Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen, wasserlöslichen, basische Eigenschaften aufweisenden Antibiotikums, das im folgenden mit A 7907 bezeichnet wird.
Das Antibiotikum A 7907 entsteht bei der Kultur einer neuen Actinomyceten-Art der Gattung Streptomyces, die mit keiner der in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology , 6. Aufl., oder in Actino- mycetes and their Antibiotics von Waksman und Lechevalier, 1953, aufgeführten Arten identisch ist und im folgenden unter der Bezeichnung Streptomyces A 7907 n. sp. beschrieben wird. Streptomyces A 7907 wurde aus einer in Zuoz, Kanton Graubünden (Schweiz), gesammelten Bodenprobe isoliert und wird in unseren Laboratorien sowie in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter dieser Bezeichnung aufbewahrt.
Streptomyces A 7907 bildet ein zimtbraunes bis rötlichgraues Luftmycel und trägt Konidienketten, die ein typisches Merkmal der Gattung Streptomyces darstellen. Das Pigment ist nicht deutlich löslich. Das Wachstum ist relativ wenig temperaturabhängig, sowohl bei 18 als auch bei 400 entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 32". Streptomyces A 7907 zeigt gewisse Ahnlichkeiten mit S. xanthophaeus Lindenbein sowie mit S. cinnamoneus Benedict, Pridham et Lindenfelser, ist mit diesen beiden Organismen jedoch nicht identisch.
Für die Herstellung des Antibiotikums A 7907 können auch Abarten der Gattung der Streptomyces A 7907 verwendet werden, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett-oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen gewonnen werden. Ein solcher Streptomyceten-Stamm wird, z. B. in wässriger, Kohlenhydrate, stickstoffhaltige Verbindungen sowie anorganische Salze enthaltender Nährlösung aerob gezüchtet, und das Antibiotikum A 7907 hierauf isoliert.
Die Züchtung erfolgt also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich z. B. eine solche zwi schen 18 und 40 . Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach ll/ó5 Tagen.
Als assimilierbares Kohlenhydrat kann z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Stärke sowie Glycerin verwendet werden. Die Nährlösung kann stickstoffhaltige Nährstoffe und gegebenenfalls wachstumfördernde Stoffe enthalten, z. B. Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte wie Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Soyapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze usw., aber auch Nitrate. Von andern anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten.
Das Antibiotikum A 7907 stellt einen wasserlöslichen Stoff oder ein Gemisch von solchen Stoffen dar. Es ist in organischen Lösungsmitteln, vor allem Lipoidlösungsmitteln, vollkommen unlöslich. Das Antibiotikum ist basisch und bildet Salze, die zum Teil, z. B. das Hydrochlorid, in gewissen organischen Lösungsmitteln, z. B. in niederen aliphatischen Alkoholen, löslich sind. Das Antibiotikum findet sich bei der Züchtung in wässrigen Medien fast vollständig in der Nährlösung, während das von dieser abgetrennte Mycel praktisch keine biologische Aktivität aufweist.
Man kann zwecks Gewinnung des Antibiotikums A 7907 aus einer Kulturlösung dieses nicht mit organischen Lösungsmitteln extrahieren. Es lässt sich dagegen vorteilhaft bei neutraler oder schwach alka- lischer Reaktion mit Adsorptionsmitteln aus der Nähr- lösung entziehen und aus den Adsorbaten mit sauren, zweckmässig ein pH unter 4 aufweisenden Elutionsflüssigkeiten extrahieren, wobei als Adsorptionsmittel einerseits Aktivkohle, z. B. Nomit (eingetragene Marke), anderseits Kationenaustauscher, namentlich solche, die Carboxylgruppen enthalten, wie z. B. das im Handel befindliche Austauscherharz Amberlite IRC-50 (eingetragene Marke), in Frage kommen können.
Wird Aktivkohle als Adsorptionsmittel verwendet, so eignen sich als Elutionsflüssigkeiten sowohl saure wässrige Lösungen als auch Säuren enthaltende, mit Wasser mischbare Lösungsmittel, wie niedere aliphatische Alkohole und Ketone. Eine Mischung von gleichen Volumenteilen Methanol und ln Ameisensäure hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen. Da ausser dem Antibiotikum von der Aktivkohle noch grössere Mengen, zum Teil gefärbte Verunreinigungen aus der Kulturlösung adsorbiert werden, wäscht man die Adsorptionskolonne vor der Elution des Antibiotikums bei sonst unveränderten Bedingungen vorteilhaft mit Äthanol, wobei ein grosser Teil der Begleitstoffe entfernt, das Antibiotikum jedoch nicht extrahiert wird.
Aus dem sauren Eluat lässt sich ein stark angereichertes Präparat des Antibiotikums in Form eines weissen Pulvers gewinnen, indem man das Eluat z. B. im Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert, wobei das organische Lösungsmittel sowie die Hauptmenge der Ameisensäure entfernt werden, und hier- auf das wässrige Konzentrat, vorteilhaft nach Ver dünnung mit 4-5 Volumen Methanol, am besten mit Aceton versetzt und die enstandene Fällung mit diesem Lösungsmittel wäscht und zuletzt trocknet. Da das Kohleeluat, besonders von Kulturen mit Calciumcarbonat enthaltenden Nährlösungen, erhebliche Mengen Ca-Ionen enthält, wird vor der Fällung des Antibiotikums aus dem Konzentrat das Calcium zweckmässig mit Oxalsäure ausgeschieden.
Zur Adsorption des Antibiotikums mit einem Kationenaustauscher wird dieser vorteilhaft in der H-form verwendet. Die Elution kann mit verdünnter wässriger Säure erfolgen, gegebenenfalls nach Vorwaschung der Kolonne mit destilliertem Wasser, wobei inaktive Begleitstoffe eliminiert werden. Als Elutionsmittel ist besonders 0, 2n Salzsäure geeignet. Das Antibiotikum ist im Eluat in Form eines Salzes enthalten. Kationenaustauscher-Eluate können als solche oder nach Konzentrierung im Vakuum, gegebenenfalls nach vorausgehender Neutralisierung, zur Herstellung weiter angereicherter Präparate des Antibiotikums dienen.
Zur Isolierung des reinen Antibiotikums A 7907 oder aus durch Kohle-oder Ionenaustauscheradsorption vorgereinigten Präparaten, versetzt man zweckmässig ihre wässrige, auf ein pH von 6, 5-7, 0 eingestellte Lösung mit einem zur vollständigen Fällung gerade ausreichenden Volumen einer wässrigen Lösung des Salzes eines Sulfonsäuregruppen enthaltenden Azofarbstoffs und isoliert das entstandene schwerlösliche Farbstoffsalz des Antibiotikums. Verwendet man dabei als Azofarbstoffsalz das unter der Bezeichnung Helianthin oder Orange III im Handel befindliche Natriumsalz der 4'-Dimethylamino-azobenzol-4- sulfonsäure, so scheidet sich das Farbstoffsalz (Helianthat) des Antibiotikums A 7907 ganz oder teilweise in kristallisierter Form aus.
Das Helianthat des Antibiotikums kann aus Wasser oder Methanol oder Mischungen dieser, aber auch aus Formamid und Wasser umkristallisiert werden. Umkristallisiert stellt es mikroskopisch ein rotbraunes Pulver dar. Unter dem Mikroskop betrachtet, bildet es gelbe, geschichtete Blättchen oder Stäbchen, die bei 186-188 unter Zersetzung schmelzen.
Um das Antibiotikum aus dem Farbstoffsalz zurückzugewinnen, kann man dieses in wässrigem oder alkoholischem Medium mit dem Salz aus einer anorganischen Säure und einer organischen Base umsetzen, wobei sich das Salz des Antibiotikums der betreffenden Säure und das Farbstoffsalz der Base bilden. Verwendet man z. B. Triäthylaminsulfat zu dieser Umsetzung und führt sie mit einer wässrigen Suspension des Antibiotikum-Helianthates aus, so erhält man das in Wasser lösliche Sulfat des Antibiotikums sowie das unlösliche Helianthat des Triäthylamins, wobei das letztere in Lösung geht, wenn man genügend Methanol zur Reaktionslösung zusetzt, während sich das nur in Wasser lösliche, in niederen Alkoholen dagegen vollständig unlösliche Antibiotikum-Sulfat ausscheidet und z. B. mittels Filtration isoliert werden kann.
