DE2828933A1

DE2828933A1 - 3- eckige klammer auf (s)-1'-phenylaethylamino eckige klammer zu -propylaminobleomycin, verfahren zu seiner herstellung und diese verbindung enthaltendes arzneimittel

Info

Publication number: DE2828933A1
Application number: DE19782828933
Authority: DE
Inventors: Akio Fujii; Takeyo Fukuoka; Yasuhiko Muraoka; Tomohisa Takita; Hamao Umezawa; Osamu Yoshioka
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1977-07-01
Filing date: 1978-06-30
Publication date: 1979-01-04
Also published as: DE2828933B2; NL7806947A; DK157081C; SE7807418L; US4238391A; FR2396021A1; FR2396021B1; DE2828933C3; IT7850131A0; IT1105081B; US4195018A; HU180894B; ES471257A1; GB2001962B; DK299578A; CH634582A5; CA1078831A; DK157081B; GB2001962A

Description

KRAUS & WEISERT

j PATENTANWÄLTE A Q A 9 V V «J

DR. WALItR KRAUS DIPLOMCHEMIKER ■ DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-SOOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077-797078 ■ TELEX O5-212156 kpat d

TELEGRAMM KRAUSPATENT

AO

1914 WK/rm

NIPPON KAYAKU KABUSHIKI KAISHA Tokyo / Japan

3-C(S)-I'-PhenyläthylaminoJ-propylaminobleomycin, Verfahren zu seiner Herstellung und diese Verbindung enthaltendes

Arzneimittel

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Beschreibung;

Die Erfindung betrifft eine neue Bleomycinverbindung, ihre
nicht-toxischen Salze und ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen Bleomycinverbindung. Die Erfindung betrifft insbesondere 3-[(S)-I'-Phenyläthylamino]-propylaminobleomycin der Formel:

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.- ι

O=O

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und die nicht-toxischen Salze davon sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses neuen Bleomycins.

Bleomycine sind karzinostatische Antibiotika, die von Umezawa et al entdeckt wurden [Journal of Antibiotics, 19A. 200 (1966)]. Es handelt sich um wasserlösliche basische Glycopeptide, die durch Actinomycete Streptomyces verticillus erzeugt werden. Diese Verbindungen sind dazu imstande, leicht ein Atom von zweiwertigem Kupfer zu chelieren. Bei der normalen Kultivierung werden 16 Komponenten von Bleomyeinen erzeugt und isoliert [vgl. z.B. Umezawa et al., Journal of Antibiotics, 19A. 210 (1966)]. Von den Bleomycinen wird ein Gemisch von kupferfreiem A₁, Ap, Ac, Bp und Demethyl-Ap (nachstehend als Bleomycinkomplex bezeichnet) im weiten Ausmaß in der Klinik zur Therapie von Krebs verwendet. Dieses Gemisch hat sich als besonders erfolgreich bei der Therapie von schuppigem Zellenkarzinom als Hauptziel, von Hautkrebs, Kopf- und Nackenkrebs, des Gebärmutterhalses, von Lungenkrebs und von malignem Lymphom erwiesen.

Was die Nebenwirkungen anbelangt, so sind jedoch Fälle von Lungenfibrose und anderen unerwünschten Zuständen berichtet worden. Von den Nebenwirkungen der Bleomycine ist die am meisten gefürchtete Nebenwirkung die Lungenfibrose. Es ist sehr leicht vorstellbar, daß die karzinostatische Aktivität der Bleomycine in der Klinik wirksamer ausgenützt werden könnte, wenn die obengenannte Nebenwirkung mehr oder weniger vermindert werden könnte.

Über Jahre wurde daher die Synthese von verschiedenen Bleomycinen untersucht. Bei verschiedenen Tieren wurden Tests hinsichtlich der karzinostatischen Aktivität und der Toxizität mit Einschluß der Lungenfibrose als Haupttestgesichtspunkt durchgeführt. Als Ergebnis wurde gefunden, daß bei 3-[(S)-1^f-Phenyl-

1/11

Ab

ethylamino]-propylaminobleomycin (nachstehend als "NK631" abgekürzt, und zwar mit Einschluß sowohl der Kupfer enthaltenden als auch der kupferfreien Formen), nämlich einem neuen Bleomycin, das durch Umsetzung eines reaktiven Derivats der Carboxylgruppe von Bleomycinsäure mit N-[(S)-I *-Phenylethyl]-1,3-diaminopropan erhalten wird, die Nebenwirkung der Lungenfibrose ausgeprägt vermindert wird und daß im Vergleich zu einem handelsüblichen Bleomycinkomplex und anderen bekannten Bleomycinen die karzinostatische Aktivität nicht verringert ist.

Die ausgezeichnete Bioaktivität des erfindungsgemäßen Bleomycins der Formel I wird nachstehend anhand der Versuchsbeispiele näher erläutert.

Die Bioaktivität von NK631 wurde hinsichtlich der folgenden vier Testgesichtspunkte untersucht, wobei ein Vergleich mit einem handelsüblichen Bleomycinkomplex und 3-[(R,S)-1'-Phenyläthylaminoj-propylaminobleomycin-monosulfat (kupferfreie Form) (nachstehend als "RS-Form" bezeichnet) durchgeführt wurde. Die RS-Form wurde durch ein Fermentationsverfahren gemäß der US-PS 3 846 400 erhalten.

1. Lungenfibrose

2. Antitumoraktivitat

3. antimikrobiell Aktivität

4. Toxizität.

1. Toxizität gegenüber der Lunge von Mäusen (Fibröse):

Mäuse vom ICR-Stamm (männlich, Alter 15 Wochen), 12 Stück pro Gruppe, wurden bei diesem Test verwendet. Die Dosis jeder pharmazeutischen Testzubereitung betrug 5 mg/kg. Die Dosis wurde

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durch intraperitoneale Injektion einmal täglich über 10 aufeinanderfolgende Tage lang verabreicht. Nach der Verabreichung wurden die Mäuse 5 Wochen lang aufgezogen. Nach der Beobachtung wurden die Mäuse getötet und einer Autopsie unterworfen, um das Ausmaß der Lungenfibrose zu bestimmen. Das Auftreten und der Grad der Lungenfibrose bei den Mäusen, die das neue erfindungsgemäße Bleomycin, einen handelsüblichen Bleomycinkomplex und die RS-Form erhalten hatten, wurden miteinander verglichen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.

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Tabelle I

Auftreten Grad

Anzahl der Mäuse mit Lungenfibrose

relativer Wert Gesamtbewertung* der Lungenfibrose/Gesamtzahl der Proben

relativer Wert

NK631-Mono sulfat
(kupferfreie Form)

RS-Form

OO O	Bleomycinkomplex	Punkte:
CO		Punkt :
OO OO	Fußnote: * O	Punkte:
—A •ν.	1	Punkte:
co	2	Punkte:
cn	4
	6

4/12 (0,33)

7/12 (0,58) 11/12 (0,92)

0,36

0,63 1,0 6/36 (0,17)

12/36 (0,33)
24/36 (0,67)

0,25
0,49

1,0

keine Fibröse

Ansammlung von Exudat in den Lungenbläschen und fibroseartige Veränderungen

im Alveolar-Septum

Fibröse in mehreren Bereichen

gestreute Fibröse

Fibröse in mehr als zwei Dritteln des Gesamtbereichs

NJ OO CD CJ CO

Aus den oben angegebenen Ergebnissen wird ersichtlich, daß im Vergleich zur RS-Form und zum Bleomycinkomplex die auf NK631-Monosulfat (kupferfreie Form) zurückzuführende Fibröse im Auftreten auf etwa 1/2 bzw. 1/3 und im Grad auf etwa 1/2 bzw. 1/4 vermindert worden war. Dies weist auf die Einsetzbarke it von NK63I-Monosulfat in der Klinik hin.

2. Antitumoraktivitat:

2-1. Wirkung auf kultivierte HeLa-S^-Zellen:

Die IDj-Q-Werte für jedes Bleomycin wurden aus der prozentualen Wachstumshemmung in 72 h Kultivierung in Gegenwart von jedem Bleomycin errechnet. Der ID^Q-Wert für NK631 wurde als 0,82 mcg/ml ermittelt. Dies steht einem Wert von 1,70 mcg/ml für den Bleomycinkomplex gegenüber, was darauf hinweist, daß KK631 das Zellwachstum zweimal so stark hemmt wie der Bleomycinkomplex. Der IDj-Q-Wert für die RS-Form wurde als 0,80 mcg/ml ermittelt, was darauf hinweist, daß der Hemmeffekt mit demjenigen von NK631-Monosulfat (kupferfreie Form) vergleichbar war.

