DK157081B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af 3-oe(s)-1'-phenylethylaminoaapropylaminobleomycin eller ugiftige salte deraf - Google Patents

Description

1 DK 157081 B

Den foreliggende opfindelse angâr en analogifremgangs-mâde til fremstilling af det hidtil ukendte 3-[(S)-1'-phenylethyl-amino]propylaminobleomycin med formlen •v

DK 157081 B

H

ÎO

\i

O / I

M' g K\

CM

W

o / o= O w

H

g=< w Ç- *=<

CM

M

O

r

CM

W K' , Μ — ü

/ W

0=0 O

^W W^ · .

O —O

«v v°-« \ ΚΛ /° ° ΚΛ k w w in

CM 0 — 0 O O

W \ / CM Μ CM

g XW W Mo M

\ 0—0 O \ ^ g .

0=0 o \ &=( M-o —— / o-ty CM / M g Μ V, \ M-0-"°

W M / g-M Ο \ Μ O

g — o 0=0 _/ / .0—0 \ \ s c o—— \

XCM M - Μ ^ \ W

Μ ο o-o Wo^ M

o \ / \ / \ ^ _ I o—g-M O—0<—

M—g -~~ O-M

SW/S=\w /¾ / n r « 0 = 0 — 0 g—( \---o—o | CM \ CM XCM \

g Μ M M W

CM s o M / o

M

3 DK 157081 B

eller ugiftige salte deraf, hvilken fremgangsmâde er ejendoxranelig ved det i kravets kendetegnende del angivne.

Bleomyciner er carcinostatiske og antibiotiske stoffer, jvf. Umezawa et al.. Journal of Antibiotics, 19A, 200, 1966. De er vandopl0selige basiske glycopeptider, som dannes af actinomyceten Streptomyces verticillus, og de danner let chelat med et atom divalent kobber. Med normal dyrkning er der dannet og isoleret 16 bleo-mycinkomponenter jvf. f.eks. Umezawa et al., Journal of Antibiotics, 19A, 210 (1966). Blandt bleomycinerne er en blanding af kobberfri A^, t og demethyl A2, som i det f0lgende betegnes "Bleomy- cin complex", blevet anvendt i udstrakt grad til klinisk behandling af cancer, og særlig gode résultater er opnâet ved behandling af squamous cellecarcinoma samt hudcancer, hoved- og halscancer, liv-moderhalscancer, lungecancer og malignt. lymphoma.

Med hensyn til bivirkninger er der imidlertid konstate-ret tilfælde med lungefibrose og andre u0nskede tilfælde. Blandt bleomycinernes bivirkninger er lungefibrose den farligste. Det er klart, at bleomycinernes carcinostatiske virkning kan udnyttes mere effektivt pâ kliniske omrâder, hvis ovennævnte bivirkning kunne for-mindskes i st0rre eller mindre grad.

I forbindelse med den foreliggende opfindelse er der blevet syntetiseret forskellige bleomyciner og gennemf0rt forskellige dyrefors0g angâende deres carcinostatiske virkning samt deres tok-sicitet, herunder specielt med hensyn til lungefibrose. Det har vist sig, at 3- [ (S) -l'-phenylethylaminojpropylaminobleomycin, der i det f01gende betegnes "NK631" omfattende sâvel kobberholdige som kobberfri former, der er et nyt bleomycin fremstillet ved omsætning af et reaktionsdygtigt dérivât af bleomycinsyrens carboxylgruppe med N-[(S)-.l' -phenylethyl3-'l/3-diaminopropan, har bemærkelsesværdig ringe bivirkning med hensyn til at fremkalde lungefibrose og lige sâ god carcinostatisk virkning som det kommercielle bleomycinkompleks og andre kendte bleomyciner.

Ved fremgangsmâden if01ge opfindelsen tilvejebrin-ges et hidtil ukendt bleomycin, 3-[(S)-1'-phenylethylamino]-propylaminobleomycin, samt ugiftige salte deraf.

I det f0lgende illustreres den fremragende biologiske virkning af bleomycinet med formlen (ï) under henvisning til for-s0gseksempler.

4 DK 157081 B

Den biologiske virkning af NK631 sammenlignes med virk-ningen af et kommercielt bleomycinkompléks og 3-[(R,S)-llphenyl-ethylamino]propylaminobleomycin-monosulfat (kobberfri form) (i det f0lgende betegnet "RS-form") i de f0lgende 4 fors0g. RS-formen er fremstillet under anvendelse af fermenteringsfremgangsmâden if0lge beskrivelsen til ü.S. patent nr. 3.846.400. Der foretages sammenlig-ning af f01gende egenskaber: 1. Lungefibrose 2. Antitumorvirkning 3. Antimikrobiel virkning 4. Toksicitet 1. Lungetoksicitet pâ mus (fibrose)

Til fors0get anvendes 15 uger garnie hanmus (stamme icr) idet der anvendes 12 dyr pr. gruppe. Dosis af fors0gspræparatet er 5 mg/kg. Fors0gsforbindelsen indgives ved intraperitonal injektion en gang om dagen i 10 pâ hinanden f01gende dage. Efter indgivelsen holdes dyrene under observation i 5 uger. Derpâ aflives musene og autopseres til besteramelse af graden af lungefibrose. Der foretages sammenligning af hyppigheden og graden af lungefibrose hos mus ind-givet det omhandlede bleomycin, et kommercielt bleomycinkompléks og RS-formen. De fremkomne resultater er anf0rt i den efterf0lgende ta-bel I.

Tabel I

Hyppighed Grad

Antal mus med Relativ * Totalt bed0mmel- Relativ lungefibrose værdi sestal for lun- værdi (%) gefibrose/sam- let antal dyr NK 631 mono- sulfat (Cu- 4/12 (0/33) 0f36 6/36 (0/17) 0/25 -fri form) RS-form 7/12 (0,58) 0,63 12/36 (0,33) 0,49

Bleomycin- 11/12 (0,92) 1,0 24/36 (0,67) 1,0 kompleks

5 DK 157081 B

£ ^ Bed0mmelsesgrad 0: Ingen fibrose.

" 1: Akkumulering af exudat i alveoler og fibroseagtig ændring i alveolevæggene.

" 2: Fibrose konstateres flere steder.

" 4: Spredt fibrose konstateres.

" 6 : Fibrose konstateres i mere end 2/3 af det samlede omrâde.

Det fremgâr af det ovenfor anf0rte resultater, at sammen-lignet med tilfældene ined RS-formen og bleomycinkomplekset er fibro-sen fremkaldt af NK631-monosulfat (kobberfri form) formindsket til henholdsvis ca. 1/2 og 1/3 hvad angâr hyppighed og til henholdsvis ca. 1/2 og 1/4 hvad angâr graden, hvilket viser den kliniske anven-delighed af NK631-monosulfat.

2. Antitumorvirkning 2-1. Virkning pâ kultiverede HeLa S3 celler.

ID „ besterames for hver af forbindelserne ud fra deres 50 inhibering af formeringen af HeLa celler efter dyrkning i 72 timer i nærværelse af fors0gsforbindelsen. Med NK631 fâs en ID^Q-værdi pâ 0,82 mcg/ml, hvori derimod med bleomycinkomplekset opnâs en ID^Q-vær-di pâ 1,70 mcg/ml, hvilket indicerer, at NK631 inhiberer cellevæksten dobbelt sâ kraftigt som bleomycinkomplekset. For RS-formen fâs en værdi pâ 0,80 mcg/ml, hvilket indicerer, at den har omtrent de samme inhiberende virkning som NK631-monosulfat (kobberfri form) .

2-2. Carcinostatisk virkning pâ Ehrlich musecancer (fast cancer).

g 2 x 10 celler transplanteres subcutant til inguinalom-râdet pâ 6 uger garnie hanmus (stamme ICR ). Efter 24 timers for10b indgives hver mus fors0gsforbindelsen pâ samme mâde som beskrevet i fors0gseksempel 1-2. 15 dage efter den subcutane transplantation udtages tumorer fra hver enkelt mus, og vægten af tumorerne sammen-lignes med vægten af tumorer fremkaldt hos den ubehandlede kontrol-gruppe til bestemmelse af den procentvise inhibering.

Resultaterne er anf0rt i nedenstâende tabel II, hvoraf det fremgâr, at den carcinostatiske virkning af NK631-monosulfat (kobberfri form) er sammenlignelig med virkningen af RS-formen og ca. 1,4 gange sâ kraftig som virkningen af bleomycinkomplekset.

Tabel II

DK 157081 B

bonis _Inhibering (i)_ (mg/kg x 10) NK 631- RS-form Bleomycin- monosulfat kompleks (Cu-fri form) 2,7 84 78 67 0,9 68 60 55 0,3 39 51 49 0,1 24 51 24 0,03 19 13 21 0 0 0 0 ID50 0,35 0,31 0,49 (mg/kg/dag) 2-3. Carcinostatisk vlrkning pâ ascites hepatoma hos rotter (ascites type).

g 1 x 10 AH66 celler transplanteres intraperitonealt til bughulen hos rotter (stamme Donryu). 24 timer senere indgives for-s0gsforbindelsen intraperitonealt ên gang om dagen i 10 pâ hinanden f0lgende dage. I et tidsrum pâ 30 dage efter transplantationen be-stemmes rottemes legemsvægt samt antallet af overlevende rotter. Resultaterne er anf0rt i den efterf0lgende tabel III.