Die Umsetzung kann aber auch in alkoholischer oder wässrigalkoholischer Lösung vorgenommen werden, wobei das Sulfat sofort ausfällt und von der Farbstofflösung abgetrennt werden kann. Das so erhaltene Sulfat des Antibiotikums A 7907 stellt ein farbloses, in Wasser und Formamid leicht lösliches, in organischen Lösungsmitteln, wie Alkoholen und Ketonen dagegen unlösliches Pulver von hoher antibiotischer Wirksamkeit dar.
Aus dem Sulfat kann z. B. das Hydrochlorid des Antibiotikums durch Umsetzung in wässriger Lösung mit Bariumchlorid und Isolierung aus der von Bariumsulfat befreiten Lösung als kaum gefärbtes, in Wasser sowie Methanol leicht, in Athanol schwerer lösliches Pulver gewonnen werden. Anderseits ist es auch möglich, das Hydrochlorid direkt aus dem Helianthat des Antibiotikums herzustellen, indem man zur Lösung bzw. Suspension des letzteren in Methanol konzentrierte Salzsäure oder eine Lösung von gasförmiger Salzsäure in Methanol im Uberschuss zusetzt, das gebildete Hydrochlorid mit Ather niederschlägt und isoliert.
Um geringe farbige Verunreinigungen aus dem nach diesen Methoden hergestellten Hydrochlorid zu entfernen, filtriert man zweckmässig dessen methano lische Lösung durch eine Kolonne von Aktivkohle, vorzugsweise Gasruss, wobei das Hydrochlorid nach der Verdampfung des Lösungsmittels aus dem Filtrat als reinweisses Pulver erhalten wird, das sich bei sehr langsamem Verdunsten aus wässriger oder methanolischer Lösung teilweise in kristalliner Form ausscheidet.
Die Isolierung des Antibiotikums A 7907 in reiner Form kann auch in der Weise erfolgen, dass dieses aus wässrigen Lösungen mit einer organischen Säure vom Typus der Pikrinsäure, wie z. B. Pikrinsäure selber, Styphninsäure oder Pikrolonsäure, als schwerlösliches Salz gefällt und letzteres durch Behandlung mit Säuren, z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure, in wässrigem Medium oder in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel wie Methanol oder Aceton in das entsprechende Salz überführt und als solches isoliert wird. Nach diesem Anreicherungsverfahren kann das Antibiotikum z. B. aus dem über das Helianthat gereinigten Sulfat, aber auch aus den Eluaten der Kohle-sowie der Kationenaustauscheradsorbate gewonnen werden.
Die freie Base des Antibiotikums A 7907 ist leicht aus ihren Salzen zugänglich, aus dem Sulfat z. B. durch Umsetzung in wässrigem Medium mit Bariumhydroxyd, Neutralisierung des überschüssigen Baryts mit Kohlendioxyd sowie Abtrennung des Bariumcarbonat-und Bariumsulfat-Niederschlags und Isolierung der Antibiotikum-Base mittels Gefriertrocknung. Einfacher erfolgt die Herstellung aus den Salzen unter Verwendung eines stark basischen Anionenaustauschers, z. B. der OH-Form des unter der Bezeichnung Dowex-2 (eingetragene Marke) im Handel befindlichen Produkts.
Das Antibiotikum A 7907 ist eine farblose Base, die in Wasser und wässrigen Medien leicht löslich, in organischen Lösungsmitteln dagegen unlöslich ist.
Die wässrige Lösung der Base reagiert alkalisch. Eine 1 /o Lösung eines mittels Ionenaustauscher isolierten Präparats zeigt ein pH von 10, 5.
Mit Säuren bildet das Antibiotikum A 7907 Salze, von denen z. B. das farblose Sulfat und Hydrochlorid in Wasser sehr leicht löslich sind. Das Hydrochlorid löst sich ausserdem in niederen aliphatischen Alkoholen, besonders in Methanol. Das Farbsalz der Base mit der 4'-Dimethylamino-azobenzol-4-sulfonsäure (Helianthat) ist sowohl in wässrigen als auch in alkoholischen Medien schwer löslich. Aus solchen heiss gesättigten Lösungen scheidet es sich in gelb gefärb- ten, lappigen, geschichteten Blättchen ab, die nach der Umkristallisation einen Zersetzungspunkt von 186-188 zeigen. Beim sehr langsamen Verdunsten wässriger oder methanolischer Lösungen kann auch das Hydrochlorid des Antibiotikums in kristalliner Form erhalten werden.
Das Hydrochlorid des Antibiotikums A 7907 hat folgende Elementarzusammensetzung : C = 39, 5 /o, H = 7, 2 /o, N = 15, 5 O/o,, O = 19, 8 O/o, Cl = 17, 2 O/o. [a] 2D = + 21 .
Andere Salze des Antibiotikums A 7907 leiten sich ab z. B. von der Essigsäure, Palmitinsäure, Bern steinsäure, Zitronensäure oder Pantothensäure.
Das Antibiotikum A 7907 hat, wie aus dem Infrarotspektrum, den Farbreaktionen sowie auch aus der Elementarzusammensetzung hervorgeht, Polypeptid Charakter. Wie die vergleichende papierchromatographische Untersuchung ergibt, ist es verschieden von den bekannten wasserlöslichen, farblosen, gegen grampositive und gramnegative Bakterien wirksamen Antibiotika Streptomycin, Streptothricin und Neomycin. Trotz der Ähnlichkeit des das neue Antibiotikum produzierenden Stammes Streptomyces A 7907 mit dem das Antibiotikum Geomycin bildenden Organismus Streptomyces xanthophaeus Lindenbein und der sehr ähnlichen Elementarzusammensetzung der Hydrochloride von Antibiotikum A 7907 und Geomycin (vgl. H. Brockmann und H.
Musso : Naturwissenschaften Band 41, Seite 451 [1954], Chemische Berichte Band 87, Seite 1779 [1954]) ist das Antibiotikum A 7907 mit Geomycin nicht identisch, da es im Gegensatz zu diesem keine Ninhydrinreaktion und auch nur eine äusserst schwache Farbreaktion nach Sakaguchi gibt. Anderseits zeigt es im Unterschied zu Geomycin eine kräftige Biuretreaktion, die letzterem fehlt.
Das Antibiotikum A 7907 ist aber auch nicht identisch mit dem wasserlöslichen Polypeptid Cinn amycin, das von dem mit Streptomyces A 7907 gleichfalls ähnlichen Streptomyces cinnamoneus Benedict, Pridham et Lindenfelser produziert wird, da Cinnamycin in seinem Molekül Schwefel enthält und übrigens nur gegen grampositive, nicht aber gegen gramnegative Bakterien wirksam ist.
Das Antibiotikum A 7907 besitzt eine sehr hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Testorganismen. Verwendet man als Testmethode in vitro Verdünnungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei 37 bebrü- tet werden, so ergeben sich folgende noch hemmende Konzentrationen :
Hemmende Testorganismen Konzentration g/cm3 Micrococcus pyogenes, var. aureus 10 Micrococcus pyogenes, var. aureus penicillin-resistent 100 Streptococcus pyogenes 100 Streptococcus viridans 100 Corynebacterium diphtheriae 1 Escherichia coli 100 Escherichia coli, streptomycin resistent 100 Escherichia coli, chloromycetin resistent 100 Salmonella typhosa 10 Salmonella schottmuelleri 10 Shigella sonnei 100 Pseudomonas aeruginosa 100 Klebsiella typ. A 100 Pasteurella pestis 100
Hemmende Testorganismen Konzentration g/em3
Vibrio cholerae el Tor 100
Bacillus megatherium 1
Bacillus subtils 10
Candida vulgaris 10
Endomyces albicans 10
In vivo ist das Antibiotikum A 7907 ebenfalls wirksam.
Bei sechsmaliger subkutaner Verabreichung von 50 mg/kg an mit Escherichia coli infizierte Mäuse werden 100 lo tJberlebende beobachtet. Bei gleicher Applikation zeigt sich dieselbe Wirkung bei Mäusen, die mit Klebsiella Typ. A, ebenso ein Effekt bei solchen, die mit Salmonella typhi murium infiziert sind.
Die Toxizität des Antibiotikums ist gering. Die subkutane Applikation von sechmal 50 mg/kg wird z. B. von Mäusen ohne Schädigung ertragen. Höhere Dosen wurden noch nicht geprüft.
Das Antibiotikum oder dessen Salze können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Träger- material. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Ole, Benzylalkohole, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien, oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.
Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz-oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
In den nachfolgenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel 1
Die Züchtung des Streptomyces A 7907 wird nach dem Submersverfahren durchgeführt. Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser folgende Zusatzstoffe enthält :
Lactose 10 g
Soyamehl 10 g
Natriumchlorid 5 g
Natriumnitrat 1 g
Calciumcarbonat 10 g
Die Nährlösung wird in den Impfkolben oder in den Fermentern während 20-30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Die sterilisierte Nährlösung zeigt ein p. von 7, 5 bis 8, 0. Die Animpfung erfolgt mit bis zu 100/o einer teilweise sporulierenden vegetativen Kultur des Organismus. Man inkubiert unter gutem Schütteln oder Rühren bei 27 , wobei Kulturen in Fermentern mit etwa 1 Vol. steriler Luft pro Vol.
Lösung in der Minute belüftet werden. Nach 70 bis 120 Stunden Bebrütung hat die Kulturlösung den grössten Hemmwert gegenüber den Testorganismen (B. subtilis, B. megatherium, Staph. aureus. Esch. coli, Candida vulgaris) erreicht, Man unterbricht die Kultur und trennt das inaktive Mycel sowie andere feste Be standteile von der das Antibiotikum enthaltenden Lösung mittels Filtration oder Zentrifugieren ab, wobei gegebenenfalls der Kulturlösung vor der Filtration etwa 1 I/o eines Filterhilfsmittels, z. B. Hyflo Super cel (eingetragene Marke), zugesetzt wird. Das pH des Kulturfiltrats ist in der Regel im Vergleich mit der sterilisierten Nährlösung nicht oder nur wenig ver ändert.
Verwendet man anstelle der oben angegebenen Nährlösung solche, die pro Liter Leitungswasser die unter a) bis f) angeführten Mischungen von Nähr- stoffen aufweisen, so erhält man nach analoger Züchtung und Aufarbeitung Kulturfiltrate von ähnlich hoher antibiotischer Wirksamkeit. Anstatt durch einen Zusatz von Hyflo Supercel oder eines andern solchen Filterhilfsmittels kann man eine rasche Filtration der Kulturlösung auch dadurch erzielen, dass man diese vor der Filtration mit Salzsäure auf PH 5 und hierauf durch Zugabe einer wässrigen Lösung von Aluminiumsulfat auf eine Konzentration von 0, 5"/o dieses Salzes einstellt.
Ausser der erwähnten Lactose-Nährlösung werden weitere Nährlösungen verwendet mit folgenden Zusatzstoffen pro Liter Wasser : a) Glucose 10 g
Soyamehl 10 g
Natriumchlorid 5 g
Natriumnitrat 1 g b) Glycerin 20 g
Soyamehl 10 g
Natriumchlorid 5 g
Natriumnitrat 1 g
Calciumcarbonat 10 g c) Glucose 10 g
Soyamehl 10 g Corn steep liquor (Maisquellwasser) 20 g
Natriumchlorid 5 g
Natriumnitrat 1 g
Calciumcarbonat 10 g d) Glucose 10 g
Pepton 5 g
Fleischextrakt ( Oxo Lab Lemco , Markenprodukt) 3 g
Natriumchlorid 5 g
Calciumcarbonat 10 g e) Glucose 10 g
Casein 3 g
Kaliumphosphat sek. 2 g f) Stärke 10 g
Pepton 4 g
Trockenhefe 1 g
Kaliumphosphat sek. 2 g
Ein gemäss den obigen Angaben gewonnenes Filtrat bzw.
Zentrifugat einer Kultur des Streptomyces A 7907 weist in der Regel ein pH von 7, 5 bis 8 auf.
Wenn dies nicht der Fall ist, wird für die folgende Anreicherung des neuen Antibiotikums das PH mit Hilfe von lOn Natronlauge auf diesen Wert eingestellt. Das schwach alkalische Filtrat wird hierauf zwecks Adsorption des Antibiotikums mit 1 /01 Aktivkohle ( Norit ) versetzt und die Masse während 1 Stunde mechanisch gerührt, wobei die gesamte antibiotisch wirksame Substanz von der Kohle aufgenommen wird.
Letztere wird durch Filtration, vorteilhaft unter Zugabe von etwas Filterhilfsmittel, wie z. B. Hyflo Supercel , von der vollständig inaktiven, fast wasserhellen Lösung abgetrennt.
Ausser dem Antibiotikum werden von der Kohle noch grosse Mengen anderer organischer, antibiotisch unwirksamer Stoffe, vor allem stark gefärbte Abbauprodukte aus der Nährlösung, aber auch anorganische Salze, adsorbiert. Diese Begleitstoffe werden vorteilhaft vor der Elution des Antibiotikums aus der Kohle entfernt. Dazu wird die abfiltrierte, noch feuchte Kohlemasse in die fünffache Menge 95 ouzo Athanol eingetragen und die Suspension 1/2 Stunde gerührt. Die so vorgewaschene Kohle lässt sich durch Filtration leicht von der Waschflüssigkeit abtrennen.
Das braun gefärbte Filtrat zeigt keine antibiotische Wirksamkeit.
Die Elution des neuen Antibiotikums erfolgt mit angesäuertem wässrigem Methanol, zweckmässig mit einer Mischung von gleichen Volumteilen Methanol und In Ameisensäure, wobei auf 1 g Adsorptionsmittel 2 cmS Elutionsflüssigkeit zur Anwendung kommen. Die Suspension wird 19 Stunde mechanisch gut gerührt, dann filtriert, worauf der Kohlerückstand noch dreimal in gleicher Weise extrahiert wird. Die Eluate, von denen nur das erste schwach gelblich gefärbt, die übrigen farblos sind, zeigen die gesamte antibiotische Aktivität. Sie werden vereinigt und im Vakuum bei niedriger Badtemperatur, z. B. bei 40 bis 60 , auf t/tOO des ursprünglichen Volumens konzentriert, wobei ausser dem Methanol und viel Wasser auch der grösste Teil der Ameisensäure entfernt wird.
Das pn des gelblich gefärbten, jedoch dünnflüssigen Konzentrats ist in der Regel um 4.
Das Konzentrat enthält, besonders wenn die Kultur in der eingangs dieses Beipiels genannten Lactose Nährlösung oder in den Nährlösungen b) bis d) durchgeführt wurde, grössere Mengen Calcium. Man entfernt dieses in Form des schwerlöslichen Oxalats, indem man dem Konzentrat unter Rühren eine 10 ouzo wässrige Oxalsäurelösung zusetzt. Die für die vollständige Fällung erforderliche Menge Oxalsäurelösung wird in einem aliquoten Teil des Konzentrats genau bestimmt.
Für Konzentrate aus Kulturen der Lactose Nährlösung oder den Nährlösungen b) bis d) werden in der Regel zwischen 300bis 500 cm3 Oxalsäurelösung pro Liter Konzentrat benötigt, entsprechend 3 bis 5 cm3 pro Liter ursprüngliches Kulturfiltrat, während Konzentrate aus Kulturlösungen mit geringem Calciumcarbonatgehalt, weniger Oxalsäure zur Abtrennung des Calciums erfordern.
Aus dem von Calcium befreiten Konzentrat wird das Antibiotikum in Form eines stark angereicherten weissen Pulvers gewonnen, indem man das wässrige Konzentrat zunächst mit 4 bis 5 Volumen Methanol verdünnt und hierauf das aktive Material mit 20 Volumen Aceton ausfällt. Der Niederschlag wird abfiltriert, zweimal mit Aceton gewaschen und zuletzt im Vakuum von d'en Lösungsmittelresten befreit.
Man erhält ein reinweisses Pulver, das nahezu die gesamte antibiotische Aktivität des Kulturfiltrats zeigt. Die Ausbeute bewegt sich zwischen 300 bis 500 mg pro Liter Kulturfiltrat.
Beispiel 2
Eine bedeutend stärkere Anreicherung des Antibiotikums A 7907 als nach der in Besipiel 1 beschriebenen Acetonfällung lässt sich über die Darstellung von dessen kristallisiertem Helianthin-Salz erzielen.
Hierzu wird das nach Beispiel 1 gewonnene calcium- freie Konzentrat mit 2 Volumen Wasser verdünnt, das pH der Lösung mit lOn Natronlauge auf PH 6, 7 bis 7, 0 eingestellt und unter kräftigem Rühren und in dünnem Strahl das zur vollständigen Fällung erforderliche Volumen einer nahezu gesättigten wässrigen Lösung von Helianthin, enthaltend 3, 5 g Helianthin (Orange III, Natriumsalz der 4'-Dimethylamino-azo benzol-4-sulfonsäure) im Liter, zugegeben, wobei die Fällungslösung vorteilhaft direkt in die Antibiotikumlösung eingeleitet wird. Das zur vollständigen Fällung benötigte Volumen der Helianthinlösung wird in einem Vorversuch mit einem aliquoten Teil ermittelt.
