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Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues, wasserlösliches Antibiotikum, das im folgenden mit A 9578 bezeichnet wird, seine Komponenten, seine Salze und Derivate sowie pharmazeutische Präparate, welche diese Verbindungen enthalten, und Verfahren zur Herstellung dieser Substanzen und Substanzgemische.
Das Antibiotikum A 9578 entsteht bei der Kultur eines neuen Actinomyceten-Stammes, der aus einer bei Boston, Mass., USA, gesammelten Erdprobe isoliert worden ist und der in unseren Laboratorien, sowie in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik unter der Bezeichnung A 9578 aufbewahrt wird.
Streptomyces A 9578 gehört der Art Streptomyces griseoflavus (Krainsky) Waksman et Henrici an, unterscheidet sich aber von andern Vertretern dieser Art durch die Bildung des neuen wasserlöslichen Antibiotikums. Es ist bis jetzt nur ein Stamm von Streptomyces griseoflavus bekannt, der ein Antibiotikum produziert. Dabei handelt es sich um das sogenannte Griseoflavin [Y. Waga, J. Antibiotics Japan, A 6, 66 (1953)], das sich aber vom neuen Antibiotikum A 9578 schon durch seine Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln unterscheidet. Das Luftmycel des Streptomyces A 9578 ist aschgrau. Die Sporenträger sind verzweigt und bilden reichlich Spiralen mit meist 2-5 Windungen. Die Sporen selbst haben eine Grösse von 1, 0-1, 3 x 0, 7-0, 9). t und tragen an ihrer Oberfläche zirka 0, 2 li lange, spitz zulaufende und an der Basis nur wenig verbreiterte Stacheln.
Das Wachstum ist relativ wenig temperaturabhängig, sowohl bei 180 als auch bei 40 entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 320.
Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum von Streptomyces A 9578 auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien 1-7 sowie 10 wurden nach W. Lindenbein, Arch.
Mikrobiol. 17,361 (1952) hergestellt.
1. Synthetischer Agar : Kolonien schleierartig, farblos, kein Luftmycel.
2. Synthetische Lösung : Sediment, Flocken rötlich. Gut ausgebildete Pellikel mit schlei- erartigem, weissgrauem Luftmycel. Substrat braungelb bis sattgelb.
3. Glucose-Agar : Kolonien anfangs punktförmig, nach 12 Tagen runzlig, blassgelb.
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: Kolonienanfangs punktförmig, späterschleierartig,gelb.
5. Calciummalat-Agar : Kolonien schleierartig, weissgelb, später sattgelb. Luftmycel spär- lich, mehlig bestäubt, mehlweiss. Substrat hellbraun.
6. Gelatinestich (180C) : Wachstum sehr spärlich, Verflüssigung sehr langsam (0,5 cm nach
30 Tagen).
7. Stärkeplatte : Kolonien schleierartig, milchweiss, kein Luftmycel, Hydrolyse
1 cm nach 5 Tagen.
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verfärbt.
9. Karotten : Wachstum sehr spärlich. Luftmycel spärlich, Substrat nicht verfärbt.
10. Lackmusmilch : RingförmigeKolonien ; Oberflächenhaut farblos. Luftmycel weiss- grau. Hydrolyse langsam, ohne Koagulation ; Lackmus blau.
Tyrosinasereaktion : Negativ.
Streptomyces A 9578 zeigt, nach der Methodik von T. G. Pridham und D. Gottlieb, J. Bacterlology 56, 107 (1948) untersucht, bei Verwendung der folgenden Kohlenstoffquellen gutes Wachstum : L-Xylose, L-Arabinose, L-Rhamnose, Saccharose, Raffinose, Inulin, D-Mannit, D-Sorbit, Mesoinosit, Salicin, D-Fructose.
Die vorliegende Erfindung ist, was die Herstellung des Antibiotikums A 9578 anbelangt, nicht auf die Verwendung des Streptomyces A 9578 oder anderer der Beschreibung entsprechender Stämme beschränkt, sondern betrifft auch die Verwendung von Varianten dieser Organismen, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stick- stoff- Senfölen gewonnen werden.
Zur Erzeugung des Antibiotikums A 9578 wird ein die Eigenschaften von Streptomyces A 9578 aufweisender Streptomyceten-Stamm, z. B. in wässeriger, Kohlenhydrate, stickstoffhaltige Verbindungen sowie anorganische Salze enthaltender Nährlösung aerob gezüchtet, bis diese eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt, und das Antibiotikum A 9578 hierauf isoliert.
Als assimilierbare Kohlenhydrate kommen z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Mannit, Stärke sowie Glycerin in Frage. Als stickstoffhaltige Nährstoffe und gegebenenfalls wachstumsfördernde Stoffe seien genannt : Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte wie Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekömern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Soyapflanze, von Samen, beispielsweise derBaumwollpf1anze usw. aber auch Ammoniumsalze und Nitrate.
Von andern anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Ma- gnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten,
Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 400. Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach l 1/2-5 Tagen.
Zur Isolierung des Antibiotikums A 9578 können z. B. folgende Verfahren dienen : Man trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge des Antibiotikums im Kulturfiltrat gefunden wird.
Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen des Antibiotikums am Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteilhaft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich Wasser und wässerige organische Lösungsmittel, wie Alkohole, z. B. wässeriges Methanol.
Um das Antibiotikum dem Kulturfiltrat zu entziehen und zu reinigen, sind verschiedene Methoden geeignet, die einzeln oder in Kombination miteinander angewendet werden können. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die Kulturlösung während dieser Operationen auf einem PH zwischen 3 und 5 zu halten.
1. Man kann Adsorptionsmittel verwenden, z. B. Aktivkohlen, wie Nont, aktivierte Erden, wie Fullererde oder Floridin, oder Harzadsorber, wie Asmit. Die Elution der Adsorbate erfolgt zweckmässig mit Gemischen von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln mit Wasser oder wässerigen Säuren, z. B. mit Wasser-Methanol-, Wasser-Pyridin-, verdünnte Essigsäure-Methanol- oder Wasser-MethanolEisessig-Butanol-Gemischen. Als besonders vorteilhaft für die Elution eines Noritadsorbates hat sich das
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Teile) erwiesen.
2. Eine zweite Methode zur Abtrennung des Antibiotikums aus dem Kulturfiltrat besteht darin, dass man das Antibiotikum an Kationenaustauschern adsorbiert, wobei besonders Säuregruppen enthaltende Harze, wie Amberlite IRC-50 geeignet sind. Letzteres kann sowohl in der Säureform als auch in der Natriumform verwendet werden, doch hat sich ein Gemisch dieser beiden Formen im Volumenverhältnis 1 : 2 besonders bewährt. Die Elution geschieht zweckmässig mit verdünnten Säuren, z. B. mit methanolischer Salzsäure.
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3. Weiter kann das basische Antibiotikum auch direkt aus dem Kulturfiltrat ausgefällt werden, z. B. mitteis Umsetzung mit einer organischen Säure vom Typus der Pikrinsäure. Durch Behandlung dieser Fällungen mit Salzen organischer Basen, z. B. mit Triäthylammoniumsulfat, oder mit verdünnten Säuren, wird das Antibiotikum in Form des entsprechenden Salzes erhalten. Man kann dabei sowohl in wässerigem Medium als auch in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Methanol oder Aceton, arbeiten.
Diese Überführung der schwerlöslichen Salze in leichtlösliche Salze des Antibiotikums wird entweder mit Mineralsäuren oder an Ionenaustauscherharzen, z. B. anAmberliteIRA-400, durchgeführt.
4. Eine Anreicherung des Antibiotikums wird auch dadurch erreicht, dass man wässerige oder alkoholisch-wässerige Lösungen des Salzes mit einem Überschuss von organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie Aceton, Dioxan usw. versetzt, wobei die Salze in fester Form ausgefällt werden.
5. Eine weitere Methode der Anreicherung des Antibiotikums besteht darin, dass man wässerige Lösungen von Phenol In Chloroform extrahiert, wobei sowohl das PH der wässerigen Lösung als auch der Phenolgehalt der Chloroformlösung variiert werden. So befindet sich das Antibiotikum z.