Tabel III

Relative værdier for det gennemsnitlige antal levedage.

Dosis NK 631- Bleomycin- (mg/kg x 10) monosuifat RS-form kompleks (Cu-fri form) 3,12 296 298 241 1,56 269 257 257 0,78 216 196 145 0,39 163 149 116 0,19 116 121 110 0 100 100 100 -

7 DK 157081 B

Det fremgâr af tabel III, at virkningen mod AH66 ascites hepatoma for NK631-monosulfat (kobberfri form) er sammenlignelig med virkningen af RS-formen og væsentlig bedre end virkningen for bleo-mycinkomplekset i hele dosisomrâdet.

2-4. Inhiberende virkning mod squamosuscellecarcinom hos mus induceret af 20-methylcholanthren, der i det f0lgende be-tegnes "20-MC11 .

En acetoneopl0sning af 20-MC pâf0res 2 gange om ugen i 18 uger topisk pâ den barberede ryg pâ 10 uger garnie hanrotter (stamme ddy). Efter 5 uger fra begyndelsen af 20-MC pâf0ringen indgives for-s0gsforbindelsen intraperitonealt i en mængde pâ 62,5 mcg/mus 2 gange om ugen i en période pâ 15 uger. I 10bet af den f0rste uge efter afslutningen af indgivelsen af fors0gsforbindelsen foretages patologisk unders0gelse for tilfælde med carcinogenese pâ det omrâde, hvor 20-MC er blevet pâf0rt.

Résultaterne fremgâr af nedenstâende tabel IV, der viser, at NK631-monosulfat (kobberfri form) og RS-formen har en lidt kraf-tigere virkning end bleomycinkomplekset med hensyn til inhibering af carcinogenese fremkaldt af 20-MC.

Tabel D0delighed Carcinogenjsse- Inhibering hyppighed (%) NK 631-monosulfat 1/12 5/11 (45,4) 47,8 (Cu-fri form) RS-form 1/12 5/11 (45,4) 47,8

Bleomycinkompleks 2/12 5/10 (50,0) 42,5

Kontrol 1/24 20/23 (86,9) 0

De ovenfor anf0rte fors0gsresultater viser klart, at NK631--monosulfat (kobberfri form) har en væsentlig bedre antitumorvirk-ning end det kommercielle bleomycinkompleks.

3. Antimikrobiel virkning.

Den antimikrobielle virkning bestemmes ved hjælp af plade-roetoden mod Mycobacterium 607 og Bacillus subtilis PCI under anven-delse af bleomycin som standard (1.000 E/mg). Resultaterne er an-f0rt i den efterf0lgende tabel V.

8

Tabel V

DK 157081 B

M. 607 B. sub.

NK 631-monosulfat 7848 1550 (Cu-fri form) RS-form 7535 1400

Bleomycinkompleks 1234 886

Det fremgâr af de i tabel V anf0rte data, at NK631-mono-sulfat (kobberfri form) og RS-formen har en langt bedre antimikro-biel virkning end bleomycinkoraplekset.

4. Toksicitet.

4-1. Akut toksicitet (LD^q) ved intraperitoneal indgift til rotter.

Fors0gsresultaterne er anf0rt i nedenstâende tabel VI, hvoraf det fremgâr, at LD5Q-værdien for NK6 31-monosulfat (kobberfri form) er omtrentlig den samme som for bleomycinkomplekset og RS--formen.

Tabel VI

LD50 Konfidensgrænse (mg/fcg) ( signifikans- niveau 5%) NK 631-monosul- 155,0 133,6 - 179,8 ____________ fat (Cu-fri form) ; »

Rot- RS-form 150,6 129,0 - 170,6 j

Bleomycin- 168,0 130,0-217,0 i kompleks 4-2. Subakut og kronisk toksicitet hos rotter og hunde.

NK631-monosulfat (kobberfri form) har en nogenlunde samme subakutte og kroniske toksicitet hos rotter og hunde som bleomycinkomplekset. Det skal desuden bemærkes, at bleomycinkomplekset frem-

9 DK 157081 B

kalder nécrosé pâ injektionsstedet hos aile hundene i gruppen med den store dosis (1,2 rag/kg, 90 injektioner), hvorimod der i enkelte tilfælde konstateres nécrosé ved den tilsvarende dosis NK631-mono-sulfat (kobberfri form). Desuden har NK631-monosulfat (kobberfri form) en lavere lungetoksicitet en bleomycinkompleks.

De ovenfor anf0rte resultater indicerer, at toksiciteten af NK631-monosulfat (kobberfri form) er af samme st0rrelsesorden som for bleomycinkomplekset, bortset fra tilfældene med lungetoksicitet og nécrosé.

5. Konklusion.

Det fremgâr af de ovenfor anf0rte fors0gsresultater, at NK631, der er en hidtil ukendt forbindelse, har f01gende karakteristi-ske egenskaber; (1) meget lav lungetoksicitet, (2) en overraskende god antimikrobionel virkning og anti-tumorvirkning i forhold til det kommercielle bleomycinkompleks, (3) en systemisk toksicitet svarende til den systemiske toksicitet for det kommercielle bleomycinkompleks, og (4) en lav lokal toksicitet pâ injektionsstedet.

Det kan derfor forventes, at NK631 vil være nyttig til klinisk anvendelse.

Bleomycinet , NK631, syntetiseres if0lge opfindelsen ved at omsætte et reaktionsdygtigt dérivât af carboxylgruppen af bleo-mycinsyre repræsenteret med formlen

DK 157081 B

10

H

H

K

0

0=0 M

H

g=( «

Y^V

0 s=(

CM

K

o /

CM

K K

g — O (C\

0 = 0^ O

\* x/

O — O

/ xo-k w -¾ \ 0 = 0 ΚΛ / K\

ffi M W K

CM O—O O O

K \ / CM M CM

S XW K K O K

\ O—O K O \ irj S

0 = 0 O l g=£ M-Ov—^TY' 0-0

g1 a7 “ P-a )°P S

V o. g “a c/Ns X“

x-é /O-a-a ^-“c—-W

\ffi /fe=\ ίχΓ /^K /

/ Λ // W-o—__\ K

0 = 0—0 ^—\ \ 0-0 I CM \ CM v CM \

g K K K XK

cm a o K o/

K

n DK 157081 B

med N- [ (S) -11 -phenylethyl]-1,3-diaminopropan i et opl0sningsmiddel, hvorefter, om 0nsket den dannede forbindelse omdannes til et ugif-tigt sait. Nærmere betegnet kan NK631 fremstilles ved (1) omsæt-ning af et i nærværelse af et aktiveringsreagens dannet reaktivt dérivât af bleomycinsyre med N-[(S)-l'-phenylethylamino]-l,3--diaminopropan, eller (2) omsætning af bleomycinsyre-3-aminopro-pylester eller dets N-monosubstituerede dérivât med N-[(S)-1'-phenylethyl ]-l,3-diaminopropan. I det f0lgende anf0res en detaljeret be-skrivelse af disse fremgangsmâder»

Den ved fremgangsmâde (1) anvendte bleomycinsyre er en kendt forbindelse, som kan fâs ved enzymatisk spaltning af bleomy-cin i overensstemmelse med fremgangsmâden if01ge beskrivelsen til U.S. patenterne nr. 3.843.448 og nr. 3.846.400.

Udgangsmaterialet N-[(S)-11-phenylethyl]-1,3-diaminopro-pan er en hidtil ukendt forbindelse, der er blevet fremstillet i forbindelse med den foreliggende opfindelse pâ f01gende mâdeî

Phenylethylamin afk0les til ca. 0°C <?g blandes med en'cmtreri lig ækvivalent mængde acrylonitril. Blandingen holdes ved 80-100°C i 10-24 timer for at opnâ fuldstændig reaktion. Overskud af acrylonitril afdestilleres derpâ under formindsket tryk, og remanensen un-derkastes yderligere destination, hvorved fâs 3-[(S)-l’-phenyl-ethylaminojpropionitril. Den dannede forbindelse reduceres pâ i og for sig kendt mâde i nærværelse af f.eks. Raney-nikkel til dannelse af H-[(S)-l1-phenylethyl]-1,3-diaminopropan, som i det f0lgende be-tegnes "aminoforbindelse". I den efterf0lgende tabel VII er anf0rt fysiske og kemiske egenskaber for denne forbindelse.