Es variiert je nach dem Antibiotikumgehalt in der Regel zwischen der 50-bis 150fachen Menge des angewendeten, unverdünnten Konzentrats. Das sich bildende Helianthat (Helianthin-Salz des Antibiotikums) fällt zum grössten Teil in kristallisiertem Zustand, in der Form von dünnen Stäbchen und/oder Plättchen aus. Man lässt die Fällungslösung einige Stunden bei tiefer Temperatur, um 0 , stehen, wobei sich der Niederschlag vollständig absetzt. Hierauf wird die Hauptmenge der klaren überstehenden Lösung durch Dekantieren, der Rest mit Hilfe der Zentrifuge vom Niederschlag abgetrennt. Dieser wird zwecks Waschung einmal mit etwa der gleichen Menge eiskaltem Wasser verrührt und hierauf mit Hilfe der Nutsche isoliert. Die Waschung wird zweimal in gleicher Weise, doch mit Aceton, wiederholt. Das so gewaschene Helianthat des neuen Antibiotikums wird hierauf im Vakuum getrocknet.
Die Ausbeute beträgt zwischen 40 und 70 mg Helianthat/cm Konzentrat. Das Trockenprodukt stellt ein rotbraunes Pulver dar. Es ist in Wasser sowie in Methanol ziemlich schwer löslich, leichter dagegen in Formamid, aber unlöslich oder sehr wenig löslich in Lipoid lösungsmitteln wie Aceton, Ather, Benzol, Chloroform u. a. Es kann sowohl aus Wasser sowie Methanol als auch aus Mischungen dieser Lösungsmittel umkristallisiert werden, wobei es in gelben, lappigen, geschichteten Blättchen anfällt, die bei 186-188 unter Zersetzung schmelzen.
Zur Herstellung des Sulfates des neuen Antibiotikums aus dem Helianthat werden z. B. 10 g des Helianthat-Trockenpulvers in 50 cmS Wasser suspendiert, zur Suspension 16 cm3 einer wässrigen, 80 ouzo Lösung von Triäthylaminsulfat zugegeben und die Masse während 1 Stunde gerührt, wobei sie sich durch das sich bildende schwerlösliche Triäthylamin- salz des Helianthins allmählich rotviolett verfärbt. Die Umsetzung kann durch Erwärmen erheblich beschleunigt werden. Man versetzt hierauf die Reaktionsmischung mit 20 Volumen Methanol, wobei das Sulfat des Antibiotikums als weisser Niederschlag ausfällt, während das Triäthylamin-Helianthat in Lösung geht.
Das durch Zentrifugieren oder Filtration gewonnene Antibiotikum-Sulfat wird durch zweimaliges Umfällen aus Wasser mit Methanol von anhaftendem Farbstoff befreit, zuletzt noch mit reinem Methanol gewaschen und dann getrocknet. Es stellt ein reinweisses, amorphes Pulver dar, das in organischen Lösungsmitteln unlöslich, leicht löslich dagegen in Wasser ist. Aus 10 g rohem Antibiotikum-Helianthat wird etwa 1 g Sulfat gewonnen.
Beispiel 3
Zwecks Umwandlung des nach Beispiel 2 hergestellten Sulfats in das sowohl in Wasser als auch in Methanol leicht lösliche Hydrochlorid des neuen Antibiotikums wird dieses in der 10fachen Menge Wasser gelöst und die wässrige Lösung bis zur vollständigen Fällung mit einer 20"/o Bariumchlorid-Lösung behandelt, wobei etwa 2 cmS je g Sulfat erforderlich sind.
Der Niederschlag von Bariumsulfat wird durch Zentrifugieren entfernt und aus der farblosen überstehenden Lösung das Hydrochlorid mittels Gefriertrocknung isoliert. Es werden so etwa 0, 8 g Hydrochlorid je g Sulfat gewonnen. Um eine weitere Reinigung des Hydrochlorids zu erzielen, wird dieses in wenig Methanol gelöst, die konzentrierte Lösung auf eine mit Methanol gewaschene Chromatographierkolonne von Gasruss gegossen und mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert. Der Verdampfungsrückstand des Eluats stellt ein reinweisses, in Methanol sowie in Wasser leicht lösliches Pulver dar, das sich aus diesen Lösungs- mitteln beim sehr langsamen Verdunsten teilweise in kristalliner Form ausscheidet.
Anstatt das Hydrochlorid über das Sulfat zu bereiten, lässt sich dieses auch direkt aus dem Helianthat gewinnen. Dazu wird letzteres in trockenem, fein verteiltem Zustand in etwa der l Ofachen Menge absolutem Methanol suspendiert, zur Suspension noch 2 Volumen lOn Salzsäure-Methanol zugesetzt und hierauf kurz aufgekocht. Nach Entfärbung mit etwas Norit -Kohle wird filtriert, das wasserhelle Filtrat dann im Vakuum auf etwa 1i des ursprünglichen Volumens konzentriert und aus dem Konzentrat das Hydrochlorid mit 10 bis 20 Volumen Ather oder Aceton gefällt.
Beispiel 4
Das nach Beispiel 2 als rohes Sulfat gewonnene Antibiotikum wird über das Pikrat wie folgt weiter gereinigt.
Zu einer gut gerührten Lösung von 1 g Sulfat in 20 cm3 Wasser lässt man langsam 130 cm3 gesättigte wässrige Pikrinsäurelösung zulaufen, welche Menge zur vollständigen Fällung gerade ausreichend ist. Es bildet sich ein öliger Niederschlag, der abzentrifugiert, je einmal mit etwas gesättigter Pikrinsäurelösung und Wasser gewaschen und hierauf im Vakuumexsikkator getrocknet wird, wobei sich das Pikrat in eine feste, jedoch nicht kristallisierte Masse umwandelt. Die Ausbeute beträgt 1, 3 g. Zur Umwandlung des Pikrats des Antibiotikums in dessen Hydrochlorid löst man ersteres in warmem, mit konzentrierter Salzsäure angesäuertem Methanol und giesst die Lösung in 10 Volumen Ather, wobei das unlösliche Hydrochlorid als weisse Masse ausfällt.
Dieses wird von noch anhaftenden Resten Pikrinsäure befreit, indem man es in der zur Lösung erforderlichen Menge kochenden Methanols auflöst und die Atherfällung wiederholt. Man erhält so etwa 0, 7 g reinweisses, pulverförmiges Hydrochlorid.
Beispiel S
Anstatt über das bisher nicht kristallisierbare Pikrat kann man das reine Antibiotikum, z. B. als Hydrochlorid, über das kristallisierte Pikrolonat gewinnen, wobei man wie folgt verfährt :
Man lässt zu einer Lösung von 5, 0 g des nach Beispiel 2 gewonnenen Sulfats in 500 cm3 Wasser unter Rühren innert 1 Stunde 2500 cm3 einer nahezu gesättigten wässrigen Lösung von Pikrolonsäure, 2, 7 g im Liter enthaltend, zutropfen. Der ausgeschiedene amorphe Niederschlag des Pikrolonats wird abgenutscht und zwecks Kristallisation in 1700 cm3 kochendem Wasser aufgelöst und die Lösung heiss filtriert. Aus dem Filtrat scheidet sich beim langsamen Abkühlen auf Raumtemperatur das Pikrolonat in teilweise kristallisierter Form aus.
Der Niederschlag wird auf der Nutsche gesammelt, mit wenig eiskaltem Wasser gewaschen und zwecks Umkristallisation in 1500 cm3 kochendem Wasser aufgelöst.
Aus der heiss filtrierten Lösung fällt das Pikrolonat nunmehr vollständig in Form feiner, zu Drusen angeordneter, gelber Nadeln aus, die nach dem Waschen mit wenig kaltem Wasser und Trocknen im Vakuum über Phosphorpentoxyd, nach Sintern bei 205-208 , einen scharfen Zersetzungspunkt von 213-214 aufweisen. Die Ausbeute des zweimal umkristallisierten Pikrolonats beträgt 5, 2 g.