B. bei einer Verteilung zwischen einer Lösung, die auf 100 cm3 Chloroform 100 g Phenol enthält, und einer wässeri- gen Phase von pH 1 bis 6 fast ausschliesslich in der organischen Phase, während es bei der Verwendung einer Lösung, die auf 100 cm Chloroform nur 33 g Phenol enthält, der wässerigen Phase lediglich bei
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Antibiotikums das Verhältnis von Konzentration intion in der wässerigen, so geht aus den obigen Angaben hervor, dass der Verteilungskoeffizient mit steigendem Phenolgehalt der organischen Phase zunimmt und mit sinkendem PH der wässerigen Phase abnimmt.
Da es somit möglich ist, jeden beliebigen Verteilungskoeffizienten des Antibiotikums in diesem System einzustellen, kann man durch Kombination von wenigen Verteilungsoperationen einen Grossteil inaktiver Verunreinigungen abtrennen.
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Anreicherungsmethode fürCelite u. dgl. als Trägersubstanzen, oder aber Chromatographie an Ionenaustauscherharzen, z. B. an Dowex 50, Amberlite IRC-50 u. dgl. Beispielsweise hat sich die Verteilungschromatographie an Cellulose unter Verwendung des Lösungsmittelsystems Butanol (4 Vol.-Teile), Eisessig (1 Vol.-Teil) und Wasser (5 Vol.-Teile) besonders bewährt.
7. Weiter kann dasantibiotikum durchgegenstromverteilung nachcraig zwischen zwei nicht mischbaren Lösungsrnittelphasen angereichert werden. Folgende Lösungsmittelsysteme haben sich dabei bewährt : a) sek. Butanol-1/10 N Ammonacetatpuffer von PH 4, 68
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teilungskoeffizient des Antibiotikums im System b) und damit die Lage des Aktivitätsmaximums In der Verteilung kann einerseits durch Änderung des PH der Pufferlösung und anderseits durch Variierung des Phenolgehaltes der organischen Phase beliebig verändert werden.
Zur Herstellung eines weitgehend reinen Präparates hat sich folgende Kombination der aufgeführten Anreicherungsverfahren bewährt. Aus dem Kulturfiltrat wird das Antibiotikum am gepufferten Ionenaustauscher Amberlite IRC-50 adsorbiert und mittels methanolischer Salzsäure eluiert. Die Eluate werden bei PH 5 im Vakuum konzentriert, wobei ein wässeriges Konzentrat des Antibiotikums erhalten wird, das volumenmässig ungefähr 1/100 derKulturlösung entspricht. Dieses wird gemäss der oben erwähnten Metho- de 5. einige Male zwischenPhenol-Chloroform-Gemischen einerseits und wässerigen Lösungen von variierendem PH anderseits verteilt, wobei nach Gefriertrocknung ein Präparat erhalten wird, das in bezug auf das. Kulturfiltrat eine um den Faktor 500-1000 erhöhte spezifische Wirksamkeit besitzt.
Durch Behandlung eines solchen Präparates gemäss der oben aufgeführten Methoden 6. (Verteilungschromatographie an Cellulose) und Methode 7. kann das basische, weitgehend einheitliche Antibiotikum A 9578 vorzugsweise in Form eines Salzes erhalten werden.
Wie aus papierchromatographischen Untersuchungen hervorgeht, besteht das Antibiotikum A 9578 aus mindestens zwei Komponenten, nämlich der Hauptkomponente A und der Nebenkomponente B. Diese werden im Verlaufe des beschriebenen Anreicherungsprozesses weitgehend voneinander getrennt, speziell bei der Verteilungschromatographie an Cellulose und bei der Gegenstromverteilung.
Die beidenKomponenten von A 9578 werden papierchromatographisch definiert durch einen direkten Vergleich ihrer Ru-Werte mit den Rr-Wenen einer Reihe von bekannten A ntibiotika (2-11) in den Systemen A-G. Beim System H wird durchlaufend chromatographiert. Die angegebenen Zahlen sind dort die in cm
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<tb>
<tb> gemessenenLaufstrecken <SEP> der <SEP> Antibiotika <SEP> nach <SEP> 16-stündiger <SEP> Chromatogrammdauer. <SEP> Der <SEP> Nachweis <SEP> der <SEP> Antibiotika <SEP> erfolgt <SEP> autobiographisch <SEP> mit <SEP> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> oder <SEP> Bacillus <SEP> subtilis.
<tb>
System <SEP> la <SEP> 1b <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP>
<tb> A <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,92 <SEP> 0,07 <SEP> 0
<tb> B <SEP> 0, <SEP> 49 <SEP> 0, <SEP> 63 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 17 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> 0, <SEP> 66 <SEP> 0, <SEP> 55 <SEP> 0.
<SEP> 92 <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP>
<tb> C <SEP> 0, <SEP> 34 <SEP> 0, <SEP> 58 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP> 0, <SEP> 72 <SEP> 0, <SEP> 62 <SEP> 0, <SEP> 93 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> 0, <SEP> 11 <SEP>
<tb> D <SEP> 0,05 <SEP> 0,15 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> x <SEP> x <SEP> 0,92 <SEP> 0
<tb> E <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> x <SEP> x <SEP> 0, <SEP> 86 <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP>
<tb> F <SEP> 0,47 <SEP> 0,47 <SEP> 0,22 <SEP> 0,14 <SEP> 0,12 <SEP> 0,04 <SEP> 0,05 <SEP> 0,49 <SEP> 0,42 <SEP> 0,91 <SEP> 0,43 <SEP> 0,36
<tb> G <SEP> 0,74 <SEP> 0,74 <SEP> 0,07 <SEP> 0,02 <SEP> x <SEP> x <SEP> 0,94 <SEP> 0,61 <SEP> 0,69
<tb> H <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> 7, <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> (14, <SEP> 5) <SEP> (8,
<SEP> 8) <SEP> 27 <SEP> 1
<tb>
A wassergesättigtes Butanol
B Butanol-Eisessig-Wasser (4 : 1 : 5) (obere Phase)
C wassergesättigtes Butanol + 2% p-Toluolsulfosäure
D wassergesättigtes Butanol + 2% Piperidin
E Butanol-Pyridin-Wasser (6 : 4 : 3)
F 80%Äthanol 1, 5% Natriumchlorid, Whatman Nr. 4 imprägniert mit 0, 95-m.
Natriumsulfat + 0,05-m. Natriumhydrosulfat
G Butanol-Äthanol-Wasser (1 : 1 : 2)
H Butanol-Butylacetat-Eisessig-Wasser (10 : 3 : 1, 3 : 14, 3) (obere Phase) la A 9578 Base A Ib A 9578 Base B
2 Streptomycin
3 Ristocetin A
4 Ristocetin B
5 Neomycin B
6 Viomycin
7 Chlortetracyclin
8 Oxytetracyclin
9 Actinomycin J 10 Cycloserin 11 Grisein x Antibiotikum über ganze Laufstrecke verteilt () Position unscharf.
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Die Komponente A des Antibiotikums A 9578 ist ein orangegelbes Pulver, das sich leicht in Wasser, gut in Methanol und schwer in den meisten organischen Lösungsmitteln löst.
Die Base A gibt folgende Farbreaktionen : FeCL : braunrot FeC-KFe (CN) : blau Ninhydrin : schwach violett
Der Sakaguchi-, Maltol- und Ehrlich-Morgantest sind negativ.
Eine wässerige Lösung der Komponente A zeigt im UV-Spektrum Absorptionsmaxima bei 215 m (El% = 312) und bei 315 mp (El% = 42). lcm lcm
Die freie Base des Antibiotikums A 9578 ist leicht aus ihren Salzen zugänglich, aus dem Sulfat z. B. durch Umsetzung in wässerigem Medium mit Bariumhydroxyd, Neutralisierung des überschüssigen Baryts
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mit Kohlendioxyd sowie Abtrennung des Bariumcarbonat- und -sulfat-Niederschlages und Isolierung der freien Base mittels Gefriertrocknung. Einfacher erfolgt die Herstellung aus den Salzen unter Verwendung eines stark basischen Anionaustauschers, z. B. der OH-Form des unter der Bezeichnung Dowex-2 im Handel befindlichen Produktes.
Eine der auffallendsten Eigenschaften des Antibiotikums A 9578 ist ein ausgeprägtes Stabilitätsminimum zwischen PH 7-11. Lösungen des Antibiotikums verlieren bei 200C und bei einem PH von 8-10 innerhalb 48 Stunden den grössten Teil ihrer Aktivität, während sie bei der gleichen Temperatur und bei PH-Werten von 1-5 vollständig und bei einem PH von 6-7 und über 11 teilweise wirksam bleiben.
