Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen kri stallinen Antibiotikums, das im folgenden Foromacidin genannt wird.
Das Foromacidin, eine Base, bildet farb lose Kristalle, die bei 126-128 schmelzen. Bei der Elementaranalyse liefert es Werte, die für die Bruttoformel C"H37_3907N spre chen; [a]" = -56,2 in Chloroform (c = 0,51%). Im Ultraviolett weist es eine starke Bande bei 231 m,u auf (log e = 4,12; in Äthanol).
Im Infrarot-Spektrum, in Nujol suspendiert aufgenommen, zeigen sich Ban den unter anderem bei den Wellenlängen 2,88,u, <B>3,42y,</B> 3,51,u, 5,68,u, 5,76,u, 5,91,u, 6,15,u, 6,80,u, 7,24,u, 8,54,u, 8,89,u, 9,46,u, 9,80,u, 10,02,u, 10,97,u und 11,79,
u. In Methylcellosolve-Wasser (80:20) gelöst weist Foromacidin einen pK-Wert von 7,02 auf.
Foromacidin bildet mit anorganischen oder organischen Säuren Salze, beispiels weise mit Salzsäure, den Schwefelsäuren, der Essig-, Propion-, Valerian-, Palmitin- oder Ölsäure, der Zitronensäure, Mandelsäure, Glutaminsäure oder Pantothensäure. Die Salze lassen sich durch Einwirkung der ent sprechenden Säuren auf die freie Base oder durch doppelte Umsetzung von Salzen her stellen, beispielsweise von Foromacidinsulfat mit pantothensaurem Natrium.
Foromacidin besitzt hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Test- organismen in vitro. Verwendet man als Testmethode Verdünnungsreihen (Zehner potenzen) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei<B>37'</B> bebrütet werden, so ergeben sich folgende noch hemmende Kon zentrationen
EMI0001.0040
Hemmende
<tb> Testorganismen <SEP> Konzentration
<tb> <U>N.g/rnl</U>Streptococcus <SEP> mitis <SEP> 0,01
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 0,1
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 1
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 1
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var.
<SEP> aureus,
<tb> Penicillin-resistent <SEP> 10
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 1
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 1 Foromacidin ist nicht wirksam in einer Konzentration von 100 Ag/cm@ gegenüber folgenden Mikroorganismen Escherichia coli, Salmonella typhosa, Salmonella schottmuelleri, Shigella Bonnei, Psäudomonas aeruginosa, Klebsiella pneu- moniae (Typ A),
Pasteurella pestis, Vibrio comme (El Tor), Mycobacterium tuberculosis (H 37 Rv), Candida tropicalis, Candida albi- cans.
In vivo ist Foromacidin ebenfalls hoch, aktiv. Bei Applikation an mit Streptococcus pyogenes infizierten Mäusen s. c. werden mit 4 x 25 mg/kg oder 5 x 10 mg/kg 100% Über lebende und mit 5 X 1 mg/kg 75% Über lebende festgestellt.
Die Toxizität von Foromäcidin ist gering 100 mg/kg einmal subkutan injiziert werden von Mäusen ohne Anzeichen irgendeiner Schädigung ertragen. Höhere Dosen wurden bisher nicht geprüft.
In Gewebskulturen von Hühnerfibro- blasten zeigt Foromaeidin in Konzentra tionen bis zu 10 ,ug/cm0 eine gewisse cysto- statische Wirkung.
Penicillin-resistente Mikroorganismen sind foromacidinempfi,ndlich. Mit Pikro- mycin weist Foromacidin eine partiell ge kreuzte Resistenz auf, d. h. ein auf Resistenz gegen Pikromycin gezüchteter Stamm Micro- coccus pyogenes var. aureus wird nicht un empfindlich gegenüber Foromacidin, aber doch deutlich weniger empfindlich als sein Mutterstamm.
Das neue Antibiotikum wird erfindungs gemäss durch Kultivierung eines Strepto- myces-Stammes, der als Stamm A 8703 be zeichnet wird, hergestellt. Dieser Stamm wurde aus einer in Rom im Forum Romanum gesammelten Bodenprobe isoliert.
Der Orga nismus ist mit keiner - der in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology , 6. Aufl. oder in Actinomycetes and their Antibiotics von Waksman und Lechevalier 1953 aufgeführten Arten identisch. Er wird in unseren Laboratorien und in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spe zielle Botanik, Zürich, unter der obigen Bezeichnung auf bewahrt.
