DE2828933A1 - 3- eckige klammer auf (s)-1'-phenylaethylamino eckige klammer zu -propylaminobleomycin, verfahren zu seiner herstellung und diese verbindung enthaltendes arzneimittel - Google Patents
3- eckige klammer auf (s)-1'-phenylaethylamino eckige klammer zu -propylaminobleomycin, verfahren zu seiner herstellung und diese verbindung enthaltendes arzneimittelInfo
- Publication number
- DE2828933A1 DE2828933A1 DE19782828933 DE2828933A DE2828933A1 DE 2828933 A1 DE2828933 A1 DE 2828933A1 DE 19782828933 DE19782828933 DE 19782828933 DE 2828933 A DE2828933 A DE 2828933A DE 2828933 A1 DE2828933 A1 DE 2828933A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- ester
- copper
- acid
- bleomycin
- aminopropyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K9/001—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure
- C07K9/003—Peptides being substituted by heterocyclic radicals, e.g. bleomycin, phleomycin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/19—Antibiotic
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/27—Cyclic peptide or cyclic protein
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
j PATENTANWÄLTE A Q A 9 V V «J
DR. WALItR KRAUS DIPLOMCHEMIKER ■ DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE
IRMGARDSTRASSE 15 · D-SOOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077-797078 ■ TELEX O5-212156 kpat d
AO
1914 WK/rm
NIPPON KAYAKU KABUSHIKI KAISHA Tokyo / Japan
3-C(S)-I'-PhenyläthylaminoJ-propylaminobleomycin, Verfahren
zu seiner Herstellung und diese Verbindung enthaltendes
Arzneimittel
809881/1135
Die Erfindung betrifft eine neue Bleomycinverbindung, ihre
nicht-toxischen Salze und ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen Bleomycinverbindung. Die Erfindung betrifft insbesondere 3-[(S)-I'-Phenyläthylamino]-propylaminobleomycin der Formel:
nicht-toxischen Salze und ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen Bleomycinverbindung. Die Erfindung betrifft insbesondere 3-[(S)-I'-Phenyläthylamino]-propylaminobleomycin der Formel:
809881/1 135
.- ι
O=O
809881/1135
und die nicht-toxischen Salze davon sowie ein Verfahren zur
Herstellung dieses neuen Bleomycins.
Bleomycine sind karzinostatische Antibiotika, die von Umezawa
et al entdeckt wurden [Journal of Antibiotics, 19A. 200 (1966)].
Es handelt sich um wasserlösliche basische Glycopeptide, die durch Actinomycete Streptomyces verticillus erzeugt werden.
Diese Verbindungen sind dazu imstande, leicht ein Atom von zweiwertigem Kupfer zu chelieren. Bei der normalen Kultivierung
werden 16 Komponenten von Bleomyeinen erzeugt und isoliert
[vgl. z.B. Umezawa et al., Journal of Antibiotics, 19A. 210 (1966)]. Von den Bleomycinen wird ein Gemisch von kupferfreiem
A1, Ap, Ac, Bp und Demethyl-Ap (nachstehend als Bleomycinkomplex
bezeichnet) im weiten Ausmaß in der Klinik zur Therapie von Krebs verwendet. Dieses Gemisch hat sich als besonders
erfolgreich bei der Therapie von schuppigem Zellenkarzinom als Hauptziel, von Hautkrebs, Kopf- und Nackenkrebs, des Gebärmutterhalses,
von Lungenkrebs und von malignem Lymphom erwiesen.
Was die Nebenwirkungen anbelangt, so sind jedoch Fälle von
Lungenfibrose und anderen unerwünschten Zuständen berichtet
worden. Von den Nebenwirkungen der Bleomycine ist die am meisten gefürchtete Nebenwirkung die Lungenfibrose. Es ist sehr
leicht vorstellbar, daß die karzinostatische Aktivität der Bleomycine
in der Klinik wirksamer ausgenützt werden könnte, wenn
die obengenannte Nebenwirkung mehr oder weniger vermindert werden könnte.
Über Jahre wurde daher die Synthese von verschiedenen Bleomycinen untersucht. Bei verschiedenen Tieren wurden Tests hinsichtlich
der karzinostatischen Aktivität und der Toxizität mit
Einschluß der Lungenfibrose als Haupttestgesichtspunkt durchgeführt. Als Ergebnis wurde gefunden, daß bei 3-[(S)-1f-Phenyl-
1/11
Ab
ethylamino]-propylaminobleomycin (nachstehend als "NK631" abgekürzt,
und zwar mit Einschluß sowohl der Kupfer enthaltenden als auch der kupferfreien Formen), nämlich einem neuen
Bleomycin, das durch Umsetzung eines reaktiven Derivats der Carboxylgruppe von Bleomycinsäure mit N-[(S)-I *-Phenylethyl]-1,3-diaminopropan
erhalten wird, die Nebenwirkung der Lungenfibrose
ausgeprägt vermindert wird und daß im Vergleich zu einem handelsüblichen Bleomycinkomplex und anderen bekannten
Bleomycinen die karzinostatische Aktivität nicht verringert ist.
Die ausgezeichnete Bioaktivität des erfindungsgemäßen Bleomycins der Formel I wird nachstehend anhand der Versuchsbeispiele
näher erläutert.
Die Bioaktivität von NK631 wurde hinsichtlich der folgenden vier Testgesichtspunkte untersucht, wobei ein Vergleich mit
einem handelsüblichen Bleomycinkomplex und 3-[(R,S)-1'-Phenyläthylaminoj-propylaminobleomycin-monosulfat
(kupferfreie Form) (nachstehend als "RS-Form" bezeichnet) durchgeführt wurde. Die
RS-Form wurde durch ein Fermentationsverfahren gemäß der US-PS 3 846 400 erhalten.
1. Lungenfibrose
2. Antitumoraktivitat
3. antimikrobiell Aktivität
4. Toxizität.
1. Toxizität gegenüber der Lunge von Mäusen (Fibröse):
Mäuse vom ICR-Stamm (männlich, Alter 15 Wochen), 12 Stück pro
Gruppe, wurden bei diesem Test verwendet. Die Dosis jeder pharmazeutischen
Testzubereitung betrug 5 mg/kg. Die Dosis wurde
80S881/113S
durch intraperitoneale Injektion einmal täglich über 10 aufeinanderfolgende
Tage lang verabreicht. Nach der Verabreichung wurden die Mäuse 5 Wochen lang aufgezogen. Nach der Beobachtung
wurden die Mäuse getötet und einer Autopsie unterworfen, um das Ausmaß der Lungenfibrose zu bestimmen. Das Auftreten
und der Grad der Lungenfibrose bei den Mäusen, die das neue erfindungsgemäße Bleomycin, einen handelsüblichen Bleomycinkomplex
und die RS-Form erhalten hatten, wurden miteinander verglichen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.
809881/1135
Auftreten Grad
Anzahl der Mäuse mit Lungenfibrose
relativer Wert Gesamtbewertung* der Lungenfibrose/Gesamtzahl
der Proben
relativer Wert
NK631-Mono sulfat
(kupferfreie Form)
(kupferfreie Form)
RS-Form
OO O |
Bleomycinkomplex | Punkte: |
CO | Punkt : | |
OO OO |
Fußnote: * O | Punkte: |
—A •ν. |
1 | Punkte: |
co | 2 | Punkte: |
cn | 4 | |
6 | ||
4/12 (0,33)
7/12 (0,58) 11/12 (0,92)
0,36
0,63 1,0 6/36 (0,17)
12/36 (0,33)
24/36 (0,67)
24/36 (0,67)
0,25
0,49
0,49
1,0
keine Fibröse
Ansammlung von Exudat in den Lungenbläschen und fibroseartige Veränderungen
im Alveolar-Septum
Fibröse in mehreren Bereichen
gestreute Fibröse
Fibröse in mehr als zwei Dritteln des Gesamtbereichs
NJ OO CD CJ CO
Aus den oben angegebenen Ergebnissen wird ersichtlich, daß
im Vergleich zur RS-Form und zum Bleomycinkomplex die auf NK631-Monosulfat (kupferfreie Form) zurückzuführende Fibröse
im Auftreten auf etwa 1/2 bzw. 1/3 und im Grad auf etwa 1/2 bzw. 1/4 vermindert worden war. Dies weist auf die Einsetzbarke
it von NK63I-Monosulfat in der Klinik hin.
2. Antitumoraktivitat:
2-1. Wirkung auf kultivierte HeLa-S^-Zellen:
Die IDj-Q-Werte für jedes Bleomycin wurden aus der prozentualen
Wachstumshemmung in 72 h Kultivierung in Gegenwart von jedem Bleomycin errechnet. Der ID^Q-Wert für NK631 wurde als
0,82 mcg/ml ermittelt. Dies steht einem Wert von 1,70 mcg/ml
für den Bleomycinkomplex gegenüber, was darauf hinweist, daß KK631 das Zellwachstum zweimal so stark hemmt wie der Bleomycinkomplex.
Der IDj-Q-Wert für die RS-Form wurde als 0,80 mcg/ml
ermittelt, was darauf hinweist, daß der Hemmeffekt mit demjenigen von NK631-Monosulfat (kupferfreie Form) vergleichbar war.
2-2. Karzinostatische Aktivität beim Ehrlich-Krebs der Maus
(fester Tumor):
Jeweils 2 χ 10 Zellen wurden subkutan in den Leibbereich von
Mäusen vom ICR-Stamm (männlich, 6 Wochen alt) transplantiert. Nach 24 h erhielt jede Maus Testzubereitungen in der gleichen
Weise, wie oben unter 1-2 beschrieben. Am 15. Tag nach der subkutanen Transplantation wurden die Tumore von jeder Maus
herausgenommen und ihr Gewicht wurde mit demjenigen von Tumoren verglichen, welche sich in der Kontrollgruppe, die keine Behandlung
erfahren hatte, entwickelt hatten. Auf diese Weise wurde die prozentuale Hemmung bestimmt.
809881/1135
-Jg-
1&
Wie aus Tabelle II ersichtlich wird, ist die karzonostatische
Aktivität von NK631-Monosulfat (kupferfrei) mit derjenigen
der RS-Form vergleichbar, und sie ist etwa 1,4-mal so hoch wie diejenige des Bleomycinkomplexes.