12

DK 157081 B

Tàbel VII

Fri base Dihydrochlorid (1) Udseende Farveles væske Hvide nâle (stuetemperatur)

(2) Smeltepunkt - 223,5-224°G

(3) Kogepunkt 95°-103°C

(2 mm Hg) (4) Ultraviolet 241, 247, 252, 250, 256, 259, adsorptions- 257, 263, 267 266 (destilleret maksima (m/i) (methanol) vand) (5) Molær extinctions- - 206 (destilleret koeff. e (256 m/Lt) vand) (6) Specifik drejning [a]p5 - 20,6e (C = 1 destilleret vand) [a]p -56,38° (ufor- tyndet, =1) (7) Tyndtlagschroma-tografi (Rf-værdi) n-Propanyl-pyridin- 0,73 0,73 eddikesyre-vand (15:10:3:12 vol/vol) "Avicell"-SF® (8) Hojspændings-elektrophorese (Rm-værdi)

Myresyre-eddike- 1,52 1,52 syre-vand (25:75:900 vol/vol "Avicell"-Sî® 800 V, 10 minutter Alanin 1,0 (9) IR absorptions- 700, 760, 820, 690, 750, 820, spektrum (cm- *-) 910, 1025, 1080, 910, 980, 1020, (KBr metoden) 1130, 1200, 1065, 1075, 1305, 1350, 1150, 1205, 1370, 1450, 1385, 1460, 1495, 1605, 1500, 1515, 2850, 2940, 1590, 2500, 3300, 3375, 2850, 3000, 3500 1

Molekylformel GiiHioNo CiiHonNoClo (molekylvægt) (178,28) (251,20)

DK 157081 B

13

Som eksempler pâ anvendelige aktiveringsreagenser kan nævnes 6-chlor-l-p-chlorbenzensulfonyloxybenzotriazol (CCBT), N--ethyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat (NEPIS), îI-tert.butyl-5--methylisoxazoliura perchlorat, N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-l,2-di-hydroquinolin, di-p-nitrophenylsulfit, tri-p-nitrophenylphosphit, p-nitrophenyltrichloracetat, N-hydroxysuccinimid, dicyclohexyl-carbodiimid (DDC), l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, l-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimid, diphenylcarbodiimid, di-p-toluylcarbodiimid, diisopropylcarbodiimid, p-nitrophënol, penta-chlorphenol og benzylalkohol.

Detaljeret beskrivelse af fremgangsmâde (1):

Bleomycinsyre· (kobberfri form) opl0ses i vand, dimethyl-formairdd, dimethylsulfoxid eller en blanding deraf. Opl0sningen om-r0res ved 0-30°C, og der tilsættes et af de ovenfor anf0rte aktiveringsreagenser. Den fremkonine opl0sning indstilles pâ den for akti-veringen egnede pH-værdi pâ 3-10 ved tilsætning af uorganisk syre eller base sâsom saltsyre eller natriumhydroxid eller ved tilsætning af en organisk syre eller base sâsom trichloreddikesyre eller N--methylmorpholin. Ved denne behandling initieres aktiveringen af carboxylgruppen i bleomycinsyre. Umiddelbart efter eller i 10bet af 30 minutter efter behandlingen blandes reaktantopl0sningen med ami-noforbindelsen (som tidligere defineret) som sâdan eller efter ind-stilling af pH-værdien pâ 7,0. Blandingen holdes derpâ ved 0-30°C i 1-24 timer medens reaktionen foregâr under dannelse af NK631. En passende portion af aktiveringsreagenset eller aminoforbindelsen er 1-10 ækvivalenter pr. ækvivalent bleomycinsyre.

Med henblik pâ isolering af NK631 fra reaktionsblandingen foretages der f0rst vidtgâende udfældning af bleomycinforbindelserne ved tilsætning af 5-10 rumfang acetone pr. rumfang reaktionsblanding. Bundfaldet frafiltreres, vaskes med acetone og opl0ses i mindst mu-lig mængde destilleret vand. Den fremkomne vandige opl0sning indstilles straks pâ pH-værdien 6,3 med saltsyre eller lignende og sæt-tes til toppen af en chromatografis0jle indeholdende CM-"Se-phadex'^ C-25 (NH+-type) pakket i en vandig ammoniumchloridopl0sning. Den uomsatte bleomycinsyre passerer gennem s0jlen uden at blive ad-sorberet. Det pâ harpiksen adsorberede NK631 elueres med vandige ammoniumchloridopl0sninger med gradientkoncentrationer, der stiger trinvis eller kontinuert fra 0,05 M til 1,0 Μ. NK631 findes i de

DK 157081 B

14 blâ afgangsfraktioner med ammoniumchloridkoncentrationer pâ ca. 0,35 M til ca. 0,45 M, og som udviser ultraviolet absorption ved 292 mji. Disse fraktioner opsamles separat og ledes gennem "Amberlite" ® eller "Diaion" HP40. Det adsorberede NK631 vaskes med vand og elueres, hvorved fâs en afsaltet afgangsstr0m, hvorfra NK531 (kobberholdig form) isoleres i form af et rent, blât amorft pulver. Hydrochloridet og sulfatet af NK631 fâs ved eluering med vandig methanol indeholdende henholdsvis saltsyre og svovlsyre.

Ved denne fremgangsmâde kan den uomsatte bleomycinsyre hensigtsmæs-sigt genvindes. Det ovenfor beskrevne procestrin, hvorved der anvendes CM-"Sephadex" C-25 {kationbytter af mikroskopiske perler af et carboxyraethylgruppederivat af polysaccaridet dextran) , tjener blot til illustration og kan modificeres i nogen grad uden at resul-taterne pâvirkes væsentligt. Der kan eksempelvis anvendes vandig natriumchlorid eller vandig ammoniumsulfat som elueringsmiddel.

Fjernelsen af kobber fra det ovenfor fremstillede, kob-berholdige NK631 kan gennemf0res under anvendelse af en vilkârlig af de kendte fremgangsmâder, ved hvilken kobber fjernes ved omsæt-ning med hydrogensulfid under omdannelse af kobberet til cuprisul-fid, som bundfældes, ved en reduktion af kobberet til frit kobber med et reduktionsmiddel som beskrevet i f.eks. beskrivelsen til U.S. patent nr. 3.646.197, Ved ekstraktion af kobberet med et or-ganisk opl0sningsmiddel indeholdende et chelateringsmiddel sâsom dithizon, jvf. f.eks. Umezawa et al.. Journal of Antibiotics, 19Δ, 210 (1960), eller ved at anvende en ikke-ioribyttende, macroreticulær harpiks, jvf. f.eks. beskrivelsen til U. S. patent.nr. 3.929.993.

I det f0lgende beskrives et eksempel pâ en kobberfjernel-sesfremgangsmâde.

NK631 (kobberholdig form) opl0ses i destilleret vand, og opl0sningen hældes pâ en harpikss0jle indeholdende "Amberlite" XAD-2 (absorptionsharpiks af styren-divinylbenzencopolymer) eller "Dia-ion" HP40 (absorptionsharpiks af styren-divinylbenzencopolymer) pak-ket i destilleret vand til adsorption af NK631. S0jlen vaskes derpâ med en 5S's vandig opl0sning af ethylendiamintetraeddikesyre-di-natriumsalt (i det f0lgende betegnet "EDTA*Na2"), hvorved kobberionen fjernes ved hjælp af EDTA*Na2-opl0sningen og efterlader det kobber-fri NK631 pâ harpiksen. Harpiksen vaskes med en vandig saltopl0sning, f.eks. natriumchlorid, natriumsulfat eller natriumacetat, til fjer-

DK 157081 B

nelse af EDTA*Na2, hvorpâ harpiksen vaskes med destilleret vand.

Til sidst ledes en syrnet methanol-vandblanding, f.eks. en blanding af methanol og 0,0025 N. saltsyre (rumfangsforhold 1:1) gennem s0jlen til eluering af et stof, som udviser en ultraviolet absorption ved 290 itiju. Denne fraktion isoleres, koncentreres, indstilles pâ pH-vær-dien 6,0 og fryset0rres, hvorved fâs NK631-dihydrochlorid (kobberfri form) i form af et lysegulligt hvidt amorft pulver.

Som syre· til anvendelse til fremstillingen af den syrnede methanol-vandblanding, kan anvendes en vilkârlig syre, nâr blot den er farmaceutisk acceptabel. Nâr der eksempelvis anvendes svovlsyre eller eddikesvre, fâs et pulver af NK631-monosulfat eller -diacetat (kobberfri form).

NK631 kan pâ gængs mâde omdannes til et andet ugiftigt sait som f.eks. sulfatet eller acetatet, der ogsâ kan fâs ved frit at vælge syren, som anvendes ved elueringen.

Da aminoforbindelsen ved fremgangsmâde (1) reaqerer med den aktiverede carboxylgruppe i bleomycinsyre som f0lge af til-stedeværelsen af et aktiveringsreagens, som anvendes ved polvpeptid-synteser, forl0ber kondensationsreaktionen glat under særdeles milde betingelser. Derfor reagerer kun den primære aminogruppe i aminogrup-peforbindelsen med den aktiverede carboxylgruppe, medens den sekun-dære iminogruppe ikke indgâr i reaktionen, og der fâs sâledes for-trinsvis NK631. Dette er en bemærkelsesvis fordel ved fremgangsmâde (1).

Fremgangsmâde (2) beskrives detaljeret i det f0lgende: 3-aminopropylesteren af bleomycinsyre, som anvendes med fremgangsmâde (2), fâs let i form af dihydrochloridet (kobberholdig form) ved termisk dekomponering af bleomycin A2 til dannelse af 3--(methylmercapto)propylaminobleomycin, hvorpâ det dannede bleomycin omsættes med et halogennitril, en halogeneddikesyre, en halogeneddike-syreester eller et halogenacetamid i sur opl0sning, jvf. beskrivel-sen U.S. patent nr. 3.886.133.