Es handelt sich um einen Streptomyceten mit den für diese Gattung charakteristischen Konidienketten. Er bildet auf fast allen Nährmedien ein weiss gelbes bis goldgelbes Substratmycel ; das Luftmycel ist am Anfang weiss und wird später grau.
Zur weiteren Kennzeichnung wird im fol genden das Wachstum von A 8703 auf ver schiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien 1-8 sowie 12 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. 17, 361 (1952) hergestellt. 1. Synthetischer Agar: Wachstum dünn, schleierartig, am Anfang graugelb, nachher hellgelb-rot und stellenweise dunkelbraun. Luftmycel weissgrau, nach 3 Tagen aschgrau. Bildet kein lösliches Pigment.
2. Synthetische Lösung: Fein punkt- förmiges Wachstum, milchweisse Flocken.
3. Glucosebrühe : Braune Flocken und oberflächliches Wachstum, pusteliges Luft- mycel bleigrau bis aschgrau. Bildet kein Pigment.
4. Glucoseagar : Substratmycel runzelig, , nach 3 Tagen goldgelb, nach 7 Tagen hell braun; Luftmycel sammetig, milchweiss nach 3 Tagen, aschgrau nach 7 Tagen. Bildet ein hellbraunes Pigment.
5. Glucose-Asparagin-Agar : Wachstum, schleierartig, weissgrau bis grünlichgrau; Luftmycel sammetig, grünlichgrau nach 3 Tagen, bräunlichgrau nach 7 Tagen, asch grau nach 13 Tagen. Keine Pigmentbildung.
6. Ca-malat-Agar : Wachstum dünn, weiss gelb bis grau, hellgelb nach 13 Tagen, Luft- mycel staubig, weissgrau, nach 7 Tagen asch grau in dem untern Teil des Schrägagar, über all grau nach 13 Tagen. Keine Pigment bildung.
7. Gelatinestich bei 1S : Oberflächliches Wachstum, braun bis bleigrau ; Luftmycel staubig, kreideweiss; Verflüssigung langsam (0,4 bis 0,5 cm) nach 21 Tagen, 0,7 bis 1,0 cm nach 37 Tagen. Substrat kaum ge färbt.
B. Stärkeplatte: Wachstum dünn, asch grau; Luftmycel sammetig aschgrau. Stärke schwach hydrolysiert (0,3 cm nach 4 Tagen).
9. Nähragar (hergestellt aus 10 g Fleisch extrakt, 10 g Pepton, 5 g NaCl, 17 g Agar; 1 1 Wasser, pH <B>7,2):</B> Wachstum dünn, glatt, hellgelb, kein Luftmycel nach 13 Tagen. Substrat nicht gefärbt.
10. Kartoffel: Substratmycel flechten artig, hellgelb; Luftmycel zuerst spärlich, dann staubig bleigrau. Bildet kein deutliches Pigment.
11. Karotte: Wachstum sehr gut, dünn, schleierartig, weissgelb; Luftmycel sammetig, nach 3 Tagen schneeweiss, nach 7 Tagen aschgrau. Keine Exopigmentbildung.
12. Lackmusmilch (Difco Nr. B 107) : Ober flächliches Wachstum, mit aschgrauem Luft- mycel ; Gerinnung und Peptonisierung deut lich nach 7 Tagen, Lackmus schwach rot.
Der Stamm A 8703 weist einige Ähnlich keit mit Streptomyces griseoluteus Umezawa und Mitarbeiter auf, wächst aber gut auf Gelatine; ebenfalls gleicht er Streptomyces griseolus (Waksman) Waksman et Henrici, aber sein Luftmycel ist nicht von Anfang an grau, zeigt auch andere Reaktionen auf Milch.
Streptomyces flavogriseus (Duche) Waksman et Lechevalier unterscheidet sich vom neuen Stamm insbesondere durch sein Verhalten auf Nähragar und Milch, Strepto- myces bikiniensis Johnstone et Waksman bildet kein dunkelbraunes Pigment.
Stamm A 8703 wächst, nach der Methodik von T. G. Pridham und D. Gottlieb, J. Bac- teriology 56, 107 (1948), untersucht, bei Ver- ,Wendung verschiedener Kohlenstoffquellen wie folgt:
EMI0003.0032
L-xylose <SEP> D-Mannit <SEP> -f L-Arabinose <SEP> -f- <SEP> D-Sorbit <SEP> (-)
<tb> L-Rhamnose <SEP> -f- <SEP> Dulcit <SEP> D-Fruktose <SEP> + <SEP> Mesoinosit <SEP> (-E-)
<tb> D-Galaktose <SEP> + <SEP> Salicin
<tb> Saccharose <SEP> - <SEP> Natriumacetat <SEP> (-)
<tb> Maltose <SEP> Natriumcitrat <SEP> (-)
<tb> Lactose <SEP> -E- <SEP> Natriumsuccinat <SEP> (-)
<tb> Raffinose <SEP> - <SEP> Glyzerin <SEP> -f Inulin <SEP> -1- <SEP> Glukose <SEP> + :Dabei bedeutet gutes Wachstum, sichere Verwendung der betreffenden C-Quelle; schwaches Wachstum, Verwendung der betreffenden C-Quelle fraglich.
(-) Wachstum sehr schwach, Verwendung unwahrscheinlich; - kein Wachstum, keine Verwendung.
Es können auch Varianten dieses Stam mes verwendet werden, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senf- ölen, gewonnen werden.
Zur Erzeugung des Foromacidin wird der Pilz z. B. in wäBriger, anorganische Salze, stickstoffhaltige Verbindungen und gegebe nenfalls Kohlehydrate enthaltender Nähr lösung aeröb gezüchtet.
Die Nährlösung enthält als anorganische Salze beispielsweise Chloride, Nitrate, Car- bonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink, Mangan. An stick stoffhaltigen Verbindungen und gegebenen falls zuzusetzenden Kohlehydraten und wachstumsfördernden Stoffen seien z. B.
genannt: Aminosäuren und ihre Gemische, Poptide und Proteine sowie ihre Hydrolysate, wie Popton oder Trypton, Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie von Mais und Weizen, von Destillations- rückständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwoll- pflanze, ferner Glukose; Saccharose, Lactose, Stärke usw.
Die Züchtung erfolgt am besten aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächen kultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauer stoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Formentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 22 und 32 . Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 11/2-5 Tagen.
Zur Isolierung des Antibiotikums aus dem vom Mycel abgetrennten Kulturfiltrat kön nen z. B. folgende Verfahren dienen: Man extrahiert das Kulturfiltrat, vorteilhaft bei einem pH über 7,0, mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Estern niederer Fettsäuren, beispiels weise Äthylacetat oder Amylacetat, chlorier ten Kohlenwasserstoffon, z. B. Äthylenchlo- rid, Methylenchlorid oder Chloroform, Keto- nen, z.
B. . Methylpropylketon, Methylamyl- keton oder Diisobutylketon, Alkoholen, wie Butylalkoholen oder Amylalkoholen, Äthern, z. B. Äthyläther, Diisopropyläther, Dibutyl- äthern oder Glykoläthern und dergleichen.
Anstelle einer Lösungsmittel-Extraktion des Kulturfiltrates oder in Kombination mit einer solchen als weitere Reinigungsoperation, kann man das Antibiotikum auch durch Adsorption isolieren, beispielsweise an Aktiv kohle oder aktivierte Erden, wie Fullererde oder Floridin, und anschliessende Extraktion des Adsorbates z.
B. mit einer sauren wäss- rigen Lösung und/oder mit einem in Wasser wenigstens teilweise löslichen organischen Lösungsmittel, wie Isopropanöl, Butanol oder Methyläthylketon.
Ein gutes Reinigungsverfahren für das neue Antibiotikum stellt die Verteilung zwi schen einer sauren wässrigen Lösung, bei spielsweise einem 0,2molaren Citratpuffer, und einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Chloroform oder Methylenchlorid, dar. Zweckmässig er folgt die Verteilung nach dem Gegenstrom verfahren in entsprechenden Apparaten. Auch Chromatographie ist zur Reinigung sehr geeignet. Die Gewinnung des reinen Anti biotikums in kristalliner Form nimmt man z.
B. aus organischen Lösungsmitteln, wie Äther-Petroläther-Gemischen, Benzol-Petrol- äther-Gemischen oder Aceton-Petroläther- Gemischen vor. Zur Umkristallisation kön nen dieselben Lösungsmittel oder auch wässrig-organische Lösungen, wie verdünnte Alkohole, verdünntes Aceton usw., dienen.
Das Foromacidin und seine Salze können als Heilmittel Verwendung finden. Man ver wendet gewöhnlich Präparate, welche die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeuti schen organischen oder anorganischen Trä germaterial enthalten. Hierfür kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbin dungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat,Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger.
Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, Cre- men, Suppositorien oder in flüssiger Form, als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen, vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Kon- servierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten..
Bei8piel Man bereitet eine Nährlösung der Zu sammensetzung: 10 g Rohglukose, 10 g des Handelsproduktes Distillers Solubles , 5 g Natriumchlorid, 1 g Natriumnitrat, 10 g Cal- ciumcarbonat und 11 Leitungswasser und stellt sie auf pH 7,8 ein.
Diese bzw. ein Viel faches derselben wird in 500-cm3-Erlen- meyern (mit je 100 cm3 Nährlösung) oder in 500-1-Fermentern (mit je 3001 Nährlösung) abgefüllt und 20-30 Minuten bei 1 atü sterili siert. Dann impft man mit bis zu 100/, einer teilweise sporulierenden, vegetativen Kultur des Stammes A 8703 an und inkubiert unter gutem Schütteln bzw.
Rühren und in den Fermentern unter Belüftung (mit etwa 1 Vol. steriler Luft pro Vol. Nährlösung pro Minute) bei<B>27'.</B> Nach 48 Stunden Wachstum filtriert man die Kulturen unter Zusatz eines Filter hilfsmittels durch eine Filterpresse oder ein rotierendes Filter und befreit so die anti- bioticumhaltige wässrige Lösung vom Mycel und andern festen Bestandteilen.
Je 1501 Kulturfiltrat werden bei p, 8,5 mit 901 Äthylacetat im Westfalia-Extraktor ausgezogen. Den Extrakt engt man in einem Dünnschichten-Eindampfer auf etwa 21 ein und schüttelt den Rückstand 8mal mit je 100 cm3 0,5 n.-wässriger Essigsäure, wobei die gesamte Aktivität in die wässrige Phase über geht. Der essigsaure Auszug wird mit konzen trierter Sodalösung alkalisch gestellt und 5mal mit je<B>100</B> cm3 Essigester ausgeschüt telt.
Die Essigesterlösung wird gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und im Va kuum bei 40 zur Trockne verdampft. Es bleiben 1,48 g eines gelblichen amorphen Produktes.
1,18 g dieses Materials werden nach Craig über 90 Stufen im Lösungsmittelsystem i Chloroform und 0,2-n. Citratpuffer (p, 5,0) verteilt. Es bildeten sich drei Aktivitäts maxima aus in den Stufen 0 und 28 sowie 66. Die Fraktionen 58-75 mit der Hauptaktivität werden vereinigt, mit Soda alkalisiert und mehrmals mit Chloroform ausgezogen. Der organische Extrakt wird mit wenig Wasser gewaschen und eingedampft. Es werden 330 mg rohes Foromacidin als gelbes zäh flüssiges Öl erhalten.
Dieses Produkt verteilt man erneut im gleichen Lösungsmittelsystem über 5 2 Stu fen, wobei es sich als weitgehend einheitlich erweist. Die Aufarbeitung der aktiven Frak- tionen wird in drei Portionen durchgeführt, Fraktionen 33-39 (65 mg), Fraktionen 40-44 (120 mg) und Fraktionen 45-52 (46 mg). Die Fraktionen 40-44 kristallisieren aus Äther- Petroläther. Durch Animpfen mit diesem Material kristallisieren auch die Fraktionen 33-39 und 45-52. Insgesamt werden 164 mg Kristalle gewonnen. Die Umkristallisation erfolgt aus Benzol-Petroläther.
Das erhaltene Foromacidin bildet farb lose Kristalle vom F. = 126-128 . Die Ele mentaranalysen (nach 10stündigem Trock nen bei 80 im Hochvakuum) liefern folgende Werte
EMI0005.0017
Process for the production of a new antibiotic The present invention relates to a process for the production of a new crystalline antibiotic, which is called foromacidin in the following.
The foromacidin, a base, forms colorless crystals that melt at 126-128. In the elemental analysis, it provides values that speak for the gross formula C "H37_3907N; [a]" = -56.2 in chloroform (c = 0.51%). In the ultraviolet it shows a strong band at 231 m, u (log e = 4.12; in ethanol).
In the infrared spectrum, recorded suspended in Nujol, bands appear among others at the wavelengths 2.88, u, <B> 3.42y, </B> 3.51, u, 5.68, u, 5, 76, u, 5.91, u, 6.15, u, 6.80, u, 7.24, u, 8.54, u, 8.89, u, 9.46, u, 9.80, u, 10.02, u, 10.97, u and 11.79,
u. Foromacidin dissolved in methyl cellosolve water (80:20) has a pK value of 7.02.
Foromacidin forms salts with inorganic or organic acids, for example with hydrochloric acid, sulfuric acids, acetic, propionic, valeric, palmitic or oleic acid, citric acid, mandelic acid, glutamic acid or pantothenic acid. The salts can be produced by the action of the corresponding acids on the free base or by double conversion of salts, for example of foromacidinsulfate with sodium pantothenic acid.
Foromacidin has a high antibiotic effectiveness against various test organisms in vitro. If the test method used is a series of dilutions (powers of ten) in glucose broth, which are incubated for 24 hours at <B> 37 '</B>, the following still inhibiting concentrations result
EMI0001.0040
Inhibitory
<tb> test organisms <SEP> concentration
<tb> <U> N.g / rnl </U> Streptococcus <SEP> mitis <SEP> 0.01
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 0.1
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 1
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 1
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var.
<SEP> aureus,
<tb> Penicillin-resistant <SEP> 10
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 1
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 1 Foromacidin at a concentration of 100 Ag / cm @ is not effective against the following microorganisms Escherichia coli, Salmonella typhosa, Salmonella schottmuelleri, Shigella Bonnei, Psäudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae (type A ),
Pasteurella pestis, Vibrio comme (El Tor), Mycobacterium tuberculosis (H 37 Rv), Candida tropicalis, Candida albicans.
Foromacidin is also highly active in vivo. For application to mice infected with Streptococcus pyogenes see Sect. c. 4 x 25 mg / kg or 5 x 10 mg / kg 100% survivors and 5 x 1 mg / kg 75% survivors.
The toxicity of foromaecidin is low. 100 mg / kg injected subcutaneously once subcutaneously by mice endured with no evidence of damage. Higher doses have not yet been tested.
In tissue cultures of chicken fibroblasts, foromaeidin shows a certain cystostatic effect in concentrations of up to 10 .mu.g / cm0.
Penicillin-resistant microorganisms are sensitive to foromacidin. Foromacidin shows a partially crossed resistance with picromycin, i. H. a strain of Micrococcus pyogenes var. aureus, bred for resistance to picromycin, is not insensitive to foromacidin, but is significantly less sensitive than its parent strain.
According to the invention, the new antibiotic is produced by cultivating a Streptomyces strain, which is designated as strain A 8703. This strain was isolated from a soil sample collected in the Roman Forum in Rome.
The organism is not identical to any of the species listed in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 6th edition, or in Actinomycetes and their Antibiotics by Waksman and Lechevalier 1953. It is stored in our laboratories and at the Swiss Federal Institute of Technology, Institute for Special Botany, Zurich, under the above description.
It is a Streptomycete with the conidial chains characteristic of this genus. It forms a white-yellow to golden-yellow substrate mycelium on almost all nutrient media; the aerial mycelium is initially white and later turns gray.
For further identification, the growth of A 8703 on different nutrient media is described below. The nutrient media 1-8 and 12 were according to W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. 17, 361 (1952). 1. Synthetic agar: growth thin, veil-like, initially gray-yellow, later light yellow-red and dark brown in places. Aerial mycelium white-gray, after 3 days ash-gray. Does not form a soluble pigment.
2. Synthetic solution: fine point-shaped growth, milk-white flakes.
3. Glucose broth: Brown flakes and superficial growth, pustular aerial mycelium lead-gray to ash-gray. Does not form pigment.
4. Glucose agar: substrate mycelium wrinkled, golden yellow after 3 days, light brown after 7 days; Air mycelium velvety, milk white after 3 days, ash gray after 7 days. Forms a light brown pigment.
5. Glucose asparagine agar: growth, veil-like, white-gray to greenish-gray; Air mycelium velvety, greenish gray after 3 days, brownish gray after 7 days, ash gray after 13 days. No pigment formation.
6. Ca malate agar: growth thin, white yellow to gray, light yellow after 13 days, aerial mycelium dusty, white gray, after 7 days ashen gray in the lower part of the agar slant, all over gray after 13 days. No pigment formation.
7. Gelatin tinge at 1S: superficial growth, brown to lead-gray; Aerial mycelium dusty, chalk white; Liquefaction slowly (0.4 to 0.5 cm) after 21 days, 0.7 to 1.0 cm after 37 days. Substrate hardly colored.
B. Starch plate: growth thin, ash gray; Air mycelium velvety ash gray. Starch weakly hydrolyzed (0.3 cm after 4 days).
9. Nutrient agar (made from 10 g meat extract, 10 g peptone, 5 g NaCl, 17 g agar; 1 l water, pH 7.2): growth thin, smooth, light yellow, no aerial mycelium after 13 days. Substrate not colored.
10. Potato: substrate mycelium lichen-like, light yellow; Aerial mycelium initially sparse, then dusty lead-gray. Does not form a clear pigment.
11. Carrot: growth very good, thin, veil-like, white-yellow; Air mycelium velvety, after 3 days snow-white, after 7 days ash-gray. No exopigmentation.
12. Litmus milk (Difco No. B 107): surface growth, with ash-gray aerial mycelium; Coagulation and peptonization evident after 7 days, litmus pale red.
Strain A 8703 shares some similarity with Streptomyces griseoluteus Umezawa et al, but grows well on gelatin; it also resembles Streptomyces griseolus (Waksman) Waksman et Henrici, but its aerial mycelium is not gray from the start and also shows other reactions to milk.
Streptomyces flavogriseus (Duche) Waksman et Lechevalier differs from the new strain in particular in its behavior on nutrient agar and milk; Streptomyces bikiniensis Johnstone et Waksman does not form a dark brown pigment.
Strain A 8703 grows, examined according to the methodology of T. G. Pridham and D. Gottlieb, J. Bacteriology 56, 107 (1948), when using different carbon sources as follows:
EMI0003.0032
L-xylose <SEP> D-mannitol <SEP> -f L-arabinose <SEP> -f- <SEP> D-sorbitol <SEP> (-)
<tb> L-rhamnose <SEP> -f- <SEP> Dulcit <SEP> D-fructose <SEP> + <SEP> meso-inositol <SEP> (-E-)
<tb> D-galactose <SEP> + <SEP> salicin
<tb> sucrose <SEP> - <SEP> sodium acetate <SEP> (-)
<tb> maltose <SEP> sodium citrate <SEP> (-)
<tb> Lactose <SEP> -E- <SEP> Sodium succinate <SEP> (-)
<tb> Raffinose <SEP> - <SEP> Glycerin <SEP> -f Inulin <SEP> -1- <SEP> Glucose <SEP> +: Here means good growth, safe use of the relevant carbon source; weak growth, use of the respective carbon source questionable.
(-) Very weak growth, unlikely to be used; - no growth, no use.
Variants of this Stam mes can also be used, as z. B. by selection or mutation, in particular under the action of ultraviolet or X-rays or nitrogen mustard oils can be obtained.
To generate the foromacidin, the fungus is z. B. in aqueous, inorganic salts, nitrogen-containing compounds and, if necessary, nutrient solution containing carbohydrates, cultured aerobically.
The nutrient solution contains, as inorganic salts, for example, chlorides, nitrates, carbonates, sulfates of alkalis, alkaline earths, magnesium, iron, zinc, manganese. On stick material-containing compounds and, if necessary, to be added carbohydrates and growth-promoting substances are z. B.
called: amino acids and their mixtures, poptides and proteins as well as their hydrolysates, such as popton or tryptone, meat extracts, water-soluble parts of cereal grains, such as corn and wheat, of distillation residues from alcohol production, of yeast, beans, especially the soy plant, of seeds , for example the cotton plant, also glucose; Sucrose, lactose, starch, etc.
The best way to grow them is aerobically, for example in static surface culture or preferably submerged with shaking or stirring with air or oxygen in shaker bottles or the known form fermenters. A suitable temperature is between 22 and 32. The nutrient solution generally shows a significant antibacterial effect after 11 / 2-5 days.
To isolate the antibiotic from the culture filtrate separated from the mycelium, z. B. the following methods are used: The culture filtrate is extracted, advantageously at a pH above 7.0, with a water-immiscible organic solvent, such as esters of lower fatty acids, example, ethyl acetate or amyl acetate, chlorinated th hydrocarbon, z. B. ethylene chloride, methylene chloride or chloroform, ketones, z.
B. Methyl propyl ketone, methyl amyl ketone or diisobutyl ketone, alcohols such as butyl alcohols or amyl alcohols, ethers, e.g. B. ethyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ethers or glycol ethers and the like.
Instead of a solvent extraction of the culture filtrate or in combination with such as a further cleaning operation, the antibiotic can also be isolated by adsorption, for example on activated carbon or activated earth, such as fuller's earth or floridine, and subsequent extraction of the adsorbate z.
B. with an acidic aqueous solution and / or with an organic solvent that is at least partially soluble in water, such as isopropane oil, butanol or methyl ethyl ketone.
A good cleaning method for the new antibiotic is the distribution between an acidic aqueous solution, for example a 0.2 molar citrate buffer, and a water-immiscible organic solvent, e.g. B. chloroform or methylene chloride. Appropriately he follows the distribution by countercurrent method in appropriate apparatus. Chromatography is also very suitable for purification. The extraction of the pure anti-biotic in crystalline form takes z.
B. from organic solvents such as ether-petroleum ether mixtures, benzene-petroleum ether mixtures or acetone-petroleum ether mixtures. The same solvents or aqueous-organic solutions, such as dilute alcohols, dilute acetone, etc., can be used for recrystallization.
Foromacidin and its salts can be used as medicinal products. Preparations are usually used which contain the compounds mentioned as a mixture with a pharmaceutical organic or inorganic carrier material suitable for enteral, parenteral or local administration. For this, substances come into question that do not react with the new connec tions, such as. B. gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohols, gum, polyalkylene glycols, petrolatum, cholesterol or other known excipients.
The pharmaceutical preparations can e.g. B. as tablets, coated tablets, powder, ointments, creams, suppositories or in liquid form, as solutions, suspensions or emulsions. If necessary, they are sterilized and / or contain auxiliary substances such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers. They can also contain other therapeutically valuable substances.
Example A nutrient solution is prepared with the following composition: 10 g of raw glucose, 10 g of the commercial product Distillers Solubles, 5 g of sodium chloride, 1 g of sodium nitrate, 10 g of calcium carbonate and 1 liter of tap water and adjusts it to pH 7.8.
These or a multiple of them are filled into 500 cm3 Erlenmeyers (with 100 cm3 nutrient solution each) or in 500-1 fermenters (with 3001 nutrient solution each) and sterilized at 1 for 20-30 minutes. Then you inoculate with up to 100%, a partially sporulating, vegetative culture of the strain A 8703 and incubate with good shaking resp.
Stir and place in the fermenters with aeration (with about 1 vol. Sterile air per vol. Nutrient solution per minute) at <B> 27 '. </B> After 48 hours of growth, the cultures are filtered through a filter press or with the addition of a filter aid a rotating filter and frees the antibiotic-containing aqueous solution from mycelium and other solid components.
150 liters of culture filtrate are extracted with 90 liters of ethyl acetate in the Westfalia extractor at p. 8.5. The extract is concentrated in a thin-layer evaporator to about 21 and the residue is shaken 8 times with 100 cm3 of 0.5N aqueous acetic acid each time, the entire activity being transferred to the aqueous phase. The acetic acid extract is made alkaline with a concentrated soda solution and shaken out 5 times with <B> 100 </B> cm3 of ethyl acetate each time.
The ethyl acetate solution is washed, dried with sodium sulfate and evaporated to dryness in a vacuum at 40. 1.48 g of a yellowish amorphous product remain.
1.18 g of this material are according to Craig over 90 stages in the solvent system i chloroform and 0.2 n. Citrate buffer (p, 5.0) distributed. Three activity maxima formed in levels 0 and 28 and 66. Fractions 58-75 with the main activity are combined, made alkaline with soda and extracted several times with chloroform. The organic extract is washed with a little water and evaporated. 330 mg of crude foromacidin are obtained as a yellow viscous liquid oil.
This product is redistributed in the same solvent system over 5 2 stages, and it turns out to be largely uniform. The active fractions are worked up in three portions, fractions 33-39 (65 mg), fractions 40-44 (120 mg) and fractions 45-52 (46 mg). Fractions 40-44 crystallize from ether-petroleum ether. By inoculating with this material, fractions 33-39 and 45-52 also crystallize. A total of 164 mg of crystals are obtained. Recrystallization takes place from benzene petroleum ether.
The foromacidin obtained forms colorless crystals of F. = 126-128. The elementary analyzes (after 10 hours drying at 80 in a high vacuum) provide the following values
EMI0005.0017