DK149200B - Bleomycinsyreester til anvendelse som mellemprodukt ved fremstillingaf bleomycinsyre samt fremgangsmaade til fremstilling af bleomycinsyreesteren - Google Patents

Description

149200

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt bleo-raycinsyreester til anvendelse som mellemprodukt ved fremstilling af bleomyeinsyre samt fremgangsmåde til fremstilling af bleomycin-syreesteren.

Bleomycin-antitumor-antibiotika er vandopløselige grundlæggende glycopeptider, der er chelateret med divalent kobber, og som frembringes af Streptomyces verticillus. De blev først opdaget af Hamao Umezawa, m.fl. i 1966 omtalt, i Journal of Antibiotics 19A, side 200 (1966).

Seksten typer bleomycin er blevet fremstillet og isoleret ved hjælp af almindeligt kendte dyrkningsmetoder, herunder bleomycin A·^, ®2* 2 149200

Disse sidstnævnte typer har været anvendt på kompleks form til behandling af skælcelle carcinoma, malign lymphoma og cerebrale tumorer og udviser antitumor-virkninger og omfattende cancer-indikationer.

Den kemiske formel for bleomyciner er vist nedenfor. Det er kendt, at de forskellige typer af bleomyc-in kan opnås ved at variere den endestillede aminogruppe "R", I udgangsmaterialet, 3~ methylmercaptopropylamino-bleornycin, for fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er R en 3-methylmercaptopropylaminogruppe.

Når R i den foreliggende beskrivelse er en -OH-gruppe, er der tale om bleomycinsyre. Når R er en -OC^CH^CH^NHg-gruppe, er der tale om 3-aminopropylesteren af bleomycinsyre.

Når R er en -NHCH2-^^ -gruppe, er der tale om benzyl -aminob1eomycin.

o nh2 Y 8 . o

i) f ϊ nfR

^Vy0 vy> ΐίπΛΕ^Η CH3 S'CH^Sr011'«!,0 -'""'S "Si “I H 3 ή 3

Ay-»

0Hn b - H \sO-1iriLOH

H V.^6 H1h ft o^m2 3 149200

OVERSIGT

R gruppe forbindelse -NH-CH0-CH0-CH0-S-CHX ...... , _ . , _ 222 3 3-methylmercaptopropylaminobleomycin Θ -NH-CH2-CH2-CH2-S - CH^ 3-(S,S-dimethylmercapto)-propylamino- j bleomycin CH^ -OH Bleomycinsyre -0-CH2-CH2-CH2-NH2 3-aminopropylester af bleomycinsyre -nhch2 Ό Benzylamino-bleomycin

Det er kendt, at når Streptomyces verticillus podes og dyrkes i et dyrkningsmedium, og en amin, der svarer til aminside-kæden i den tilsigtede bleomycin, tilsættes som precursor, kan der fremstilles og isoleres en ny bleomycin, der har en amidbinding til den til R svarende amin (jfr. f.eks. beskrivelsen til belgisk patent nr. 7^5*926).

Typen af biologisk aktivitet vil variere i væsentlig grad afhængig af den særlige type bleomycin, og det er følgelig muligt at udvikle nye udmærkede antitumor-midler ved at isolere en sådan hidtil ukendt bleomycin og afprøve dens antitumor-virkning. Ved ovennævnte forgæringsproces til fremstilling af bleomyciner er imidlertid de endestillede aminer begrænset på grund af den biokemiske syntese.

Store fremskridt med hensyn til f.eks. antitumor-virkninger og cancer-indikationer i bred almindelighed ville imidlertid kunne opnås, såfremt nye bleomyciner kunne fremstilles syntetisk i stedet for ved den kendte biokemiske syntese, f.eks. ved kemisk at forbinde bleomycinsyre og den ønskede amin under anvendelse af bleomycinsyre og forskellige aminer som udgangsmateriale.

At det forholder sig således har nu vist sig at være rigtigt, og det har vist sig muligt at fremstille bleomycinsyre ud fra det nye mellemprodukt ifølge opfindelsen, hvilket mellemprodukt er en hidtil ukendt bleomycinsyreester, som er ejendommelig 4 149200 ved, at den er 3-aminopropylesteren af bleomyeinsyre og har den i krav l's kendetegnende del angivne formel, eller et syresalt eller kobberkompleks heraf.

Den nye bleomycinsyreester ifølge opfindelsen har vist sig at kunne fremstilles ved en fremgangsmåde, som er ejendommelig ved, at 3-methylmereaptopropylaminobleomycin eller et syresalt heraf bringes til at reagere med en halogenforbindelse med formlen: R - X, hvor R er -CN, -CH2C00H, -C^COOR1, -CH2C0NH2 eller —^ N02 , no2 hvor R1 er en lavere alkylgruppe, og X er et halogenatom, i et surt vandigt medium eller et surt vandholdigt organisk medium.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opløses 3-methyl-mercaptopropylaminobleomycin i en sur vandig opløsning indeholdende en mineralsyre, såsom saltsyre, brombrintesyre, svovlsyre, eller en organisk syre, såsom myresyre, eddikesyre, trifluor-eddikesyre eller vinsyre, og derefter tilblandes opløsningen ovennævnte halogenid, såsom cyanogenbromid (BrCN), jodeddikesyre (ICH2COOH), ethyl-bromacetat (BrCH2C00C2H^), jodaeetamid (ICH2C0NH2) eller 2,4-dinitrofluorbenzen (F—f y—N02) i et forhold på 1-50 mol, fortrinsvis 3—30 mol halogenid i forhold til 3-methylmercaptopropylaminobleomycin og omsættes ved 0-90°C, fortrinsvis i fra 14-48 timer.