Det N-monosubstituerede dérivât af 3-aminopropylesteren af bleomycinsyre, hvis aminogruppe er beskyttet, fâs i h0jt udbytte ved at opl0se dihydrochloridet af 3-aminopropylesteren af bleomycinsyre i vand eller et organisk opl0sningsmiddel sâsom methanol eller en blanding deraf, hvorpâ der langsomt til den dannede opl0sning under kraftig omr0ring sættes en ækvivalent mængde eller et lille

16 DK 157081 B

overskud af et af de kendte aminogruppebeskvttelsesreagenser i form af et pulver eller en opl0sning i et organisk opl0sningsnp-ddel · sâsom methanol, hvorefter reaktionen fâr lov til forl0be ved stue-teraperatur eller under afk0ling med is, rnedens reaktionsblandingens pH-værdi kontinuerligt holdes ved 5,0-7,5 ved tilsætning af en organisk base som f.eks. trimethylamin, triethylamin, pyridin, 1,3--diazabicyclo-[5,4,0]-7-undecen, 1,5-diazabicyclo-[3,4,0]-5-nonen, l,4-diazabicyclo[2,2,2]-oktan eller N-methylmorpholin. Som typiske eksempler pâ sâdanne N-monosubstituerede derivater kan nævnes mono-hydrochloridet af 3-acetylaminopropvlesteren af bleomycinsyre, 3--succinylaminopropylesteren af bleomycinsyre, monohydrochloridet af 3-benzoylaminopropylesteren af bleomycinsyre, monohydrochloridet af 3-benzyloxycarbonylaminopropylesteren af bleomycinsyre, monohydrochloridet af 3-p-toluensulfonylaminopropylesteren af bleomycinsyre, monohydrochloridet af 3-(2,4-dinitrophenyl)aminopropylesteren af bleomycinsyre, monohydrochloridet af 3-(3,5-dimethvl-3-oxocyclo-hexen-l-yl)aminopropylesteren af bleomycinsyre, monohydrochloridet af 3-N-tert.-butoxycarbonylpropylesteren af bleomycinsyre og monohydrochloridet af 3-N-salicylideniminopropylesteren af bleomycinsyre, jvf. beskrivelsen til U.S. patent nr. 3.886.133.

Ved fremgangsmâde (2) dannes NK631 ved omsætning mellem 3-aminopropylesteren eller den N-monosubstituerede 3-aminopropyl-ester af bleomycinsyre og aminoforbindelsen. I de tilfælde, at den N-monosubstituerede 3-aminoprôpylester af bleomycinsyre anvendes som udgangsmateriale, kan der anvendes enten et rent materiale eller en reaktionsblanding, som kan være koncentreret, og som fâs ud fra 3-aminopropylesteren af bleomycinsyre og et aminogruppebeskyttelses-reagens.

Foretrukne opl0sningsmidler til anvendelse i omsætningen af 3-aminopropylesteren eller den N-monosubstituerede 3-aminopropylesteren af bleomycinsyre og aminoforbindelsen er vand og organiske opl0sningsmidler sâsom methanol, dimethylformamid og dimethylsulf-oxid. Reaktionsblandingen henstilles ved 0-80°C i 1-72 timer under neutrale eller alkaliske betingelser, der tillader, at aminolyse-reaktionen forl0ber, hvorved NK631 dannes. Under betingelser med en st0rre pH-værdi er en længere reaktionstid ved relativ lave tem-peraturer 0nskelig, rnedens under betingelser med en lav pH-værdi foretrækkes en kort reaktionstid ved h0jere temperaturer. Den pas-

DK 157081 B

17 sende mængde af aminoforbindelsen i reaktionsblandingen er 1-10 ækvivalenter pr. ækvivalent 3-aminopropylester af bleoiaycinsyre eller et N-monosubstitueret dérivât deraf.

Med henblik pâ isolering af NK631 fra reaktionsblandingen foretages grundig fældning af bleomycinkomponenterne ved tilsætning af acetone i en mængde pâ 2-5 gange rumfanget af reaktionsblandingen. Bundfaldet frafiltreres, vaskes omhyggeligt med acetone og opl0ses derpâ i den mindst mulige mængde destilleret vand. Den fremkomne vandige opl0sning indstilles hurtigt pâ pH-værdien 6,0 ved tilsætning af saltsyre eller lignende og hældes pâ en chromatografi-s0jle med CM-,,Sephadex" C-25 (NH^-typen) pakket i en 0,05 M vandig ammoniumchloridopl0sning til adsorption af bleomycinkomponenterne pâ harpiksen. Gennem s0jlen ledes vandig ammoniumchloridopl0sning, hvori koncentrationen for0ges trinvis eller kontinuerligt fra 0,05 M til 1,0 M, hvorved den uomsatte 3-aminopropylester af bleomy-cinsyre eller et N-monosubstitueret dérivât deraf og NK631 elueres og danner blâ bând (UV absorption ved 292 mji) i afgangsvaesken med koncentrationer af ammoniumchlorid pâ henholdsvis 0,15-0,20 M og 0,35-0,45 M. Disse fraktioner opsamles separat og afsaltes ved adsorption pâ "Amberlite" XAD-2 eller "Diaion” HP40, hvorefter der vaskes med vand og elueres, og NK631 (kobberholdig form) fâs i form af et blât amorft pulver. Hydrochloridet og sulfatet fâs ved som elueringsmidler at anvende methanol-vandblandinger syrnet med henholdsvis saltsyre og svovlsyre. Den uomsatte 3-aminopropylester af bleomycinsyre eller et N-monosubstitueret dérivât deraf kan hen-sigtsmæssigt udvindes. Det ovenfor beskrevne fremgangsmâdetrin, ved hvilket der anvendes CM "Sephadex" C-25, er et typisk illustrerende eksempel, som kan modificeres i nogen grad uden væsentlig pâvirk-ning af résultaterne. Som elueringsmiddel kan eksempelvis anvendes vandigtnatriumchlorid eller vandigtammoniumsulfat.

NK631 fremstillet under anvendelse af fremgangsmâde (2) kan omdannes til den kobberfri form ved anvendelse af de ovenfor i forbindelse med fremgangsmâde (1) beskrevne kendte kobberfjernel-sesfremgangsmâder. Om n0dvendigt er det muligt at omdanne det til andre ugiftige salte sâsom hydrochloridet, sulfatet og aceta-tet.

I de efterf0lgende tabeller VIII og IX er anf0rt væsent-lige fysiske og kemiske egenskaber for NK631.

Strukturen af NK631 repræsenteret ved formlen (I) er blevet bekræftet pâ f0lgende mâde; NK631-monosulfat (kobber-

DK 157081 B

18 fri form) opl0ses i tungt vand, og der foretages bestemmelse af 13C-NMR-spektret ved hjælp af protonst0j_dekoblingsmetoden under an-vendelse af dioxan som indre standard. Signalerne som f0lge af ialt 11 13C-atomer indeholdt i aminoforbindelsen med sidekæden og 3—[(S)— -1'-phenylethylamino]propylaminogruppen konstateres ved 19,4, 26,3, 37,0, 43,5, 58,9, 128,3 (to signaler), 13Q,0 (to signaler) og 136,3 ppm. Signaler som f0lge af andre carbonatomer svarer aile til de signaler, som er fælles for bleomycinerne, jvf. Naganawa et al., Journal of Antibiotics, 30, 388 (1977).

19

DK 15708 1 B

Tabel VIII

Fysiske og kemiske egenskaber for NK 631 (kobberholdig form)

Dihydrochlorid Monosulfat (1) Udseende blât amorft pulver blât amorft pulver (2) Opl0selighed opl0seligt i vand, som for dihydro- methanol, eddike- chloridet syre, dimethylsul-foxid og dimethyl-formamid, tungt-i'opl0seligt i dioxan jog uopl0seligt i et-Ihanol, acetone, et- __! her ocr benzen__ (3) Smeltepunkt 205-207 205-207 (s0nderdeling) (°C) (4) Specifik drejning -95,6° -93,7° ,„,25 436 (destil-leret vand, C = 1,0) (5) Tyndtlagschromato- (a) 0,72 (a) 0,72 grafi (R^-værdj) (b) 0,75 (b) 0,75 (Se noterl) (6) Elektrophorese 0,80 0,80 (R^-værdi) (Alanin=l) (se note 2) (Note 1) (a) Silikagel G (et adsorptionsmiddel til tyndtlagschroma-tografi fra Merck Inc. U.S.A.), methanol-10% ammonium-acetat-10% ammoniakvand (10 : 9 : 1 vol/vol) (b) "Avicell" SF ^(adsorptionsmiddel til tyndtlags-chromatografi bestâende af krystallinsk cellulose fra FMC Corporation, U.S.A.), n-propanol-pyridin--eddikesyre-vand (15 : 10 : 3 : 12) (Note 2) ‘'Avicell" SF, myresyre-eddikesyre-vand (25 : 75 : 900 vol/vol), 800 V, 15 min.