Dosis mg/kg χ 10 |
Prozeni NK631-Monosulfat (Cu-frei) |
tuale Hemmui RS-Form |
,31 | ig Bleomycinkomplex |
2,7 | 84 | 78 | 67 | |
0,9 | 68 | 60 | 55 | |
0,3 | 39 | 51 | 49 | |
0,1 | 24 | 51 | 24 | |
0,03 | 19 | 13 | 21 | |
0 | 0 | 0 | 0 | |
ID50 mg/kg/Tag |
0,35 | 0 | 0,49 | |
2-3. Karzinostatische Aktivität gegen Ascites Hepatoma (Ascites-Typ)
bei Ratten:
Jeweils 1 χ 10 AH66-Zellen wurden intraperitoneal in Ratten
vom Donryu-Stamm transplantiert. Nach 24 h wurde die Testzubereitung
intraperitoneal einmal täglich über 10 aufeinanderfolgende Tage lang verabreicht. Während einer Periode von 30
Tagen nach der Transplantation wurde das Gewicht jeder Ratte und die Anzahl der toten und überlebenden Tiere bestimmt.
809881/1135
Tabelle III - Relativer Wert der mittleren Uberlebenstage
Dosis | NK631-Monosulfat | RS-Form | Bleomycinkomplex |
mg/kg χ 10 | (Cu-frei) | ||
3,12 | 296 | 298 | 241 |
1,56 | 269 | 257 | 257 |
0,78 | 216 | 196 | 145 |
0,39 | 163 | 149 | 116 |
0,19 | 116 | 121 | 110 |
0 | 100 | 100 | 100 |
Wie aus Tabelle III ersichtlich wird, war die Aktivität von NK631-Monosulfat (kupferfreie Form) gegenüber AH66-Ascites
Hepatoma mit derjenigen der RS-Form vergleichbar. Sie war bei jeder Dosis derjenigen des Bleomycinkomplexes überlegen.
2-4. Hemmaktivität gegen schwammiges Zellkarzinom bei der Maus, das durch 20-Methylcholanthren induziert wird
(nachstehend als »20-MCM abgekürzt):
Eine Acetonlösung von 20-MC wurde topisch auf den rasierten
Rücken von Mäusen vom ddy-Stamm (männlich, 10 Wochen alt) zweimal pro Woche über einen Zeitraum von 18 Wochen aufgebracht.
Nach 5 Wochen vom Beginn der 20-MC-Behandlung wurde die Testzubereitung
in einer Menge von 62,5 mcg/Maus intraperitoneal zweimal wöchentlich und über einen Zeitraum von 15 Wochen verabreicht.
Innerhalb der ersten Woche nach Beendigung der Verabreichung der Testzubereitung wurde der Bereich, wo das 20-MC
aufgebracht worden war, pathologisch auf das Auftreten einer Karzinogenese untersucht.
Wie aus Tabelle IV ersichtlich ist, sind NK631-Monosulfat (kupferfreie
Form) und die RS-Form geringfügig wirksamer als der Bleomycinkomplex bei der Hemmung der Karzinogenese, die auf
20-MC zurückzuführen ist.
809881/1135
- ier -
Mortalität
Auftreten einer Karzinogenese
prozentuale Hemmung
NK631-Monosulfat
(kupferfrei)
(kupferfrei)
RS-Form
Bleomycinkomplex
Kontrolle
1/12 1/12 2/12 1/24
5/11 (45,4)
5/11 (45,4)
5/10 (50,0)
20/23 (86,9)
47,8 47,8 42,5 0
Aus den obigen Ergebnissen wird ersichtlich, daß NK631-Monosulfat
(kupferfreie Form) im Vergleich zu einem handelsüblichen Bleomycinkomplex eine ausgeprägt überlegene Antitumoraktivität
besitzt.
Antimikrobiell Aktivität:
Die antimikrobielle Aktivität wurde nach der Schalenmethode gegen Mycobacterium 607 und Bacillus subtilis PCI unter Verwendung
von Bleomycin A2 als Standard (1000 U/mg) getestet. Die
erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt.
Tabelle V | M. 607 | B. Sub. | |
7848 7535 1234 |
1550 1400 886 |
||
m | |||
NK631-Monosulfat RS-Form Bleomycinkomplex |
(Cu-frei) | ||
Wie aus Tabelle V ersichtlich wird, zeigen das NK63I-Monosulfat
(kupferfreie Form) und die RS-Form eine weitaus bessere antimikrobielle Aktivität als der Bleomycinkomplex.
809881/1135
Toxizität:
4-1. Akute Toxizität bei intraperitonealemWeg (LD50) bei
Ratten:
Wie aus Tabelle VI hervorgeht, ist der LD5Q-Wert von NK631-Monosulfat
(kupferfreie Form) bei Ratten ungefähr vergleichbar zu demjenigen des Bleomycinkomplexes und der RS-Form.
Vertrauensgrenzen (Signifikanzwert von 5%)
Ratte
NK63I-Monosulfat
(kupferfrei)
RS-Form
Bleomycinkomplex
Bleomycinkomplex
155,0 150,6 168,0
133,6 bis 179,8 129,0 bis 170,6 130,0 bis 217,0
4-2. Subakute und chronische Toxizität bei Ratten und Hunden:
NK631-Monosulfat (kupferfreie Form) ist hinsichtlich der subakuten
und chronischen Toxizität bei Ratten und Hunden mit dem Bleomycinkomplex vergleichbar. Weiterhin sollte die Tatsache
speziell erwähnt werden, daß in allen Fällen, wo Hunden eine hohe Dosis des Bleomycinkomplexes (1,2 mg/kg, 90 Injektionen)
injiziert wurde, eine Nekrose auftrat, daß dies jedoch bei keinem der Fälle erfolgte, wo den Hunden die gleiche
Dosis von NK631-Monosulfat (kupferfreie Form) verabreicht
wurde. Die Toxizität von NK63I-Monosulfat (kupferfreie Form)
gegenüber der Lunge war ebenfalls niedriger als bei dem Bleomycinkomplex
.
809881/1135
Aus den obigen Ergebnissen ergibt sich, daß die Toxizität von NK631-Monosulfat (kupferfreie Form) mit derjenigen des Bleomycinkomplexes,
ausgenommen der Toxizität gegenüber der Lunge und der Nekrose vergleichbar ist.
5. Zusammenfassung:
Aus den oben angegebenen Testergebnissen kann die Schlußfolgerung gezogen werden, daß NK631 eine neue Verbindung ist, die
die folgenden Eigenschaften hat:
(1) Eine extrem niedrige Toxizität gegenüber der Lunge;
(2) eine antimikrobiell und Antitumoraktivitat, die derjenigen
des handelsüblichen Bleomycinkomplexes überlegen ist;
(3) eine systemische Toxizität, die mit derjenigen des handelsüblichen
Bleomycinkomplexes vergleichbar ist; und
(4) eine niedrige lokale Toxizität an der Injektionsstelle.
Es kann daher angenommen werden, daß NK631 für klinische Zwekke
geeignet ist.
Das neue erfindungsgemäße Bleomycin NK631 wird in der Weise
synthetisiert, daß man ein reaktives Derivat der Carboxylgruppe der Bleomycinsäure der Formel:
809881/1135
809881/1135
mit N-[(S)-1·-Phenylethyl]-1,3-diaminopropan umsetzt. Die Verbindimg
kann man insbesondere dadurch herstellen, daß man (1) Bleomycinsäure mit N-[(S)-1!-Phenyläthylamino]-1,3-diaminopropan
in Gegenwart eines Aktivierungsmittels umsetzt oder (2) Bleomycinsäure-3-aminopropylester oder das N-monosubstituierte
Derivat davon mit N-[(S)-1'-Phenyläthylj-I,3-diaminopropan zur
Umsetzung bringt.
Nachstehend wird eine detaillierte Beschreibung dieser Verfahrensweisen
gegeben.
Die bei dem Verfahren (1) verwendete Bleomycinsäure ist eine bekannte Verbindung, die durch enzymatische Spaltung von Bleomycin
B2. nach der Methode gemäß den US-PS 3 843 448 und
3 846 400 erhalten wird.
Das andere Ausgangsmaterial, d.h. N-[(S)-I1-Phenyläthyl]-1,3-diaminopropan
ist eine neue Verbindung, die auf folgende Weise zuerst synthetisiert worden ist.
Auf etwa O0C abgekühltes Phenyläthylamin wird mit einer ungefähr
äquivalenten Menge von Acrylnitril vermischt. Das Gemisch wird 10 bis 24 h bei 80 bis 1000C gehalten, um die Reaktion
zu vervollständigen. Überschüssiges Acrylnitril wird sodann bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wird
weiter destilliert, wodurch 3-C(S)-1'-Phenyläthylamino]-propionitril
erhalten wird. Die auf diese Weise erhaltene Verbindung wird in üblicher Weise, beispielsweise in Gegenwart von Raney-Niekel,
reduziert, wodurch das angestrebte N-[(S)-I'-Phenyläthyl3-1,3-diaminopropan
(nachstehend als "Aminoverbindung11 bezeichnet) erhalten wird. In Tabelle VII sind die physikalischchemischen Eigenschaften dieser Verbindung zusammengestellt.
809881/1135
- 15 Tabelle VII
Freie Base
Dihydro Chlorid
(1) Aussehen
(2) Schmelzpunkt
(3) Siedepunkt
(4) Ultraviolettabsorptions-Maxima (in )
to (5) molekularer Extinktionskoef-
o fizient, ε (256 mn)
co (6) spezifische Drehung Ca]2/^
(8)
Rf-Wert bei der Dünnschichtchromatographie , n-Propanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser
(15 ϊ 10 : 3 : 12 V/V), Avicel-SF
Rm-Wert bei der Hochspannungselektrophorese, Ameisensäure/ Essigsäure/Wasser
(25 : 75 : 900 V/V), Avicel-SF, 800 V, 10 min, Rm-Wert
von Alanin =1,0
farblose Flüssigkeit bei Raumtemperatur
bis 1030C (2 mm Hg)
241, 247, 252, 257, 263, 267
(Methanol)
(Methanol)
-56,38° (unverdünnt, 1=1)
0,73
1,52
weiße nadeiförmige Kristalle 223,5 bis 2240C
250, 256, 259, 266
(destilliertes Wasser)
(destilliertes Wasser)
(destilliertes Wasser)
-20,6° (c = 1, destilliertes Wasser)
0,73
1,52
IS? CO K) OO CD CJ CO
ί> φ
H H Φ
.α
ftf
N P Φ
η P U
ο - ·. cMino
ooo ο
V-CM
oo mo ολο cn
cm in
mo in ν-ο •.ν-in in
O ν- ν-ΚΛ
CM
ιηοο
οο ιηο ιην- v-tn
»moo OVDVO ιη
CM H
O '"Ν
CMO
S CM
O «
CM ν-
W ιη
V-CM Ο~
VD
CM
00 ·> ·>
οοο
«ν CM
ιη
οοο ν-ιηιη
»ν- CM
OO
CM-^
S ω
COCM
CM
CO
οιηιη
οο ■ί
ο cm-a-ro
VO ν- τ-Κ\
ooo OKMno
OKO
P Xi
H O)-H
O bo O
ΦΗ
809881/1135
Beispiele für geeignete Aktivierungsreagentien sind 6-Chlor-1-p-chlorbenzolsulfonyloxybenzotriazol
(CCBT), N-Äthyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat
(NEPIS), N-tert.-Butyl-5-methylisoxazolitimperchlorat,
N-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-i,2-dihydrochinolin,
Di-p-nitrophenylsulfit, Tri-p-nitrophenylphosphit,
p-Nitraphenyltrichloracetat, N-Hydroxysuccinimid, Dicyclohexylcarbodiimid
(DCC), 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid, Diphenyl
carbodiimid, Di-p-toluylcarbodiimid, Diisopropylcarbodiimid,
p-Nitrophenol, Pentachlorphenol und Benzylalkohol.
