DE2828933B2

DE2828933B2 -

Info

Publication number: DE2828933B2
Application number: DE2828933A
Authority: DE
Inventors: Akio Kamakura Fujii; Takeyo Tokio Fukuoka; Yasuhiko Kitamoto Muraoka; Tomohisa Oaza Negishi Asaka Takita; Hamao Tokio Umezawa; Osamu Yono Yoshioka
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1977-07-01
Filing date: 1978-06-30
Publication date: 1980-01-10
Also published as: DE2828933C3; DE2828933A1; ES471257A1; FR2396021A1; IT1105081B; US4238391A; IT7850131A0; GB2001962B; NL7806947A; SE7807418L; DK157081C; DK299578A; FR2396021B1; US4195018A; GB2001962A; HU180894B; DK157081B; CA1078831A; CH634582A5

Description

Cl HO CH N

C Cl CH C

!I C

Cl

Il

C-ClH

H(I

Η,Ν I C Cl CH C CH NH

CU₁ I Il I ! i I

N C CH O CH CH, ι

CH N CH, O CHj CH,

CH H

\ H C) [T j

I I .--"N-x

C CHjH

CHj	C	O
	OH
	i C
■ η c

Il OH Il il

ί Η

: ι

C C

Il ! (') C

on I !

C H

O Nil,

CH, OM

mit N-[(S)-l'-Phenyläthyl]-l,3-diaminopropan in einem Lösungsmittel in an sich bekannter Weise umsetzt und erforderlichenfalls das Produkt in ein nicht-toxisches Salz überführt.

4. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es neben üblichen Hilfs- und Trägersto.Ten 3-[(S)-I'-Phenyläthylamino]-propylaminobleomycin oder ein nicht-toxisches Salz davon enthält.

Die Erfindung betrifft 3-[(S)-l'-Phenyiathylamino]-propylaminobleomycin, dessen nicht-toxische Salze, ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel.

Bleomycine sind karzinostatische Antibiotika, die von Umezawa et al. entdeckt wurden (Journal of Antibiotics, 19A₁ 200 [ 1966j). Es handelt sich um wasserlösliche basische Glycopeptide, die durch Actinomycete Streptomyces verticillus erzeugt werden. Diese Verbindungen sind dazu imstande, leicht ein Atom von zweiwertigem Kupfer zu chelieren. Bei der normalen Kultivierung werden 16 Komponenten von Bleomycinen erzeugt und isoliert (vgl. z. B. Umezawa et al., lournal of Antibiotics, 19 A, 210 [1966]). Von den Bleomycinen wird ein Gemisch von kupferfreiem Ai, A^, Ai, B2 und Demethyl-A^ (nachstehend als Bleomycinkomplex bezeichnet) im weiten Ausmaß in der Klinik zur Therapie von Krebs verwendet. Dieses Gemisch hat sich als besonders ei'olglich bei der Therapie von schuppigem Zellenkarzinom als Hauptziel, von Hautkrebs, Kopf- und Nackenkrebs, des Gebärmutterhalses, von Lungenkrebs und von malignen L;mphom erwiesen.

Was die Nebenwirkungen anbeiangt, so sind jedoch F .!Ie von Lungenfibrose und anderen unerwünschten Zuständen berichtet worden. Von den Nebenwirkungen der Bleomycine ist die am meisten gefurchtete Nebenwirkung die Lungenfibrose. Es ist sehr leicht vorstellbar, daß die karzinostatische Aktivität der Bleomycine in der Klinik wirksamer ausgenützt werden könnte, wenn die obengenannte Nebenwirkung mehr oder weniger vermindert werden könnte.

Über Jahre wurde daher die Synthese von verschiedenen Bleomycinen untersucht. Bei verschiedenen Tieren wurden Tests hinsichtlich der karzinostatischen Aktivität und der Toxizität mit Einschluß der Lungenfibrose als Haupttestgesichtspunkt durchgeführt. Als Ergebnis wurde gefunden, daß bei 3-[(S)-l'-Phenyläthylamino]-propylaminobleonycin (nachstehend als »Nk.631« abgekürzt, und zwar mit Einschluß sowohl der Kupfer enthaltenden als auch der kupferfreien Formen), nämlich einem neuen Bleomycin, das durch Umsetzung eines reaktiven Derivats der Carboxylgruppe von Bleomycirsäure mit N-[(S)-l'-Phenylälhyl]-l,3-dia!ninopropan erhalten wird, die Nebenwirkung der Lungenfibrose ausgeprägt vermindert wird und d;iß im Vergleich zu einem handelsüblichen Bleomycinkomplex und anderen bekannten Bleomycinen die karzinostalische Aktivität nicht venrngert ist.

Die ausgezeichnete Bioaktivität des erfindungsgemäßen Bleomycins der Formel I wird nachstehend anhand der VersuchsbeisDiele näher erläutert.

Die Bioaktivität von NK 631 wurde hinsichtlich der folgenden vier Testgesichtspunkle untersucht, wobei ein Vergleich mit einem handelsüblichen Bleomycinkomplex und 3-[(R₁S)-r-Phenyläthylamino]-propylaminobleomycin-monosulfat (kupferfreie Form) (nachstehend als »RS-Form« bezeichnet) durchgeführt wurde. Die RS-Form wurde durch ein Fermentationsverfahren gemäß der US-PS 38 46 400 erhalten.

1. Lungenfibrose

2. Antitumoraktivität

3. antimikrobielle Aktivität

4. Toxizität.

I.Toxizität gegenüber der Lunge von Mäusen (Fibröse)

Mäuse vom ICR-Stamm (männlich, Alter 1 5 Wochen), 12 Stück pro Gruppe, wurden bei diesem Test verwendet. Die Dosis jeder pharmazeutischen Tcstzubereitung betrug 5 mg/kg. Die Dosis wurde durch intraperitoneale Injektion einmal täglich über 10 aufeinanderfolgende lage lang verabreicht. Nach der Verabreichung wurden die Mäuse 5 Wochen lang aufgezogen. Nach der Beobachtung wurden die Mäuse getötet und einer Autopsie unterworfen, um das Ausmaß der Lungenfibrose zu bestimmen. Das Auftreten und der Grad der Lungenfibrose bei den Mäusen, die das neue erfindungsgemäBe Bleomycin, einen handelsüblichen Bleomycinkomplex und die RS-Form erhalten hatten, wurden miteinander verglichen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle

	Auftreten	rel.ili\er Wert	C ι rail	relativer
	Λπ/ahl der Mäuse		(.•esamtbcwcrtung*) der	Wert
	mil l.ungenfibrose		Lungcnfihrose/liesaml/ahl
	("'«)	0.36	der l'roben	0.25
NK63I-Mont)sulfiit	4/12 (0.33)		6/36 (0.17)
(kupferfreie Form)		0.63		().4^l>
RS-Form	7/12 (0.58)	1.0	12/36 (0.33)	1.0
B korn ve in korn nie χ	M/12 (0.92)	24/36 (0,67)

FuUnote:

*! 0 Punkte Keine Fibröse.

1 Punkt. Ansammlung von Exudat in den Lungenbläschen und fihrosearlige Veränderungen im Alveolar-Septum

2 Punkte: I ibrose in mehreren Bereichen
4 Punkte (restreute Fibröse.

d Punkte: [ibrose in mehr als /wei Dritteln des Gesamtbereichs

Aus den oben angegebenen Ergebnissen wird ersichtlich, daß im Vergleich zur RS-Form und ium Bleomycinkomplex die auf NK. 631-Monosulfat (kupferfreie Form) zurückzuführende Fibröse im Auftreten auf etwa 'Λ bzw. '/3 und im Grad auf etwa '/2 bzw. Ά vermindert worden war. Dies weist auf die Einsetzbarkeit von NK 631 -Monosulfat in der Klinik hin.