20 DK 157081 B

-P I

d O

Ή M

> p d Λ CD >i ^ &> > 43

g -H H -H

P H d d -P

o h a a> 9 ^ ή fi p d o mr-'O'i jj en -P Ο -H σι - - * •h td m m P ή - ο Ο ο o P -p -P P O 1 ° Ή (ü 03 O g H co -r· P O >i H O 43 CO cm «S Λ

(D ni fil rd 03 ü H I

43 -H

43 a o--------—-- *w*

-P I

, 'd o

H -HP

„ *2 > P 'd >< Ό 4fi CD >i H « en > 43 £5 -P *H rH Ή h idHH'd-P _ _ · <D p M-i h a — CD - vo ° ^ iQO«HdPId oo int^cn d m d en-P o -p en k ““

Eh wmmp ho o o o

P O -PP O I O

CD fi CO O 6 H CD - '"''O

42 O >ig ο 43 en cm d Λ d S (41 d co Ο H l 44 ta a _____ CD------—--- en

® . I ,H

0) T) I H I I

44 -p S CD d H I 0 -P CD

en d d44 en îm-P-nenfi fi

-H H ÜVd H O CD

g *d f> P d >i-P d H -P N

CD ·Η Λ CD H 'd 43 CD P H O CD S

44 P tn> CD -P g -P MÜCD

O HH -P CD H -P Ό. d 43 en h h P en ^ g d * en h __ 0 43 H a -H H H d -H a - Cn CDO ^ o p h D'd en h HOHOe* co i en (D O en 4-1 CD P O g CD d Ο σ> *> *· * 44 p mind^dwdPH O oo o 01 d -P p «^cD'dg^-dCD i h

H >i tQO H+) Ρ·Η PH CXld en - -"T'O

03 43 >i g aCD^XOftd-P-PO' OJ d 43 >1 H fi| d OStnOCHOtfCUCD H t ü. o i ___________—---Ά---- --- . w I >

—s I H 11 CD

en -η -H Ο Ή en rd fi CD 44 P BS CD ' m 4J H P en * 43 P , χ 44 H 'dCD'd U h o _ M —

% fi CD C en H 43 VT CM

«.η d'd 44—'d~ enm cd ad 11

d H a P -H >©dd-POPJ3<D

c CD CD CD IP CD*>HPOPfiJ'H44

m o) .p d Hinn4JH4Jenfi4J>fiO

m -Ql H fi — ü tneM^ CD ’d 0 44 I d fi 01 H V- CD U CDfif— PII c ^ ω ω d 1 d a geno a-H a <d >i d en h p3 <i cd P O cni^HU oi , , ^ fl1 «—-

2i DK 157081 B

Tll label IX

(note 1) (a) Silikagel G, methanol-10%' s. ammoniumacetat-10% ' s ammo-niakvand (10 : 9 : 1 vol/vol) (b) "Avicell" SF, n-propanol-pyridin-eddikesyre-vand (15 : 10 : 3 : 12) (note 2) "Avicell" SF, myresyre-eddikesyre-vand (25 : 75 : 900 vol/vol, 800 V, 15 min.

Pâ tegningen viser fig. 1 og fig. 2 det ultraviolette absorptionsspektrum for bleomycin NK631, og fig. 3 og fig. 4 viser det infrar0de absorptionsspektrum for NK631.

Nærmere betegnet viser fig. 1 det ultraviolette absorptionsspektrum for 3-[(Si-l’-pbenylethylaminolpropylaminobleomyçin-di-hydrochlorid (kobberholdig form), fig. 2 viser det ultraviolette absorptionsspektrum for 3-[(S)-1*-phenylethylamino]-propylamino-bleomycin-monosulfat (kobberfri form), fig. 3 viser det infrar0de absorptionsspektrum for 3-[(S)-1'-phenylethylamino]propylaminobleo-mycin-dihydrochlorid (kobberholdig form), hvor stofpr0ven har fore-ligget i en kaliumbromidtablet, og fig. 4 viser det infrar0de absorptionsspektrum for 3-[(S)-1'-phenylethylamino]propylaminobleomy-cin (kobberfri form), hvor stofpr0ven har foreligget en kaliumbromidtablet .

Fremgangsmâden if0lge opfindelsen illustreres nærmere i de f01gende eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling af dihydrochloridet (kobberholdig form) og monosuifatet (kobberfri form) af NK631

Trin A: I 400 ml dimethylformamid opl0ses 15,0 g bleomy-cinsyre (kobberholdig form). Til opl0sningen, som holdes ved 0°C ved afk0ling, sættes 1,1 ml N-methylmorpholin og 10,3 g CCBT. Blan-dingen omr0res i 5 minutter ved 0°C, hvorpâ den blandes med 5,3 g af aminoforbindelsen og omrpres i yderligere 1 time. Efter at reak-tionen er bragt til oph0r ved tilsætning af 200 ml 25%"s vandig ed-dikesyreopl0sning, blandes reaktionsblandingen med 5 1 kold acetone til fældning af reaktionsproduktet. Bundfaldet frafiltreres, vaskes med acetone og opl0ses i 500 ml destilleret vand. Den fremkomne van-dige opl0sning indstilles straks pâ pH-værdien 6,0 og hældes pâ en s0jle indeholdende 2 1 CM "Sephadex” C-25 (NH^-type) pakket i 0,05

DK 157081 B

22 M vandig ammoniumchloridopl0sning til adsorbtion af bleomycinerne.

Under anvendelse af vandig ammoniumchloridopl0sning elueres s0jlen med ialt 20 1 eluent, hvori koncentrationen af am-moniumchlorid kontinuert for0ges fra 0,05 til 1,0 M. Den uomsatte bleomycinsyre findes i afgangsvæsken med en ammoniumchloridkon-centration pâ ca. 0,05 M, og NK631 findes i fraktionen med en am-moniumchloridkoncentration pâ ca. 0,45 M. De to fraktioner, som udviser UV-absorption ved 292 mji, opsamles hver for sig. Den NK631 holdige fraktion hældes pâ en harpikss0jle indeholdende 2,6 1 "Am-berlite" XAD-2. S0jlen vaskes derpâ omhyggeligt med vand og elueres med 0,01 N saltsyre i en blanding af methanol og vand (4:1 vol/vol). lait 2,5 1 af en blâ fraktion, som udviser UV-absorption ved 292 mju, opsamles. Efter fordampning af methanolen fra eluentfraktionen ind-stilles koncentratet pâ pH-værdien 6,0 med "Dowex" 44 (OH -type) (anionbytterharpiks bestâende af en copolymer af epichlorhydrin og ammoniak), og produktet fryset0rres, hvorved fâs 16,1 g (92%1 s ud-bytte) af NK631-dihydrochlorid (kobberholdig form) i form af et blât amorft pulver.

Pâ lignende mâde udvindes 280 mg af den uomsatte bleomycinsyre (kobberholdig form).

NK631-dihydrochloridet (kobberholdig form) har f0lgende ultraviolette absorptionsmaksima og antimikrobielle styrke: UV-absorptionsmaksima: 1% mu (E.° , destilleret vand) ~ 1 cm 242 (151) 292 (121)

Antimikrobiel styrke: 8.100 E/mg

Den antimikrobielle styrke bestemmes under anvendelse af Mycobacterium smegmatis ATCC 607 som fors0gsorganisme, og idet styr-ken af bleomycin (kobberfri form) sættes til 1.000 E/mg. Dette gælder ogsâ i det f01gende.

Trin B: I 200 ml destilleret vand opl0ses 10,0 g NK631--dihydrochlorid (kobberholdig form). Opl0sningen hældes pâ en s0jle indeholdende 600 ml "Amberlite" XAD-2 pakket i destilleret vand.

S0jlen vaskes derpâ f0rst med 2 1 vandig opl0sning indeholdende 5%'s EDTA*Na2, derpâ med 2,5 1 5%'s vandig natriumsulfatopl0sning og til sidst med 630 ml destilleret vand. Derpâ elueres s0jlen med 0,0025 N svovlsyre i en methanol-vandblanding (1:1 vol/vol). Der opsamles ialt 900 ml fraktioner indeholdende et stof, som har en UV-absorp-tion ved 290 πιμ. Efter fjernelse af methanolen ved destination ind-

23 DK 157081 B

stilles remanensvæsken pâ pH-værdien 6,0 med "Dowex" 44 (OH “type), hvorpâ der fryset0rres, og der fâs 9,3 g (95%'s udbytte) NK631-mono-sulfat (kobberfri form) i form af et lyst gullighvidt amorft pulver. Dette produkt udviser f0lgende UV-absorptionsmaksimum og antimikro-bielle styrke:

N

UV-absorption maksimum: mu (E^° 0,1 N saltsyre) 290 (106)

Antimikrobiel styrke: 7.865 E/mg.