Die Salze des Antibiotikums A 9578 und seiner Komponente leiten sich von den bekannten anorganischen und organischen Salzen ab, beispielsweise von der Salzsäure, den Schwefelsäuren und Phosphor- säuren, der Essig-, Propion-, Valerian-, Palmitin- oder Ölsäure, der Bernsteinsäure, Zitronensäure, Mandelsäure, Glutaminsäure oder Pantothensäure. Sie stellen neutrale oder saure Salze dar. Ihre Herstellung erfolgt durch Einwirkung der entsprechenden Säuren auf die freie Base oder durch doppelte Umsetzung von Salzen, beispielsweise von A 9578-sulfat mit pantothensaurem Calcium.
Das Antibiotikum A 9578 besitzt eine sehr hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Testorganismen. Im sogenannten Agarquerstrich-Test Ist es aktiv gegen folgende Testorganismen : Micrococcus pyogenes, var. aureus, Streptococcus viridans, Streptococcus faeca1is, Corynebacterium diphteriae, Escherichia coli, Bacillus megatherium und Bacillus subtilis.
In vivo ist das Antibiotikum A 9578 ebenfalls wirksam. Bei fünfma1iger subkutanerVerabreichung von 10 mg/kg an mit Staphylococcus pyogenes, var. aureus infizierte Mäuse werden 100% und bei einer Dosis von 5 mal 5 mg/kg 5Clo Überlebende beobachtet. 50% Überlebende erhält man, wenn man Mäusen, die mit Escherichia coli infiziert sind, 5 mal 50 mg/kg subkutan appliziert.
Die Toxizität des Antibiotikums ist gering. So wird z. B. die subkutane Applikation von 1000 mg/kg von Mäusen ohne Schädigung ertragen. Höhere Dosen wurden noch nicht geprüft.
Das Antibiotikum A 9578, seine Komponenten, seine Salze oder Derivate können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannteArzneimittelträger. Die pharmazeutischenpräparate können z. B. als Tabletten, Dragées, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien, oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.
Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, ohne dass damit eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel l : DieZüchtung desStreptomycesA 9578 wird nach demSubmersverfahrendurchgeführt.
Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 20 g Soyamehl und 20 g Mannit enthält.
Die Nährlösung wird in den Impfkolben oder in den Fermentern während 20-30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Die sterilisierte Nährlösung zeigt ein PH von 7,5 bis 8, 0. Die Animpfung erfolgt mit bis zu 10% einer teilweise sporulierenden vegetativen Kultur des Organismus. Man inkubiert unter gutem Schütteln oder Rühren bei 270, wobei Kulturen in Fermentern mit zirka 2 Vol. steriler Luft pro Vol. Lösung in der Minute belüftet werden. Nach 48-120 Stunden BebrUtung hat die Kulturlösung den grössten Hemmwert ge- genüber den Testorganismen (B. subtilis, B. megatherium, Micrococcus pyogenes, var. aureus) erreicht.
Man unterbricht die Kultur, bringt das PH durch Zugabe von verdünnter Schwefelsäure auf 4, 5 und trennt das Mycel sowie andere feste Bestandteile von der die Hauptmenge des Antibiotikums enthaltenden Lösung mittels Filtration oder Zentrifugation ab, wobei gegebenenfalls der Kulturlösung vor der Filtration etwa l% eines Filterhilfsmittels, z. B. Hyflo Supercel, zugesetzt wird, Die Filterrückstände wäscht man mit Wasser und mit wässerigem Methanol und vereinigt die Waschflüssigkeiten mit dem Kulturfiltrat.
Verwendet man an Stelle der oben angegebenen Nährlösung solche, die pro Liter Leitungswasser die folgenden Nährstoffe enthalten, so erhält man nach analoger Züchtung und Aufarbeitung Kulturfiltrate von ähnlich hoher antibiotischer Wirksamkeit.
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<tb>
<tb> a) <SEP> Glucose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Soyamehl <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb>
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<tb>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumnitrat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> b) <SEP> Glycerin <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> Soyamehl <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumnitrat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 10 <SEP> g
<tb> c) <SEP> Glucose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Soyamehl <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Corn <SEP> steep <SEP> liquor
<tb> (Maisquellwasser)
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumnitrat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 10 <SEP> g
<tb> d) <SEP> Laktose <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Distillers <SEP> solubles <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumnitrat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb>
Beispiel 2 : 31 eines gemäss Beispiel l emaltenenKultuniltrates wenden durch Zugabe von ver- dünnter Natronlauge auf PH 7, 5 gebracht und mit 50 g Aktivkohle (Norit A) versetzt. Man lässt während 1 Stunde mechanisch rühren, wobei die gesamte antibiotisch wirksame Substanz von der Kohle adsorbiert wird. Letztere wird durch Filtration, vorteilhaft unter Zugabe von etwas Filterhilfsmittel, wie z. B. Ryf10 Supercel, von der vollständig inaktiven Lösung abgetrennt.
Die Kohle wird darauf in 500 cm einer Mi-
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-Teilen WasserBeispiel S: S 1 eines gemäss Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates werden durch Zugabe von verdünnter Natronlauge auf PH 7, 5 gebracht und dann sofort mit einer Durchlaufgeschwindigkeit von 0, 5 1 pro Stunde auf eine Säule von Amberlite IRC-50 (H-Form) gebracht, deren Länge bzw. Durchmesser 30 cm bzw. 5 cm beträgt. Das Antibiotikum wird dabei vollständig adsorbiert. Die Säule wird mit 3 1 Wasser gewaschen. Zur Elution verwendet man 11 0, 4 n Salzsäure. Die ersten 500 cm des Eluates sind antibiotisch unwirksam, während die zweiten 500 cms die gesamte Aktivität enthalten. Dieses aktive Eluat wird zur Entfernung der überschüssigen Salzsäure durch eine Säule von Amberlite IR-4B perkoliert.
Durch Gefriertrocknung des Perkolates erhält man das angereicherte Antibiotikum A 9578 in Form eines hochwirksamen amorphen Pulvers.
Beispiel 4 : 61 eines gemäss Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates werden durch Zugabe von ver-
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14 cm lang ist und einen Durchmesser von 4,5 cm hat. Das Antibiotikum wird dabei vollständig adsorbiert. Man wäscht das Adsorberharz hierauf mit 3 1 Wasser und eluiert das Antibiotikum mit 11 einer Mischung von Methanol und l n Essigsäure (1 : 1). Das Eluat, das die gesamte antibiotisch wirksame Substanz enthält, wird im Vakuum bei 350 auf 15 cm eingeengt. Man versetzt diese Lösung mit 75 cm 0, 25 n methanolischer Salzsäure und giesst das Gemisch in 10 1 Aceton, wobei das Hydrochlorid des Antibiotikums ausfällt. Es wird filtriert und mit Aceton gewaschen. Zur weiteren Reinigung löst man es in 150 Cm Methanol und filtriert die etwas trübe Lösung unter Zugabe von Celit.
Nach Eindampfen des Filtrates im Vakuum bei 250 erhält man das Hydrochlorid des Antibiotikums A 9578 in Form eines amorphen Pulvers.
Beispiel 5 : 30 1 eines gemäss Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates werden auf PH 4, 5 gebracht und dann in einem Dünnschichteneindampfer auf 2 1 eingeengt. Das Konzentrat bringt man durch Zugabe von verdünnter Natronlauge. auf PH 8 und filtriert es unter Zugabe von Celit. Das klare Filtrat wird auf PH 5 gebracht und unter Rührung mit 1, 51 einer heissen, 5%igen, wässerigen Pikrinsäurelösung versetzt. Der entstandene. Niederschlag wird nach mehrstündigem Stehen bei 00 unter Zugabe von 50 g Celit abfiltriert. Das Filtrat ist antibiotisch nur sehr schwach aktiv. Der Filterrückstand wird hierauf dreimal mit
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bei das Pikrat des Antibiotikums und überschüssige Pikrinsäure ausfallen. Nach Abtrennung erhält man 8, 5 g Trockensubstanz.
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Zur Isolierung des Antibiotikums als Hydrochlorid werden 2,5 g der erwähnten Trochensubstanz in 30 ca Methanol gelöst. Man gibt hierauf zuerst eine Mischung von 1 cms konz. Salzsäure und 10 eins Aceton und dann 500 cm Äther zu, wobei das Hydrochlorid quantitativ ausgefällt wird. Durch wieder- holtes Lösen des Niederschlages in salzsaurem Methanol und Ausfällen mit Äther können die letzten Reste Pikrinsäure daraus entfernt werden. Schliesslich wird das Hydrochlorid In möglichst wenig Methanol gelöst, filtriert und im Vakuum eingedampft. Man erhält 714 mg des Hydrochlorides des Antibiotikums A 9578, das, antibiotisch sehr aktiv ist.
Beispiel 6 : 6001 einesnachBeispiel l erhaltenenKulturfiltrateswerden mit 5, 5 kgHyfloSupercel
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nrückstand wäscht man mit 1001 Wasser. Das klare Filtrat wird mit 7 kg vorbehandeltem Norit während 45 Minuten verrührt. Die Vorbehandlung des Norits erfolgt durch mehrmaliges Ausrühren mit l n Salzsäure und anschliessendem Neutralwaschen mit Wasser. Der mit Antibiotikum beladene Norit wird abfiltriert. Das Filtrat zeigt keine antibiotische Aktivität. Das Noritadsorbat wird zweimal mit 200 1 Wasser durchRühren und Filtrieren gewaschen. Die Waschflüssigkeit enthält keine aktive Substanz.
Die Elution erfolgt durch zweimaliges, 1-stündiges Ausrühren der Aktivkohle mit einem Gemisch von n-ButanolMethanol-Eisessig-Wasser im Volumenverhältnis von 2 : 1 : 1 : 2, wobei die Aktivkohle durch Filtration abgetrennt wird. Die vereinigten Eluate (140 1 + 46 1) werden mit 96 1 n-Butylacetat gut durchmischt. Die sich abscheidende wässerige Phase wird abgetrennt und die organische Phase mit 1, 21 Wasser nachgewaschen. Die vereinigten wässerigen Phasen (65, 5 l) werden sukzessive mit 72 l eines Gemisches von n-Butanol-n-Butylacetat im Volumenverhältnis von 1 : 2, 48 1 Essigester und schliesslich mit 241 Äther durchausrühren gewaschen, Die organischen Phasen werden verworfen.
Die verbleibende wässerige Phase (441), die die gesamte antibiotische aktive Substanz enthält, wird im Quickfitt-Verdampfer bei höchstens 30 C auf ein Volumen von 5, 451 eingeengt. Aus diesem hochaktiven, schwarz-braun gefärbten Konzentrat erhält man das Antibiotikum durch Gefriertrocknung in Form von 509 g eines braunen Pulvers.
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7 :Kulturfiltrates werden 1 Vol.-TeilAmberliteIRC-50 in der H-Form mit 2 Vol.-Teilen Amberlite IRC-50 in der Na-Form mechanisch gemischt. 6, 31 dieses Gemisches werden in eine Glassäule eingefüllt. Das Höhe : Durchmesser.. Verhältnis des Harzbettes beträgt 8 : 1.
Das Kulturfiltrat wird mit 2 n Salzsäure auf PH 4, 0 eingestellt und mit einer Durchlaufgeschwindigkeit von 0, 2 l/min/l Harz durch das Harz perkoliert, wobei sich in den oberen 2/3 der Säule eine orange-braune Zone ausbildet. Das Harz wird an-
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Wasservon wenig unlöslichem Material durch Hyflo Supercel filtriert. Dieses Filtrat (2, 31) enthält annähernd die gesamte antibiotisch aktive Substanz der Kulturlösung. Es wird in 4 Portionen mit insgesamt 500 ml eines Phenol-Chloroformgemisches, das 100 g Phenol in 100 ml Chloroform enthält, extrahiert. Die wässerige Phase wird verworfen.
Der Phenol-Chloroformextrakt (500 ml) wird mit 11 Chloroform verdünnt und mit 3 mal 500 ml 1/10 n Ammoniumacetatpuffer von PH 4, 60 ausgeschüttelt, wobei der organischen Phase gefärbte, antibiotisch inaktive Verunreinigungen entzogen werden. Die Chloroformphase wird nun mit 300+2 mal 100 ml 1/10 n Salzsäure extrahiert. Der tiefrot gefärbte Säureextrakt, der das Antibiotikum enthält, wird mit Kaliumbicarbonat auf pH 3, 5 gebracht und mit 4 50 ml-Portionen PhenolChloroformgemisch (100 g : 100 rnl) zurilckextrahiert. Man filtriert den Phenol-Chloroformextrakt durch Celite. Das klare, rotgefärbte Filtrat (200 ml) wird unter starkem Schütteln mit 50 ml Wasser, 500 ml, Äther und 300 ml Petroläther versetzt. Nach dem Abtrennen der wässerigen Phase wird die organische Phase mit 2 mal 50 ml Wasser nachgewaschen.
Die vereinigten wässerigen Extrakte werden 2 mal mit 500 ml Äther und 1 mal mit 500 ml Benzol ausgeschüttelt und hierauf lyophilisiert. Man erhält 2, 60 g eines antibiotisch hochwirksamen, orange-braun gefärbten Pulvers. Dieses Material zeigt in bezug auf das Ausgangsmaterial eine 500-1000fache spezifische antibiotische Aktivität (Aktivität pro Gewichtseinheit Trockensubstanz). Auf Whatman Nr. 1-Papier zeigt dieses Material im System n-Butanol : n-Bu- tylacetat : Eisessig : Wasser = 10 : 3 : 1, 3 : 14, 3 bei der autobiographischen Entwicklung mit Staphylococcus aureus 2 Substanzflecken. Die langsamer wandernde antibiotische Substanz wird als Base A, die 2, 5 mal schneller wandernde Substanz als Base B bezeichnet.
Die Base A gibt auf dem Papier beim Besprühen mit FeC + K FeCN eine blaue Farbreaktion.
<Desc/Clms Page number 8>
Beispiel 8 : 338 g eines nach Beispiel 6 erhaltenen Antibiotikumpräparates werden in 1, 5 l Wasser gelöst. Man setzt 150 g kristallines Ammoniumsulfat zu und extrahiert die Lösung mit 1 1 pu 2 mal 500 ml eines Phenol-Chloroformgemisches, das 100 g Phenol in 100 ml Chloroform enthalt. Die vereinigten Phenol-Chloroformextrakte werden mit 750 ml 1 n Salzsäure ausgeschüttelt und hierauf durch eine Schicht von Celite filtriert. Das klare rotbraune Filtrat wird unter Rühren mit 600 ml Wasser, 41 Äther und schliesslich mit 4 1 Petroläther versetzt. Die wässerige Phase wird abgetrennt und die organische Phase mit 2 mal 200 ml Wasser nachextrahiert. Die vereinigten wässerigen Phasen (11) werden 2 mal mit 11 Äther gewaschen und hierauf lyophilisiert.
Man erhält 136 g eines braunen Pulvers, das in bezug auf das Ausgangsmaterial eine um den Faktor 2 erhöhte spezifische antibiotische Aktivität aufweist.
Beispiel 9 : 550 mg eines nach Beispiel 11 erhaltenen, stark aktiven Aaübiotikumpräparates (Ba- se A) werden in 55 rnl eines 1/10 n Ammoniumacetatpuffers von PH4, 60 gelöst md mit 4mal 20 ml eines Phenol-Chloroformgemisches, das 100 g Phenol in 400 ml Chloroform enthält, extrahiert. Die organischen Extrakte werden mit 2 mal 15 ml Pufferlösung zurückgewaschen. Der das AEtIbiotikum enthaltende orga- nische Extrakt (80 ml) wird mit 40 ml Chloroform verdünnt, noch einmal mit 60 ml Pufferlösung gewaschen und hierauf durch ein doppeltes Faltenfilter filtriert. Das tiefrot gefärbte Filsat extrahiert man mit 30+20+10 ml 0, 2 n Salzsäure.
Die das Antibiotikum enthaltende Säurelösung wird mit 50 ml Wasser verdiinnt und mit einem Phenol-Chloroformgemisch, das 100 g Phenol in 100 mi Chloroform enthält, er- schöpfend extrahiert (2x20+10 ml). Die vereinigten Phenol-Chloroformextrstkts werden durch ein doppeltes Faltenfilter filtriert und mit 20 ml Wasser, 200 ml Äther und 100 ml Pescimher geschüttelt. Nach dem Abtrennen der wässerigen Phase wird die organische Phase mit 2 mal 15 ml Wasser maehextrahiert.
Die vereinigten wässerigen Extrakte werden 2 mal mit 50 ml Äther und l mal mit 50 ml Benzol gewa- schen und hierauf lyophilisiert. Man erhält 117 mg eines braunroten Pulvers, dss in bezug auf das Ausgangsmaterial eine annähernd 5fache Anreicherung der antibiotischen Aktivist aufweist.
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Gemisches von 4 Teilen Butanol, 1 Teil Eisessig und 5 Teilen Wasser. Dsr abgetrennten oberen Phase werden 10 Vol. -0/0 reines Butanol zugesetzt. Die Substanz wird mit der 10fachen Menge Cellulosepulver verrieben und als Pulver auf die Säule aufgetragen. Die Durchlaufgeschwindigkeit beträgt 15-20 ml/Std.
Es werden Fraktionen zu 40 ml aufgefangen. Die einzelnen Fraktionen werden mit 50 ml Petoläther geschüttelt. Die ausgeschiedene wässerige Phase wird mit Benzol gewaschen und lyophilisier ie Hauptmenge der antibiotisch wirksamen Substanz befindet sich in den Fraktionen 7-8 (121 mg) und 10-13 (142 mg). Gemäss papierchromatographischen Untersuchungen enthalten die Fraktionen 7-8 vorwiegend Base B, die Fraktionen 10-13 vorwiegend Base A.
Beispiel 11 : 3 g eines nach Beispiel 8 erhaltenen AntibiotilumprEparates werden in einer Craig'schen Verteilungsapparatur im System sek. Butanol-0,1 n AmmonacetatpHf'ferpH 4, 68 über 100 Stufen verteilt. Jede Einheit enthält je 100 ml obere und untere Phase. Die Substanz wird in die Einheit Nr. 3 eingefüllt. Die Aufarbeitung erfolgt durch Versetzen des Gemisches der beiden Phasen mit dem doppelten Volumen Petroläther und Lyophilisation der wässerigen Phase. Die dunkel gefärbten Fraktionen 3-11 enthalten nur wenig antibiotisch aktive Substanz. Die orange-gelb gefärbten Fraktionen 12-20 (631 mg) enthalten den Hauptteil der antibiotisch wirksamen Substanz (vorwiegend Base A). Die gelb gefärbten Fraktionen 21-40 sind schwächer aktiv und enthalten einGemisch vonBass A und E, in dem die letztere aberwiegt.
Beispiel 12 : 200 mg eines nach Beispiel 10 erhaltenemAntibiotikumpraparates (Base A) werden in einer Craig'schen Verteilungsapparatur im System 1/20 n Ammoniumacetztpuffer PH 4,58-105 Phenol in Chloroform über 29 Stufen verteilt. Jede Stufe enthält je 10 ml obere und untere Phase. Die Hauptmenge der antibiotisch aktiven Substanz befindet sich in den Fraktionen 6-15. Diese werden vereinigt (zirka 200 ml), mit 400 ml Äther und 300 ml Petroläther versetzt und geschüttelt. Die abgetrennte, orange-rot gefärbte, wässerige Phase wird mit Chloroform gewaschen und mit 20 3 mal 10 ml eines Gemisches von 100 g Phenol in 100 ml Chloroform extrahiert.
Den Phenol-Chloroformextrakt versetzt man unter Schütteln mit 20 ml Wasser, 300 ml Äther und 200 ml Petroläthero Die rotgefärbte wässerige Phase wird abgetrennt, mit viel Äther und Benzol gewaschen und lyophilisiert. Man erhält 86, 4 mg der
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eines gelben wasserlöslichen Pulvers. UV-Spektrumin Wassers ? L max. s 215 ml{jt (E*- =312),Ninhydrin : schwach positiv. Negativ : Sakaguchi, Maltol, Elson-Morgan.
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Process for the production of a new antibiotic The present invention relates to a new, water-soluble antibiotic, which is referred to below with A 9578, its components, its salts and derivatives and pharmaceutical preparations which contain these compounds, and processes for the production of these substances and substance mixtures.
The antibiotic A 9578 arises from the culture of a new actinomycete strain, which was isolated from a soil sample collected near Boston, Mass., USA and which is in our laboratories and in the Federal Institute of Technology, Institute for Special Botany under the Designation A 9578 is kept.
Streptomyces A 9578 belongs to the species Streptomyces griseoflavus (Krainsky) Waksman et Henrici, but differs from other representatives of this species in the formation of the new water-soluble antibiotic. So far, only one strain of Streptomyces griseoflavus is known to produce an antibiotic. This is the so-called griseoflavin [Y. Waga, J. Antibiotics Japan, A 6, 66 (1953)], which differs from the new antibiotic A 9578 by its solubility in organic solvents. The aerial mycelium of Streptomyces A 9578 is ash gray. The spore carriers are branched and form copious spirals with mostly 2-5 turns. The spores themselves have a size of 1.0-1.3 x 0.7-0.9). t and have on their surface about 0.2 li long, tapering and only slightly broadened spines at the base.
The growth is relatively little dependent on temperature, both at 180 and 40 the fungus develops well, but the optimum is between 25 and 320.
For further characterization, the growth of Streptomyces A 9578 on various nutrient media is described below. The nutrient media 1-7 and 10 were according to W. Lindenbein, Arch.
Microbiol. 17.361 (1952).
1. Synthetic agar: colonies like a haze, colorless, no aerial mycelium.
2. Synthetic solution: sediment, flakes reddish. Well-developed pellicles with veil-like, white-gray aerial mycelium. Substrate brown-yellow to deep yellow.
3. Glucose agar: colonies initially punctiform, after 12 days wrinkled, pale yellow.
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: At the beginning of the colonies punctiform, later veil-like, yellow.
5. Calcium malate agar: colonies like a veil, white-yellow, later deep yellow. Aerial mycelium sparse, floury, powdery white. Substrate light brown.
6. Gelatin stitch (180C): growth very sparse, liquefaction very slowly (0.5 cm after
30 days).
7. Starch plate: colonies like a veil, milk white, no aerial mycelium, hydrolysis
1 cm after 5 days.
<Desc / Clms Page number 2>
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discolored.
9. Carrots: growth very sparse. Aerial mycelium sparse, substrate not discolored.
10. Litmus milk: annular colonies; Surface skin colorless. Aerial mycelium white-gray. Slow hydrolysis without coagulation; Litmus blue.
Tyrosinase reaction: negative.
Streptomyces A 9578, examined according to the method of TG Pridham and D. Gottlieb, J. Bacterlology 56, 107 (1948), shows good growth when using the following carbon sources: L-xylose, L-arabinose, L-rhamnose, sucrose, raffinose , Inulin, D-mannitol, D-sorbitol, meso-inositol, salicin, D-fructose.
As far as the production of the antibiotic A 9578 is concerned, the present invention is not limited to the use of Streptomyces A 9578 or other strains corresponding to the description, but also relates to the use of variants of these organisms, as they are, for. B. be obtained by selection or mutation, in particular under the action of ultraviolet or X-rays or nitrogen mustard oils.
To produce the antibiotic A 9578, a Streptomyces strain having the properties of Streptomyces A 9578, e.g. B. cultured aerobically in aqueous, carbohydrates, nitrogen-containing compounds and inorganic salts containing nutrient solution until it shows a significant antibacterial effect, and the antibiotic A 9578 isolated on it.
As assimilable carbohydrates z. B. glucose, sucrose, lactose, mannitol, starch and glycerol in question. Nitrogen-containing nutrients and possibly growth-promoting substances may be mentioned: amino acids, peptides and proteins and their breakdown products such as peptone or tryptone, also meat extracts, water-soluble parts of grains such as maize and wheat, of distillation residues from alcohol production, of yeast, beans, in particular the soy plant, of seeds, for example the cotton plant, etc. but also ammonium salts and nitrates.
The nutrient solution can contain other inorganic salts, for example, chlorides, carbonates, sulfates of alkalis, alkaline earths, magnesium, iron, zinc and manganese,
The cultivation takes place aerobically, for example in resting surface culture or preferably submerged with shaking or stirring with air or oxygen in shaker bottles or the known fermenters. A suitable temperature is between 18 and 400. The nutrient solution generally shows a significant antibacterial effect after 11/25 days.
To isolate the antibiotic A 9578 z. B. serve the following procedures: The mycelium is separated from the culture filtrate, after which the main amount of the antibiotic is found in the culture filtrate.