Aus dem vorstehend gewonnenen Pikrolonat wird das reine Hydrochlorid erhalten, indem man zur fein verteilten Suspension von 5, 0 g Pikrolonat in 80 cm3 eiskaltem Methanol unter kräftigem Rühren 3, 5 cm3 einer lOn Lösung von gasförmigem Chlorwasserstoff in absolutem Methanol portionenweise zugibt und nach der vollständigen Umsetzung das gebildete, teil weise ausgeschiedene Hydrochlorid des Antibiotikums durch Versetzen des Reaktionsgemisches mit 10 Volumen absolutem Ather vollständig ausfällt. Das Hydrochlorid wird abgenutscht, auf der Nutsche einmal mit etwas Ather gewaschen und hierauf zwecks Entfernung von noch anhaftenden Pikrolonsäureestern in 20 cm3 Methanol gelöst und erneut mit Ather ausgeschieden und gewaschen.
Das nunmehr reine Hydrochlorid des Antibiotikums stellt nach dem Trocknen im Vakuum ein reinweisses, amorphes Pulver dar. Die Ausbeute ist 2, 2 g.
Beispiel 6
Die Darstellung der freien Base des neuen Antibiotikums aus dessen Sulfat kann sowohl mit Bariumhydroxyd als auch unter Verwendung eines schwach basischen Ionenaustauschers erfolgen. Im ersten Fall versetzt man z. B. eine Lösung von 1 g des nach Beispiel 2 erhaltenen Sulfats des Antibiotikums in 5 cm3 Wasser mit einem geringen Überschuss einer warm gesättigten Lösung von Bariumhydroxyd, das heisst bis die Reaktionsmischung ein PH von etwa 9 aufweist. Man neutralisiert hierauf das überschüssige Bariumhydroxyd sofort, indem man Kohlendioxyd in die Lösung einleitet. Dann wird die Reaktionsmischung zwecks Überführung des gebildeten Bariumbikarbonats einige Minuten im Wasserbad bei 60 gehalten, worauf das ausgefallene Bariumcarbonat zusammen mit dem Bariumsulfat abzentrifugiert wird.
Aus der überstehenden, wasserhellen, alkalischen Zentrifugierlösung isoliert man die freie Base des neuen Antibiotikums mittels Gefriertrocknung. Sie stellt ein weisses, in Wasser mit stark alkalischer Reaktion lösliches, in organischen Lösungsmitteln unlös- liches Pulver dar. Ausbeute 0, 4 g.
Zur Gewinnung der freien Base mit Hilfe eines schwach basischen Ionenaustauschers wird wie folgt vorgegangen :
Man perkoliert eine etwa 20"/o wässrige Lösung von 1 g des nach Beispiel 2 erhaltenen Rohsulfats des neuen Antibiotikums durch eine Kolonne des schwach basischen Ionenaustauschers Dowex-2p, wobei etwa die 30fache Menge des zuvor mit ver dünnter Salzsäure-Wasser-verdünnter Natronlauge Wasser wiederholt in dieser Reihenfolge gewaschenen lonenaustauscherharzes angewendet wird. Die mit der Sulfatlösung beschickte Kolonne wird mit Wasser nachgewaschen, wobei die Base leicht eluiert wird.
Das Eluat wird zwecks Gewinnung der Base wie zuvor vorteilhaft lyophilisiert. Ausbeute 0, 7 g.
Beispiel 7
Eine nach Beispiel 1 gewonnene, vom Mycel befreite Kulturlösung des Antibiotikums A 7907 wird langsam durch eine Kolonne eines schwach sauren, Carboxylgruppen enthaltenden Ionenaustauscher- harzes wie z. B. Amberlite IRC-50 filtriert, wobei je Liter der Antibiotikumlösung 100 g der H-Form des Austauschers angewendet werden, und die Durchflussgeschwindigkeit auf 5 bis 10 Liter je Stunde eingestellt wird. Das Antibiotikum A 7907 wird, zusammen mit inaktiven, zum Teil stark braun gefärbten Begleitstoffen adsorbiert ; die abfliessende, ein p von 3 bis 3, 5 aufweisende Lösung hat nur eine sehr geringe antibiotische Wirksamkeit.
Man wäscht hierauf die Amberlitep-Kolonne mit 1/5 des Volumens der einfiltrierten Kulturlösung destillierten Wassers nach, wobei ein Teil der inaktiven, gefärbten Begleitstoffe entfernt, das Antibiotikum selber jedoch nicht eluiert wird. Um dieses aus dem Adsorbat zu gewinnen, schickt man durch die vorgewaschene Kolonne eine wässrige Lösung von 0, 2n Salzsäure, und zwar total 1/des des Volumens der angewendeten Kulturlösung.
Das Eluat wird in 5 gleichen Fraktionen aufgefangen.
Die Testierung derselben ergibt, dass die Hauptmenge des aktiven Materials, nämlich 80 bis 90 /a, in den ersten beiden Eluaten vorhanden ist, während die übrigen, gleichfalls noch gefärbten Eluate nur eine relativ geringe antibiotische Wirksamkeit aufweisen.
Man vereinigt die beiden stark aktiven, sauren Eluate und neutralisiert sie entweder mit konzentrierter Natronlauge oder mit Hilfe eines schwach basischen Ionenaustauschers in der OH-Form. Die so gewonnene Antibiotikumlösung kann als solche oder nach Konzentrierung im Vakuum und bei niedriger Temperatur als Ausgangslösung zur Herstellung weiter angereicherter Präparate des Antibiotikums A 7907, z. B. nach den in den Beispielen 2-3 oder 4 beschriebenen Verfahren, verwendet werden.
Process for the production of a new antibiotic
The present invention relates to a process for the production of a new, water-soluble antibiotic which has basic properties and which is referred to below as A 7907.
The antibiotic A 7907 arises from the culture of a new actinomycetes species of the genus Streptomyces, which does not match any of the species listed in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 6th edition, or in Actinomycetes and their Antibiotics by Waksman and Lechevalier, 1953 is identical and is referred to below under the name Streptomyces A 7907 n. sp. is described. Streptomyces A 7907 was isolated from a soil sample collected in Zuoz, Canton of Graubünden (Switzerland) and is stored under this name in our laboratories and at the Swiss Federal Institute of Technology, Institute for Special Botany, Zurich.
Streptomyces A 7907 forms a cinnamon-brown to reddish-gray aerial mycelium and carries chains of conidia, which are a typical feature of the genus Streptomyces. The pigment is not clearly soluble. The growth is relatively little dependent on temperature, both at 18 and at 400 the fungus develops well, but the optimum is between 25 and 32 ". Streptomyces A 7907 shows certain similarities with S. xanthophaeus Lindenbein and with S. cinnamoneus Benedict, Pridham et Lindenfelser, however, is not identical to these two organisms.
For the production of the antibiotic A 7907 variants of the genus Streptomyces A 7907 can be used, as they are, for. B. by selection or mutation, in particular under the action of ultraviolet or X-rays or of nitrogen mustard oils. Such a Streptomycete strain is e.g. B. cultured aerobically in aqueous, carbohydrates, nitrogen-containing compounds and inorganic salts containing nutrient solution, and the antibiotic A 7907 isolated on it.
The cultivation thus takes place, for example, in static surface culture or preferably submerged with shaking or stirring with air or oxygen in shake flasks or the known fermenters. The temperature is suitable, for. B. between 18 and 40's. The nutrient solution generally shows a significant antibacterial effect after 11/15 days.
As an assimilable carbohydrate, for. B. glucose, sucrose, lactose, starch and glycerol can be used. The nutrient solution can contain nitrogen-containing nutrients and optionally growth-promoting substances, e.g. B. amino acids, peptides and proteins and their breakdown products such as peptone or tryptone, also meat extracts, water-soluble components of cereal grains such as maize and wheat, of distillation residues from alcohol production, of yeast, beans, especially the soya plant, of seeds, for example the cotton plant, etc. , but also nitrates. The nutrient solution can contain other inorganic salts, for example, chlorides, carbonates, sulphates of alkalis, alkaline earths, magnesium, iron, zinc and manganese.
The antibiotic A 7907 is a water-soluble substance or a mixture of such substances. It is completely insoluble in organic solvents, especially lipoid solvents. The antibiotic is basic and forms salts which, in part, e.g. B. the hydrochloride, in certain organic solvents, e.g. B. in lower aliphatic alcohols, are soluble. When cultivated in aqueous media, the antibiotic is found almost entirely in the nutrient solution, while the mycelium separated from it has practically no biological activity.
For the purpose of obtaining antibiotic A 7907 from a culture solution, it cannot be extracted with organic solvents. On the other hand, it can advantageously be withdrawn from the nutrient solution in the case of a neutral or weakly alkaline reaction with adsorbents and extracted from the adsorbates with acidic elution liquids, suitably with a pH below 4, with activated carbon, e.g. B. Nomit (registered trademark), on the other hand, cation exchangers, namely those that contain carboxyl groups, such as. B. the commercially available exchange resin Amberlite IRC-50 (registered trademark) can be used.