Eksempel 2

Fremstllllng af NK631-dihydrochlorid (kobberholdig form) I 40 ml destilleret vand opl0ses 1,5 g bleomycinsyre (kobberholdig form). Til den omr0rte opl0sning ved 26°C sættes 800 mg nepis, medens reaktionsblandingens pH-værdi holdes pâ 4,8-5,5 ved tilsætning af 0,1 N vandig natriumhydroxidopl0sning. Efter 30 minut-ter tilsættes blandingen en opl0sning, som er fremstillet ved op-10sning af 1,8 g af aminoforbindelsen i 20 ml destilleret vand og indstilling af pH-værdien pâ 7,0 med saltsyre. Blandingen henstil-les i 20 timer ved 26°C. Til reaktionsblandingen sættes under om-r0ring 600 ml kold acetone til udfældning af bleomycinkomponenterne. Bundfaldet isoleres ved filtrering, vaskes med acetone, opl0ses i 30 ml destilleret vand, hvorefter pH-værdien straks indstilles pâ 6,0 med 0,1 H saltsyre. Den fremkomne vandige opl0sning renses analogt med den i trin A i eksempel 1 beskrevne fremgangsmâde, og der fâs 932 mg (53%'s udbytte) af NK631-dihydrochlorid (kobberholdig form) i form af et blât amorft pulver med en antimikrobiel styrke pâ 8.073 E/mg.

Eksempel 3

Fremstilling af NK631-dihydrochlorid (kobberholdig form).

I 40 ml dimethylsulfoxid opl0ses 1,5 g bleomycinsyre (kobberholdig form). Til den omr0rte opl0sning ved 30°C sættes 740 mg af N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-l,2-dihydroquinolin og 0,1 ml N-methylmorpholin. Til blandingen, som er blevet omr0rt i 30 minutter, sættes under omr0ring 530 mg af aminoforbindelsen, og blandingen henstilles i 3 timer ved 30°C. Til reaktionsblandingen sættes under omr0ring 600 ml kold acetone til udfældning af bleomycinkomponenterne. Bundfaldet frafiltreres, vaskes med acetone, hvorpâ det opl0ses i 24

DK 157081 B

30 ml destilleret vand, hvorefter pH-værdien straks indstilles pâ 6,0 med 0,1 N saltsyre. Den fremkomne vandige opl0sning behandles analogt med den i eksempel 1 trin A beskrevne fremgangsmâde, og der fâs 809 mg (46%'s udbytte) af NK631-dihydrochlorid (kobberholdig form) i form af et blât amorft pulver, som har en antimikrobiel styrke pâ 8.028 E/mg.

Eksempel 4

Syntese af NK631-dihydrochlorid (kobberholdig form) I 40 ml destilleret vand opl0ses 1,5 g bleomycinsyre (kobberholdig form). Efter tilsætning af 1,2 g l-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid ved 27°C indstilles blandingen pâ pH-værdien 4,5 med 0,1 N saltsyre. Efter tilsætning af 530 mg af aminoforbindelsen indstilles blandingens pH-værdi pâ 5,0 med 1 N saltsyre, og blandingen henstilles i 20 timer ved 27°C. Til reak-tionsblandingen sættes under omr0ring 400 ml kold acetone til fæld-ning af bleomycinkomponenterne. Bundfaldet frafiltreres, vaskes med acetone, hvorefter det opl0ses i 30 ml destilleret vand, og pH-vær-dien indstilles straks pâ 6,0 med 0,1 N natriumhydroxidopl0sning.

Den fremkomne vandige opl0sning renses analogt med den i eksempel 1 trin A beskrevne fremgangsmâde, og der fâs 440 mg (25%'s udbytte) af NK631-dihydrochlorid (kobberholdig form) i form af et blât amorft pulver med en antimikrobiel styrke pâ 7.985 E/mg.

Eksempel 5

Fremstilling af NK631-dihydrochlorid (kobberholdig form) I 16 ml methanol opl0ses 9,0 g bleomycinsyre-3-N-benzoyl-aminopropylester-monohydrochlorid (kobberholdig form). Under afk0-ling af opl0sningen til 0°C tilsættes 9,16 g af aminoforbindelsen. Efter fortsat omr0ring i 40 timer ved 0°C sættes kold acetone til reaktionsblandingen til udfældning af reaktionsprodukterne. Bundfaldet frafiltreres, vaskes med acetone og opl0ses i 300 ml destilleret vand. Opl0sningen indstilles straks pâ pH-værdien 6,0 med 0,1 N saltsyre og hældes pâ en s0jle indeholdende 1 1 CM "Sephadex" C-25 (NH^type) pakket i 0,05 M vandig ammoniumchloridopl0sning til adsorption af bleomycinerne. Under anvendelse af vandige ammonium-chloridopl0sninger som eluent gennemf0res elueringen under anvendelse af 10 1 elueringsvæske, hvori koncentrationen af ammoniumchlorid kontinuert stiger fra 0,05 til 1,0 M. Den uomsatte 3-N-benzoylamino-propylester af bleomycinsyre findes i afgangsvæsken med en ammonium-

25 DK 157081 B

chloridkoncentration pâ ca. 0,2 M, og NK631 findes i afgangsvæsken med en ammoniumchloridkoncentration pâ ca. 0,45 M. De to fraktioner, sorti udviser UV-absorbtion ved 272 ταμ, opsamles hver for sig. Fraktio-nen indeholdende NK631 hældes pâ en harpikss0jle indeholdende 1,3 1 "Amberlite" XAD-2. S0jlen vaskes derpâ omhyggeligt med vand og elu-eres med 0,01 N saltsyre i en blanding af methanol og vand (4 : 1 vol/vol). Der opsamles ialt 2,5 1 af en blâ fraktion, som udviser en UV-absorbtion ved 292 m^a. Efter f jernelse af methanolen ved de-stillation og indstilling af pH-værdien pâ 6,0 med "Dowex" 44 (OH -type) fryset0rres fraktionen, og der fâs 8,2 g (90%'s udbytte) NK631-dihydrochlorid (kobberholdig form) i form af et blât amorft pulver méd en antimikrobiel styrke pâ 8.030 E/mg.

Pâ tilsvarende mâde genvindes 910 mg af det uomsatte bleomycinsyre-3-N-benzoylaminopropylester-monohydrochlorid (kobberholdig form) .

Eksempel 6

Fremstilling af NK631-dihydrochlorid (kobberholdig form) I 3 ml methanol opl0ses 950 mg bleomycinsyre-3-N-p--toluensulfonylaminopropylester-monohydrochlorid (kobberholdig form). Til opl0sningen, som omr0res ved 0°C, sættes 980 mg af aminoforbin-delsen, og blandingen omr0res i 48 timer ved 0°C. Til reaktionsblan-dingen sættes under omr0ring 15 ml kold acetone til udfældning af bleomycinkomponenterne. Bundfaldet frafiltreres, vaskes med acetone og opl0ses i 30 ml destilleret vand, hvorefter pK-værdien straks ind-stilles pâ 6,0 med 0,1 N saltsyre. Den fremkomne opl0sning renses under anvendelse af fremgangsmâden if0lge trin A i eksempel 5, og der fâs 833 mg (85%'s udbytte) af NK631-dihydrochlorid (kobberholdig form) i form af et blât amorft pulver med en antimikrobiel styrke pâ 8.010 E/mg.

Eksempel 7

Fremstilling af NKeil-dihydrochlorid (kobberholdig form) I 5 ml dimethylformamid opl0ses 850 mg bleomycinsyre-3--acetylaminopropylester-monohydrochlorid (kobberholdig form). Til opl0sningen sættes under omr0ring 0°C 950 mg af aminoforbindelsen, og blandingen omr0res i 45 timer ved 0°C. Til reaktionsblandingen sættes under omr0ring 20 ml kold acetone til udfældning af bleomycinkomponenterne. Bundfaldet frafiltreres, vaskes med acetone, hvorpâ det opl0ses i 30 ml destilleret vand, og pH-værdien indstilles straks

26 DK 157081 B

pâ 6,0 med 0,1 N saltsyre. Den fremkomne opl0sning behandles analogt med den i trin A i eksempel 1 beskrevne fremgangsmâde, og der fâs 570 mg (63%'s udbytte) af NK631-dihydrochlorid (kobberholdig fora) i fora af et blât amorft pulver med en antimikrobiel styrke pâ 8.010 E/mg.

Eksempel 8

Fremstilling af NK631-dihydrochlorid (kobberholdig fora).

I 3 ml dimethylsulfoxid opl0ses 900 mg bleomycinsyre -3-N-(2,4-dinitrophenyl)-aminopropylester-monohydrochlorid (kobberholdig fora). Til opl0snxngen, som omr0res ved 0°C, sættes 793 mg af aminoforbindelsen, og blandingen omr0res i 24 timer ved 0°C. Til reaktionsblandingen sættes under omr0ring 15 ml kold acetone til fældning af bleomycinkomponenterne. Bundfaldet frafiltreres, vaskes med acetone, hvorpâ det opl0ses i 30 ml destilleret vand, og pH-vær-dien indstilles straks pâ 6,0 med 0,1 N saltsyre. Den fremkomne van-dige opl0sning renses analogt med den i eksempel 5^ trin A beskrevne fremgangsmâde, og der fâs 690 mg (78%'s udbytte) af NK631-dihydro-chlorid (kobberholdig fora) i fora af et blât amorft pulver med en antimikrobiel styrke pâ 8.010 E/mg.

Eksempel 9

Fremstilling af NK631-dihydrochlorid (kobberholdig fora) og kobberfrit dihydrochlorid.