2-2. Karzinostatische Aktivität beim Ehrlich-Krebs der Maus (fester Tumor):

Jeweils 2 χ 10 Zellen wurden subkutan in den Leibbereich von Mäusen vom ICR-Stamm (männlich, 6 Wochen alt) transplantiert. Nach 24 h erhielt jede Maus Testzubereitungen in der gleichen Weise, wie oben unter 1-2 beschrieben. Am 15. Tag nach der subkutanen Transplantation wurden die Tumore von jeder Maus herausgenommen und ihr Gewicht wurde mit demjenigen von Tumoren verglichen, welche sich in der Kontrollgruppe, die keine Behandlung erfahren hatte, entwickelt hatten. Auf diese Weise wurde die prozentuale Hemmung bestimmt.

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-Jg-

1&

Wie aus Tabelle II ersichtlich wird, ist die karzonostatische Aktivität von NK631-Monosulfat (kupferfrei) mit derjenigen der RS-Form vergleichbar, und sie ist etwa 1,4-mal so hoch wie diejenige des Bleomycinkomplexes.

Tabelle II

Dosis mg/kg χ 10	Prozeni NK631-Monosulfat (Cu-frei)	tuale Hemmui RS-Form	,31	ig Bleomycinkomplex
2,7	84	78	67
0,9	68	60	55
0,3	39	51	49
0,1	24	51	24
0,03	19	13	21
0	0	0	0
^ID50 mg/kg/Tag	0,35	0	0,49

2-3. Karzinostatische Aktivität gegen Ascites Hepatoma (Ascites-Typ) bei Ratten:

Jeweils 1 χ 10 AH66-Zellen wurden intraperitoneal in Ratten vom Donryu-Stamm transplantiert. Nach 24 h wurde die Testzubereitung intraperitoneal einmal täglich über 10 aufeinanderfolgende Tage lang verabreicht. Während einer Periode von 30 Tagen nach der Transplantation wurde das Gewicht jeder Ratte und die Anzahl der toten und überlebenden Tiere bestimmt.

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Tabelle III - Relativer Wert der mittleren Uberlebenstage

Dosis	NK631-Monosulfat	RS-Form	Bleomycinkomplex
mg/kg χ 10	(Cu-frei)
3,12	296	298	241
1,56	269	257	257
0,78	216	196	145
0,39	163	149	116
0,19	116	121	110
0	100	100	100

Wie aus Tabelle III ersichtlich wird, war die Aktivität von NK631-Monosulfat (kupferfreie Form) gegenüber AH66-Ascites Hepatoma mit derjenigen der RS-Form vergleichbar. Sie war bei jeder Dosis derjenigen des Bleomycinkomplexes überlegen.

2-4. Hemmaktivität gegen schwammiges Zellkarzinom bei der Maus, das durch 20-Methylcholanthren induziert wird (nachstehend als »20-MC^M abgekürzt):

Eine Acetonlösung von 20-MC wurde topisch auf den rasierten Rücken von Mäusen vom ddy-Stamm (männlich, 10 Wochen alt) zweimal pro Woche über einen Zeitraum von 18 Wochen aufgebracht. Nach 5 Wochen vom Beginn der 20-MC-Behandlung wurde die Testzubereitung in einer Menge von 62,5 mcg/Maus intraperitoneal zweimal wöchentlich und über einen Zeitraum von 15 Wochen verabreicht. Innerhalb der ersten Woche nach Beendigung der Verabreichung der Testzubereitung wurde der Bereich, wo das 20-MC aufgebracht worden war, pathologisch auf das Auftreten einer Karzinogenese untersucht.

Wie aus Tabelle IV ersichtlich ist, sind NK631-Monosulfat (kupferfreie Form) und die RS-Form geringfügig wirksamer als der Bleomycinkomplex bei der Hemmung der Karzinogenese, die auf 20-MC zurückzuführen ist.

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- ier -

Tabelle IV

Mortalität

Auftreten einer Karzinogenese

prozentuale Hemmung

NK631-Monosulfat
(kupferfrei)

RS-Form

Bleomycinkomplex

Kontrolle

1/12 1/12 2/12 1/24

5/11 (45,4)

5/10 (50,0)

20/23 (86,9)

47,8 47,8 42,5 0

Aus den obigen Ergebnissen wird ersichtlich, daß NK631-Monosulfat (kupferfreie Form) im Vergleich zu einem handelsüblichen Bleomycinkomplex eine ausgeprägt überlegene Antitumoraktivität besitzt.

Antimikrobiell Aktivität:

Die antimikrobielle Aktivität wurde nach der Schalenmethode gegen Mycobacterium 607 und Bacillus subtilis PCI unter Verwendung von Bleomycin A₂ als Standard (1000 U/mg) getestet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt.

	Tabelle V	M. 607	B. Sub.
		7848 7535 1234	1550 1400 886
m
NK631-Monosulfat RS-Form Bleomycinkomplex	(Cu-frei)

Wie aus Tabelle V ersichtlich wird, zeigen das NK63I-Monosulfat (kupferfreie Form) und die RS-Form eine weitaus bessere antimikrobielle Aktivität als der Bleomycinkomplex.

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Toxizität:

4-1. Akute Toxizität bei intraperitonealemWeg (LD₅₀) bei Ratten:

Wie aus Tabelle VI hervorgeht, ist der LD_5Q-Wert von NK631-Monosulfat (kupferfreie Form) bei Ratten ungefähr vergleichbar zu demjenigen des Bleomycinkomplexes und der RS-Form.

Tabelle VI

Vertrauensgrenzen (Signifikanzwert von 5%)

Ratte

NK63I-Monosulfat (kupferfrei)

RS-Form
Bleomycinkomplex

155,0 150,6 168,0

133,6 bis 179,8 129,0 bis 170,6 130,0 bis 217,0

4-2. Subakute und chronische Toxizität bei Ratten und Hunden:

NK631-Monosulfat (kupferfreie Form) ist hinsichtlich der subakuten und chronischen Toxizität bei Ratten und Hunden mit dem Bleomycinkomplex vergleichbar. Weiterhin sollte die Tatsache speziell erwähnt werden, daß in allen Fällen, wo Hunden eine hohe Dosis des Bleomycinkomplexes (1,2 mg/kg, 90 Injektionen) injiziert wurde, eine Nekrose auftrat, daß dies jedoch bei keinem der Fälle erfolgte, wo den Hunden die gleiche Dosis von NK631-Monosulfat (kupferfreie Form) verabreicht wurde. Die Toxizität von NK63I-Monosulfat (kupferfreie Form) gegenüber der Lunge war ebenfalls niedriger als bei dem Bleomycinkomplex .

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Aus den obigen Ergebnissen ergibt sich, daß die Toxizität von NK631-Monosulfat (kupferfreie Form) mit derjenigen des Bleomycinkomplexes, ausgenommen der Toxizität gegenüber der Lunge und der Nekrose vergleichbar ist.

5. Zusammenfassung:

Aus den oben angegebenen Testergebnissen kann die Schlußfolgerung gezogen werden, daß NK631 eine neue Verbindung ist, die die folgenden Eigenschaften hat:

(1) Eine extrem niedrige Toxizität gegenüber der Lunge;

(2) eine antimikrobiell und Antitumoraktivitat, die derjenigen des handelsüblichen Bleomycinkomplexes überlegen ist;

(3) eine systemische Toxizität, die mit derjenigen des handelsüblichen Bleomycinkomplexes vergleichbar ist; und

(4) eine niedrige lokale Toxizität an der Injektionsstelle.

Es kann daher angenommen werden, daß NK631 für klinische Zwekke geeignet ist.

Das neue erfindungsgemäße Bleomycin NK631 wird in der Weise synthetisiert, daß man ein reaktives Derivat der Carboxylgruppe der Bleomycinsäure der Formel:

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mit N-[(S)-1·-Phenylethyl]-1,3-diaminopropan umsetzt. Die Verbindimg kann man insbesondere dadurch herstellen, daß man (1) Bleomycinsäure mit N-[(S)-1^!-Phenyläthylamino]-1,3-diaminopropan in Gegenwart eines Aktivierungsmittels umsetzt oder (2) Bleomycinsäure-3-aminopropylester oder das N-monosubstituierte Derivat davon mit N-[(S)-1'-Phenyläthylj-I,3-diaminopropan zur Umsetzung bringt.

Nachstehend wird eine detaillierte Beschreibung dieser Verfahrensweisen gegeben.

Die bei dem Verfahren (1) verwendete Bleomycinsäure ist eine bekannte Verbindung, die durch enzymatische Spaltung von Bleomycin B₂. nach der Methode gemäß den US-PS 3 843 448 und 3 846 400 erhalten wird.

Das andere Ausgangsmaterial, d.h. N-[(S)-I¹-Phenyläthyl]-1,3-diaminopropan ist eine neue Verbindung, die auf folgende Weise zuerst synthetisiert worden ist.

