition point of 198 to 2000C.
The free base of the antibiotic lemacidin is easily accessible from its salts, from the sulfate z. B. by reaction in an aqueous medium with barium hydroxide, neutralization of the excess barium with carbon dioxide and separation of the barium carbonate and sulfate precipitate and isolation of the antibiotic base by freeze-drying. It is easier to prepare from the salts using a strongly basic anion exchanger, e.g. B. the OH form of the product marketed under the name Dowex-2.
The antibiotic lemacidin is a colorless, amorphous base that lives in water and aqueous media
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easily soluble, but insoluble in organic solvents. The aqueous solution of the base has an alkaline reaction. A 1% solution of a preparation produced by means of an ion exchanger has a pH of 8.6.
The antibiotic lemacidin forms salts with acids. B. the colorless sulfate and hydrochloride are very easily soluble in water. The hydrochloride also dissolves in lower aliphatic alcohols, especially in methanol.
If aqueous or methanolic solutions evaporate very slowly, the hydrochloride of the antibiotic can be obtained in crystalline form. It has the following elemental composition: C = 37.3%,
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0%, N = 16, 8%, 0 = 20, 8% (her.), Cl = 18, 1%, [(x] p = + 24, 4 (c = 1, 0aqueous as well as alcoholic media difficult Soluble. From such hot, saturated solutions it is deposited in irregularly shaped, layered flakes, also needles, which are yellow under the microscope and which show a decomposition point of 202 to 2030 after recrystallization.
Other salts of the antibiotic lemacidin are derived from z. B. acetic acid, palmitic acid, succinic acid, citric acid, pantothenic acid, ascorbic acid or amino acids such as leucine and methionine.
The hydrochloride of the antibiotic lemacidin gives a positive ninhydrin, weakly positive biuret and Elson-Morgan reaction, while the maltol and Sakaguchi test are negative. As the comparative paper chromatographic examination shows, it differs from the known water-soluble, colorless antibiotics that are effective against gram-positive and gram-negative bacteria.
The hydrochloride of the antibiotic lemacidin can be separated into three, probably closely related components B1, B2 and B3 by means of paper chromatography. If you use z. B. as a solvent system a mixture of 3 parts of ethanol and 1 part of water, which contains 2% sodium chloride, and if the Rf value (= RB) of the fastest running component B3 (reference substance) is equal to 1, the result for the two other components B1 and B2 RB values of 0.34 and 0.61, respectively.
The antibiotic lemacidin has a high antibiotic effectiveness against various test organisms. If one uses as a test method in vitro dilution series (powers of ten) in glucose broth, which are incubated for 24 hours at 370, the following still inhibiting concentrations result:
EMI4.2
<tb>
<tb> Test organisms <SEP> Inhibiting <SEP> concentration <SEP> jug / cmS <SEP>
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes. <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 10 <SEP>
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> penicillin-resistant <SEP> 10
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 10
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 10
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 1
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 1
<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> streptomycin-resistant <SEP> 10
<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> chloromycetin-resistant <SEP> 10
<tb> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 10
<tb> Salmonella <SEP> schottmuelleri <SEP> l <SEP>
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 10
<tb>
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EMI5.1
<tb>
<tb> test organisms <SEP> inhibiting <SEP> concentration <SEP> pg / cmt
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 1
<tb> Klebsiella <SEP> typ.
<SEP> A <SEP> 10
<tb> Pasteurella <SEP> pestis <SEP> 1
<tb> Vibrio <SEP> cholerae <SEP> el <SEP> Tor <SEP> 10
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 10
<tb> Candida <SEP> vulgaris <SEP> 10
<tb> Endomyces <SEP> albicans <SEP> 10
<tb>
The antibiotic lemacidin is also effective in vivo. After 5 subcutaneous administration of 1 mg / kg to mice infected with Micrococcus pyogenes var. Aureus, 1000/0 survivors were observed. With the same application of 5 mg / kg, there is a similar effect in mice infected with Escherichia coli, as well as an effect in those infected with Salmonella typhi murium.
The antibiotic lemacidin has a certain toxicity. after all, z. B. the subcutaneous application of 50 mg antibiotic hydrochloride / kg of mice relatively well tolerated.
The sulfate and pantothenate are slightly less toxic than the hydrochloride, the salt of L (+) - ascorbic acid and the salts of the amino acids L (-) - leucine and L (-) - methionine are significantly less toxic.