Detaillierte Beschreibung des Verfahrens (1):
Bleomycinsäure (Kupfer enthaltende Form) wird in Wasser, Dimethylformamid,
Dimethylsulfoxid oder einem Gemisch davon aufgelöst. Zu der Lösung wird unter Rühren bei 0 bis 30°C eines
der oben angegebenen Aktivierungsreagentien gegeben. Die resultierende Lösung wird auf einen für die Aktivierung geeigneten
pH-Wert von 3 bis 10 durch Zugabe einer anorganischen Säure
oder Base, wie Salzsäure oder Natriumhydroxid, oder durch Zugabe einer organischen Säure oder Base, wie z.B. Trichloressigsäure
oder N-Methylmorpholin, eingestellt. Nach einer solchen
Behandlung wird die Aktivierung der Carboxylgruppe der Bleomycinsäure eingeleitet. Unmittelbar oder innerhalb von
min nach der Behandlung wird die Ausgangslösung mit der Aminoverbindung (wie vorstehend definiert) so, wie sie ist, oder
nach Einstellung des pH-Werts auf etwa 7,0 vermischt. Das Gemisch wird sodann 1 bis 24 h bei 0 bis 300G gehalten, um die
Reaktion ablaufen zu lassen. Auf diese Weise wird NK631 erhalten. Eine geeignete Verhältnismenge des Aktivierungsreagenses
oder der Aminoverbindung ist 1 bis 10 Äquivalente für 1 Äquivalent der Bleomycinsäure.
809881/1135
Um das NK631 aus dem Reaktionsgemisch zu isolieren, werden
zuerst die Bleomycinverbindungen durch Zugabe von 5 bis 10 Volumenteilen Aceton pro 1 Volumenteil des Reaktionsgemisches
erschöpfend ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen und in der kleinstmöglichen
Menge destilliertem Wasser aufgelöst. Die resultierende wäßrige Lösung wird sofort mit Salzsäure oder dergleichen auf
einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und auf eine chromatographische Säule aufgegeben, welche CM-Sephadex C-25 (vom NHr-Typ
von Pharmacia Fine Chemicals), eingepackt in eine wäßrige Ammoniumchloridlösung,
enthält. Die nicht-umgesetzte Bleomycinsäure
läuft durch die Säule, ohne adsorbiert zu werden. Das auf dem Harz adsorbierte NK631 wird mit wäßrigen Ammoniumchloridlösungen
mit Konzentrationsgradienten, die stufenweise oder
kontinuierlich von 0,05 M bis 1,0 M erhöht sind, eluiert. NK63I ist in den blauen Abstromfraktionen mit einer Ammoniumchloridkonzentration
von etwa 0,35 M bis 0,45 M enthalten, die eine Ultraviolettabsorption bei 292 ταμ zeigen. Diese Fraktionen
werden gesondert gesammelt und durch Amberite XAD-2 (Röhm & Haas Co.) oder Diaion HP40 (Mitsubishi Chemical Co.) geleitet.
Das adsorbierte NK63I wird mit Wasser gewaschen und eluiert, wodurch ein entsalzter Abstrom erhalten wird, aus dem ein reines
blaues amorphes Pulver von NK63I (Kupfer enthaltende Form) erhalten wird. Das Hydrochlorid und das Sulfat von NK63I werden
erhalten, indem man mit wäßrigem Methanol eluiert, das "Salzsäure bzw. Schwefelsäure enthält. Bei diesem Verfahren
kann nicht-umgesetzte Bleomycinsäure leicht wiedergewonnen werden. Die oben beschriebene Verfahrensstufe, bei der CM-Sephadex
C-25 (Sephadex ist ein Warenzeichen für einen Kationenaustauscher aus mikroskopisch kleinen Perlen eines Carboxymethylgruppenderivats
von Polysacchariddextran, von Pharmacia Fine Chemicals Inc., Schweden) verwendet wird, ist nur ein
der Veranschaulichung dienendes Beispiel. Die Verfahrensweise kann bis zu einem gewissen Ausmaß modifiziert werden, ohne daß
809881/1 135
die Ergebnisse wesentlich beeinflußt werden. So kann z.B. wäßrige
Natriumchlorid- oder wäßrige Ammoniumsulfatlösung als
Eluierungsmittel verwendet werden.
Die Entfernung des Kupfers aus dem oben erhaltenen Kupfer enthaltenden
NK63I kann nach bekannten Methoden geschehen. So
kann beispielsweise das Kupfer in der Weise entfernt werden, daß man eine Umsetzung mit Schwefelwasserstoff vornimmt, um
das Kupfer in Kupfer(II)-sulfid umzuwandeln, das ausgefällt
wird. Das Kupfer kann auch zu nullwertigem Kupfer mit einem Reduktionsmittel
reduziert werden (vgl. US-PS 3 646 197). Man kann das Kupfer auch mit einem organischen Lösungsmittel extrahieren,
das einen Chelatbildner, wie z.B. Dithizon, enthält (vgl. Umezawa et al., Journal of Antibiotics, 1,2A, 210 (1960)).
Schließlich kann man beispielsweise auch ein nicht-ionogenes makroretikuläres Austauscherharz verwenden (vgl. US-PS
3 929 993). Nachstehend wird ein Beispiel für das Verfahren
zur Entfernung des Kupfers angegeben.
NK631 (Kupfer enthaltende Form) wird in destilliertem Wasser
aufgelöst und die Lösung wird in eine Harzsäule gegossen, die Amberlite XAD-2 (Warenzeichen für ein absorbierendes Harz aus
Styrol-Divinylbenzol-Copolymerem von Röhm & Haas Co., USA) oder Diaion HP40 (Warenzeichen für ein absorbierendes Harz
aus einem Styrol-Divinylbenzol-Copolymerem von Mitsubishi Chemical
Co., Japan), gepackt in destilliertem Wasser, enthält, um das NK631 adsorbieren zu lassen. Die Säule wird sodann mit
einer 5%igen wäßrigen Lösung von Äthylendiamintetraessigsäuredinatriumsalz
(nachstehend als "EDTA.Nag" bezeichnet) gewaschen,
wodurch die Kupferionen durch die EDTA.Na2-Lösung weggetragen
werden. Kupferfreies NK631 bleibt auf dem Harz zurück. Das Harz wird mit einer wäßrigen Lösung eines Salzes, z.B. von Natriumchlorid,
Natriumsulfat oder Natriumacetat, zur Entfernung von EDTA.Nap und sodann mit destilliertem Wasser gewaschen. Schließ-
809881/1135
lieh wird ein angesäuertes Methanol/Wasser-Gemisch, beispielsweise
ein Gemisch aus Methanol und O,0025N-SaIzsäure (1:1
Volumenverhältnis) durch die Säule geleitet, um eine Substanz zu eluieren, die eine Ultraviolettabsorption bei 290 mu hat.
Diese Fraktion wird gesammelt, konzentriert, auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und gefriergetrocknet, wodurch ein hellgelblich weißes amorphes Pulver von NK631-DihydroChlorid (kupferfreie
Form) erhalten wird.
Als Säure zur Herstellung des angesäuerten Methanol/Wasser-Gemisches
können alle beliebigen Säuren verwendet werden, sofern sie pharmazeutisch annehmbar sind. Wenn beispielsweise Schwefelsäure
oder Essigsäure verwendet wird, dann wird ein Pulver von NK631-Monosulfat oder dem Diessigsäuresalz (kupferfreie
Form) erhalten.
Das erfindungsgemäße NK63I kann in üblicher Weise in andere
nicht-toxische Salze, beispielsweise in das Sulfat- und Essigsäuresalz,
umgewandelt werden. Diese Salze können auch in der Weise erhalten werden, daß man in entsprechender Weise die
beim Eluieren verwendete Säure verändert.
Da bei dem Verfahren (1) sich die Aminoverbindung mit der
aktivierten Carboxylgruppe der Bleomycinsäure aufgrund des Vorhandenseins eines Aktivierungsreagenses, das bei der PoIypeptidsynthese
verwendet wird, umsetzt, schreitet die Kondensationsreaktion glatt und unter extrem milden Bedingungen voran«
Es setzt sich daher nur die primäre Aminogruppe der Aminoverbindung mit der aktivierten Carboxylgruppe um, während die sekundäre
Iminogruppe an der Reaktion nicht teilnimmt, wodurch bevorzugt NK63I erhalten wird. Dies stellt einen erheblichen
Vorteil des Verfahrens (1) dar.
