DE2022311C3 - Negamycin, its salts and process for its preparation - Google Patents
Negamycin, its salts and process for its preparationInfo
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Description
und dessen Salze. n>and its salts. n>
2. Verfahren zur Herstellung von Negamycin gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm von Streptomyces purpeofuscus ATCC 21 470 in einer wäßrigen Kohlehydratlösung gezüchtet wird, die ein stickstoffhaltiges Nährmittel enthält, wobei das Züchten unter aeroben Bedingungen so lange durchgeführt wird, bis die Lösung eine antibakterielle Aktivität besitzt, und an- 2. A method for producing negamycin according to claim 1, characterized in that the strain of Streptomyces purpeofuscus ATCC 21 470 is grown in an aqueous carbohydrate solution containing a nitrogenous nutrient, the cultivation being carried out under aerobic conditions until the solution has antibacterial activity, and
O CH3 O CH 3
schließend das Necamycin aus der wäßrigen Lösung entweder durch Ausfällung mit einer wasserunlöslichen Säure oder durch Adsorption an einem Kationenaustauscherharz, an einem stark basischen Anionenaustauscherharz oder an Kohlenstoff und anschließende Eluierung abgetrennt wird und dieses gegebenenfalls in an sich bekannter Weise in die Salze übergeführt wird.subsequently the necamycin from the aqueous solution either by precipitation with a water-insoluble one Acid or by adsorption on a cation exchange resin, on a strongly basic one Anion exchange resin or carbon and subsequent elution is separated and this is optionally converted into the salts in a manner known per se.
Die Erfindung betrifft das Antibiotikum Negamycin der FormelThe invention relates to the antibiotic negamycin of the formula
CH, - CH - CH2 - CH - CH2 - C - NH — N - CH2 - COOHCH, - CH - CH 2 - CH - CH 2 - C - NH - N - CH 2 - COOH
NH2 OHNH 2 OH
NH2 NH 2
und dessen Salze und ein Verfahren zu seiner Herstellung durch Gärung, Abtrennung und Reinigung desselben.and its salts and a process for their preparation by fermentation, separation and purification same.
Diese Substanz vermag in wirksamer Weise Pseudomonas, Salmonella, Klebsiella und Staphylococci zu inhibieren. Sie besitzt eine geringe Toxizit£t und übt eine therapeutische Wirkung auf Infektionen von Pseudomonas und anderen ansprechbaren Organismen in Mäusen aus. Diese Substanz eignet sich zur Heilung von Infektionen von Pseudomonas sowie anderen ansprechbaren Organismen in Menschen und Tieren.This substance can effectively Pseudomonas, Inhibit Salmonella, Klebsiella and Staphylococci. She has low toxicity and exercises a therapeutic effect on infections of Pseudomonas and other responsive organisms in mice. This substance is useful for curing infections from Pseudomonas as well as others responsive organisms in humans and animals.
Das Antibiotikum Negamycin ist in Wasser löslich und in Methanol, Äthanol, Butanol, Butylacetat, Äthylacetat, Chloroform und Benzol praktisch unlöslich. Sie zeigt keine maximale Absorption von UV-Licht zwischen 220 und 400 ηm und liefert auf Ninhydrin, rotes Tetrazolium und Rydon-Smith-Reagcns posilive Reaktionen, während die Reaktionen gegenüber Sakaguchi und Molisch negativ verlaufen. Die Substanz weist in dem Infrarotteil des Spektrums Absorptionsbanden auf, wenn sie mit Kaliumbromid in pelletisierter Form untersucht wird. Die Absorptionsbanden treten bei folgenden Wellenzahlcn in cm~' auf: 3430, 3200, 3050, 2950, 1660, 1590, 1405, 1320, 1140, 1050, 970, 890, 820 und 720. Ferner ist die Substanz optisch aktiv ([«]'j E-|-2,5° (c 2, H2O)). Sie entspricht der Formel C11IL0N4O4 und zeigt drei pll-Werte von 3,55, 8,10 und 9,75.The antibiotic negamycin is soluble in water and practically insoluble in methanol, ethanol, butanol, butyl acetate, ethyl acetate, chloroform and benzene. It shows no maximum absorption of UV light between 220 and 400 μm and gives positive reactions to ninhydrin, red tetrazolium and Rydon-Smith reagents, while the reactions to Sakaguchi and Molisch are negative. The substance shows absorption bands in the infrared part of the spectrum when examined with potassium bromide in pelletized form. The absorption bands appear at the following wave numbers in cm ~ ': 3430, 3200, 3050, 2950, 1660, 1590, 1405, 1320, 1140, 1050, 970, 890, 820 and 720. The substance is also optically active ([«] 'j E- | -2.5 ° (c 2, H 2 O)). It corresponds to the formula C 11 IL 0 N 4 O 4 and shows three pI values of 3.55, 8.10 and 9.75.
F i g. 1 ist das Infrarotspektrum von Negamycin zusammen mit Kaliumbromid, währendF i g. 1 is the infrared spectrum of negamycin along with potassium bromide while
F i g. 2 das NMR-Spcktrum von Negamycin in D2O wiedergibt.F i g. 2, the NMR Spcktrum reproduces from negamycin in D 2 O.
Das Verfahren zur Herstellung dieses Antibiotikums Negamycin besteht darin, einen Stamm von S. purpeofuscus in einem Nährmedium unter aeroben Bedingungen so lange zu züchten, bis eine merkliche Menge an Negamycin in der Lösung angereichert worden ist.The process for making this antibiotic negamycin is to use a strain of S. purpeofuscus to grow in a nutrient medium under aerobic conditions until a noticeable Amount of negamycin has been accumulated in the solution.
Neuamyciii ist ein neues Antibiotikum. Der Or-Neuamyciii is a new antibiotic. The Or-
CH3 CH 3
35 ganismus, welcher das erfindungsgemäße Antibiotikum erzeugt, wurde ebenfalls zum ersten Male aufgefunden und aus einer Bodenprobe isoliert, die bei Myogisan, Gunma im Jahre 1964 (August) gesammelt worden ist. Dieser Stamm wurde mit der Laboratoriums-Nummer M89O-C2 versehen. Dieser Stamm M890-C2 wurde als Streptomyces purpeofuscus klassifiziert. Der Stamm Nr. M890-C2 wurde am 6. Mai 1969 unter der Nr. 306 in K-ogyogijutsuin Hakko Kenkyujo hinterlegt. Er wurde ferner in der American Type Culture Collection unter der Nr. ATCC 21 470 hinterlegt.The organism producing the antibiotic of the present invention was also found for the first time and isolated from a soil sample collected at Myogisan, Gunma in 1964 (August). This strain was given the laboratory number M89O-C2. This strain was M890-C2 classified as Streptomyces purpeofuscus. The strain No. M890-C2 was registered on May 6, 1969 under the No. 306 deposited in K-ogyogijutsuin Hakko Kenkyujo. It was also included in the American Type Culture Collection deposited under the number ATCC 21 470.
Der Stamm Nr. ATCC 21470 besitzt folgende Eigenschaften: Unter dem Mikroskop entwickelt ein verzweigtes Substratmyzelium gerade bis gebogene Luftmyzeln ohne eine Wirtelverzweigung noch eineThe strain No. ATCC 21470 has the following properties: Developed under the microscope branched substrate mycelium straight to curved aerial mycelia without one whorl branching or one
Spiralenbildung. Die Oberfläche der Sporen ist glatt. Die charakteristischen Eigenschaften in verschiedenen Medien (die Bezeichnung der Farbe wird in eckigen Klammern gemäß dem »Color Harmony Manual« der Container Corporation of America beschrieben) sind wie folgt:Spiral formation. The surface of the spores is smooth. The characteristic properties in different Media (the designation of the color is given in square brackets according to the »Color Harmony Manual «of the Container Corporation of America) are as follows:
1. Auf einem Glyzerin-Czapek-Agarmedium, inkubiert bei 27'C: Hellgelbes bis dunkelgelblichbraunes [Spice brown 4 ni] Wachstum bildet in überreichem Ausmaß Luftmyzeln mit einer hellgrauen Farbe. Es wird ein bräunliches bis hellrötlichbrauncs lösliches Pigment erzeugt.1. On a glycerine Czapek agar medium, incubated at 27 ° C.: light yellow to dark yellowish brown [Spice brown 4 ni] Growth forms abundant aerial mycelia with a light gray one Color. It becomes brownish to light reddish brown soluble pigment produced.
2. Auf einem Krainsky-Glucose-Asparagin-Agarmedium, inkubiert bei 27°C: Ein gclblichbrauncs [Luggage Tan 4 nc] bis dunkelgelblichbraunes [Clove Brown 3 ni] Wachstum erzeugt Luftmyzeln mit einem gelblich«cißen bis leichtbräunlichgrauen Farbton. Das lösliche Pigment ist schwachbraun. 2. On a Krainsky glucose asparagine agar medium, incubated at 27 ° C: a yellowish brown color [Luggage Tan 4 nc] to dark yellowish brown [Clove Brown 3 ni] Growth produces aerial mycelia with a yellowish to slightly brownish-gray hue. The soluble pigment is pale brown.
3. Auf einem Calciiimmalat-Agarmedium, inkubiert bei 27"C: Ein gräulichbraunes Wachstum [Fawn 4 ig] erzeugt gräulichweiße bis hellgraue Luftmyzeln. Es wird kein lösliches Pigment fcstge-3. Incubated on calcium salad agar medium at 27 "C: a grayish-brown growth [Fawn 4 ig] produces grayish-white to light-gray aerial mycelia. There is no soluble pigment
5555
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stellt. Das Calciiimmaku-Wachstum wird stark nach 3tägiger Inkubation solubilisieit.represents. The calciiimmaku growth becomes strong solubilized after 3 days of incubation.
