DE1058216B

DE1058216B - Production and extraction of the antibiotic A 9578

Info

Publication number: DE1058216B
Application number: DEC17214A
Authority: DE
Inventors: Dr Vladimir Prelog; Dr Ernst Gaeumann
Original assignee: Ciba Geigy AG; Ciba AG
Current assignee: Novartis AG; BASF Schweiz AG
Priority date: 1957-07-26
Filing date: 1958-07-18
Publication date: 1959-05-27

Description

DEUTSCHESGERMAN

Die Erfindung betrifft die Herstellung eines neuen, wasserlöslichen Antibiotikums, das im folgenden mit A 9578 bezeichnet wird, seiner Komponenten A und B, seiner Salze und Derivate sowie pharmazeutischer Präparate, welche diese Verbindungen enthalten.The invention relates to the production of a new, water-soluble antibiotic, which in the following with A 9578 is designated, its components A and B, its salts and derivatives as well as pharmaceutical Preparations containing these compounds.

Das Antibiotikum A 9578 entsteht bei der Kultur eines neuen Actinomvcetenstammes, der aus einer bei Boston, Mass., USA., gesammelten. Erdprobe isoliert worden ist und der in den Laboratorien des Erfinders sowie in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, unter der Bezeichnung A 9578 aufbewahrt wird.The antibiotic A 9578 arises from the culture of a new actinoma virus strain, which is derived from a with Boston, Mass., USA., Collected. Earth sample has been isolated and that in the laboratories of the inventor as well as in the Federal Institute of Technology, Institute for Special Botany, under the designation A 9578 is kept.

Streptomyces A 9578 gehört der Art Streptomyces griseoflavus (Krainsky) Waksman. et Henrici an, unterscheidet sich aber von anderen Vertretern dieser *5 Art durch die Bildung des neuen wasserlöslichen Antibiotikums. Es ist bis jetzt nur ein Stamm von Streptomyces griseoflavus bekannt, der ein Antibiotikum produziert. Dabei handelt es sich um das sogenannte Griseoflavin (Y. Waga, J. Antibiotics Japan, ao A 6, S. 66 [1953]), das sich aber vom neuen Antibiotikum A 9578 schon durch seine Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln unterscheidet. Das Luftmycel des Streptomyces A 9578 ist aschgrau. Die Sporenträger sind verzweigt und bilden reichlich Spiralen mit meist zwei bis fünf Windungen. Die Sporen selbst haben eine Größe von 1,0 bis 1,3 μ · 0,7 bis 0,9 μ und tragen an ihrer Oberfläche etwa 0,2γ lange, spitz zulaufende und an der Basis nur wenig verbreiterte Stacheln. DasWachstum ist relativ wenig temperaturabhängig, sowohl bei 18° C als auch bei 40° C entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 32° C.Streptomyces A 9578 belongs to the species Streptomyces griseoflavus (Krainsky) Waksman. et Henrici, but differs from other representatives of this * 5 species in the formation of the new water-soluble antibiotic. So far, only one strain of Streptomyces griseoflavus is known to produce an antibiotic. This is what is known as griseoflavin (Y. Waga, J. Antibiotics Japan, loc. Cit. A 6, p. 66 [1953]), which, however, differs from the new antibiotic A 9578 by its solubility in organic solvents. The aerial mycelium of Streptomyces A 9578 is ash gray. The spore carriers are branched and form copious spirals with usually two to five turns. The spores themselves have a size of 1.0 to 1.3 μ · 0.7 to 0.9 μ and have about 0.2 γ long, pointed spines on their surface that are only slightly broadened at the base. The growth is relatively little dependent on temperature, both at 18 ° C and at 40 ° C the fungus develops well, but the optimum is between 25 and 32 ° C.

Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum von Streptomyces A 9578 auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien 1 bis 7 sowie 10 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol., 17, S. 361 (1952), hergestellt.For further characterization, the growth of Streptomyces A 9578 on various Culture media described. The nutrient media 1 to 7 and 10 were according to W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol., 17, p. 361 (1952).

1. Synthetischer Agar:1. Synthetic agar:

Wachstum schleierartig, farblos, kein Luftmycel. Growth like a veil, colorless, no aerial mycelium.

2. Synthetische Lösung:2. Synthetic solution:

Sediment, Flocken rötlich. Gut ausgebildete Pellikel mit schleierartigem, weißgrauem Luftmycel. Substrat braungelb bis sattgelb.Sediment, flakes reddish. Well-developed pellicles with veil-like, white-gray aerial mycelium. Substrate brown-yellow to deep yellow.

3. Glucose-Agar:3. Glucose agar:

Wachstum anfangs punktförmig, nach 12 Tagen runzlig, blaßgelb.Growth initially punctiform, wrinkled after 12 days, pale yellow.

4. Glucose-Asparagin-Agar:4. Glucose asparagine agar:

Wachstum anfangs punktförmig, später schleierartig, gelblich. Luftmycel sammetig, anfangs bräunlichgrau, später aschgrau. Substrat gelb.Growth initially punctiform, later veil-like, yellowish. Air mycelium velvety, initially brownish gray, later ash gray. Substrate yellow.

Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums A 9578Production and extraction of the antibiotic A 9578

Anmelder:
CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)Applicant:
CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Switzerland)

Vertreter: Dipl.-Ing. E. Splanemann, Patentanwalt, Hamburg 36, Neuer Wall 10Representative: Dipl.-Ing. E. Splanemann, patent attorney, Hamburg 36, Neuer Wall 10

Beanspruchte Priorität: Schweiz vom 26. Juli 1957 und 8. Juli 1958Claimed priority: Switzerland of July 26, 1957 and July 8, 1958

Dr. Vladimir Prelog und Dr. Ernst Gäumann, Zürich (Schweiz),
sind als Erfinder genannt wordenDr. Vladimir Prelog and Dr. Ernst Gäumann, Zurich (Switzerland),
have been named as inventors

5. Calciummalat-Agar:5. Calcium malate agar:

Wachstum schleierartig, weißgelb, später sattgelb. Luftmycel spärlich, mehlig bestäubt, mehlweiß. Substrat hellbraun.Growth like a veil, white-yellow, later deep yellow. Aerial mycelium sparse, floury, powdery white. Substrate light brown.

6. Gelatinestich (18° C):6. Gelatin prick (18 ° C):

Wachstum sehr spärlich, Verflüssigung sehr langsam (0,5 cm nach 30Tagen).Growth very sparse, liquefaction very slowly (0.5 cm after 30 days).

7. Stärkeplatte:7. Thickness plate:

Wachstum schleierartig, milchweiß, kein Luftmycel. Hydrolyse 1 cm nach 5 Tagen.Growth veil-like, milk-white, no aerial mycelium. Hydrolysis 1 cm after 5 days.

8. Kartoffeln:8. Potatoes:

Wachstum anfänglich punktförmig, blaßgelb, später pustelig. Luftmycel sammetig, weißgelb bis aschgrau. Substrat bräunlichgrau verfärbt.Growth initially punctiform, pale yellow, later pustular. Air mycelium velvety, white-yellow to ash gray. The substrate is discolored brownish-gray.

9. Karotten:9. Carrots:

Wachstum sehr spärlich. Luftmycel spärlich. Substrat nicht verfärbt.
10. Lackmusmilch:Very sparse growth. Aerial mycelium sparse. Substrate not discolored.
10. Litmus milk:

Ringwachstum und Oberflächenhaut farblos. Luftmycel weißgrau. Hydrolyse langsam, ohne Koagulation; Lackmus blau. Tyrosinasereaktion:
Negativ.Ring growth and surface skin colorless. Aerial mycelium white-gray. Slow hydrolysis without coagulation; Litmus blue. Tyrosinase reaction:
Negative.

Streptomyces A 9578 zeigt, nach, der Methodik von T.G. Pridham und D. Gottlieb, J. Bacteriology, 56, S. 107 (1948), untersucht, bei Verwendung der fol-Streptomyces A 9578 shows, according to the methodology of T.G. Pridham and D. Gottlieb, J. Bacteriology, 56, p. 107 (1948), examined, when using the fol-

909 523/375909 523/375

genden Kohlenstoffquellen gutes Wachstum: L-Xylose, L-Arabinose, L-Rhamnose, Saccharose, Raffinose, Inulin, D-Mannit, D-Sorbit, Mesoinosit, Salicin, D-Fructose. low carbon sources good growth: L-xylose, L-arabinose, L-rhamnose, sucrose, raffinose, inulin, D-mannitol, D-sorbitol, meso-inositol, salicin, D-fructose.

Die vorliegende Erfindung ist, was die Herstellung des Antibiotikums A 9578 anbelangt, nicht auf die Verwendung des Streptomyces A 9578 oder anderer der Beschreibung entsprechender Stämme beschränkt, sondern betrifft auch die Verwendung von Varianten dieser Organismen, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen gewonnen werden.The present invention is not limited to the manufacture of antibiotic A 9578 Use of Streptomyces A 9578 or other strains corresponding to the description restricted, but also relates to the use of variants of these organisms, as z. B. by selection or mutation, especially under the action of ultraviolet or X-rays or of nitrogen mustard oils be won.