Auf etwa O⁰C abgekühltes Phenyläthylamin wird mit einer ungefähr äquivalenten Menge von Acrylnitril vermischt. Das Gemisch wird 10 bis 24 h bei 80 bis 100⁰C gehalten, um die Reaktion zu vervollständigen. Überschüssiges Acrylnitril wird sodann bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wird weiter destilliert, wodurch 3-C(S)-1'-Phenyläthylamino]-propionitril erhalten wird. Die auf diese Weise erhaltene Verbindung wird in üblicher Weise, beispielsweise in Gegenwart von Raney-Niekel, reduziert, wodurch das angestrebte N-[(S)-I'-Phenyläthyl3-1,3-diaminopropan (nachstehend als "Aminoverbindung¹¹ bezeichnet) erhalten wird. In Tabelle VII sind die physikalischchemischen Eigenschaften dieser Verbindung zusammengestellt.

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- 15 Tabelle VII

Freie Base

Dihydro Chlorid

(1) Aussehen

(2) Schmelzpunkt

(3) Siedepunkt

(4) Ultraviolettabsorptions-Maxima (in )

to (5) molekularer Extinktionskoef-

o fizient, ε (256 mn)

co (6) spezifische Drehung Ca]²/^

(8)

Rf-Wert bei der Dünnschichtchromatographie , n-Propanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser (15 ϊ 10 : 3 : 12 V/V), Avicel-SF

Rm-Wert bei der Hochspannungselektrophorese, Ameisensäure/ Essigsäure/Wasser (25 : 75 : 900 V/V), Avicel-SF, 800 V, 10 min, Rm-Wert von Alanin =1,0

farblose Flüssigkeit bei Raumtemperatur

bis 103⁰C (2 mm Hg)

241, 247, 252, 257, 263, 267
(Methanol)

-56,38° (unverdünnt, 1=1)

0,73

1,52

weiße nadeiförmige Kristalle 223,5 bis 224⁰C

250, 256, 259, 266
(destilliertes Wasser)

(destilliertes Wasser)

-20,6° (c = 1, destilliertes Wasser)

0,73

1,52

IS? CO K) OO CD CJ CO

ί> φ H H Φ .α

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O bo O

ΦΗ

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Beispiele für geeignete Aktivierungsreagentien sind 6-Chlor-1-p-chlorbenzolsulfonyloxybenzotriazol (CCBT), N-Äthyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat (NEPIS), N-tert.-Butyl-5-methylisoxazolitimperchlorat, N-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-i,2-dihydrochinolin, Di-p-nitrophenylsulfit, Tri-p-nitrophenylphosphit, p-Nitraphenyltrichloracetat, N-Hydroxysuccinimid, Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid, Diphenyl carbodiimid, Di-p-toluylcarbodiimid, Diisopropylcarbodiimid, p-Nitrophenol, Pentachlorphenol und Benzylalkohol.

Detaillierte Beschreibung des Verfahrens (1):

Bleomycinsäure (Kupfer enthaltende Form) wird in Wasser, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder einem Gemisch davon aufgelöst. Zu der Lösung wird unter Rühren bei 0 bis 30°C eines der oben angegebenen Aktivierungsreagentien gegeben. Die resultierende Lösung wird auf einen für die Aktivierung geeigneten pH-Wert von 3 bis 10 durch Zugabe einer anorganischen Säure oder Base, wie Salzsäure oder Natriumhydroxid, oder durch Zugabe einer organischen Säure oder Base, wie z.B. Trichloressigsäure oder N-Methylmorpholin, eingestellt. Nach einer solchen Behandlung wird die Aktivierung der Carboxylgruppe der Bleomycinsäure eingeleitet. Unmittelbar oder innerhalb von min nach der Behandlung wird die Ausgangslösung mit der Aminoverbindung (wie vorstehend definiert) so, wie sie ist, oder nach Einstellung des pH-Werts auf etwa 7,0 vermischt. Das Gemisch wird sodann 1 bis 24 h bei 0 bis 30⁰G gehalten, um die Reaktion ablaufen zu lassen. Auf diese Weise wird NK631 erhalten. Eine geeignete Verhältnismenge des Aktivierungsreagenses oder der Aminoverbindung ist 1 bis 10 Äquivalente für 1 Äquivalent der Bleomycinsäure.

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Um das NK631 aus dem Reaktionsgemisch zu isolieren, werden zuerst die Bleomycinverbindungen durch Zugabe von 5 bis 10 Volumenteilen Aceton pro 1 Volumenteil des Reaktionsgemisches erschöpfend ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen und in der kleinstmöglichen Menge destilliertem Wasser aufgelöst. Die resultierende wäßrige Lösung wird sofort mit Salzsäure oder dergleichen auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und auf eine chromatographische Säule aufgegeben, welche CM-Sephadex C-25 (vom NHr-Typ von Pharmacia Fine Chemicals), eingepackt in eine wäßrige Ammoniumchloridlösung, enthält. Die nicht-umgesetzte Bleomycinsäure läuft durch die Säule, ohne adsorbiert zu werden. Das auf dem Harz adsorbierte NK631 wird mit wäßrigen Ammoniumchloridlösungen mit Konzentrationsgradienten, die stufenweise oder kontinuierlich von 0,05 M bis 1,0 M erhöht sind, eluiert. NK63I ist in den blauen Abstromfraktionen mit einer Ammoniumchloridkonzentration von etwa 0,35 M bis 0,45 M enthalten, die eine Ultraviolettabsorption bei 292 ταμ zeigen. Diese Fraktionen werden gesondert gesammelt und durch Amberite XAD-2 (Röhm & Haas Co.) oder Diaion HP40 (Mitsubishi Chemical Co.) geleitet. Das adsorbierte NK63I wird mit Wasser gewaschen und eluiert, wodurch ein entsalzter Abstrom erhalten wird, aus dem ein reines blaues amorphes Pulver von NK63I (Kupfer enthaltende Form) erhalten wird. Das Hydrochlorid und das Sulfat von NK63I werden erhalten, indem man mit wäßrigem Methanol eluiert, das "Salzsäure bzw. Schwefelsäure enthält. Bei diesem Verfahren kann nicht-umgesetzte Bleomycinsäure leicht wiedergewonnen werden. Die oben beschriebene Verfahrensstufe, bei der CM-Sephadex C-25 (Sephadex ist ein Warenzeichen für einen Kationenaustauscher aus mikroskopisch kleinen Perlen eines Carboxymethylgruppenderivats von Polysacchariddextran, von Pharmacia Fine Chemicals Inc., Schweden) verwendet wird, ist nur ein der Veranschaulichung dienendes Beispiel. Die Verfahrensweise kann bis zu einem gewissen Ausmaß modifiziert werden, ohne daß

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die Ergebnisse wesentlich beeinflußt werden. So kann z.B. wäßrige Natriumchlorid- oder wäßrige Ammoniumsulfatlösung als Eluierungsmittel verwendet werden.

Die Entfernung des Kupfers aus dem oben erhaltenen Kupfer enthaltenden NK63I kann nach bekannten Methoden geschehen. So kann beispielsweise das Kupfer in der Weise entfernt werden, daß man eine Umsetzung mit Schwefelwasserstoff vornimmt, um das Kupfer in Kupfer(II)-sulfid umzuwandeln, das ausgefällt wird. Das Kupfer kann auch zu nullwertigem Kupfer mit einem Reduktionsmittel reduziert werden (vgl. US-PS 3 646 197). Man kann das Kupfer auch mit einem organischen Lösungsmittel extrahieren, das einen Chelatbildner, wie z.B. Dithizon, enthält (vgl. Umezawa et al., Journal of Antibiotics, 1,2A, 210 (1960)). Schließlich kann man beispielsweise auch ein nicht-ionogenes makroretikuläres Austauscherharz verwenden (vgl. US-PS 3 929 993). Nachstehend wird ein Beispiel für das Verfahren zur Entfernung des Kupfers angegeben.

NK631 (Kupfer enthaltende Form) wird in destilliertem Wasser aufgelöst und die Lösung wird in eine Harzsäule gegossen, die Amberlite XAD-2 (Warenzeichen für ein absorbierendes Harz aus Styrol-Divinylbenzol-Copolymerem von Röhm & Haas Co., USA) oder Diaion HP40 (Warenzeichen für ein absorbierendes Harz aus einem Styrol-Divinylbenzol-Copolymerem von Mitsubishi Chemical Co., Japan), gepackt in destilliertem Wasser, enthält, um das NK631 adsorbieren zu lassen. Die Säule wird sodann mit einer 5%igen wäßrigen Lösung von Äthylendiamintetraessigsäuredinatriumsalz (nachstehend als "EDTA.Nag" bezeichnet) gewaschen, wodurch die Kupferionen durch die EDTA.Na₂-Lösung weggetragen werden. Kupferfreies NK631 bleibt auf dem Harz zurück. Das Harz wird mit einer wäßrigen Lösung eines Salzes, z.B. von Natriumchlorid, Natriumsulfat oder Natriumacetat, zur Entfernung von EDTA.Nap und sodann mit destilliertem Wasser gewaschen. Schließ-

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lieh wird ein angesäuertes Methanol/Wasser-Gemisch, beispielsweise ein Gemisch aus Methanol und O,0025N-SaIzsäure (1:1 Volumenverhältnis) durch die Säule geleitet, um eine Substanz zu eluieren, die eine Ultraviolettabsorption bei 290 mu hat. Diese Fraktion wird gesammelt, konzentriert, auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und gefriergetrocknet, wodurch ein hellgelblich weißes amorphes Pulver von NK631-DihydroChlorid (kupferfreie Form) erhalten wird.