Por at forøge opløseligheden af halogenidforbindelsen er det hensigtsmæssigt at tilsætte et organisk opløsningsmiddel, såsom methanol, acetone, dioxan, dimethylsulfoxid, dimethylformamid eller methylcellosolve.

Ifølge ovennævnte reaktion knyttes halogenforbindelsen til S-atomet i 3-methylmereaptopropyl-gruppen (I) for at indføre N0„ hvor R har den ovenfor angivne betydning, således at der dannes en sulfoniumsaltstruktur (II). Derefter fjernes denne gruppe sammen med methylmercaptotruppen til dannelse af en iminolactonstruktur (III),og derefter hydrolyseres iminobindingen til dannelse af en 5 149200 esterbinding, hvorved 3-aminopropylesteren af bleomycinsyre (IV) fremkommer.

Reaktionstemperaturen er sædvanligvis stuetemperatur, selvom omdannelsen fra strukturen (II) til strukturen (IV) undertiden fremmes ved at opvarme reaktionsblandingen til 80-90°C i 30-40 minutter i det tilfælde, hvor bestemte halogenforbindelser, f.eks. jodacetamid, anvendes.

Når pH for den vandigeopløsning er under 1,0, er det at foretrække at afkøle til ca. 0°C for at hindre sidereaktioner for bleomycinet. Reaktionen fremgår af nedenstående reaktionsskema, der viser den endestillede -COR-gruppe i bleomycin.

ch2 - ch2 ch2 - ch2 / \ RX / \ -C - NH CH7 -» - C - NH CH2

o S O R - S - XU

I 1 ch3 ch3 il) (II) s > - (R-S-CH3) ^N-CH2 > -C CH2 \ s c

l °-ch2 J

(III) Θ Θ h3o o h3n-ch^ -:-* -C CH2 o — ch2 .

(IV) hvor R har den ovenfor angivne betydning.

6 149200

Efter reaktionen fjernes overskud af halogenforbindelse.

En flygtig forbindelse, såsom cyanogenbromid,afdrives f.eks. ved formindsket tryk.

I det følgende er der anført en kort omtale vedrørende ion-bytteharpikser, gelfiltreringsmiddel, adsorbent og tyndlags chroma-tografiplader, der er benyttet ved de udførte forsøg.

"CM-Sephadex C-2511 (Sephadex er et i DK reg.varemærke)

Handelsnavn for et tørt uopløseligt pulver bestående af mikroskopiske kugler af syntetisk organiske forbindelser indeholdende earboxymethylgrupper afledt af dextranpolysaccharid fremstillet og markedsført af firmaet Pharmacia Pine Chemicals, Inc.

"Amberlit^CG-So» "Amber lit#45::

Handelsnavn for en ion-bytteharpiks fremstillet og markedsført af firmaet Rohm and Haas Co.

nDowex®W (OH -type)

Handelsnavn for en ion-bytteharpiks fremstillet og markedsført af firmaet The Dow Chemical Co.

,rSephadex®G-2ff:

Handelsnavn for et gelfiltreringsmiddel bestående af et dextran derivat fremstillet af firmaet Pharmacia Pine Chemicals, Inc.

'Silicagel G':

Handelsnavn for en adsorbent til tyndlags chromatografi bestående af silicagel og gips fremstillet af firmaet Merck Inc.

"Avicel®Sff';

Handelsnavn for en tyndlags chromatografiplade bestående af krystallinsk cellulose fremstillet af firmaet PMC Corporation.

"Amberlist 15': '

Handelsnavn for en ion-bytteharpiks fremstillet og markedsført af firmaet Rohm and Haas Co.

" Amb e r 1 ItffilAD - 2':

Handelsnavn for en adsorbent harpiks bestående af styren-di- 3 vinylbenzen copolymer fremstillet og markedsført af firmaet Rohm and Haas Co.

Det er at foretrække at fjerne overskud af f.eks. jodeddikesyre eller 2,4-dinitrofluorbenzen ved at ekstrahere det med et organisk opløsningsmiddel, såsom æter. Reaktionsopløsningen neutraliseres derefter med en vandig natriumhydroxidopløsning til pH på 4,5“5j0. Efter neutralisationen adsorberes produktet og ikke-omsat bleomycin af en svagt sur ion-bytteharpiks, såsom "Amberlite® CG-50"(H+-type)(handelsnavn for firmaet Rohm and Haas Co.) ved at føre opløsningen gennem en søjle pakket 7 149200 med nævnte ionbytterharpiks og fyldt med destilleret vand.

Søjlen vaskes med vand og derefter med en o,1-1,o# vandig eddikesyreopløsning og den elueres derefter med en sur methanol-vand-blanding såsom en blanding af 5o# methanol-o,o2 N HC1, således at der opsamles en fraktion med maksimal absorption ved 29o mp . Fraktionen blandes med pyridin, således at den indstilles på pH 4,5-5,0. Produktstrømmen koncentreres og tørres ved formindsket tryk til opnåelse af et råpulver. Produktet bringes i kontakt med en søjle af "CM-Sephadex C-25" (handelsvare fremstillet af Pharmacia Fine Chemicals, Inc.), der er bufferet med 0,05 M-pyridineddikesyre-stødpudeopløsning med pH på 4,5.