4. In einer Pcpior.'.ösung, die 1,0% Natriumnitrat enthält und bei 27"C inkuriert worden ist: Farbloses bis hellgelblichbraunes Wachstum ohne Luftmyzeln. Kein lösliches Pigment oder leichtbraunes Pigment. Es wird eine schwache Nitratreduktion festgestellt.4. In a Pcpior. '. Solution containing 1.0% sodium nitrate contains and has been incubated at 27 "C: Colorless to pale yellowish brown growth without aerial mycelia. No soluble pigment or light brown pigment. There will be a weak nitrate reduction detected.
5. Auf einem bei 27· C inkubierten Kartoffelstück: Gerunzeltes hellgelblichbraunes [Lt Gold 2 ic] bis gelblichbraunes [Yellow Maple 3 ng], später dunkelgeiblichbraunes [Clove Brown 3 pi] bis schwarzes Wachstum. Keine Luftmyzeln. Schwachbräunliches lösliches Pigment. 5. On a potato piece incubated at 27 ° C: Wrinkled light yellowish brown [Lt Gold 2 ic] to yellowish brown [Yellow Maple 3 ng], later Dark yellow [Clove Brown 3 pi] to black growth. No aerial mycelia. Pale brownish soluble pigment.
6. Auf einer Stärke-Agarplatte, inkubiert bei 270C: Ein hellgelblichbraunes bis gelblichbniunes [Spiee Broun 4 m] Wachstum erzeugt Luftmyzeln mit einer gelblichweißen bis leichtgraucn Farbe. Bräunlich bis hellrötlichbraunes lösliches Pigment. Positive Hydrolyse von Stärke.6. On a starch-agar plate, incubated at 27 0 C: A pale yellowish brown [4 m skewers Broun] to gelblichbniunes growth generated Luftmyzeln with a yellowish white to leichtgraucn color. Brownish to light reddish brown soluble pigment. Positive hydrolysis of starch.
7. Auf einem Nährmittel-Agarmedium, inkubiert bei 37= C: Kein Wachstum innerhalb einer Inkubation von 14 Tagen.7. On nutrient agar medium, incubated at 37 ° C: no growth within 14 days of incubation.
8. Auf einem Nähr-Agarmedium, inkubiert bei 27 C: Ein hellrötlichbraunes [Brick Red 61/, ng] Wachstum erzeugt keine Luftmyzeln, jedoch ein hellrötlichbraunes lösliches Pigment.8. On a nutrient agar medium, incubated at 27 C: A light reddish brown [Brick Red 6 1 /, ng] growth does not produce aerial mycelia, but does produce a light reddish brown soluble pigment.
9. Auf einem koagulierten Loeffler-Serummedium, inkubiert bei 37;C. Kein Wachstum innerhalb einer Mtägigen Inkubation.9. On coagulated Loeffler serum medium, incubated at 37 ; C. No growth within 1 day of incubation.
,0. Auf einem bei 20 C gezüchteten Gelatinstumpf: Ein farbloses bis hellgelblichbraunes Wachstum erzeugt keine Luftmyzeln, jedoch ein lösliches Pigment mit einer braunen bis dunkelbraunen Farbe. Dk Verflüssigung von Gelatine ist stark., 0. On a gelatin stump grown at 20 C: A colorless to pale yellowish brown growth does not produce aerial mycelia, but does produce a soluble one Pigment with a brown to dark brown color. Dk liquefaction of gelatin is strong.
11. Auf einer bei 3 7CC inkubierten entrahmten Milch: Ein farbloses Wachstum erzeugt keine Luftmyzeln und auch kein lösliches Pigment. Nach einer vollständigen Koagulierung der Milch bei einer 4tägigen Inkubation erfolgt eine langsame Peptonisierung.11. In an incubated at 3 7 C C skimmed milk: A colorless growth does not generate Luftmyzeln and no soluble pigment. After a complete coagulation of the milk with a 4-day incubation, a slow peptonization takes place.
12. Auf einem bei 27CC inkubierten Tyrosin-Agarmedium: Ein farbloses oder graues bis dunkelbraunes Wachstum erzeugt dünne Luftmy-Leln mit einer weißen bis gräulichweißen Farbe. Die Bestimmung der Tyrosinaseaktivität ist schwierig, und zwar infolge einer schwärzlichen Pigmentierung eines löslichen Pigmentes.12. On a tyrosine agar medium incubated at 27 C C: A colorless or gray to dark brown growth produces thin aerial myeles with a white to grayish white color. The determination of the tyrosinase activity is difficult due to a blackish pigmentation of a soluble pigment.
13. Auf Zellulose (Filterpapier), inkubiert bei 27°C: Geringes Wachstum ohne Zersetzung von Zellulose. 13. On cellulose (filter paper), incubated at 27 ° C: Little growth with no decomposition of cellulose.
14. Verwendung von Kohlehydraten auf einem Priaham -Gottlieb- Basalmedium, inkubiert bei 27 C: Positives Wachstum mit Stärke, Dextrin, Glyzerin. Galaktose, Glukose, Rohrzucker, Maltose und Mannose. Negatives Wachstum mit Inosit, Laktose. Mannit, Raflinose, Rhamnose, Inulin. Sorbit. Fruktose, Xylose, Arabinose, Salicin und Dulcit.14. Use of carbohydrates on a Priaham-Gottlieb basal medium, incubated at 27 C: Positive growth with starch, dextrin, glycerine. Galactose, glucose, cane sugar, maltose and mannose. Negative growth with inositol, lactose. Mannitol, Raflinose, Rhamnose, Inulin. Sorbitol. Fructose, xylose, arabinose, salicin and dulcitol.
Die charakteristischen Eigenschaften des Stammes Nr. ATCC 21 470 könneii wie folgt zusammengefaßt werden: Er gehört zu dem Genus Streptomyces und besitzt Luftmyzeln, die weder Spiralen noch Wirtein bilden. Die Oberfläche der Sporen ist glatt. Auf verschiedenen Medien bildet er ein dunkelgeiblichbraunes Wachstum mit grauen oder leichtgrauen bis leichtbräunlicharauen Luftmyzeln. Er bildet kein lösliches Pigment oder nur in geringem Ausmaß ein leicht rötlichbraunes lösliches Pigment. Die Umkehr des Wachstums schlägt in Schwarz während der Tage der Inkubation über. Auf einem Nähragar bei 270C bildet dieser Stamm ein rötlichbraunes Wachstum sowie ein rötlichbraunes lösliches Pigment. Er bildet ein Melaminpigment, hydrolysiert Stärke und besitzt eine relativ starke proteolytische Aktivität. Diese Eigenschaften stimmen mit denjenigen von Streptomyces purpeofuscus Yamaguchi und Saburi (beschrieben im International Journal of Systematic Microbiology, 18, 364, 1968) überein. Jedoch verbraucht der Stamm ATCC 21 470 keine Laktose und Xylose, die von S. purpeofuscus verbraucht werden.The characteristic properties of the strain No. ATCC 21 470 can be summarized as follows: It belongs to the genus Streptomyces and has aerial mycelia which neither form spirals nor hosts. The surface of the spores is smooth. On various media, it forms a dark-yellowish-brown growth with gray or slightly gray to slightly brownish-rough aerial mycelia. It does not form any soluble pigment or only to a small extent a slightly reddish-brown soluble pigment. The reversal of growth turns black during the days of incubation. On a nutrient agar at 27 0 C, this strain forms a reddish brown growth as well as a reddish brown soluble pigment. It forms a melamine pigment, hydrolyzes starch and has a relatively strong proteolytic activity. These properties agree with those of Streptomyces purpeofuscus Yamaguchi and Saburi (described in the International Journal of Systematic Microbiology, 18, 364, 1968). However, the ATCC 21 470 strain does not consume lactose and xylose which are consumed by S. purpeofuscus.
Obwohl der erfindungsgemäß isolierte Stamm, der Negamycin erzeugt, geringfügig von der bekannten Spezies von S. purpeofuscus abweicht, wurde er dennoch als S. purpeofuscus bezeichnet. Hinsichtlich der Herstellung von Antibiotika durch S. purpeofuscus Yamaguchi und Saburi gibt es nur eine einzige Veröffentlichung (J. of General and Applied Microbiology, 1, 201 bis 234, 1955). Darin wird angegeben, daß das Kulturfiltrat gegenüber Trichomonas, grampositiven Bakterien sowie säurebeständigen Bakterien eine inhibierende Wirkung zeigt. Man findet keinen Hinweis auf die Erzeugung von Antibiotika, die gegenüber gramnegativen Bakterien wirksam sind. Daher steht fest, daß bisher noch niemals beobachtet wurde, daß Negamycin hergestellt werden kann, obwohl S. purpeofuscus eine bekannte Spezies ist.Although the strain isolated according to the invention which produces negamycin is slightly different from the known one Species differs from S. purpeofuscus, it was nevertheless designated as S. purpeofuscus. Regarding There is only one publication of the manufacture of antibiotics by S. purpeofuscus Yamaguchi and Saburi (J. of General and Applied Microbiology, 1, 201-234, 1955). It states that the Culture filtrate against Trichomonas, gram-positive bacteria and acid-resistant bacteria shows inhibiting effect. There is no evidence of the generation of antibiotics as opposed to that gram-negative bacteria are effective. It is therefore clear that it has never been observed before that Negamycin can be produced, although S. purpeofuscus is a known species.