If activated charcoal is used as the adsorbent, suitable elution liquids are both acidic aqueous solutions and acid-containing solvents which are miscible with water, such as lower aliphatic alcohols and ketones. A mixture of equal parts by volume of methanol and formic acid has proven to be particularly advantageous. Since, in addition to the antibiotic, the activated charcoal also adsorbs larger amounts, some of which are colored, impurities from the culture solution, the adsorption column is washed with ethanol before the antibiotic is eluted, with otherwise unchanged conditions, whereby a large part of the accompanying substances is removed, but the antibiotic is not is extracted.
A highly enriched preparation of the antibiotic in the form of a white powder can be obtained from the acidic eluate by z. B. concentrated in vacuo to a small volume, the organic solvent and most of the formic acid being removed, and then the aqueous concentrate, advantageously after dilution with 4-5 volumes of methanol, preferably mixed with acetone and the resulting precipitate washes with this solvent and finally dries. Since the coal eluate, especially from cultures with nutrient solutions containing calcium carbonate, contains considerable amounts of calcium ions, the calcium is expediently excreted from the concentrate with oxalic acid before the antibiotic is precipitated.
To adsorb the antibiotic with a cation exchanger, it is advantageously used in the H form. The elution can take place with dilute aqueous acid, if necessary after prewashing the column with distilled water, with inactive accompanying substances being eliminated. A particularly suitable eluant is 0.2N hydrochloric acid. The antibiotic is contained in the eluate in the form of a salt. Cation exchanger eluates can be used as such or after concentration in vacuo, if necessary after prior neutralization, for the production of further enriched preparations of the antibiotic.
To isolate the pure antibiotic A 7907 or from preparations pre-purified by carbon or ion exchange adsorption, it is expedient to add a volume of an aqueous solution of the salt of a salt which is just sufficient for complete precipitation to its aqueous solution, which has been adjusted to a pH of 6.57.0 Azo dye containing sulfonic acid groups and isolates the resulting poorly soluble dye salt of the antibiotic. If the azo dye salt used is the sodium salt of 4'-dimethylamino-azobenzene-4-sulfonic acid, which is commercially available under the name Helianthin or Orange III, the dye salt (heliantate) of antibiotic A 7907 is entirely or partially precipitated in crystallized form.
The heliantate of the antibiotic can be recrystallized from water or methanol or mixtures of these, but also from formamide and water. When recrystallized, it is a red-brown powder under the microscope. When viewed under the microscope, it forms yellow, layered flakes or rods that melt at 186-188 with decomposition.
To recover the antibiotic from the dye salt, it can be reacted in an aqueous or alcoholic medium with the salt of an inorganic acid and an organic base, the salt of the antibiotic of the acid in question and the dye salt of the base being formed. If you use z. B. triethylamine sulfate to this reaction and carries it out with an aqueous suspension of the antibiotic helianthate, the water-soluble sulfate of the antibiotic and the insoluble helianthate of triethylamine are obtained, the latter going into solution if enough methanol is added to the reaction solution , while the antibiotic sulfate, which is only soluble in water but completely insoluble in lower alcohols, precipitates and z. B. can be isolated by filtration.
The reaction can, however, also be carried out in an alcoholic or aqueous alcoholic solution, the sulfate precipitating out immediately and being able to be separated off from the dye solution. The sulfate of antibiotic A 7907 obtained in this way is a colorless powder that is easily soluble in water and formamide, but insoluble in organic solvents such as alcohols and ketones and has high antibiotic activity.
From the sulfate z. B. the hydrochloride of the antibiotic can be obtained by reacting in aqueous solution with barium chloride and isolating from the barium sulfate-free solution as a hardly colored powder that is easily soluble in water and methanol and less soluble in ethanol. On the other hand, it is also possible to prepare the hydrochloride directly from the heliantate of the antibiotic by adding concentrated hydrochloric acid or an excess of gaseous hydrochloric acid in methanol to the solution or suspension of the latter in methanol, precipitating the hydrochloride formed with ether and isolating it.
In order to remove small colored impurities from the hydrochloride produced by these methods, it is useful to filter its methanolic solution through a column of activated carbon, preferably carbon black, the hydrochloride being obtained as a pure white powder after evaporation of the solvent from the filtrate very slow evaporation from aqueous or methanolic solution partially precipitates in crystalline form.
The isolation of the antibiotic A 7907 in pure form can also be done in such a way that it is extracted from aqueous solutions with an organic acid of the picric acid type, such as. B. picric acid itself, styphnic acid or picrolonic acid, precipitated as a sparingly soluble salt and the latter by treatment with acids, e.g. B. hydrochloric acid or sulfuric acid, in an aqueous medium or in a water-miscible solvent such as methanol or acetone is converted into the corresponding salt and isolated as such. After this enrichment process, the antibiotic can e.g. B. from the sulfate purified via the heliantate, but also from the eluates of the carbon and cation exchange adsorbates.
The free base of the antibiotic A 7907 is easily accessible from its salts, from the sulfate z. B. by reaction in an aqueous medium with barium hydroxide, neutralization of the excess barite with carbon dioxide and separation of the barium carbonate and barium sulfate precipitate and isolation of the antibiotic base by freeze-drying. It is easier to prepare from the salts using a strongly basic anion exchanger, e.g. B. the OH form of the product under the name Dowex-2 (registered trademark).
Antibiotic A 7907 is a colorless base which is easily soluble in water and aqueous media, but insoluble in organic solvents.
The aqueous solution of the base has an alkaline reaction. A 1 / o solution of a preparation isolated by means of an ion exchanger has a pH of 10.5.
The antibiotic A 7907 forms salts with acids. B. the colorless sulfate and hydrochloride are very easily soluble in water. The hydrochloride also dissolves in lower aliphatic alcohols, especially in methanol. The color salt of the base with 4'-dimethylamino-azobenzene-4-sulfonic acid (helianthat) is sparingly soluble in both aqueous and alcoholic media. From such hot, saturated solutions it separates in yellow-colored, lobed, layered flakes which, after recrystallization, show a decomposition point of 186-188. If aqueous or methanolic solutions evaporate very slowly, the hydrochloride of the antibiotic can also be obtained in crystalline form.
The hydrochloride of the antibiotic A 7907 has the following elementary composition: C = 39.5 / o, H = 7.2 / o, N = 15.5 O / o, O = 19.8 O / o, Cl = 17.2 O / o. [a] 2D = + 21.
Other salts of the antibiotic A 7907 are derived from z. B. acetic acid, palmitic acid, succinic acid, citric acid or pantothenic acid.
The antibiotic A 7907 has a polypeptide character, as can be seen from the infrared spectrum, the color reactions and the elemental composition. As the comparative paper chromatographic examination shows, it differs from the known water-soluble, colorless antibiotics streptomycin, streptothricin and neomycin that are effective against gram-positive and gram-negative bacteria. Despite the similarity of the strain Streptomyces A 7907, which produces the new antibiotic, with the organism Streptomyces xanthophaeus Lindenbein, which produces the antibiotic geomycin, and the very similar elementary composition of the hydrochlorides of antibiotic A 7907 and geomycin (cf. H. Brockmann and H.
Musso: Naturwissenschaften Volume 41, page 451 [1954], Chemical Reports Volume 87, page 1779 [1954]) the antibiotic A 7907 is not identical to geomycin, since, in contrast to this, there is no ninhydrin reaction and only an extremely weak color reaction according to Sakaguchi gives. On the other hand, in contrast to geomycin, it shows a strong biuret reaction, which the latter lacks.
The antibiotic A 7907 is also not identical to the water-soluble polypeptide cinnamycin, which is produced by Streptomyces cinnamoneus Benedict, Pridham and Lindenfelser, which is also similar to Streptomyces A 7907, because cinnamycin contains sulfur in its molecule and, incidentally, only against gram-positive, but not is effective against gram-negative bacteria.
The antibiotic A 7907 has a very high antibiotic effectiveness against various test organisms. If one uses as a test method in vitro dilution series (powers of ten) in glucose broth, which are incubated for 24 hours at 37, the following still inhibiting concentrations result:
Inhibitory test organisms Concentration g / cm3 Micrococcus pyogenes, var. Aureus 10 Micrococcus pyogenes, var. Aureus penicillin-resistant 100 Streptococcus pyogenes 100 Streptococcus viridans 100 Corynebacterium diphtheriae 1 Escherichia coli 100 Escherichia coli resistant, Escherichomycetin 100 type coli, streptosa 100, Escherichia coli 100 Salmonella schottmuelleri 10 Shigella sonnei 100 Pseudomonas aeruginosa 100 Klebsiella typ. A 100 Pasteurella pestis 100
Inhibitory test organisms concentration g / em3
Vibrio cholerae el Gate 100
Bacillus megatherium 1
Bacillus subtle 10
Candida vulgaris 10
Endomyces albicans 10
The antibiotic A 7907 is also effective in vivo.