Zur Erzeugung des Antibiotikums A 9578 wird ein die Eigenschaften von Streptomyces A 9578 aufweisender Streptomycetenstamm, z. B. in wäßriger, Kohlenhydrate, stickstoffhaltige Verbindungen sowie anorganische Salze enthaltender Nährlösung aerob gezüchtet, bis diese eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt, und das Antibiotikum A 9578 hierauf isoliert.In order to produce the antibiotic A 9578, one having the properties of Streptomyces A 9578 is used Streptomycete strain, e.g. B. in aqueous, carbohydrates, nitrogenous compounds and inorganic Nutrient solution containing salts is grown aerobically until it is an essential antibacterial Shows effect, and the antibiotic A 9578 isolated thereupon.

Als assimilierbare Kohlenhydrate kommen z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Mannit, Stärke sowie Glycerin in Frage. Als stickstoffhaltige Nährstoffe und gegebenenfalls wachstumsfördernde Stoffe seien genannt: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte wie Pepton oder Trypton, ferner Flei sch extrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze usw., aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. Von anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten. As assimilable carbohydrates z. B. glucose, sucrose, lactose, mannitol, starch as well Glycerin in question. As nitrogenous nutrients and possibly growth-promoting substances called: amino acids, peptides and proteins as well as their breakdown products such as peptone or tryptone, furthermore Flax extracts, water-soluble parts of cereal grains, such as corn and wheat, from distillation residues the production of alcohol, of yeast, beans, especially the soy plant, of seeds, for example the cotton plant etc., but also ammonium salts and nitrates. From other inorganic The nutrient solution can salt, for example, chlorides, carbonates, sulphates of alkalis, alkaline earths, Contains magnesium, iron, zinc and manganese.

Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 40° C Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach I¹Zz bis 5 Tagen.The cultivation takes place aerobically, for example in resting surface culture or preferably submerged with shaking or stirring with air or oxygen in shaker bottles or the known fermenters. A suitable temperature is between 18 and 40 ° C. The nutrient solution generally shows a substantial antibacterial effect after ^{1 1} hours to 5 days.

Zur Isolierung des Antibiotikums A 9578 können z. B. folgende Verfahren dienen: Man trennt das Mycel vom KuIturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge des Antibiotikums im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen des Antibiotikums am Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteilhaft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich Wasser und wäßrige organische Lösungsmittel, wie Alkohole, z. B. wäßriges Methanol.To isolate the antibiotic A 9578 z. B. serve the following procedures: The mycelium is separated from the culture filtrate, after which the main amount of the antibiotic is found in the culture filtrate. Nevertheless, significant amounts of the antibiotic remain adsorbed on the mycelium. It is therefore advantageous to wash out the latter well. Water and aqueous organic solvents such as alcohols, e.g. B. aqueous methanol.

Um das Antibiotikum dem Kulturfiltrat zu entziehen und zu reinigen, sind verschiedene Methoden geeignet, die einzeln oder in Kombination miteinander angewandt werden können. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die Kulturlösung während dieser Operationen auf einem pn zwischen 3 und 5 zu halten.There are various methods of removing the antibiotic from the culture filtrate and purifying it suitable, which can be used individually or in combination with one another. It has been found to be beneficial proven to maintain the culture solution at a pn between 3 and 5 during these operations.

1. Man kann Adsorptionsmittel verwenden, z. B. Aktivkohlen, wie Norit, aktivierte Erden, wie Fullersräe oder Floridin, oder Harzadsorber, wie Asmit. Die Elution der Adsorbate erfolgt zweckmäßig mit Gemischen von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln mit Wasser oder wäßrigen Säuren, z. B. mit Wasser-Methanol-, Wasser-Pyridin-, verdünnte Essigsäure-Methanol- oder Wasser-Methanol-Eisessig-Butanol-Gemischen. Als besonders vorteilhaft für die Elution eines Noritadsorbates hat sich das Gemisch von Wasser (2 Volumteile), Methanol (1 Volumteil), Eisessig (1 Volumteil) und Butanol (2 Volumteile) erwiesen.
2. Eine zweite Methode zur Abtrennung des Antibiotikums aus dem Kulturfiltrat besteht darin, daß man das Antibiotikum an Kationenaustauschern adsorbiert, wobei besonders Säuregruppen enthaltende Harze, wie Amberlite IRC-50, geeignet sind. Letzteres kann sowohl in der Säureform als auch in der1. One can use adsorbents, e.g. B. activated carbons such as Norit, activated earths such as Fuller sräe or Floridin, or resin adsorbers such as Asmit. The adsorbates are expediently eluted with mixtures of water-miscible organic solvents with water or aqueous acids, e.g. B. with water-methanol, water-pyridine, dilute acetic acid-methanol or water-methanol-glacial acetic acid-butanol mixtures. The mixture of water (2 parts by volume), methanol (1 part by volume), glacial acetic acid (1 part by volume) and butanol (2 parts by volume) has proven to be particularly advantageous for the elution of a norit adsorbate.
2. A second method of separating the antibiotic from the culture filtrate is to adsorb the antibiotic on cation exchangers, resins containing acid groups, such as Amberlite IRC-50, being particularly suitable. The latter can be in the acid form as well as in the

ίο Natriumform verwendet werden, doch hat sich ein Gemisch dieser beiden Formen im Volumverhältnis 1:2 besonders bewährt. Die Elution geschieht zweckmäßig mit verdünnten Säuren, z. B. mit methanolischer Salzsäure. ίο the sodium form can be used, but a mixture of these two forms in a volume ratio of 1: 2 has proven particularly useful. The elution is expediently done with dilute acids, e.g. B. with methanolic hydrochloric acid.

3. Weiter kann das basische Antibiotikum auch direkt aus dem Kulturfiltrat ausgefällt werden, z. B. mittels Umsetzung mit einer organischen Säure vom Typus der Pikrinsäure. Durch Behandlung dieser Fällungen mit Salzen organischer Basen, z. B. mit Triäthylammoniumsulfat, oder mit verdünnten Säuren wird das Antibiotikum in Form des entsprechenden Salzes erhalten. Man kann dabei sowohl in wäßrigem Medium als auch in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Methanol oder Aceton, arbeiten.3. The basic antibiotic can also be precipitated directly from the culture filtrate, e.g. B. by reaction with an organic acid of the picric acid type. By treating this Precipitations with salts of organic bases, e.g. B. with triethylammonium sulfate, or with dilute acids the antibiotic is obtained in the form of the corresponding salt. You can do this both in aqueous Medium as well as in a water-miscible solvent, such as methanol or acetone, work.

Diese Überführung der schwerlöslichen Salze in leichtlösliche Salze des Antibiotikums wird entweder mit Mineralsäuren oder an Ionenaustauscherharzen, z. B. an Amberlite IRA-400, durchgeführt.This conversion of the sparingly soluble salts into easily soluble salts of the antibiotic is either with mineral acids or on ion exchange resins, e.g. B. on Amberlite IRA-400.

4. Eine Anreicherung des Antibiotikums wird auch dadurch erreicht, daß man wäßrige oder alkoholischwäßrige Lösungen des Salzes mit einem Überschuß von organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie Aceton, Dioxan usw. versetzt, wobei die Salze in fester Form ausgefällt werden.4. An enrichment of the antibiotic is also achieved in that one aqueous or alcoholic aqueous solutions of the salt with an excess of organic, water-miscible solvents such as acetone, dioxane, etc. added, the Salts are precipitated in solid form.

5. Eine weitere Methode der Anreicherung des Antibiotikums besteht darin, daß man wäßrige Lösungen desselben mit Lösungen von Phenol in Chloroform extrahiert, wobei sowohl das p_H der wäßrigen Lösung als auch der Phenolgehalt der Chloroformlösung variiert werden. So befindet sich das Antibiotikum z. B. bei einer Verteilung zwischen einer Lösung, die auf 100 cm³ Chloroform 100 g Phenol enthält, und einer wäßrigen Phase vom p_H 1 bis 6 fast ausschließlich in der organischen Phase, während es bei der Verwendung einer Lösung, die auf 100 cm³ Chloroform nur 33 g Phenol enthält, der wäßrigen Phase lediglich bei einem p_H zwischen 4 und 6 annähernd vollständig entzogen wird. Versteht man unter dem Verteilungskoeffizienten des Antibiotikums das Verhältnis von Konzentration in der organischen Phase zur Konzentration in der wäßrigen, so geht aus den obigen Angaben hervor, daß der Verteilungskoeffizient mit steigendem Phenolgehalt der organischen Phase zunimmt und mit sinkendem p_H der wäßrigen Phase abnimmt. Da es somit möglich ist, jeden beliebigen Verteilungskoeffizienten des Antibiotikums in diesem System einzustellen, kann man durch Kombination von wenigen Verteilungsoperationen einen Großteil inaktiver Verunreinigungen abtrennen.5. Another method of enrichment of the antibiotic is that aqueous solutions thereof with solutions of phenol in chloroform extracted, and both the p _H of the aqueous solution can be varied as well as the phenol content of the chloroform solution. So is the antibiotic z. B. with a distribution between a solution containing ^{100 g of phenol per 100 cm 3 of} chloroform, and an aqueous phase from p _H 1 to 6 almost exclusively in the organic phase, while when using a solution that is 100 cm ³ chloroform containing only 33 g of phenol, the aqueous phase is removed completely from approximately only at a p _H 4-6 Is meant by the distribution coefficient of the antibiotic, the ratio of concentration in the organic phase to the concentration in the aqueous, it is apparent from the above data that the distribution coefficient increases with increasing phenolic content of the organic phase and decreases with decreasing p _H of the aqueous phase. Since it is thus possible to set any arbitrary distribution coefficient of the antibiotic in this system, a large number of inactive impurities can be separated off by combining a few distribution operations.