I 10 ml methanol opl0ses 1,0 g bleomycinsyre-3-aminopropyl-ester-dihydrochlorid (kobberholdig fora). Opl0sningen omr0res kraf-tigt, og der tilsættes drâbevis 104 mg benzoylchlorid i 10bet af 30 minutter, medens opl0sningens pH-værdi holdes pâ 6,5-7,5 ved tilsæt-ning af l,4-diazabicyclo[2,2,2]octan. Efter omr0ring i yderligere 30 minutter koncentreres reaktionsblandingen til 2 ml. Den koncen-trerede blanding afk0les til 0°C, og der tilsættes under omr0ring 1,1 g af aminoforbindelsen, og blandingen omr0res i 72 timer ved 0°C. Til reaktionsblandingen sættes under omr0ring 6 ml kold acetone til fældning af bleomycinkomponenterne. Bundfaldet frafiltreres, vaskes med acetone og opl0ses i 30 ml destilleret vand, hvorefter pH--værdien straks indstilles pâ 6,0 med 0,1 N saltsyre. Den fremkomne vandige opl0sning hældes pâ en s0jle indeholdende 100 ml CM "Sephadex" (NH^-type) pakket i 0,05 M vandig ammoniumchloridopl0sning til adsorb-tion af bleomycinkomponenterne. Det adsorberede materiale behandles analogt med den i eksempel 5 trin A beskrevne fremgangsmâde, og der

27 DK 157081 B

fâs 779 mg (73%'s udbytte) af NK631-dihydrochlorid (kobberholdig form) i form af et blât amorft pulver med en antimikrobiel styrke 8.000 E/mg.

Desuden genvindes 240 mg af det uomsatte bleomycinsyre--3-N-benzoylaminopropylester-monohydrochlorid (kobberholdig form).

Trin B: I 20 ml destilleret vand opl0ses 700 mg NK631--dihydrochlorid (kobberholdig form) fremstillet som beskrevet oven-for i trin A. Opl0sningen hældes pâ en s0jle indeholdende 65 ml "Diaion" HP-40 pakket i destilleret vand til adsorbtion af bleomy-cinkomponenterne. S0jlen vaskes derpâ med 200 ml vandig opl0sning indeholdende 5% EDTAïNa2, derpâ med 250 ml 5%'s vandig natriumchlo-ridopl0sning og til sidst med 100 ml destilleret vand. Derpâ elu-eres s0jlen med en blanding af methanol og 0,0025 N vandig saltsyre (1:1 vol/vol), og der opsamles 98 ml af fraktionen, som udviser ultraviolet absorbtion ved 290 mp. Efter fjernelse af methanolen ved destination undér :formindsket tryk indstilles remanensvæsken pâ pH-værdien 6,0 med "Dowex" 44 (OH “typé) og fryset0rres, og der fâs 658 mg (98%'s udbytte) af NK631 dihydrochlorid (kobberfri form) i form af et lyst gullighvidt amorft pulver med en antimikrobiel styrke pâ 7.834 E/mg.

Eksempel 10

Fremstilling af NK631-monosulfat (kobberholdig form) og dieddikesyresaltet (kobberfri form).

Trin A: I 10 ml methanol opl0ses 1,0 g bleomycinsyre--3-aminopropylester-dihydrochlorid (kobberholdig form). Opl0sningen omr0res kraftigt ved stuetemperatur, og der tilsættes drâbevis 104 mg benzoylchlorid i l0bet af 30 minutter, medens opl0sningens pH--værdi holdes pâ 5,0-7,5 ved tilsætning af N-methylmorpholin. Efter omr0ring i vderligere 30 minutter sættes 50 ml acetone til reaktions-blandingen til fældning af bleomycinkomponenterne. Bundfaldet fra-filtreres, vaskes med acetone, hvorpâ det opl0ses i 3 ml methanol.

Til methanolopl0sningen, som afk0les til 0°C og omr0res, sættes 597 mg af aminoforbindelsen, og blandingen omr0res i 42 timer ved 0°C. Til reaktionsblandingen sættes under omr0ring 10 ml kold acetone til fældning af reaktionsproduktet. Bundfaldet frafiltreres, vaskes med acetone, opl0ses i 30 ml destilleret vand, hvorefter pH-værdien straks indstilles pâ 6,0 med 0,1 N saltsyre. Den vandige opl0sning behandles med CM-" Sephadex" analogt med den i eksempel 5 trin A beskrevne fremgangsmâde. Fraktionen indeholdende reaktions-produkterne hældes pâ en s0jle indeholdende 65 ml "Diaion" HP-40

28 DK 157081 B

pakket i âestilleret vand til adsorbtion af bleomycinkomponenterne pâ harpiksen. Efter vaskning med vand elueres den adsorberede fase med en blanding af methanol og 0,01 N vandig svovlsyre (1 : 1 vol/vol), og der opsamles 130 ml af en fraktion, soin udviser ultraviolet absorption med 292 ημ. Efter fjernelse af methanolet ved destination ind-stilles remanensvæsken pâ pH-værdien 6,0 med "Dowex" 44 (OH type) og fryset0rres, og der fâs 813 mg (75%'s udbytte) af en NK631-monosul-fat (kobberholdig form) i form af et blât amorft pulver med en anti-mikrobiel styrke pâ 7.819 E/mg.

Trin B: 800 mg af det ovenfor i trin A fremstillede NK631--monosuifat (kobberholdig form) underkastes en kobberfjernelsesbe-handling analogt med den i trin B i eksempel 9 beskrevne fremgangs-mâde, med den undtagelse, at i elueringstrinnet anvendes der i en 5%'s vandig ammoniumacetatopl0sning og en blanding af methanol og 0,01 N vandig eddikesyre (1:1 vol/vol) i stedet for 5%'s vandig natriumchloridopl0sning og blandingen af methanol og 0,0025 N vandig saltsyre (1 : 1 vol/vol). Der fâs 748 mg (96%'s udbytte) NK631 di-acetat (kobberfri form) i form af et lyst gullighvidt amorft pulver. Dette produkt udviser f01gende UV-absorptionsmaksimum og antimikrobiel UV-absorptionsmaksimum: πιμ El°cm N saltsyre 290 (105)

Antimikrobiel styrke: 7.620 E/mg.

Eksempel 11

Fremstilling af NK631-dihydrochlorid (kobberholdig form) og kobberfrit dihydrochlorld.

I 3 ml methanol opl0ses 1,0 g bleomycinsyre-3-aminopropyl-ester-dihydrochlorid. Til opl0sningen sættes drâbevis ved stuetempe-ratur 193 mg S-tert.-butoxycarbonyl-4,6-dimethyl-2-mercaptopyrimidin i I0bet af 60 minutter, medens pH-værdien holdes pâ 6,0-7,4 ved til-sætning af 14%'s triethylamin i methanol. Blandingen omr0res i yder-ligere 2 timer til dannelse af 3-N-tert.-butoxycarbonylaminopropyl-esteren af bleomycinsyre. Blandingen afk01es derpâ til 0°C, blan-des med 1,2 g af aminoforbindelsen og omr0res i 70 timer. Til reak-tionsblandingen sættes 10 ml kold acetone til udfældning af bleomycinkomponenterne. Bundfaldet frafiltreres, vaskes med acetone, op-

29 DK 157081 B

l0ses i 30 ml destilleret vand, hvorpâ pH-værdien straks indstilles pâ 6,0 med 0,1 N saltsvre. Den fremkomne vandige opl0sning renses analogt med den i eksempel 5 trin A beskrevne fremgangsmâde, og der fâs 597 mg (56%'s udbytte) af NK631-dihydrochlorid (kobberholdig form) i form af et blât amorft pulver med en antimikrobiel styrke pâ 8.010 E/mg.

Trin B: I 50 ml methanol opl0ses 500 ml NK631-dihydro-chlorid (kobberholdig form) fremstillet if01ge trin A ovenfor. Op-10sningen omr0res kraftigt, og der tilf0res hydrogensulfid gennem en neddyppet dyse med en indre diameter pâ 1 mm i 1 time til opl0s-ning af et stort overskud af hydrogensulfid i opl0sningen, Efter endt tilsætning af hydrogensulfid henstilles opl0sningen i 30 minut-ter ved stuetemperatur. Det udfældede kobbersulfid frafiltreres og vaskes med 50 ml methanol mættet med hydrogensulfid. Filtratet og vaskevæskerne kombineres og befries for methanolen og hydrogensul-fidet ved destination under formindsket tryk. Remanensen opl0ses i 50 ml methanol og blandes med 100 ml ethylether. Det dannede bund-fald frafiltreres, vaskes med ether og t0rres, og der fâs 394 mg (82% 1 s udbytte) af NK631-dihydrochlorid (kobberfri form) i form af et lyst gullighvidt amorft pulver med en antimikrobiel styrke pâ 7.820 E/mg.

Eksempel 12

Fremstilling af NK631-dihydro'chlorld (kobberholdig form) og kobberfrit dihydrochlorid.

Trin A: I 2 ml methanol opl0ses 1,0g bleomycinsyre-3--aminopropylester-dihydrochlorid (kobberholdig form). Opl0sningen omr0res kraftigt ved stuetemperatur, og der tilsættes 98 mg sali-cylaldehyd, medens opl0sningens pïï-værdi hôldes pâ 7,0-7,4 ved tilsætning af triethylamin, til dannelse af bleomycinsyre-3-N-sali-cylideniminopropylester. Omr0ringen fortsættes i 1 time, og til blandingen, som afk0les til 0°C, sættes under omr0ring 600 ml af aminoforbindelsen. Blandingen omr0res i 30 timer. Til reaktionsblan-dingen sættes 10 ml kold acetone til fældning af bleomycinkomponen-terne. Bundfaldet frafiltreres, vaskes med acetone og opl0ses i 30 ml destilleret vand, hvorefter pll-værdien straks indstilles pâ 6,0 med 0,1 N saltsyre. Den fremkomne vandige opl0sning renses under an-vendelse af den i eksempel 5 i trin A beskrevne fremgangsmâde, og der 30

DK 157081 B

fâs 501 mg (47%'s udbytte) af NK631-*dihydrochlorid (kobberholdig form) med en antimikrobiel styrke pâ 8.013 E/mg.

Trin B: I 25 ml 0,5 N saltsyre opl0ses 450 mg NK631-dihydro--chlorid (kobberholdig form) fremstillet som beskrevet ovenfor i trin A. Til opl0sningen sættes 25 ml af en chloroformopl0sning indeholdende 0,2% dithizon (diphenylthiocarbazon). Efter hurtig omryst-ning og blanding henstilles blandingen, som derved adskiller i to lag. Det nedre lag (chloroformfasen) fjernes, og det 0vre lag blan-des med 25 ml frisk chloroformopl0sning indeholdende dithizon. Den-ne behandling omfattende rystning, faseadskillelse og tilsætning af frisk chloroformopl0sning indeholdende dithizon gentages 8 gange.

Til sidst vaskes det 0vre lag (vandigt lag) med chloroform, og det isolerede vandige lag indstilles pâ pH-værdien 6,0 med "Dowex" 44 (OH -type). Det sâledes behandlede vandige lag inddampes under for-mindsket tryk til t0rhed, og der fâs 415 mg (96%'s udbytte) af NK631--dihydrochlorid (kobberfri form) i form af et lyst gullighvidt amorft .pu1ver med en antimikrobiel styrke pâ 7.845 E/mg.

Eksempel 13

Fremstilling af NK631-dihydrochlorid (kobberholdig form).

I 2 ml methanol opl0ses 1,0 g bleomycinsyre-3-aminopropyl-ester-dihydrochlorid (kobberholdig form). Til opl0sningen, som er afk0let til 0°C, sættes under omr0ring 1,0 g af aminoforbindelsen, og blandingen omr0res i yderligere i 72 timer. Til reaktionsblandin-gen sættes under omr0ring 6 ml kold acetone til udfældning af bleomy-cinkomponenterne. Bundfaldet renses analogt med den i eksempel 5 trin A beskrevne fremgangsmâde, og der fâs 128 mg (12%1 s udbytte) af NK631-dihydrochlorid (kobberholdig form) i form af et blât amorft pulver med en antimikrobiel styrke pâ 8.015 E/mg.

Fremstilling af N-[(S)-1*-phenylethylJ-1,3-diamlnopropan.

Til 50 g (S)-1-phenylethylamin afk0let til 0°C sættes 33 g acrylonitril under omr0ring. Blandingen anbringes i en kolbe forsynet med en tilbagesvaler forbundet med et kalciumchloridr0r, og der opvarmes til 93°C, ved hvilken temperaturblandingen omr0res i 18 timer. Efter endt reaktion befries reaktionsblandingen for over-skud af acrylonitril ved destination under formindsket tryk. Rema-nensen destilleres under formindsket tryk, og der opsamles en frak-tion, som koger ved 142-145°C/7 mmHg , hvorved fâs 53,5 g 3— ['(S) —11 — -phenylethylamino]propionitril. Dette nitril anbringes i en autoklav

DK 157081 B

sammen med 5 g Raney-nikkel W-7 og 50 ml éthanol indeholdende 15% ammoniak. Blandingen omr0res med 1.000 omdrejninger pr. minut i 1,5 timer ved 50-58°C under et hydrogerrpartialtryk pâ 100-40 kg/cm^. Efter endt reduktion destilleres reaktionsblandingen under formind-sket tryk. En fraktion, som koger ved 95-103°C/2 mmHg, opsamles, hvor-ved fâs 48,3 g N-[ (S)-11-phenylethyl]-1,3-diaminopropan (66%'s teore-tisk udbytte beregnet pâ (S)-1-phenylethylamin).

Claims (11)

32 DK 157081 B Patentkrav.

1. Analogifremgangsmâde til fremstilling af 3—[(S)—11 — -phenylethylamino]propylaminobleoitiycin med formlen Φ Ao i W g K\ CM W o Ά S ! 0=0 W H CO / 'cm W O / CM — Ο [Λ o = o( g W W O — o / Xo-w w-s \ CC\ /° ° tOv W W W Uj ^ . o-ox O O S \h hh/ W CM ^ WW W O w \ w O 'o-W S CM /°=° § U S=< g g o r/ s-w > 1 K \> s — 0=0^ U -/ X o—o 'MN W w ^ W ü\ \ HJ w o^ /0 — 0 WO XW w > o — w-w ο—ο-~___Λ\ ^ \Ξ \w / \ W / W / o-X /)-O / o-o-w 0 = 0 — 0 'W-—\ \ ~~---0 — 0 W EiT1 W ™ w o w / w DK 157081 B eller et ugiftigt sait deraf, kendetegnet ved, at et reak-tivt dérivât af carboxylgruppen i bleomycinsyre med formlen K o - 0=0 K y/ CO K rt cm K O / CM K K s —O tn / κ O — O7 o ^K ffi/ O — O / ^o — w κ -¾ \ 0 = 0 ^ / iT1 trj Μ K K S cm 0 — 0 O cm pp £1 S NjTj tri KO S \ 0—0 P /\___^0-K -7 'ο = ο οΧ \ ,, *=< a a7 * / 31-® Χ,'ο-S ° K — O 0=0 >=< o - \M V oN > —S "> ? ^o-sZ-a O-o(-->0_K w-a B=/ ^ V. / w / \ ^ / o-o-a M-0c-->o-§ °-8-§ xa aN M § /g K

34 DK 157081 B omsættes med N-[(S)-1'-phenylethyl]-1,3-diaminopropan i et opl0snings-middel, hvorefter, om 0nsket, den dannede forbindelse omdannestil et ugiftigt sait.

2. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at det ugiftige sait er hydrochloridet, sulfatet eller acetatet.

3. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at det reaktive dérivât af carboxylgruppen i bleomycinsyre er dannet under anvendelse af en forbindelse valgt blandt 6-chlor-l--p-chlorbenzensulfonyloxybenzotriazol, N-ethyl-5-phenylisooxazolium--3'-sulfonat, N-tert.-butyl-5-methylisooxazolium-perchlorat, N-ethoxy-carbonyl-2-ethoxy-l,2-dihydroquinolin, di-p-nitrophenylsulfit, tri--p-nitrophenylphosphit, p-nitrophenyltrichloracetat, N-hydroxysuccin-imid, dicyclohexylcarbodiimid, l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbo-diimid, l-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimid, diphenylcarbo-diimid/ di-p-toluylcarbodiimid/ diisopropylcarbodiimid, p-nitrophenol, pentachlorphenol og benzylalkohol.

4. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at det reaktive dérivât af carboxylgruppen i bleomycinsyre er 3-aminopropylesteren.

5. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at det reaktive dérivât af carboxylgruppen i bleomycinsyre er N-monosubstitueret 3-aminopropylester.

6. Fremgangsmâde if01ge krav 5., kendetegnet ved, at den N-monosubstituerede 3-aminopropylester er en ester valgt blandt 3-acetylaminopropylester, 3-succinylaminopropylester, 3-benz-oylaminopropylester, 3-benzylaminopropylester, 3-p-toluensulfonyl-aminopropylester, 3-(2,4-dinitrophenyl) aminopropylester, 3-(3,5--dimethyl-3-oxocyclohexan-l-yl)aminopropylester, 3-(tert.-butoxy-carbonyl)aminopropylester og 3-(salicyliden)iminopropylester.

7. Fremgangsmâde if01ge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes 1-10 ækvivalenter N-[(S)-1'-phenylethyl]-1,3--diaminopropan pr. ækvivalent bleomycinsyre.

8. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at bleomycinsyre og N-[(S)-1'-phenylethyl]-1,3-diaminopropan omsættes ved 0-30°C i 1-24 timer.

9. Fremgangsmâde if01ge krav 1, kendetegnet ved, at 1-10 ækvivalenter N-[(S)-1'-phenylethyl]-1,3-diaminopropan « DK 157081 B anvendes pr. ækvivalent bleomycinsyre-3-aminopropylester eller et N-monosubstitueret dérivât deraf.

10. Fremgangsmâde if01ge krav 1, kendetegnet ved, at bleomycinsyre-3-aminopropylester eller et N-monosubstitueret dérivât deraf og N-[(S)-l'-phenylethyl]-1,3-diaminopropan omsættes ved 0-80°C i 1-72 timer.

11. Fremgangsmâde if01ge krav 1, kendetegnet ved, at der sorn opl0sningsmiddel anvendes vand, methanol, dimethyl-formamid, dimethylsulfoxid eller en blanding deraf.