Als Säure zur Herstellung des angesäuerten Methanol/Wasser-Gemisches können alle beliebigen Säuren verwendet werden, sofern sie pharmazeutisch annehmbar sind. Wenn beispielsweise Schwefelsäure oder Essigsäure verwendet wird, dann wird ein Pulver von NK631-Monosulfat oder dem Diessigsäuresalz (kupferfreie Form) erhalten.

Das erfindungsgemäße NK63I kann in üblicher Weise in andere nicht-toxische Salze, beispielsweise in das Sulfat- und Essigsäuresalz, umgewandelt werden. Diese Salze können auch in der Weise erhalten werden, daß man in entsprechender Weise die beim Eluieren verwendete Säure verändert.

Da bei dem Verfahren (1) sich die Aminoverbindung mit der aktivierten Carboxylgruppe der Bleomycinsäure aufgrund des Vorhandenseins eines Aktivierungsreagenses, das bei der PoIypeptidsynthese verwendet wird, umsetzt, schreitet die Kondensationsreaktion glatt und unter extrem milden Bedingungen voran« Es setzt sich daher nur die primäre Aminogruppe der Aminoverbindung mit der aktivierten Carboxylgruppe um, während die sekundäre Iminogruppe an der Reaktion nicht teilnimmt, wodurch bevorzugt NK63I erhalten wird. Dies stellt einen erheblichen Vorteil des Verfahrens (1) dar.

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Detaillierte Beschreibung des Verfahrens (2):

Der beim Verfahren (2) verwendete 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure wird leicht in Form des Dihydrochlorids (Kupfer enthaltende Form) erhalten, indem man thermisch Bleomycin A₂ unter Bildung von 3-(Methylmercapto)-propylaminobleomycin zersetzt und das resultierende Bleomycin mit einem Halogennitril, einer Halogenessigsäure, einem Halogenacetatester oder einem Halogenacetamid in einer sauren Lösung umsetzt (US-PS 3 886 133),

Das N-monosubstituierte Derivat des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure, bei dem die Aminogruppe geschützt ist, wird in hoher Ausbeute erhalten, indem man das DihydroChlorid des 3-Aminopropylesters von Bleomycinsäure in wasser oder einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol, oder einem Gemisch davon auflöst und sodann langsam unter heftigem Rühren zu der resultierenden Lösung eine äquivalente Menge oder einen geringen Überschuß eines der bekannten Aminogruppen schützenden Reagentien in Form eines Pulvers oder als Lösung in einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol, gibt und indem man die Reaktion bei Raumtemperatur oder unter Eiskühlung ablaufen läßt, wobei man kontinuierlich den pH-Wert des Reaktionsgemisches bei 5,0 bis 7,5 durch Zugabe einer organischen Base, wie z.B. von Trimethylamin, Triäthylamin, Pyridin, 1,3-Diazabicyclo-[5,4,0]-7-undecen, 1,5-Diazabicyclo-[3,4,0]-5-nonen, 1,4-Diazabicyclo-[2j2,2]-octan oder N-Methylmorpholin, hält. Typische solche N-monosubstituierten Derivate sind das Monohydrochlorid des 3-Acetylaminopropylesters von Bleomycinsäure, des 3-Succinylaminopropylesters der Bleomycinsäure, das Monohydrochlorid des 3-Benzoylaminopropylesters von Bleomycinsäure, das Monohydrochlorid des 3-Benzyloxycarbonylaminopropylesters von Bleomycinsäure, das Monohydrochlorid von 3-p-Toluolsulfonylaminopropylesters von Bleomycinsäure, das Monohydrochlorid des 3-(2,4-Dinitrophenyl)-aminopropylesters der

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Bleomycinsäure, das Monohydrochlorid des 3-(3,5-Dimethyl-3-oxocyclohexen-1-yl)-aminopropylesters der Bleomycinsäure, das Monohydrochlorid des 3-N-tert.-Butoxycarbonylpropylesters der Bleomycinsäure und das Monohydrochlorid des 3-N-Salicylideniminopropylesters der Bleomycinsäure (US-PS 3 886 133).

Bei dem Verfahren (2) wird NK631 durch Umsetzung des 3-Aminopropylesters oder N-monosubstituierten 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure mit der Aminoverbindung gebildet. Wenn der N-monosubstituierte 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure als Ausgangsmaterial verwendet wird, dann kann entweder ein reines Material oder ein Reaktionsgemisch, das konzentriert sein kann, erhalten aus dem 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure und einem Aminogruppenschutzmittel, verwendet werden.

Bevorzugte Lösungsmittel, die bei der Umsetzung des 3-Aminopropylesters oder des N-monosubstituierten 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure mit der Aminoverbindung verwendet werden, sind Wasser und organische Lösungsmittel, wie z.B. Methanol, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid. Das Reaktionsgemisch wird 1 bis 72 h lang bei 0 bis 8O⁰C bei neutralen oder alkalischen Bedingungen stehen gelassen, damit die Aminolysereaktion ablaufen kann. Auf diese Weise wird NK631 gebildet. Bei den Bedingungen eines höheren pH-Werts ist eine verlängerte Reaktionszeit bei verhältnismäßig niedrigen Temperaturen zweckmäßig, während bei den Bedingungen eines niedrigeren pH-Wertes eine kürzere Reaktionszeit bei höheren Temperaturen bevorzugt wird. Die geeignete Verhältnismenge der Aminoverbindung in dem Reaktionsgemisch ist 1 bis 10 Äquivalente pro 1 Äquivalent des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure oder des N-monosubstituierten Derivats davon.

Zur Isolierung des NK631 aus dem Reaktionsgemisch werden zuerst die Bleomycinkomponenten durch Zugabe der 2- bis 5-fachen

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Volumenmenge Aceton zu dem Reaktionsgemisch erschöpfend ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Filtration gesammelt, gründlich mit Aceton gewaschen und sodann in der geringstmöglichen Menge von destilliertem Wasser aufgelöst. Die resultierende wäßrige Lösung wird rasch auf einen pH-Wert von 6,0 durch Zugabe von Salzsäure oder dergleichen eingestellt und in eine chromatographische Säule aus CM-Sephadex C-25 (vom ΝΗλ⁺· Typ von Pharmacia Fine Chemicals), das in eine 0,05M-wäßrige Ammoniumchloridlösung eingepackt ist, eingegossen, damit die Bleomycinkomponenten auf dem Harz adsorbiert werden können. Durch Durchlaufenlassen durch die Säule einer wäßrigen Ammoniumchloridlösung, deren Konzentration stufenweise oder kontinuierlich von 0,05H auf 1,OM erhöht wird, werden der nicht-umgesetzte 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure oder ein N-monosubstituiertes Derivat davon und NK631 eluiert, die blaue Bänder (UV-Absorption bei 292 m u ) in dem Abstrom bei Ammoniumchloridkonzentrationen von 0,15 bis 0,2OM bzw. 0,35 bis 0,45M bilden. Diese Fraktionen werden gesondert gesammelt und durch Adsorption auf Amberlite XAD-2 oder Diaion HP40, Waschen mit Wasser und Elution entsalzt, wodurch ein blaues amorphes Pulver von NK631 (Kupfer enthaltende Form) erhalten wird. Das Hydrochlorid und das Sulfat werden erhalten, wenn man Methanol/Wasser-Gemische, die mit Salzsäure bzw. Schwefelsäure angesäuert worden sind, als Elutionsmittel verwendet. Der nichtumgesetzte 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure oder ein N-monosubstituiertes Derivat davon können in geeigneter Weise gewonnen werden. Die oben beschriebene Verfahrens stufe, bei der CM-Sephadex C-25 verwendet wird, ist ein typisches, der Veranschaulichung dienendes Beispiel. Sie kann bis zu einem gewissen Ausmaß modifiziert werden, ohne daß die Ergebnisse praktisch verändert werden. So kann z.B. als Eluierungsmittel wäßrige Natriumchlorid- oder wäßrige Ammoniumsulfatlösung verwendet werden.

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Das nach dem Verfahren (2) erhaltene NK631 kann in die kupferfreie Form durch Anwendung bekannter Kupferentfernungsmethoden umgewandelt werden, wie sie oben im Zusammenhang mit der Verfahrensweise (1) beschrieben wurden. Erforderlichenfalls ist es möglich, die Verbindung in ein anderes nicht-toxisches Salz, beispielsweise das Hydrochlorid, Sulfat oder Essigsäuresalz, umzuwandeln.

In den Tabellen VIII und IX sind die hauptsächlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften von NK63I zusammengestellt.

Die Strukturformel I von NK631 wurde auf folgende Weise bestätigt: NK63I-Monosulfat (kupferfreie Form) wurde in schwerem

13
Wasser aufgelöst. ^C-NMR wurde nach der Protonengeräusch-Entkupplungsmethode gemessen, wobei Dioxan als innerer Standard

13 verwendet wurde. Signale, die auf insgesamt 11 C-Atome, die in der Aminoverbindung in der Seitenkette und der 3-[(S)-1'-Phenyläthylaminoj-propylamino-Gruppierung enthalten waren, zurückzuführen sind, wurden bei 19,4, 26,3, 37,0, 43,5, 58,9, 128,3 (zwei Signale), 130,0 (zwei Signale) und 136,3 ppm festgestellt. Auf andere Kohlenstoffatome zurückzuführende Signale entsprachen alle den Signalen, die der Bleomycinfamilie gemeinsam waren [Naganawa et al., Journal of Antibiotics, 30. 388 (1977)].

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- 25 -

Tabelle VIII - Physikalisch-chemische Eigenschaften von NK63I (Kupfer enthaltende Form)

CO OO OO

	Aussehen	Dihydrochlorid	Monosulfat
(D	Löslichkeit	blaues amorphes Pulver	blaues amorphes Pulver
(2)	Schmelzpunkt (Zers.)» °C	löslich in Wasser, Methanol, Dimethylsulfoxid, Dimethyl formamid; geringfügig lös lich in Dioxan; unlöslich in Äthanol, Aceton, Äther, Benzol.	gleiche Löslichkeit wie im Falle des DihydroChlorids
(3)	spezifische Drehung (destil liertes Wasser, C = 1,0) [«3*36 ,,	205 bis 207	205 bis 207
(4)	Dünnschichtchromatographie ' lU-Wert f «\	-95,6°	CP -93,7° "«
Ib)	Elektrophorese"' Plm-Wert (Alanin = 1)	(a) 0,72 (b) 0,75	(a) 0,72 (b) 0,75
(6)	0,80	0,80

OO ■CD

- 26 -

Fußnote:

1) (a) Silica Gel G (Warenzeichen für ein Adsorptionsmittel für die Dünnschichtchromatographie aus Silicagel, hergestellt von Merck Inc., USA); Methanol/10% Ammoniumacetat/10% Ammoniak (10 : 9 : 1 V/V)

(b) Avicel SF (Warenzeichen für ein Adsorptionsmittel für die Dünnschichtchromatographie aus kristalliner Cellulose, hergestellt von FMC Corporation, USA); n-Propanol/Pyridin/Essig-

⁰⁰ säure/Wasser (15 : 10 : 3 : 12). ο

S 2) Avicel SF; Ameisensäure/Essigsäure/Wasser (25 : 75 : 900 V/V); 800 V; 15 min.

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Tabelle IX - Physikalisch-chemische Eigenschaften von NK63I (kupferfreie Form)

Dihydrochlorid

Monosulfat

Di-(essigsaure)-salz

(1) Aussehen

hell-gelblich weißes amorphes Pulver

(2) Löslichkeit

löslich in Wasser, Methanol, Essigsäure, löslich in Dioxan; unlöslich in Äthanol,

DMSO, DMF; geringfügig Aceton, Äther, Benzol.

(3) Schmelzpunkt (Zers.), C

bis 197

bis 198

188 bis

O (O OO

(4) spezifische Drehung (destilliertes Wasser, c = 1,0)

⁰^ (5) DUnnschichtchromatographie

-2,1

-2,0^c

-2,O^C

Rp-Wert

(6) Elektrophorese²'

Rt (Alanin =1,0)

(a) 0,56 (b) 0,70

0,94

Fußnote:

1) (a) Silica Gel G; Methanol/10% Ammoniumacetat/10% Ammoniak (10 : 9 : 1 V/V) (b) Avicel SF; n-Propanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser (15 : 10 : 3 : 12)

2) Avicel SF; Ameisensäure/Essigsäure/Wasser (25 : 75 : 900 V/V); 800 V; 15 min

3a 2828133

In den beigefügten Zeichnungen zeigen die Figuren 1 und 2 die Ultraviolettabsorptionskurven des erfindungsgemäßen Bleomycins NK631 und die Figuren 3 und 4 zeigen die Infrarotabsorptionskurven von NK63I.

Die Figur 1 zeigt somit die Ultraviolettabsorptionskurve von 3-[(S)-1'-PhenyläthylaminoJ-propylaminobleomycin-dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form). Die Figur 2 zeigt die Ultraviolettabsorptionskurve von 3-[(s)-1'-Phenyläthylaminoj-propylaminobleomycin-monosulfat (kupferfreie Form). Die Figur 3 zeigt die Infrarotabsorptioiiskurve von 3-[(S)-1 '-Phenyläthylaminojpropylaminobleomycin-dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form), gemessen in Form einer Kaliumbromidtablette, und die Figur 4 zeigt die Infrarotabsorptionskurve von 3-[(S)-1^f-Phenyläthylamino]-propylaminobleomycin (kupferfreie Form), gemessen in Form einer Kaliumbromidtablette.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Beispiel 1

Synthese des DihydroChlorids (Kupfer enthaltende Form) und des Monosulfats (kupferfreie Form) von NK63I:

Stufe A: In 400 ml Dimethylformamid wurden 15,0 g Bleomycinsäure (Kupfer enthaltende Form) gelöst. Zu dieser Lösung wurden, während sie durch Kühlen bei O⁰C gehalten wurde, 1,1 ml N-Methylmorpholin und 10,3 g CCBT gegeben. Das Gemisch wurde 5 min bei 0⁰C gerührt und sodann wurden 5»3 g der Aminoverbindung zugemischt. Es wurde 1 h" lang weiter gerührt. Nachdem die Umsetzung durch Zugabe von 200.ml einer 25%igen wäßrigen Essigsäurelösung beendigt worden war, wurde das Reaktionsgemisch; .mit 5 1 kalten Acetons vermischt, um. das Reaktionsprodukt zur Ausfällung zu bringen-. .Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen

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" 2828833

und in 500 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die resultierende wäßrige Lösung wurde sofort auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und in eine Säule gegossen, die 2 1 CM-Sephadex C-25 (vom NH^⁺-Typ), gepackt in eine 0,05M-wäßrige Ammoniumchloridlösung, enthielt, um die Bleomycine zu adsorbieren.

Mit einer wäßrigen Ammoniumchloridlösung wurde die Elution durchgeführt, indem durch die Säule 20 1 des Elutionsmittels durchgeleitet wurden, bei dem die Konzentration von Ammoniumchlorid kontinuierlich von 0,05 auf 1,OM erhöht wurde. Die nicht-umgesetzte Bleomycinsäure wurde in dem Abstrom bei einer Ammoniumchloridkonzentration von etwa 0,05M festgestellt. Das NK631 wurde bei einer Ammoniumchloridkonzentration von etwa 0,45M festgestellt. Beide Fraktionen, die eine UV-Absorption bei 292 mu zeigten, wurden gesondert gesammelt. Die das NK631 enthaltende Fraktion wurde in eine Harzsäule gegossen, die 2,6 1 Amberlite XAD-2 enthielt. Die Säule wurde sodann gründlich mit Wasser gewaschen und mit 0,01N-SaIzsäure in Methanol/ Wasser (4 : 1 V/V) eluiert. Insgesamt 2,5 1 der blauen Fraktion, die eine UV-Absorption bei 292 mu zeigte, wurden gesammelt. Nach Abdampfen des Methanols aus der eluierten Fraktion wurde das Konzentrat mit Dowex 44 (OH~-Typ) (Warenzeichen für ein Anionenaustauscherharz, bestehend aus einem Copolymeren von Epichlorhydrin und Ammoniak, hergestellt von Dow Chemical Co., USA) auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Das Filtrat wurde gefriergetrocknet, wodurch 16,1 g (Ausbeute 92%) NK63I-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers erhalten wurden.

Durch eine ähnliche Behandlung wurden 280 mg nicht-umgesetzte Bleomycinsäure (Kupfer enthaltende Form) gewonnen.

Die Ultraviolettabsorptionsmaxima und die antimikrobielle Aktivität des NK63I-Dihydrochloride (Kupfer enthaltende Form)

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sind nachfolgend angegeben.

UV-Absorptionsmaxima:

19^

mn (Ey„, destilliertes Wasser)

/ ι ein

242 (151)

292 (121)

Antimikrobielle Aktivität: 8100 u/mg

(Fußnote: Die antimikrobielle Aktivität -wurde unter Verwendung von Mycobacterium smegmatis ATCC 607 als Testorganismus bestimmt. Die Aktivität von Bleomycin Ap (kupferfreie Form) wurde als 1000 u/mg angesetzt. Das Gleiche gilt für die späteren Ausführungen).

Stufe B:. In 200 ml destilliertem Wasser wurden 10,0 g NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Die Lösung wurde in eine Säule gegossen, die 600 ml Amberlite XAD-2, gepackt in destilliertes Wasser, enthielt. Die Säule wurde sodann nacheinander mit 2 1 einer wäßrigen Lösung, die 5% EDTA.Nap enthielt, 2,5 1 einer 5/<5lgen wäßrigen Natriumsulfatlösung und 630 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die Säule wurde sodann mit 0,0025N-Schwefelsäure in einem Methanol/Wasser-Gemisch (1 : 1 V/V) eluiert. Insgesamt 900 ml Fraktionen, die eine Substanz enthielten, welche eine UV-Absorption bei 290 mu zeigte, wurden gesammelt. Nach dem Abdestillieren des Methanols wurde die zurückgebliebene Flüssigkeit mit Dowex 44 (OH~-Typ) auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und gefriergetrocknet, wodurch 9,3 g (Ausbeute 95/0 von NK63I-Monosulfat (kupferfreie Form) in Form eines hell-gelblich weißen amorphen Pulvers erhalten wurden. Dieses Produkt zeigte ein UV-Absorptionsmaximum und eine antimikrobielle Aktivität wie folgt:

UV-Absorptlonsmaximum:

nyi (E^_cm 0,1N-HCl)

290 (106)

Antimikrobielle Aktivität: 7865 u/mg

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Beispiel 2

Synthese von NK63I -DihydroChlorid (Kupfer enthaltende Form):

In 40 ml destilliertem Wasser wurden 1,5 g Bleomyclnsäure (Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Zu der gerührten Lösung wurden bei 26°C 800 mg NEPIS gegeben, wobei der pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zugabe einer 0,1N-wäßrigen Natriumhydroxidlösung bei 4,8 bis 5,5 gehalten wurde. Nach 30 min wurde zu dem Gemisch eine Lösung gegeben, die in der Weise hergestellt worden war, daß 1,8 g der Aminoverbindung in 20 ml destilliertem Wasser aufgelöst wurden und mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt wurde. Das Gemisch wurde 26 h bei 26°C stehen gelassen. Zu dem Reaktionsgemisch wurden sodann unter Rühren 600 ml kaltes Aceton gegeben, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst und sofort mit O,1N-Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde nach der Verfahrensweise der Stufe A des Beispiels 1 gereinigt, wodurch 932 mg (Ausbeute 53%) NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers mit einer antimikrobiellen Aktivität von 8073 u/mg erhalten wurden.

Beispiel 3

Synthese von NK631-Dihydrochlorld (Kupfer enthaltende Form):

In 40 ml Dimethylsulfoxid wurden 1,5 g Bleomycinsäure (Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Zu der gerührten Lösung von 30 C wurden 740 mg N-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-1,2-dihydrochinolin und 0,1 ml N-Methylmorpholin gegeben. Zu dem Gemisch, das 30 min gerührt worden war, wurden unter Rühren 530 mg der Aminoverbindung gegeben und das Gemisch wurde 3 h lang bei 30⁰C stehen

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gelassen« Das Reaktionsgemisch wurde sodann unter Rühren mit 600 ml kaltem Aceton versetzt, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst und sofort mit 0,1N-SaIzsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde in ähnlicher Weise wie in Stufe A des Beispiels 1 behandelt, wodurch 809 mg (Ausbeute 46$) NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers erhalten wurden, das eine antimikrobiell Aktivität von 8028 u/mg zeigte.

Beispiel 4

Synthese von NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form):

In 40 ml destilliertem Wasser wurden 1,5 g Bleomycinsäure (Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Nach Zugabe von 1,2 g 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid von 27⁰C wurde das Gemisch mit 0,1 N-SaIzsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt. Nach Zugabe von 530 mg der Aminoverbindung wurde das Gemisch erneut mit 1N-Salzsäure auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt und 20 h lang bei 27⁰C stehen gelassen. Zu dem Reaktionsgemisch wurden unter Rühren 400 ml kaltes Aceton gegeben, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst und sofort mit 0,1N-Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde nach der Arbeitsweise der Stufe A des Beispiels 1 gereinigt, wodurch 440 mg (Ausbeute 25%) NK631 -Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers erhalten wurden, das eine antimikrobielle Aktivität von 7985 u/mg hatte.

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Beispiel 5

Synthese von NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form):

In 16 ml Methanol wurden 9,0 g Bleomycinsäure-3-N-benzoylaminopropylester-monohydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Unter Kühlen auf 0⁰C wurde die Lösung mit 9,16 g der Aminoverbindung versetzt. Nach weiterem 40-stündigen Rühren bei O⁰C wurde kaltes Aceton zu dem Reaktionsgemisch gegeben, um die Reaktionsprodukte auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen und in 300 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde sofort mit O,1N-Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und in eine Säule gegossen, die 1 1 CM-Sephadex C-25 (NH^-Typ), gepackt in 0,05M-wäßrige Ammoniumchloridlösung, enthielt, um die Bleomycine adsorbieren zu lassen. Unter Verwendung von wäßriger Ammoniumchloridlösung als Elutionsmittel wurde die Elution durchgeführt, wobei durch die Säule 10 1 eines Elutionsmittels geleitet wurden, bei dem die Konzentration von Ammoniumchlorid kontinuierlich von 0,05 auf 1,OM erhöht wurde. Der nicht-umgesetzte 3-N-Benzoylaminopropylester der Bleomycinsäure wurde in dem Abstrom bei einer Ammoniumchloridkonzentration von etwa 0,214 festgestellt. Das NK631 wurde bei einer Ammoniumchloridkonzentration von etwa 0,45M festgestellt. Beide Fraktionen, die eine UV-Absorption bei 272 mu zeigten, wurden gesondert gesammelt. Die NK63I enthaltende Fraktion wurde in eine Harzsäule gegossen, die 1,3 1 Amberlite XAD-2 enthielt. Die Säule wurde sodann gründlich mit Wasser gewaschen und mit 0,01N-Salzsäure" in einem Methanol/Wasser-Gemisch (4 : 1 V/V) eluiert. Insgesamt 2,5 1 der blauen Fraktion, die eine UV-Absorption bei 292 mu zeigte, wurden gesammelt. Nachdem das Methanol abdestilliert worden war und der pH-Wert mit Dowex 44 (OH~-Typ) auf 6,0 eingestellt worden war, wurde die Fraktion gefriergetrocknet, wodurch 8,2 g (Ausbeute 90%) NK631-DihydroChlorid

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(Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers erhalten wurden, das eine antimikrobiell Aktivität von 8030 u/mg hatte.

Durch eine ähnliche Behandlung wurden 910 mg nicht-umgesetztes Bleomycinsäure-3-N-benzoylaminopropylester-monohydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) gewonnen.

Beispiel 6

Synthese von NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form):

In 3 ml Methanol wurden 950 mg Bleomycinsäure-3-N-p-toluolsulfonylaminopropylester-monohydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Zu der Lösung wurden unter Rühren bei 0⁰C 980 mg der Aminoverbindung gegeben und das Gemisch wurde 48 h bei 0⁰C gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wurden unter Rühren 15 ml kaltes Aceton gegeben, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst und sofort mit 0,1 N-SaIzsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Die resultierende Lösung wurde nach der Verfahrensweise der Stufe A des Beispiels 5 gereinigt, wodurch 833 mg (Ausbeute 8596) NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers erhalten wurden, das eine antimikrobielle Aktivität von 8010 u/mg hatte.

Beispiel 7

Synthese von NKöSI-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form):

In 5 ml Dimethylformamid wurden 850 mg Bleomycinsäure-3-acetylaminopropylester-monohydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Zu der Lösung wurden unter Rühren bei O⁰C 950 mg

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der Aminoverbindung gegeben und das Gemisch wurde 45 h bei 0⁰C gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wurden unter Rühren 20 ml kaltes Aceton zugesetzt, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst und sofort mit O,1N-Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Die resultierende Lösung wurde in der gleichen Weise wie in Stufe A des Beispiels 5 behandelt, wodurch 570 mg (Ausbeute &5%) NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers mit einer antimikrobiellen Aktivität von 8010 u/mg erhalten wurden.