809881/113S
- 2Γ -
Detaillierte Beschreibung des Verfahrens (2):
Der beim Verfahren (2) verwendete 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure
wird leicht in Form des Dihydrochlorids (Kupfer enthaltende Form) erhalten, indem man thermisch Bleomycin A2
unter Bildung von 3-(Methylmercapto)-propylaminobleomycin zersetzt und das resultierende Bleomycin mit einem Halogennitril,
einer Halogenessigsäure, einem Halogenacetatester oder einem Halogenacetamid in einer sauren Lösung umsetzt (US-PS 3 886 133),
Das N-monosubstituierte Derivat des 3-Aminopropylesters der
Bleomycinsäure, bei dem die Aminogruppe geschützt ist, wird in hoher Ausbeute erhalten, indem man das DihydroChlorid des
3-Aminopropylesters von Bleomycinsäure in wasser oder einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol, oder einem Gemisch davon
auflöst und sodann langsam unter heftigem Rühren zu der resultierenden Lösung eine äquivalente Menge oder einen geringen
Überschuß eines der bekannten Aminogruppen schützenden Reagentien in Form eines Pulvers oder als Lösung in einem organischen
Lösungsmittel, wie Methanol, gibt und indem man die Reaktion bei Raumtemperatur oder unter Eiskühlung ablaufen
läßt, wobei man kontinuierlich den pH-Wert des Reaktionsgemisches bei 5,0 bis 7,5 durch Zugabe einer organischen Base, wie
z.B. von Trimethylamin, Triäthylamin, Pyridin, 1,3-Diazabicyclo-[5,4,0]-7-undecen,
1,5-Diazabicyclo-[3,4,0]-5-nonen, 1,4-Diazabicyclo-[2j2,2]-octan oder N-Methylmorpholin, hält.
Typische solche N-monosubstituierten Derivate sind das Monohydrochlorid des 3-Acetylaminopropylesters von Bleomycinsäure,
des 3-Succinylaminopropylesters der Bleomycinsäure, das Monohydrochlorid
des 3-Benzoylaminopropylesters von Bleomycinsäure, das Monohydrochlorid des 3-Benzyloxycarbonylaminopropylesters
von Bleomycinsäure, das Monohydrochlorid von 3-p-Toluolsulfonylaminopropylesters
von Bleomycinsäure, das Monohydrochlorid des 3-(2,4-Dinitrophenyl)-aminopropylesters der
809881/1135
Bleomycinsäure, das Monohydrochlorid des 3-(3,5-Dimethyl-3-oxocyclohexen-1-yl)-aminopropylesters
der Bleomycinsäure, das Monohydrochlorid des 3-N-tert.-Butoxycarbonylpropylesters der
Bleomycinsäure und das Monohydrochlorid des 3-N-Salicylideniminopropylesters
der Bleomycinsäure (US-PS 3 886 133).
Bei dem Verfahren (2) wird NK631 durch Umsetzung des 3-Aminopropylesters
oder N-monosubstituierten 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure mit der Aminoverbindung gebildet. Wenn der N-monosubstituierte
3-Aminopropylester der Bleomycinsäure als Ausgangsmaterial verwendet wird, dann kann entweder ein reines
Material oder ein Reaktionsgemisch, das konzentriert sein kann, erhalten aus dem 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure
und einem Aminogruppenschutzmittel, verwendet werden.
Bevorzugte Lösungsmittel, die bei der Umsetzung des 3-Aminopropylesters
oder des N-monosubstituierten 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure mit der Aminoverbindung verwendet werden,
sind Wasser und organische Lösungsmittel, wie z.B. Methanol, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid. Das Reaktionsgemisch
wird 1 bis 72 h lang bei 0 bis 8O0C bei neutralen oder alkalischen
Bedingungen stehen gelassen, damit die Aminolysereaktion ablaufen kann. Auf diese Weise wird NK631 gebildet. Bei den
Bedingungen eines höheren pH-Werts ist eine verlängerte Reaktionszeit bei verhältnismäßig niedrigen Temperaturen zweckmäßig,
während bei den Bedingungen eines niedrigeren pH-Wertes eine kürzere Reaktionszeit bei höheren Temperaturen bevorzugt
wird. Die geeignete Verhältnismenge der Aminoverbindung in dem Reaktionsgemisch ist 1 bis 10 Äquivalente pro 1 Äquivalent
des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure oder des N-monosubstituierten
Derivats davon.
Zur Isolierung des NK631 aus dem Reaktionsgemisch werden zuerst die Bleomycinkomponenten durch Zugabe der 2- bis 5-fachen
809881/1135
Volumenmenge Aceton zu dem Reaktionsgemisch erschöpfend ausgefällt.
Der Niederschlag wird durch Filtration gesammelt, gründlich mit Aceton gewaschen und sodann in der geringstmöglichen
Menge von destilliertem Wasser aufgelöst. Die resultierende wäßrige Lösung wird rasch auf einen pH-Wert von 6,0
durch Zugabe von Salzsäure oder dergleichen eingestellt und in eine chromatographische Säule aus CM-Sephadex C-25 (vom ΝΗλ+·
Typ von Pharmacia Fine Chemicals), das in eine 0,05M-wäßrige
Ammoniumchloridlösung eingepackt ist, eingegossen, damit die Bleomycinkomponenten auf dem Harz adsorbiert werden können.
Durch Durchlaufenlassen durch die Säule einer wäßrigen Ammoniumchloridlösung,
deren Konzentration stufenweise oder kontinuierlich von 0,05H auf 1,OM erhöht wird, werden der nicht-umgesetzte
3-Aminopropylester der Bleomycinsäure oder ein N-monosubstituiertes
Derivat davon und NK631 eluiert, die blaue Bänder (UV-Absorption bei 292 m u ) in dem Abstrom bei Ammoniumchloridkonzentrationen
von 0,15 bis 0,2OM bzw. 0,35 bis 0,45M
bilden. Diese Fraktionen werden gesondert gesammelt und durch Adsorption auf Amberlite XAD-2 oder Diaion HP40, Waschen mit
Wasser und Elution entsalzt, wodurch ein blaues amorphes Pulver von NK631 (Kupfer enthaltende Form) erhalten wird. Das
Hydrochlorid und das Sulfat werden erhalten, wenn man Methanol/Wasser-Gemische, die mit Salzsäure bzw. Schwefelsäure angesäuert
worden sind, als Elutionsmittel verwendet. Der nichtumgesetzte 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure oder ein N-monosubstituiertes
Derivat davon können in geeigneter Weise gewonnen werden. Die oben beschriebene Verfahrens stufe, bei der
CM-Sephadex C-25 verwendet wird, ist ein typisches, der Veranschaulichung dienendes Beispiel. Sie kann bis zu einem gewissen
Ausmaß modifiziert werden, ohne daß die Ergebnisse praktisch verändert werden. So kann z.B. als Eluierungsmittel wäßrige
Natriumchlorid- oder wäßrige Ammoniumsulfatlösung verwendet werden.
809881/1 135
Das nach dem Verfahren (2) erhaltene NK631 kann in die kupferfreie
Form durch Anwendung bekannter Kupferentfernungsmethoden umgewandelt werden, wie sie oben im Zusammenhang mit der Verfahrensweise
(1) beschrieben wurden. Erforderlichenfalls ist es möglich, die Verbindung in ein anderes nicht-toxisches Salz,
beispielsweise das Hydrochlorid, Sulfat oder Essigsäuresalz, umzuwandeln.
In den Tabellen VIII und IX sind die hauptsächlichen physikalisch-chemischen
Eigenschaften von NK63I zusammengestellt.
Die Strukturformel I von NK631 wurde auf folgende Weise bestätigt:
NK63I-Monosulfat (kupferfreie Form) wurde in schwerem
13
Wasser aufgelöst. ^C-NMR wurde nach der Protonengeräusch-Entkupplungsmethode gemessen, wobei Dioxan als innerer Standard
Wasser aufgelöst. ^C-NMR wurde nach der Protonengeräusch-Entkupplungsmethode gemessen, wobei Dioxan als innerer Standard
13 verwendet wurde. Signale, die auf insgesamt 11 C-Atome, die
in der Aminoverbindung in der Seitenkette und der 3-[(S)-1'-Phenyläthylaminoj-propylamino-Gruppierung
enthalten waren, zurückzuführen sind, wurden bei 19,4, 26,3, 37,0, 43,5, 58,9, 128,3 (zwei Signale), 130,0 (zwei Signale) und 136,3 ppm festgestellt.
Auf andere Kohlenstoffatome zurückzuführende Signale
entsprachen alle den Signalen, die der Bleomycinfamilie gemeinsam waren [Naganawa et al., Journal of Antibiotics, 30.
388 (1977)].
809881/1 135
- 25 -
Tabelle VIII - Physikalisch-chemische Eigenschaften von NK63I (Kupfer enthaltende Form)
CO OO OO
Aussehen | Dihydrochlorid | Monosulfat | |
(D | Löslichkeit | blaues amorphes Pulver | blaues amorphes Pulver |
(2) | Schmelzpunkt (Zers.)» °C | löslich in Wasser, Methanol, Dimethylsulfoxid, Dimethyl formamid; geringfügig lös lich in Dioxan; unlöslich in Äthanol, Aceton, Äther, Benzol. |
gleiche Löslichkeit wie im Falle des DihydroChlorids |
(3) | spezifische Drehung (destil liertes Wasser, C = 1,0) [«3*36 ,, |
205 bis 207 | 205 bis 207 |
(4) | Dünnschichtchromatographie ' lU-Wert f «\ |
-95,6° | CP -93,7° "« |
Ib) | Elektrophorese"' Plm-Wert (Alanin = 1) |
(a) 0,72 (b) 0,75 | (a) 0,72 (b) 0,75 |
(6) | 0,80 | 0,80 | |
OO ■CD
- 26 -
Fußnote:
1) (a) Silica Gel G (Warenzeichen für ein Adsorptionsmittel für die Dünnschichtchromatographie
aus Silicagel, hergestellt von Merck Inc., USA); Methanol/10% Ammoniumacetat/10% Ammoniak
(10 : 9 : 1 V/V)
(b) Avicel SF (Warenzeichen für ein Adsorptionsmittel für die Dünnschichtchromatographie aus
kristalliner Cellulose, hergestellt von FMC Corporation, USA); n-Propanol/Pyridin/Essig-
00 säure/Wasser (15 : 10 : 3 : 12).
ο
S 2) Avicel SF; Ameisensäure/Essigsäure/Wasser (25 : 75 : 900 V/V); 800 V; 15 min.
-■ 27 -
Tabelle IX - Physikalisch-chemische Eigenschaften von NK63I (kupferfreie Form)
Dihydrochlorid
Monosulfat
Di-(essigsaure)-salz
(1) Aussehen
hell-gelblich weißes amorphes Pulver
hell-gelblich weißes amorphes Pulver
hell-gelblich weißes amorphes Pulver
(2) Löslichkeit
löslich in Wasser, Methanol, Essigsäure, löslich in Dioxan; unlöslich in Äthanol,
DMSO, DMF; geringfügig Aceton, Äther, Benzol.