Reaktionsproduktet og det ikke-omsatte bleomycin kan adskilles i hver sin fraktion ved eluering med en pufferopløsning me'd samme pH ved gradvis af forøge koncentrationen af pyridineddikesyre-pufferopløsningen fra 0,05 M til 0,5 M. Det vil sige det ikke-omsatte bleomycin elueres med 0,3 M pyridineddikesyre-pufferopløsning, medens 3-aminopropylesteren af bleomycinsyre elueres med 0,5 M pyridineddikesyre-puf feropløsning. I overensstemmelse hermed opsamles afløbet af 0,5 M opløsningen og tørres, og produktet genudfældes fra metha-nolether til opnåelse af et amorft pulver af dieddikesyresaltet af 3-aminopropylesteren af bleomycinsyre, og produktet bringes i kontakt med "Amberlite® IR-45' [(Cl -type)] (handelsvare fra Rohm and Haas Co.) ved at føre det gennem søjlen, der er pakket med nævnte ionbytteharpiks, således at dihydrochloridet af 3-aminopropylester af bleomycinsyre (Cu-complex) opnås. De fysisk-kemiske egenskaber af dihydrochloridet af 3-aminopropylesteren af bleomycinsyre (Cu-complex) er anført i nedenstående tabel I.

TABEL I

(1) Udseende blåt amorft pulver · (2) Opløselighed opløselig i vand, methanol og eddike syre, i ringe grad opløselig i dime-thylsulfoxid og uopløselig i ethanol, acetone, æter og benzen.

(3) Reaktion positiv ved ninhydrin-reaktion, Dra- gendorf-reaktion, Pauly-og Ehrlich-re-aktion, negativ ved Toliens reaktion, ferrichlorid-reaktion, Fehling- og Molisch-reaktion og Sagaguchi-reaktion.

149200

; O

TABEL I (fortsat) (4) Smeltepunkt (dekomponerer ved 201-203°C) (5) Specifik drejning . H ^ = -78,6° (c. = 0,1, destilleret vand) (6) Tyndlags-chromatografi (Rfværdi) x (a) o,74 (b) o,5o (7) Papir-chromatografi (R„værdi) o,8o (HToyo"-filterpapir nr. 51: lo# ammonium ehlorid) (8) . Papir elektrophorese (Rm værdi — alanin: l,o) o,815 (ved 3ooo V i 4o min.,) (25: 75: 9oo myresyre:) (eddikesyre: vand ) (9) Ultraviolet maksimumabsorption my (E^m) 29o my- (131) 246 my (147) i destilleret vand (10) Infrarødt absorptions- ved 34oo, 172o, l66o, l64o, spektrum (KBr metode) 15lli 1ή6°* 12203 lo5°> 765 (cm-1) (11) Grundstofanalyse (%)

som C^^H^gN1g022S2Cu, 2HC1, HgO

Beregnet C: 42,21; H: 5,35; N: 14,87; 0: 24,4o; S: 4,25; Cl: 4,70; Cu: 4,21

Pundet C: 41,82; H: 5,41; N: 15,31; 0: 24,52; S: 4,19; Cl: 4,46; Cu: 4,22 x) (a) ’Silicagel G” methanol: lo# ammonium acetat =1:1 (b)"Avieel SF" n-propanol: pyridin: eddikesyre:vand = 15 : lo:3:12

Det ultraviolette absorptions spektrum for produktet er vist 9 149200 på fig. 1, og det infrarøde spektrum for produktet bestemt ved hjælp af KBr-tabletmetoden er vist på fig. 2.

Når produktet blev fuldstændigt hydrolyseret i 6N-HC1, fandtes intet 3-methylmercaptopropylamin, som forekom i udgangsmaterialet, 3-methylmereaptopropylamino bleomycin, men i stedet 3-aminopropanol. Ved 2, 4-dinitrofluorphenyl-reaktionen blev amino-gruppen i 3-aminopropanol bragt til at reagere med 2,4-dinitrofluor-phenylgruppen.

Ved sammenligning med udgangsforbindelsen 3-methylmercapto-propylaminobleomycin var NMR-spektret (i tungt vand, ved 100 MHz og tetramethylsilan som ydre standard) for produktet ikke forskelligt med undtagelse af, at den ikke udviste 62,50 milliontedele (3 proton enkeltspektrallinie), og det infrarøde spektrum for produktet var' ikke forskelligt med undtagelse af, at absorptionen steg ved 1720 cm 1 som følge af estercarbonyl-gruppen. Ovennævnte forhold og de fysisk-kemiske egenskaber, der er anført i ovenstående tabel viser, at produktet var 3-aminopropylesteren af bleomycin.

Den resulterende 3-aminopropylester af bleomycinsyre kunne let omdannes til bleomycinsyre. Nærmere bestemt blev hydrochloridet eller acetatet af 3-aminopropylesteren af bleomycinsyre opløst i destilleret vand, og opløsningen blev indstillet på pH 2,0-5,5 ved tilsætning af saltsyre eller vandig natriumhydroxidopløsning. Opløsningen opvarmedes til 40-120°C i en autoklave eller en åben reaktor til hydrolyse og selektiv fjernelse af den endestillede gruppe i 3-aminopropylgruppen som 3-aminopropanol til dannelse af bleomycinsyre.