Beispiel 8

Synthese von NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form):

In 3 ml Dimethylsulfoxid wurden 900 mg Bleomycinsäure-3-N-(2,4-dinitrophenyl)-aminopropylester-monohydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Zu der Lösung wurden unter Rühren bei O⁰C 793 mg der Aminoverbindung gegeben und das Gemisch wurde 24 h bei O⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rühren mit 15 ml kaltes Aceton versetzt, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst und sofort mit O,1N-Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde nach der Verfahrensweise der Stufe A des Beispiels 5 gereinigt, wodurch 690 mg (Ausbeute 78%) NK631 -Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers mit einer antimikrobiellen Aktivität von 8010 u/mg erhalten wurden.

Beispiel 9

Synthese von NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) und des kupferfreien Dihydrochlorids:

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In 10 ml Methanol wurden 1,0 g Bleonycinsäure-3-aminopropyle5ter-dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Die heftig gerührte Lösung wurde tropfenweise mit 104 mg Benzoylchlorid im Verlauf von 30 min versetzt, wobei der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von 1,4-Diazabicyclo-[2,2,2]-octan bei 6,5 bis 7,5 gehalten wurde. Nach weiterem 30-minütigen Rühren wurde das Reaktionsgemisch auf 2 ml konzentriert. Zu dem konzentrierten Material, das auf 0⁰C abgekühlt war, wurden unter Rühren 1,1 g der Aminoverbindung gegeben und das Gemisch wurde 72 h bei 0⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rühren mit 6 ml kaltes Aceton versetzt, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst und sofort mit 0,1N-SaIzsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde in eine Säule gegossen, die 100 ml CM-Sephadex (NH^⁺-Typ), gepackt in eine 0,05M-wäßrige Ammoniumchloridlösung, enthielt, um die Bleomycinkomponenten adsorbieren zu lassen. Das adsorbierte Material wurde in ähnlicher Weise wie in Stufe A des Beispiels 5 behandelt, wodurch 779 mg (Ausbeute 73%) NK631-DihydroChlorid (Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers mit einer antimikrobiellen Aktivität von 8000 u/mg erhalten wurden.

Zusätzlich wurden 240 mg nicht-umgesetztes Bleomycinsäure-3-N-benzoylaminopropylester-monohydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) wiedergewonnen.

Stufe B: In 20 ml destilliertem Wasser wurden 700 mg NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form), erhalten in Stufe A oben, aufgelöst. Die Lösung wurde in eine Säule gegossen, die 65 ml Diaion HP-40, gepackt in destilliertes Wasser enthielt, um die Bleomycinkomponenten adsorbieren zu lassen. Die Säule wurde sodann mit 200 ml einer wäßrigen Lösung, die 5% EDTA.Na₂

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enthielt, sodann mit 250 ml einer 5%igen wäßrigen Natriumchloridlösung und schließlich mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die Säule wurde sodann mit einem Gemisch aus Methanol und 0,0025N-wäßriger Salzsäure (1:1 V/V) eluiert. 98 ml einer Fraktion mit einer Ultraviolettabsorption bei 290 m u wurden gesammelt. Nach dem Abdestillieren des Methanols bei vermindertem Druck wurde die zurückgebliebene Flüssigkeit mit Dowex 44 (OH""-Typ) auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und gefriergetrocknet, wodurch 658 mg (Ausbeute" 98%) NK631-Dihydrochlorid (kupferfreie Form) in Form eines hell-gelblich weißen amorphen Pulvers mit einer antimikrobiellen Aktivität von 7834 u/mg erhalten wurden.

Beispiel 10

Synthese von NK63I-Monosulfat (Kupfer enthaltende Form) und des Diessigsäuresalzes (kupferfreie Form):

Stufe A: In 10 ml Methanol wurden 1,0 g Bleomycinsäure-3-aminopropylester-dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Die heftig gerührte Lösung wurde bei Raumtemperatur tropfenweise mit 104 mg Benzoylchlorid im Verlauf von 30 min versetzt, während der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von N-Methylmorpholin bei 5,0 bis 7,5 gehalten wurde. Nach weiterem 30-minütigen Rühren wurde das Reaktionsgemisch mit 50 ml Aceton versetzt, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen und erneut in 3 nil Methanol aufgelöst. Zu der Methanollösung wurden unter Kühlen-auf O⁰C und Rühren 597 mg Aminoverbindung gegeben und das Gemisch wurde 42 h bei 0⁰C gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wurden unter Rühren 10 ml kaltes Aceton gegeben, um das Reaktionsprodukt zur Ausfällung zu bringen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst und

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sofort mit O,1N-Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Die wäßrige Lösung wurde mit CM-Sephadex in ähnlicher Weise wie in Stufe A des Beispiels 5 behandelt. Die Fraktion, die die Reaktionsprodukte enthielt, wurde in eine Säule gegossen, die 65 ml Diaion HP-40- gepackt in destilliertes Wasser, enthielt, um die Bleomycinkomponenten auf dem Harz adsorbieren zu lassen. Nach dem Waschen mit Wasser wurde die adsorbierte Phase mit einem Gemisch aus Methanol und 0,01N-wäßrige Schwefelsäure (1 : 1 V/V) eluiert. 130 ml einer Fraktion, die eine Ultraviolettabsorption bei 292 mii zeigte, wurden gesammelt. Nach dem Abdestillieren des Methanols wurde die zurückgebliebene Flüssigkeit mit Dowex 44 (OH~-Typ) auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und gefriergetrocknet, wodurch 813 mg (Ausbeute 75%) NK631-Monosulfat (Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers mit einer antimikrobiellen Aktivität von 7819 u/mg erhalten wurden.

Stufe B: Die Kupferentfernungsbehandlung von 800 mg des NK631-Monosulfate (Kupfer enthaltende Form), erhalten in Stufe A oben, wurde in der gleichen Weise wie in Stufe B des Beispiels 9 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß in der Elutionsstufe eine 5%ige wäßrige Ammoniumacetatlösung und ein Gemisch aus ^wethanol und 0,01N-wäßrige Essigsäure (1:1 V/V) anstelle der 59&Lgen wäßrigen Natriumchloridlösung bzw. des Gemisches aus Methanol und 0,0025N-wäßriger Salzsäure (1 : 1 V/V) verwendet wurden. Auf diese Weise wurden 748 mg (Ausbeute 96?6) NK631-Diessigsäuresalz (kupferfreie Form)' in Form eines hell-gelblich weißen amorphen Pulvers erhalten. Das UV-Absorptionsmaximum und die antimikrobielle Aktivität dieses Produkts sind wie folgt:

UV-Absorptionsmaximum:

m/i (E^_cm 0,1N-HCl)

290 (105)

Antimikrobielle Aktivität: 7620 u/mg.

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Beispiel 11

In 3 ml Methanol wurden 1,0 g Bleomycinsäure-3-aminopropylester-dihydrochlorid aufgelöst. Die Lösung wurde tropfenweise bei Raumtemperatur mit 193 mg S-tert.-Butoxycarbonyl^jö-dimethyl-2-mercaptopyrimidin im Verlauf von 60 min versetzt, während der pH-Wert durch Zugabe von 14% Triäthylamin in Methanol bei 6,0 bis 7,4 gehalten wurde. Das Gemisch wurde weitere 2 h gerührt, wodurch der,3-N-tert.-Butoxycarbonylaminopropylester der Bleomycinsäure erhalten wurde. Das Gemisch wurde sodann auf O⁰C abgekühlt, mit 1,2 g der Aminoverbindung vermischt und 70 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 10 ml kaltem Aceton versetzt, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst und sofort mit 0,1N-SaIzsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde nach der Verfahrensweise der Stufe A des Beispiels 5 gereinigt, wodurch 597 mg (Ausbeute 56%) NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers mit einer antimikrobiellen Aktivität von 8010 u/mg erhalten wurden.

Stufe Bi In 50 ml Methanol vfurden 500 mg NKöSI-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form), erhalten in Stufe A oben, aufgelöst. In die heftig gerührte Lösung wurde Schwefelwasserstoff durch eine Düse mit einem Innendurchmesser von 1 mm, die in. die Lösung eingetaucht war, 1 h lang eingeleitet, um einen, großen Überschuß von Schwefelwasserstoff in der Lösung aufzulösen. Nach Beendigung der Einführung von Schwefelwasserstoff wurde die Lösung 30 min bei Raumtemperatur stehen gelaasen. Das ausgefällte Kupfersulfid wurde abfiltriert und mit 50 ml

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her -

Methanol gewaschen, das mit Schwefelwasserstoff gesättigt war. Das Filtrat und die Waschwässer wurden kombiniert und von Methanol und Schwefelwasserstoff durchDestillation unter vermindertem Druck befreit. Der Rückstand wurde in 50 ml Methanol aufgelöst und mit 100 ml Ithyläther vermischt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Äther gewaschen und getrocknet, wodurch 394 mg (Ausbeute B2%) von NK631-Dihydrochlorld (kupferfreie Form) in Form eines hellgelblich weißen amorphen Pulvers mit einer antimikrobiellen Aktivität von 7820 u/mg erhalten wurden.