(3) Schmelzpunkt (Zers.), C
bis 197
bis 198
188 bis
O (O OO
(4) spezifische Drehung (destilliertes Wasser, c = 1,0)
0^ (5) DUnnschichtchromatographie
-2,1
-2,0c
-2,OC
Rp-Wert
(6) Elektrophorese2'
Rt (Alanin =1,0)
(a) 0,56 (b) 0,70
(a) 0,56 (b) 0,70
(a) 0,56 (b) 0,70
0,94
0,94
0,94
Fußnote:
1) (a) Silica Gel G; Methanol/10% Ammoniumacetat/10% Ammoniak (10 : 9 : 1 V/V)
(b) Avicel SF; n-Propanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser (15 : 10 : 3 : 12)
2) Avicel SF; Ameisensäure/Essigsäure/Wasser (25 : 75 : 900 V/V); 800 V; 15 min
3a 2828133
In den beigefügten Zeichnungen zeigen die Figuren 1 und 2 die Ultraviolettabsorptionskurven des erfindungsgemäßen Bleomycins
NK631 und die Figuren 3 und 4 zeigen die Infrarotabsorptionskurven von NK63I.
Die Figur 1 zeigt somit die Ultraviolettabsorptionskurve von
3-[(S)-1'-PhenyläthylaminoJ-propylaminobleomycin-dihydrochlorid
(Kupfer enthaltende Form). Die Figur 2 zeigt die Ultraviolettabsorptionskurve von 3-[(s)-1'-Phenyläthylaminoj-propylaminobleomycin-monosulfat
(kupferfreie Form). Die Figur 3 zeigt die Infrarotabsorptioiiskurve von 3-[(S)-1 '-Phenyläthylaminojpropylaminobleomycin-dihydrochlorid
(Kupfer enthaltende Form), gemessen in Form einer Kaliumbromidtablette, und die Figur 4
zeigt die Infrarotabsorptionskurve von 3-[(S)-1f-Phenyläthylamino]-propylaminobleomycin
(kupferfreie Form), gemessen in Form einer Kaliumbromidtablette.
Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Beispiel 1
Synthese des DihydroChlorids (Kupfer enthaltende Form) und
des Monosulfats (kupferfreie Form) von NK63I:
Stufe A: In 400 ml Dimethylformamid wurden 15,0 g Bleomycinsäure
(Kupfer enthaltende Form) gelöst. Zu dieser Lösung wurden, während sie durch Kühlen bei O0C gehalten wurde, 1,1 ml
N-Methylmorpholin und 10,3 g CCBT gegeben. Das Gemisch wurde
5 min bei 00C gerührt und sodann wurden 5»3 g der Aminoverbindung
zugemischt. Es wurde 1 h" lang weiter gerührt. Nachdem die Umsetzung durch Zugabe von 200.ml einer 25%igen wäßrigen
Essigsäurelösung beendigt worden war, wurde das Reaktionsgemisch; .mit 5 1 kalten Acetons vermischt, um. das Reaktionsprodukt zur Ausfällung zu bringen-. .Der Niederschlag wurde
durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen
809881/1 135
" 2828833
und in 500 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die resultierende wäßrige Lösung wurde sofort auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt
und in eine Säule gegossen, die 2 1 CM-Sephadex C-25 (vom NH^+-Typ), gepackt in eine 0,05M-wäßrige Ammoniumchloridlösung,
enthielt, um die Bleomycine zu adsorbieren.
Mit einer wäßrigen Ammoniumchloridlösung wurde die Elution durchgeführt, indem durch die Säule 20 1 des Elutionsmittels
durchgeleitet wurden, bei dem die Konzentration von Ammoniumchlorid kontinuierlich von 0,05 auf 1,OM erhöht wurde. Die
nicht-umgesetzte Bleomycinsäure wurde in dem Abstrom bei einer Ammoniumchloridkonzentration von etwa 0,05M festgestellt. Das
NK631 wurde bei einer Ammoniumchloridkonzentration von etwa 0,45M festgestellt. Beide Fraktionen, die eine UV-Absorption
bei 292 mu zeigten, wurden gesondert gesammelt. Die das NK631
enthaltende Fraktion wurde in eine Harzsäule gegossen, die 2,6 1 Amberlite XAD-2 enthielt. Die Säule wurde sodann gründlich
mit Wasser gewaschen und mit 0,01N-SaIzsäure in Methanol/
Wasser (4 : 1 V/V) eluiert. Insgesamt 2,5 1 der blauen Fraktion, die eine UV-Absorption bei 292 mu zeigte, wurden gesammelt.
Nach Abdampfen des Methanols aus der eluierten Fraktion wurde das Konzentrat mit Dowex 44 (OH~-Typ) (Warenzeichen für
ein Anionenaustauscherharz, bestehend aus einem Copolymeren von Epichlorhydrin und Ammoniak, hergestellt von Dow Chemical
Co., USA) auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Das Filtrat wurde gefriergetrocknet, wodurch 16,1 g (Ausbeute 92%) NK63I-Dihydrochlorid
(Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers erhalten wurden.
Durch eine ähnliche Behandlung wurden 280 mg nicht-umgesetzte
Bleomycinsäure (Kupfer enthaltende Form) gewonnen.
Die Ultraviolettabsorptionsmaxima und die antimikrobielle Aktivität
des NK63I-Dihydrochloride (Kupfer enthaltende Form)
809881/1 135
sind nachfolgend angegeben.
UV-Absorptionsmaxima:
19^
mn (Ey„, destilliertes Wasser)
/ ι ein
242 (151)
292 (121)
Antimikrobielle Aktivität: 8100 u/mg
(Fußnote: Die antimikrobielle Aktivität -wurde unter Verwendung
von Mycobacterium smegmatis ATCC 607 als Testorganismus
bestimmt. Die Aktivität von Bleomycin Ap (kupferfreie
Form) wurde als 1000 u/mg angesetzt. Das Gleiche gilt für die späteren Ausführungen).
Stufe B:. In 200 ml destilliertem Wasser wurden 10,0 g NK631-Dihydrochlorid
(Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Die Lösung wurde in eine Säule gegossen, die 600 ml Amberlite XAD-2, gepackt
in destilliertes Wasser, enthielt. Die Säule wurde sodann nacheinander mit 2 1 einer wäßrigen Lösung, die 5% EDTA.Nap
enthielt, 2,5 1 einer 5/<5lgen wäßrigen Natriumsulfatlösung und
630 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die Säule wurde sodann
mit 0,0025N-Schwefelsäure in einem Methanol/Wasser-Gemisch
(1 : 1 V/V) eluiert. Insgesamt 900 ml Fraktionen, die eine Substanz enthielten, welche eine UV-Absorption bei 290 mu zeigte,
wurden gesammelt. Nach dem Abdestillieren des Methanols wurde die zurückgebliebene Flüssigkeit mit Dowex 44 (OH~-Typ)
auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und gefriergetrocknet, wodurch 9,3 g (Ausbeute 95/0 von NK63I-Monosulfat (kupferfreie
Form) in Form eines hell-gelblich weißen amorphen Pulvers erhalten wurden. Dieses Produkt zeigte ein UV-Absorptionsmaximum
und eine antimikrobielle Aktivität wie folgt:
UV-Absorptlonsmaximum:
nyi (E^cm 0,1N-HCl)
290 (106)
Antimikrobielle Aktivität: 7865 u/mg
809881/1 135 COPY Ü
Synthese von NK63I -DihydroChlorid (Kupfer enthaltende Form):
In 40 ml destilliertem Wasser wurden 1,5 g Bleomyclnsäure (Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Zu der gerührten Lösung wurden
bei 26°C 800 mg NEPIS gegeben, wobei der pH-Wert des Reaktionsgemisches
durch Zugabe einer 0,1N-wäßrigen Natriumhydroxidlösung bei 4,8 bis 5,5 gehalten wurde. Nach 30 min wurde zu
dem Gemisch eine Lösung gegeben, die in der Weise hergestellt worden war, daß 1,8 g der Aminoverbindung in 20 ml destilliertem
Wasser aufgelöst wurden und mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt wurde. Das Gemisch wurde 26 h bei 26°C stehen
gelassen. Zu dem Reaktionsgemisch wurden sodann unter Rühren 600 ml kaltes Aceton gegeben, um die Bleomycinkomponenten
auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst
und sofort mit O,1N-Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,0
eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde nach der Verfahrensweise der Stufe A des Beispiels 1 gereinigt, wodurch
932 mg (Ausbeute 53%) NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende
Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers mit einer antimikrobiellen
Aktivität von 8073 u/mg erhalten wurden.
Synthese von NK631-Dihydrochlorld (Kupfer enthaltende Form):
In 40 ml Dimethylsulfoxid wurden 1,5 g Bleomycinsäure (Kupfer
enthaltende Form) aufgelöst. Zu der gerührten Lösung von 30 C
wurden 740 mg N-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-1,2-dihydrochinolin
und 0,1 ml N-Methylmorpholin gegeben. Zu dem Gemisch, das 30 min
gerührt worden war, wurden unter Rühren 530 mg der Aminoverbindung gegeben und das Gemisch wurde 3 h lang bei 300C stehen
809881/1 135
gelassen« Das Reaktionsgemisch wurde sodann unter Rühren mit 600 ml kaltem Aceton versetzt, um die Bleomycinkomponenten
auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser
aufgelöst und sofort mit 0,1N-SaIzsäure auf einen pH-Wert
von 6,0 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde in ähnlicher Weise wie in Stufe A des Beispiels 1 behandelt,
wodurch 809 mg (Ausbeute 46$) NK631-Dihydrochlorid (Kupfer
enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers erhalten
wurden, das eine antimikrobiell Aktivität von 8028 u/mg zeigte.
Synthese von NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form):
In 40 ml destilliertem Wasser wurden 1,5 g Bleomycinsäure (Kupfer
enthaltende Form) aufgelöst. Nach Zugabe von 1,2 g 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid
von 270C wurde das Gemisch mit 0,1 N-SaIzsäure auf einen pH-Wert von
4,5 eingestellt. Nach Zugabe von 530 mg der Aminoverbindung wurde das Gemisch erneut mit 1N-Salzsäure auf einen pH-Wert von
5,0 eingestellt und 20 h lang bei 270C stehen gelassen. Zu dem
Reaktionsgemisch wurden unter Rühren 400 ml kaltes Aceton gegeben, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag
wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst und sofort mit
0,1N-Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt.
Die resultierende wäßrige Lösung wurde nach der Arbeitsweise der Stufe A des Beispiels 1 gereinigt, wodurch 440 mg
(Ausbeute 25%) NK631 -Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers erhalten wurden, das
eine antimikrobielle Aktivität von 7985 u/mg hatte.