2. Antitumoraktivität
2-1. Wirkung auf kultivierte HeLa-Si-Zellen

Die I Dto-Werte für jedes Bleomycin wurden aus der prozentualen Wachstumshemmung in 72 h Kultivierung in Gegenwart von jedem Bleomycin errechnet. Der ID₅₀-Wert für NK 631 wurde als 0,82 mcg/mi ermittelt. Dies steht einem Wert von 1,70 mcg/rnl für den Bleomycinkomplex gegenüber, was darauf hinweist, daB NK 631 das Zellwachstum zweimal so stark hemmt wie der Bleomycinkomplex. Der IDso-Wert für die RS-Form wurde als 0,80 mcg/mi ermittelt, was darauf hinweist. daß der Hemmeffekt mit demjenigen von NK 63!-Mortosulfat (kupferfreie Form) vergleichbar war.

2-2. Kariinostatische Aktivität beim
Ehrlich-Krebs der Maus (festerTumor)

Jeweils 2x10* Zellen wurden subkutan in den Leibbereich von Mäusen vom ICR-Stamm (männlich, 6 Wochen alt) transplantiert. Nach 24 h erhielt jede Maus Testzubereitungen in der gleichen Weise, wie oben unter 1—2 beschrieben. Am 15. Tag nach der subkutanen Transplantation wurden die Tumore von jeder Maus herausgenommen und ihr Gewicht wurde mit demjenigen von Tumoren verglichen, welche sich in der Kontrollgruppe, die keine Behandlung erfahren hatte, entwickelt hatten. Auf diese Weise wurde die prozentuale Hemmung bestimmt.

Wie aus Tabeiie ii ersichtlich wird, ist die karzonostatische Aktivität von NK 631-Monosulfat (kupferfrei) mit derjenigen der RS-Form vergleichbar, und sie ist etwa 1,4mal so hoch wie diejenige des Bleomycinkomplexes.

Tabelle II

Dosis
mg/kg x 10

mg/kg/Tag

Wozentuale Hemmung

ΝΚ631-ΜΠΠΟ- RS-lorm

sulfat

(Cu-frei)

84

6 X
39
24
19

0.35

78
60
51
51
13

0.31

Bleomycinkomplex

67

SS 49 24 21 0

0.4')

2 3. Karzinostatische Aktivität gegen Ascites llepatoma (Ascites-Typ) bei Ratten

leweils 1 χ 10·> All 66-/.eilen wurden intraperitoneal in Ratten vom Donryu-Stamm transplanticrt. Nach 24 h wurde die Testzubereitung intraperitoneal einmal täglich über 10 aufeinanderfolgende Tage lang verabreicht. Während einer Periode von 30 Tagen nach der Tra splantation wurde das Gewicht jeder Ratte und die Anzahl der toten und überlebenden Tiere bestimmt.

Ta beil.: III

Relativer Wert der mittleren Überlebenstage

Bleomycinkomplex

241 257 145 116 HO 100

Wie aus Tabelle III ersichtlich wird, war die Aktivität von NK 631-Monosulfat (kupferfreie Form) gegenüber AH 66-Asciles Hepatoma mil derjenigen der RS-Form vergleichbar. Sie war bei jeder Dosis derjenigen des Bleomycinkomplexes überlegen.

2-4. Hemmaktivität gegen schwammiges Zellkarzinom bei der Maus, das durch 20-Methylcholanthren induziert wird (nachstehend als »20-MC« abgekürzt)

Eine Acetonlösung von 20-MC wurde topisch auf den rasierten Rücken von Mäusen vom ddy-Stamm (männlich, 10 Wochen alt) zweimal pro Woche über einen Zeitraum von 18 Wochen aufgebracht Nach 5 Wochen vom Beginn der 20-MC-Behandlung wurde die Testzubereitung in einer Menge von 62,5 mcg/Maus intraperitoneal zweimal wöchentlich und über einen Zeitraum von 15 Wochen verabreicht. Innerhalb der ersten Woche nach Beendigung der Verabreichung der

Dosis	10	NKfi.'1-Mono-	RS-
mg/kg χ		sulfat
		(Cu-frei ι
3.12		296	29X
1.56		269	257
0.78		216	196
Π.39		163	149
0.19		116	121
0	100	100

Testzubereitung wurde der Bereich, wo das 20-MC aufgebracht worden war, pathologisch auf das Auftreten einer Karzinogenese untersucht.

Wie aus Tabelle IV ersichtlich ist, sind NK 631-Monosulfat (kupferfreie Form) und die RS-Form geringfügig wirksamer als der Bleomycinkomplex bei der Hemmung der Karzinogenese, die auf 20-MC zurückzuführen ist.

Tabelle IV

Mortali- Aultreten einer l'ro/entualo tat Kar/inogenese Hemmung

NK63I-Monosulfat 1/12
(kupferfrei)

RS-Form i/i 2

Hleomycinkomplex 2/12
Kontrolle 1/24

5/11 (45,4) 47.8

.v i i (45,4i 47,K

5/IO (50.0) 42.5

20/23 (86.9) ()

Aus den obigen Ergebnissen wird ersichtlich, daß NK 631-Monosulfat (kupferfreie Form) im Vergleich zu einem handelsüblichen Bleomycinkomplex eine ausgeprägt überlegene Antitumoraktivität besitzt.

3. Antimikrobielle Aktivität

Die antimikrobielle Aktivität wurde nach der Schalenmethode gegen Mycobacterium 607 und Bacillus siibtilis PCI unter Verwendung von Bleomycin Aj als Standard (1000 U/mg) getestet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt.

Tabelle V

NK631-Monosulfat (Cu-frei)

RS-torm

liieomycinkomplex

M. 607

7848
7535
1234

B. Sub.

1550

1400

886

Wie aus Tabelle V ersichtlich wird, zeigen das NK 631-Monosulfat (kupferfreie Form) und die RS-Form eine weitaus bessere mikrobielle Aktivität als der Bleomycinkomplex.

4. Toxizität

4-1. Akute Toxizität bei intraperitonealem Weg
(LD₅₀) bei Ratten

Wie aus Tabelle VI hervorgeht, ist der LDso-Wert von NK 631-Monosulfat (kupferfreie Form) bei Ratten ungefähr vergleichbar zu demjenigen des Bleomycinkomplexes und der RS-Form.

Tabelle VI

LD₅₀ mg/kg

Vertrauensgrenzen (Signifikanzwert von 5%)

NK631-Monosulfat 155,0 133,6 bis 179,8
(kupferfrei)

_Ratte/RS-Form 150,6 129,0 bis 170,6

iBleomycinkomplex 168,0 130,0 bis 217,0

4-2. Subakute und chronische Toxizität
bei Ratten und Hunden

NK 631-MonosuIfat (kupferfreie Form) ist hinsichtlich der subakuten und chronischen Toxizität bei Ratten und Hunden mit dem Bleomycinkomplex vergleichbar. Weiterhin sollte die Tatsache speziell erwähnt werden, daß in allen Fällen, wo Hunden eine hohe Dosis des Bleomycinkomplexes (1,2 mg/kg, 90 Injektionen) injiziert wurde, eine Nekrose auftrat, daß dies jedoch bei keinem der Fälle erfolgte, wo den Hunden die gleiche Dosis von NK 631-Monosulfat (kupferfreie Form) verabreicht wurde. Die Toxizität von NK 631-Monosulfat (kupferfreie Form) gegenüber der Lunge war ebenfalls niedriger als bei dem Bleomycinkomplex.

Aus den obigen Ergebnissen ergibt sich, daß die Toxizität von NK 631-Monosulfat (kupferfreie Form) mit derjenigen des Bleomycinkomplexes, ausgenommen der loxizität gegenüber der Lunge und der Nekmse vergleichbar ist.

5. Zusammenfassung

Aus den oben angegebenen Testergebnissen kann die Schlußfolgerung gezogen werden, daß NK 631 eine neue Verbindung ist, die die folgenden Eigenschaften hat:

(1) Eine extrem niedrige Toxizität gegenüber der Lunge,

(2) eine antimikrobielle und Antitumoraktivität, die derjenigen des handelsüblichen Bleomycinkomplexes überlegen ist;

(3) eine systemische Toxizität, die mit derjenigen des handelsüblichen Bleomycinkomplexes vergleichbar ist; und

(4) eine niedrige lokale Toxizität an der Injektionsstelle.

Es kann dah*r angenommen werden, daß NK 631 für klinische Zwecke geeignet ist.

Das neue erfindungsgemäße Bleomycin NK 631 wird in der Weise synthetisiert, daß man ein reaktives Derivat der Carboxylgruppe der Bleomycinsäure gemäß Anspruch 3 mit N-[(S)-l'-Phenyläthyl]-l,3-diaminopropan umsetzt. Die Verbindung kann man insbesondere dadurch herstellen, daß man (1) Bleomycinsäure mit N-f(S)-r-Phenyläthylamino]-l,3-diaminopropan in Gegenwart eines Aktivierungsmittels umsetzt oder (2) Uleomycinsäure^-aminopropylester oder das N-monosubstituierte Derivat davon mit N-[(S)-1'-Phenyläthyl]-1,3-diarninopropan zur Umsetzung bringt

Nachstehend wird eine detaillierte Beschreibung dieser Verfahrensweisen gegeben.

Die bei dem Verfahren (1) verwendete Bleomycinr.uure ist eine bekannte Verbindung, die durch enzymatische Spaltung von Bleomycin B₂ nach der Methode gemäß den ÜS-PS 3S 43 448 und 38 46 4öö erhalten wird.

Das andere Ausgangsmaterial, d. h. N-[(S)-I'-Phenyläthyl]-l,3-diaminopropan ist eine neue Verbindung, die auf folgende Weise zuerst synthetisiert worden ist.

Auf etwa 0⁰C abgekühltes (S)-l-Phenyläthylamin wird mit einer ungefähr äquivalenten Menge von Acrylnitril vermischt. Das Gemisch wird 10 bis 24 h bei 80 bis 100°C gehalten, um die Reaktion zu vervollständigen. Überschüssiges Acrylnitril wird sodann bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wird weiter destilliert, wodurch 3-[(S)-l'-Phenyläthylamino]-propionitril erhalten wird. Die auf diese Weise erhaltene Verbindung wird in üblicher Weise, beispielsweise in Gegenwart von Raney-Nickel, reduziert, wodurch das angestrebte N-[(S)-l'-Phenyläthyl]-l,3-diaminopropan (nachstehend als »Aminoverbindung« bezeichnet) erhalten wird. In Tabelle VII sind die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser Verbindung zusammengestellt.

Tabelle VII

Freie Base

Dihvdrochlorid

(D	Aussehen	(ιτιμ)
(2)	Schmelzpunkt
(3)	Siedepunkt
(4)	Ultra violettabsorptions-Maxima

molekularer Extinktionskoeffizient,
ε (256 m;j.)

spezifische Drehung M'd

Rf-Wert bei der Dünnschichtchromatographie. n-Propanool/Pyridin/Essigsäure/
Wasser (15:10:3 :12 V/V), Avicel-SF

Rm-Wert bei der Hochspannungselektrophorese, Ameisensäure/Essigsäure/Wasser
(25 : 75 : 900 V/V), Avicel-SF, 800 V,
10 min. Rm-Wert von Alanin = 1,0

farblose Flüssigkeit bei
Raumtemperatur

bis 103 C" (2 mm Hg)

241,247,252,257,263,267

(Methanol)

-56,38° (unverdünnt,
0,73

= D

weiße nadeiförmige

Kristalle

223,5 bis 224 C

250, 256, 259, 266
(destilliertes Wasser)

206 (destilliertes Wasser)

-206° (c = 1, destilliertes Wasser

0,73

1,52

If

I oitsel/ιιημ

Freie Base

Dihyilrochlorid

(9) IR-Absorptionsspektrum, cm ', KBr

(10) Molckularformcl

(Molekulargewicht)

700, 760,820,910, 1025, 1080,
1130, 1200, 1305, 1350, 1370,
1450, 1495, 1605, 2850, 2940,
3300, 3375

C₁₁Il₁₁₁N,
(17X.28)

690, 750, 820, 910, 980,
1020, 1065, 1075, 1150.
1205, 1385, 1460, 1500.
1515, 1590, 2500, 2850.
3000, 3500

C||H.,„N;Cl·

(251,20)

Beispiele für geeignete Aktivierungsreagentien sind

ö-Chlor-l-p-chlorben/.olsulfonyloxyben/o-

ir!2?.o!'CCBT\
N-Äthyi-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat

(NL?IS),
N-tert.-Butyl-5-methylisoxazolium-

perchlorat,
N-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-

1,2-dihydrochinolin.
Dip-nitrophenylsulfit,
Tri-p-nitrophenylphosp'¹ r,
p-NitrophenyltrichloriiLctat,
N-Hydroxysuccinimid,
Dicyclohexylcarbodiimid (DCC').
l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopiopyl)·

carbodiimid,
1 -Cyclohexyl- J-(2-morpholinoäthy I)-

carbodiimid,
Diphenylcarbodiimid,
Di-p-toluylcarbodiimid,
Diisopropylcarbodiimid,
p-Nitrophenol, Pentachlorphenol und
Benzylalkohol.

Detaillierte Beschreibung des Verfahrens (1)

Bleomycinsäure (Kupfer enthaltende Form) wird in Wasser, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder einem Gemisch davon aufgelöst. Zu der Lösung wird unter Rühren bei 0 bis 30°C eines der oben angegebenen Aktivierungsreagentien gegeben. Die resultierende Lösung wird auf einen für die Aktivierung geeigneten pH-Wert von 3 bis 10 durch Zugabe einer anorganischen Säure oder Base, wie Salzsäure oder Natriumhydroxid, oder durch Zugabe einer organischen Säure oder Base, wie z. B. Trichloressigsäure oder N-Methylmorpholin, eingestellt. Nach einer solchen Behandlung wird die Aktivierung der Carboxylgruppe der Bleomycinsäure eingeleitet. Unmittelbar oder innerhalb von 30 min nach der Behandlung wird die Ausgangslösung mit der Aminoverbindung (wie vorstehend definiert) so, wie sie ist, oder nach Einstellung des pH-Wertes auf etwa 7,0 vermischt. Das Gemisch wird sodann 1 bis 24 h bei 0 bis 30° C gehalten, um die Reaktion ablaufen zu lassen. Auf diese Weise wird NK 631 erhalten. Eine geeignete Verhältnismenge des Aktivierungsreagenses oder der Aminoverbindung ist 1 bis 10 Äquivalente für 1 Äquivalent der Bleomycinsäure.

Um das NK 631 aus dem Reaktionsgemisch zu isolieren, werden zuerst die Bleomycinverbindungen durch Zugabe von 5 bis 10 Volumenteilen Aceton pro 1 Volumenteil des Reaktionsgemisches erschöpfend ausgefällt Der Niederschlag wird durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen und in der kleinstmöglicnen Menge destilliertem Wasser aufgelöst Die resultierende wäßrige Lösung wird sofort mit Salzsäure oder dergleichen auf einen pH-Wert von b,U eingestellt und auf eine chromatographische Säule aufgegeben, welche CM-Sephadex®C-25 (vom NHj Typ), eingepackt in eine wäßrige Ammoniumchloridlösung, enthält. Die nichtumgesetzte Bleomycinsäure läuft durch die Säule, oh ie adsorbiert zu werden. Das auf dem Harz adsorbierte NK 631 wird mit wäßrigen Ammoniumchloridlösungen mit Konzentrationsgradienten, die stufenweise oder kontinuierlich von 0,05 M bis 1,0 M erhöht sind, eluiert. NK 631 ist in den blauen Abstromfraktionen mit einer Ammoniumchloridkonzentration von etwa OJ) M bis 0,45 M enthalten, die eine Ultraviolettabsorption bei 292 Γημ zeigen. Diese Fraktionen werden gesondert gesammelt und durch Amberlite® XAD-2 ( Amberlite ist ein Warenzeichen für ein lonenaustauseherharz aus Styrol-Vinylbenzolcopolymer) oder Diaion* HP 40 (Warenzeichen für ein absorbierendes Harz aus einem Styrol-Divinylcopolymeren) geleitet. Das adsorbierte NK 631 wird mit Wasser gewaschen und eluiert. wodurch ein entsalzter Abstrom erhalten wird, aus dem ein reines blaues amorph.s Pulver von NK 631 (Kupfer enthaltende Form) erhalten wird. Das Hydrochl· >rid und das Sulfat von NK 631 werden erhalten, indem man mit wäßrigem Methanol eluiert, das Salzsäure bzw. Schwefelsäure enthält. Bei diesem Verfah' :n kann nicht-umgesetzte Bleomycinsäure leicht wiedergewonnen werden. Die oben beschriebene Verfahrensstufe, bei der CM-Sephadex⁸¹ C-25 (Sephadex ist ein Warenzeichen für einen Kation· naustauscher aus mikroskopisch kleinen Perlen eines Carboxymethylgruppenderivats von Polysacchariddextran) verwendet wird, ist nur ein der Veranschaulichung dienendes Beispiel. Die Verfahrensweise kann bis zu einem gewissen Ausmaß modifiziert werden, ohne daß die Ergebnisse wesentlich beeinflußt werden. So kann z. B. wäßrige Natriumchlorid- oder wäßrige Ammoniumsulfatlösung als Eluierungsmittel verwendet werden.

Die Entfernung des Kupfers aus dem oben erhaltenen Kupfer enthaltenden NK 631 kann nach bekannten Methoden geschehen. So kann beispielsweise das Kupfer in der Weise entfernt werden, daß man eine Umsetzung mit Schwefelwasserstoff vornimmt, um das Kupfer in Kupfer(II)-sulfid umzuwandeln, das ausgefällt wird. Das Kupfer kann auch zu nullwertigem Kupfer mit einem Reduktionsmittel reduziert wurden (vgl. US-PS 36 46 197). Man kann das Kupfer auch mit einem organischen Lösungsmittel extrahieren, das einen Chelatbildner, wie z. B. Dithizon, enthält (vgl. Umezawa et al.. Journal of Antibiotics, 19 A, 210[196O]). Schließlich kann man beispielsweise auch ein nicht-ionogenes

makroretikuläres Austauscherharz verwenden (vgl. US-PS 39 29 993). Nachstehend wird ein Beispiel für das Verfahren zur Entfernung des Kupfers angegeben.

NK 631 (Kupier enthaltende Form) wird in destilliertem Wasser aufgelöst und die Lösung wird in eine Harzsäule gegossen, die Amberlite® XAD-2 (Warenzeichen für ein absorbierendes Harz aus Styrol-Divinylbenzol-Copolymerem oder Diaion· HP 40 (Warenzeichen für ein absorbierendes Harz aus einem Styrol-DivinylbenzoI-Copolymerem), gepackt in destilliertem Wasser, enthält, um das NK 631 adsorbieren zu lassen. Die Säule wird sodann mit einer 5%igen wäßrigen Lösung von Äthylendiamiiitetraessigsäuredinatriumsalz (nachstehend als »EDTA - Na?« bezeichnet) gewaschen, wodurch die Kupferionen durch die EDTA - Na2-Lösung weggetragen werden. Kupferfreies NK 631 bleibt auf dem Harz zurück. Das Harz wird mit einer wäßrigen Lösung eines Salzes, z. B. von Natriumchlorid, Natriumsulfat oder Natriumacetat, zur Entfernung von EDTA · Nai und sodann mit destilliertem Wasser gewaschen. Schließlich wird ein angesäuerte Methanol/Wasser-Gemisch, beispielsweise ein Gemisch aus Methanol und 0,0025 N-Salzsäure (1 :1 Volumenverhältnis) durch die Säule geleitet, um eine Substanz zu eluieren, die eine Ultraviolettabsorption bei 290 πιμ hat. Diese Fraktion wird gesammelt, konzentriert, auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und gefriergetrocknet, wodurch ein hellgelblich weißes amorphes Pulver von NK631-Dihydrochlorid (kupferfreie Form) erhalten wird.

Als Säure zur Herstellung des angesäuerten Methanol/Wasser-Gemisches kennen alle beliebigen Säuren verwendet werden, sofern sie pharmazeutisch annehmbar sind. Wenn beispielsweise Schwefelsäure oder Essigsaure verwendet wird, diinn wird ein Pulver von NK 631-Monosulfat oder dem Diessigsäuresalz (kupferfreie Form) erhalten.

Das erfindungsgemäße NK 631 kann in üblicher Weise in andere nicht-toxische Salze, beispielsweise in das Sulfat- und Essigsäuresalz, umgewandelt werden. Diese Salze können auch in der Weise erhalten werden, daß man in entsprechender Weise die beim Eluieren verwendete Säure verändert.

Da bei dem Verfahren (1) sich die Aminoverbindung mit der aktivierten Carboxylgruppe der Bleomycinsäure aufgrund des Vorhandenseins eines Aktivierungsreagenses, das bei der Polypeptidsvnthese verwendet wird, umsetzt, schreitet die Kondensationsreaktion glatt und unter extrem milden Bedingungen voran. Es setzt sich daher nur die primäre Aminogruppe der Aminoverbindung mit der aktivierten Carboxylgruppe um, während die sekundäre Iminogruppe an der Reaktion nicht teilnimmt, wodurch bevorzugt NK 631 erhalten wird. Dies stellt einen erheblichen Vorteil des Verfahrens (1) dar.

Detaillierte Beschreibung des Verfahrens (2)

Der beim Verfahren (2) verwendete 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure wird leicht in Form des Dihydrochlorids (Kupfer enthaltende Form) erhalten, indem man thermisch Bleomycin A₂ unter Bildung von 3-(Methylmercapto)-propylaminobleornycin zersetzt und das resultierende Bleomycin mit einem Halogennitril, einer Halogenessigsäure, einem Halogenacetatester oder einem Halogenacetamid in einer sauren Lösung umsetzt (US-PS 38 86 133).

Das N-monosubstituierte Derivat des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure, bei dem die Aminogruppe geschützt ist, wird in hoher Ausbeute erhalten, indem man das Dihydrochlorid des 3-Aminopropylesters νο.η Bleomycinsäure in Wasser oder einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol, oder einem Gemisch ■> davon auflöst und sodann langsam unter heftigem Rühren zu der resultierenden Lösung eine äquivalente Menge oder einen geringen Oberschuß eines der bekannten Aminogruppen schützenden Reagentien in Form eines Pulvers oder als Lösung in einem

ίο organischen Lösungsmittel, wie Methanol, gibt und indem man die Reaktion bei Raumtemperatur oder unter Eiskühlung ablaufen läßt, wobei man kontinuierlich den pH-Wert des Reaktionsgemisches bei 5,0 bis 7,5 durch Zugabe einer organischen Base, wie z. B. von Trimethylamin, Triäthylamin, Pyridin, 1,3-Diazabicyclo-[5,4,0]-7-undecen, 1.5-DiazabicycIo-[3,4_>0]-5-nonen l,4-Diazabicyclo-[2,2,2]-octan oder N-Methylmorpholin, hält. Typische solche N-monosubstituierten Derivate sind das Monohydrochlorid des 3-Acetylaminopropylesters von Bleomycinsäure, des 3-Succinylaminopropylesters der Bleomycinsäure, das Monohydrochlorid des 3-Benzoylaminopropylesters von Bleomycinsäure, das Monohydrochlorid des 3-Benzyloxycarbonylaminopropylesters von Bleomycinsäure, das Monohydrochlorid von 3-p-Toluolsulfonylaminopropylesters von Bleomycinsäure, das Monohydrochlorid des 3-(2,4-Dinitrophenyl)-aminoprop > !esters der Bleomycinsäure, das Monohydrochlorid des 3-(3^-Dimethyl-3-oxocyclohexen-tyl)-aminopropylesters der Bleomycinsäure, das Mono-

jo hydrochlorid des S-N-terl.-Butoxycarbonylpropylesters der Bleomycinsäure und das Monohydrochlorid des 3-N-Salicylideniminopropylesters der Bleomvcinsäure (US-PS 38 86 133).

Bei dem Verfahren (2) wird NK 631 durch Umsetzung

r, des 3-Aminopropylesters oder N-monosubstituierten 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure mit der Aminoverbindung gebildet. Wenn der N-monosubstituierte 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure als Ausgangsmaterial verwendet wird, dann kann entweder

w ein reines Material oder ein Reaktionsgemisch, das konzentriert sein kann, erhalten aus dem 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure und einem Aminogruppen-Schutzmittel, verwendet werden.

Bevorzugte Lösungsmittel, die bei der Umsetzung des

r. 3-Aminopropylesters oder des N-monosubstituierten 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure mit der Aminoverbindung verwendet werden, sind Wasser und organische Lösungsmittel, wie /.. B. Methanol, Dimethylformamid und Dimethylsuifoxid. Das Reaktionsgemisch

ϊο wird I bis 72 h lang bei 0 bis 80°C bei neutralen oder alkalischen Bedingungen stehengelassen, damit die Aminolysereaktion ablaufen kann. Auf diese Weise wird NK 631 gebildet. Bei den Bedingungen eines höheren pH-Wertes ist eine verlängerte Reaktionszeit bei

,) verhältnismäßig niedrigen Temperaturen zweckmäßig, während bei den Bedingungen eines niedrigeren pH-Wertes eine kürzere Reaktionszeit bei höheren Temperaturen bevorzugt wird. Die geeignete Verhältnismenge der Aminoverbindung in dem Reaktionsge-

Mi misch ist 1 bis 10 Äquivalente pro I Äquivalent des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure oder des N-monosubstituierten Derivats davon.

Zur Isolierung des NK 631 aus dem Reaktionsgemisch werden zuerst die Bleomycinkomponenten durch

ι,-, Zugabe der 2- bis 5fachen Volumenmenge Aceton zu dem Reaktionsgemisch erschöpfend ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Filtration gesammelt, gründlich mit Aceton gewaschen und sodann in der

geringstmöglichen Menge von destilliertem Wasser aufgelöst. Die resultierende wäßrige Lösung wird rasch auf einen pH-Wert von 6,0 durch Zugabe von Salzsäure oder dergleichen eingestellt und in eine chromatographische Säule aus CM-Sephadex C-25 (vom NH₄ +-Typ von Pharmacia Fine Chemicals), das in eine 0,05 M-wäßrige Ammoniumchloridlösung eingepackt ist, eingegossen, damit die Bleomycinkomponenten auf dem Harz adsorbiert werden können. Durch Durchlaufenlassen durch die Säule einer wäßrigen Ammoniumchloridlösung, deren Konzentration stufenweise oder kontinuierlich von 0,05 M auf 1,0 M erhöht wird, werden der nicht-umgesetzte 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure oder ein N-monosubstituiertes Derivat davon und NK 631 eluiert, die blaue Bänder (UV-Absorption bei 292 ΐημ) in dem Abstrom bei Ammoniumchloridkonzentrationen von 0,15 bis 0,20 M bzw. 0,35 bis 0,45 M bilden. Diese Fraktionen werden gesondert gesammelt und durch Adsorption auf Amberlite® XAD-2 oder Diaion®

wodurch ein blaues amorphes Pulver von NK 631 (Kupfer enthaltende Form) erhalten wird. Das Hydrochlorid und das Sulfat werden erhalten, wenn man Methanol/Wasser-Gemische, die mit Salzsäure bzw. Schwefelsäure angesäuert worden sind, als Elutionsmittel verwendet. Der nicht-umgesetzte 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure oder ein N-monosubstituiertes Derivat davon können in geeigneter Weise gewonnen werden. Die oben beschriebene Verfahrensstufe, bei der CM-Sephadex® C-25 verwendet wird, ist ein typisches der Veranschaulichung dienendes Beispiel. Sie kann bis zu einem gewissen Ausmaß modifiziert werden, ohne daß die Ergebnisse praktisch verändert werden. So kann z. B. als Eluierungsmittel wäßrige Natriumchlorid- oder wäßrige Ammoniumsulfatlösung verwendet werden.

Das nach dem Verfahren (2) erhaltene NK 631 kann in die kupferfreie Form durch Anwendung bekannter Kupferentfernungsmethoden umgewandelt werden, wie sie oben im Zusammenhang mit der Verfahrensweise (1) beschrieben wurden. Erforderlichenfalls ist es möglich, die Verbindung in ein anderes nicht-toxisches Salz, beispielsweise das Hydrochlorid, Sulfat oder Essigsäuresalz, umzuwandeln.

In den Tabellen VIII und IX sind die hauptsächlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften von NK 631 zusammengestellt.

Die Strukturformel I von NK 631 wurde auf folgende Weise bestätigt: NK 631-Monosulfat (kupferfreie Form) wurde in schwerem Wasser aufgelöst. ¹³C-NMR wurde nach der "rotonengeräusch-Enikuppiungsmethode gemessen, wobei Dioxan als innerer Standard verwendet wurde. Signale, die auf insgesamt 11 ¹³C-Atome, die in der Aminoverbindung in der Seitenkette und der 3-[(S)-1 '-PhenyläthylaminoJ-propylamino-Gruppierung enthalten waren, zurückzuführen sind, wurden bei 19,4, 26,3, 37,0, 43,5, 58,9, 128,3 (zwei Signale), 130,0 (zwei Signale) und 1363 ppm festgestellt. Auf andere Kohlenstoffatome zurückzuführende Signale entsprachen alle den Signalen, die der Bleomycinfamilie gemeinsam waren (Naganawa et al. Journal of Antibiotics, 30,388 [1977]).

Tabelle VIII

Physikalisch-chemische Eigenschaften von NK631 (Kupfer enthaltende Form)

	Dihydrochlorid	Monosulfat
(1) Aussehen	blaues amorphes Pulver	blaues amorphes Pulver
(2; Löslichkeil	löslich in Wasser, Methanol. Dimethylsulfoxid. Dimethyl formamid; geringfügig löslich in Dioxan: unlöslich in Äthanol. Aceton. Äther, Benzol	gleiche Löslichkeit wie im Falle des Dihydro- chlorids
(3) Schmelzpunkt (Zers.), t"	205 bis 207	205 bis 207
(4) spezifische Drehung (destilliertes Wassc. C = 1.0)	- 95.6°	- 9.1,7°
1.1 I i.lft
(5) Dünnschichtchromatographic') RrWerl	(a)0.72 (b) 0.75	(a) 0,72 (b) 0.75
(6) Itlektronhorese")	0.80	0,80

Rm-Wert (Alanin = I)
I uUnote:

Ί (a) Silica Gel G (Waren/eichen für ein Adsorptionsmittel für die Dünnschichtchromatographie aus Silicagel: Methanol/

10% Ammoniumacetat/10% Ammoniak (10:9: 1 V/V),
(h) \vicel*SF (Warenzeichen für ein Adsorptionsmittel für die Dünnschichtchromatographie aus kristalliner Cellulose:

n-l'ropanol/Pyridin/l:ssigsäure/Wasser (15 : 10:.V 12).
Ί Avkel*Sl·; Ameiscnsäurc/P.ssigsäurc/Wasscr (25 : 75 : 900 V/V; 8(K) V; 15 min.

Tabelle IX

Physikalisch-chemische Eigenschaften von NK.631 (kupferfreie Form)

Dihydrochlorid Monosulfat

Diacetat

(1) Aussehen

(2) Löslichkeit

(3) Schmelzpunkt (Zers.), C

(4) spezifische Drehung (destilliertes Wasser, c =1,0)

helt-gelblich weißes amorphes Pulver hell-gelblich
weißes amorphes
Pulver

hell-gelblich weißes
amorphes Pulver

löslich in Wasser, Methanol, Essigsäure, DMSO, DMF;
geringfügig löslich in Dioxan; unlöslich in Äthanol, Aceton,
Äther, Benzol

195 bis -2,1° 196 bis 198
-2,0°

188 bis 190
-2,0°

(a) 0,56 (b) 0,70
0,94

(5) Dünnschichtchromatographie¹) (a) 0,56 (b) 0,70 Rr-Wert

(6) Elektrophorese²) 0,94 R_n,-Wert (Alanin = 1,0)

Fußnote:

') (a) Silica Ge! G^e; Methanol/10% AmmoniumaceiatylO% Ammoniak (10:9:1 V/V).

(b) Avicel* SF; n-Propanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser (15 : 10 : 3 : 12). ²) Avicel* SF; Ameisensäure/Essigsäure/Wasser (25 : 75 : 900 V/V); 800 V; 15 min.

(a) 0,56 (b) 0,70
0,94

Die F i g. 1 und 2 zeigen die I "traviolettabsorptionskurven des erfindungsgemäBen Bleomycins NK 631 und die Fig.3 und 4 zeigen die infrar »tabsorptionskurven von NK 631.

Die Fig. 1 zeigt somit die Ultraviolettabsorptionskurve von 3-[(S)-I '-PhenyläthylaminoJ-propylaminobleomycin-dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form). Die Fig. 2 zeigt die Ultraviolettabsorptionskurve von

S-KSJ-l'-Phenyläthylaminoj-propylaminobleomycinmonosulfat (kupferfreie Form). Die F i g. 3 zeigt die Infrarotabsorptionskurve von 3-[(S)-l'-PhenyIäthylan.ino]-propylaminobleomycin-dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form), gemessen in Form eines Kaliumbromid-Preßlings, und die Fig. 4 zeigt die Infrarotabsorptionskurve von 3-[(S)-I'-PhenyläthylaminoJ-propylaminobleomycin (kupferfreie Form), gemessen in Form eines Kaüumbromid-Preßlings.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Synthese des Dihydrochloricls (Kupfer enthaltende Form) und des Monosulfats (kupferfreie Form)

von NK 631

Stufe A

In 400 ml Dimethylformamid wurden 15,0 g Bleomycinsäure (Kupfer enthaltende Form) gelöst. Zu dieser Lösung wurden, während sie durch Kühlen bei 0°C gehalten wurde, 1,1 ml N-Methylmorpholin und 10,3 g CCBT gegeben. Das Gemisch wurde 5 min bei O⁰C gerührt und sodann wurden 5,3 g der Aminoverbindung /ugemischt. Es wurde 1 h lang weitergerührt. Nachdem die Umsetzung durch Zugabe von 200 ml einer 25%igen wäßrigen Essigsäurelösung beendigt worden war, wurde das Reaktionsgemisch mit 5 I kalten Acetons vermischt, um das Reaktionsprodukt zur Ausfällung zu bringen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen und in 500 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die resultierende wäßrige Lösung wurde sofort auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und in eine Säule gegossen, die 2 I CM-Sephadex® C-25 (vom NH₄ ^f-Typ), gepackt in eine 0,05 M-wäßrige Ammoniumchloridlösung, enthielt, um die Bleomycine zu adsorbieren.

Mit einer wäßrigen Ammoniumchloridlösung wurde die Elution durchgeführt, indem durch die Säule 20 1 des Elutionsmittels durchgeleitet wurden, bei dem die Konzentration von Ammoniumchlorid kontinuierlich von 0,05 auf 1,0 M erhöht wurde. Die nicht-umgesetzte Bleomycinsäure wurde in dem Abstrom bei einer Ammoniumchloridkonzentration von etwa 0,05 M festgestellt. Das NK 631 wurde bei einer Ammoniumchloridkonzentration von etwa 0,45 M festgestellt. Beide Fraktionen, die eine UV-Absorption bei 292 ιημ zeigten, wurden gesondert gesammelt. Die das NK 631 enthaltende Fraktion wurde in eine Harzsäule gegossen, die :,6 I Amberlitc* XAD-2 enthielt. Die Säule wurde sodann gründlich mit Wasser gewaschen und mit 0,01 N-Salzsäure in Methanol/Wasser (4 : I V/V) eluiert. Insgesamt 2,5 I der blauen Fraktion, die eine UV-Absorption bei 292 πιμ zeigte, wurden gesammelt. Nach Abdampfen des Methanols aus der eluierten Fraktion wurde das Konzertrat mit Dowex® 44 (OH -Typ) (Warenzeichen für ein Anionenaustauscherharz, bestehend aus einem Copolymeren von Epichlorhydrin und Ammoniak auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Das Filtrat wurde gefriergetrocknet, wodurch 16,1 g (Ausbeute 92%) NK 631 -Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers erhalten wurden.

Durch eine ähnliche Behandlung wurden 280 mg nicht-umgesetzte Bleomycinsäure (Kupfer enthaltende Form) gewonnen.

Die Ultraviolettabsorptionsmaxima und die antimi-

lcrobielle Aktivität des NK 631-Dihydrochlonds (Kupfer enthaltende Form) sind nachfolgend angegeben.

UV-Absorptionsmaxima:
πιμ

Antimikrobielle
Aktivität:

(E I " cm,

destilliertes Wasser)

(151)

(121)

8100 u/mg

(Fußnote: Die antimikrobielle Aktivität wurde unter Verwendung von Mycobacterium smegmatis ATCC 607 als Testorganismus bestimmt. Die Aktivität von Bleomycin Ai [kupferfreie Form] wurde als 1000 u/mg angesetzt Das gleiche gilt für die späteren Ausführungen.)

Stufe B

In 200 ml destilliertem Wasser wurden 10,0 g NK Wl-Dihydrochiorid (Kupfer enthaltende Form) aufgelöst Die Lösung wurde in eine Säule gegossen, die 600 ml Amberlite® XAD-2, gepackt in destilliertes Wasser, enthielt Die Säule wurde sodann nacheinander mit 2 I einer wäßrigen Lösung, die 5% EDTA · Na₂ enthielt, 2,5 I einer 5%igen wäßrigen Natriumsulfatlösung und 630 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die Säule wurde sodann mit 0,0025 N-Schwefelsäure in einem Methanol/Wasser-Gemisch (1 :1 V/V) eluiert. Insgesamt 900 ml Fraktionen, die eine Substanz enthielten, welche eine UV-Absorption bei 290 πιμ zeigte, wurden gesammelt Nach dem Abdestillieren des Methanols wurde die zurückgebliebene Flüssigkeit mit Dowex^e44 (OH--Typ) auf e^;nen pH-Wert von 6,0 eingestellt und gefriergetrocknet, wodurch 9,3 g (Ausbeute 95%) von NK 631-Monosulfat (kupferfreie Form) in Form eines hell-gelblich weißen amorphen Pulvers erhalten wurden. Dieses Produkt zeigte ein UV-Absorptionsmaximum und eine antimikrobielle Aktivität wie folgt:

U V-Absorptionsmaximum:

Antimikrobielle
Aktivität:

(E I""™ 0,1 N - HCI) (106)

7865 u. mg

Beispiel 2

Synthese von NK 631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Furm) und des kupferfreien

Dihydrochlorids

In 10 ml Methanol wurden 1,0 g Bleomycinsäure-3-aminopropylester-dihydrochlorid (Kupfer enthaltende; Form) aufgelöst Die heftig gerührte Lösung wurde tropfenweise mit 104 mg Benzoylchlorid im Verlauf von 30 min versetzt, wobei der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von l,4-Diazabicyclo-[2,2,2] octan bei 6,5 bis 7,5 gehalten wurde. Nach weiterem 30minütigcm Rühren wurde das Reaktionsgemisch auf 2 ml konzentriert. Zu dem konzentrierten Material, das auf O⁰C abgekühlt war, wurden unter Rühren 1,1 g der Aminoverbindung gegeben und das Gemisch wurden 72 h bei 0⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rühren mit 6 ml kaltes Aceton versetzt, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst und sofort mit 0.1 N-Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde in eine Sank:

gegosser., die 100 ml CM-Sephadex (NH₄ ^T-Typ), gepackt in eine 0,05 M-wäßrige Ammoniumchloridlösung, enthielt, um die Bleomycinkomponenten adsorbieren zu lassen. Das adsorbierte Material wurde in ähnlicher Weise wie in Stufe A des Beispiels 5 behandelt, wodurch 779 mg (Ausbeute 73%) NK 631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers mit einer antimikrobielien Aktivität von 8000 u/mg erhalten wurden.

) Zusätzlich wurden 240 mg nicht-umgeset?:tes Bleo-

mycinsäure-3-N-benzoylaminopropylester-monohydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) wiedergewon-

nen.

Stufe B

In 20 ml destilliertem Wasser wurden 700 mg NK 631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form), erhalten in Stufe A oben, aufgelöst Die Lösung wurde in eine Säule die 65 ml Diaion iP-40, gepackt in destilliertes Wasser enthielt, um die B'eomycinkomponenten adsorbieren zu lassen. Die Säule wurde sodann mit 200 ml einer wäßrigen Lösung, die 5% EDTA · Na? enthielt, sodann mit 250 ml einer 5%igen wäßrigen Natri'.mchloridlösung und schließlich mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die Säule wurde sodann mit einem Gemisch aus Methanol und 0,0025 N-wäßriger Salzsäure (1 : 1 V/V) eluiert 98 ml einer Fraktion mit einer Ultraviolettabsorption bei 290 Γ.ιμ wurden gesammelt. Nach dem Abdestillieren des Methanols bei vermindertem Druck wurde die zurückgebliebene Flüssigkeit, mit Dowex 44 (OH--Typ) auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und gefriergetrocknet, wodurch 658 mg (Ausbeute 98%) NK 631-Dihydrochlorid (kupferfreie Form) in Form eines hell-gelblich weißen amorphen Pulvers mit einer antimikrobielien Aktivität von 7834 u/mg erhalten wurden.

Beispiel 3

Synthese von NK 631-Monosulfat(Kupfer

enthaltende Form) und des Diessigsäuresalzes

(kupferfreie Form)

Stufe A

In 10 ml Methanol wurden 1,0 g Bleom>cinsäure-3-aminopropylester-dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Die heftig gerührte Lösung wurde bei Raumtemperatur tropfenweise mit 104 mg Benzoylchlorid im Verlauf von 30 min versetzt, während der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von N-Methylmorpholin bei 5,0 bis 7,5 gehalten wurde. Nach weiterem 30minütigen Rühren v/urde das Reaktionsgemisch mit 50 f'i Aceton versetzt, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen und tneut in 3 ml Methanol aufgelöst. Zu der Methanollösung wurden unter Kühlen auf 0°C und Rühren 597 mg Aminoverbindung gegeben und das Gemisch wurde 42 h bei 0°C gerührt. Zu dein Reaktionsgemisch wurden unter Rühren IC ml kaltes Aceton gegeben, um das Reaktionsprodukt zur Ausfällung zu bringen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gew?- schen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst und sofort mit 0,1 N-Salzsäure auf einen pH-Wert von 6.0 eingestellt, üie wäßrige Lösung wurde mit CM-Sephadex in ähnlicher Weise wie in Stufe A des Beispiels 5 behandelt. Die Fraktion, die die Reaktionsprodukte enthielt, wurde in eine Säule gego-sen. die 65 ml Didion HP-40, gepackt in destilliertes Wasser,

2!

enthielt, um die Bleomycinkomponenlen auf dem Harz adsorbieren zu lassen. Nach dem Waschen mit Wasser wurde die adsorbierte Phase mit einem Gemisch aus Methanol und 0,01 N-wäßrige Schwefelsäure (I : I V/V) eluiert. 130 ml einer Fraktion, die eine Ultraviolettabsorption bei 292 ηιμ zeigte, wurden gesammelt. Nach dem Abdestillieren des Methanols wurde die zurückgebliebene Flüssigkeit mit Dowex 44 (OH -Typ) auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und gefriergetrocknet, wodurch 8IJ mg (Ausbeute 75%) NK 631 -Monosnlfat (Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers mit einer antimikrobiellcn Aktivität von 7819 u/mg erhalten wurden.