Beispiel 12

Stufe A: In 2 ml Methanol wurden 1,0 g Bleomycinsäure-3-aminopropylester-dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Zu der heftig gerührten Lösung von Raumtemperatur wurden 93 mg Salicylaldehyd gegeben, während der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von Triäthylamin bei 7,0 bis 7,4 gehalten wurde. Auf diese Weise wurde Bleomycinsäure-3-N-salicylideniminopropylester erhalten. Nach 1-stündigem weitergeführten Rühren wurde das auf 0⁰C abgekühlte Gemisch unter Rühren mit 600 mg der Aminoverbindung versetzt. Das Gemisch wurde 30 h lang gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 10 ml kaltes Aceton gegeben, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst und sofort mit 0,1N-SaIzsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Die resultierende wäßrige ösung wurde wie in Stufe A des Beispiels 5 gereinigt, wodurch 501 mg (Ausbeute 47?0 NK631-Dihydrocnlorid (Kupfer enthaltende Form) mit einer antimikrobiellen Aktivität von 8013 u/mg erhalten wurden.

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Stufe B: In 25 ml einer O,5N-wäßrigen Salzsäurelösung v/urden 450 mg NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form), erhalten in Stufe A oben, aufgelöst. Zu der Lösung wurden 25 ml einer Chloroformlösung, enthaltend O,2?6 Dithizon (Diphenylthiocarbazon) gegeben. Nach heftigem Schütteln und Mischen wurde das Gemisch stehen gelassen. Hierdurch schied sich das Gemisch in zwei Schichten ab. Die untere Schicht (Chloroformschicht) wurde abgezogen und die obere Schicht wurde mit 25 ml einer frischen Chloroformlösung, die Dithizon enthielt, vermischt. Die obigen Maßnahmen des Schütteins, der Phasentrennung und der Zugabe einer frischen Chloroformlösung, die Dithizon enthielt, wurde achtmal wiederholt. Schließlich wurde die obere Schicht (wäßrige Schicht) mit Chloroform gewaschen und die abgetrennte wäßrige Schicht wurde mit Dowex 44 (OH~-Typ) auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Die auf diese Weise behandelte wäßrige Schicht wurde bei vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wodurch 415 mg (Ausbeute 96%) NK631-Dihydrochlorid (kupferfreie Form) in Form eines hellgelben weißen amorphen Pulvers mit einer antimikrobiellen Aktivität von 7845 u/mg erhalten wurden.

Beispiel 13

Synthese von NK63I-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form):

In 2 ml Methanol wurden 1,0g Bleomycinsäure-3-aminopropylester-dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Zu der auf O⁰C abgekühlten Lösung wurden unter Rühren 1,0 g der Aminoverbindung gegeben und das Gemisch wurde weitere 72 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rühren mit 6 ml kaltem Aceton versetzt, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag wurde wie in Stufe A des Beispiels 5 gereinigt, wodurch 128 mg (Ausbeute 12#) ΝΚ631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen PuI-

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vers mit einer antimikrobiellen Aktivität von 8015 u/mg erhalten wurden.

Referenzbeispiel 1

Synthese von N-[(S)-1^f-Phenyläthyl]-1,3-dimainopropan:

Zu 50 g (S)-I-Phenyläthylamin von O⁰C wurden unter Kühlen 33 g Acrylnitril gegeben. Das Gemisch wurde in einen Kolben gebracht, der mit einem Rückflußkühler ausgestattet war, welcher an ein Calciumchloridrohr angeschlossen war. Das Gemisch wurde auf 93°C erhitzt, bei welcher Temperatur das Gemisch 18 h lang gerührt wurde. Nach beendigter Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch von überschüssigem Acrylnitril durch Destillation unter vermindertem Druck befreit. Der Rückstand wurde unter vermindertem Druck destilliert. Eine Fraktion mit einem Siedepunkt von 142 bis i45°C/7 mm Hg wurde gesammelt, wodurch 53,5 g 3-[(S)-I'-Phenyläthylamino]-propionitril erhalten wurden. Dieses Nitril wurde in einen Autoklaven zusammen mit 5 g Raney-Nickel W-7 und 50 ml Äthanol, das 15?o Ammoniak enthielt, gegeben. Das Gemisch wurde mit einer Geschwindigkeit von 1000 Upm 1,5 h lang bei 50 bis 58⁰C und bei einem Wasserstoffpartialdruck von 100 bis 40 kg/cm gerührt. Nach beendigter Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch bei vermindertem Druck destilliert. Eine Fraktion mit einem Siedepunkt von 95 bis 103°C/ 2 mm Hg wurde gesammelt, wodurch 48,3 g N-[(S)-1'-Phenyläthyl]-1,3-dimainopropan erhalten wurden [66% theoretische Ausbeute von (S)-I-Phenyläthylamin].

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Claims

KRAUS & WEISERT

DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-INS. ANNEKÄTE WEISERT D1PL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 ■ TELEFON O89/797O77-79 7O78 · TELEX OS-212156 kpnt d

TELEGRAMM KRAUSPATENT

-JC-

Patentansprüche

3-C(S)-I¹ -Phenyläthylamiilo ]-propylaminobleomycin der Formel:

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ORIGINAL INSPECTED

• 09l81/t13S "\

und die nicht-toxischen Salze davon.

2« 3-[(S)-1'-Phenyläthylaminoj-propylaminobleomycin und

die nicht-toxischen Salze davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-toxische Salz das Hydrochlorid, Sulfat oder Essigsäuresalz ist.

3. Verfahren zur Herstellung von 3-[(S)-1'-Phenyläthylami

no ]-propylaminobleomycin der Formel:

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2828333

O= ü

ta

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und der nicht-toxischen Salze davon, dadurch gekennzeichnet, daß man ein reaktives Derivat der Carboxylgruppe der Bleomycinsäure der Formel:

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2628933

ο ι

O=D

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mit N-[(S)-I'-Phenyläthyl]-1,3-diaminopropan in einem Lösungsmittel umsetzt und erforderlichenfalls das Produkt in ein nicht-toxisches Salz umwandelt.

4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-toxische Salz das Hydrochlorid, Sulfat oder Essigsäuresalz ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das reaktive Derivat der Carboxylgruppe der Bleomycinsäure in der Weise herstellt, daß man eine Verbindung aus der Gruppe 6-Chlor-i-p-chlorbenzolsulfonyloxybenzotriazol, N-Äthyl-5-phenylisooxazolium-3'-sulfonat, N-tert.-Butyl-5-methylisooxazoliumperchlorat, N-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-1,2-dihydrochinolin, Di-p-nitrophenylsulfit, Tri-pnitrophenylphosphit, p-Nitrophenyltrichloracetat, N-Hydroxysuccinimid, Dicyclohexylcarbodiimid, 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid, Diphenylcarbodiimid, Di-p-toluylcarbodiimid, Diisopropylcarbodiimid, p-Nitrophenol, Pentachlorphenol und Benzylalkohol verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als reaktives Derivat der Carboxylgruppe der Bleomycinsäure den 3-Aminopropylester verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als reaktives Derivat der Carboxylgruppe der Bleomycinsäure den N-monosubstituierten 3-Aminopropylester verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als N-monosubstituierten 3-Aminopropylester einen Ester aus der Gruppe 3-Acetylaminopropyl-

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ester, 3-Succinylaminopropyleßter, 3-Benzoylaminopropylester, 3-Benzylaminopropylester, 3-p-Toluolsulfonylaminopropylester, 3-(2,4-Dinitrophenyl)-aminopropylester, 3-(3,5-Dimethyl-3-oxocyclohexen-1-yl)-aminopropylester, 3-(tert.-Butoxycarbonyl)-aminopropylester und 3-(Salicyliden)-iminopropylester verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man 1 bis 10 Äquivalente von N-[(S)-1^!- Phenyläthyl]-1,3-diaminopropan pro 1 Äquivalent Bleomycinsäure einsetzt.

10. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man die Bleomycinsäure und das N-[(S)-1^f-Phenylethyl]-1,3-diaminopropan 1 bis 24 h lang bei 0 bis 30⁰C reagieren läßt.

11. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man 1 bis 10 Äquivalente N-[(S)-1'-Phenyläthyl]-1,3-diaminopropan pro 1 Äquivalent Bleomycinsäure-3-aminopropylester oder eines N-monosubstituierten Derivats davon einsetzt.

12. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den Bleomycinsäure-3-aminopropylester oder ein N-monosubstituiertes Derivat davon und das N-[(S)-1«-Phenyläthyl]-1,3-diaminopropan 1 bis 72 h lang bei 0 bis 80⁰C reagieren läßt.

13. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel Wasser, Methanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder ein Gemisch davon verwendet.

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14. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet , daß es neben üblichen Hilfs- und Trägerstoffen 3-[(S)-1^!- Phenyläthylaminoj-propylaminobleomycin oder ein nicht-toxisches Salz davon enthält.

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