809881/1135
^ " 2828333
Synthese von NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form):
In 16 ml Methanol wurden 9,0 g Bleomycinsäure-3-N-benzoylaminopropylester-monohydrochlorid
(Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Unter Kühlen auf 00C wurde die Lösung mit 9,16 g der
Aminoverbindung versetzt. Nach weiterem 40-stündigen Rühren bei O0C wurde kaltes Aceton zu dem Reaktionsgemisch gegeben,
um die Reaktionsprodukte auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen und in 300 ml
destilliertem Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde sofort mit O,1N-Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und in
eine Säule gegossen, die 1 1 CM-Sephadex C-25 (NH^-Typ), gepackt
in 0,05M-wäßrige Ammoniumchloridlösung, enthielt, um die Bleomycine adsorbieren zu lassen. Unter Verwendung von wäßriger
Ammoniumchloridlösung als Elutionsmittel wurde die Elution durchgeführt, wobei durch die Säule 10 1 eines Elutionsmittels
geleitet wurden, bei dem die Konzentration von Ammoniumchlorid kontinuierlich von 0,05 auf 1,OM erhöht wurde. Der nicht-umgesetzte
3-N-Benzoylaminopropylester der Bleomycinsäure wurde
in dem Abstrom bei einer Ammoniumchloridkonzentration von etwa 0,214 festgestellt. Das NK631 wurde bei einer Ammoniumchloridkonzentration
von etwa 0,45M festgestellt. Beide Fraktionen, die eine UV-Absorption bei 272 mu zeigten, wurden gesondert
gesammelt. Die NK63I enthaltende Fraktion wurde in eine Harzsäule gegossen, die 1,3 1 Amberlite XAD-2 enthielt. Die Säule
wurde sodann gründlich mit Wasser gewaschen und mit 0,01N-Salzsäure" in einem Methanol/Wasser-Gemisch (4 : 1 V/V) eluiert.
Insgesamt 2,5 1 der blauen Fraktion, die eine UV-Absorption bei 292 mu zeigte, wurden gesammelt. Nachdem das Methanol abdestilliert
worden war und der pH-Wert mit Dowex 44 (OH~-Typ)
auf 6,0 eingestellt worden war, wurde die Fraktion gefriergetrocknet, wodurch 8,2 g (Ausbeute 90%) NK631-DihydroChlorid
809881 /1135
(Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers
erhalten wurden, das eine antimikrobiell Aktivität von 8030 u/mg hatte.
Durch eine ähnliche Behandlung wurden 910 mg nicht-umgesetztes Bleomycinsäure-3-N-benzoylaminopropylester-monohydrochlorid
(Kupfer enthaltende Form) gewonnen.
Synthese von NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form):
In 3 ml Methanol wurden 950 mg Bleomycinsäure-3-N-p-toluolsulfonylaminopropylester-monohydrochlorid
(Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Zu der Lösung wurden unter Rühren bei 00C
980 mg der Aminoverbindung gegeben und das Gemisch wurde 48 h bei 00C gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wurden unter Rühren
15 ml kaltes Aceton gegeben, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt,
mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst und sofort mit 0,1 N-SaIzsäure auf einen pH-Wert von
6,0 eingestellt. Die resultierende Lösung wurde nach der Verfahrensweise der Stufe A des Beispiels 5 gereinigt, wodurch
833 mg (Ausbeute 8596) NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende
Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers erhalten wurden, das eine antimikrobielle Aktivität von 8010 u/mg hatte.
Synthese von NKöSI-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form):
In 5 ml Dimethylformamid wurden 850 mg Bleomycinsäure-3-acetylaminopropylester-monohydrochlorid
(Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Zu der Lösung wurden unter Rühren bei O0C 950 mg
809881/1135
der Aminoverbindung gegeben und das Gemisch wurde 45 h bei 00C
gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wurden unter Rühren 20 ml kaltes Aceton zugesetzt, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt,
mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst und sofort mit O,1N-Salzsäure auf einen pH-Wert von
6,0 eingestellt. Die resultierende Lösung wurde in der gleichen Weise wie in Stufe A des Beispiels 5 behandelt, wodurch
570 mg (Ausbeute &5%) NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende
Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers mit einer antimikrobiellen
Aktivität von 8010 u/mg erhalten wurden.
Synthese von NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form):
In 3 ml Dimethylsulfoxid wurden 900 mg Bleomycinsäure-3-N-(2,4-dinitrophenyl)-aminopropylester-monohydrochlorid
(Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Zu der Lösung wurden unter Rühren
bei O0C 793 mg der Aminoverbindung gegeben und das Gemisch
wurde 24 h bei O0C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter
Rühren mit 15 ml kaltes Aceton versetzt, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration
gesammelt, mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst und sofort mit O,1N-Salzsäure auf einen pH-Wert
von 6,0 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde nach der Verfahrensweise der Stufe A des Beispiels 5 gereinigt,
wodurch 690 mg (Ausbeute 78%) NK631 -Dihydrochlorid
(Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers
mit einer antimikrobiellen Aktivität von 8010 u/mg erhalten wurden.
Synthese von NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form)
und des kupferfreien Dihydrochlorids:
809881/T135
In 10 ml Methanol wurden 1,0 g Bleonycinsäure-3-aminopropyle5ter-dihydrochlorid
(Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Die heftig gerührte Lösung wurde tropfenweise mit 104 mg Benzoylchlorid
im Verlauf von 30 min versetzt, wobei der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von 1,4-Diazabicyclo-[2,2,2]-octan bei 6,5
bis 7,5 gehalten wurde. Nach weiterem 30-minütigen Rühren wurde das Reaktionsgemisch auf 2 ml konzentriert. Zu dem konzentrierten
Material, das auf 00C abgekühlt war, wurden unter Rühren
1,1 g der Aminoverbindung gegeben und das Gemisch wurde 72 h bei 00C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rühren mit
6 ml kaltes Aceton versetzt, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt,
mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst und sofort mit 0,1N-SaIzsäure auf einen pH-Wert von 6,0
eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde in eine Säule gegossen, die 100 ml CM-Sephadex (NH^+-Typ), gepackt in
eine 0,05M-wäßrige Ammoniumchloridlösung, enthielt, um die
Bleomycinkomponenten adsorbieren zu lassen. Das adsorbierte Material wurde in ähnlicher Weise wie in Stufe A des Beispiels
5 behandelt, wodurch 779 mg (Ausbeute 73%) NK631-DihydroChlorid
(Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers mit einer antimikrobiellen Aktivität von 8000 u/mg erhalten
wurden.
Zusätzlich wurden 240 mg nicht-umgesetztes Bleomycinsäure-3-N-benzoylaminopropylester-monohydrochlorid
(Kupfer enthaltende Form) wiedergewonnen.
Stufe B: In 20 ml destilliertem Wasser wurden 700 mg NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form), erhalten in Stufe A
oben, aufgelöst. Die Lösung wurde in eine Säule gegossen, die 65 ml Diaion HP-40, gepackt in destilliertes Wasser enthielt,
um die Bleomycinkomponenten adsorbieren zu lassen. Die Säule
wurde sodann mit 200 ml einer wäßrigen Lösung, die 5% EDTA.Na2
809881/1136
enthielt, sodann mit 250 ml einer 5%igen wäßrigen Natriumchloridlösung
und schließlich mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die Säule wurde sodann mit einem Gemisch aus Methanol
und 0,0025N-wäßriger Salzsäure (1:1 V/V) eluiert. 98 ml
einer Fraktion mit einer Ultraviolettabsorption bei 290 m u wurden gesammelt. Nach dem Abdestillieren des Methanols bei
vermindertem Druck wurde die zurückgebliebene Flüssigkeit mit Dowex 44 (OH""-Typ) auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und
gefriergetrocknet, wodurch 658 mg (Ausbeute" 98%) NK631-Dihydrochlorid
(kupferfreie Form) in Form eines hell-gelblich weißen amorphen Pulvers mit einer antimikrobiellen Aktivität von
7834 u/mg erhalten wurden.
Synthese von NK63I-Monosulfat (Kupfer enthaltende Form) und
des Diessigsäuresalzes (kupferfreie Form):
Stufe A: In 10 ml Methanol wurden 1,0 g Bleomycinsäure-3-aminopropylester-dihydrochlorid
(Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Die heftig gerührte Lösung wurde bei Raumtemperatur
tropfenweise mit 104 mg Benzoylchlorid im Verlauf von 30 min versetzt, während der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von N-Methylmorpholin
bei 5,0 bis 7,5 gehalten wurde. Nach weiterem 30-minütigen Rühren wurde das Reaktionsgemisch mit 50 ml Aceton
versetzt, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen
und erneut in 3 nil Methanol aufgelöst. Zu der Methanollösung
wurden unter Kühlen-auf O0C und Rühren 597 mg Aminoverbindung
gegeben und das Gemisch wurde 42 h bei 00C gerührt.
Zu dem Reaktionsgemisch wurden unter Rühren 10 ml kaltes Aceton gegeben, um das Reaktionsprodukt zur Ausfällung zu bringen.
Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst und
809881/1135
sofort mit O,1N-Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt.
Die wäßrige Lösung wurde mit CM-Sephadex in ähnlicher
Weise wie in Stufe A des Beispiels 5 behandelt. Die Fraktion, die die Reaktionsprodukte enthielt, wurde in eine Säule gegossen,
die 65 ml Diaion HP-40- gepackt in destilliertes Wasser, enthielt, um die Bleomycinkomponenten auf dem Harz adsorbieren
zu lassen. Nach dem Waschen mit Wasser wurde die adsorbierte Phase mit einem Gemisch aus Methanol und 0,01N-wäßrige Schwefelsäure
(1 : 1 V/V) eluiert. 130 ml einer Fraktion, die eine Ultraviolettabsorption bei 292 mii zeigte, wurden gesammelt.
Nach dem Abdestillieren des Methanols wurde die zurückgebliebene Flüssigkeit mit Dowex 44 (OH~-Typ) auf einen pH-Wert von
6,0 eingestellt und gefriergetrocknet, wodurch 813 mg (Ausbeute 75%) NK631-Monosulfat (Kupfer enthaltende Form) in Form
eines blauen amorphen Pulvers mit einer antimikrobiellen Aktivität
von 7819 u/mg erhalten wurden.