The antibiotic, its components B1, B2 and B3 and their salts can be used as remedies, e.g. B. find use in the form of pharmaceutical preparations. These contain the compounds mentioned in a mixture with a pharmaceutical, organic or inorganic carrier material suitable for enteral, parenteral or local administration. For the same, substances come into question that do not react with the new compounds, such as. B. gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohols, gum, polyalkylene glycols, petrolatum, cholesterol or other known excipients. The pharmaceutical preparations can e.g. B. in the form of tablets, dragees, powders, ointments, creams, suppositories or in liquid form as solutions, suspensions or emulsions.
If necessary, they are sterilized and / or contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers. They can also contain other therapeutically valuable substances.
The invention is described in the following examples, without any intention that the subject matter of the invention is restricted. The temperatures are given in degrees Celsius.
Example 1: The cultivation of Streptomyces A 9692 is carried out according to the submerged method. A nutrient solution is used that contains the following additives per liter of tap water:
EMI5.2
<tb>
<tb> Glycerine <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Soya flour <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> sodium chloride <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> sodium nitrate <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> calcium carbonate <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
The nutrient solution is sterilized in the inoculation flask or in the fermenter for 20-30 minutes at 1 atm. The sterilized nutrient solution has a pH of 7.0 to 7.5. The inoculation takes place with up to 100/0 of a partially sporulating vegetative culture of the organism.
Incubate with good shaking
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pouring or stirring at 21-2 * 70, cultures in fermenters being aerated with about 1 volume of sterile air per volume of solution per minute; After 30 - 50 hours of incubation, the culture solution has reached the greatest inhibition value against the test organisms (B. megatherium, Esch. coli, Candida vulgaris). The culture is interrupted and the only weakly active mycelium and other solid constituents are separated from the solution containing the antibiotic by means of filtration or centrifugation, with about 1% of a filter aid, e.g. B. Hyflo Supercel is added.
The pH of the culture filtrate is usually not or only slightly changed in comparison with the sterilized nutrient solution.
If, instead of the above nutrient solutions, those containing the mixtures of nutrients listed under a) to g) per liter of tap water are used, culture filtrates of similarly high antibiotic activity are obtained after analogous cultivation and processing. Instead of adding Hyflo Supercel or another such filter aid, rapid filtration of the culture solution can also be achieved by bringing it to pH 5 with hydrochloric acid before filtration and then to a concentration of 0.5 by adding an aqueous solution of aluminum sulfate % of this salt sets.
Nutrient mixtures with the following additives per liter of water are also suitable:
EMI6.1
<tb>
<tb> a) <SEP> Glucose <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> Soya flour <SEP> 40 <SEP> g <SEP>
<tb> Distiller's <SEP> Solubles <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> sodium chloride <SEP> 20 <SEP> g
<tb> calcium carbonate <SEP> 10 <SEP> g
<tb> b) <SEP> glucose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Soya flour <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Corn <SEP> steep <SEP> liquor <SEP> 20 <SEP> g
<tb> (corn spring water)
<tb> sodium chloride <SEP> 5g
<tb> sodium nitrate <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> Calcium carbonate <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> c) <SEP> glucose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Peptone <SEP> 5g
<tb> meat extract <SEP> 3 <SEP> g <SEP>
<tb> (Oxo <SEP> Lab <SEP> Lemco)
<tb> sodium chloride <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> calcium carbonate <SEP> 10 <SEP> g
<tb> d)
<SEP> glucose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Distiller's <SEP> Solubles <SEP> 10 <SEP> g
<tb> sodium chloride <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> sodium nitrate <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> calcium carbonate <SEP> 10 <SEP> g
<tb> e) <SEP> Mannitol <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> Distiller's <SEP> Solubles <SEP> 20 <SEP> g
<tb> sodium chloride <SEP> 3 <SEP> g <SEP>
<tb> sodium nitrate <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> f) <SEP> Malt extract <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Distiller's <SEP> Solubles <SEP> 20 <SEP> g
<tb> sodium chloride <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> sodium nitrate <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb>
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<tb>
<tb> g) <SEP> Lactose <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> Distiller's <SEP> Solubles <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> sodium chloride <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> sodium nitrate <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb>
A filtrate obtained in accordance with the above information or
Centrifugate of a culture of Streptomyces A 9692 usually has a pH of 7.0 to 7.5. If this is not the case, the pH is adjusted to this value for the subsequent enrichment of the new antibiotic using 10N sodium hydroxide solution. The weakly alkaline filtrate is then mixed with 1% activated charcoal (Norit) for the purpose of adsorbing the antibiotic, and the mass is mechanically stirred for 1 hour, the entire antiblotic substance being absorbed by the charcoal. The latter is filtered by filtration, advantageously with the addition of some filter aid, such as. B. Hyflo Supercel, separated from the completely inactive, almost water-white solution.
In addition to the antibiotic, the coal adsorbs large amounts of other organic, antibiotic inactive substances, especially strongly colored degradation products from the nutrient solution, but also inorganic salts. These accompanying substances are advantageously removed from the charcoal before the antibiotic is eluted. For this purpose, the filtered, still moist coal mass is introduced into 5 times the amount of 95% ethanol and the suspension is stirred for 1/2 hour. The carbon pre-washed in this way can easily be separated from the washing liquid by filtration. The brown colored filtrate shows no antibiotic activity.
The new antibiotic is eluted with acidified aqueous methanol, expediently with a mixture of equal parts by volume of methanol and in-formic acid, with 2 cm S of elution liquid being used for 1 g of adsorbent. The suspension is mechanically stirred well for 1/2 hour, then filtered, whereupon the carbon residue is extracted 3 more times in the same way.
The eluates, of which only the first is pale yellowish in color and the rest are colorless, show the entire antibiotic activity. They are combined and placed in vacuo at a low bath temperature, e.g. B. at 40-600, concentrated to 1/100 of the original volume, except for the methanol. and a lot of water will also remove most of the formic acid. The pH of the yellowish colored, but thin concentrate is usually around 4.
The concentrate contains large amounts of calcium, especially if the culture according to paragraph 1 or according to a) to d) was carried out. This is removed in the form of the sparingly soluble oxalate by adding a 10% aqueous oxalic acid solution to the concentrate while stirring. The amount of oxalic acid solution required for complete precipitation is precisely determined in an aliquot. For concentrates from cultures with calcium carbonate, between 300 - 500 cmS of oxalic acid solution are usually required per liter of concentrate, corresponding to 3-5 cm! per liter of original culture filtrate, while concentrates from culture solutions without added calcium carbonate require less.
The antibiotic is obtained from the calcium-free concentrate in the form of a highly enriched, white powder by first diluting the aqueous concentrate with 4-5 volumes of methanol and then precipitating the active material with 20 volumes of acetone. The precipitate is filtered off, washed twice with acetone and finally freed from the solvent residues in vacuo. A pure white powder is obtained which shows almost the entire antibiotic activity of the culture filtrate.
The yield is about 300 mg per liter of culture filtrate.
Example 2: A significantly greater concentration of the antibiotic lemacidin than after the acetone precipitation described in Example 1 can be achieved by preparing its crystallized helianthin salt. For this purpose, the calcium-free concentrate obtained according to Example 1 is diluted with 2 volumes of water, the pH of the solution is adjusted to pH 6.7-7.0 with 10N sodium hydroxide solution and the volume of an almost saturated aqueous solution required for complete precipitation is achieved with vigorous stirring and in a thin stream of helianthin, containing 3.5 g of helianthin (orange III, sodium salt of 4'-dimethylamino-azobenzene-4-sulfonic acid) per liter, the precipitating solution being advantageously introduced directly into the antibiotic solution.
The volume of the helianthin solution required for complete precipitation is determined in a preliminary test with an aliquot. Part determined. Depending on the antibiotic content, it usually varies between 20-100 times the amount of the undiluted concentrate used. The helianthat (helianthin salt of the antibiotic) that forms is largely precipitated in a crystallized state, in the form of thin platelets, also needles. The precipitation solution is left to stand for a few hours at a low temperature, around 00, during which the precipitate completely settles. The majority of the clear supernatant solution is then decanted, the rest with the aid of the
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Centrifuge separated from the precipitate.
This is mixed with about the same amount of ice-cold water for the purpose of washing and then isolated using the suction filter. The washing is repeated twice in the same way, but with acetone. The heliantate of the new antibiotic washed in this way is dried in vacuo. The yield is between 100 and 180 mg helianthat / cmS concentrate. The dry product is a red-brown powder; it is rather sparingly soluble in water and in methanol, but more easily in formamide, but insoluble or very sparingly soluble in lipoid solvents such as acetone, ether, benzene, chloroform and the like. a.
It can be recrystallized both from water and methanol, as well as from mixtures of these solvents, whereby it is obtained in irregularly shaped, layered platelets which are yellow under the microscope and which melt at 202-2030C with decomposition.
To produce the sulfate of the new antibiotic from the helianthat z. B. 30 g of the Helianthat dry powder suspended in 150 ems of water, 33 cms of an aqueous, blessed solution of triethylamine sulfate added to the suspension and the mass stirred for 1 hour, gradually turning brownish-red due to the sparingly soluble triethylamine salt of helianthin that is formed. The implementation can be accelerated considerably by heating. The reaction mixture is then treated with 20 volumes of methanol, the sulfate of the antibiotic precipitating out as a white precipitate, while the triethylamine heliantate dissolves.
The antibiotic sulfate obtained by centrifugation or filtration is freed from adhering dye by reprecipitating twice from water with methanol, finally washed with pure methanol and then dried. It is a pure white, amorphous powder that is insoluble in organic solvents, but slightly soluble in water. The yield is 5.6 g.
Example 3: For the purpose of converting the sulfate into the hydrochloride of the new antibiotic, which is easily soluble in both water and methanol, this is dissolved in 10 times the amount of water and the aqueous solution is treated with a 20% barium chloride solution until complete precipitation, with about 4 cms per g of sulfate are required. The barium sulfate precipitate is removed by centrifugation and the hydrochloride is isolated from the colorless supernatant solution by freeze-drying. Somewhat more than 1 g of hydrochloride per g of sulfate are obtained in this way. In order to achieve further purification of the hydrochloride, it is dissolved in a little methanol, the concentrated solution is poured onto a chromatography column of gas black washed with methanol and eluted with the same solvent.
The evaporation residue of the eluate is a pure white powder which is easily soluble in methanol and water and which separates out of these solvents in crystalline form when evaporating very slowly.
Instead of preparing the hydrochloride via the sulfate, this can also be extracted directly from the helianthat
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then briefly boiled. After decolorization with a little Norit, it is filtered, the water-white filtrate is then concentrated in vacuo to about 1/4 of the original volume and the hydrochloride is precipitated from the concentrate with 10-20 volumes of ether or acetone.
Example 4: The antibiotic obtained as crude sulphate according to Example 2 is further purified over the picrate as follows: 130 cms of saturated aqueous picric acid solution is slowly added to a well-stirred solution of 1 g of sulphate in 20 cms of water, which is just sufficient for complete precipitation . An oily precipitate forms, which is centrifuged off, washed once with a little saturated picric acid solution and once with water and then dried in a vacuum desiccator, the picrate being converted into a solid but not crystallized mass. The yield is 1.2 g.
To convert the picrate of the antibiotic into its hydrochloride, the former is dissolved in warm methanol acidified with concentrated hydrochloric acid and the solution is poured into 10 volumes of ether, the insoluble hydrochloride precipitating as a white mass. This is freed from any residues of picric acid still adhering to it by dissolving it in the amount of boiling methanol required to dissolve it and repeating the ether precipitation.
About 0.6 g of pure white, powdery hydrochloride is obtained in this way.
Example 5: Instead of using the picrate, which has not yet been crystallized, the pure antibiotic, e.g. B. win as hydrochloride via the crystallized picrolonate, proceeding as follows:
To a solution of 1.0 g of the sulfate obtained according to Example 2 in 100 cm * of water, 700 cms of a concentrated aqueous solution of picrolonic acid containing 2.4 g per liter are added dropwise with stirring over the course of 1 hour. The separated amorphous precipitate of the picrolonate is filtered off with suction and dissolved in 150 cm3 of boiling water for crystallization and the solution is filtered while hot. From the
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When the filtrate cools slowly to room temperature, the picrolonate separates out in partially crystallized form.
The precipitate is collected on the suction filter, washed with a little ice-cold water and dissolved in 100 cms of boiling water for recrystallization. From the hot-filtered solution, the picrolonate now completely precipitates in the form of fine yellow sticks arranged in drusen, which after washing with a little cold water and drying in vacuo over phosphorus pentoxide, have a sharp decomposition point of 2020 after sintering. The yield of the twice recrystallized picrolonate is 0.64 g.
The pure hydrochloride is obtained from the picrolonate obtained above by adding 0.6 ems of an IOn solution of gaseous hydrogen chloride in absolute methanol in portions to the finely divided suspension of 0.6 g of pikrolonate in 10 cms of ice-cold methanol with vigorous stirring, and after complete implementation, the partially excreted hydrochloride of the antibiotic that has formed is completely precipitated by adding 20 volumes of absolute ether to the reaction mixture. The hydrochloride is filtered off with suction, washed once with a little ether on the suction filter and then dissolved in 2 cm * of methanol in order to remove still adhering picrolonic acid residues and again precipitated and washed with ether.
The now pure hydrochloride of the antibiotic is a pure white, amorphous powder after drying in vacuo. The yield is 0.25 g.
According to paper chromatographic investigations, the hydrochloride of the antibiotic lemacidin obtained in this way is a mixture of three probably closely related compounds (B1, B2 and B3).
If you use z. B. as a solvent system a mixture of 3 parts of ethanol and 1 part of water, which contains 2% sodium chloride, and if the Rr value (= RB) of the fastest running component B3 i (reference substance) is equal to 1, the result for the two other components B1 and B2 RB values of 0, 34 and 0, 61, respectively.
Example 6: The preparation of the free base of the new antibiotic can take place either from its sulfate with barium hydroxide or using a weakly basic ion exchanger.
In the first case z. B. a solution of 1 g of the sulfate of the antibiotic obtained according to Example 2 in 5 cm * of water with a slight excess of a warm, saturated solution of barium hydroxide, d. H. until the reaction mixture has a pH of about 9. The excess barium hydroxide is then immediately neutralized by introducing carbon dioxide into the solution. The reaction mixture is then kept in a water bath at 600 for a few minutes in order to transfer the barium bicarbonate formed, after which the precipitated barium carbonate is centrifuged off together with the barium sulfate. The free base of the new antibiotic is isolated from the supernatant, water-white, alkaline centrifugation solution by means of freeze-drying.
It is a white powder which is soluble in water with a strongly alkaline reaction and insoluble in organic solvents. Yield 0.5 g.
To obtain the free base with the help of a weakly basic ion exchanger, proceed as follows:
An approximately 20 aqueous solution of 0.2 g of the crude sulfate of the new antibiotic obtained according to Example 2 is percolated through a column of the weakly basic ion exchanger Dowex-2, with about 30 times the amount of sodium hydroxide solution previously diluted with dilute hydrochloric acid and water. Water is repeatedly applied to ion exchange resins washed in this order. The column charged with the sulfate solution is washed with water, the base being easily eluted. The eluate is advantageously lyophilized as before in order to obtain the base. Yield 0.65g. The base is a white, amorphous powder.
Example 7: A culture solution of the antibiotic lemacidin obtained according to Example 1 and freed from the mycelium is slowly passed through a column of a weakly acidic ion exchange resin containing carboxyl groups, such as. B. Amberlite IRC-50, filtered using 100 g of the H-form of the exchanger per liter of the antibiotic solution and adjusting the flow rate to about 5 liters per hour. The antibiotic lemacidin is adsorbed together with inactive accompanying substances, some of which are very brown in color; the solution flowing off, with a pH of 3 to 3.5, has only very little antibiotic activity. The Amberlite column is then washed with 1/5 of the volume of the culture solution filtered in with distilled water, some of the inactive, colored accompanying substances being removed, but the antibiotic itself not being eluted.
To obtain this from the adsorbate, an aqueous solution of is sent through the pre-washed column. 0, 2N hydrochloric acid u. between a total of 1/4 of the volume of the culture solution used. The strongly acidic eluate is neutralized either with concentrated sodium hydroxide solution or with the help of a basic ion exchanger. The solution obtained in this way can be used as such or after concentration in vacuo and at low temperature as a starting solution for the production of further enriched preparations of the antibiotic lemacidin, e.g. B. by the methods described in Examples 2-3 or 4 can be used.
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Example 8: The pantothenate of the antibiotic lemacidin can, for. B. obtained from the sulfate obtained according to Example 2. For this purpose, the solution of 1.0 g of sulfate in 10 cms of water is added
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formed a precipitate of calcium sulfate and lyophilized the filtrate or centrifugate or evaporated it to dryness in a vacuum. The dry residue of the pantothenate of the antibiotic lemacidin is a white, amorphous powder that is very easily soluble in water.
Similarly, other salts of the antibiotic lemacidin with organic acids such as e.g. B. with L (+) - ascorbic acid or with amino acids such as L (-) - leucine or L (-) - methionine. It is advantageous to start from the antibiotic free base obtained according to Example 6 by adding a warm, saturated solution of the organic acid to its concentrated aqueous solution. B. 1.2 g ascorbic acid or 0.9 g leucine or 1.05 g methionine can be used for 1 g base.
PATENT CLAIMS:
1. Process for the production of a new antibiotic, its components and salts by aerobic cultivation of Streptomyces strains in an aqueous nutrient solution which contains assimilable carbon and nitrogen compounds, inorganic salts and possibly growth-promoting substances, and subsequent isolation of the antibiotic substances afterwards known methods, separation into components and conversion into therapeutically usable salts, characterized in that Streptomyces venezuelae A 9692 or a mutation of this strain is cultivated preferably submerged for 36-120 hours at a temperature between 18 and 400, preferably 21-270 ,
then separates the antibiotic lemacidin from the nutrient solution. further purifies, optionally divides it into its components Bd B2 and B3 and, if desired, prepares salts of these compounds.