Nevertheless, significant amounts of the antibiotic remain adsorbed on the mycelium. It is therefore advantageous to wash out the latter well. Water and aqueous organic solvents such as alcohols, e.g. B. aqueous methanol.
In order to remove the antibiotic from the culture filtrate and to purify it, various methods are suitable, which can be used individually or in combination with one another. It has proven advantageous to keep the culture solution at a pH between 3 and 5 during these operations.
1. One can use adsorbents, e.g. B. activated carbons such as Nont, activated earths such as Fuller's earth or floridin, or resin adsorbers such as Asmit. The adsorbates are expediently eluted with mixtures of water-miscible organic solvents with water or aqueous acids, e.g. B. with water-methanol, water-pyridine, dilute acetic acid-methanol or water-methanol-acetic acid-butanol mixtures. This has proven to be particularly advantageous for the elution of a noritol adsorbate
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Parts).
2. A second method of separating the antibiotic from the culture filtrate is to adsorb the antibiotic on cation exchangers, resins containing acid groups such as Amberlite IRC-50 being particularly suitable. The latter can be used both in the acid form and in the sodium form, but a mixture of these two forms in a volume ratio of 1: 2 has proven particularly useful. The elution is conveniently done with dilute acids, e.g. B. with methanolic hydrochloric acid.
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3. Next, the basic antibiotic can also be precipitated directly from the culture filtrate, e.g. B. mitteis reaction with an organic acid of the picric acid type. By treating these precipitates with salts of organic bases, e.g. B. with triethylammonium sulfate, or with dilute acids, the antibiotic is obtained in the form of the corresponding salt. You can work either in an aqueous medium or in a water-miscible solvent such as methanol or acetone.
This conversion of the sparingly soluble salts into readily soluble salts of the antibiotic is carried out either with mineral acids or on ion exchange resins, e.g. AnAmberliteIRA-400.
4. The antibiotic is also enriched by adding an excess of organic, water-miscible solvents such as acetone, dioxane, etc. to aqueous or alcoholic-aqueous solutions of the salt, the salts being precipitated in solid form.
5. Another method of enriching the antibiotic consists in extracting aqueous solutions of phenol into chloroform, varying both the pH of the aqueous solution and the phenol content of the chloroform solution. So is the antibiotic z.
B. with a distribution between a solution containing 100 g of phenol per 100 cm3 of chloroform and an aqueous phase of pH 1 to 6 almost exclusively in the organic phase, while when using a solution that contains 100 cm of chloroform contains only 33 g phenol, the aqueous phase only at
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Antibiotic the ratio of concentration intion in the aqueous, so it follows from the above information that the distribution coefficient increases with increasing phenol content of the organic phase and decreases with decreasing pH of the aqueous phase.
Since it is thus possible to set any arbitrary distribution coefficient of the antibiotic in this system, a large number of inactive impurities can be separated off by combining a few distribution operations.
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Enrichment method for Celite u. Like. As carrier substances, or chromatography on ion exchange resins, eg. At Dowex 50, Amberlite IRC-50 and the like. Like. For example, partition chromatography on cellulose using the solvent system butanol (4 parts by volume), glacial acetic acid (1 part by volume) and water (5 parts by volume) has proven particularly useful.
7. The antibiotic can furthermore be enriched by countercurrent distribution between two immiscible solvent phases. The following solvent systems have proven themselves: a) sec. Butanol-1/10 N ammonium acetate buffer of PH 4, 68
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partition coefficient of the antibiotic in system b) and thus the position of the maximum activity in the distribution can be changed as desired on the one hand by changing the pH of the buffer solution and on the other hand by varying the phenol content of the organic phase.
For the production of a largely pure preparation, the following combination of the enrichment processes listed has proven itself. The antibiotic is adsorbed from the culture filtrate on the buffered ion exchanger Amberlite IRC-50 and eluted using methanolic hydrochloric acid. The eluates are concentrated at pH 5 in vacuo, an aqueous concentrate of the antibiotic being obtained which corresponds in volume to approximately 1/100 of the culture solution. According to the method mentioned above, this is distributed a few times between phenol-chloroform mixtures on the one hand and aqueous solutions of varying pH on the other hand, a preparation being obtained after freeze-drying which, in relation to the culture filtrate, is by a factor of 500-1000 has increased specific effectiveness.
By treating such a preparation according to the above-listed methods 6 (partition chromatography on cellulose) and method 7, the basic, largely uniform antibiotic A 9578 can be obtained, preferably in the form of a salt.
As can be seen from paper chromatographic studies, the antibiotic A 9578 consists of at least two components, namely the main component A and the secondary component B. These are largely separated from each other in the course of the enrichment process described, especially in partition chromatography on cellulose and in countercurrent distribution.
The two components of A 9578 are defined by paper chromatography by direct comparison of their Ru values with the Rr values of a number of known antibiotics (2-11) in systems A-G. System H is continuously chromatographed. The numbers given are in cm
<Desc / Clms Page number 4>
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<tb>
<tb> Measured running distances <SEP> of the <SEP> antibiotics <SEP> after <SEP> 16-hour <SEP> chromatogram duration. <SEP> The <SEP> proof <SEP> of the <SEP> antibiotics <SEP> takes place <SEP> autobiographically <SEP> with <SEP> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> or <SEP> Bacillus <SEP> subtilis.
<tb>
System <SEP> la <SEP> 1b <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> 11 < SEP>
<tb> A <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0.92 <SEP> 0.07 <SEP> 0
<tb> B <SEP> 0, <SEP> 49 <SEP> 0, <SEP> 63 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 17 < SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> 0, <SEP> 66 <SEP> 0, <SEP> 55 <SEP> 0.
<SEP> 92 <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP>
<tb> C <SEP> 0, <SEP> 34 <SEP> 0, <SEP> 58 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> 0, < SEP> 22 <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP> 0, <SEP> 72 <SEP> 0, <SEP> 62 <SEP> 0, <SEP> 93 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP > 0, <SEP> 11 <SEP>
<tb> D <SEP> 0.05 <SEP> 0.15 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> x <SEP> x <SEP> 0.92 <SEP> 0
<tb> E <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 0 <SEP > 0 <SEP> x <SEP> x <SEP> 0, <SEP> 86 <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP>
<tb> F <SEP> 0.47 <SEP> 0.47 <SEP> 0.22 <SEP> 0.14 <SEP> 0.12 <SEP> 0.04 <SEP> 0.05 <SEP> 0 , 49 <SEP> 0.42 <SEP> 0.91 <SEP> 0.43 <SEP> 0.36
<tb> G <SEP> 0.74 <SEP> 0.74 <SEP> 0.07 <SEP> 0.02 <SEP> x <SEP> x <SEP> 0.94 <SEP> 0.61 <SEP > 0.69
<tb> H <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> 7, <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> (14, <SEP > 5) <SEP> (8,
<SEP> 8) <SEP> 27 <SEP> 1
<tb>
A water-saturated butanol
B butanol-glacial acetic acid-water (4: 1: 5) (upper phase)
C water-saturated butanol + 2% p-toluenesulphonic acid
D water-saturated butanol + 2% piperidine
E butanol-pyridine-water (6: 4: 3)
F 80% ethanol 1.5% sodium chloride, Whatman No. 4 impregnated with 0.95-m.
Sodium sulfate + 0.05-m. Sodium hydrosulfate
G butanol-ethanol-water (1: 1: 2)
H butanol-butyl acetate-glacial acetic acid-water (10: 3: 1, 3: 14, 3) (upper phase) la A 9578 base A Ib A 9578 base B
2 streptomycin
3 ristocetin A
4 ristocetin B
5 neomycin B
6 viomycin
7 chlortetracycline
8 oxytetracycline
9 actinomycin J 10 cycloserine 11 grisein x antibiotic distributed over the entire course () position out of focus.
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Component A of antibiotic A 9578 is an orange-yellow powder that dissolves easily in water, well in methanol, and difficultly in most organic solvents.
Base A gives the following color reactions: FeCL: brown-red FeC-KFe (CN): blue ninhydrin: pale violet
The Sakaguchi, Maltol and Ehrlich Morgan tests are negative.
An aqueous solution of component A shows absorption maxima in the UV spectrum at 215 m (El% = 312) and at 315 mp (El% = 42). lcm lcm
The free base of the antibiotic A 9578 is easily accessible from its salts, from the sulfate z. B. by reaction in an aqueous medium with barium hydroxide, neutralization of the excess barite
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with carbon dioxide and separation of the barium carbonate and sulfate precipitate and isolation of the free base by means of freeze-drying. It is easier to prepare from the salts using a strongly basic anion exchanger, e.g. B. the OH form of the product marketed under the name Dowex-2.
One of the most striking properties of antibiotic A 9578 is a pronounced stability minimum between PH 7-11. Solutions of the antibiotic lose most of their activity within 48 hours at 200C and at a pH of 8-10, while at the same temperature and at pH values of 1-5 they lose most of their activity and at a pH of 6-7 and above 11 remain partially effective.
The salts of the antibiotic A 9578 and its components are derived from the known inorganic and organic salts, for example from hydrochloric acid, sulfuric acids and phosphoric acids, acetic, propionic, valeric, palmitic or oleic acid, succinic acid, Citric acid, mandelic acid, glutamic acid or pantothenic acid. They are neutral or acidic salts. They are produced by the action of the corresponding acids on the free base or by double conversion of salts, for example of A 9578 sulfate with calcium pantothenic acid.
The antibiotic A 9578 has a very high antibiotic effectiveness against various test organisms. In the so-called agar cross-stroke test, it is active against the following test organisms: Micrococcus pyogenes, var. Aureus, Streptococcus viridans, Streptococcus faeca1is, Corynebacterium diphteriae, Escherichia coli, Bacillus megatherium and Bacillus subtilis.
The antibiotic A 9578 is also effective in vivo. After five times subcutaneous administration of 10 mg / kg to mice infected with Staphylococcus pyogenes, var. Aureus, 100% survivors and with a dose of 5 times 5 mg / kg 5Clo survivors are observed. 50% survivors are obtained when mice infected with Escherichia coli are administered 5 times 50 mg / kg subcutaneously.
The toxicity of the antibiotic is low. So z. B. the subcutaneous application of 1000 mg / kg of mice without damage. Higher doses have not yet been tested.
The antibiotic A 9578, its components, its salts or derivatives can be used as remedies, e.g. B. find use in the form of pharmaceutical preparations. These contain the compounds mentioned in a mixture with a pharmaceutical, organic or inorganic carrier material suitable for enteral, parenteral or local administration. For the same, substances come into question that do not react with the new compounds, such as. Gelatin, milk sugar, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohols, gums, polyalkylene glycols, petrolatum, cholesterol or other known excipients. The pharmaceutical preparations can e.g. B. as tablets, dragees, powders, ointments, creams, suppositories, or in liquid form as solutions, suspensions or emulsions.
If necessary, they are sterilized and / or contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers. They can also contain other therapeutically valuable substances.
The invention is described in the following examples, without any intention that the subject matter of the invention is restricted. The temperatures are given in degrees Celsius.
Example 1: The cultivation of Streptomyces A 9578 is carried out according to the Submer's method.
A nutrient solution is used which contains 20 g of soya flour and 20 g of mannitol per liter of tap water.
The nutrient solution is sterilized in the inoculation flask or in the fermenter for 20-30 minutes at 1 atm. The sterilized nutrient solution has a pH of 7.5 to 8.0. Inoculation takes place with up to 10% of a partially sporulating vegetative culture of the organism. It is incubated at 270 ° with good shaking or stirring, cultures in fermenters being aerated with about 2 volumes of sterile air per volume of solution per minute. After 48-120 hours of incubation, the culture solution has reached the highest inhibitory value against the test organisms (B. subtilis, B. megatherium, Micrococcus pyogenes, var. Aureus).
The culture is interrupted, the pH is brought to 4.5 by adding dilute sulfuric acid and the mycelium and other solid constituents are separated from the solution containing the majority of the antibiotic by means of filtration or centrifugation, with about 1% of the culture solution prior to filtration if necessary Filter aid, e.g. B. Hyflo Supercel is added. The filter residue is washed with water and with aqueous methanol and the washing liquids are combined with the culture filtrate.
If, instead of the nutrient solutions given above, those containing the following nutrients per liter of tap water are used, culture filtrates with a similarly high antibiotic activity are obtained after analogous cultivation and processing.
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<tb>
<tb> a) <SEP> Glucose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Soya flour <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb>
<Desc / Clms Page number 6>
EMI6.1
<tb>
<tb> sodium chloride <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> sodium nitrate <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> b) <SEP> Glycerin <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> Soya flour <SEP> 10 <SEP> g
<tb> sodium chloride <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> sodium nitrate <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> calcium carbonate <SEP> 10 <SEP> g
<tb> c) <SEP> Glucose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Soya flour <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Corn <SEP> steep <SEP> liquor
<tb> (corn spring water)
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> sodium chloride <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> sodium nitrate <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> calcium carbonate <SEP> 10 <SEP> g
<tb> d) <SEP> lactose <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Distillers <SEP> solubles <SEP> 20 <SEP> g
<tb> sodium chloride <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> sodium nitrate <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb>
Example 2: 31 of a culture filtrate prepared according to Example 1 are brought to pH 7.5 by adding dilute sodium hydroxide solution and 50 g of activated charcoal (Norit A) are added. The mixture is left to stir mechanically for 1 hour, all of the antibiotic substance being adsorbed by the charcoal. The latter is filtered by filtration, advantageously with the addition of some filter aid, such as. B. Ryf10 Supercel, separated from the completely inactive solution.
The coal is then in 500 cm of a mini
EMI6.2
Parts of water Example S: S 1 of a culture filtrate obtained according to Example 1 is brought to pH 7.5 by adding dilute sodium hydroxide solution and then immediately at a flow rate of 0.5 1 per hour on a column of Amberlite IRC-50 (H-form ), the length or diameter of which is 30 cm and 5 cm, respectively. The antibiotic is completely adsorbed. The column is washed with 3 l of water. 11 0.4 N hydrochloric acid is used for the elution. The first 500 cm of the eluate are antibiotic ineffective, while the second 500 cms contain all the activity. This active eluate is percolated through a column of Amberlite IR-4B to remove the excess hydrochloric acid.
The enriched antibiotic A 9578 is obtained in the form of a highly effective amorphous powder by freeze drying the percolate.
Example 4: 61 of a culture filtrate obtained according to Example 1 are added by adding
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14 cm long and 4.5 cm in diameter. The antibiotic is completely adsorbed. The adsorber resin is then washed with 3 liters of water and the antibiotic is eluted with a mixture of methanol and 1N acetic acid (1: 1). The eluate, which contains the entire antibiotic substance, is concentrated in vacuo at 350 to 15 cm. This solution is mixed with 75 cm of 0.25 N methanolic hydrochloric acid and the mixture is poured into 10 1 of acetone, the hydrochloride of the antibiotic precipitating. It is filtered and washed with acetone. For further purification, it is dissolved in 150 cm of methanol and the somewhat cloudy solution is filtered with the addition of Celite.
After evaporating the filtrate in vacuo at 250, the hydrochloride of the antibiotic A 9578 is obtained in the form of an amorphous powder.
Example 5: 30 liters of a culture filtrate obtained according to Example 1 are brought to pH 4.5 and then concentrated to 2 liters in a thin-layer evaporator. The concentrate is brought by adding dilute sodium hydroxide solution. to pH 8 and filtered it with the addition of Celite. The clear filtrate is brought to pH 5 and 1.51 of a hot, 5% strength, aqueous picric acid solution is added while stirring. The resulting. After standing at 00 for several hours, the precipitate is filtered off with the addition of 50 g of Celite. The filtrate has only very weak antibiotic activity. The filter residue is then three times with
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when the picrate of the antibiotic and excess picric acid precipitate. After separation, 8.5 g of dry substance are obtained.
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To isolate the antibiotic as the hydrochloride, 2.5 g of the aforementioned dry substance are dissolved in 30 ca methanol. A mixture of 1 cms of conc. Hydrochloric acid and 10 one acetone and then 500 cm of ether are added, the hydrochloride being precipitated quantitatively. The last residues of picric acid can be removed from it by repeatedly dissolving the precipitate in hydrochloric acid methanol and precipitating it with ether. Finally, the hydrochloride is dissolved in as little methanol as possible, filtered and evaporated in vacuo. 714 mg of the hydrochloride of the antibiotic A 9578, which is very antibiotically active, are obtained.