Stufe B: Die Kupferentfernungsbehandlung von 800 mg des NK631-Monosulfate
(Kupfer enthaltende Form), erhalten in Stufe A oben, wurde in der gleichen Weise wie in Stufe B des Beispiels 9
durchgeführt, mit der Ausnahme, daß in der Elutionsstufe eine 5%ige wäßrige Ammoniumacetatlösung und ein Gemisch aus wethanol
und 0,01N-wäßrige Essigsäure (1:1 V/V) anstelle der 59&Lgen wäßrigen Natriumchloridlösung bzw. des Gemisches aus
Methanol und 0,0025N-wäßriger Salzsäure (1 : 1 V/V) verwendet wurden. Auf diese Weise wurden 748 mg (Ausbeute 96?6) NK631-Diessigsäuresalz
(kupferfreie Form)' in Form eines hell-gelblich weißen amorphen Pulvers erhalten. Das UV-Absorptionsmaximum
und die antimikrobielle Aktivität dieses Produkts sind wie folgt:
UV-Absorptionsmaximum:
m/i (E^cm 0,1N-HCl)
290 (105)
Antimikrobielle Aktivität: 7620 u/mg.
809881/1 135
Synthese von NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) und des kupferfreien DihydroChlorids:
In 3 ml Methanol wurden 1,0 g Bleomycinsäure-3-aminopropylester-dihydrochlorid
aufgelöst. Die Lösung wurde tropfenweise bei Raumtemperatur mit 193 mg S-tert.-Butoxycarbonyl^jö-dimethyl-2-mercaptopyrimidin
im Verlauf von 60 min versetzt, während der pH-Wert durch Zugabe von 14% Triäthylamin in Methanol
bei 6,0 bis 7,4 gehalten wurde. Das Gemisch wurde weitere 2 h gerührt, wodurch der,3-N-tert.-Butoxycarbonylaminopropylester
der Bleomycinsäure erhalten wurde. Das Gemisch wurde sodann
auf O0C abgekühlt, mit 1,2 g der Aminoverbindung vermischt
und 70 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 10 ml kaltem Aceton versetzt, um die Bleomycinkomponenten auszufällen.
Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst
und sofort mit 0,1N-SaIzsäure auf einen pH-Wert von 6,0
eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde nach der Verfahrensweise der Stufe A des Beispiels 5 gereinigt, wodurch
597 mg (Ausbeute 56%) NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende
Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers mit einer antimikrobiellen Aktivität von 8010 u/mg erhalten wurden.
Stufe Bi In 50 ml Methanol vfurden 500 mg NKöSI-Dihydrochlorid
(Kupfer enthaltende Form), erhalten in Stufe A oben, aufgelöst. In die heftig gerührte Lösung wurde Schwefelwasserstoff
durch eine Düse mit einem Innendurchmesser von 1 mm, die in. die Lösung eingetaucht war, 1 h lang eingeleitet, um einen,
großen Überschuß von Schwefelwasserstoff in der Lösung aufzulösen. Nach Beendigung der Einführung von Schwefelwasserstoff
wurde die Lösung 30 min bei Raumtemperatur stehen gelaasen. Das ausgefällte Kupfersulfid wurde abfiltriert und mit 50 ml
809881/113S
her -
Methanol gewaschen, das mit Schwefelwasserstoff gesättigt war. Das Filtrat und die Waschwässer wurden kombiniert und von
Methanol und Schwefelwasserstoff durchDestillation unter vermindertem Druck befreit. Der Rückstand wurde in 50 ml Methanol
aufgelöst und mit 100 ml Ithyläther vermischt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Äther
gewaschen und getrocknet, wodurch 394 mg (Ausbeute B2%) von
NK631-Dihydrochlorld (kupferfreie Form) in Form eines hellgelblich weißen amorphen Pulvers mit einer antimikrobiellen
Aktivität von 7820 u/mg erhalten wurden.
Synthese von NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form)
und des kupferfreien DihydroChlorids:
Stufe A: In 2 ml Methanol wurden 1,0 g Bleomycinsäure-3-aminopropylester-dihydrochlorid
(Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Zu der heftig gerührten Lösung von Raumtemperatur
wurden 93 mg Salicylaldehyd gegeben, während der pH-Wert der
Lösung durch Zugabe von Triäthylamin bei 7,0 bis 7,4 gehalten wurde. Auf diese Weise wurde Bleomycinsäure-3-N-salicylideniminopropylester
erhalten. Nach 1-stündigem weitergeführten Rühren wurde das auf 00C abgekühlte Gemisch unter Rühren mit
600 mg der Aminoverbindung versetzt. Das Gemisch wurde 30 h lang gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 10 ml kaltes Aceton
gegeben, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag
wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst und sofort
mit 0,1N-SaIzsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt.
Die resultierende wäßrige ösung wurde wie in Stufe A des Beispiels 5 gereinigt, wodurch 501 mg (Ausbeute 47?0 NK631-Dihydrocnlorid
(Kupfer enthaltende Form) mit einer antimikrobiellen Aktivität von 8013 u/mg erhalten wurden.
809881/1 135
Stufe B: In 25 ml einer O,5N-wäßrigen Salzsäurelösung v/urden
450 mg NK631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form), erhalten in Stufe A oben, aufgelöst. Zu der Lösung wurden 25 ml
einer Chloroformlösung, enthaltend O,2?6 Dithizon (Diphenylthiocarbazon)
gegeben. Nach heftigem Schütteln und Mischen wurde das Gemisch stehen gelassen. Hierdurch schied sich das
Gemisch in zwei Schichten ab. Die untere Schicht (Chloroformschicht) wurde abgezogen und die obere Schicht wurde mit 25 ml
einer frischen Chloroformlösung, die Dithizon enthielt, vermischt. Die obigen Maßnahmen des Schütteins, der Phasentrennung
und der Zugabe einer frischen Chloroformlösung, die Dithizon enthielt, wurde achtmal wiederholt. Schließlich wurde die
obere Schicht (wäßrige Schicht) mit Chloroform gewaschen und die abgetrennte wäßrige Schicht wurde mit Dowex 44 (OH~-Typ)
auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Die auf diese Weise behandelte
wäßrige Schicht wurde bei vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wodurch 415 mg (Ausbeute 96%) NK631-Dihydrochlorid
(kupferfreie Form) in Form eines hellgelben weißen amorphen Pulvers mit einer antimikrobiellen Aktivität von
7845 u/mg erhalten wurden.
Synthese von NK63I-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form):
In 2 ml Methanol wurden 1,0g Bleomycinsäure-3-aminopropylester-dihydrochlorid
(Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Zu der auf O0C abgekühlten Lösung wurden unter Rühren 1,0 g der
Aminoverbindung gegeben und das Gemisch wurde weitere 72 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rühren mit 6 ml
kaltem Aceton versetzt, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag wurde wie in Stufe A des Beispiels 5 gereinigt,
wodurch 128 mg (Ausbeute 12#) ΝΚ631-Dihydrochlorid
(Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen PuI-
809881/1135
vers mit einer antimikrobiellen Aktivität von 8015 u/mg erhalten wurden.
Synthese von N-[(S)-1f-Phenyläthyl]-1,3-dimainopropan:
Zu 50 g (S)-I-Phenyläthylamin von O0C wurden unter Kühlen 33 g
Acrylnitril gegeben. Das Gemisch wurde in einen Kolben gebracht, der mit einem Rückflußkühler ausgestattet war, welcher
an ein Calciumchloridrohr angeschlossen war. Das Gemisch wurde auf 93°C erhitzt, bei welcher Temperatur das Gemisch 18 h
lang gerührt wurde. Nach beendigter Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch von überschüssigem Acrylnitril durch Destillation
unter vermindertem Druck befreit. Der Rückstand wurde unter vermindertem Druck destilliert. Eine Fraktion mit einem Siedepunkt
von 142 bis i45°C/7 mm Hg wurde gesammelt, wodurch 53,5 g 3-[(S)-I'-Phenyläthylamino]-propionitril erhalten wurden.
Dieses Nitril wurde in einen Autoklaven zusammen mit 5 g Raney-Nickel W-7 und 50 ml Äthanol, das 15?o Ammoniak enthielt,
gegeben. Das Gemisch wurde mit einer Geschwindigkeit von 1000 Upm 1,5 h lang bei 50 bis 580C und bei einem Wasserstoffpartialdruck
von 100 bis 40 kg/cm gerührt. Nach beendigter Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch bei vermindertem Druck destilliert.
Eine Fraktion mit einem Siedepunkt von 95 bis 103°C/ 2 mm Hg wurde gesammelt, wodurch 48,3 g N-[(S)-1'-Phenyläthyl]-1,3-dimainopropan
erhalten wurden [66% theoretische Ausbeute von (S)-I-Phenyläthylamin].