Ved reaktionen er pH-området den vigtige faktor. Ved pH over 5,5 er sidereaktionen til fremstilling af 3-hydroxypropylamino-bleomyein ved Ν,Ο-acylomlejring dominerende i forhold til hydrolysen af esterbindingen, hvorved fremstillingen af bleomycinsyre bliver temmelig nedsat. Ved pH under 5,5 forøges hydrolysehastigheden af esterbindingen i afhængighed af pH-faldet, men en sidereaktion med dekomponering af glycosidbindinger fremkaldes imidlertid samtidig, når pH er for lav. På baggrund af ovenstående er det optimale pH-område følgelig fra 2 til 5,5· Reaktionstidsrummet kan vælges indenfor området 1-24 timer afhængigt af pH-værdien og reaktionstemperaturen.

Por at isolere reaktionsproduktet neutraliseres reaktionsopløsningen med en vandig opløsning af natriumhydroxid til en pH-værdi på 6-7, og derefter fortyndes opløsningen med vand, således at der opnås en uorganisk saltkoncentration under o,.o5 M, og den fortyndede 10 149200 opløsning føres gennem en søjle pakket med "CM-Sephadex C-25" (Na+-type) (handelsvare eller"Amberlite® CG-50"(Na+-type)(handelsvare). Produktet elueres med destilleret vand, hvorved bleomycin-syren, der ikke er adsorberet, elueres, medens den ikke-reagerede 3-aminopropylester af blebmycinsyre stadig er adsorberet. Pølgelig opsamles den fraktion indeholdende bleomycinsyre, som har maksimal absorption ved 292 my. Afløbet bringes endvidere i kontakt medrtAm-berlite® XAD-2"(handelsvare) eller aktivt carbon ved søjleehromato-. grafiadsorption og elueres dernæst til afsaltningsbehandling, og eluatet neutraliseres til indstilling af pH på 6-7, hvorefter det koncentreres og tørres til opnåelse af et amorft pulver af bleo-myeinsyre. Specielt fra en sur opløsning med et pH på under 4,5 opnås det amorfe pulver af bleomycinsyre som monohydrochlorid. De fysisk-kemiske egenskaber af bleomyeinsyren (Cu-complex) er vist i nedenstående tabel II.

TABEL II

(.1) Udseende blåt amorft pulver (2) Opløselighed opløselig i vand, ringe opløselig i • methanol, eddikesyre og dimethylsul- foxid samt uopløselig i ethanol, acetone, æter og benzen.

(3) Reaktion positiv ved Pauly-og Ehrlich-reaktion, negativ ved Dragendorff-reaktion, ninhydrinreaktion, Tollens reaktion, ferrichloridreaktion, Pehling-og - Molisch-reaktion og Sakaguchi-reaktion.

(4) Smeltepunkt 224-227°C

(dekomponering) 228-23o°C (hydrochlorid) (5) Specifik drejning [bf] -84,6° |V| -81,5° (hydrochlorid) (C = 0,1, destilleret vand) (6) Tyndlags-chromatografi x) (a) 0,78 (Rj værdi) (b) o,46 (7) Papir chromatografi 0,86 ("Toyo"-filterpapir nr. 51, 1055 (R^ værdi) ammoniumchlorld) n 149200 TABEL II (fortsat) (8) Papir elektrophorese 0,65 (Rm værdi ... alanin: l,o) (ved 3000 V i 4o min., 25:75:900 myresyre: eddikesyre: vand) (9) Ultraviolet maksimumabsorption my (E^ ) 292 my (145) 1 cm 246 my (148) i destilleret vand (10) Infrarød absorptions- ved 335ο, 172ο, 1670, 164ο, 1580, l46o, spektrum (KBr metode) 1365, lo5o, 77° (cm ^) (11) Grundstofanalyse (%) som C5oH69N15022S2Cu

Beregnet C: 44,16; H: 5,11; N: 15,45 0: 25,88; S: 4,72; Cu: 4,67

Fundet C: 43,56; H: 5,27; N: 16,25; 0: 25,60; S: 4,68; Cu: 4,51 x) (a) "Silicagel G"methanol: lo# ammonium acetat: lo# ammoniakvand = lo:9:1 (b)"Avicel SF" n-propanol: pyridin: eddikesyre: vand = 15:lo:3:12

Det ultraviolette absorptionsspektrum for produktet er vist på fig. 3, og det infrarøde spektrum for produktet bestemt ved hjælp af KBr tabletmetoden er vist på fig. 4. Når produktet blev fuldstændig hydrolyseret i 6N-HC1, blev der ikke dannet en forbindelse med endestillet aminogruppe som R. Når den resulterende bleomycinsyre blev esterificeret ved opløsning i methanol-saltsyre og henstand ved stuetemperatur i 48 timer blev methylesteren fremstillet. Når methyl-esteren blev reduceret med LiBH^ i vandfri tetrahydrofuran og yderligere fuldstændig hydrolyseret, og hydrolysatet undersøgtes ved 2-dimens ional chromatografi (første dimension: højspændingspapirelek-trophorese: myresyre : eddikesyre : vand = 25:75:900, anden dimension af papirchromatografi: n-propanol : pyridin : eddikesyre : vand = 15:10:3:12. "Toyo"-filterpapir nr. 51: opstigende metode) fandtes 12 149200 det, at 2,-(2-aminoethyl)-2,4'-bithiazol-4-carbinol var blevet dannet i stedet for 2’-(2-aminoethyl)-2,4'-bithiazol-4-carboxylsyre.