Stufe B

Die Kupferentfernungsbehandlung von 800 mg des NK 631-Monosulfats (Kupfer enthaltende Form), erhalten in Stufe A oben, wurde in tier gleichen Weise wie in Stufe B des Beispiels 9 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß in der F.lutionsstufc eine 5°/oige wäßrige Ammoniumacetatlösung und ein Gemisch aus Methanol und 0.01 N wäßrige [Essigsäure (I : I V/V) anstelle der 5%igen wäßrigen Natriumchloridlösung bzw. des Gemisches aus Methanol und 0,0025 N-wäßriger Salzsäure (1:1 V/V) verwendet wurden. Auf diese Weise wurden 748 mg (Ausbeute 96%) NK 631-Diessigsäuresalz (kupferfreie Form) in Form eines hell-gelblich weißen amorphen Pulvers erhalten. Das UV-Absorptionsmaximum und die antimikrobielle Aktivität dieses Produkts sind wie folgt:

U V-Absorptionsmaximum:

ηιμ (El ,,-0.1 N ■ HCI)

290 (105)

Antimikrobiell
Aktivität: 7620 u/mg.

B ei s ρ i e i 4

Synthese von NK 631-Dihydrochk'rid (Kupfer enthaltende form) und des kupferfreien Dihydrochlorids

Stufe A

In 2 ml Methanol wurden 1,0 g Bleomycinsäure-3-aminopropylester-dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) aufgelöst. Zu der heftig gerührten Lösung von Raumtemperatur wurden 98 mg Saücylaldehyd gegeben, während der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von Triethylamin bei 7,0 bis 7,4 gehalten wurde. Auf diese Weise wurde Bleomycinsäure-3-N-salicyliden-iminopropylester erhalten. Nach 1 stündigem weitergeführten Rühren wurde das auf 0"C abgekühlte Gemisch unter Rühren mit 600 mg der Aminoverbindung versetzt. Das Gemisch wurde 30 h lang gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 10 ml kaltes Aceton gegeben, um die Bleomycinkomponenten auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, sodann in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst und sofort mit 0,1 N-Saizsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde wie in Stufe A des Beispiels 5 gereinigt, wodurch 501 mg (Ausbeute 47%) NK 631-Dihydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) mit einer antimikroHellen Aktivität von 8013 u/mg erhalten wurden.

Stufe B

In 25 ml einer 0,5 N-wäßrigen Salzsäurelösung wurden 450 mg NK 631-DihydrochIorid (Kupfer enthaltende Form) erhalten in Stufe A oben, aufgelöst. Zu de Lösung wurden 25 ml einer Chloroformlösung, entha tend 0,2% Dithizon (Diphenylthiocarbazon) gegebet Nach heftigem Schütteln und Mischen wurde da > Gemisch stehen gelassen. Hierdurch schied sich da Gemisch in zwei Schichten ab. Die untere Schich (Chloroformschicht) wurde abgezogen und die ober Schicht wurde mit 25 ml einer frischen Chloroformlö sung, die Dithizon enthielt, vermischt. Die obige

'■ Maßnahmen des Schüttclns, der Phasentrennung um der Zugabe einer frischen Chloroformlösung, di Dilhi/on enthielt, wurde achtmal wiederholt. Schlic'Jlicl wurde die obere Schicht (wäßrige Schicht) mi Chloroform gewaschen und die abgetrennte wäßrig

■> Schicht wurde mit Dowex 44 (OH -Typ) auf einei pH-Wert von 6.0 eingestellt. Die auf diese Weis behandelte wäßrige Schicht wurde bei verminderten Druck zur Trockene eingedampft, wodurch 4iim (Ausbeute %%) NK 631-Dihydrochlcirid (kupferfrei ■ Form) in Form eines hellgelben weißen amorphe Pulvers mit einer antimikrobiellcn Aktivität vo 7ΗΊ5 u/mg erhalten wurden.

Beispiel 5

Synthese von NK 631-Dihydrochlorid
(Kupfer enthaltende Form)

In 2ml Methanol wurden I₁Og Bleomycinsäure-3 aminopropylesler-dihydrochlorid (Kupfer enthaltend

i" Form) aufgelöst. Zu der auf 0^cC abgekühlten l.ösunj wurden unter Rühren 1.0g der Aminovcrbindunj gegeben und das Gemisch wurde weitere 72 h lanj gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rühren mi 6 ml kaltem Aceton versetzt, um die Bleomycinkomp«

r> nentcn auszufällen. Der Niederschlag wurde wie ii Stufe A des Beispiels 5 gereinigt, wodurch 128 m; (Ausbeute 12%) NK 631-Dihydrochlorid (Kupfer ent haltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulver mit einer antimikrobiellcn Aktivität von 8O15u/mj

μ erhalten werden.

Synthese von N-[(S)-Γ-Phenyläthyl]
1,3-diaminopropar

Zu 50 g (S)-I-Phenyläthylamin von OX wurden urne

■·'< Kühlen 33 g Acrylnitril gegeben. Das Gemisch wurde ir einen Kolben gebracht, der mit einem Rückflußkühle ausgestattet war. welcher an ein Calciumchloridroh angeschlossen war. Das Gemisch wurde auf 93°C erhitzt, bei welcher Temperatur das Gemisch 18 h lanj

-.ii gerührt wurde. Nach beendigter Umsetzung wu>de da Reaktionsgemiscn von überschüssigem Acrylnitril durcl Destillation unter vermindertem Druck befreit. De Rückstand wurde unter vermindertem Druck destilliert Eine Fraktion mit einem Siedepunkt von 142 bi

« 145^cC/7mmHg wurde gesammelt, wodurch 53,5 j 3-[(S)-l'-Phenyläthylamino]-propionitril erhalten wur den. Dieses Nitril wurde in einen Autoklav zusammer mit 5 g Raney-Nickel W-7 und 50 ml Äthanol, das 15°/< Ammoniak enthielt, gegeben. Das Gemisch wurde mi

ho einer Geschwindigkeit von 1000 UpM 1,5 h lang bei 5v bis 58'C und bei einem Wasserstoffpartialdruck von 10( bis 40 kg/cm² gerührt. Nach beendigter Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch bei vermindertem Drucl destilliert. Eine Fraktion mit einem Siedepunkt von 9ί

ti bis 103"C/2 mm Hg wurde gesammelt, wodurch 483 j N-[(S)-I'-Phenylethyl]-13-diaminopropan erhalten wur den [66% theoretische Ausbeute von (S)-l-Phenyläthyl aminj.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche: 3-[(S)-r-Phenyläthylamino]-propylaminobleomycin der Formel:

NH,

H,N—C H CH NH,

H,C N-CH, C

CH O

N N

CHj H

O HO CH N

Il

H CH₁

H,N I C ίϊ CH C CH NH

CH, I Il I Il I I

N C CH O CH CH, ι Il

CH N CH₁ O CH., CH, H

i| NHieii,), — N

/'S " Il

[ H

CH

I H

~^Ν

IK)

Il O

i ANA

C CH| H

H O

C Il C C

H OH H Il

Il C O t CH₂OII

Il

C C

OH

O C

OH

C Il O NH₂

und dessen nicht-toxische Salze.
2. Hydrochlorid, Sulfat oder Acetat von 3-[(S)-1'- -,-, Phenyläthylamino]-propylaminobleomycin nach Anspruch 1.
3. Verfahren zur Herstellung von 3-[(S)-1'-Phenyl-

äthylamino]-propylaminobleomycin nach Anspruch I und dessen nicht-toxischen Salzen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein reaktives Derivat der Carboxylgruppe der Bleomycinsäure der Formel:

NH.

II.NC H CH NH.

H,C N-CH. C

CH

N N

I. Il

CMj H