Methode zur Bestimmung der NegamycinmengeMethod of determining the amount of negamycin
Diese Menge wird durch eine übliche Zylinderplattenmethode bestimmt, wobei reines N^gamyän als Standard verwendet wird.This amount is determined by a standard cylinder plate method, using pure N ^ gamyän is used as the standard.
Als anfälliger Organismus wird beispielsweiseAs a susceptible organism, for example
E. coli K12, Pseudomonas aeruginosa verwendet.E. coli K12, Pseudomonas aeruginosa were used.
Wird S. purpeofuscus unter geeigneten Bedingungen gezüchtet, dann wird Negamycin erzeugt. Eine Gärungsbrühe, die Negamycin enthält, wird in der Weise hergestellt, daß Sporen oder Myzeln des Negamycin erzeugenden Organismus auf ein geeignetes Medium aufgeimpft werden, worauf unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird. Zur Erzeugung von Negamycin ist eine Züchtung auf einem festen Medium möglich. Zur Erzeugung größerer Mengen wird jedoch eine Züchtung in einem flüssigen Medium bevorzugt. Jede Gärungstemperatur kann dabei eingehalten werden, und zwar innerhalb des Bereiches, in welchem der Negamycin erzeugende Organismus wachsen und Negamycin erzeugen kann. Ein Bereich von 25 bis 32" C wird bevorzugt. Medien, die aus bekannten Nährquellen für Schimmelpilze bestehen, eignen sich zur Erzeugung von Negamycin. Beispielsweise eignen sich als Stickstoffquelle Pepton, Fleischextrakt, N-Z-Amin, Kasein, Sojabohnenmehl, Maisflüssigkeit, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat sowie andere sticksloffhaltigc Materialien, wie beispielsweise Weizenkleie oder Reiskleie. Als Kohlenstoffquelle kommen beispielsweise Glykose, Glyzerin, Stärke, Maltose, Dextrin, Rohrzucker, Laktose, Sojabohnenöle oder andere Kohlehydrate oder andere Fette in reinem oder rohem Zustand in Frage. Natriumchlorid, Natrium- oder Kaliumphosphat oder Calciumcarbonat können ebenfalls verwendet werden. Gegebenenfalls können Spuren an Metallsalzen zugesetzt werden.When S. purpeofuscus is grown under suitable conditions, negamycin is produced. One Fermentation broth containing negamycin is made in such a way that spores or mycelia of negamycin are produced producing organism are inoculated on a suitable medium, whereupon under aerobic Conditions is bred. Negamycin is grown by growing it on a solid medium possible. In order to produce larger quantities, however, cultivation in a liquid medium is preferred. Any fermentation temperature can be maintained within the range in which the negamycin producing organism can grow and produce negamycin. A range from 25 to 32 "C is preferred. Media consisting of known nutrient sources for molds are suitable to produce negamycin. For example, peptone, meat extract, N-Z-amine, Casein, soybean meal, corn liquor, peanut meal, cottonseed meal, sodium nitrate, ammonium nitrate, Ammonium sulphate and other nitrogenous materials such as wheat bran or rice bran. As a carbon source, for example, glycose, glycerine, starch, maltose, Dextrin, cane sugar, lactose, soybean oils or other carbohydrates or other fats in pure or raw state in question. Sodium chloride, sodium or potassium phosphate or calcium carbonate can also be used. If necessary, traces of metal salts can be added.
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Die Gärung wird so lange fortgesetzt, His sich eine erhebliche Ncgamycinmengc angereichert hai. Beispielsweise können Sporen und Myzeln auf einer Schrägkultur von S. purpeofuscus ;;uf ein Medium aufgeimpft werden, das aus 2,0% Glukose, 2,0",, Stärke, 2,0% Sojabohnenmehl, 0,5% I lefccxtrakt, 0,2? % Natriumchlorid, 0,35",, Calciumcarbonat, 0,0005% CuSO,, · 5HA 0,0005",, MnCI2 · 711,O und 0,005%, ZnSO4 ■ 7HaO (eingestellt auf einen pll von 7,0) besteht. Dann erfolgt ein Züchten unter Schütteln bei 27' C. Man stellt eine Anreicherung von Megamycin während einer Zeitspanne von 3 bis 8 Tagen fest, beispielsweise in einer Menge von 20 (tg/ml nach 3 Tagen, 108|xg/ml (pH 7.4) am 6. Tag, 185|xg/ml (pH 7,6) am 7. Tag und 122 (zg/nil (pH 7,8) am 8. Tag.The fermentation continues until a considerable amount of ncgamycin has been enriched. For example, spores and mycelia can be inoculated on a slant of S. purpeofuscus ;; on a medium composed of 2.0% glucose, 2.0% starch, 2.0% soybean meal, 0.5% lefcc extract, 0 , 2% sodium chloride, 0.35 ", calcium carbonate, 0.0005% CuSO ,, · 5HA 0.0005", MnCI 2 · 711.0 and 0.005%, ZnSO 4 · 7H a O (adjusted to a pll This is followed by cultivation with shaking at 27 ° C. An accumulation of megamycin is found over a period of 3 to 8 days, for example in an amount of 20 (tg / ml after 3 days, 108 | xg / ml (pH 7.4) on the 6th day, 185 | xg / ml (pH 7.6) on the 7th day and 122 (zg / nil (pH 7.8) on the 8th day.
Negamycin ist in seiner wäßrigen Lösung relativ stabil. Nach einem Erhitzen von 5 mg/ml einer Negamycinlösung mit wechselnden pH-Werten (d. h. 1,8, 7,2 und 9,2) bei 60"C während einer Zeitspanne von 30 Minuten verbleiben 91 % ohne Zersetzung. Werden Negamycinlösungen mit 2 mg/ml bei verschiedenen pH-Werten bei 27°C während einer Zeitspanne von einer Woche gehalten, dann werden die folgenden Prozentsätze an Negamycin in unzersetzter Form festgestellt: 86% bei einem pH von 2,25, 80% bei einem pH von 4,90, 76% bei einem pH von 7,15, 89% bei einem pH von 9,0 und 79% bei einem pH von 10,2.Negamycin is relatively stable in its aqueous solution. After heating 5 mg / ml of a negamycin solution with varying pH values (i.e. 1.8, 7.2 and 9.2) at 60 "C for a period of 91% remain without decomposition for 30 minutes. Are negamycin solutions with 2 mg / ml at different pH values maintained at 27 ° C for a period of one week, then the following Percentages of negamycin in undecomposed form found: 86% at a pH of 2.25, 80% at a pH of 4.90, 76% at a pH of 7.15, 89% at pH 9.0 and 79% at pH of 10.2.
Durch die Erfindung werden ferner Methoden zur Extraktion und Reinigung von Negamycin zur Verfügimg gestellt. Negamycin ist in Wasser löslich und liegt hauptsächlich in dem flüssigen Teil der Gärungsbrühc vor. Negamycin in der Brühe wird nicht aus der Brühe in organische Lösungsmittel übertragen, beispielsweise in Butanol. Äthylacetat, Äther, Chloroform oder Benzol.The invention also provides methods for extracting and purifying negamycin placed. Negamycin is soluble in water and resides mainly in the liquid part of the fermentation broth before. Negamycin in the broth does not transfer from the broth into organic solvents, for example in butanol. Ethyl acetate, ether, chloroform or benzene.
in-i Verwendung von Adsorptionsmittel kann Megamycin aus der Gärbrühe oder aus seiner wäßrigen Lösung abgetrennt werden. Aktivkohle ist eines der bevorzugten Adsorbcntien. An Aktivkohle adsorbiertes Negamycin kann in wirksamer Weise durch wäßriges Methanol, wäßriges Butanol oder wäßriges Aceton eluiert werden. Die Eluierung erfolgt noch leichter, falls die Eluierung in saurem Medium unter Verwendung von Chlorwasserstoffsäure erfolgt. Wenn auch Negamycin eine Carbonsäuregruppe aufweist, so ist das Molekül dennoch durch das Vorhandensein von zwei basischen Gruppen basisch und läßt sich von einem Kationenaustauscherharz adsorbieren. Ein Knlionenaustauschcrharz eignet sich am besten zur Extraktion von Negamycin aus der Kulturbrühe oder aus seiner wäßrigen Lösung. Diese Harze können in der Η-Form, in der Natriumform, in der Kaliumform oder in der Ammoniumform oder in gemischten Formen verwendet werden. An dem Kationenaustauschcrharz adsorbiertes Negamycin kann mit einer Säure cluicrt werden, beispielsweise mit Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure, wobei jedoch in bevorzugter Weise wäßriges Ammoniak verwendet wird. Negamycin. das eine Carbonsäuregruppe aufweist, kann ebenfalls von einem Anioncnaustauscherharz adsorbiert werden. Dazu kann ein stark basisches Anionenaustauscherharz in der OH-Form verwendet werden. Das adsorbierte Negamycin kann mit verdünnter Chlorwasserstoff sä ure cluicrt werden. Anionenaustauscherharze mit schwach basischen Gruppen können in der OH-Form zur Ncutralisicrung einer sauren Negarnycinlösung verwende, werde::, ohne daß dabei merkliche Mengen dieses Antibiotikums adsorbiert werden.in-i use of adsorbent can Megamycin can be separated from the fermentation broth or from its aqueous solution. Activated carbon is one of the preferred adsorbents. Negamycin adsorbed on activated charcoal can be effectively replaced by aqueous Methanol, aqueous butanol or aqueous acetone are eluted. Elution is still in progress easier if the elution is done in acidic medium using hydrochloric acid. When Negamycin also has a carboxylic acid group, the molecule is nonetheless due to its presence of two basic groups and can be adsorbed by a cation exchange resin. A Ion exchange resin is best for extracting negamycin from the culture broth or from its aqueous solution. These resins can be in the Η form, in the sodium form, in the potassium form or in the ammonium form or in mixed forms. On the cation exchange resin Adsorbed negamycin can be clenched with an acid, such as hydrochloric acid or sulfuric acid, but preferably aqueous ammonia is used. Negamycin. which has a carboxylic acid group can also be adsorbed by an anion exchange resin will. A strongly basic anion exchange resin can be used for this purpose can be used in the OH form. The adsorbed negamycin can be cluicrt with dilute hydrochloric acid. Anion exchange resins with weakly basic groups can in the OH form for Ncutralisicrung an acidic Using negarnycin solution will :: without doing anything significant amounts of this antibiotic are adsorbed.
Die Myzele in der Gärbrühc können durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt werden. Die My/cln enthaltende Gärbrühe kann ferner direkt auf eine I lar/koloniK· aufgebracht werden, ohne daß dabei vorher die My/cln entfernt werden, solern große Teilchen, welche ein Durchllieüen durch die Kolonne verhindern, durch Durchschicken durch ein MctallnetzThe mycelia in the fermentation broth can be filtered through or centrifugation. The fermentation broth containing My / cln can also directly on an I lar / koloniK · can be applied without thereby the particles must first be removed so as to remove large particles which pass through the column prevent by sending it through a metal net
ίο entfernt werden. Nachfolgend wird eine Methode angegeben, die sich /ur Isolierung von Negamycin aus der Gärbrühe von S. purpeofuscus eignet: Die Gärbrühc wird filtriert oder zentrifugiert, worauf das liltral oder die überstehende Flüssigkeit durch eine KationcnauslauseherhaiY-Kolonne (70% in der NH4-l'orm) geschickt wird. Nachdem die Kolonne mit Wasser gewaschen worden ist, wird das adsorbierte Negamycin mit 2,0%igcm NH4OH in Wasser eluiert. Das Negamycin enthaltende Eluat wird unter vermindertem Druck zur Entfernung von Ammoniak konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird durch eine Säule mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz in der OH-Lorm geschickt. Nach einem Waschen wird das Negamycin auf dem Harz mit 0,5n-HCI eluiert. Das Eluat, das Negamycin enthält, wird mit einem schwach basischen Anioncnaustauscherharz in der OH-Form neutralisiert und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Dabei wird ein rohes Pulver aus Negamycin-Hydrochlorid erhalten. Das rohe Pulver des Hydrochlorids wird in Wasser gelösl und durch ein Harz in der NH4-Form geschickt, worauf eine chromatographische Entwicklung mit Wassci oder 0,l%igem NH4OH erfolgt. Die Fraktionen, welche Negamycin enthalten, werden unter Vakuun eingedampft. Dabei wird ein weißes Pulver aus rcinerr Negamycin erhalten. 1st die Reinheit nicht aus reichend, dann wird die Chromatographie wiederholt Ferner kann Negamycin durch Zugabe einer wasser unlöslichen Säure, beispielsweise Picrinsäure ode!ίο be removed. A method is given below which is suitable for isolating negamycin from the fermentation broth of S. purpeofuscus: The fermentation broth is filtered or centrifuged, whereupon the liltral or supernatant liquid is passed through a KationcnauslauseherhaiY column (70% in the NH 4 -1 'orm) is sent. After the column has been washed with water, the adsorbed negamycin is eluted with 2.0% NH 4 OH in water. The eluate containing negamycin is concentrated under reduced pressure to remove ammonia. The concentrated solution is passed through a column with a strongly basic anion exchange resin in the OH-Lorm. After washing, the negamycin on the resin is eluted with 0.5N HCl. The eluate, which contains negamycin, is neutralized in the OH form with a weakly basic anion exchange resin and evaporated to dryness under reduced pressure. A raw powder of negamycin hydrochloride is obtained. The crude powder of the hydrochloride is dissolved in water and passed through a resin in the NH 4 form, whereupon chromatographic development with water or 0.1% NH 4 OH takes place. The fractions which contain negamycin are evaporated in vacuo. A white powder of red negamycin is obtained. If the purity is insufficient, the chromatography is repeated. Negamycin can also be removed by adding a water-insoluble acid, for example picric acid or!
p-Hydroxyazobenzol-p'-sulfonsäure, ausgefällt wer den. Negamycin kristallisiert als Salz von p-Hydroxy azobenzol-p'-sulfonsäure aus. Das in diesen wasser unlöslichen Salzen enthaltene Negamycin kann vor den Säuren nach bekannten Methoden zur Frei setzung einer Base aus einem wasserunlöslichen Sah abgetrennt werden. Beispielsweise wird Negamycin p-hydroxyazobenzol-p'-sulfonat mit HCl in Äthano behandelt, wobei Negamscin-Hydrochlorid ausgefäll wird. Eine in Wasser unlösliche Säure, wie beispiels weise anionische Tenside, sowie Natriumlaurylsulfona können ebenfalls zur Ausfällung von Negamycii verwendet werden.p-Hydroxyazobenzene-p'-sulfonic acid, precipitated who the. Negamycin crystallizes out as a salt of p-hydroxy azobenzene-p'-sulfonic acid. That in this water Negamycin contained in insoluble salts can be removed from the acids according to known methods A base can be separated from a water-insoluble saw. For example, negamycin is used Treated p-hydroxyazobenzene-p'-sulfonate with HCl in ethano, whereby negamscin hydrochloride precipitated will. A water-insoluble acid, such as, for example, anionic surfactants, and sodium lauryl sulfona can also be used to precipitate Negamycii.
Nach einer der vorstehend beschriebenen Methode! gereinigtes Negamycin liegt in Form eines weißci Pulvers vor. Es ist in Wasser löslich und in Mithanoi Äthanol, Estern sowie in Benzol unlöslich. Negamycinir der wäßrigen Lösung zeigt eine Endabsorption, jedocl keine maximale Absorption von UV-Licht zwischer 220 und 400 nm. Es ist amphoter und zeigt star!Using one of the methods described above! Purified negamycin is in the form of a white ci Powder. It is soluble in water and insoluble in Mithanoi ethanol, esters and benzene. Negamycinir the aqueous solution shows a final absorption, but no maximum absorption of UV light between 220 and 400 nm. It is amphoteric and shows star!
basische und schwach saure Eigenschaften. Unte einer Spannung von 3500 V sowie bei einem pH voi 1,8 (Puffer) (Ameisensäure / Essigsäure / Wasser 25 : 75 : 900, bezogen auf das Volumen), bewegt siel Negamycin um 12 cm an die Kathode. Se.zt man di Beweglichkeit von Alanin gleich 1,0, dann ist di Beweglichkeit von Negamycin 1,4. Es bildet Säure additionssalze mit Chlorwasserstoffsäure, Schwefel säure, ρ - Hydroxyazuberizoi - ρ' - sulfonsäure odebasic and weakly acidic properties. Below a voltage of 3500 V and at a pH voi 1.8 (buffer) (formic acid / acetic acid / water 25: 75: 900, based on the volume), agitated Negamycin by 12 cm to the cathode. If the mobility of alanine is equal to 1.0, then di Motility of negamycin 1.4. It forms acid addition salts with hydrochloric acid, sulfur acid, ρ - Hydroxyazuberizoi - ρ '- sulfonic acid ode
Picrinsäure. Das eine Carboxylgruppe aufweisende Negamycin bildet ferner Metallsalze und -ester. Es liefert positive Reaktionen auf Ninhydrin, Rydon-Smith-Reagcns und negative Reaktionen auf Anthron und Sakaguchi-Reagens. Erhitzt man es auf 105"C in 611-HCl während einer Zeitspanne von 6 Stunden, dann zeigt das Hydrolysat mehr als drei Ninhydrin-Produktc (die Hauptprodukte bestehen aus drei Produkten). Die drei Haupthydrolyse-Produkte sind τ- Hydroxy -β -lysin, Ν,Ν' - Dimcthylhydrazin und Methylamin. Sarkosin sowie 1-Methylhydraginoessigsäure werden als in kleineren Mengen anfallende Hydrolyse-Produkte erhalten.Picric acid. The negamycin having a carboxyl group also forms metal salts and esters. It gives positive reactions to ninhydrin, Rydon-Smith reagents and negative reactions to anthrone and Sakaguchi reagent. It is heated to 105 "C in 611-HCl over a period of 6 hours, then the hydrolyzate is more than three ninhydrin Produktc (the main products consist of three products). The three main hydrolysis products are τ- hydroxy -β -lysine , Ν, Ν '- dimethylhydrazine and methylamine, sarcosine and 1-methylhydraginoacetic acid are obtained as hydrolysis products in smaller quantities.
Hochreines Negamycin schmilzt allmählich beginnend bei 75'C und zersetzt sich unter Schäumen bei 110 bis 1200C. Die Elementaranalyse liefert folgende Werte:High purity negamycin melts gradually starting at 75'C and decomposes with foaming at 110 to 120 0 C. Elemental analysis gives the following values:
Analyse für C9H20N4O4 · 2H2O:Analysis for C 9 H 20 N 4 O 4 · 2H 2 O:
Berechnet ... C 38,02, H 8.51, N 19,71, 0 33,77; gefunden ... C 37,78, H 8,62, N 18,94, O 31,70.Calculated ... C 38.02, H 8.51, N 19.71, 0.33.77; Found ... C 37.78, H 8.62, N 18.94, O 31.70.
Es wird ein Titrationsäquivalent von 287 erhalten. Negamycin-p-hydroxyazoben^ol-p'-sulfonat fällt in Form gelboranger Kristalle (F. 180 bis 182°C, Zersetzung) an. Diese Verbindung zeigt eine antibakterielle Aktivität, die etwa '/3 der Aktivität von Negamycin entspricht. Die Analyse liefert folgende Ergebnisse: A titration equivalent of 287 is obtained. Negamycin-p-hydroxyazoben ^ ol-p'-sulfonate falls into Form yellow-orange crystals (mp 180 to 182 ° C, decomposition). This compound shows an antibacterial Activity approximately 1/3 that of negamycin. The analysis provides the following results:
Analyse für C9H20N4O4(Ci2H10N2O4S)2 · 2H2O: Berechnet ... C 47,13, H 5,27, N 13,33, O 26,64,Analysis for C 9 H 20 N 4 O 4 (Ci 2 H 10 N 2 O 4 S) 2 • 2H 2 O: Calculated ... C 47.13, H 5.27, N 13.33, O 26.64 ,
S 7,63;
gefunden ... C 47,09, H 5,16, N 13,20, O 25,53, S 8,01.S 7.63;
Found ... C 47.09, H 5.16, N 13.20, O 25.53, S 8.01.
Negamycin weist drei tilrierbare pK-Werte auf, und zwar wie folgt: 3,55, 8,10 und 9,75. Im Infrarotspektrum von Negamycin, das unter Verwendung von Kaliumbromid aufgenommen wird, werden Absorptionsbanden bei folgenden Wcllenzahlen in cm'1 beobachtet: 3430, 3200, 3050, 2950, 1660, 1590, 1405, 1320, 1140, 1050, 970, 890, 820 und 720. Negamycin-p-hydroxyazobenzol-p'-sulfonat zeigt Absorptionsbanden bei folgenden Wellenzahlen in cm"1: 3550, 3400, 3350, 3250, 3200, 3050, 2950, 1730, 1690, 1600, 1560, 1510, 1440, 1430, 1400, 1360, 1280—1100, 1060, 1030, 1010, 990, 960, 945, 900, 880, 850, 800, 715 und 680. Bei diesem Salz tritt die Bande für die Carbonsäure bei 1730 cm"1 auf. Das Infrarotspektrum von Negamycin-Methylester besitzt die Banden bei folgenden Wellenzahlen in cm-1: 3400, 3200, 3000, 2950, 1740, 1665, 1600, 1485, 1445, 1400, 1200. 1140, 1050, 1000, 960, 890 und 720. Die Bande für die Estergruppe liegt bei 1740 und 1220 cm"1.Negamycin has three filterable pK values as follows: 3.55, 8.10 and 9.75. In the infrared spectrum of negamycin, which is recorded using potassium bromide, absorption bands are observed at the following numbers in cm -1 : 3430, 3200, 3050, 2950, 1660, 1590, 1405, 1320, 1140, 1050, 970, 890, 820 and 720. Negamycin-p-hydroxyazobenzene-p'-sulfonate shows absorption bands at the following wave numbers in cm " 1 : 3550, 3400, 3350, 3250, 3200, 3050, 2950, 1730, 1690, 1600, 1560, 1510, 1440, 1430, 1400, 1360, 1280-1100, 1060, 1030, 1010, 990, 960, 945, 900, 880, 850, 800, 715 and 680. For this salt, the band for the carboxylic acid occurs at 1730 cm " 1 . The infrared spectrum of negamycin methyl ester has the bands at the following wave numbers in cm- 1 : 3400, 3200, 3000, 2950, 1740, 1665, 1600, 1485, 1445, 1400, 1200, 1140, 1050, 1000, 960, 890 and 720 The band for the ester group is at 1740 and 1220 cm " 1 .
Die bereits gezeigte Struktur wird auf Grund einer Massenspektrometrie von Negamycin- Methylester und Triacetyl-Negamycin-Methylester sowie durch Bestimmung der Strukturen der Hydrolyse-Produkte nahegelegt.The structure already shown is based on a mass spectrometry of negamycin methyl ester and Triacetyl negamycin methyl ester as well as by determination the structures of the hydrolysis products suggested.
Negamycin hemmt ein Wachstum von gramnegativen und -positiven Organismen. Wird die antibakterielie
Wirkung durch Agarstrichmethoden unter Verwendung von Fleischextrakt/Pepton-Agar getestet,
dann werden folgende Organismen bei den angegebenen Konzentrationen inhibiert (es wird eine in eine
Schleife gehende Menge einer 20 Stunden alten Nährbrühenkultur aufgestrichen; die Werte in den Klammern
sind die Konzentrationen der jeweiligen Inhibierung:
Staphylococcus aureus 209 ρ 50 μg/mI, Staphylococcus
aureus 193 12,5 μg/ml (6,12 ^gImX), Staphylo
coccus aureus Smith 5C^g/ml, Sarcina lutea PCI-100
12^g/ml (1,56μ§/ηιΙ), Bacillus subtilis NRRL-B55I
25 μβ/ηι1 (12,5 μ8/ιη1), E. coli K12 3,12 [ig/ml (1,56 μβ
ml), E. coli NIHJ 12^g/ml (3,^g/ml), Shigelli
llexneri 12,5 μg/ml, Salmonella typhosa 3,12 μg/ml
Klebsiella pneumoniae PCI 60212,5 μg/ml (6,25 μg/ml)
Seratia marscesccns 12,5 μg/ml (6,25 μg/ml), Proteu;
vulgaris, OX19 6,25 μg/m!, Proteus rettgeri (GN311
12,5 μg/ml (6,25 μg/ml), Pseudomonas aeruginos.
(Nr. 2) 12,5 μg/ml, Pseudomonas aeruginosa Nr.;
25 μg/ml (12,5 μg/ml), Pseudomonas fluorescem
6,25 μg/ml (3,12μg/ml), Mycobaclerium smegmati:
607 100μg/ml. Wird die 20 Stunden alte Nähr
brühenkultur auf das lOOOfache verdünnt und wire eine in eine Schleife gehende Menge aufgestrichen
dann wird die Wachstumsinhibierung um die Hälfte der vorstehend angegebenen Inhibierung vermindert
Bei Verwendung eines aus 0,5% Pepton bestehender Agar ist die inhibierende Wirkung stärker als im Fall
des Nährmittelagars. Die nachstehend angegebenen Organismen werden bei den angegebenen Konzentrationen
inhibiert (die Werte in den Klammern sind die Konzentrationen der jeweiligen Inhibierung):
S. aureus 209p 1,56μ§/ηι1, S. lutea PCI 1001
(2,5μβ/πι1), Β. subtilis NRRL-B 558
, E. coli K12 l)56μg/ml, E. coli NlHJ
1,56 μg/ml, S. flexneri 3,12 μg/ml, K. pneumoniae
PCI 602 6,25 \Lgjm\ (3,12 μg/ml), S. typhosa
<Ο,78μβ/ ml, Pr. rettgeri CN 311 1,56μ§/πι1, S. marscescens
12,5μg/ml (3,12μg/ml), Ps. aeruginosa Nr. 3 6,25μg/
ml, Ps. aeruginosa Nr. 46 3,12μg/ml (l)56μg/ml),
M. segmatis 607 50 μg/ml. Die inhibierende Wirkung
von Negamycin wird durch Serum nicht reduziert. Beispielsweise wird E. coli durch 3,12μg/ml Negamycin
in allen Medien inhibiert, die Serum in Mengen von 0, 5,10, 20 und 40 % enthalten. Negamycin besitzt
eine stärkere antibakterielle Wirkung im alkalischen Medium, beispielsweise sind die inhibierenden Konzentrationen
gegen E. coli in 0,5%igem Pepton in Wasser bei verschiedenen pH-Werten wie folgt: pH 5,0
12,5 (ig/ml (3,12 |ig/ml) pH 6,012,5 μβ/πι1 (3,12 |x,g/ml),
pH 7,0 3,^g/ml (l,56μg/ml) pH 8,0 l,56μg/ml
(Ο,78μ^/ηι1), ph 9,0 1,56 ^g/ml (0,78 μg/ml). Bei der
Durchführung einer Zylinderplattenmethode unter Verwendung eines aus 0,5% Pepton bestehenden
Agars und E. coli K12 zeigen 25 μg/ml Negamycin folgende inhibierende Durchmesser bei folgendem
pH: pH 6,0 16 mm, pH 7,0 20 mm, pH 8,0 21 mm. Negamycin besitzt eine geringe Toxizität. Die
intravenöse Injektion von 400 mg/kg verursacht den Tod von Mäusen. Keine toxische Wirkung wird beobachtet,
wenn 200 mg/kg täglich intraperitoneal während einer Zeitspanne von 30 Tagen in Mäuse injiziert
werden. Negamycin besitzt auch keine verzögerte Toxizität.Negamycin inhibits the growth of gram-negative and gram-positive organisms. If the antibacterial effect is tested by agar streak methods using meat extract / peptone agar, then the following organisms are inhibited at the indicated concentrations (a loop amount of a 20 hour old nutrient broth culture is streaked on; the values in brackets are the concentrations of respective inhibition: Staphylococcus aureus 209 ρ 50 μg / ml, Staphylococcus aureus 193 12.5 μg / ml (6.12 ^ gImX), Staphylo coccus aureus Smith 5C ^ g / ml, Sarcina lutea PCI-100 12 ^ g / ml ( 1.56 μ§ / ηιΙ), Bacillus subtilis NRRL-B55I 25 μ β / ηι1 (12.5 μ8 / ιη1), E. coli K12 3.12 [μg / ml (1.56 μ β ml), E. coli NIHJ 12 ^ g / ml (3, ^ g / ml), Shigelli llexneri 12.5 μg / ml, Salmonella typhosa 3.12 μg / ml, Klebsiella pneumoniae PCI 60212.5 μg / ml (6.25 μg / ml) Seratia marscesccns 12.5 μg / ml (6.25 μg / ml), Proteu; vulgaris, OX19 6.25 μg / m !, Proteus rettgeri (GN311 12.5 μg / ml (6.25 μg / ml), Pseudomonas aeruginos . (No. 2) 12.5 μg / ml, Pseudomonas aeruginosa No.; 25 μg / ml (12.5 μ g / ml), Pseudomonas fluorescem 6.25 μg / ml (3.12 μg / ml), Mycobaclerium smegmati: 607 100 μg / ml. If the 20 hour old broth culture is diluted 100 times and a looped amount is spread on, the inhibition of growth is reduced by half of the inhibition indicated above Case of the nutrient agar. The organisms specified below are inhibited at the specified concentrations (the values in brackets are the concentrations of the respective inhibition):
S. aureus 209p 1.56μ§ / ηι1, S. lutea PCI 1001 (2.5μ β / πι1), Β. subtilis NRRL-B 558, E. coli K12 l ) 56 μg / ml, E. coli NlHJ 1.56 μg / ml, S. flexneri 3.12 μg / ml, K. pneumoniae PCI 602 6.25 \ Lgjm \ (3 , 12 μg / ml), S. typhosa <Ο, 78μ β / ml, Pr. Rettgeri CN 311 1.56μ§ / πι1, S. marscescens 12.5μg / ml (3.12μg / ml), Ps. Aeruginosa No. 3 6.25 µg / ml, Ps. Aeruginosa No. 46 3.12 µg / ml (l ) 56 µg / ml), M. segmatis 607 50 µg / ml. The inhibiting effect of negamycin is not reduced by serum. E. coli, for example, is inhibited by 3.12 μg / ml negamycin in all media containing serum in amounts of 0, 5, 10, 20 and 40%. Negamycin has a stronger antibacterial effect in an alkaline medium, for example the inhibiting concentrations against E. coli in 0.5% peptone in water at various pH values are as follows: pH 5.0 12.5 (ig / ml (3, 12 | ig / ml) pH 6.012.5 μ β / πι1 (3.12 | x, g / ml), pH 7.0 3, ^ g / ml (l, 56μg / ml) pH 8.0 l, 56μg / ml (Ο, 78μ ^ / ηι1), pH 9.0 1.56 ^ g / ml (0.78 μg / ml) When performing a cylinder plate method using an agar consisting of 0.5% peptone and E. coli K12 show 25 μg / ml negamycin the following inhibiting diameters at the following pH: pH 6.0 16 mm, pH 7.0 20 mm, pH 8.0 21 mm. Negamycin has a low toxicity. The intravenous injection of 400 mg / kg causes death of mice. No toxic effect is observed when 200 mg / kg is injected intraperitoneally into mice daily for a period of 30 days. Negamycin also has no delayed toxicity.
Die intramuskuläre Injektion von 50 mg/kg an Kaninchen ergibt eine hohe Blutkonzentration, beispielsweise 100 μg/ml 1 Stunde nach der Verabreichung, wobei 80% in den Urin nach 24 Stunden abgeschieden werden, wie eine hohe Urinkonzentration zeigt, beispielsweise 4480 μg/ml im Urin, der 1 bis 2 Stunden nach der Injektion gelassen worden ist. Diese Ergebnisse zeigen die positive Wirkung auch in vivo. Negamycin ist wirksam gegen eine Infektion durch Pseudomonas aeruginosa Nr. 12, Klebsiella pneumoniae S-1802, Salmonella typhosa 63 und Staphylococcus aureus Smith S-424 in Mäusen.Intramuscular injection of 50 mg / kg to rabbits gives a high concentration of blood, for example 100 μg / ml 1 hour after administration, with 80% excreted in the urine after 24 hours, like a high urine concentration shows, for example 4480 μg / ml in the urine, the Left 1 to 2 hours after injection. These results show the positive effect also in vivo. Negamycin is effective against infection by Pseudomonas aeruginosa No. 12, Klebsiella pneumoniae S-1802, Salmonella typhosa 63 and Staphylococcus aureus Smith S-424 in mice.
509 686/156509 686/156
20 2220 22
i.Vi.V
Die CD50-Werte gegen diese Infektionen betragen 4,4, 5,0, 2,5 bzw. 12,5 mg/kg, falls 10 MLD intraperitoneal infbiert werden. Negamycin wird subkutan unmittelbar danach sowie 6 Stunden nach der Infizierung injiziert.The CD 50 values against these infections are 4.4, 5.0, 2.5 and 12.5 mg / kg, if 10 MLD are infused intraperitoneally. Negamycin is injected subcutaneously immediately after and 6 hours after infection.
Wie vorstehend erwähnt, ist Negamycin eine antibakterielle Substanz mit einer geringen Toxizität, die grampositive und -negative Bakterien einschließlich Pseudomonas zu inhibieren vermag. Diese sAntiebiotikum läßt sich in einfacher Weise von bekannten Antibiotika auf Grund seiner Analysecrgcbnissc, seines Infrarotspektrums, seiner amphoteren Eigenschaften, seines Verhaltens bei einer Hochspannungs-Elektrophorese sowie seiner Struktur unterscheiden. Daher ist Negamycin definitiv ein neues Antibiotikum.As mentioned above, negamycin is an antibacterial substance with a low toxicity, capable of inhibiting Gram positive and negative bacteria including Pseudomonas. This anti-biotic can be easily removed from known antibiotics on the basis of its analysis results, its Infrared spectrum, its amphoteric properties, its behavior in a high-voltage electrophoresis as well as its structure. Hence, negamycin is definitely a new antibiotic.
Wie aus der Struktur hervorgeht, liefert eine Hydrolyse von Negamycin 1-MelhyIhydrazino-Essigsäure, welche sich in N,N'-Dimethylhydrazin umwandelt. l-Methylhydrazino-Essigsäure vermag, wie erfindungsgemäß ermittelt wurde, eine Glutaminsäure-Pyruvat-Transaminase zu inhibieren und übt eine Lebertoxizilät aus. Negamycin besitzt jedoch keine derartige Toxizität. Erwägt man jedoch eine mögliche Hydrolyse, dann sollte Negamycin ?ur Behandlung von empfindlichen Stellen nur kurzzeitig verabreicht werden. Negamycin läßt sich auch lokal zur Behandlung von Oberflächeninfektionen verwenden, beispielsweise von Infektioren der Haut und der Mucosamembran.As can be seen from the structure, hydrolysis of negamycin yields 1-melhyIhydrazino-acetic acid, which converts to N, N'-dimethylhydrazine. L-methylhydrazino-acetic acid is capable of, as according to the invention was found to inhibit glutamic acid pyruvate transaminase and exert liver toxicity out. Negamycin, however, has no such toxicity. However, if one considers a possible hydrolysis, Negamycin should then only be given briefly to treat sensitive areas. Negamycin can also be used topically to treat surface infections such as Infectious sites of the skin and the mucosal membrane.
Darüber hinaus e:gnet sich Negymcin zur Synthese
von Nepamycin-Analoga.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.In addition, e: is Negymcin gnet for synthesizing Nepamycin analogues.
The following examples illustrate the invention.
tem Druck getrocknet. Man erhält ein Rohpulver aus Negamycin-Hydrochlorid in einer Menge von 300 mg (Reinheit 21%).dried under pressure. A raw powder of negamycin hydrochloride is obtained in an amount of 300 mg (Purity 21%).
300 mg eines Rohpulvers von Negamycin-Hydrochlorid, da:? gemäß Beispiel 1 erhalten worden ist, werden in 10 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule (Durchmesser 16 mm) geschickt300 mg of a raw powder of negamycin hydrochloride as :? has been obtained according to Example 1, are dissolved in 10 ml of water. The solution is passed through a column (diameter 16 mm)
ίο die 60 ml eines schwach sauren Kationenaustauschers (NH4-Form) enthält. Anschließend wird destilliertes Wasser durchgeschickt. Der Abfluß wird in ΙΟ-mi-Fraktionen eingeteilt. Der aktive Abfluß findet sich zwischen den Fraktionen 57 und 96. Aus den Fraktionen 57 bis 74 erhält man 25 mg (Reinheit 68 μg/me' eines leicht gelblichen Pulvers, das aus Negamycin besteht. Aus den Fraktionen 75 bis 85 erhält man 20 mg eines farblosen Pulvers aus reinem Negamycin Die Fraktionen 86 bis 96 liefern 19 mg (Reinheil 910μg/mg).ίο which contains 60 ml of a weakly acidic cation exchanger (NH 4 form). Then distilled water is sent through. The outflow is divided into ΙΟ-mi fractions. The active drainage is found between fractions 57 and 96. 25 mg (purity 68 μg / me 'of a slightly yellowish powder consisting of negamycin are obtained from fractions 57 to 74. 20 mg of one are obtained from fractions 75 to 85) colorless powder made from pure negamycin. Fractions 86 to 96 provide 19 mg (Reinheil 910μg / mg).
Es werden verschiedene Arten von Austauscherharzen zur Isolation von Negamvcin getestet. Da' gemäß Beispiel 1 erhaltene Brühen'! trat (200ml) wid durch eine Säule geschickt (Durchmesser lOrrm). die 10 ml eines Harzes enthält. Die Säule wird mil 50 ml Wasser gewaschen und anschließend in dn nachstehend geschilderten Weise eluhrt. In al'cr Fällen wird in den Abflüssen sowie in dem 7 rr Waschen der Säule verwendeten Wasser keine Akti' itat festgestellt. Es werden folgende Ergebnisse erhaltenDifferent types of exchange resins for the isolation of negamvcin are tested. There' broths obtained according to example 1! entered (200ml) wid sent through a column (diameter lOrrm). which contains 10 ml of a resin. The column is mil Washed 50 ml of water and then eluhrt in the manner described below. In al'cr There is no activity in the drains or in the water used for 7 rr washing of the column detected. The following results are obtained
125 ml eines Mediums, das 2% Glukose, 2% Stärke, 2% Sojabohnenmehl. 0.5% Heferxtrakt, 0.25% NaCl, 0,35% CaCO3, 0.0005% CuSO4-5 H,O, 0,0005% MnO.-7HO '·πΗ 0 0005% ZnSO4-7"H2O enthält, ν ird in einen Schüttelkolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml gegeben. Nach dem Einstellen des pH auf 7,0 wird das Medium bei 1200C während einer Zeitspanne von 20 Minuten sterilisiert. Auf dieses Medium werden 2,5 ml einer 2 Tage alten geschüttelten Kulturbrüre des Stammes Nr. ATCC 21 470 aseptisch aufge'mpft. Das Medium für die Impfkultur enthält 1 % Glukose 1 % Stärke, 0,75 % Fleischextrakt, 0,75% Peptcn, 0.3% NaCl, 0,1%; M<?SO4 · 7H,O, 0,0007% CuSO4-1H2O, 0,0001% FeSO4-7H2O, 0,0008% MnCl2-7H2O und 0,0002% ZnSO, ■ 7H2O. Das Schütteln erfolft mit 130 Hin- und Herbewegungen pro Minute während der Gärungsperiode (5 Tage). Die Temperatur wird bei 27°C gehalten. Diese Kulturbrühe wird zur Abtrennung von Myzeln zentrifugiert. Man erhält f 000 ml eines Filtrats aus den 60 Kolben. Das Filtrat enthält 35 μg/ml Negamycin. Das Filtrat wird durch eine Säule (Durchmesser 30 mm) geschickt, die 400 ml eines schwach sauren Kationenaustauschers (70% in der Na-Form) enthält. Nach einem Waschen mit Wasser wird Negamycin mit 20%igem Ammoniak in Wasser eluiert. Die aktive Fraktion (600 ml) wird unter vermindertem Druck konzentriert. Man erhält 144 ml einer konzentrierten Lösung (pH 9,4,800 μg/mI).125 ml of a medium containing 2% glucose, 2% starch, 2% soybean meal. Contains 0.5% yeast extract, 0.25% NaCl, 0.35% CaCO 3 , 0.0005% CuSO 4 -5 H, O, 0.0005% MnO.-7HO '· πΗ 0 0005% ZnSO 4 -7 "H 2 O, ν It is placed in a shaking flask with a capacity of 500 ml. After adjusting the pH to 7.0, the medium is sterilized for a period of 20 minutes at 120 ° C. 2.5 ml of a 2-day-old shaken culture broth are placed on this medium of strain No. ATCC 21 470. The medium for the inoculation culture contains 1% glucose, 1% starch, 0.75% meat extract, 0.75% peptic, 0.3% NaCl, 0.1%; M <? SO 4 · 7H, O, 0.0007% CuSO 4 - 1 H 2 O, 0.0001% FeSO 4 -7H 2 O, 0.0008% MnCl 2 -7H 2 O, and 0.0002% ZnSO, ■ 7H 2 O The shaking takes place at 130 to and fro movements per minute during the fermentation period (5 days). The temperature is kept at 27 ° C. This culture broth is centrifuged to separate the mycelia. 000 ml of a filtrate is obtained from the 60 flasks. The filtrate contains 35 μg / ml negamycin ne column (diameter 30 mm) sent containing 400 ml of a weakly acidic cation exchanger (70% in the Na form). After washing with water, negamycin is eluted with 20% ammonia in water. The active fraction (600 ml) is concentrated under reduced pressure. 144 ml of a concentrated solution (pH 9.4,800 μg / ml) are obtained.
Die konzentrierte Lösung wird durch eine Säule (Durchmesser 16 mm) geschickt, die 60 ml eines stark basischen Anionenaustauschers (OH-Form) enthält. Nach einem Waschen mit 200 ml Wasser wird Negamycin mit 0,5 n-HCl eluiert. Nach einer Neutralisation mit einem schwach basischen Anionenaustauscher (OH-Form) wird die aktive Fraktion unter verminder-The concentrated solution is passed through a column (diameter 16 mm) containing 60 ml of a strong basic anion exchanger (OH form). After washing with 200 ml of water, negamycin becomes eluted with 0.5 N HCl. After neutralization with a weakly basic anion exchanger (OH form) the active fraction is reduced under
tauscherharzCations from
exchange resin
nung von
Nega
mycinWin
tion of
Nega
mycin
NH4OH2% iees
NH 4 OH
Na-Form70%
Na form
NH4OH2%
NH 4 OH
Na-Form70%
Na form
NH4-Form70%
NH 4 form
NH4OH2%
NH 4 OH
NH4OH2%
NH 4 OH
NH4OH2%
NH 4 OH
Negamycin wird in einer Menge von 102 mg ir 8 ml Wasser, das 15% Äthylenglykolmonomethyl äther enthält, gelöst. Dieser Lösung werden 106 m{ ρ - Hydroxyazobenzol - p' - sulfonsäure zugesetzt Die Mischung wird auf 500C zum Auflöser erwärmt, worauf 0,5 ml 1 n-HCl zur Einstellung de; pH auf 3 zugesetzt werden. Nach einem Lagern ir einem Kühlschrank erhält man 49 mg gelborange gefärbter Kristalle. Diese Kristalle werden aus einengemischten Lösungsmittel (4,5 ml Wasser und 0,5 m Methanol) umkristallisiert. Man erhält 28 mg gelb orangegefärbter Kristalle (F. 180 bis 182° C, Zersetzung). Die Kristalle weisen 34% der AktivitäiNegamycin is dissolved in an amount of 102 mg ir 8 ml of water containing 15% ethylene glycol monomethyl ether. 106 m {ρ - hydroxyazobenzene - p '- sulfonic acid are added to this solution. The mixture is heated to 50 ° C. for the dissolver, whereupon 0.5 ml of 1 n HCl is used to adjust the; pH to 3 can be added. After storage in a refrigerator, 49 mg of yellow-orange crystals are obtained. These crystals are recrystallized from a mixed solvent (4.5 ml of water and 0.5 M methanol). 28 mg of yellow-orange crystals are obtained (mp 180 ° to 182 ° C., decomposition). The crystals show 34% of the activity
von freiem Negamycin gegenüber F.. coli K. 12 auf. Analyse für C9Ho0N4O4(C12M10N2O4S)1, · 2H2O:of free negamycin versus F. coli K. 12. Analysis for C 9 Ho 0 N 4 O 4 (C 12 M 10 N 2 O 4 S) 1 , · 2H 2 O:
Berechnet ... C 47,13, H 5,27, N 13,33, 0 26,64, S 7,63;Calculated ... C 47.13, H 5.27, N 13.33, 0 26.64, S 7.63;
gefunden ... C 47,09, H 5,16, N 13,20, 0 25,53, S 8,01.Found ... C 47.09, H 5.16, N 13.20, 0 25.53, S 8.01.