809881/1135
Claims (1)
- KRAUS & WEISERTDR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-INS. ANNEKÄTE WEISERT D1PL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 ■ TELEFON O89/797O77-79 7O78 · TELEX OS-212156 kpnt dTELEGRAMM KRAUSPATENT-JC-Patentansprüche3-C(S)-I1 -Phenyläthylamiilo ]-propylaminobleomycin der Formel:809881/1135ORIGINAL INSPECTED• 09l81/t13S "\und die nicht-toxischen Salze davon.2« 3-[(S)-1'-Phenyläthylaminoj-propylaminobleomycin unddie nicht-toxischen Salze davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-toxische Salz das Hydrochlorid, Sulfat oder Essigsäuresalz ist.3. Verfahren zur Herstellung von 3-[(S)-1'-Phenyläthylamino ]-propylaminobleomycin der Formel:809881/113S2828333O= üta809881/1 135und der nicht-toxischen Salze davon, dadurch gekennzeichnet, daß man ein reaktives Derivat der Carboxylgruppe der Bleomycinsäure der Formel:809881/11352628933ο ιO=D809881/1135mit N-[(S)-I'-Phenyläthyl]-1,3-diaminopropan in einem Lösungsmittel umsetzt und erforderlichenfalls das Produkt in ein nicht-toxisches Salz umwandelt.4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-toxische Salz das Hydrochlorid, Sulfat oder Essigsäuresalz ist.5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das reaktive Derivat der Carboxylgruppe der Bleomycinsäure in der Weise herstellt, daß man eine Verbindung aus der Gruppe 6-Chlor-i-p-chlorbenzolsulfonyloxybenzotriazol, N-Äthyl-5-phenylisooxazolium-3'-sulfonat, N-tert.-Butyl-5-methylisooxazoliumperchlorat, N-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-1,2-dihydrochinolin, Di-p-nitrophenylsulfit, Tri-pnitrophenylphosphit, p-Nitrophenyltrichloracetat, N-Hydroxysuccinimid, Dicyclohexylcarbodiimid, 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid, Diphenylcarbodiimid, Di-p-toluylcarbodiimid, Diisopropylcarbodiimid, p-Nitrophenol, Pentachlorphenol und Benzylalkohol verwendet.6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als reaktives Derivat der Carboxylgruppe der Bleomycinsäure den 3-Aminopropylester verwendet.7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als reaktives Derivat der Carboxylgruppe der Bleomycinsäure den N-monosubstituierten 3-Aminopropylester verwendet.8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als N-monosubstituierten 3-Aminopropylester einen Ester aus der Gruppe 3-Acetylaminopropyl-809881/1135ester, 3-Succinylaminopropyleßter, 3-Benzoylaminopropylester, 3-Benzylaminopropylester, 3-p-Toluolsulfonylaminopropylester, 3-(2,4-Dinitrophenyl)-aminopropylester, 3-(3,5-Dimethyl-3-oxocyclohexen-1-yl)-aminopropylester, 3-(tert.-Butoxycarbonyl)-aminopropylester und 3-(Salicyliden)-iminopropylester verwendet.9. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man 1 bis 10 Äquivalente von N-[(S)-1!- Phenyläthyl]-1,3-diaminopropan pro 1 Äquivalent Bleomycinsäure einsetzt.10. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man die Bleomycinsäure und das N-[(S)-1f-Phenylethyl]-1,3-diaminopropan 1 bis 24 h lang bei 0 bis 300C reagieren läßt.11. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man 1 bis 10 Äquivalente N-[(S)-1'-Phenyläthyl]-1,3-diaminopropan pro 1 Äquivalent Bleomycinsäure-3-aminopropylester oder eines N-monosubstituierten Derivats davon einsetzt.12. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den Bleomycinsäure-3-aminopropylester oder ein N-monosubstituiertes Derivat davon und das N-[(S)-1«-Phenyläthyl]-1,3-diaminopropan 1 bis 72 h lang bei 0 bis 800C reagieren läßt.13. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel Wasser, Methanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder ein Gemisch davon verwendet.809881/113621214. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet , daß es neben üblichen Hilfs- und Trägerstoffen 3-[(S)-1!- Phenyläthylaminoj-propylaminobleomycin oder ein nicht-toxisches Salz davon enthält.809881/113 5
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7777077A JPS5414980A (en) | 1977-07-01 | 1977-07-01 | 3-((s)-1'-phenylethylamino)propylaminobleomycin |
JP12248577A JPS5463089A (en) | 1977-10-14 | 1977-10-14 | Preparation of 3-(s)-1' phenylethylaminopropylamino-bleomycin and its non-toxic salt |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2828933A1 true DE2828933A1 (de) | 1979-01-04 |
DE2828933B2 DE2828933B2 (de) | 1980-01-10 |
DE2828933C3 DE2828933C3 (de) | 1980-09-11 |
Family
ID=26418836
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19782828933 Granted DE2828933A1 (de) | 1977-07-01 | 1978-06-30 | 3- eckige klammer auf (s)-1'-phenylaethylamino eckige klammer zu -propylaminobleomycin, verfahren zu seiner herstellung und diese verbindung enthaltendes arzneimittel |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US4195018A (de) |
CA (1) | CA1078831A (de) |
CH (1) | CH634582A5 (de) |
DE (1) | DE2828933A1 (de) |
DK (1) | DK157081C (de) |
ES (1) | ES471257A1 (de) |
FR (1) | FR2396021A1 (de) |
GB (1) | GB2001962B (de) |
HU (1) | HU180894B (de) |
IT (1) | IT1105081B (de) |
NL (1) | NL7806947A (de) |
SE (1) | SE7807418L (de) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4267102A (en) * | 1979-03-05 | 1981-05-12 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | Bleomycin group antibiotics |
US4314028A (en) * | 1979-07-13 | 1982-02-02 | Bristol-Myers Company | Fermentation process for producing tallysomycin compounds |
US4246400A (en) * | 1979-07-13 | 1981-01-20 | Bristol-Myers Company | Tallysomycin compounds |
JPS5625197A (en) * | 1979-07-19 | 1981-03-10 | Microbial Chem Res Found | Cleomycin and its preparation |
EP0055716B1 (de) * | 1980-06-24 | 1984-11-07 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Antibiotische und antitumor-verbindungen mit erhöhter aktivität |
JPS58116496A (ja) * | 1981-12-29 | 1983-07-11 | Nippon Kayaku Co Ltd | アミドn置換ブレオマイシン類 |
JPS58116497A (ja) * | 1981-12-29 | 1983-07-11 | Microbial Chem Res Found | アミノプロピルアミノブレオマイシン誘導体及びその製造法 |
US4810777A (en) * | 1987-03-04 | 1989-03-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Antimicrobial compounds |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3846400A (en) * | 1969-02-15 | 1974-11-05 | Microbial Chem Res Found | Novel process for producing antibiotics bleomycin |
US3922262A (en) * | 1971-04-28 | 1975-11-25 | Nippon Kayaku Kk | N-Substituted derivatives of bleomycins |
US4032567A (en) * | 1972-02-16 | 1977-06-28 | Schering Aktiengesellschaft | Triiodoisophthalic acid monoamino acid amides, process for the preparation thereof, and use thereof as x-ray contrast media |
JPS5739751B2 (de) * | 1972-03-03 | 1982-08-23 | ||
US3971822A (en) * | 1974-07-19 | 1976-07-27 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | Aspartyl amide sweetening agents |
US4007219A (en) * | 1974-08-20 | 1977-02-08 | Hoffmann-La Roche Inc. | Benzophenone glycinamide derivatives |
GB1585076A (en) * | 1976-07-13 | 1981-02-25 | Roche Products Ltd | Peptides of phosphonic and phosphinic acids |
-
1978
- 1978-06-15 US US05/915,805 patent/US4195018A/en not_active Expired - Lifetime
- 1978-06-26 CA CA306,189A patent/CA1078831A/en not_active Expired
- 1978-06-28 NL NL7806947A patent/NL7806947A/xx not_active Application Discontinuation
- 1978-06-29 CH CH707678A patent/CH634582A5/de not_active IP Right Cessation
- 1978-06-29 ES ES471257A patent/ES471257A1/es not_active Expired
- 1978-06-30 SE SE7807418A patent/SE7807418L/xx unknown
- 1978-06-30 FR FR7819661A patent/FR2396021A1/fr active Granted
- 1978-06-30 HU HU78NI216A patent/HU180894B/hu not_active IP Right Cessation
- 1978-06-30 GB GB7828396A patent/GB2001962B/en not_active Expired
- 1978-06-30 IT IT50131/78A patent/IT1105081B/it active
- 1978-06-30 DE DE19782828933 patent/DE2828933A1/de active Granted
- 1978-06-30 DK DK299578A patent/DK157081C/da active
-
1979
- 1979-07-18 US US06/058,526 patent/US4238391A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE2828933B2 (de) | 1980-01-10 |
NL7806947A (nl) | 1979-01-03 |
DK157081C (da) | 1990-04-09 |
SE7807418L (sv) | 1979-01-02 |
US4238391A (en) | 1980-12-09 |
FR2396021A1 (fr) | 1979-01-26 |
FR2396021B1 (de) | 1983-01-07 |
DE2828933C3 (de) | 1980-09-11 |
IT7850131A0 (it) | 1978-06-30 |
IT1105081B (it) | 1985-10-28 |
US4195018A (en) | 1980-03-25 |
HU180894B (en) | 1983-05-30 |
ES471257A1 (es) | 1979-01-16 |
GB2001962B (en) | 1982-02-10 |
DK299578A (da) | 1979-01-02 |
CH634582A5 (de) | 1983-02-15 |
CA1078831A (en) | 1980-06-03 |
DK157081B (da) | 1989-11-06 |
GB2001962A (en) | 1979-02-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE2321174C2 (de) | Nonapeptidamid und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
CH634548A5 (de) | Verfahren zur herstellung von neuen peptiden. | |
DE2426304C2 (de) | ||
DE2813017C2 (de) | ||
DE2828933A1 (de) | 3- eckige klammer auf (s)-1'-phenylaethylamino eckige klammer zu -propylaminobleomycin, verfahren zu seiner herstellung und diese verbindung enthaltendes arzneimittel | |
DE2253750C3 (de) | Apovincaminsaure-alkylester, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische | |
DE2006446C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von Bleomycin-Antibiotika sowie Bleomycine mit strukturell abgewandelter Seitenkette | |
DE3888718T2 (de) | Chemische Derivate von GHL-Cu. | |
DE1543872C3 (de) | D Ser hoch 1 Nie hoch 4 Pentacosapeptid sowie Verfahren zu dessen Herstellung | |
CH570972A5 (en) | Decapeptide | |
DE2618009C3 (de) | 1-N-<a-Hydroxy-to-aminoacyl)- derivate des 3'-Deoxykanamycin A und diese enthaltende Arzneimittel | |
EP0338308A2 (de) | Substituierte N-Glycosylamide, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung als Arzneimittel | |
EP0267179A2 (de) | Neue Cystinverbindungen, ihre Herstellung und Verwendung | |
DE69009211T2 (de) | Derivate von Thiazolidin-4-carbonsäure, deren Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen. | |
DE1961947A1 (de) | 6,7-Diacyloxy-tetrahydroisochinolinverbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
DE3522638A1 (de) | Neue somatostatin-derivate | |
DE1943207C3 (de) | Tetrapeptidamide und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
DE3248358C2 (de) | ||
DE1916481A1 (de) | Hydroxylaminderivate,ihre Verwendung und Verfahren zur Herstellung derselben | |
DE2614946C2 (de) | Neue Nucleosidderivate | |
DE2901914C2 (de) | Zinksalz der 6-N-Acetylamino-capronsäure, Verfahren zu dessen Herstellung und diese Verbindung enthaltende Arzneimittel | |
DE2436694A1 (de) | Verfahren zur herstellung von 1-n(s)-alpha-hydroxy-omega-aminoacyl)-derivaten von 3',4'-dideoxyneamin oder 3', 4'-dideoxyribostamycin | |
DE3217693C2 (de) | ||
KR810001407B1 (ko) | 3-〔(s)-1'-페닐에틸 아미노〕프로필 아미노 브레오마이신의 제조법 | |
DE3873255T2 (de) | Methoden und praeparate zur vorbeugung von ulcera. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OAP | Request for examination filed | ||
OD | Request for examination | ||
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |