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Verfahren zur Herstellung einer neuartigen stickstoffhaltigen organischen Base und ihrer Säureadditionssalze
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer neuartigen stickstoffhaltigen Base und ihrer Säureadditionssalze.
Im einzelnen schlägt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Capreomycin vor, das darin besteht, dass man einen Capreomycin bildenden Stamm von Streptomyces capreolus in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, eingetaucht unter aeroben Bedingungen züchtet, bis von dem Organismus in dem Kulturmedium eine wesentliche Menge Capreomycin gebildet worden ist.
Die hier beschriebene neuartige Base wird als Capreomycin bezeichnet und ist eine weisse feste Substanz mit den folgenden Eigenschaften : Sie ist leicht löslich in Wasser. Dagegen ist sie in den meisten organischen Lösungsmitteln verhältnismässig unlöslich. Sie ist z. B. verhältnismässig unlöslich in niederen Ketonen, wie Aceton und Methylisobutylketon, in Alkoholen, wie Methanol, Äthanol und Butanol, in Estern, wie Amylacetat, und in Äthern, wie Diäthyläther. Ferner ist sie verhältnismässig unlöslich in Lösungsmitteln, wie Pyridin, halogenierten Kohlenwasserstoffen, Benzol und Kohlenwasserstoffen.
Die freie Base Capreomycin ist verhältnismässig beständig in wässerigen Lösungen innerhalb eines pH-Bereiches von etwa 4 bis 8, ist aber unbeständig in stark basischen und stark sauren Lösungen. Im allgemeinen ist Capreomycin in sauren Lösungen beständiger als in basischen Lösungen.
Die elektrometrische Titration von Capreomycin in Dimethylformamid-Wasser (Volumsverhältnis2 : 1) zeigt die Anwesenheit von titrierbaren Gruppen mit den folgenden pK'a-Werten : 6, 5 ; 8, 0 ; 10,0 und 13,0.
Das durch elektrometrische Titration bestimmte Molekulargewicht von Capeomycin ist etwa 740.
Das Tetrahydrochlorid von Capreomycin ist in wasserfreiem Methanol zu etwa 6, 6 mg je ml bei 260C löslich.
Die Analyse von Capreomycin, das im Vakuum bei Raumtemperatur über wasserfreiem Calciumsulfat 16 h getrocknet wurde, ergab, dass es als freie Base vorlag und ungefähr die folgende Zusammensetzung hatte :
EMI1.1
<tb>
<tb> Kohlenstoff <SEP> 44, <SEP> 08%
<tb> Wasserstoff <SEP> 6, <SEP> 94% <SEP>
<tb> Stickstoff <SEP> 26, <SEP> 23% <SEP>
<tb> Sauerstoff <SEP> (direkt) <SEP> 22, <SEP> 18%
<tb>
Diese Werte ergeben die empirische Formel C Hsos3N1401, doch stellt diese Formel natürlich nur eine Annäherung dar, die sich bei der genauen Aufklärung der Struktur der Verbindung noch etwas ändern kann.
Die Infrarotabsorptionskurve des Capreomycindihydrochlorids als von Mineralöl bedecktes Pulver ist in der Zeichnung veranschaulicht. Die erkennbaren Banden des Infrarotabsorptionsspektrums im Bereich
EMI1.2
Capreomycin zeigt intensive Absorptionsmaxima von etwa 268 mll in 0, 03 n-Salzsäure bei einem Absorptionswert von El : 269 und von etwa 283 mllln 0, 05 n - Kalilauge bei einem Absorptionswert von
EMI1.3
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Wasser).
Die Substanz wurde nach bekannten Verfahren zur Analyse von Aminosäuren untersucht, z. B. nach dem von Moore und Stein in J. Biol. Chem. 192 [1951], S. 663, angegebenen Verfahren, wobei die Analyse der Hydrolysate von Capreomycin, die durch Hydrolyse mit 5,7n-Salzsäure bei 1000C er. halten wurde, die Anwesenheit von mehreren Aminosäureresten anzeigte. Die quantitative Bestimmbarkeit der in derartigen Säurehydrolysaten enthaltenen Aminosäurereste ist begrenzt, weil die Beständigkeit der Peptidbindungen gegenüber Spaltung und die Beständigkeit der Aminosäurereste in den Säurehydrolysaten sehr unterschiedlich ist.
Unter dieser Voraussetzung und unter Annahme eines Mol. -Gewichts von etwa 740 ergibt die vorläufige Aminosäureanalyse mindestens je einen Rest der folgenden Aminosäuren im Molekül des Capreomycins : Alanin, Serin, 2, 3-Diaminopropionsäure und zwei basische Aminosäuren, von denen die eine sich wahrscheinlich von Ornithin herleitet und die andere wahrscheinlich bisher unbekannt ist.
Die bisherigen Analysen haben noch keinen Aufschluss über die Anwesenheit von "sauren" (mehrere Carboxylgruppen enthaltenden), aromatischen oder Schwefel enthaltenden Aminosäuren gegeben. mit Capreomycin ausgeführte chemische Untersuchungen brachten die folgenden Ergebnisse : Die Ninhydrinprobe auf Anwesenheit von Cl-Aminogruppen war positiv. Die Lowry'sche Proteinprobe (J. Biol.
Chem. 193 [1951), S. 265) und die Folin-Ciocalteau'sche Proteinprobe waren positiv. Die Anthron-, Bial'sche und Tauber'sche Saccharidprobe waren negativ sowie auch die Ehrlich'sche Indolprobe. Die Hydroxamsäureprobe auf Estergruppen, wie sie in J. Biol. Chem 159 [1945], S. 21, beschrieben ist, war
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negativ.Capreomycin hat eine Hemmwirkung gegenüber dem Wachstum bestimmter Mikroorganismen, einschliesslich grampositiver und gramnegativer Bakterien. Die Mengen, die eine Hemmwirkung gegenüber dem Wachstum einer Reihe von Organismen hervorrufen, sind in Tabelle I angegeben. Die Hemmkon- zentrationen wurden durch Agarverdünnungsprobe oder durch Nährlösungsverdünnungsprobe bestimmt (in der Tabelle mit "ad" bzw. "bd" bezeichnet).
Bei der Agarverdünnungsprobe wird der Testorganismus auf eine Reihe von Agarplatten, die verschiedene Konzentrationen an Cap : eomycin in dem Agar enthalten, ausgestrichen oder in diese eingeimpft, um die Mindestkonzentration an Capreomycin in y/ml zu ermitteln, die das Wachstum des. Organismus 48 h lang hemmt.
Bei der Nährlösungsverdünnungsprobe wird eine Reihe von Röhrchen, die eine Nährlösung mit verschiedenen Konzentrationen an Capreomycin enthalten, mit dem Testorganismus beimpft, um die Mindestkonzentration an Capreomycin in y/ml in der Nährlösung zu ermitteln, die das Wachstum des Organismus etwa 24 h lang hemmt.
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Tabelle I !
EMI3.1
<tb>
<tb> Untersuchter <SEP> Organismus <SEP> : <SEP> Hemmkonzentration <SEP>
<tb> 07mil) <SEP> : <SEP>
<tb> Bakterien <SEP> :
<SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP> ad
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP> ad
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 25,0 <SEP> ad
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> > <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> phlei <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis <SEP> (607) <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis <SEP> (607,
<tb> streptomy <SEP> cinresistent) <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> avium <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> avium
<tb> (streptomycinresistent) <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP> ad
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> > <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP> ad
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> 100,0 <SEP> ad
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 100,
<SEP> 0 <SEP> ad
<tb> Salmonella <SEP> enteritidis <SEP> > <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Shigella <SEP> paradysenteriae <SEP> 100,0 <SEP> ad
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> 125, <SEP> 0 <SEP> bd
<tb> Salmonella <SEP> pullorum <SEP> 62, <SEP> 5 <SEP> bd
<tb> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 125, <SEP> 0 <SEP> bd
<tb> Salmonella <SEP> berta <SEP> 125, <SEP> 0 <SEP> bd
<tb>
Wie oben erwähnt, können Capreomycin und seine Säureadditionssalze zur Behandlung von Bakterieninfektionen in der Veterinärmedizin verwendet werden. Die Verbindungen sind z. B. wirksam zur Behandlung von Krankheiten, die von Salmonellen hervorgerufen werden. Im einzelnen reichen etwa 400 mg je kg Körpergewicht, subcutan gegeben, aus, um eine Infektion durch Salmonella typhimurium bei Mäu- sen zu bekämpfen.
Ferner reichen etwa 1-5 mg Capreomycin bei intramuskulärer Injektion je Eintagsküken zur Bekämpfung einer Infektion von Salmonella pullorum aus.
Die Verbindungen sind ferner wirksame Kontaktgifte für Hausfliegen. Ein geeignetes Präparat für diesen Zweck ist eine wässerige Lösung von 0, 4 Gew.-% Capreomycin, entweder als freie Base oder als wasserlösliches Säureadditionssalz.
Die Verbindungen haben blutdrucksenkende Wirkung, wie die pharmakologische Standardprüfung an anästhesierten Hunden zeigt.
Capreomycin und seine Säureadditionssalze haben in vivo eine antibakterielle Wirkung gegenüber infizierenden Organismen bei subcutaner Injektion bei Mäusen, wobei der EDso-Wert (wirksame Menge, um 50% der Versuchstiere zu schützen) bei einigen Beispielen wie folgt liegt : Streptomycetes pyogenes, 250 mg (x 2) ; Proteus vulgaris, 84 mg (x 2) ; Salmonella typhosa, 90 mg (x 2) und Klebsiella pneumoniae, 30 mg (x 2). (Die Werte bedeuten die Menge Capreomycin je kg Körpergewicht des Versuchstieres ;"x 2" bedeutet zwei Gaben.)
Ferner ist Capreomycin in vivo bei Mäusen wirksam gegen experimentell verursachte Tuberkulosein-
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fektionen. Es ist z.
B. wirksam gegenüber Mycobacterium tuberculosis var. hominis (Stamm H37RV) bei
Infektionen an Mäusen, wenn es subcutan oder oral gegeben wird. Bel subcutaner Injektion ist es wirksam bei einer Dosierung in dem allgemeinen Bereich, in dem die gegenwärtig angewendeten antituberkulösen
Antibiotika, wie Streptomycin, wirksam sind.
Capreomycin kann durch Züchten eines bisher unbekannten Organismus unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium hergestellt werden, das asslmilierbare Quellen tür Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält. Der Organismus wurde aus einer Bodenprobe isoliert, indem Teile der Bodenprobe in sterilem destilliertem Wasser suspendiert und die Suspension auf Nähragar ausgestrichen wurden. Die beimpften Nähragarplatten wurden mehrere Tage bei etwa 25-350C bebrütet. Nach Ablauf der Bebrütungszeit wurden Kolonien der Capreomycin bildenden Organismen mit einer sterilen Platinöse auf Schräg- agar übertragen. Die beimpften Schrägagarböden wurden bebrütet, um grössere Mengen Inoculum für die Herstellung von Capreomycin zu erhalten.
Der zur Bildung von Capreomycin befähigte neuartige Organismus wurde zur ständigen Aufbewahrung an The Culture Collection of the Northern Utilization Research and Development Branch des United States Department of Agriculture in Paoria, Illinois. gegeben und erhielt die Kulturbezeichnung NRRL 2773 und den Namen Streptomyces capreolus.
Die folgende ausführliche Beschreibung nimmt im einzelnen Bezug auf diesen neu gefundenen Organismus NRRL 2773. Selbstverständlich gehört aber auch die Herstellung von Capreomycin durch Züchten von andern Capreomycin bildenden Organismen oder Mutanten von Capreomycin bildenden Organismen, einschliesslich Mutanten von NRRL 2773, in den Bereich der Erfindung. Derartige andere Organismen, Rassen oder Mutanten können durch bekannte Verfahren, z. B. durch Behandeln eines Capreomycin bildenden Organismus mit Röntgenstrahlen oder ultravioletter Strahlung oder mit chemischen Mitteln, z. B. den Stickstoffsenfölen (nitrogen musards), hergestellt werden.
Es folgen nun die Ergebnisse einer eingehenden systematischen Untersuchung des neuen Organismus S. capreolus NRRL 2773. Die in der Beschreibung angegebenen Farben entsprechen den von Maerz und Paul, Dictionary of Color [1950], angegebenen Definitionen.
Mikroskopische Morphologie.
Tomatenpaste-Hafermehl-Agar (14 Tage bei 30 C) :
Die Kolonien bilden gerade oder gekrümmte Sporophoren und zylindrische Konidien. Die Konidien haben l, 0-1,2 u Durchmesser und 3,0-4, 8 jLt Länge.
Agar nach Hickey und Tresner (14 Tage bei 300C) :
Mikroskopische Morphologie wie vorstehend beschrieben.
Salz-Stärke-Agar (14 Tage bei 300C) : Mikroskopische Morphologie wie vorstehend beschrieben.
Kennzeichen der Kultur.
Czapek'scher Agar (14 Tage bei 300C) : Mässig gutes Wachstum. Grössere Mengen an Luftmycel, weisse und sehr geringe Sporenbildung. Rückseite orangebraun bis rotbraun. Keine löslichen Pigmente.
Glucose-Asparagin-Agar (14 Tage bei 300C) : Mässiges Wachstum. Geringes, schwach gelbbraunes (Pl. 10-2B) Luftmycel. Geringe Sporenbildung, Rückseite rotbraun. Hellbraunes lösliches Pigment.
Anorganische Salze-Stärke-Agar (14 Tage bei SOOC) : Mässiges Wachstum. Ziemlich starkes, fast weisses Luftmycel, Rückseite rotbraun. Hell rotbraunes lösliches Pigment.
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lösliches Pigment.
Emerson'scher Agar (14 Tage bei 30 C) : Mässiges Wachstum. Geringes, weisses Luftmycel. Keine Sporenbildung. Rückseite rotbraun. Hellbraunes lösliches Pigment.
Kartoffelpfropfen-Agar (14 Tage bei 300C) : Kein Wachstum bis ausgezeichnetes Wachstum von vegetativem Mycel je nach der Kartoffelsorte. Kein sichtbares Luftmycel. Durch die hellorange Rückseite und vegetatives Wachstum wird der Kartoffelpfropfen etwas gedunkelt.
Tyrosinagar (14 Tage bei 300C) : Ziemlich gutes Wachstum. Luftmycel fast weiss. Rückseite henbraun. Hellbraunes lösliches Pigment.
Physiologie.
HS-BiIdung : Auf Pepton-Eisen-Agar unter Zusatz von Hefeextrakt nicht beobachtet.
Gelatineverflüssigung : Mässig unter Bildung eines rotbraunen löslichen Pigments.
Nitratreduktion : Keine Reduktion in organischer Nährlösung, geringe Reduktion in synthetischer Nähr- lösung.
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Stärkehydrolyse : Nur teilweise Hydrolyse nach 14 Tagen.
Magermilch : Weder Koagulation noch Peptonisation in 14 Tagen. Orangebrauner Ring, kein Häut- chen. Geringer pH-Anstieg.
In Tabelle II sind die Ergebnisse angegeben, die bei Versuchen zur Kohlenstoffverwertung mit dem Organismus NRRL 2773 erhalten wurden. In der Tabelle werden die folgenden Symbole verwendet : + = Wachstum und Verwertung ;-= kein erkennbares Wachstum bzw. keine Verwertung.
Tabelle II :
Kohlenstoffverwertung von NRRL 2773
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<tb>
<tb> Verbindung <SEP> : <SEP> Wachstumsverhalten <SEP> : <SEP>
<tb> L <SEP> (+)-Arabinose <SEP> +
<tb> D <SEP> (+)-Glucose <SEP> +
<tb> D <SEP> (-)-Fructose <SEP> +
<tb> i-Inosit <SEP> +
<tb> Maltose <SEP> +
<tb> Mannose <SEP> +
<tb> D <SEP> (+)-XyloseL <SEP> (+)-RhamnoseSaccharoseLactoseD <SEP> -Raffinose
<tb> Inulin <SEP> - <SEP>
<tb> MannitSalicinSorbitCelluloseD-RiboseD <SEP> (+)-Trehalose-
<tb>
Das zur Herstellung von Capreomycin durch Züchten von NRRL 2773 verwendbare Kulturmedium kann verschiedenartig gewählt werden, wie aus den obigen Verwertungsversuchen hervorgeht ; der Organismus vermag verschiedene Energiequellen zu nutzen.
Wegen der billigen Herstellung, der grossen Ausbeute an Antibioticum und der leichten Isolierung des Antibioticums werden bestimmte Kulturmedien bevorzugt, die verhältnismässig einfache Nährquellen enthalten. So enthalten z. B. die Medien, die zur Herstellung von Capreomycin verwendbar sind, eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff, wie Glucose, Fructose, Maltose, Mannose, lösliche Stärke, Melassen, Dextrin, braunen Zucker, Maisquellflüssigkeiten od. dgl. Die bevorzugte Quelle für Kohlenstoff ist Glucose. Ferner enthalten die verwendbaren Medien eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, wie Hafermehl, Rindfleischextrakt, Peptone (aus Fleisch oder Soja), hydrolysiertes Casein, Hefe, Aminosäurengemische od. dgl. Gegenwärtig werden als Stickstoffquellen Peptone, hydrolysiertes Casein und Rindfleischextrakt bevorzugt.
Mineralsalze, z. B. Salze mit Calcium-, Natrium-, Kalium-, Chlorid-, Sulfat- und Carbonationen, und eine Quelle für Wachstumsfaktoren, wie Hefe oder Hefeextrakt, können den Medien vorteilhaft zugesetzt werden.
Wie es auch für das Wachstum und die Entwicklung anderer Mikroorganismen notwendig ist, müssen dem Kulturmedium ferner wesentliche Spurenelemente zugesetzt werden, um den erfindungsgemäss verwendeten Actinomyceten zu züchten. Solche Spurenelemente gelangen gewöhnlich als Verunreinigungen beim Zusatz der andern Bestandteile in das Medium.
Der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums kann stark schwanken. Es hat sich jedoch als zweckmässig erwiesen, dass der anfängliche PH-Wert des Mediums zwischen etwa 5, 5 und 8, 0, vorzugsweise zwischen etwa 6, 5 und 7,0, liegt. Wie auch bei andern Actinomyceten beobachtet wurde, steigt der PH-Wert des Mediums während des Wachstums des Organismus allmählich an, während das Capreomycin gebildet wird und kann Werte von etwa 7, 2 bis 8,0 oder darüber erreichen, wobei der Endwert mindestens teilweise von dem anfänglichen PH-Wert des Mediums, den in dem Medium enthaltenen Puffern und der Zeit abhängt, die der Organismus wachsen kann.
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Eingetauchte aerobe Kulturen sind wählbare Bedingungen bei der Herstellung von Capreomycin. Zur
Herstellung verhältnismässig kleiner Mengen können Schüttelkolben und Oberflächenkulturen in Flaschen verwendet werden, doch werden für die Herstellung grosser Mengen submerse aerobe Kulturen in sterilen
Tanks bevorzugt. Das Medium in dem sterilen Tank kann mit einer Sporensuspension beimpft werden, aber wegen der bei Verwendung einer Sporensuspension als Inoculum zu beobachtenden Wachstumsverzö- gerung wird die vegetative Form der Kultur bevorzugt. Wenn die Wachstumsverzögerung hiedurch vermie- den wird, ist auch eine wirksamere Ausnutzung der Gärvorrichtung möglich.
Es ist also zweckmässig, zu- erst ein vegetatives Inoculum der Organismen herzustellen, indem eine verhältnismässig kleine Menge
Kulturmedium mit der Sporenform des Organismus beimpft wird, und wenn ein junges, aktives vegetati- ves Inoculum erhalten worden ist, dieses Inoculum aseptisch in den grossen Tank überzuführen. Das Me- dium, in dem das vegetative Inoculum gebildet wird, kann das gleiche oder ein anderes sein, wie es zur
Herstellung von Capreomycin im grossen Massstab verwendet wird.
Die Organismen wachsen am besten bei Temperaturen im Bereich von etwa 28 bis 370C. Die beste
Capreomycinbildung scheint bei etwa 29-330C zu erfolgen.
Wie es bei Submerskulturverfahren üblich ist, wird sterile Luft durch das Kulturmedium geblasen. Die wirksamste Förderung des Wachstums des Organismus und der Bildung von Capreomycin wird dann erreicht, wenn das bei dem Tankverfahren verwendete Luftvolumen mehr als 0, 1 Vol. -Teil Luft je Minute je Vol. -Teil Kulturmedium beträgt. Wirksames Wachstum und beste Ausbeuten an Capreomycin werden erzielt, wenn das verwendete Luftvolumen mindestens 1 Vol.-Teil Luft je Minute je Vol.-Teil Kulturmedium beträgt.
Die Konzentration anCapreomycinaktivität in dem Kulturmedium kann leicht während der Gärungszeit durch Untersuchung von Proben des Kulturmediums auf ihre Hemmwirkung gegenüber dem Wachstum eines Organismus verfolgt werden, der durch Capreomycin gehemmt wird. Der Organismus Klebsiella pneumoniae hat sich für diesen Zweck als geeignet erwiesen. Die Untersuchung kann in bekannter Weise durch Trübungsmessung oder in Schalen erfolgen.
Im allgemeinen wird die grösste Menge nach dem Beimpfen des Kulturmediums innerhalb von etwa 4 bis 7 Tagen gebildet, wenn eine aerobe Submerskultur oder eine Schüttelkolbenkultur verwendet wird, und innerhalb von etwa 5 bis 10 Tagen, wenn eine Oberflächenkultur verwendet wird.
Das Mycel und ungelöste Feststoffe werden aus der Gärlösung in üblicher Weise, z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren, entfernt. Das Antibioticum ist in der filtrierten Lösung enthalten und kann daraus z. B. durch Adsorption entfernt werden. Zu den verschiedenen hiefür verwendbaren Adsorptionsmit- tellr gehören Adsorptionskohlen und Ionenaustauschharze mit saurem Charakter ; ein geeignetes Harz dieser Art ist"Dowex"50 (ein sulfoniertes Polystyrolharz der Dow Chemical Company).-
Bei Verwendung von Kohle als Adsorptionsmittel kann Capreomycin dadurch gewonnen werden, dass man als Adsorptionsmittel Aktivkohle, z. B."Darco"G-60 (von der Atlas Powder Company) der filtrierten Lösung unter Rühren zusetzt. Das Gemisch wird lange genug gerührt, dass das Capreomycin wirksam an der Kohle adsorbiert wird.
Gewöhnlich wird, wenn etwa 2-5 Teile Kohle je 1 Teil Feststoffgehalt der Lösung zugesetzt werden, eine befriedigende Entfernung des Cap : eomycins aus der Lösung innerhalb von etwa 1 bis 2 h erreicht. Die Kohle, an der das Antibioticum adsorbiert ist, wird von dem Gemisch abfiltriert und zur Entfernung nicht adsorbierter Verunreinigungen gründlich gewaschen. Das Antibioticum wird dann aus der gewaschenen Kohle eluiert. Es wurde gefunden, dass eine Kombination einer verdünnten wässerigen Säure mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wirksam zur Entfernung des Antibioticums aus der Kohle dienen kann. Beispielsweise hat sich ein Gemisch von 80 Vol. -Teilen 0, 05n-Salzsäure und 20 Vol. -Teilen Aceton zum Eluieren von Capreomycin als wirksam erwiesen.
Nach einem andern Verfahren kann Capreomycin aus der filtrierten Lösung durch Inberührungbringen mit einem sauren Harz entfernt werden. Das Harz wird normalerweise in Salzform, z. B. als Natriumsalz, angewendet. Das adsorbierte Capreomycin kann aus dem Harz beispielsweise mit einer wässerigen Lösung eines löslichen Salzes, z. B. eines Sulfats, eines Chlorids oder eines Citrats, eluiert werden. Das
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Die Capreomycineluate können gegebenenfalls durch Behandeln mit Kohle entfärbt werden.
Wenn ein verhältnismässig unreines Präparat von Capreomycin erhalten werden soll, brauchen die genannten Eluate nur zur Trockne eingedampft zu werden. Die Eluate oder der trockene Rückstand derselben können jedoch zur weiteren Reinigung von Capreomycin verwendet werden.. So kann z. B. das durch Adsorption mit Kohle erhaltene Eluat auf etwa 1/5-1/10 seines Volumens eingedampft werden, wobei das Aceton entfernt wird, worauf das Capreomycin aus dem wässerigen Konzentrat ausgefällt werden kann.
Die Fällung kann durch Zusatz eines geeigneten Salzes unter Rühren erfolgen, z. B. eines üblicherweise
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zum Ausfällen von Proteinen verwendeten Salzes, wie Ammoniumsulfat, durch Ansäuern mit einer Säu- re, die ein Anion für das Capreomycinsalz liefert, oder mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Methanol oder Caton, erfolgen. Ein bevorzugtes Fällungsmittel ist Schwefelsäure.
Zur Ausfällung wird dem konzentrierten Eluat gewöhnlich 10n-Schwefelsäure in einer Menge von et- wa 1 Vol.-Teil Säure je 100 Vol.-Teile Capreomycinkonzentrat zugesetzt. Das als Schwefelsäureadditionssalz ausgefällte Capreomycin wird abfiltriert oder abzentrifugiert, gewaschen und gegebenenfalls getrocknet. Das Capreomycin kann durch wiederholtes Ausfällen mit Schwefelsäure weiter gereinigt werden. Der Niederschlag von Capreomycin kann weiter zu einer weissen festen Substanz gereinigt werden, indem er in der gerade nötigen Menge Wasser gelöst und die Lösung unter Rühren in ein grosses Volumen eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, z. B. indiel0-30fache Menge Methanol, gegeben wird, worauf das Capreomycin ausfällt.
Der weisse feste Niederschlag von Capreomycin wird abgetrennt und gegebenenfalls getrocknet.
Die freie Base Capreomycin kann aus dem nach dem obigen Verfahren erhaltenen Säureadditionssalz durch Auflösen einer Menge des Salzes in Wasser, Neutralisieren der Lösung und Klären der neutralisierten Lösung durch Filtrieren erhalten werden. Die filtrierte Lösung von Capreomycin kann über eine Säule eines basischen Harzes geschickt werden, z. B. Dowex-1 in der OH-Form (ein stark basisches Anionenaustauschharz vom Styrol-Divinylbenzol-Mischpolymerisattyp mit quaternären Ammoniumgruppen von der DowChemical Company), wodurch das Salz aus der Lösung entfernt wird, aber das Capreomycin als freie Base durch die Säule läuft. Die freie Base kann als trockene weisse feste Substanz erhalten werden, indem die abfliessende Lösung der Gefriertrocknung unterworfen wird.
Es können auch weitere Säureadditionssalze des Capreomycins ausser den oben genannten anorganischen Säureadditionssalzen hergestellt werden. Neben anorganischen Säuren können auch organische Säuren zur Herstellung von Salzen von Capreomycin verwendet werden, z. B. Pikrinsäure, p- (2-Hydroxy- - l-naphthylazo)-benzolsulfonsäure, Essigsäure od. dgl. Das gewünschte Salz kann gewöhnlich erhalten werden, indem zu einer wässerigen Lösung der freien Base Capreomycin mindestens die äquivalente Menge der entsprechenden Säure je Mol Capreomycin gegeben wird. Wenn ein Überschuss an Säure verwendet wird, werden gewöhnlich 4 Äquivalente Säure zur Herstellung des Salzes verbraucht, z. B. wird das Tetrahydrochlorid mit einem Überschuss an Salzsäure gebildet.
Selbstverständlich können Salze, die 1, 2 oder 3 Äquivalente Säure enthalten, durch entsprechend bemessenen Säurezusatz erhalten werden. Wenn das gewünschte Säureadditionssalz nicht leicht ausfällt, kann die Ausfällung z. B. durch Eindampfen der Lösung auf ein kleineres Volumen oder durch Zusetzen eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, z. B.
Methanol oder Aceton, gefördert werden.
Die Erfindung wird eingehender durch die folgenden Beispiele erläutert : Beispiel l : Herstellung von Capreomycin. Eine Sporenkultur von NRRL 2773 wird hergestellt, indem der Organismus auf einem Schrägagar der folgenden Zusammensetzung gezüchtet wird.
Hafermehl- Tomatenpaste - Ag ar :
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<tb>
<tb> Tomatenpaste <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> vorgekochtes <SEP> Hafermehl <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Agar <SEP> 15 <SEP> g <SEP>
<tb> Leitungswasser, <SEP> zur <SEP> Auffüllung
<tb> auf <SEP> ein <SEP> Endvolumen <SEP> von <SEP> 11
<tb>
Der Schrägagar wird mit Sporen von NRRL 2773 beimpft und 10 Tage bei etwa 300C bebrütet. Die auf dem Schrägagar gewachsene Kultur wird mit 6 ml Nährlösung bedeckt, und der Agar wird vorsichtig gerieben, um die Sporen zu entfernen und eine wässerige Sporensuspension zu erhalten.
2 ml der Sporensuspension werden unter aseptischen Bedingungen zum Beimpfen von 80 ml eines sterilen vegetativen Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung verwendet : Hefe-I-Medium :
EMI7.2
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 15 <SEP> g <SEP>
<tb> Hefe <SEP> 15 <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> Leitungswasser <SEP> 1100 <SEP> ml
<tb>
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Das beimpfte vegetative Medium wird 48 h bei etwa 280C bebrütet, wobei das Incubat mit einer Geschwindigkeit von 250 Perioden je Minute auf einer Schüttelvorrichtung mit einem Hub von 2, 5 cm geschüttelt wird.
EMI8.1
Mediums in 500 ml-Erlenmeyerkolben aseptisch zu beimpfen :
EMI8.2
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 25 <SEP> g <SEP>
<tb> Peptone <SEP> 45 <SEP> g <SEP>
<tb> hydrolysiertes <SEP> Casein <SEP> 4g <SEP>
<tb> Rummelassen <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 2 <SEP> g <SEP>
<tb> Leitungswasser <SEP> 1100 <SEP> ml
<tb>
Die beimpfte Kultur wird B Tage bei etwa 300C bebrütet. Während der Bebrütungszeit wird das Incubat 250mal je Minute auf einer Schüttelmaschine mit 2, 5 cm Hub geschüttelt. Der pH-Wert des Ausgangsmediums ist etwa 6,5. Nach Ablauf der Incubationszeit steigt der PH-Wert des Mediums auf etwa 7, 0.
Die erhaltene Kulturlösung wird filtriert, um das Mycel und andere ungelöste Feststoffe zu entfernen.
Die filtrierte Lösung enthält das Capreomycin, das durch den Organismus gebildet worden ist.
Beispiel 2 : Herstellung von Capreomycindisulfat. Eine Sporenkultur von NRRL 2773 wird hergestellt, indem der Organismus auf einem Schrägagar aus Hafermehl-Tomatenpaste-Agar wie in Beispiel 1 gezüchtet wird. Der Schrägagar wird mit Sporen von NRRL 2773 beimpft und der beimpfte Nährboden 9 Tage bei etwa 300C bebrütet. Nach dem Bebrüten wird die auf dem Schrägagar gewachsene Sporenkultur mit 5 ml Nährlösung bedeckt, und die Oberfläche des Agars wird vorsichtig gerieben, um die Sporen zu entfernen und eine wässerige Sporensuspension zu erhalten.
Auf aseptischem Wege werden mit dem von einem 2,5 cm Schrägagar erhaltenen Inoculum 500 ml eines sterilisierten vegetativen Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung in einem 2 1-Erlenmeyerkolben beimpft :
EMI8.3
<tb>
<tb> Lösliche <SEP> Stärke <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Peptone <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Rindfleis- <SEP> : <SEP> hextrakt <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Hefeextrakt <SEP> 2,5g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1100 <SEP> ml
<tb>
Die Bebrütung erfolgt 48 h lang bei 28 C unter Schütteln mit 250 Hüben je Minute auf einer Schüttelmaschine mit 2, 5 cm Hub.
Um eine grössere Menge an vegetativem Inoculum herzustellen, werden die 500 ml vegetatives Inoculum aseptisch in einen 1310 l fassenden Gärtank aus rostfreiem Stahl gegeben, der 940 1 eines sterilen Mediums der folgenden Zusammensetzung enthält (Gewicht/Volumen) :
EMI8.4
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> % <SEP>
<tb> Hefe <SEP> 1, <SEP> 5% <SEP>
<tb> Antischaummittel <SEP> (Polyglykol
<tb> Nr. <SEP> 2000 <SEP> der <SEP> Dow <SEP> Chemical <SEP> Company) <SEP> 0, <SEP> 02%
<tb>
Das Inoculum'wind 22 h bei 30 C wachsen gelassen. Während der Wachstumszeit wird das Medium
EMI8.5
160 Umdr/min gerührt.
In einen 6350 1 fassenden Gärtank aus rostfreiem Stahl werden 4130 l eines Mediums der folgenden Zusammensetzung (Gewicht/Volumen) gegeben :
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Peptonmedium Nr. 159 :
EMI9.1
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 2, <SEP> 5% <SEP>
<tb> Melasse <SEP> 1, <SEP> 00/0
<tb> Peptone <SEP> 4, <SEP> 0%
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 2% <SEP>
<tb> hydrolysiertes <SEP> Casein <SEP> 0, <SEP> 6%
<tb> Antischaummittel
<tb> ("Polyglykol"Nr. <SEP> 2000 <SEP>
<tb> der <SEP> Dow <SEP> Chemical <SEP> Company) <SEP> 0, <SEP> 0050/0
<tb>
Das Medium wird nach dem Sterilisieren mit 375 l des in dem Gärtank gezüchtete Inoculums be- impft. Die Gärung wird 5 Tage bei 300C ausgeführt.
Der Schaum wird nötigenfalls durch Zusatz von "Larex"Nr. 1 (Antischaummittel der Swift & Co.) beseitigt. Das Medium wird während der Gärung durch
Zuführen von steriler Luft in einer Menge von 2, 72 m3/min belüftet und mit den beiden 56 cm-Rührern mit 140 Umdr/min gerührt. 109 kg"Dicalite"476 (ein Perlit-Filtermittel der Great Lakes Carbon Cor- poration) werden zu 3750 l der Lösung des Antibiotikums gegeben. Das Gemisch wird gerührt und filtriert.
Der Filterkuchen wird mit Leitungswasser gewaschen. Das Waschwasser und das Filtrat werden zu einem Gesamtvolumen von 3750 l vereinigt. Zu 1875 l des vereinigten Filtrats werden 59,7 kg Aktivkohle "Darco"G-60 gegeben. Das Gemisch wird gründlich gerührt und filtriert. Das Filtrat wird verworfen. Der Kohlefilterkuchen wird mit 200 1 Leitungswasser gewaschen. Das Waschwasser wird verworfen. Der gewaschene Kohlekuchen, an dem das Capreomycin adsorbiert ist, wird mit 200 l 0,05n-wässeriger Salzsäure gewaschen. Die Säure wird verworfen. Der gewaschene Kohlekuchen wird 1 h lang mit 400 l eines wässerigen Gemisches, das l, 65 l 11, 7n-wässeriger Salzsäure und 80 l Aceton enthält, eluiert.
Der Filterkuchen wird weiter durch Waschen mit 200 l eines wässerigen Acetongemisches, das 825 ml 11, 7n-Salzsäure und 40 l Aceton enthält, innerhalb von 15 min eluiert. Die Eluate werden vereinigt. Die vereinigten Eluate haben ein Gesamtvolumen von 575 1 und werden im Vakuum auf 52, 5 l eingeengt. Der konzentrierte Extrakt wird unter Rühren zu 525 l Aceton gegeben. Das Acetongemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen, wobei sich ein öliger Niederschlag von Capreomycin ausscheidet. Die überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert und verworfen. Der ölige Niederschlag wird in 20 l destilliertem Wasser gelöst. Die wässerige Lösung wird im Vakuum auf 12 l eingedampft, um alles anhaftende Aceton zu entfernen.
Das wässerige Konzentrat von Capreomycin wird zur Entfernung eines geringen Niederschlags filtriert, worauf dieser verworfen wird. Das das Capreomycin enthaltende Filtrat wird unter Rühren zu 240 IMethanol gegeben. Die methanolische Lösung von Capreomycin wird durch Zusatz von 1110n-Schwe- felsäure angesäuert, worauf das Schwefelsäureadditionssalz ausfällt. Das Gemisch wird zur vollständigen Ausfällung über Nacht stehen gelassen. Die überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert und abfiltriert. Der Niederschlag, der aus dem Additionssalz von Capreomycin mit 2 Mol Schwefelsäure besteht, wird mit 10 l Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute = 2510 g.
Soll das Tetrahydrochlorid von Capreomycin erhalten werden, so wird die methanolische Lösung von Capreomycin statt mit 10n-Schwefelsäure mit 11,7n-Salzsäure angesäuert.
Beispiel 3 : Herstellung von Capreomycindisulfat. Zu 360 l filtrierter Gärlösung, die nach dem Verfahren von Beispiel 2 erhalten worden ist, werden 585 g Oxalsäure und 260 g Natriumhydroxyd in 3 1 destilliertem Wasser gegeben. Das Gemisch wird kräftig gerührt und zur Entfernung eines etwaigen Niederschlags filtriert, der verworfen wird. Das Volumen des Capreomycin enthaltenden Filtrats beträgt 317 l. Das Filtrat wird über eine Säule von "Dowex" 50 (20/0 vernetzt, als Natriumsalz) geschickt. Die Säule hat einen Durchmesser von 10 cm und eine Höhe von 122 cm. Die Säule wird mit 2 l destilliertem Wasser gewaschen.
Das adsorbierte Capreomycin wird aus der Säule durch Waschen mit 25 l einer 2010gen wässerigen Lösung von Triäthylaminosulfat mit einer Geschwindigkeit von 75 ml/min eluiert. Dann werden 2, 5 kg Aktivkohle"Darco"G-60 zur Entfärbung des Eluats zugesetzt. Nachdem das Gemisch 15 min gerührt worden ist, wird 1 kg"Hyflo Supercel" (Diatomeenerde-Filtrierhilfsmittel der Johns-Manville Co.) unter Rühren zugesetzt. Das Gemisch wird filtriert und der Filterkuchen mit 11 destilliertem Wasser gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser werden zu einem Volumen von 21, 5 1 vereinigt.
Das vereinigte, Capreomycin enthaltende Filtrat wird unter Rühren zu 86 l Methanol gegeben, um das Capreomycfn auszufällen. Das Gemisch wird über Nacht stehen gelassen, wobei das Capreomycin als Schwefelsäureadditionssalz ausfällt. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit 12 l Methanol gewaschen. Der gewaschene Niederschlag wird ferner mit 7 1 Chloroform gewaschen. Der gewaschene Niederschlag, der aus dem
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Additionssalz von 2 Mol Schwefelsäure an Capreomycin besteht, wird im Vakuum bei 350G getrocknet.
Ausbeute = 1, 09 kg.
Beispiel 4 : Herstellung der freien Base Capreomycin. 3 g Tetrahydrochlorid von Capreomycin werden in 15 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung von Capreomycin wird mit In-Natronlauge auf etwa 7,0 gebracht. Die Lösung wird zur Entfernung eines geringen Niederschlags filtriert. Der Nieder- schlag wird verworfen. Das das Capreomycin enthaltende Filtrat wird auf eine Säule gegeben, die aus
Dowex 1 in der Hydroxylform, mit 81oVernetzung und einer Teilchengrösse zwischen 1460 und 5840 Sieb- maschen je cm2 besteht. Die Säule hat 2 cm Durchmesser und ist 30 cm hoch. In der Säule wird das Salz aus der aufgegebenen Capreomycinlösung gespalten, so dass aus der aus der Säule ablaufenden Flüssigkeit Capreomycin als freie Base gewonnen werden kann. Die Säule wird mit 350 ml Wasser gewaschen.
Das
Waschwasser und die Reaktionslösung werden vereinigt und zu einer trockenen, weissen, festen Substanz gefriergetrocknet, die aus der freien Base Capreomycin besteht. Ausbeute = 2, 7 g.
Das Präparat hat bei der Prüfung mit Klebsiella pneumoniae Capreomycinaktivität.
Beispiel 5 : Herstellung des Pikrinsäureadditionssalzes von Capreomycin. 1 g der freien Base Ca- preomycin wird in 10 ml destilliertem Wasser gelöst. Eine 5% ige Losung von Pikrinsäure (Gewicht/Volu- men) in 95% gem Äthanol wird tropfenweise unter Rühren zu der Capreomycinlösung gegeben, bis die
Ausfällung des Pikrinsäureadditionssalzes von Capreomycin beendet war. Der gelbe Niederschlag wird ab- filtriert, gewaschen und im Vakuum über wasserfreiem Calciumsulfat getrocknet. Das getrocknete Salz zeigt Aktivität gegenüber Klebsiella pneumoniae. Ausbeute = 1, 7 g.
EMI10.1
des p- (2-Hydroxy-1-naphthylazo)-benzoIsulfonsäureadditionssalzes vonCapreomycin. 3 g der freien Base Capreomycin werden in 8 ml Wasser gelöst.
Eine heiss gesättigte wässerige Lösung des Natriumsalzes von p- (2- Hydroxy-1-naphthylazo) -benzolsulfonsäure wird tropfenweise unter Rühren zu der Capreomycinlösung gegeben. Der Zusatz von p- (2-Hydroxy-l-naphthylazo)-benzolsul- fonsäurelösung wird fortgesetzt, bis das gelöste Capreomycin vollständig als p-(2-Hydroxy-1-naphthylazo)- -benzolsulfonsäureadditionssalz ausgefällt ist. Das p-(2-Hydroxy-1-naphthylazo)-benzolsulfonsäuresalz des Capreomycins fällt als hochviskoses, orange gefärbtes Öl an. Der Niederschlag des Capreomycinadditionssalzes wird durch Dekantieren der überstehenden Lösung abgetrennt, gewaschen und im Vakuum über wasserfreiem Calciumsulfat getrocknet.
Der getrocknete Rückstand des p- (2-Hydroxy-l-naphthyl- azo)-benzolsulfonsäureadditionssalzes von Capreomycin ist eine orange gefärbte, feste Substanz. Sie besitzt Aktivität gegenüber Klebsiella pneumoniae. Ausbeute = 4, 6 g.
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Process for the preparation of a novel nitrogen-containing organic base and its acid addition salts
The invention relates to a process for the preparation of a novel nitrogen-containing base and its acid addition salts.
In particular, the invention proposes a process for the production of capreomycin, which consists in cultivating a capreomycin-producing strain of Streptomyces capreolus in a culture medium containing assimilable sources of carbon, nitrogen and inorganic salts, immersed under aerobic conditions until from a substantial amount of capreomycin has been formed in the organism in the culture medium.
The novel base described here is called capreomycin and is a white solid substance with the following properties: It is easily soluble in water. In contrast, it is relatively insoluble in most organic solvents. She is z. B. relatively insoluble in lower ketones such as acetone and methyl isobutyl ketone, in alcohols such as methanol, ethanol and butanol, in esters such as amyl acetate, and in ethers such as diethyl ether. It is also relatively insoluble in solvents such as pyridine, halogenated hydrocarbons, benzene and hydrocarbons.
The free base capreomycin is relatively stable in aqueous solutions within a pH range of about 4 to 8, but is unstable in strongly basic and strongly acidic solutions. In general, capreomycin is more stable in acidic solutions than in basic solutions.
The electrometric titration of capreomycin in dimethylformamide-water (volume ratio 2: 1) shows the presence of titratable groups with the following pK'a values: 6.5; 8, 0; 10.0 and 13.0.
The molecular weight of capomycin as determined by electrometric titration is about 740.
The tetrahydrochloride of capreomycin is soluble in anhydrous methanol to about 6.6 mg per ml at 260C.
Analysis of capreomycin, which was dried in vacuo at room temperature over anhydrous calcium sulfate for 16 hours, showed that it was present as a free base and had approximately the following composition:
EMI1.1
<tb>
<tb> carbon <SEP> 44, <SEP> 08%
<tb> hydrogen <SEP> 6, <SEP> 94% <SEP>
<tb> nitrogen <SEP> 26, <SEP> 23% <SEP>
<tb> Oxygen <SEP> (direct) <SEP> 22, <SEP> 18%
<tb>
These values result in the empirical formula C Hsos3N1401, but of course this formula is only an approximation, which can still change somewhat when the structure of the compound is precisely explained.
The infrared absorption curve of capreomycin dihydrochloride as a powder covered by mineral oil is illustrated in the drawing. The visible bands of the infrared absorption spectrum in the region
EMI1.2
Capreomycin shows intense absorption maxima of about 268 ml in 0.03 N hydrochloric acid with an absorption value of E1: 269 and of about 283 ml in 0.05 N potassium hydroxide solution with an absorption value of
EMI1.3
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EMI2.1
Water).
The substance was examined by known methods for the analysis of amino acids, e.g. B. by the method given by Moore and Stein in J. Biol. Chem. 192 [1951], p. 663, the analysis of the hydrolysates of capreomycin obtained by hydrolysis with 5,7N hydrochloric acid at 1000C. indicated the presence of several amino acid residues. The quantitative determinability of the amino acid residues contained in such acid hydrolyzates is limited because the resistance of the peptide bonds to cleavage and the resistance of the amino acid residues in the acid hydrolyzates are very different.
Under this assumption and assuming a molar weight of about 740, the preliminary amino acid analysis reveals at least one residue of each of the following amino acids in the capreomycin molecule: alanine, serine, 2,3-diaminopropionic acid and two basic amino acids, one of which is likely to be derived from ornithine and the other is probably not yet known.
The analyzes to date have not yet provided any information about the presence of "acidic" (containing several carboxyl groups), aromatic or sulfur-containing amino acids. Chemical tests carried out with capreomycin gave the following results: The ninhydrin sample for the presence of Cl-amino groups was positive. The Lowry protein sample (J. Biol.
Chem. 193 [1951), p. 265) and the Folin-Ciocalteau protein sample were positive. The Anthron, Bial and Tauber saccharide samples were negative, as was Ehrlich's indole sample. The hydroxamic acid test for ester groups as described in J. Biol. Chem 159 [1945], p. 21, was
EMI2.2
negative. Capreomycin inhibits the growth of certain microorganisms, including gram-positive and gram-negative bacteria. The amounts which produce an inhibitory effect on the growth of a number of organisms are given in Table I. The inhibitory concentrations were determined by means of an agar dilution sample or a nutrient solution dilution sample (labeled "ad" or "bd" in the table).
In the case of the agar dilution sample, the test organism is spread or inoculated onto a series of agar plates containing different concentrations of Cap: eomycin in the agar, in order to determine the minimum concentration of capreomycin in y / ml which is sufficient for the growth of the organism for 48 h long inhibits.
For the nutrient dilution test, a series of tubes containing a nutrient solution with various concentrations of capreomycin are inoculated with the test organism in order to determine the minimum concentration of capreomycin in y / ml in the nutrient solution, which inhibits the growth of the organism for about 24 hours.
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Table I!
EMI3.1
<tb>
<tb> Examined <SEP> organism <SEP>: <SEP> inhibiting concentration <SEP>
<tb> 07mil) <SEP>: <SEP>
<tb> bacteria <SEP>:
<SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP> ad
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP> ad
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 25.0 <SEP> ad
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP>> <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> phlei <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis <SEP> (607) <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis <SEP> (607,
<tb> streptomy <SEP> cinresistent) <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> avium <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> avium
<tb> (streptomycin resistant) <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP> ad
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP>> <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP> ad
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> 100.0 <SEP> ad
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 100,
<SEP> 0 <SEP> ad
<tb> Salmonella <SEP> enteritidis <SEP>> <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Shigella <SEP> paradysenteriae <SEP> 100.0 <SEP> ad
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> 125, <SEP> 0 <SEP> bd
<tb> Salmonella <SEP> pullorum <SEP> 62, <SEP> 5 <SEP> bd
<tb> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 125, <SEP> 0 <SEP> bd
<tb> Salmonella <SEP> berta <SEP> 125, <SEP> 0 <SEP> bd
<tb>
As mentioned above, capreomycin and its acid addition salts can be used to treat bacterial infections in veterinary medicine. The connections are e.g. B. effective in treating diseases caused by salmonella. In particular, about 400 mg per kg of body weight, given subcutaneously, is sufficient to combat an infection by Salmonella typhimurium in mice.
Furthermore, about 1-5 mg of capreomycin with intramuscular injection per day-old chick are sufficient to combat an infection of Salmonella pullorum.
The compounds are also effective contact poisons for house flies. A suitable preparation for this purpose is an aqueous solution of 0.4% by weight of capreomycin, either as a free base or as a water-soluble acid addition salt.
The compounds have antihypertensive effects, as the standard pharmacological test on anesthetized dogs shows.
Capreomycin and its acid addition salts have an antibacterial effect against infecting organisms in vivo when injected subcutaneously in mice, the ED 50 value (effective amount to protect 50% of the test animals) in some examples being as follows: Streptomycetes pyogenes, 250 mg (x 2); Proteus vulgaris, 84 mg (x 2); Salmonella typhosa, 90 mg (x 2) and Klebsiella pneumoniae, 30 mg (x 2). (The values mean the amount of capreomycin per kg body weight of the test animal; "x 2" means two doses.)
Furthermore, capreomycin is effective in vivo in mice against experimentally caused tuberculosis
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fections. It is Z.
B. effective against Mycobacterium tuberculosis var. Hominis (strain H37RV)
Infections in mice when given subcutaneously or orally. By subcutaneous injection, it is effective at a dosage in the general range in which the currently used anti-tuberculous
Antibiotics, such as streptomycin, are effective.
Capreomycin can be produced by growing a heretofore unknown organism under aerobic conditions in a culture medium that contains assimilable sources of carbon, nitrogen and inorganic salts. The organism was isolated from a soil sample by suspending parts of the soil sample in sterile distilled water and spreading the suspension on nutrient agar. The inoculated nutrient agar plates were incubated for several days at about 25-350C. After the incubation time had expired, colonies of the capreomycin-producing organisms were transferred to agar slants using a sterile platinum loop. The inoculated slant agar bottoms were incubated in order to obtain larger quantities of inoculum for the production of capreomycin.
The novel organism, capable of producing capreomycin, has been submitted to The Culture Collection of the Northern Utilization Research and Development Branch of the United States Department of Agriculture in Paoria, Illinois. given and received the culture name NRRL 2773 and the name Streptomyces capreolus.
The following detailed description refers in detail to this newly found organism NRRL 2773. Of course, the production of capreomycin by cultivating other capreomycin-producing organisms or mutants of capreomycin-producing organisms, including mutants of NRRL 2773, also belongs within the scope of the invention. Such other organisms, races or mutants can be identified by known methods, e.g. By treating a capreomycin producing organism with X-rays or ultraviolet radiation or with chemical agents, e.g. B. the nitrogen mustards (nitrogen musards) are produced.
The results of a detailed systematic investigation of the new organism S. capreolus NRRL 2773 now follow. The colors given in the description correspond to the definitions given by Maerz and Paul, Dictionary of Color [1950].
Microscopic morphology.
Tomato paste oatmeal agar (14 days at 30 C):
The colonies form straight or curved sporophores and cylindrical conidia. The conidia are 1.0-1.2 µm in diameter and 3.0-4.8 µm in length.
Agar according to Hickey and Tresner (14 days at 300C):
Microscopic morphology as described above.
Salt-starch agar (14 days at 300C): microscopic morphology as described above.
Hallmarks of culture.
Czapek agar (14 days at 300C): Moderately good growth. Larger amounts of aerial mycelium, white and very little spore formation. The reverse is orange-brown to red-brown. No soluble pigments.
Glucose asparagine agar (14 days at 300C): Moderate growth. Slight, pale yellow-brown (Pl. 10-2B) aerial mycelium. Little spore formation, red-brown reverse side. Light brown soluble pigment.
Inorganic Salts and Starch Agar (14 days at SOOC): Moderate growth. Fairly strong, almost white aerial mycelium, red-brown reverse side. Light red-brown soluble pigment.
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soluble pigment.
Emerson's agar (14 days at 30 C): Moderate growth. Slight, white aerial mycelium. No spore formation. Red-brown back. Light brown soluble pigment.
Potato plug agar (14 days at 300C): no growth to excellent growth of vegetative mycelium depending on the potato variety. No visible aerial mycelium. The light orange back and vegetative growth darken the potato wad a little.
Tyrosine agar (14 days at 300C): Fairly good growth. Aerial mycelium almost white. Reverse brown. Light brown soluble pigment.
Physiology.
HS formation: Not observed on peptone iron agar with the addition of yeast extract.
Gelatin liquefaction: Moderately with the formation of a red-brown soluble pigment.
Nitrate reduction: No reduction in organic nutrient solution, slight reduction in synthetic nutrient solution.
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Starch hydrolysis: Only partial hydrolysis after 14 days.
Skimmed milk: neither coagulation nor peptonization in 14 days. Orange-brown ring, no skin. Little increase in pH.
Table II shows the results obtained in experiments on carbon utilization with the organism NRRL 2773. The following symbols are used in the table: + = growth and recovery; - = no noticeable growth or no recovery.
Table II:
Carbon recovery from NRRL 2773
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<tb>
<tb> Connection <SEP>: <SEP> Growth behavior <SEP>: <SEP>
<tb> L <SEP> (+) - arabinose <SEP> +
<tb> D <SEP> (+) - Glucose <SEP> +
<tb> D <SEP> (-) - Fructose <SEP> +
<tb> i-inositol <SEP> +
<tb> Maltose <SEP> +
<tb> Mannose <SEP> +
<tb> D <SEP> (+) - XyloseL <SEP> (+) - RhamnoseSaccharoseLactoseD <SEP> -Raffinose
<tb> Inulin <SEP> - <SEP>
<tb> MannitolSalicinSorbitolCelluloseD-RiboseD <SEP> (+) - Trehalose-
<tb>
The culture medium which can be used for the production of capreomycin by culturing NRRL 2773 can be selected in various ways, as can be seen from the above utilization experiments; the organism can use different energy sources.
Because of the cheap production, the large yield of antibiotic and the easy isolation of the antibiotic, certain culture media are preferred which contain relatively simple nutrient sources. So contain z. B. the media that can be used for the production of capreomycin, an assimilable source of carbon such as glucose, fructose, maltose, mannose, soluble starch, molasses, dextrin, brown sugar, corn steep liquors od. The like. The preferred source of carbon is glucose . The media that can be used also contain a source of assimilable nitrogen, such as oatmeal, beef extract, peptones (from meat or soy), hydrolyzed casein, yeast, amino acid mixtures or the like. Currently preferred nitrogen sources are peptones, hydrolyzed casein and beef extract.
Mineral salts, e.g. B. salts with calcium, sodium, potassium, chloride, sulfate and carbonate ions, and a source of growth factors such as yeast or yeast extract, can advantageously be added to the media.
As is also necessary for the growth and development of other microorganisms, essential trace elements must also be added to the culture medium in order to breed the actinomycetes used according to the invention. Such trace elements usually get into the medium as impurities when the other constituents are added.
The initial pH of the culture medium can vary widely. However, it has been found to be useful that the initial pH value of the medium is between about 5.5 and 8.0, preferably between about 6.5 and 7.0. As has also been observed with other actinomycetes, the pH of the medium increases gradually as the organism grows, while the capreomycin is formed and can reach values of about 7.2 to 8.0 or above, with the final value at least partially from the initial pH of the medium, the buffers contained in the medium and the time the organism can grow.
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Submerged aerobic cultures are elective conditions in the production of capreomycin. To
Shake flasks and flask surface cultures can be used to produce relatively small quantities, but sterile submerged aerobic cultures are used to produce large quantities
Tanks preferred. The medium in the sterile tank can be inoculated with a spore suspension, but because of the growth retardation observed when using a spore suspension as an inoculum, the vegetative form of the culture is preferred. If the growth retardation is avoided in this way, a more effective utilization of the fermentation device is also possible.
It is therefore advisable to first prepare a vegetative inoculum of the organisms by adding a comparatively small amount
Culture medium is inoculated with the spore shape of the organism, and when a young, active vegetative inoculum has been obtained, this inoculum is aseptically transferred into the large tank. The medium in which the vegetative inoculum is formed can be the same or different from that used for
Manufacture of capreomycin is used on a large scale.
The organisms grow best at temperatures in the range of about 28-370C. The best
Capreomycin formation appears to occur at around 29-330C.
As is usual with submerged culture methods, sterile air is blown through the culture medium. The most effective promotion of the growth of the organism and the formation of capreomycin is achieved when the air volume used in the tank process is more than 0.1 part by volume of air per minute per part by volume of culture medium. Effective growth and the best yields of capreomycin are achieved if the air volume used is at least 1 part by volume of air per minute per part by volume of culture medium.
The concentration of capreomycin activity in the culture medium can easily be followed during the fermentation period by examining samples of the culture medium for their inhibitory effect on the growth of an organism which is inhibited by capreomycin. The organism Klebsiella pneumoniae has proven to be suitable for this purpose. The investigation can be carried out in a known manner by measuring turbidity or in dishes.
Generally, after inoculation of the culture medium, the greatest amount will be produced within about 4 to 7 days if submerged aerobic culture or shake flask culture is used, and within about 5 to 10 days if surface culture is used.
The mycelium and undissolved solids are removed from the fermentation solution in a conventional manner, e.g. B. by filtration or centrifugation removed. The antibiotic is contained in the filtered solution and can, for. B. be removed by adsorption. The various adsorbents that can be used for this purpose include adsorbent carbon and ion exchange resins with an acidic character; a suitable resin of this type is "Dowex" 50 (a sulfonated polystyrene resin from Dow Chemical Company).
When using charcoal as the adsorbent, capreomycin can be obtained by using activated charcoal as the adsorbent, e.g. B. "Darco" G-60 (from Atlas Powder Company) is added to the filtered solution with stirring. The mixture is stirred long enough that the capreomycin is effectively adsorbed on the charcoal.
Usually, when about 2-5 parts of charcoal per 1 part of solids content are added to the solution, satisfactory removal of the cap: eomycin from the solution is achieved within about 1 to 2 hours. The charcoal on which the antibiotic is adsorbed is filtered off from the mixture and washed thoroughly to remove unadsorbed impurities. The antibiotic is then eluted from the washed charcoal. It has been found that a combination of a dilute aqueous acid with a water-miscible organic solvent can be effective in removing the antibiotic from the char. For example, a mixture of 80 parts by volume of 0.05N hydrochloric acid and 20 parts by volume of acetone has been found to be effective in eluting capreomycin.
In another method, capreomycin can be removed from the filtered solution by contacting it with an acidic resin. The resin is usually supplied in salt form, e.g. B. as the sodium salt applied. The adsorbed capreomycin can be removed from the resin, for example with an aqueous solution of a soluble salt, e.g. B. a sulfate, a chloride or a citrate, are eluted. The
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The capreomycin eluates can optionally be decolorized by treatment with charcoal.
If a relatively impure preparation of capreomycin is to be obtained, the eluates mentioned only need to be evaporated to dryness. However, the eluates or the dry residue thereof can be used for further purification of capreomycin. B. the eluate obtained by adsorption with charcoal can be evaporated to about 1 / 5-1 / 10 of its volume, the acetone is removed, whereupon the capreomycin can be precipitated from the aqueous concentrate.
The precipitation can be carried out by adding a suitable salt with stirring, e.g. B. one usually
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salt used to precipitate proteins, such as ammonium sulfate, by acidification with an acid which provides an anion for the capreomycin salt, or with a water-miscible solvent such as methanol or Caton. A preferred precipitant is sulfuric acid.
For precipitation, 10N sulfuric acid is usually added to the concentrated eluate in an amount of about 1 part by volume of acid per 100 parts by volume of capreomycin concentrate. The capreomycin precipitated as the sulfuric acid addition salt is filtered off or centrifuged off, washed and optionally dried. The capreomycin can be further purified by repeated precipitation with sulfuric acid. The precipitate of capreomycin can be further purified to a white solid substance by dissolving it in just the necessary amount of water and pouring the solution into a large volume of a water-miscible solvent, e.g. B. indiel0-30 times the amount of methanol, is added, whereupon the capreomycin precipitates.
The white solid precipitate of capreomycin is separated off and optionally dried.
The capreomycin free base can be obtained from the acid addition salt obtained by the above method by dissolving an amount of the salt in water, neutralizing the solution and clarifying the neutralized solution by filtration. The filtered solution of capreomycin can be passed through a column of basic resin, e.g. B. Dowex-1 in the OH form (a strongly basic anion exchange resin of the styrene-divinylbenzene copolymer type with quaternary ammonium groups from the Dow Chemical Company), which removes the salt from the solution, but the capreomycin passes through the column as a free base. The free base can be obtained as a dry white solid substance by subjecting the draining solution to freeze-drying.
It is also possible to produce other acid addition salts of capreomycin in addition to the above-mentioned inorganic acid addition salts. In addition to inorganic acids, organic acids can also be used to prepare salts of capreomycin, e.g. B. picric acid, p- (2-hydroxy- - l-naphthylazo) -benzenesulfonic acid, acetic acid or the like. The desired salt can usually be obtained by adding at least the equivalent amount of the corresponding acid per mole to an aqueous solution of the free base capreomycin Capreomycin is given. If an excess of acid is used, 4 equivalents of acid are usually consumed to make the salt, e.g. B. the tetrahydrochloride is formed with an excess of hydrochloric acid.
Of course, salts containing 1, 2 or 3 equivalents of acid can be obtained by adding an appropriate amount of acid. If the desired acid addition salt does not readily precipitate, the precipitation can e.g. B. by evaporating the solution to a smaller volume or by adding a water-miscible solvent, e.g. B.
Methanol or acetone.
The invention is illustrated in more detail by the following examples: Example 1: Preparation of Capreomycin. A spore culture of NRRL 2773 is prepared by growing the organism on an agar slant of the following composition.
Oatmeal Tomato Paste - Ag ar:
EMI7.1
<tb>
<tb> Tomato paste <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> pre-cooked <SEP> oat flour <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Agar <SEP> 15 <SEP> g <SEP>
<tb> tap water, <SEP> for <SEP> replenishment
<tb> on <SEP> a <SEP> final volume <SEP> from <SEP> 11
<tb>
The agar slant is inoculated with spores from NRRL 2773 and incubated for 10 days at about 300C. The culture grown on the agar slant is covered with 6 ml of nutrient solution, and the agar is gently rubbed to remove the spores and obtain an aqueous spore suspension.
2 ml of the spore suspension are used under aseptic conditions to inoculate 80 ml of a sterile vegetative culture medium of the following composition: Yeast I medium:
EMI7.2
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 15 <SEP> g <SEP>
<tb> yeast <SEP> 15 <SEP> g <SEP>
<tb> calcium carbonate <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> tap water <SEP> 1100 <SEP> ml
<tb>
<Desc / Clms Page number 8>
The inoculated vegetative medium is incubated for 48 hours at about 280 ° C., the incubate being shaken at a rate of 250 periods per minute on a shaker with a stroke of 2.5 cm.
EMI8.1
To inoculate aseptically into the medium in 500 ml Erlenmeyer flasks:
EMI8.2
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 25 <SEP> g <SEP>
<tb> Peptone <SEP> 45 <SEP> g <SEP>
<tb> hydrolyzed <SEP> casein <SEP> 4g <SEP>
<tb> Rummelassen <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Calcium carbonate <SEP> 2 <SEP> g <SEP>
<tb> tap water <SEP> 1100 <SEP> ml
<tb>
The inoculated culture is incubated for B days at about 300C. During the incubation period, the incubate is shaken 250 times per minute on a shaking machine with a 2.5 cm stroke. The pH of the starting medium is about 6.5. After the incubation period has expired, the pH of the medium increases to around 7.0.
The resulting culture solution is filtered to remove the mycelium and other undissolved solids.
The filtered solution contains the capreomycin, which has been produced by the organism.
Example 2: Production of Capreomycin Disulfate. A spore culture of NRRL 2773 is prepared by growing the organism on an oatmeal-tomato paste agar slant as in Example 1. The agar slant is inoculated with spores from NRRL 2773 and the inoculated nutrient medium is incubated for 9 days at about 300C. After incubation, the spore culture grown on the agar slant is covered with 5 ml of nutrient solution, and the surface of the agar is gently rubbed to remove the spores and obtain an aqueous spore suspension.
The inoculum obtained from a 2.5 cm agar slant is aseptically inoculated with 500 ml of a sterilized vegetative culture medium of the following composition in a 2 l Erlenmeyer flask:
EMI8.3
<tb>
<tb> Soluble <SEP> Starch <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Peptone <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Beef- <SEP>: <SEP> hextrakt <SEP> 5 <SEP> g
<tb> sodium chloride <SEP> 5 <SEP> g
<tb> yeast extract <SEP> 2.5g
<tb> tap water <SEP> 1100 <SEP> ml
<tb>
Incubation is carried out for 48 hours at 28 ° C. with shaking at 250 strokes per minute on a shaking machine with a 2.5 cm stroke.
To produce a larger amount of vegetative inoculum, the 500 ml of vegetative inoculum are aseptically placed in a 1310 l stainless steel fermentation tank containing 940 l of a sterile medium of the following composition (weight / volume):
EMI8.4
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP>% <SEP>
<tb> yeast <SEP> 1, <SEP> 5% <SEP>
<tb> Antifoam agent <SEP> (polyglycol
<tb> No. <SEP> 2000 <SEP> of the <SEP> Dow <SEP> Chemical <SEP> Company) <SEP> 0, <SEP> 02%
<tb>
The inoculum is allowed to grow at 30 ° C. for 22 h. During the growing season, the medium becomes
EMI8.5
160 rev / min stirred.
4130 l of a medium of the following composition (weight / volume) are placed in a 6350 1 stainless steel fermentation tank:
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Peptone Medium # 159:
EMI9.1
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 2, <SEP> 5% <SEP>
<tb> molasses <SEP> 1, <SEP> 00/0
<tb> Peptone <SEP> 4, <SEP> 0%
<tb> Calcium carbonate <SEP> 0, <SEP> 2% <SEP>
<tb> hydrolyzed <SEP> casein <SEP> 0, <SEP> 6%
<tb> antifoam agent
<tb> ("Polyglycol" No. <SEP> 2000 <SEP>
<tb> of the <SEP> Dow <SEP> Chemical <SEP> Company) <SEP> 0, <SEP> 0050/0
<tb>
After sterilization, the medium is inoculated with 375 l of the inoculum grown in the fermentation tank. The fermentation is carried out for 5 days at 300C.
If necessary, the foam is made by adding "Larex" No. 1 (anti-foam agent from Swift & Co.) eliminated. The medium gets through during fermentation
Supply of sterile air in an amount of 2.72 m3 / min, aerated and stirred with the two 56 cm stirrers at 140 rev / min. 109 kg of “Dicalite” 476 (a perlite filter medium from Great Lakes Carbon Corporation) are added to 3750 l of the solution of the antibiotic. The mixture is stirred and filtered.
The filter cake is washed with tap water. The wash water and the filtrate are combined to a total volume of 3750 l. 59.7 kg of "Darco" G-60 activated carbon are added to 1875 l of the combined filtrate. The mixture is stirred thoroughly and filtered. The filtrate is discarded. The charcoal filter cake is washed with 200 l of tap water. The wash water is discarded. The washed charcoal cake on which the capreomycin is adsorbed is washed with 200 l of 0.05N aqueous hydrochloric acid. The acid is discarded. The washed charcoal cake is eluted for 1 hour with 400 liters of an aqueous mixture containing 1.65 liters of 11.7N aqueous hydrochloric acid and 80 liters of acetone.
The filter cake is eluted further by washing with 200 l of an aqueous acetone mixture containing 825 ml of 11.7N hydrochloric acid and 40 l of acetone within 15 min. The eluates are combined. The combined eluates have a total volume of 575 l and are concentrated to 52.5 l in vacuo. The concentrated extract is added to 525 l of acetone with stirring. The acetone mixture is left to stand overnight at room temperature, an oily precipitate of capreomycin separating out. The supernatant liquid is decanted off and discarded. The oily precipitate is dissolved in 20 liters of distilled water. The aqueous solution is evaporated to 12 l in vacuo in order to remove any adhering acetone.
The aqueous concentrate of capreomycin is filtered to remove a small amount of precipitate and then discarded. The filtrate containing the capreomycin is added to 240 l ethanol with stirring. The methanolic solution of capreomycin is acidified by adding 1110N sulfuric acid, whereupon the sulfuric acid addition salt precipitates. The mixture is left to stand overnight for complete precipitation. The supernatant liquid is decanted off and filtered off. The precipitate, which consists of the addition salt of capreomycin with 2 mol of sulfuric acid, is washed with 10 l of methanol and dried in vacuo. Yield = 2510 g.
If the tetrahydrochloride of capreomycin is to be obtained, the methanolic solution of capreomycin is acidified with 11.7N hydrochloric acid instead of 10N sulfuric acid.
Example 3: Production of Capreomycin Disulfate. 585 g of oxalic acid and 260 g of sodium hydroxide in 3 l of distilled water are added to 360 l of filtered fermentation solution which has been obtained by the method of Example 2. The mixture is stirred vigorously and filtered to remove any precipitate which is discarded. The volume of the filtrate containing capreomycin is 317 liters. The filtrate is passed through a column of "Dowex" 50 (20/0 crosslinked, as the sodium salt). The column has a diameter of 10 cm and a height of 122 cm. The column is washed with 2 liters of distilled water.
The adsorbed capreomycin is eluted from the column by washing with 25 l of a 2010gen aqueous solution of triethylamino sulfate at a rate of 75 ml / min. Then 2.5 kg of activated carbon "Darco" G-60 are added to decolorize the eluate. After stirring the mixture for 15 minutes, 1 kg of "Hyflo Supercel" (diatomaceous earth filter aid from Johns-Manville Co.) is added with stirring. The mixture is filtered and the filter cake washed with 1 liter of distilled water. The filtrate and the wash water are combined to a volume of 21.5 liters.
The combined, capreomycin-containing filtrate is added to 86 l of methanol with stirring to precipitate the capreomycin. The mixture is left to stand overnight, the capreomycin precipitating as the sulfuric acid addition salt. The precipitate is filtered off and washed with 12 l of methanol. The washed precipitate is further washed with 7 l of chloroform. The washed precipitate from the
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The addition salt of 2 moles of sulfuric acid to capreomycin is dried in vacuo at 350G.
Yield = 1.09 kg.
Example 4: Preparation of the free base capreomycin. 3 g of tetrahydrochloride of capreomycin are dissolved in 15 ml of water. The pH of the solution of capreomycin is brought to about 7.0 with 1N sodium hydroxide solution. The solution is filtered to remove a small amount of precipitate. The precipitate is discarded. The filtrate containing the capreomycin is applied to a column consisting of
Dowex 1 in the hydroxyl form, with 81o cross-linking and a particle size between 1460 and 5840 sieve meshes per cm2. The column is 2 cm in diameter and 30 cm high. In the column, the salt is split from the capreomycin solution applied, so that capreomycin can be obtained as a free base from the liquid draining from the column. The column is washed with 350 ml of water.
The
Wash water and the reaction solution are combined and freeze-dried to a dry, white, solid substance, which consists of the free base capreomycin. Yield = 2.7 g.
The preparation has capreomycin activity when tested with Klebsiella pneumoniae.
Example 5: Preparation of the picric acid addition salt of capreomycin. 1 g of the free base capreomycin is dissolved in 10 ml of distilled water. A 5% solution of picric acid (weight / volume) in 95% according to ethanol is added dropwise with stirring to the capreomycin solution until the
Precipitation of the picric acid addition salt of capreomycin was complete. The yellow precipitate is filtered off, washed and dried in vacuo over anhydrous calcium sulfate. The dried salt shows activity against Klebsiella pneumoniae. Yield = 1.7g.
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of the p- (2-Hydroxy-1-naphthylazo) -benzoisulphonic acid addition salt of capreomycin. 3 g of the free base capreomycin are dissolved in 8 ml of water.
A hot, saturated aqueous solution of the sodium salt of p- (2-hydroxy-1-naphthylazo) -benzenesulfonic acid is added dropwise to the capreomycin solution with stirring. The addition of p- (2-hydroxy-1-naphthylazo) -benzenesulphonic acid solution is continued until the dissolved capreomycin has completely precipitated as p- (2-hydroxy-1-naphthylazo) - -benzenesulphonic acid addition salt. The p- (2-hydroxy-1-naphthylazo) -benzenesulfonic acid salt of capreomycin is obtained as a highly viscous, orange-colored oil. The precipitate of the capreomycin addition salt is separated off by decanting the supernatant solution, washed and dried in vacuo over anhydrous calcium sulfate.
The dried residue of the p- (2-hydroxy-l-naphthyl-azo) -benzenesulfonic acid addition salt of capreomycin is an orange colored, solid substance. It has activity against Klebsiella pneumoniae. Yield = 4.6 g.