130! eines Mediums, das 3% Glukose, 1'% Stärke, 2% Sojabohnenmehl, 0,5% getrocknete Hefe, 0,35% CaCO,, 0,0005% CuSO4 -5 H,O, 0,0005% MnCl2-7H,O und 0,0005% ZnSO4 · 7H2O enthält, werden in eine Gäriingsvorrichtung aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 2001 gegeben. Nach einer Sterilisation bei 1200C während einer Zeitspanne von 30 Minuten werden 1,21 einer Kulturbrühe des Stammes Nr. ATCC 21470 aseptisch aufgeimpft. Das Rühren erfolgt mit 200 UpM, während unter Verwendung von 25 1 Luft pro Minute belüftet wird. Die Gärungszeilspannc beträgt 113 Stunden. Die Temperatur wird auf 27"C gehalten. Die aus 1101 bestehende Kulturbrühe (pH 7,4, 63 jxg/ml) wird unter Verwendung von 8 kg Diatomeenerde nach einem Einstellen des pH auf 4,9 unier Verwendung von 11 611-HCI filtriert. Einschließlich des zum Waschen des Fillers verwendeten Wassers erhält man insgesamt 117 1 eines Fillrals. Das Filtrat wird durch eine Säule geschickt, die 6,5 ml eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes (zu 70% in der NH4-Form) enthält. Nach einem Waschen mit Wasser wird das Negamycin mit 0,5 η-Ammoniak eluiert. Das aus 3 1 bestehende ak ive Eluat wird auf 495 ml (3520 μg/ml) unter vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wird durch eine Säule geschickt, die ein stark basisches Anionenauslauscherharz (OH-Typ) enthält. Nach einem Waschen mit 350 ml Wasser wird Negamycin mit 0,5 n-HCl cluiert. Das aktive Eluat (180 ml) wird mit 3 η-Ammoniak neutralisiert. Man erhält 5,5 g eines gelblichbraunen Pulvers aus rohem Negamycin (Reinheit 294 μg/'mg) nach dem Trocknen. Die Gesamtausbeute beträgt 23,4%.130! a medium containing 3% glucose, 1% starch, 2% soybean meal, 0.5% dried yeast, 0.35% CaCO ,, 0.0005% CuSO 4 -5 H, O, 0.0005% MnCl 2 - 7H, O and 0.0005% ZnSO 4 · 7H 2 O are placed in a 2001 stainless steel fermentation ring. After sterilization at 120 0 C for a period of 30 minutes 1.21 a culture broth of the strain no. ATCC be inoculated aseptically 21,470th The stirring is carried out at 200 rpm while aerating using 25 liters of air per minute. The fermentation cell span is 113 hours. The temperature is kept at 27 ° C. The culture broth consisting of 1101 (pH 7.4, 63 μg / ml) is filtered using 8 kg of diatomaceous earth after adjusting the pH to 4.9 using 11 611 HCl. Including the water used to wash the filler, a total of 117 l of a filler is obtained. The filtrate is passed through a column which contains 6.5 ml of a weakly acidic cation exchange resin (70% in the NH 4 form) Water, the negamycin is eluted with 0.5 η-ammonia. The active eluate consisting of 3 l is concentrated to 495 ml (3520 μg / ml) under reduced pressure. The concentrate is passed through a column containing a strongly basic anion exchange resin ( After washing with 350 ml of water, negamycin is cluted with 0.5 N HCl. The active eluate (180 ml) is neutralized with 3 η ammonia. 5.5 g of a yellowish-brown powder are obtained from crude Negamycin (purity 294 μg / 'mg) after the dry nen. The overall yield is 23.4%.
3,4 g des gemäß Beispiel 5 erhaltenen Pulvers mit einer Reinheit von 29,4% werden in 22ml Wasser aufgelöst, worauf die Lösung auf einen pH von 8,8 eingestellt wird. Diese Lösung wird auf eine Säule mit einem Durchmesser von 26 mm aufgebracht, die mit 250 ml eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes (in der NH4-Form) gefüllt ist. Nach einem Waschen mit 500 ml Wasser wird 0,1 %iges NH4OH durch die Säule geschickt. Das Eluat wird in 20-ml-Fraktioncn eingeteilt. Das Negamycin wird in den Fraktionen 69 bis 81 gefunden. Aus den Fraktionen 69 bis 73 erhält man 233 mg (Reinheit 90%) eines hellgclblichen Negamycin-Pulvers. Aus den Fraktionen 74 bis 77 erhält man 383 mg eines reinen Negamycin. Die Fraktionen 78 bis 81 liefern 395 mg eines reinen Negamycins.3.4 g of the powder obtained according to Example 5 with a purity of 29.4% are dissolved in 22 ml of water, whereupon the solution is adjusted to a pH of 8.8. This solution is applied to a column with a diameter of 26 mm which is filled with 250 ml of a weakly acidic cation exchange resin (in the NH 4 form). After washing with 500 ml of water, 0.1% NH 4 OH is passed through the column. The eluate is divided into 20 ml fractions. The negamycin is found in fractions 69-81. From fractions 69 to 73, 233 mg (purity 90%) of a pale yellow negamycin powder are obtained. 383 mg of a pure negamycin are obtained from fractions 74 to 77. Fractions 78 to 81 provide 395 mg of a pure negamycin.
Beispiel 7
(Vergleichsbeispiel)Example 7
(Comparative example)
Zur Bestimmung der Wirksamkeit des erfindungs-To determine the effectiveness of the invention
gemäßen Negamycins und zum Nachweis der Überlegenheit des erfindungsgemäßen Negamycins gegenüber Carbenicillin, einem bekannten halbsynthetischen Penicillin mit breitem Wirkungsspektrum, bei der Behandlung von durch bakterielle Infektionen hervorgerufenen Erkrankungen wurden die folgenden Versuche durchgeführt:according to negamycins and to demonstrate the superiority of the negamycins according to the invention Carbenicillin, a well-known, semi-synthetic penicillin with a broad spectrum of activity, in the Treatment of diseases caused by bacterial infections have been the following attempts accomplished:
Mäuse wurden intraperitoneal mit Bakterienzellen künstlich infiziert (2 · 10° Zellen von Staphylococcus aureus Smith S-424, 7 · 102 Zellen von KlsbsiellaMice were artificially infected intraperitoneally with bacterial cells (2 × 10 ° cells from Staphylococcus aureus Smith S-424, 7 × 10 2 cells from Klsbsiella
zo pneumoniae S-1802 und 1,1 · 108 Zellen von Pseudomonas aeruginosa Nr. 12). Dann wurden die infizierte η Mäuse in zwei Gruppen aufgeteilt. Die eine wurde mit Negamycin subcutan in Einzeldosen unmittelbar nach der Infektion behandelt, während die andere mit Carbenicillin behandelt wurde. Dabei wurden folgend:: Ergebnisse erhalten:zo pneumoniae S-1802 and 1.1 x 10 8 cells of Pseudomonas aeruginosa No. 12). Then the infected η mice were divided into two groups. One was treated with negamycin subcutaneously in single doses immediately after infection, while the other was treated with carbenicillin. The following results were obtained:
Die CD50-Werte bei der Behandlung von Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae und Pseudomonas aeruginosa mit Ncgamy;in betrugen 25, 12,5 bzw. 8,9 mg/kg Körpergewi ;ht, während die Cr*-0-Wertc bei der Behandlung der gleichen Bakteri η mit Carbenicillin 8,1, >100 bzw. >400 m?/.cg Körpergewicht betrugen.The CD 50 values in the treatment of Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa with Ncgamy; in were 25, 12.5 and 8.9 mg / kg body weight, respectively, while the Cr * - 0 values in the treatment of the same bacteri η with carbenicillin 8.1,> 100 or> 400 m? /. cg body weight.
Die vorstehenden Frg'bnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße Negamycin bei der Bekämpfung von künstlich hervorgerufenen Infektionen bei Mäusen stark wirksam war und daß es hin?ichtli;h seiner Wirkung dem bekannten halb;ynth:tisehen Breitbandpenicillin Carbeni .il.in überlegen war.The above results show that the inventive Negamycin in the fight against artificially induced infections in mice was strongly effective and that it was insufficiently effective to the well-known half-ynth: tisehen broad spectrum penicillin Carbeni .il.in was superior.
In den Rahmen der Erfndung fallen neben dem Negamy.-in auch Säureadditi jns.a'ze von Negamycin mit organischen und anorganischen Säuren, beispielsweise Chlorwaiserstoffiäure, Schwefelsäure, Bromwasserstoff äure, Phosphorsäure, Salpetersäure, 2 kroneniäure, Maleinsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Benzoesäure, Zimtiäure, Ascorbinsäure, Essigsäure, Picrin säure, ρ - Hydroxyazobenzol - p' - sulfonsäure, Phylinsäure, Livopimarin - 6,8a - eis - endobernsteinsäure, SuIfaminsäure, Glykolsäure und Mandelsäure.In addition to that fall within the scope of the invention Negamy.-in also acid additi jns.a'ze of negamycin with organic and inorganic acids, e.g. hydrochloric acid, sulfuric acid, Hydrobromic acid, phosphoric acid, nitric acid, 2 crownic acid, maleic acid, malic acid, tartaric acid, benzoic acid, cinnamic acid, ascorbic acid, acetic acid, Picric acid, ρ - hydroxyazobenzene - p '- sulfonic acid, phylic acid, livopimarin - 6,8a - ice - endosuccinic acid, Sulfamic acid, glycolic acid and mandelic acid.
Für therapeutische Zwecke verwendet man Salze nichttoxischer Säuren, während Salze toxischer Säuren, beispielsweise η - Hydroxyazobenzol - p' - sulfonsäuresalz, für Isoiationszwecke geeignet sind, beispielsweise als Ausfällmittel aus wäßrigen Lösungen, sowie für Desinfektionszwecke, bei denen eine Toxizität keine Rolle spielt.For therapeutic purposes, salts of non-toxic acids are used, while salts of toxic acids, for example η - hydroxyazobenzene - p '- sulfonic acid salt, are suitable for insulation purposes, for example as a precipitant from aqueous solutions, as well as for disinfection purposes, where there is no toxicity Role play.
Hierzu 2 Blatt ZeichnungenFor this purpose 2 sheets of drawings
Claims (1)
Applications Claiming Priority (4)
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| JP3482769 | 1969-05-08 | ||
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| JP8384369 | 1969-10-22 |
Publications (3)
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|---|---|
| DE2022311A1 DE2022311A1 (en) | 1971-11-04 |
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| DE2022311C3 true DE2022311C3 (en) | 1976-02-05 |
Family
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