After subcutaneous administration of 50 mg / kg to mice infected with Escherichia coli six times, 100% survivors were observed. With the same application, the same effect can be seen in mice with the Klebsiella type. A, also an effect in those infected with Salmonella typhi murium.
The toxicity of the antibiotic is low. The subcutaneous application of six times 50 mg / kg is z. B. endured by mice without harm. Higher doses have not yet been tested.
The antibiotic or its salts can be used as a remedy, e.g. B. in the form of pharmaceutical preparations, use. These contain the compounds mentioned in a mixture with a pharmaceutical, organic or inorganic carrier material suitable for enteral, parenteral or local administration. For the same, substances come into question that do not react with the new compounds, such as. B. gelatin, milk sugar, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohols, gum, polyalkylene glycols, petrolatum, cholesterol or other known excipients. The pharmaceutical preparations can e.g. B. as tablets, coated tablets, powders, ointments, creams, suppositories, or in liquid form as solutions, suspensions or emulsions.
If necessary, they are sterilized and / or contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers. They can also contain other therapeutically valuable substances.
In the following examples, the temperatures are given in degrees Celsius.
example 1
The cultivation of Streptomyces A 7907 is carried out according to the submerged method. A nutrient solution is used that contains the following additives per liter of tap water:
Lactose 10 g
Soy flour 10 g
Sodium chloride 5 g
Sodium nitrate 1 g
Calcium carbonate 10 g
The nutrient solution is sterilized in the inoculation flask or in the fermenter for 20-30 minutes at 1 atm. The sterilized nutrient solution shows ap. from 7.5 to 8.0. Inoculation takes place with up to 100 / o of a partially sporulating vegetative culture of the organism. Incubate with good shaking or stirring at 27, cultures in fermenters with about 1 vol. Sterile air per vol.
Solution to be aerated in the minute. After 70 to 120 hours of incubation, the culture solution has reached the greatest inhibitory value against the test organisms (B. subtilis, B. megatherium, Staph. Aureus, Esch. Coli, Candida vulgaris). The culture is interrupted and the inactive mycelium and other solid substances are separated constituents of the solution containing the antibiotic by means of filtration or centrifugation, optionally the culture solution before the filtration about 1 I / o of a filter aid, for. B. Hyflo Super cel (registered trademark) is added. The pH of the culture filtrate is usually not or only slightly changed compared to the sterilized nutrient solution.
If, instead of the nutrient solutions given above, those containing the mixtures of nutrients per liter of tap water listed under a) to f) are used, culture filtrates of similarly high antibiotic activity are obtained after analogous cultivation and processing. Instead of adding Hyflo Supercel or another such filter aid, rapid filtration of the culture solution can also be achieved by bringing it to pH 5 with hydrochloric acid before filtration and then to a concentration of 0.5 by adding an aqueous solution of aluminum sulfate "/ o this salt discontinues.
In addition to the lactose nutrient solution mentioned, other nutrient solutions are used with the following additives per liter of water: a) Glucose 10 g
Soy flour 10 g
Sodium chloride 5 g
Sodium nitrate 1 g b) glycerine 20 g
Soy flour 10 g
Sodium chloride 5 g
Sodium nitrate 1 g
Calcium carbonate 10 g c) glucose 10 g
Soya flour 10 g Corn steep liquor (corn steep liquor) 20 g
Sodium chloride 5 g
Sodium nitrate 1 g
Calcium carbonate 10 g d) glucose 10 g
Peptone 5 g
Meat extract (Oxo Lab Lemco, branded product) 3 g
Sodium chloride 5 g
Calcium carbonate 10 g e) glucose 10 g
Casein 3 g
Potassium phosphate sec. 2 g f) starch 10 g
Peptone 4 g
Dry yeast 1 g
Potassium phosphate sec. 2 g
A filtrate obtained in accordance with the above information or
Centrifugate of a culture of Streptomyces A 7907 usually has a pH of 7.5 to 8.
If this is not the case, the pH is adjusted to this value for the subsequent enrichment of the new antibiotic with the help of 10N sodium hydroxide solution. The weakly alkaline filtrate is then mixed with 1/01 activated charcoal (Norit) for the purpose of adsorbing the antibiotic and the mass is mechanically stirred for 1 hour, the entire antibiotic substance being absorbed by the charcoal.
The latter is filtered by filtration, advantageously with the addition of some filter aid, such as. B. Hyflo Supercel, separated from the completely inactive, almost water-white solution.
In addition to the antibiotic, the coal adsorbs large amounts of other organic, antibiotic inactive substances, especially strongly colored degradation products from the nutrient solution, but also inorganic salts. These accompanying substances are advantageously removed from the charcoal before the antibiotic is eluted. For this purpose, the filtered off, still moist coal mass is added to five times the amount of 95 ouzo ethanol and the suspension is stirred for 1/2 hour. The carbon pre-washed in this way can easily be separated from the washing liquid by filtration.
The brown colored filtrate shows no antibiotic activity.
The new antibiotic is eluted with acidified aqueous methanol, expediently with a mixture of equal parts by volume of methanol and formic acid, with 2 cmS of elution liquid being used for 1 g of adsorbent. The suspension is stirred well mechanically for 19 hours, then filtered, whereupon the carbon residue is extracted three more times in the same way. The eluates, of which only the first is pale yellowish in color and the rest are colorless, show the entire antibiotic activity. They are combined and placed in vacuo at a low bath temperature, e.g. B. at 40 to 60, concentrated to t / tOO of the original volume, with most of the formic acid being removed in addition to the methanol and a lot of water.
The pn of the yellowish, but thin concentrate is usually around 4.
The concentrate contains, especially if the culture was carried out in the lactose nutrient solution mentioned at the beginning of this example or in the nutrient solutions b) to d), larger amounts of calcium. This is removed in the form of the sparingly soluble oxalate by adding a 10 ouzo aqueous oxalic acid solution to the concentrate while stirring. The amount of oxalic acid solution required for complete precipitation is precisely determined in an aliquot of the concentrate.
For concentrates from cultures of the lactose nutrient solution or the nutrient solutions b) to d), between 300 to 500 cm3 of oxalic acid solution per liter of concentrate are required, corresponding to 3 to 5 cm3 per liter of original culture filtrate, while concentrates from culture solutions with a low calcium carbonate content, less oxalic acid Require separation of the calcium.
The antibiotic is obtained from the calcium-free concentrate in the form of a highly enriched white powder by first diluting the aqueous concentrate with 4 to 5 volumes of methanol and then precipitating the active material with 20 volumes of acetone. The precipitate is filtered off, washed twice with acetone and finally freed from residual solvent in vacuo.
A pure white powder is obtained which shows almost the entire antibiotic activity of the culture filtrate. The yield is between 300 and 500 mg per liter of culture filtrate.
Example 2
A significantly greater concentration of the antibiotic A 7907 than after the acetone precipitation described in Example 1 can be achieved by preparing its crystallized helianthin salt.
For this purpose, the calcium-free concentrate obtained according to Example 1 is diluted with 2 volumes of water, the pH of the solution is adjusted to pH 6.7 to 7.0 with 10N sodium hydroxide solution and the volume required for complete precipitation is almost one with vigorous stirring and in a thin stream saturated aqueous solution of helianthin containing 3.5 g of helianthin (orange III, sodium salt of 4'-dimethylamino-azo benzene-4-sulfonic acid) per liter, the precipitating solution advantageously being introduced directly into the antibiotic solution. The volume of the helianthin solution required for complete precipitation is determined in a preliminary test with an aliquot.
Depending on the antibiotic content, it usually varies between 50 to 150 times the amount of the undiluted concentrate used. The helianthat (helianthin salt of the antibiotic) that forms is largely precipitated in a crystallized state, in the form of thin rods and / or platelets. The precipitation solution is left to stand for a few hours at a low temperature, around 0, during which the precipitate completely settles out. The majority of the clear supernatant solution is then separated off from the precipitate by decanting, the remainder using the centrifuge. This is mixed with about the same amount of ice-cold water for the purpose of washing and then isolated using the suction filter. The washing is repeated twice in the same way, but with acetone. The helianthat of the new antibiotic which has been washed in this way is then dried in a vacuum.