6. Eine andere Anreicherungsmethode für das Antibiotikum stellt die Chromatographie dar, wie Adsorptionschromatographie an verschiedenen Materialien, z. B. an Α-Kohle, Aluminiumoxyd, Magnesiumsilikaten, Kieselsäuregel, Calciumsulfat, sowie Verteilungs-Chromatographie mit Cellulose, Stärke, Kieselsäuregel u. dgl. als Trägersubstanzen, oder aber Chromatographie an Ionenaustauscherharzen, z.B. anDowex50, Amberlite IRC-50 u. dgl. Beispielsweise hat sich die Verteilungschromatographie an Cellulose unter \^rerwendung des Lösungsmittelsystems Butanol (4 Volum-6. Another enrichment method for the antibiotic is chromatography, such as adsorption chromatography on various materials, e.g. B. on carbon, aluminum oxide, magnesium silicates, silica gel, calcium sulfate, as well as partition chromatography with cellulose, starch, silica gel and the like as carrier substances, or chromatography on ion exchange resins, e.g. anDowex50, Amberlite IRC-50 and the like. For example has the partition to cellulose, \ ^r Before Using the solvent system butanol (4 Volum-

teile), Eisessig (IVolumteil) und Wasser (5 Volumteile) besonders bewährt.parts), glacial acetic acid (I part by volume) and water (5 parts by volume) are particularly effective.

7. Weiter kann das Antibiotikum durch Gegenstromverteilung nach Craig zwischen zwei nicht mischbaren Lösungsmittelphasen angereichert werden. Folgende Lösungsmittelsysteme haben sich dabei besonders bewährt:7. Further, the antibiotic cannot, due to the countercurrent distribution according to Craig between two, not miscible solvent phases are enriched. The following solvent systems have proven particularly useful proven:

a) sek.Butanol — Vio η - AmmonacetatpufFer vom Ph 4,68;a) secondary butanol - Vio η - ammonium acetate buffer of Ph 4.68;

b) Vio η - AmmoniumacetatpufTer vom p_H 4,6 — 10%ige Lösung von Phenol in Chloroform.b) Vio η - AmmoniumacetatpufTer p _H, 4.6 - 10% solution of phenol in chloroform.

Der Verteilungskoeffizient des Antibiotikums im System b) und damit die Lage des Aktivitätsmaximums in der Verteilung kann einerseits durch Änderung des p_H der Pufferlösung und anderseits durch Variierung des Phenolgehaltes der organischen Phase beliebig verändert werden.The distribution coefficient of the antibiotic in the system b) and thus the position of the activity peak in the distribution on the one hand by altering the p _H of the buffer solution and the other, by varying the phenol content of the organic phase be changed arbitrarily.

Zur Herstellung eines weitgehend reinen Präparates hat sich folgende Kombination der aufgeführten Anreicherungsverfahren bewährt. Aus dem Kulturfiltrat wird das Antibiotikum am gepufferten Ionenaustauscher Amberlite IRC-50 adsorbiert und mittels methanolischer Salzsäure eluiert. Die Eluate werden, bei P _h 5 im Vakuum konzentriert, wobei ein wäßriges Konzentrat des Antibiotikums erhalten wird, das volumenmäßig ungefähr ein Hundertstel der Kulturlösung entspricht. Dieses wird gemäß der obenerwähnten Methode5 einige Male zwischen Phenol-Chloroform-Gemi sehen einerseits und wäßrigen Lösungen von variierendem p_H anderseits verteilt, wobei nach Gefriertrocknung ein Präparat erhalten wird, das in bezug auf das KulturfiItrat eine um den Faktor 500 bis 1000 erhöhte spezifische Wirksamkeit besitzt. Durch Behandlung eines solchen Präparates gemäß der oben aufgeführten Methoden 6 (Verteilungschromatographie an Cellulose) und Methode 7 kann das basische, weitgehend einheitliche Antibiotikum A 9578 vorzugsweise in Form eines Salzes erhalten werden.The following combination of the enrichment processes listed has proven itself to produce a largely pure preparation. The antibiotic is adsorbed from the culture filtrate on the buffered ion exchanger Amberlite IRC-50 and eluted using methanolic hydrochloric acid. The eluates are concentrated in vacuo at P _h 5, an aqueous concentrate of the antibiotic being obtained which corresponds in volume to approximately one hundredth of the culture solution. According to the method mentioned above, this is distributed several times between phenol-chloroform mixtures on the one hand and aqueous solutions of varying p _H on the other hand, a preparation being obtained after freeze-drying which has a specific activity increased by a factor of 500 to 1000 with respect to the culture filtrate owns. By treating such a preparation according to the above-mentioned methods 6 (partition chromatography on cellulose) and method 7, the basic, largely uniform antibiotic A 9578 can be obtained, preferably in the form of a salt.

Wie aus papierchromatographischen Untersuchungen hervorgeht, besteht das Antibiotikum A 9578 aus mindestens zwei Komponenten, nämlich der Hauptkomponente A und der Nebenkomponente B. Diese werden im Verlauf des beschriebenen Anreicherungsprozeses weitgehend voneinander getrennt, speziell bei der Verteilungschromatographie an Cellulose und bei der Gegenstromverteilung.As can be seen from paper chromatographic studies, antibiotic A 9578 consists of at least two components, namely the main component A and the secondary component B. These are largely separated from one another in the course of the enrichment process described, especially in partition chromatography on cellulose and in countercurrent distribution.

Die beiden Komponenten von A 9578 werden papierchromatographisch definiert durch einen direkten Vergleich ihrer R_f-Werte mit den R_f-Werten einer Reihe von bekannten Antibiotika (2 bis 11) in den Systemen A bis G. Beim System H wird durchlaufend chromatographiert. Die angegebenen Zahlen sind dort die in cm gemessenen Laufstrecken der Antibiotika nach 16stündiger Chromatogrammdauer. Der Nachweis der Antibiotika erfolgt autobiographisch mit Staphylococcus aureus oder Bacillus subtilis.The two components of A 9578 are defined by paper chromatography by direct comparison of their R _f values with the R _f values of a number of known antibiotics (2 to 11) in systems A to G. System H is continuously chromatographed. The figures given there are the distances of the antibiotics, measured in cm, after a chromatogram lasting 16 hours. The antibiotics are detected autobiographically with Staphylococcus aureus or Bacillus subtilis.

Systemsystem lala IbIb 22 33 44th 55 66th 77th 88th 99 1010 1111 AA. 00 00 00 00 00 00 00 00 00 ',inSitJp'
*~ 0,92 ', inSitJp'
* ~ 0.92 0,070.07 00 BB. 0,490.49 0,630.63 0,050.05 0,050.05 0,170.17 0,020.02 0,020.02 0,660.66 0,550.55 0,920.92 0,320.32 0,220.22 CC. 0,340.34 0,580.58 0,220.22 00 0,020.02 0,220.22 0,030.03 0,720.72 0,62 .0.62. 0,930.93 0,390.39 0,110.11 DD. 0,050.05 0,150.15 00 00 00 00 00 xx xx 0,920.92 00 EE. 0,320.32 0,320.32 00 0,100.10 0,220.22 00 00 xx xx 0,860.86 0,120.12 FF. 0,470.47 0,470.47 0,220.22 0,140.14 0,120.12 0,040.04 0,050.05 0,490.49 0,420.42 0,910.91 0,430.43 0,360.36 GG 0,740.74 0,740.74 0,070.07 0,020.02 xx xx 0,940.94 0,610.61 0,690.69 HH 2,72.7 7,67.6 00 00 00 00 00 (14,5)(14.5) (8,8)(8.8) 2727 11

A wassergesättigtes Butanol.A water-saturated butanol.

B Butanol — Eisessig — "Wasser (4:1:5) (obere Phase).B butanol - glacial acetic acid - "water (4: 1: 5) (upper phase).