Når bleomycinsyre blev behandlet med den stærkt sure ionbytterharpiks,"Amberlist 15" (H+-type)(handelsvare) som katalysator for methanolysen, og methanolysatet blev omdannet til trimethyl-silylforbindelsen og blev undersøgt ved gasehromatografi fandtes det, . at 1 mol L-gulose og 1 mol af 3-O-earbamoyl-D-manhose var blevet frembragt som methylglycosid.

Ud fra ovennævnte resultater og de fysisk-kemiske egenskaber, der er anført i tabel II konkluderedes det, at produktet var bleomycinsyre.

Bleomycinsyren, der er fremstillet ud fra bleomycinsyre-esteren ifølge den foreliggende opfindelse, har en svag antitumorvirkning, men det er imidlertid muligt at indføre enhver form for amin i den endestillede carboxylgruppe ved en kemisk reaktion uden den begrænsning, der forekommer i forbindelse med de kendte forgæringsprocesser til fremstilling af bleomyeiner.

Følgelig er bleomycinsyre en ret betydningsfuld forbindelse. F.eks. kan det hidtil ukendte benzylaminobleomycin (R = -NHCH2 -O i ovenstående formel), der ikke kan fremstilles ved forgæring, fremstilles ved at koble benzylamin med bleomycinsyre, og produktet har følgende egenskaber. Produktet er et farveløst amorft pulver, der gradvis dekomponerer ved temperaturer over 2l8°C, og som har maksimal ultraviolet absorption (i destilleret vand) ved 243 my (E**cm = 158,0) og ved 293 (E^cm = 120,5).

Produktets antimikrobielle virkning overfor Mycobacterium smegmatis 607 var 2,367 y/mg. Produktets væksthæmningsvirkning overfor dyrkede cancerceller (HeLa S^) er vist i nedenstående tabel VI.

Tabel VI.

Dosis (mcg/ml) 6 3 1*5 -Hæmningsvirkning (%) 92 73 38

Produktets karakteristiske egenskaber vil fremgå af det følgende. Produktet blev indgivet i ICR-SLC hanmus ved intraperitoneal injektion i et omfang på 10 mg/kg over et tidsrum på 10 dage.

Musene blev opdrættet i 5 uger efter den afsluttende indgivelse og 13 149200 derefter aflivet, Højre og venstre lunge blev undersøgt mikroskopisk. Graden af fibrosis var ret lav sammenlignet med den, der opstår i forbindelse med de kendte bleomyciner B2 som vist i nedenstående tabel VII. Almindeligvis er fibrosis i lunger bleomyciners hovedbivirkning i det menneskelige legeme. Det kan forventes, at der kan opnås forskellige hidtil ukendte bleomyciner med mindre bivirkning ved derivatfremstilling ud fra bleomycinsyre fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse.

Tabel VII.

Lunge Grad af fibrosis*_ - ± + ++

Bleomycin B2 Venstre 5 1-3 1 Højre 4 3 3 0

Benzylaminobleomycin Venstre 8 1 1 0 Højre 7 3 0 0

X

Antal prøver Grader af fibrosis - : fravær af fibrosis ± : forekomst af områder med tvivlsom fibrosis + : nogle få foci af ++ : spredte foci af fibrosis, fibrosis

Udgangsmaterialet 3-methylmercaptopropylamino-bleomycin kan fremstilles ved demethylering af bleomycin A2, 3-(S,S-dimethylmercapto)-propylamino-bleomycin, der fremstilles ved at dyrke den bleomyein-producerende mikroorganisme Streptom'yces verticillus i et nærings-medium ved ca. 80-120°C i ca, 3-24 timer ved normal-t tryk, højt tryk eller formindsket tryk. Det er muligt at tilsætte et medium, der ikke opløser bleomycin A2, såsom toluen, xylen og benzen.

Det resulterende 3-methylmercaptopropylamino-bleomycin (Cu-kompleks, hydrochlorid) er et blåt pulver, der gradvis dekomponerer ved 201-212°C og er opløselig i vand eller methanol, men er uopløselig i ethanol, propanol, butanol og ethylacetat.

Undertiden er det at foretrække at anvende Cu-komplekset af 3“ methylmercaptopropylamino-bleomycin eller 3-aminopropylesteren af bleo- • + + mycmsyre, der er en chelatforbindelse af et Cu , af følgende grunde.

14 149200 + + ·

Ved at chelatere Cu mindskes sidereaktionen, og placeringen af bleomycinet er synlig i en chromatografikolonne som følge af den blå farve, der følger af Cu-chelatdannelsen.

Det er imidlertid muligt at anvende det Cu-fjernede produkt, der fremstilles ved den kendte Cu-fjernelsesmetode, som udgangsmateriale i forbindelse med den foreliggende opfindelse, selv om nævnte fordele ikke kan forventes opnået.

Som anført ovenfor, er bleomycinsyre en nyttig forbindelse, som kan benyttes udgangsmateriale til fremstilling af nye syntetiske bleomyciner, såsom det hidtil ukendte benzylaminobleomycin. 3-Amino-propylesteren af bleomycinsyre anvendes-som mellemprodukt ved fremstilling af bleomycinsyre.

Fremstilling og anvendelse af mellemproduktet ifølge den foreliggende opfindelse belyses nærmere af nedenstående eksempler.

Eksempel 1.

1,0 g hydrochlorid af 3-methylmercaptopropylamino-bleomyein (Cu-kompleks) blev opløst i 20 ml 1% vandig trifluoreddikesyreopløs-ning,og 2,0 g cyanogenbromid blev tilsat under omrøring. Reaktions-opløsningen havde et pH på 0,7. Reaktoren blev lukket, og indholdet omrørt ved 27°C i 18 timer, og overskud af cyanogenbromid blev afdrevet ved formindsket tryk, og 2N-vandig natriumhydroxidopløsning blev tilsat under kraftig omrøring, og opløsningen blev indstillet på en pH-værdi på 5,1.

Opløsningen blev tilført en søjle (150 ml) pakket med"Amberlit^* CG-50"(H+ type) fyldt med destilleret vand og derefter i stigende grad vasket med 400 ml 0,3¾ vandig eddikesyreopløsning og 200 ml destilleret vand. Efter vask blev den blåfarvede fraktion indeholdende bleomycin elueret og opsamlet ved at føre 0,02N HCl-methanol (1:1) gennem,og derefter blev methanolet afdrevet ved formindsket tryk. Den resterende opløsning blev indstillet til pH 4,5 ved tilsætning af pyridin og derefter tilført en søjle (100 ml) pakket med "CM-Sephadex C-2^', der var pufret med 0,05N-pyridineddikesyrestødpudeopløsning med et pH på 4,5 for at adsorbere bleomycin.

Endvidere blev 100 ml 0,2N-pyridineddikesyrestødpudeopløsning med det samme pH ført igennem, og derefter blev 100 ml 0,3N-pyridin-eddikesyrestødpudeopløsning med det samme pH ført igennem, hvorved det ikke-reagerede bleomycin begyndte at blive elueret. Følgelig blev 100 ml af den første fraktion opsamlet til udvinding af 254 mg af 15 149200 udgangsmaterialet bleomycin. Når yderligere 80 ml af fraktionen blev elueret, blev der yderligere tilført 115 ml 0,5N-pyridin-eddikesyre-stødpudeopløsning, hvorved 3-aminopropylesteren af bleomycinsyre begyndte at blive elueret. I overensstemmelse hermed blev der opsamlet 200 ml af den blåfarvede fraktion og koncentreret ved formindsket tryk og tørret.

Produktet blev opløst i methanol-ether og genudfældet til opnåelse af 528 mg blåfarvet amorft pulver af acetatet af 3-aminopropyl-ester af bleomycinsyre (Cu-kompleks), der blev tilført i en søjle (20 ml) pakket med en svag basisk ionbytterharpiks "Amberilte IR-45" (Cl -type). Afløbet blev koncentreret og tørret til opnåelse af 497 mg blåfarvet amorft pulver af dihydrochloridet af 3-aminopropylester af bleomycinsyre (Cu-kompleks).

Eksempel 2.

100 mg hydrochlorid af 3-methylmercaptopropylaminobleomycin (Cu-kompleks) blev opløst i en blanding af 1 ml 0,2N-HC1 og 1 ml methanol, og 52,3 mg iodacetamid blev tilsat under omrøring.

Blandingen blev omrørt ved 27°C i 20 timer i et lukket rør. Overskud af iodacetamid blev ekstraheret med ether for at fjerne dette. Den resterende opløsning blev opvarmet til 85°C i 35 minutter og derefter indstillet til pH på 5,0 ved tilsætning af vandig 2N-natriumhydroxidopløsning. I overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 1 blev produktet isoleret til opnåelse af 29,5 mg dihydro-chlorid af 3-aminopropylesteren af bleomycinsyre (Cu-kompleks).

Eksempel 3.

100 mg hydrochlorid af 3-methylmercaptopropylamino-bleomycin (Cu-kompleks) blev opløst i 2 ml 95¾ eddikesyre, og 240 mg cyanogen-bromid blev tilsat under omrøring. Blandingen blev omrørt ved 27°C i 24 timer i et lukket rør. Overskud af cyanogenbromid blev afdrevet ' ved formindsket tryk, Og reaktionsopløsningen blev indstillet på pH

5,1 ved tilsætning af vandig 2N-natriumhydroxidopløsning. I overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge eksempel 1 blev produktet isoleret til opnåelse af 17,9 mg dihydrochlorid af 3-aminopropylester af bleomycinsyre (Cu-kompleks).

16 149200

Eksempel 4.

100 mg hydrochlorid af 3-methylmereaptopropylamino-bleomycin (Cu-kompleks) blev opløst i 2 ml 0,13N-brombrintesyre,og 100 mg cyanogenbromid blev tilsat under omrøring. I overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 3 blev reaktionsblandingen behandlet til opnåelse af 29,6 mg af dihydrochloridet af 3-aminopropylester af bleomycinsyre (Cu-kompleks).

Eksempel 5« 100 mg hydrochlorid af 3-methylmereaptopropylamino-bleomycin (Cu-kompleks) blev opløst i en blanding af 1 ml 0,2N-HC1 og 1 ml ethanol, og der blev tilsat 47,7*1 mg ethylbromacetat under omrøring. Blandingen blev omrørt ved 27°C i 20 timer i et lukket rør. Overskud af ethylbromacetat blev ekstraheret med ether, og den resterende opløsning blev indstillet på pH 5,0 ved tilsætning af 2N-natrium-hydroxid. I overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 1 blev produktet behandlet til opnåelse af 92 mg dihydrochlorid af 3~amino-propylester af bleomycinsyre (Cu-kompleks).

Eksempel 6.' 100 mg hydrochlorid af 3-methylmercaptopropylamino-bleomycin (Cu-kompleks) blev opløst i 4 ml vandig 1% trifluoreddikesyreopløs-ning, og der blev tilsat 36,06 mg iodeddikesyre under omrøring. Blandingen blev omrørt ved 27°C i 24 timer i et lukket rør. I overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 1 blev produktet behandlet til opnåelse af l4 mg dihydrochlorid af 3-aminopropylester af bleomycinsyre (Cu-kompleks).

Eksempel 7.

100 mg hydrochlorid af 3-methylmercaptopropylamino-bleomycin (Cu-kompleks) blev opløst i en blanding af 1 ml 0,2N-myresyre og 1 ml acetone, og der blev tilsat 250 mg 2,4-dinitrofluorbenzen. Blandingen blev omrørt ved 27°C i 48 timer i et lukket rør. Overskud af 2,4-dinitrofluorbenzen blev elueret med ether for at fjerne dette og derefter indstillet på pH 5,0 ved tilsætning af 2N-natriumhydroxid. I overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 1 blev produktet behandlet til opnåelse af 8 mg dihydrochlorat af 3-aminopropylester af bleomycinsyre (Cu-kompleks).

149200 17

Eksempel 8.

100 mg hydrochloric! af 3-methylmercaptopropylamino-bleomycin (Cu-kompleks) blev opløst i 2 ml lN-E^SOjj, og derefter blev der tilsat 100 mg cyanogenbromid under omrøring. Blandingen blev omrørt ved 0°C i 48 timer i et lukket rør. Overskud af cyanogenbromid blev afdrevet ved formindsket tryk, og reaktionsopløsningen blev indstillet på pH 5,0 ved tilsætning af 2N-natriumhydroxid. I overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 1 blev produktet behandlet til opnåelse af 26 mg dihydrochlorid af 3-aminopropylester af bleomycinsyre (Cu-kompleks).

Eksempel 9· 100 mg hydrochlorid af 3-methylmercaptopropylamino-bleomycin (Cu-fjernet) blev opløst i 2 ml 0,1N-HC1, og 200 mg cyanogenbromid blev tilsat. Blandingen blev omrørt ved 27°C i 24 timer i et lukket rør. I overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 1 blev produktet isoleret til opnåelse af 24 mg lysegult pulver af dihydrochloridet af 3-aminopropylester af bleomycinsyre (Cu-fjernet). Produktet blev opløst i vand, og 10 mg basisk kobbercarbonat blev opslæmmet heri og omrørt i 30 minutter. Overskud af basis kobbercarbonat blev frafiltreret, og filtratet blev behandlet ved hjælp af søjlechromatografi ved © tilførsel til en søjle pakket med"Sephadex G-25"til opnåelse af 25 mg dihydrochlorid af 3-aminopropylester af bleomycinsyre (Cu-kompleks).

Eksempel 10.

1,0 g dihydrochlorid af 3-aminopropylester af bleomycinsyre (Cu-kompleks) blev opløst i 10 ml destilleret vand, og opløsningen blev indstillet på pH 4,0 ved tilsætning af 0,1N-HC1. Blandingen blev opvarmet til 105°C i 6 timer i et lukket rør. Reaktionsopløsningen blev indstillet på pH 6,5 ved tilsætning af 0,lN-natriumhydroxid og blev ført gennem en søjle pakket med 20 ml"CM-Sephadex C-25" (Na+-type). Efter fjernelse af 10 ml af det første afløb blev 50 ml destilleret vand ført gennem· søjlen, hvorved alt den resulterende bleomycinsyre blev opsamlet i fraktionen. Opløsningen blev tilført ® en søjle (100 ml) pakket med ikke-ionisk harpiks "Amberlite XAD-2" fyldt med destilleret vand til adsorption af bleomycinsyre. Efter vask af søjlen med 200 ml destilleret vand blev produktet elueret med 200 ml af en blanding af 0,0025N-HC1 og methanol (1:1). Bleomycinsyre blev elueret i 70 ml af den sidste fraktion. Afløbet blev indstillet på pH 6,5 under anvendelse af"Dowex 44" (OH -.type), og opløsningsmidlet blev koncentreret og tørret og genudfældet i acetone indeholdende vand til opnåelse af 780 mg blåfarvet amorft pulver af bleomycinsyre 18 149200 (Cu-kompleks). Når søjlen af'CM-Sephadex C-25" blev behandlet med 0,5M-NaCl blev der udvundet 185 mg ikke-reageret biDsomycirisyreester.

Eksempel 11.

1,0 g dihydrochlorid af 3-aminopropylester af bleomyeinsyre (Cu-kompleks) blev opløst i 20 ml destilleret vand, og opløsningen blev indstillet på pH 2,5 ved tilsætning af 0,1N-HC1. Blandingen blev opvarmet til 100°C i 1 time, og reaktionsopløsningen blev indstillet på pH 6,5 ved tilsætning af Ο,ΙΝ-natriumhydroxid og tilført en søjle ® + (50 ml) pakket med "Amberlite CG~50"(Na -type) fyldt med destilleret vand. Efter fjernelse af 20 ml af det første afløb blev der tilført 150 ml destilleret vand til søjlen, og al bleomyeinsyre blev opsamlet i fraktionen. Opløsningen blev ført gennem en søjle (50 ml) pakket med aktivt carbon (chromatografikvalitet fremstillet af firmaet Wako Junyaku K.K.) fyldt med destilleret vand til adsorption af bleomyeinsyre. Efter vask med 200 ml destilleret vand blev produktet elueret med 150 ml af en blanding af 0,1N-HC1 og acetone (1:1), hvorved bleomyeinsyre blev udludet i 100 ml af den afsluttende fraktion.

I overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge eksempel 10 blev produktet behandlet til opnåelse af 420 mg bleomyeinsyre (Cu-kompleks).

415 mg ikke-reageret bleomycinsyreester blev udvundet.

Eksempel 12.

100 mg dihydrochlorid af 3-aminopropylester af bleomyeinsyre (Cu-kompleks) blev opløst i 2 ml destilleret vand, og opløsningen blev indstillet på pH 3S0 ved tilsætning af 0,1 N-HC1. Blandingen blev opvarmet til 105°C i 6 timer i et lukket rør. I overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 10 blev produktet isoleret til opnåelse af 83 mg bleomyeinsyre (Cu-kompleks).

Eksempel 13.

100 mg dihydrochlorid af 3-aminopropylester af bleomyeinsyre (Cu-kompleks) blev opløst i 2 ml destilleret vand og indstillet på . pH 5,5 ved tilsætning af 0,1N-HC1, og blandingen blev opvarmet til 120°C i 24 timer i et lukket rør. I overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 10 blev produktet isoleret til opnåelse af 68 mg bleomyeinsyre (Cu-kompleks).

Eksempel 14.

100 mg diacetatsalt af 3-aminopropylester af bleomyeinsyre .(Cu-kompleks) blev opløst i 2 ml destilleret vand og indstillet, til pH 2,0, og blandingen blev opvarmet til 80°C i 6 timer. I overensstemmelse med eksempel 10 blev produktet isoleret til opnåelse af 149200 19 72 mg bleomycinsyre (Cu-kompleks).

Eksempel 1'5.

100 mg dihydrochlorid af 3-åminopropylester af bleomycinsyre (Cu-fjernet) blev opløst i 2 ml destilleret vand og indstillet på pH 4,5 ved tilsætning af 0,1N-HC1. Blandingen blev opvarmet til 105°C i 6 timer i et lukket rør. I overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 10 blev produktet isoleret til opnåelse af 43 mg farveløst amorft pulver af bleomycinsyre (Cu-fjernet). Produktet blev behandlet til forbindelse med kobber i overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 9 til opnåelse af 45 mg bleomycinsyre (Cu-kompleks).

Eksempel 16.

100 mg dihydrochlorid af 3-aminopropylester af bleomycinsyra (Cu-fjernet) blev opløst i 2 ral destilleret vand og indstillet på pH 5,0 ved tilsætning af 0,1N-HC1. Blandingen blev opvarmet til 120°C i 24 timer i et lukket rør. I overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 10 blev produktet isoleret til opnåelse af 45 mg bleomycinsyre (Cu-fjernet). Produktet blev behandlet til forbindelse med kobber i overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 9 til opnåelse af 42 mg bleomycinsyre (Cu-kompleks).

Eksempel 17.

Fremstilling af benzylaminobleomycin-Cu-complex,mono- i _._hydrochlorid_ 250 mg monohydrochlorid af bleomycinsyre (Cu-complex) blev opløst i 5 ml dimethylformamid. En opløsning, der var fremstillet ved opløsning af 187 mg dicyclohexylcarbodiimid i 1 ml dimethyl-formamid blev tilsat denne opløsning under omrøring og afkøling med is, og reaktionen fik lov til at forløbe ved en temperatur på fra 0 til 5°C i 20 timer. Til reaktionsopløsning blev tilsat 50 ml diethylether, hvorved der dannedes et blåt præcipitat. Præ-cipitatet blev indvundet ved filtrering og blev igen opløst i dimethylformamid og afkølet til en temperatur på 0-5°C. Der blev derpå tilsat 194 mg benzylamin og reaktionen fik lov til at forløbe i 16 timer. Til reaktionsopløsningen blev tilsat 50 ml diethylether, hvorved der dannedes et blåt præcipitat. Præcipitatet blev opsamlet ved filtrering og derpå underkastet isolering og rensning på samme måde som i eksempel 1, hvorved der opnåedes 8l mg monohydrochlorid af benzylaminobleomycin-Cu-complex. Udbyttet var 31$, og produktet var et blåt amorft pulver med følgende ultraviolette absorptionstoppe og antimikrobiel aktivitet: 20 149200 ί y

Ultraviolette absorptionstoppe: , *· destilleret vand) 243(158,0), 293 (120,5)

Antimikrobiel aktivitet: 2367 u/mg (Mycobacterium smegmatis ATCC 607)·

Claims (2)

2i 149200 Patentkrav.

1. Bleoraycinsyreester til anvendelse som mellemprodukt ved fremstilling af bleomycinsyre, kendetegnet ved, at den er 3-aminopropylesteren af bleomycinsyre med formlen:

0 NH0 u I 2 A. /CH NHp 2 xc6 2 U O T 0 U ΙΓΝ CH, „ O N-r °CH2CH2CH2NH2 Λ,Α HOx ✓CH A 1 Jlh ra2 Y Y o (j!H xo (pir n—\\S E CH3 !ΝΟΗ/0νί·Ι'ΟΗΝΟΗ° a j H * É ^ Cil2 u-c^c''\ H 5 ohh a · ηΑ0^\°Η90Η H1h ^ eller et syresalt eller kobberkompleks heraf.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af bleomycinsyreesteren ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 3-methylmercaptopropylamino-bleomycin eller et syresalt heraf bringes til at reagere med en halogenforbindelse med formlen: R - X hvor R er -CN, -CH2COOH, -C^COOR1, -CH2C0NH2 eller N02