The yield is between 40 and 70 mg heliantate / cm concentrate. The dry product is a red-brown powder. It is rather sparingly soluble in water and methanol, but more easily in formamide, but insoluble or very sparingly soluble in lipoid solvents such as acetone, ether, benzene, chloroform and the like. a. It can be recrystallized from water and methanol as well as from mixtures of these solvents, whereby it is obtained in yellow, lobed, layered flakes that melt at 186-188 with decomposition.
To produce the sulfate of the new antibiotic from the Helianthat z. B. 10 g of the Helianthat dry powder suspended in 50 cmS of water, 16 cm3 of an aqueous, 80 ouzo solution of triethylamine sulfate added to the suspension and the mass stirred for 1 hour, gradually turning red-violet due to the sparingly soluble triethylamine salt of the helianthin discolored. The implementation can be accelerated considerably by heating. The reaction mixture is then treated with 20 volumes of methanol, the sulfate of the antibiotic precipitating out as a white precipitate, while the triethylamine heliantate dissolves.
The antibiotic sulfate obtained by centrifugation or filtration is freed from adhering dye by reprecipitating twice from water with methanol, finally washed with pure methanol and then dried. It is a pure white, amorphous powder that is insoluble in organic solvents, but slightly soluble in water. About 1 g of sulfate is obtained from 10 g of raw antibiotic helianthat.
Example 3
For the purpose of converting the sulfate prepared according to Example 2 into the hydrochloride of the new antibiotic, which is readily soluble in both water and methanol, this is dissolved in 10 times the amount of water and the aqueous solution is treated with a 20 "/ o barium chloride solution until it is completely precipitated, about 2 cmS per g of sulfate are required.
The barium sulfate precipitate is removed by centrifugation and the hydrochloride is isolated from the colorless supernatant solution by freeze-drying. About 0.8 g of hydrochloride per g of sulfate are obtained in this way. In order to achieve further purification of the hydrochloride, it is dissolved in a little methanol, the concentrated solution is poured onto a chromatography column of gas black washed with methanol and eluted with the same solvent. The evaporation residue of the eluate is a pure white powder that is easily soluble in methanol and water, which separates out of these solvents in crystalline form when evaporating very slowly.
Instead of preparing the hydrochloride via the sulfate, this can also be obtained directly from the helianthat. For this purpose, the latter is suspended in a dry, finely divided state in approximately 10 times the amount of absolute methanol, 2 volumes of 10N hydrochloric acid-methanol are added to the suspension and then briefly boiled. After decolorization with a little Norit carbon, it is filtered, the water-white filtrate is then concentrated in vacuo to about 1 liter of the original volume and the hydrochloride is precipitated from the concentrate with 10 to 20 volumes of ether or acetone.
Example 4
The antibiotic obtained as crude sulfate according to Example 2 is further purified via the picrate as follows.
130 cm3 of saturated aqueous picric acid solution is slowly added to a well-stirred solution of 1 g of sulfate in 20 cm3 of water, which is just sufficient for complete precipitation. An oily precipitate forms, which is centrifuged off, washed once with a little saturated picric acid solution and once with water and then dried in a vacuum desiccator, the picrate being converted into a solid but not crystallized mass. The yield is 1.3 g. To convert the picrate of the antibiotic into its hydrochloride, the first is dissolved in warm methanol acidified with concentrated hydrochloric acid and the solution is poured into 10 volumes of ether, the insoluble hydrochloride precipitating as a white mass.
This is freed from any residues of picric acid that are still adhering to it by dissolving it in the amount of boiling methanol required for solution and repeating the ether precipitation. This gives about 0.7 g of pure white, powdery hydrochloride.
Example p
Instead of the picrate, which has not yet been crystallized, you can use the pure antibiotic, e.g. B. win as hydrochloride via the crystallized picrolonate, proceeding as follows:
A solution of 5.0 g of the sulfate obtained according to Example 2 in 500 cm3 of water is added dropwise with stirring within 1 hour of 2500 cm3 of a nearly saturated aqueous solution of picrolonic acid containing 2.7 g per liter. The separated amorphous precipitate of the picrolonate is filtered off with suction and dissolved in 1700 cm3 of boiling water for crystallization and the solution is filtered while hot. The picrolonate separates out of the filtrate in partially crystallized form on slow cooling to room temperature.
The precipitate is collected on the suction filter, washed with a little ice-cold water and dissolved in 1500 cm3 of boiling water for recrystallization.
The picrolonate now completely precipitates from the hot, filtered solution in the form of fine yellow needles arranged in drusen, which after washing with a little cold water and drying in vacuo over phosphorus pentoxide, after sintering at 205-208, have a sharp decomposition point of 213- 214 have. The yield of the twice recrystallized picrolonate is 5.2 g.
The pure hydrochloride is obtained from the picrolonate obtained above by adding 3.5 cm3 of a 10N solution of gaseous hydrogen chloride in absolute methanol in portions to the finely divided suspension of 5.0 g of picrolonate in 80 cm3 of ice-cold methanol with vigorous stirring Implementation of the partially excreted hydrochloride of the antibiotic that is formed is completely precipitated by adding 10 volumes of absolute ether to the reaction mixture. The hydrochloride is filtered off with suction, washed once with a little ether on the suction filter and then dissolved in 20 cm3 of methanol in order to remove any still adhering picrolonic acid esters and again precipitated and washed with ether.
The now pure hydrochloride of the antibiotic is a pure white, amorphous powder after drying in vacuo. The yield is 2.2 g.
Example 6
The preparation of the free base of the new antibiotic from its sulfate can be done either with barium hydroxide or by using a weakly basic ion exchanger. In the first case z. B. a solution of 1 g of the sulfate of the antibiotic obtained according to Example 2 in 5 cm3 of water with a slight excess of a warm, saturated solution of barium hydroxide, that is, until the reaction mixture has a pH of about 9. The excess barium hydroxide is then immediately neutralized by introducing carbon dioxide into the solution. The reaction mixture is then kept in a water bath at 60 for a few minutes in order to transfer the barium bicarbonate formed, whereupon the precipitated barium carbonate is centrifuged off together with the barium sulfate.
The free base of the new antibiotic is isolated from the supernatant, water-white, alkaline centrifugation solution by means of freeze-drying. It is a white powder which is soluble in water with a strongly alkaline reaction and insoluble in organic solvents. Yield 0.4 g.
To obtain the free base with the help of a weakly basic ion exchanger, proceed as follows:
An approximately 20 "/ o aqueous solution of 1 g of the crude sulfate of the new antibiotic obtained according to Example 2 is percolated through a column of the weakly basic ion exchanger Dowex-2p, about 30 times the amount of sodium hydroxide solution previously diluted with dilute hydrochloric acid-water ion exchange resin washed repeatedly in this order is used: The column charged with the sulfate solution is washed with water, the base being easily eluted.
The eluate is advantageously lyophilized as before in order to obtain the base. Yield 0.7g.
Example 7
A culture solution of antibiotic A 7907 obtained according to Example 1 and freed from the mycelium is slowly passed through a column of a weakly acidic ion exchange resin containing carboxyl groups, such as. B. Amberlite IRC-50 filtered, using 100 g of the H-form of the exchanger per liter of the antibiotic solution, and the flow rate is set to 5 to 10 liters per hour. The antibiotic A 7907 is adsorbed together with inactive accompanying substances, some of which are very brown in color; the solution flowing off, with a p of 3 to 3.5, has only very little antibiotic activity.
The Amberlitep column is then washed with 1/5 of the volume of the culture solution filtered in with distilled water, some of the inactive, colored accompanying substances being removed, but the antibiotic itself not being eluted. In order to obtain this from the adsorbate, an aqueous solution of 0.2N hydrochloric acid is sent through the pre-washed column, namely a total of 1 / that of the volume of the culture solution used.
The eluate is collected in 5 equal fractions.
The testing of the same shows that the main amount of the active material, namely 80 to 90 / a, is present in the first two eluates, while the remaining, likewise still colored eluates have only a relatively low antibiotic activity.
The two strongly active, acidic eluates are combined and they are neutralized either with concentrated sodium hydroxide solution or with the aid of a weakly basic ion exchanger in the OH form. The antibiotic solution obtained in this way can be used as such or after concentration in vacuo and at low temperature as a starting solution for the production of further enriched preparations of the antibiotic A 7907, e.g. The procedures described in Examples 2-3 or 4 can be used.