C wassergesättigtes Butanol + 2% p-Toluolsulfosäure.C water-saturated butanol + 2% p-toluenesulphonic acid.

D wassergesättigtes Butanol + 2 °/o Piperidin.D water-saturated butanol + 2% piperidine.

E Butanol — Pyridin — "Wasser (6:4:3).E butanol - pyridine - "water (6: 4: 3).

F 80 »/0 Äthanol + 1,5 °/o Natriumchlorid, "Whatman Nr. 4 imprägniert mit 0,95 m Natriumsulfat + 0,05 m Natriumhydrosulfat. F 80 »/ 0 ethanol + 1.5% sodium chloride," Whatman No. 4 impregnated with 0.95 M sodium sulphate + 0.05 M sodium hydrosulphate.

G Butanol —Äthanol —"Wasser (1:1: 2).G butanol - ethanol - "water (1: 1: 2).

H Butanol — Butylacetat—Eisessig — "Wasser (10 : 3 : 1,
3 : 14 : 3) (obere Phase).H butanol - butyl acetate - glacial acetic acid - "water (10: 3: 1,
3: 14: 3) (upper phase).

Bei der Papierelektrophorese in 0,1 m-Acetatpuff er vom pjj 4,6 wandert das Antibiotikum A 9578 gegen die Kathode. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist etwa halb so groß wie diejenige des Streptomycins.In paper electrophoresis in 0.1 m acetate buffer he pjj 4.6 the antibiotic A 9578 migrates against the cathode. The migration speed is about half that of streptomycin.

Die Komponente A des Antibiotikums A 9578 ist ein orangegelbes Pulver, das sich leicht in Wasser, gut in Methanol und schwer in den meisten organischen Lösungsmitteln löst.Component A of antibiotic A 9578 is an orange-yellow powder that dissolves easily in water, dissolves well in methanol and poorly in most organic solvents.

Die BaseA gibt folgende Farbreaktionen:The BaseA gives the following color reactions:

FeCl₃ braunrotFeCl ₃ brown-red

FeCl₃-K₃Fe(CN)₆ blauFeCl ₃ -K ₃ Fe (CN) ₆ blue

Ninhydrin schwachviolettNinhydrin pale purple

Der Sakaguchi-, Maltol- und Ehrlich-Morgan-Test sind negativ. Eine wäßrige Lösung der Komponente AThe Sakaguchi, Maltol, and Ehrlich-Morgan tests are negative. An aqueous solution of component A

6060

6565

7070

la A 9578 Base A.la A 9578 base A.

Ib A 9578 BaseB.Ib A 9578 BaseB.

2 Streptomycin.2 streptomycin.

3 Ristocetin A.3 ristocetin A.

4 Ristocetin Β.4 ristocetin Β.

5 Neomycin Β.5 neomycin Β.

6 Viomycin.6 viomycin.

7 Chlortetracyclin.7 chlortetracycline.

8 Oxytetracyclin.8 oxytetracycline.

9 Actinomycin J.9 actinomycin J.

10 Cycloserin.10 cycloserine.

11 Grisein.11 Grisness.

χ Antibiotikum über ganze Laufstrecke verteilt.χ Antibiotic spread over the entire course.

() Position unscharf.() Position out of focus.

zeigt im UV-Spektrum Absorptionsmaxima bei 215 παμ (E5L==312) und bei 315 ιημ (Ei?_m=42).shows absorption maxima at 215 παμ (E5L == 312) and at 315 ιημ (Ei? _m = 42) in the UV spectrum.

Die freie Base des Antibiotikums A 9578 ist leicht aus ihren Salzen zugänglich, aus dem Sulfat z. B. durch Umsetzung in wäßrigem Medium mit Bariumhydroxyd, Neutralisierung des überschüssigen Baryts mit Kohlendioxyd sowie Abtrennung des Bariumcarbonat- und -Sulfatniederschlages und Isolierung der freien Base mittels Gefriertrocknung. Einfacher erfolgt die Herstellung aus den Salzen unter Verwendung eines stark basischenAnionenaustauschers, z.B. der OH-Form des unter der Bezeichnung Dowex-2 im Handel befindlichen Produktes.The free base of the antibiotic A 9578 is easily accessible from its salts, from the sulfate z. B. by reaction in an aqueous medium with barium hydroxide, neutralization of the excess barite with carbon dioxide as well as separation of the barium carbonate and sulfate precipitate and isolation the free base by means of freeze drying. It is easier to manufacture from the salts using a strongly basic anion exchanger, e.g. the OH form of the under the name Dowex-2 commercially available product.

Eine der auffallendsten Eigenschaften des Antibiotikums A 9578 ist ein ausgeprägtes StabilitätsOne of the most striking properties of antibiotic A 9578 is its pronounced stability

minimum zwischen ρ_Ξ 7 und 11. Lösungen des Anti biotikums verlieren bei 20° C und bei einem p_H von 8 bis 10 innerhalb 48 Stunden den größten Teil ihrer Aktivität, während sie bei der gleichen Temperatur und bei p_H-Werten von 1 bis 5 vollständig und bei 5 einem p_H von 6 bis 7 und 11 teilweise wirksam bleiben.minimum between _ρ Ξ 7 and 11. Solutions of the anti-spectrum antibiotic to lose most of its activity at 20 ° C and at a p _H 8-10 within 48 hours, while it at the same temperature and at _pH values of 1 to 5 completely, and at 5 a p _H 6-7 and 11 partially remain effective.

Die Salze des Antibiotikums A 9578 und seiner Komponente leiten sich von den bekannten anorganischen und organischen Salzen ab, beispielsweise von der Salzsäure, den Schwefelsäuren und Phosphorsäuren, der Essig-, Propion-, Valerian-, Palmitin- oder ölsäure, der Bernsteinsäure, Zitronensäure, Mandelsäure, Glutaminsäure oder Pantothensäure. Sie stellen neutrale oder saure Salze dar. Ihre Herstellung erfolgt durch Einwirkung der entsprechenden Säuren auf die freie Base oder durch doppelte Umsetzung von Salzen, beispielsweise von A9578-Sulfat mit pantothensaurem Calcium.The salts of the antibiotic A 9578 and its components are derived from the known inorganic ones and organic salts, for example from hydrochloric acid, sulfuric acids and phosphoric acids, acetic, propionic, valeric, palmitic or oleic acid, succinic acid, citric acid, Mandelic acid, glutamic acid or pantothenic acid. They represent neutral or acidic salts. Their production takes place by the action of the corresponding acids on the free base or by double conversion of salts, for example of A9578 sulfate with calcium pantothenic.

Das Antibiotikum A 9578 besitzt eine sehr hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Testorganismen. Im sogenannten Agarquerstrichtest ist es aktiv gegen folgende Testorganismen: Micrococcus pyogenes, var. aureus, Streptococcus viridans, Streptococcus faecalis, Corynebacterium diphteriae, Escherichia coli, Bacillus megatherium und Bacillus subtilis.The antibiotic A 9578 has a very high antibiotic effectiveness against various Test organisms. In the so-called agar cross test, it is active against the following test organisms: Micrococcus pyogenes, var.aureus, Streptococcus viridans, Streptococcus faecalis, Corynebacterium diphteriae, Escherichia coli, Bacillus megatherium and Bacillus subtilis.

In vivo ist das Antibiotikum A 9578 ebenfalls wirksam. Bei fünfmaliger subkutaner Verabreichung von 10 mg/kg an mit Staphylococcus pyogenes, var. aureus infizierte Mäuse werden 100% und bei einer Dosis von fünfmal 5 mg/kg 50% Überlebende beobachtet. 50% Uberlebende erhält man, wenn man Mäusen, die mit Escherichia coli infiziert sind, fünfmal 50 mg/kg subkutan appliziert.The antibiotic A 9578 is also effective in vivo. When administered subcutaneously five times of 10 mg / kg of mice infected with Staphylococcus pyogenes, var. aureus are 100% and in one Dose of five times 5 mg / kg 50% survivors were observed. 50% survivors are obtained if one Mice infected with Escherichia coli were administered five times 50 mg / kg subcutaneously.

Die Toxizität des Antibiotikums ist gering. So wird z. B. die subkutane Applikation von IOOO¹ mg/kg von Mäusen ohne Schädigung ertragen. Höhere Dosen wurden nicht geprüft.The toxicity of the antibiotic is low. So z. B. subcutaneous administration of IOOO ¹ mg / kg in mice without harming bear. Higher doses have not been tested.

Das Antibiotikum A 9578, seine Komponenten, seine Salze oder Derivate können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche öle, Benzylalkohol, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-. Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.The antibiotic A 9578, its components, its salts or derivatives can be used as remedies, e.g. B. in the form of pharmaceutical preparations, use. These contain the compounds mentioned in a mixture with a pharmaceutical suitable for enteral, parenteral or local application organic or inorganic carrier material. For the same purpose, those substances come into question that are linked to the new connections do not respond, such as B. gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohol, gum, polyalkylene glycols, petrolatum, cholesterol or other known ones Drug carrier. The pharmaceutical preparations can e.g. B. as tablets, coated tablets, powders, ointments, Creams, suppositories or in liquid form as solutions, suspensions or emulsions. If necessary, they are sterilized and / or contain auxiliary substances such as preservatives and stabilizers. Wetting or emulsifying agents. They can also contain other therapeutically valuable substances.

DieErfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, ohne daß damit eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.The invention is described in the following examples, without thereby limiting the Subject of the invention is intended. The temperatures are given in degrees Celsius.

example 1

Die Züchtung des Streptomyces A 9578 wird nach lern Submersverfahren durchgeführt. Man verwendet ;ine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 20 g Sojamehl und 20 g Mannit enthält. Die Nährlösung wird in den Impfkolben oder in den Fermentern wäh-The cultivation of Streptomyces A 9578 is carried out according to the submerged learning method. One uses A nutrient solution that contains 20 g soy flour and 20 g mannitol per liter of tap water. The nutrient solution is selected in the inoculation flasks or in the fermenters

rend 20 bis 30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Die sterilisierte Nährlösung zeigt ein p_H von 7,5 bis 8,0. Die Animpfung erfolgt mit bis zu 10% einer teilweise sporulierenden vegetativen Kultur des Organismus. Man inkubiert unter gutem Schütteln oder Rühren bei lumen steriler Kulturen in Fermentern mit etwa 2 Volumen striler Luft pro Volumen Lösung in der Minute belüftet werden. Nach 48 bis 120 Stunden Bebrütung hat die Kulturlösung den größten Hemmwert gegenüber den Testorganismen (B. subtilis, B. megatherium, Micrococcus pyogenes, var aureus) erreicht. Man unterbricht die Kultur, bringt das p_H durch Zugabe von verdünnter Schwefelsäure auf 4,5 und trennt das Mycel sowie andere feste Bestandteile von der die Hauptmenge des Antibiotikums enthaltenden Lösung mittels Filtration oder Zentrifugation ab, wobei gegebenenfalls der Kulturlösung vor der Filtration etwa 1% eines Filterhilfsmittels zugesetzt wird. Die Filterrückstände wäscht man mit Wasser und mit wäßrigem Methanol und vereinigt die Waschflüssigkeiten mit dem Kulturfiltrat.Sterilized for 20 to 30 minutes at 1 atm. The sterilized nutrient solution is a p _H 7.5 to 8.0. The inoculation takes place with up to 10% of a partially sporulating vegetative culture of the organism. Incubation is carried out with vigorous shaking or stirring with lumen sterile cultures in fermenters with about 2 volumes of sterile air per volume of solution being aerated per minute. After 48 to 120 hours of incubation, the culture solution has reached the greatest inhibitory value against the test organisms (B. subtilis, B. megatherium, Micrococcus pyogenes, var aureus). Interrupting the culture, the p _H brings by addition of dilute sulfuric acid to 4.5 and separating the mycelium and other solid components from which the main amount of the antibiotic-containing solution by filtration or centrifugation from, optionally wherein the culture solution before filtration, about 1% a filter aid is added. The filter residues are washed with water and with aqueous methanol and the washing liquids are combined with the culture filtrate.

Verwendet man an Stelle der oben angegebenen Nährlösung solche, die pro Liter Leitungswasser die folgenden Nährstoffe enthalten, so> erhält man nach analoger Züchtung und Aufarbeitung Kulturfiltrate von ähnlich hoher antibiotischer Wirksamkeit.If, instead of the nutrient solution given above, one uses those that per liter of tap water contain the following nutrients, then culture filtrates are obtained after analogous cultivation and processing of similar high antibiotic effectiveness.

a) Glucose IOga) Glucose IOg

Sojamehl . IOgSoy flour. IOg

Natriumchlorid 5 gSodium chloride 5 g

Natriumnitrat IgSodium nitrate Ig

b) Glycerin 20 gb) glycerin 20 g

Sojamehl IOgSoy flour IOg

Natriumchlorid 5 gSodium chloride 5 g

Natriumnitrat IgSodium nitrate Ig

Calciumcarbonat IOgCalcium carbonate IOg

c) Glucose IOgc) Glucose IOg

Sojamehl IOgSoy flour IOg

Corn steep liquorCorn steep liquor

(Maisquellwasser) 20 g(Corn steep water) 20 g

Natriumchlorid 5 gSodium chloride 5 g

Natriumnitrat IgSodium nitrate Ig

Calciumcarbonat IOgCalcium carbonate IOg

d) Laktose 20 gd) lactose 20 g

Distillers solubles 20 gDistillers solubles 20 g

Natriumchlorid 5 gSodium chloride 5 g

Natriumnitrat IgSodium nitrate Ig

Example 2

3 1 eines gemäß Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates werden durch Zugabe von verdünnter Natronlauge auf p_H 7,5 gebracht und mit 50 g Aktivkohle versetzt. Man läßt während 1 Stunde mechanisch rühren, wobei die gesamte antibiotisch wirksame Substanz von der Kohle adsorbiert wird. Letztere wird durch Filtration, vorteilhaft unter Zugabe von etwas Filterhilfsmittel, wie z. B. Hyflo Subercel, von der vollständig inaktiven Lösung abgetrennt. Die Kohle wird darauf in 500 cm³ einer Mischung von 4 Volumteilen Wasser und 1 Volumteil Pyridin eingetragen, die Mischung ¹Ii Stunde mechanisch gerührt und dann filtriert, worauf der Kohlerückstand noch einmal in gleicher Weise extrahiert wird. Die Eluate enthalten die gesamte antibiotische Aktivität.3 1 of a culture filtrate obtained in Example 1 and are brought by the addition of dilute sodium hydroxide solution to p _H 7.5 treated with 50 g activated carbon. The mixture is left to stir mechanically for 1 hour, all of the antibiotic substance being adsorbed by the charcoal. The latter is by filtration, advantageously with the addition of some filter aid, such as. B. Hyflo Subercel, separated from the completely inactive solution. The coal is a blend of 4 parts by volume of water and 1 part by volume of pyridine was added to it in 500 cm ^3, the mixture stirred for ¹ hour Ii mechanically and then filtered, after which the coal is extracted residue once more in the same manner. The eluates contain all of the antibiotic activity.

Example 3

3 1 eines gemäß Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates werden durch Zugabe von verdünnter Natronlauge auf Ph 7,5 gebracht und dann sofort mit einer Durchlauf-3 l of a culture filtrate obtained according to Example 1 are brought to pH 7.5 by adding dilute sodium hydroxide solution and then immediately with a flow

geschwindigkeit von 0,5 1 pro Stunde auf eine Säule von Amberlite IRC-50 (H-Form) gebracht, deren Länge bzw. Durchmesser 30 cm bzw. 5 cm beträgt. Das Antibiotikum wird dabei vollständig adsorbiert. Die Säule wird mit 3 1 Wasser gewaschen. Zur Elution verwendet man 1 1 0,4 η-Salzsäure. Die ersten 50O cm³ des Eluates sind antibiotisch unwirksam, während die zweiten 500 cm³ die gesamte Aktivität enthalten. Dieses aktive Eluat wird zur Entfernung der überschüssigen Salzsäure durch eine Säule von Amberlite IR-4B perkoliert. Durch Gefriertrocknung des Perkolates erhält man das angereicherte Antibiotikum A 9578 in Form eines hochwirksamen amorphen Pulvers.speed of 0.5 1 per hour brought onto a column of Amberlite IRC-50 (H-shape), the length and diameter of which are 30 cm and 5 cm, respectively. The antibiotic is completely adsorbed. The column is washed with 3 l of water. 1 1 0.4 η-hydrochloric acid is used for the elution. The first 50O cm ^{3 of} the eluate are antibiotically ineffective, while the second 500 cm ³ contain the entire activity. This active eluate is percolated through a column of Amberlite IR-4B to remove the excess hydrochloric acid. Freeze-drying the percolate gives the enriched antibiotic A 9578 in the form of a highly effective amorphous powder.

1515th

Example 4

6 1 eines gemäß Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates werden durch Zugabe von verdünnter Natronlauge auf p_H 7,5 gebracht und dann sofort durch eine Säule von Asmit 173 perkoliert, die 14 cm lang ist und einen Durchmesser von 4,5 cm hat. Das Antibiotikum wird dabei vollständig adsorbiert. Man wäscht das Adsorberharz hierauf mit 3 1 Wasser und eluiert das Antibiotikum mit 1 1 einer Mischung von Methanol und 1 η-Essigsäure (1:1). Das Eluat, das die gesamte Aktivität enthält, wird im Vakuum bei 35° auf 15 cm³ konzentriert. Man versetzt diese Lösung mit 75 cm³ 0,25 η methanolischer Salzsäure und gießt das Gemisch in 10 1 Aceton, wobei das Hydrochlorid des Antibiotikums ausfällt. Es wird filtriert und mit Aceton gewaschen. Zur weiteren Reinigung löst man es in 150 cm³ Methanol und nitriert die etwas trübe Lösung unter Zugabe von Cellulose. Nach Eindampfen des Filtrates im Vakuum bei 25° erhält man das Hydrochlorid des Antibiotikums A 9578 in Form eines amorphen Pulvers.6 1 of a culture filtrate obtained according to Example 1 by the addition of dilute sodium hydroxide solution to p _H 7.5 and then immediately percolated through a column of Asmit 173, which is cm long and 14 has a diameter of 4.5 cm. The antibiotic is completely adsorbed. The adsorber resin is then washed with 3 liters of water and the antibiotic is eluted with 1 liter of a mixture of methanol and 1-acetic acid (1: 1). The eluate, which contains the entire activity, is concentrated ^{to 15 cm 3 in vacuo at 35 °.} This solution is mixed with 75 cm ^{3 of} 0.25 η methanolic hydrochloric acid and the mixture is poured into 10 1 of acetone, the hydrochloride of the antibiotic precipitating out. It is filtered and washed with acetone. For further purification, it is dissolved in 150 cm ^{3 of} methanol and the somewhat cloudy solution is nitrated with the addition of cellulose. After evaporating the filtrate in vacuo at 25 °, the hydrochloride of the antibiotic A 9578 is obtained in the form of an amorphous powder.

Example 5

4040

301 eines gemäß Beispiel 1 erhaltenen Kulturnitrates werden auf p_H 4,5 gebracht und dann in einem Dünnschichteneindampfer auf 2 1 eingeengt. Das Konzentrat bringt man durch Zugabe von verdünnter Natronlauge aus p_H 8 und filtriert es unter Zugabe von Cellulose. Das klare Filtrat wird auf p_H 5 gebracht und unter Rührung mit 1,5 1 einer heißen, 5%igen wäßrigen Pikrinsäurelösung versetzt. Der entstandene Niederschlag wird nach mehrstündigem Stehen bei 0°C unter Zugabe von 50 g Cellulose abnitriert. Das Filtrat ist antibiotisch nur sehr schwach aktiv. Der Filterrückstand wird hierauf dreimal mit je 800 cm³ kaltem Aceton ausgerührt und filtriert. Man engt das Filtrat im Vakuum auf 80 cm³ ein, wobei das Pikrat des Antibiotikums und überschüssige Pikrinsäure ausfallen. Nach Abtrennung erhält man 8,5 g Trockensubstanz.301 of a culture nitrate obtained in Example 1 and are brought to p _H 4.5 then concentrated in a Dünnschichteneindampfer 2. 1 The concentrate is brought by the addition of dilute sodium hydroxide solution of p _H 8 and is filtered with the addition of cellulose. The clear filtrate is brought to p _H 5 and under stirring with 1.5 1 of a hot offset 5% aqueous solution of picric acid. After standing for several hours at 0 ° C., the resulting precipitate is nitrated off with the addition of 50 g of cellulose. The filtrate has only very weak antibiotic activity. The filter residue is then ^{stirred three times with 800 cm 3 of} cold acetone each time and filtered. The filtrate is concentrated in vacuo to 80 cm ³ , the picrate of the antibiotic and excess picric acid precipitating out. After separation, 8.5 g of dry substance are obtained.

Zur Isolierung des Antibiotikums als Hydrochlorid werden 2,5 g der erwähnten Trockensubstanz in 30 cm³ Methanol gelöst. Man gibt hierauf zuerst eine Mischung von 1 cm³ konz. Salzsäure und 10 cm³ Aceton und dann 500 cm³ Äther zu, wobei das Hydrochlorid quantitativ ausgefällt wird. Durch wiederholtes Lösen des Niederschlages in salzsaurem Methanol und Ausfällen mit Äther können die letzten Reste Pikrinsäure daraus entfernt werden. Schließlich wird das Hydrochlorid in möglichst wenig Methanol gelöst, filtriert und im Vakuum eingedampft. Man erhält 714 mg des Hydrochlorides des Antibiotikums A9578, das antibiotisch sehr aktiv ist.To isolate the antibiotic as the hydrochloride, 2.5 g of the dry substance mentioned are dissolved in 30 cm ^{3 of} methanol. One then gives a mixture of 1 cm ^{3 of} conc. Hydrochloric acid and 10 cm ^{3 of} acetone and then 500 cm ^{3 of} ether are added, the hydrochloride being precipitated quantitatively. The last residues of picric acid can be removed from it by repeatedly dissolving the precipitate in hydrochloric acid methanol and precipitating it with ether. Finally, the hydrochloride is dissolved in as little methanol as possible, filtered and evaporated in vacuo. 714 mg of the hydrochloride of the antibiotic A9578, which is very antibiotically active, are obtained.

Example 6

6001 eines nach Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates werden mit 5,5 kg Filterhilfe verrührt, mit 2,5 I 2 η-Salzsäure auf einen p_H-Wert von 4,0 eingestellt und hierauf filtriert. Den Filterrückstand wäscht man mit 1001 Wasser. Das klare Filtrat wird mit 7 kg vorbehandelter A-Kohle während 45 Minuten verrührt. Die Vorbehandlung der A-Kohle erfolgt durch mehrmaliges Ausrühren mit 1 η-Salzsäure und anschließendem Neutralwaschen mit Wasser. Die mit Antibiotikum beladene A-Kohle wird abfiltriert. Das FiI-trat enthält keine antibiotische Aktivität. Das Kohleadsorbat wird zweimal mit 2001 Wasser durch Rühren und Filtrieren gewaschen. Die Waschflüssigkeit enthält keine Aktivität. Die Elution erfolgt durch zweimaliges 1 stündiges Ausrühren der Aktivkohle mit einem Gemisch von n-Butanol—Methanol—Eisessig—Wasser im Volumenverhältnis von 2:1:1:2, wobei die Aktivkohle durch Filtration abgetrennt wird. Die vereinigten Eluate (140 1+46 1) werden mit 961 n-Butylacetat gut durchgemischt. Die sich abscheidende wäßrige Phase wird abgetrennt und die organische Phase mit 1,21 Wasser nachgewaschen. Die vereinigten wäßrigen Phasen (65,51) werden sukzessive mit 72 1 eines Gemisches von n-Butanol— n-Butylacetat im Volumenverhältnis von 1:2, 481 Essigester und schließlich mit 241 Äther durch Ausrühren gewaschen. Die organischen Phasen werden verworfen. Die verbleibende wäßrige Phase (44 1), die die gesamte antibiotische Aktivität enthält, wird im Ouickfittverdampfer bei höchstens 30° auf ein Volumen von 5,451 konzentriert. Aus diesem hochaktiven, schwarzbraungefärbten Konzentrat erhält man das Antibiotikum durch Gefriertrocknung in Form von 509 g eines braunen Pulvers. Dieses Material zeigt in bezug auf das Kulturfiltrat eine 30- bis 50fache spezifische antibiotische Aktivität.6001 of a culture filtrate obtained according to Example 1 are stirred with 5.5 kg of filter aid, adjusted with 2.5 I 2 η-hydrochloric acid to a _pH value of 4.0 and then filtered. The filter residue is washed with 100 liters of water. The clear filtrate is stirred with 7 kg of pretreated activated charcoal for 45 minutes. The pretreatment of the activated charcoal is carried out by repeated stirring with 1η hydrochloric acid and subsequent neutral washing with water. The activated charcoal loaded with antibiotics is filtered off. The fiI-step does not contain any antibiotic activity. The carbon adsorbate is washed twice with 2001 water by stirring and filtering. The washing liquid does not contain any activity. Elution takes place by stirring the activated carbon twice for 1 hour with a mixture of n-butanol, methanol, glacial acetic acid and water in a volume ratio of 2: 1: 1: 2, the activated carbon being separated off by filtration. The combined eluates (140 l + 46 l) are mixed thoroughly with 96 l of n-butyl acetate. The aqueous phase which separates out is separated off and the organic phase is washed with 1.21 of water. The combined aqueous phases (65.51) are washed successively with 72 liters of a mixture of n-butanol-n-butyl acetate in a volume ratio of 1: 2, 481 ethyl acetate and finally with 241 ether by stirring. The organic phases are discarded. The remaining aqueous phase (44 1), which contains the entire antibiotic activity, is concentrated in the Ouickfitt evaporator at a maximum of 30 ° to a volume of 5.451. The antibiotic is obtained from this highly active, black-brown colored concentrate by freeze-drying in the form of 509 g of a brown powder. This material shows a 30 to 50-fold specific antibiotic activity with respect to the culture filtrate.

Example 7

Zur Isolierung des Antibiotikums A 9578 aus 300 I eines nach Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates werdenTo isolate the antibiotic A 9578 from 300 l of a culture filtrate obtained according to Example 1 are used

1 Volumteil Amberlite IRC-50 in der H-Form mit1 part by volume of Amberlite IRC-50 in the H-shape with

2 Volumteilen Amberlite IRC-50 in der Na-Forrh mechanisch gemischt. 6,3 1 dieses Gemisches werden in eine Glassäule eingefüllt. Das Höhe-Durchmesser-Verhältnis des Harzbettes beträgt 8:1. Das Kulturfiltrat wird mit 2 η-Salzsäure auf p_H 4,0 eingestellt und mit einer Durchlaufgeschwindigkeit von 0,21/ Min./l Harz durch das Harz perkoliert, wobei sich in den oberen zwei Dritteln der Säule eine orangebraune Zone ausbildet. Das Harz wird anschließend mit 30 1 Wasser und mit 601 80°/oigem Methanol gewaschen. Der Durchlauf und die Waschflüssigkeiten enthalten nur wenig antibiotische Aktivität. Die Elution erfolgt in zwei Portionen mit insgesamt 37 1 eines Gemisches von 8 Volumteilen Methanol und 2 Volumteilen 1 η-Salzsäure. Beide Portionen werden mit 5 n-NaO H auf p_H 5,0 gestellt, vereinigt und hierauf im Zirkulationsverdampfer bei höchstens 30° auf 21 konzentriert. Das wäßrige Konzentrat wird auf p_H 5,6 gestellt und zwecks Entfernung von wenig unlöslichem Material durch Filterhilfe filtriert. Dieses Filtrat (2,3 1) enthält annähernd die gesamte antibiotische Aktivität der Kulturlösung. Es wird in vier Portionen mit insgesamt 500 ml eines Phenol-Chloroform-Gemisches, das 100 g Phenol in 100 ml Chloroform enthält, extrahiert. Die wäßrige Phase wird verworfen. Der Phenol-Chloroform-Extrakt (500¹ ml) wird mit 1 1 Chloroform verdünnt und mit dreimal 500 ml ¹Aa2 parts by volume of Amberlite IRC-50 mechanically mixed in the Na-Forrh. 6.3 l of this mixture are poured into a glass column. The height-to-diameter ratio of the resin bed is 8: 1. The culture filtrate is adjusted with 2 η-hydrochloric acid to p _H 4.0 percolated with a flow rate of 0.21 / Min./l resin by the resin, whereby an orange-brown zone is formed in the upper two thirds of the column. The resin is then washed with 30 l of water and with 60 l of 80% methanol. The run-through and wash liquids contain little antibiotic activity. Elution takes place in two portions with a total of 37 liters of a mixture of 8 parts by volume of methanol and 2 parts by volume of 1 η-hydrochloric acid. Both portions are provided with 5N NaO H on p _H 5.0, pooled and then concentrated in circulation evaporator at a maximum 30 ° to the 21st The aqueous concentrate is adjusted to p _H 5.6 and for the removal of little insoluble material filtered through filter aid. This filtrate (2.3 l) contains almost all of the antibiotic activity of the culture solution. It is extracted in four portions with a total of 500 ml of a phenol-chloroform mixture containing 100 g of phenol in 100 ml of chloroform. The aqueous phase is discarded. The phenol-chloroform extract (500 ml ¹⁾ is diluted with 1 1 of chloroform and three times with 500 ml of ¹ Aa

909 528/375909 528/375

n-Ammoniumacetatpuffer von p_H 4,60 ausgeschüttelt, wobei der organischen Phase gefärbte, antibiotisch inaktive Verunreinigungen entzogen werden. Die Chloroformphase wird nun mit 300 + zweimal 100 ml Vio η-Salzsäure extrahiert. Der tief rotgefärbte Säureextrakt, der das Antibiotikum enthält, wird mit Kaliumbicarbonat auf p_H 3,5 gebracht und mit vier 50-ml-Portionen Phenol-Chloroform-Gemisch (100 g: 100 ml) zurückextrahiert. Man filtriert den Phenol-Chloroform-Extrakt durch Cellulose. Das klare, rotgefärbte Filtrat (200 ml) wird unter starkem Schütteln mit 50 ml Wasser, 500 ml Äther und 300 ml Petroläther versetzt. Nach dem Abtrennen der wäßrigen Phase wird die organische Phase mit zweimal 50 ml Wasser nachgewaschen. Die vereinigten wäßrigen Extrakte werden zweimal mit 500 ml Äther und einmal mit 500 ml Benzol ausgeschüttelt und hierauf lyophilisiert. Man erhält 2,60 g eines antibiotisch hochwirksamen, orangebraungefärbten Pulvers. Dieses Material zeigt in bezug auf das Ausgangsmaterial eine 500 bis lOOOfache spezifische antibiotische Aktivität (Aktivität pro GewichtseinheitTrockensubstanz). Auf Whatman-Nr. I-Papier zeigt dieses Material im System n-Butanol—n-Butylacetat—Eisessig-—-Wasser = 10:3:1,3:14,3 bei der autobiographischen Entwicklung mit Staphylococcus aurus zwei Substanzflecken. Die langsamer wandernde antibiotische Substanz wird als Base A, die zweieinhalbmal schneller wandernde Substanz als BaseB bezeichnet. Die BaseA gibt auf dem Papier beim Besprühen mit FeCl₃-I-K₃FeCN_e eine blaue Farbreaktion.n-ammonium extracted from p _H 4.60, wherein the organic phase dyed antibiotic inactive impurities are withdrawn. The chloroform phase is then extracted with 300 + twice 100 ml of VI η hydrochloric acid. The deep red colored acid extract, which contains the antibiotic is reacted with potassium bicarbonate to p _H 3.5, and (g 100: 100 ml), with four 50 ml portions of phenol-chloroform mixture back extracted. The phenol-chloroform extract is filtered through cellulose. The clear, red-colored filtrate (200 ml) is mixed with 50 ml of water, 500 ml of ether and 300 ml of petroleum ether while shaking vigorously. After the aqueous phase has been separated off, the organic phase is washed twice with 50 ml of water. The combined aqueous extracts are extracted twice with 500 ml of ether and once with 500 ml of benzene and then lyophilized. 2.60 g of an antibiotic highly effective, orange-brown powder are obtained. This material shows a 500 to 100-fold specific antibiotic activity (activity per unit weight of dry substance) with respect to the starting material. On Whatman no. I-paper shows this material in the system n-butanol-n-butyl acetate-glacial acetic acid -—- water = 10: 3: 1.3: 14.3 in the autobiographical development with Staphylococcus aurus, two substance spots. The slower moving antibiotic is called Base A, and the two and a half times faster moving substance is called BaseB. The BaseA gives a blue color reaction on the paper when sprayed with FeCl ₃ -IK ₃ FeCN _e.

Example 8

338 g eines nach Beispiel 6 erhaltenen Antibiotikumpräparates werden in 1,5 1 Wasser gelöst. Man setzt 150 g kristallines Ammoniumsulfat zu und extrahiert die Lösung mit 1 1 + zweimal 500 ml eines Phenol-Chloroform-Gemisches, das 100 g Phenol in 100 ml Chloroform enthält. Die vereinigten Phenol-Chloroform-Extrakte werden mit 750 ml 1 η-Salzsäure ausgeschüttelt und hierauf durch eine Schicht von Cellulose filtriert. Das klare rotbraune Filtrat wird unter Rühren mit 600 ml Wasser, 4 1 Äther und schließlich mit 41 Petroläther versetzt. Die wäßrige Phase wird abgetrennt und die organische Phase mit zweimal 200 ml Wasser nachextrahiert. Die vereinigten wäßrigen Phasen (1 1) werden zweimal mit 11 Äther gewaschen und hierauf lyophilisiert. Man erhält 136 g eines braunen Pulvers, das in bezug auf das Ausgangsmaterial eine um den Faktor 2 erhöhtespezifische antibiotische Aktivität aufweist.338 g of an antibiotic preparation obtained according to Example 6 are dissolved in 1.5 l of water. One sets 150 g of crystalline ammonium sulfate and extracted the solution with 1 1 + twice 500 ml of a phenol-chloroform mixture, which contains 100 g of phenol in 100 ml of chloroform. The combined phenol-chloroform extracts are extracted with 750 ml of 1 η hydrochloric acid and then through a layer of cellulose filtered. The clear red-brown filtrate is stirred with 600 ml of water, 4 liters of ether and finally mixed with 41 petroleum ether. The aqueous phase is separated off and the organic phase with twice 200 ml of water re-extracted. The combined aqueous phases (11) are washed twice with 11 ether and then lyophilized. 136 g of a brown powder are obtained, which relative to the starting material has a specific antibiotic activity increased by a factor of 2.

Example 9

550 mg eines nach Beispiel H erhaltene^ir^stark aktiven Antibiotikumpräparates (BaseS),": werden in 55 ml eines Vio n-Ammoniumacetatpuffers von p_H 4,60 gelöst und mit viermal 20 ml eines Phenol-Chloroform-Gemisches, das 100 g Phenol in 400 ml Chloroform enthält, extrahiert. Die organischen Extrakte werden mit zweimal 15 ml Pufferlösung zurückgewaschen. Der das Antibiotikum enthaltende organische Extrakt (80 ml) wird mit 40 ml Chloroform verdünnt, noch einmal mit 60 ml Pufferlösung gewaschen und hierauf durch ein doppeltes Faltenfilter filtriert. Das tiefrotgefärbte Filtrat extrahiert man mit 30+ 20+10 ml 0,2 η-Salzsäure. Die das Antibiotikum enthaltende Säurelösung wird mit 50 ml Wasser verdünnt und mit einem Phenol-Chloroform-Gemisch, das 100 g Phenol in 100 ml Chloroform enthält, erschöpfend extrahiert (zweimal 20 + 10 ml).550 mg of a highly active antibiotic preparation (BaseS) obtained according to Example H , ": are dissolved in 55 ml of a Vio n-ammonium acetate _{buffer of p H} 4.60 and mixed with four times 20 ml of a phenol-chloroform mixture containing 100 g The organic extracts are backwashed twice with 15 ml of buffer solution. The organic extract containing the antibiotic (80 ml) is diluted with 40 ml of chloroform, washed once more with 60 ml of buffer solution and then passed through a double folded filter The deep red colored filtrate is extracted with 30 + 20 + 10 ml of 0.2 η-hydrochloric acid The acid solution containing the antibiotic is diluted with 50 ml of water and with a phenol-chloroform mixture containing 100 g of phenol in 100 ml of chloroform , exhaustively extracted (twice 20 + 10 ml).

Die vereinigten Phenol-Chloroform-Extrakte werden durch ein doppeltes Faltenfilter filtriert und mit 20 ml Wasser, 200 ml Äther und 100 ml Petroläther geschüttelt. Nach dem Abtrennen der wäßrigen Phase wird die organische Phase mit zweimal 15 ml Wasser nachextrahiert. Die vereinigten wäßrigen Extrakte werden zweimal mit 50 ml Äther und einmal mit 50 ml Benzol gewaschen und hierauf lyophilisiert. Man erhält 117 mg eines braunroten Pulvers, das in bezug auf das Ausgangsmaterial eine annähernd fünffache Anreicherung der antibiotischen Aktivität aufweist. The combined phenol-chloroform extracts are filtered through a double folded filter and with 20 ml Shake water, 200 ml ether and 100 ml petroleum ether. After separating off the aqueous phase the organic phase is extracted twice with 15 ml of water. The combined aqueous extracts are washed twice with 50 ml of ether and once with 50 ml of benzene and then lyophilized. 117 mg of a brownish-red powder are obtained, which is approximately five times that of the starting material Has enrichment of antibiotic activity.

Example 10

700 mg eines nach Beispiel 7 erhaltenen Antibiotikumpräparates werden an 127 g Whatman Nr. 1 Cellulosepulver chromatographiert. Als Elutionsmittel verwendet man die obere Phase eines Gemisches von 4 Teilen Butanol, 1 Teil Eisessig und 5 Teilen Wasser. Der abgetrennten oberen Phase werden 10 Volumprozente reines Butanol zugestzt. Die Substanz wird mit der zehnfachen Menge Cellulosepulver verrieben und als Pulver auf die Säule aufgetragen. Die Durchlaufgeschwindigkeit beträgt 15 bis 20ml/Std. Es werden Fraktionen zu 40 ml aufgefangen. Die einzelnen Fraktionen werden mit 50 ml Petroläther geschüttelt. Die ausgeschiedene wäßrige Phase wird mit Benzol gewaschen und lyophilisiert. Die Hauptmenge der antibiotischen Aktivität befindet sich in den Fraktionen 7 und 8 (121 mg) und 10 bis 13 (142 mg). Gemäß papierchromatographischen Untersuchungen enthalten die Fraktionen 7 und 8 vorwiegend Base B, die Fraktionen 10 bis 13 vorwiegend Base A.700 mg of an antibiotic preparation obtained according to Example 7 are mixed with 127 g of Whatman No. 1 cellulose powder chromatographed. The upper phase of a mixture of 4 parts of butanol, 1 part of glacial acetic acid and 5 parts of water. The separated upper phase becomes 10 percent by volume pure butanol added. The substance is rubbed with ten times the amount of cellulose powder and applied to the column as a powder. The throughput speed is 15 to 20 ml / hour. It will 40 ml fractions collected. The individual fractions are shaken with 50 ml of petroleum ether. The precipitated aqueous phase is washed with benzene and lyophilized. The bulk of the antibiotic activity is in fractions 7 and 8 (121 mg) and 10 to 13 (142 mg). According to paper chromatographic studies contain fractions 7 and 8 mainly base B, the Fractions 10 to 13 mainly base A.

Example 11

3 g eines nach Beispiel 8 erhaltenen Antibiotikumpräparates werden in einer Craigschen Verteilungsapparatur im System sek. Butanol—0,1 n-Ammonacetatpuffer p_H 4,68 über hundert Stufen verteilt. Jede Einheit enthält je 100 ml obere und untere Phase. Die Substanz wird in die Einheit Nr. 3 eingefüllt. Die Aufarbeitung erfolgt durch Versetzen des Gemisches der beiden Phasen mit dem doppelten Volumen Petroläther und Lyophilisation der wäßrigen Phase. Die dunkelgefärbten Fraktionen 3 bis 11 enthalten nur wenig antibiotische Aktivität. Die orangegelbgefärbten Fraktionen 12 bis 20 (631 mg) enthalten den Hauptteil der antibiotischen Aktivität (vorwiegend Base A). Die gelbgefärbten Fraktionen 21 bis 40 sind schwächer aktiv und enthalten ein Gemisch von BaseA und B, in dem die letztere überwiegt.3 g of an antibiotic preparation obtained according to Example 8 are sec in a Craig distribution apparatus in the system. Butanol — 0.1 n-ammonium acetate buffer p _H 4.68 distributed over a hundred levels. Each unit contains 100 ml each of the upper and lower phases. The substance is poured into unit # 3. Working up is carried out by adding twice the volume of petroleum ether to the mixture of the two phases and lyophilizing the aqueous phase. The dark-colored fractions 3 to 11 contain little antibiotic activity. The orange-yellow colored fractions 12 to 20 (631 mg) contain the majority of the antibiotic activity (predominantly base A). The yellow-colored fractions 21 to 40 are less active and contain a mixture of base A and B, in which the latter predominates.

Example 12

200 mg eines nach Beispiel 10 erhaltenen Antibiotikumpräparates (BaseA) werden in einer Craigschen Verteilungsapparatur im System V20 n-Ammoniumacetatpuffer p_H 4,58—10% Phenol in Chloroform über neunundzwanzig Stufen verteilt. Jede Stufe enthält je 10 ml obere und untere Phase. Die Hauptmenge der antibiotischen Aktivität befindet sich in den Fraktionen 6 bis 15. Diese werden vereinigt (etwa 200 ml), mit 400 ml Äther und 300 ml Petroläther versetzt und geschüttelt. Die abgetrennte, orangerotgefärbte wäßrige Phase wird mit Chloroform gewaschen und mit 20 + dreimal 10 ml eines Gemisches von 100 g Phenol in 100 ml Chloroform extrahiert. Den Phenol-Chloroform-Extrakt versetzt man unter Schütteln mit 20 ml Wasser, 300 ml Äther und 200 ml Petroläther. Die rotgefärbte wäßrige Phase wird abgetrennt, mit viel Äther und Benzol gewaschen und lyophilisiert. Man200 mg of an antibiotic preparation obtained according to Example 10 (Baasha) are distributed in a Craig's equipment of distribution in the system n-V20 ammonium p _H from 4.58 to 10% phenol in chloroform over twenty-nine stages. Each stage contains 10 ml each of the upper and lower phases. The bulk of the antibiotic activity is found in fractions 6 to 15. These are combined (about 200 ml), mixed with 400 ml of ether and 300 ml of petroleum ether and shaken. The separated, orange-red colored aqueous phase is washed with chloroform and extracted with 20 + three times 10 ml of a mixture of 100 g of phenol in 100 ml of chloroform. The phenol-chloroform extract is mixed with 20 ml of water, 300 ml of ether and 200 ml of petroleum ether while shaking. The red colored aqueous phase is separated off, washed with a lot of ether and benzene and lyophilized. Man

Claims

receives 86.4 mg of base A in the form of a yellow water-soluble powder. UV spectrum in water: 2max .: 215 ιημ (Ε} * = 312), 315 ιημ (Εϊ * = 42).

Color reactions: _g

Fe Cl ₃ brown-red

FeCl ₃ + K ₃ Fe (CN) ₆ .... blue

Ninhydrin weakly positive.

Negative Sakaguchi, Maltol,

Elson-Morgan.

Claim:

The use of Streptomyces A 9578 or a microorganism exhibiting its properties of the genus Streptomyces for the production of the antibiotic A 9578 or its components A and B by conventional biological Cultivation, extraction of the antibiotic from the culture filtrate, preparation and production of its salts.