Example 6: 6001 of a culture filtrate obtained according to Example 1 are mixed with 5.5 kg of HyfloSupercel
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The residue is washed with 100 liters of water. The clear filtrate is stirred with 7 kg of pretreated Norit for 45 minutes. The Norit is pretreated by stirring it several times with 1N hydrochloric acid and then washing it neutral with water. The norit laden with antibiotic is filtered off. The filtrate shows no antibiotic activity. The noritol adsorbate is washed twice with 200 liters of water by stirring and filtering. The washing liquid does not contain any active substance.
Elution is carried out by stirring the activated carbon twice for 1 hour with a mixture of n-butanol-methanol-glacial acetic acid-water in a volume ratio of 2: 1: 1: 2, the activated carbon being separated off by filtration. The combined eluates (140 1 + 46 1) are mixed well with 96 liters of n-butyl acetate. The aqueous phase which separates out is separated off and the organic phase is washed with 1.21 water. The combined aqueous phases (65.5 l) are successively washed with 72 l of a mixture of n-butanol-n-butyl acetate in a volume ratio of 1: 2, 48 l ethyl acetate and finally thoroughly stirring with 241 ether. The organic phases are discarded.
The remaining aqueous phase (441), which contains the entire antibiotic active substance, is concentrated in the Quickfitt evaporator at a maximum of 30 ° C. to a volume of 5.451. The antibiotic is obtained from this highly active, black-brown concentrate by freeze-drying in the form of 509 g of a brown powder.
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7: 1 part by volume of Amberlite IRC-50 in the H form with 2 parts by volume of Amberlite IRC-50 in the Na form is mechanically mixed with culture filtrates. 6, 31 of this mixture are poured into a glass column. The height: diameter .. ratio of the resin bed is 8: 1.
The culture filtrate is adjusted to pH 4.0 with 2N hydrochloric acid and percolated through the resin at a flow rate of 0.2 l / min / l resin, an orange-brown zone forming in the upper 2/3 of the column. The resin is
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Filtered water from slightly insoluble material through Hyflo Supercel. This filtrate (2, 31) contains almost all of the antibiotically active substance of the culture solution. It is extracted in 4 portions with a total of 500 ml of a phenol-chloroform mixture containing 100 g of phenol in 100 ml of chloroform. The aqueous phase is discarded.
The phenol-chloroform extract (500 ml) is diluted with 11% chloroform and extracted 3 times with 500 ml 1/10 N ammonium acetate buffer of PH 4.60, whereby the organic phase is removed from the colored, antibiotically inactive impurities. The chloroform phase is then extracted with 300 + 2 times 100 ml of 1/10 N hydrochloric acid. The deep red colored acid extract, which contains the antibiotic, is brought to pH 3.5 with potassium bicarbonate and back-extracted with 4 50 ml portions of phenol-chloroform mixture (100 g: 100 ml). The phenol-chloroform extract is filtered through Celite. The clear, red-colored filtrate (200 ml) is mixed with 50 ml of water, 500 ml, ether and 300 ml of petroleum ether while shaking vigorously. After the aqueous phase has been separated off, the organic phase is washed twice with 50 ml of water.
The combined aqueous extracts are extracted twice with 500 ml of ether and once with 500 ml of benzene and then lyophilized. 2.60 g of an antibiotic highly effective, orange-brown powder are obtained. This material shows a 500-1000-fold specific antibiotic activity (activity per unit weight of dry substance) in relation to the starting material. On Whatman No. 1 paper, this material shows in the system n-butanol: n-butyl acetate: glacial acetic acid: water = 10: 3: 1, 3: 14, 3 in the autobiographical development with Staphylococcus aureus 2 substance spots. The slower migrating antibiotic substance is called base A, the substance that migrates 2.5 times faster is called base B.
Base A gives a blue color reaction on paper when sprayed with FeC + K FeCN.
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Example 8: 338 g of an antibiotic preparation obtained according to Example 6 are dissolved in 1.5 l of water. 150 g of crystalline ammonium sulfate are added and the solution is extracted with 1 l pu 2 times 500 ml of a phenol-chloroform mixture which contains 100 g of phenol in 100 ml of chloroform. The combined phenol-chloroform extracts are extracted by shaking with 750 ml of 1N hydrochloric acid and then filtered through a layer of Celite. The clear red-brown filtrate is mixed with 600 ml of water, 41 ether and finally 4 liters of petroleum ether while stirring. The aqueous phase is separated off and the organic phase is back-extracted with 2 times 200 ml of water. The combined aqueous phases (11) are washed twice with 11 ether and then lyophilized.
136 g of a brown powder are obtained which, in relation to the starting material, has a specific antibiotic activity which is increased by a factor of 2.
EXAMPLE 9 550 mg of a highly active aubiotic preparation (base A) obtained according to Example 11 are dissolved in 55 ml of a 1/10 N ammonium acetate buffer of PH4, 60 with 4 times 20 ml of a phenol-chloroform mixture containing 100 g of phenol in Contains 400 ml of chloroform, extracted. The organic extracts are washed back with 2 times 15 ml of buffer solution. The organic extract (80 ml) containing the AEtibiotic is diluted with 40 ml of chloroform, washed once more with 60 ml of buffer solution and then filtered through a double folded filter. The deep red colored filtrate is extracted with 30 + 20 + 10 ml of 0.2N hydrochloric acid.
The acid solution containing the antibiotic is diluted with 50 ml of water and extracted exhaustively with a phenol-chloroform mixture containing 100 g of phenol in 100 ml of chloroform (2 × 20 + 10 ml). The combined phenol-chloroform extracts are filtered through a double folded filter and shaken with 20 ml of water, 200 ml of ether and 100 ml of Pescimher. After the aqueous phase has been separated off, the organic phase is extracted twice with 15 ml of water.
The combined aqueous extracts are washed twice with 50 ml of ether and once with 50 ml of benzene and then lyophilized. 117 mg of a brown-red powder are obtained, which has an almost 5-fold enrichment in antibiotic activist in relation to the starting material.
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Mixture of 4 parts of butanol, 1 part of glacial acetic acid and 5 parts of water. 10 vol. -0/0 pure butanol are added to the separated upper phase. The substance is triturated with 10 times the amount of cellulose powder and applied to the column as a powder. The flow rate is 15-20 ml / hour.
40 ml fractions are collected. The individual fractions are shaken with 50 ml of petol ether. The excreted aqueous phase is washed with benzene and lyophilized ie the main amount of the antibiotic substance is in fractions 7-8 (121 mg) and 10-13 (142 mg). According to paper chromatographic investigations, fractions 7-8 predominantly contain base B, fractions 10-13 predominantly base A.
Example 11: 3 g of an antibiotic preparation obtained according to Example 8 are sec in a Craig's distribution apparatus in the system. Butanol-0.1 N AmmonacetatpHf'ferpH 4, 68 distributed over 100 levels. Each unit contains 100 ml each of the upper and lower phases. The substance is poured into unit No. 3. Work-up is carried out by adding twice the volume of petroleum ether to the mixture of the two phases and lyophilizing the aqueous phase. The darkly colored fractions 3-11 contain only a small amount of antibiotic active substance. The orange-yellow colored fractions 12-20 (631 mg) contain the main part of the antibiotic active substance (mainly base A). The yellow-colored fractions 21-40 are less active and contain a mixture of bass A and E, in which the latter predominates.
Example 12: 200 mg of an antibiotic preparation (base A) obtained according to Example 10 are distributed in a Craig's distribution apparatus in the system 1/20 N ammonium acetate buffer PH 4.58-105 phenol in chloroform over 29 stages. Each stage contains 10 ml each of the upper and lower phases. The main amount of the antibiotic active substance is in fractions 6-15. These are combined (approx. 200 ml), mixed with 400 ml of ether and 300 ml of petroleum ether and shaken. The separated, orange-red colored, aqueous phase is washed with chloroform and extracted with 20 3 times 10 ml of a mixture of 100 g of phenol in 100 ml of chloroform.
The phenol-chloroform extract is mixed with 20 ml of water, 300 ml of ether and 200 ml of petroleum ether while shaking. The red-colored aqueous phase is separated off, washed with a lot of ether and benzene and lyophilized. One receives 86.4 mg of
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of a yellow water-soluble powder. UV spectrum in water? L max. s 215 ml {jt (E * - = 312), ninhydrin: weakly positive. Negatives: Sakaguchi, Maltol, Elson-Morgan.