DE2543535A1

DE2543535A1 - Neue derivate des kanamycins b und verfahren zur herstellung derselben

Info

Publication number: DE2543535A1
Application number: DE19752543535
Authority: DE
Inventors: Shinji Kondo; Kenji Maeda; Hamao Umezawa; Sumio Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1974-10-08
Filing date: 1975-09-30
Publication date: 1976-04-22
Also published as: DK451475A; CA1050537A; SU965359A3; GB1475481A; ZA756291B; SE7511229L; BE834236A; YU253075A; LU73533A1; SE431216B; HU173702B; CH615685A5; IE42354L; FR2287233B1; NL7511662A; IE42354B1; JPS5148634A; FR2287233A1; DE2543535C3; NL181503C

Description

(Die Priorität aus der japanischen Patentanmeldung No. 115199/74 vom 8.Oktober 1974 wird in Anspruch genommen).

Die Erfindung betrifft neue halbsynthetische Derivate des Kanamycins B mit antibiotischer Wirkung, und zwar l-N-(cc-Hydroxy-CJ-aminoalkanoyl)-6'-N-methyl-3', 4'-dideoxy-kanamydne B, die sich zur Behandlung verschiedener durch gram-negative und gram-positive Bakterien, einschließlich der drogenresistenten Stämme dieser Bakterien, hervorgerufene Infektionen eignen. Insbesondere betrifft die Erfindung folgende neue Derivate des Kanamycins B: 1-N-(DL-Isoseryl)-6'-N-methyl-3',4·-dideoxykanamycin B; 1-N-(L-Isoseryl)-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B; 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxy-butyryl)-6'-N-methyl-3·,4'-dideoxykanamycin B und l-N-(L-5-Amino-2-hydroxyvaleryl)-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B einschließlich der nicht-toxischen, pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalze dieser Verbindungen. Darüberhinaus betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur halbsynthetischen Herstellung dieser 1-N-(a-Hydroxy-w-amino-alkanoyl)-6'-N-methylderivate des 3',4'-Dideoxykanamycins B.

609817/1079

Eingesandte Modelle werden nach 2 Monaten, falls nicht zurückgefordert, vernichtet. Mündliche Abreden, insbesondere durch Fernsprecher, bedürfen sdirrfBIctter Bestätigung. — Die in Rechnung gestellten Kosten sind mit Rechnungsdatum ohne Abzug füllig. - Bei verspäteter Zahlung werden Bankzinsen berechnet

Gerichtsstand und Erfüllungsort Bremen.

2 I543535

De Kanamycine A und B sind bekannte aminoglycosidische Antibiotika, die als chemotherapeutische Mittel weite Verbreitung gefunden haben.In den letzten Jahren sind jedoch viele kanamycin-resistente Stämme von Bakterien aufgetreten. So hat sich beispielsweise gezeigt, daß einige, den R-Faktor tragende Stämme der gram-negativen Bakterien Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa, die aus Patienten isoliert worden sind, gegenüber der antibakteriellen Wirkung des Kanamycins resistent sind. Der Mechanismus der Resistenz dieser kanamycinresistenten Bakterien gegenüber bekannten aminoglycosidischen Antibiotika ist von H. Umezawa et al. ("Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry", Bd. 30, Seiten 183-225,1974, Academic Press) untersucht worden. Dabei konnte festgestellt werden, daß einige kanamycin-resistente Bakterien Enzyme produzieren, die die Fähigkeit besitzen, die 3'-Hydroxylgruppe der Kanamycine zu phosphorylieren und die Kanamycine mit Hilfe dieser 3'-Phosphotransferasen zu inaktivieren; andere kanamycin-resistente Bakterien erzeugen ein Enzym, welches die Eigenschaft besitzt, die 2"-Hydroxylgruppe der Kanamycine zu nucleotidylieren und über die 2"-Nucleotidyltransferase die Kanamycine zu inaktivieren; wieder andere kanamycin-resistente Bakterien erzeugen Enzyme, die die Fähigkeit besitzen, die ö'-Aminogruppe der Kanamycine zu acetylieren und die Kanamycine mittels der 6'-Acety!transferasen zu inaktivieren. Auf diese Weise konnte der Zusammenhang zwischen der Molekularstruktur der aminoglycosidischen Antibiotika und ihrer antibakteriellen Wirkung wie auch der biochemische Mechanismus der Resistenz der kanamycin-resistenten Bakterien gegenüber aminoglycosidischen Antibiotika aufgeklärt werden.

Es sind bereits mehrere halbsynthetische Derivate des Kanamycins, die auch gegenüber kanamycin-resistenten Bakterien eine Wirkung aufweisen, aus den Stammkanamyeinen sythetisiert worden. Dabei handelt es sich beispielsweise um folgende: 3·,4'-Dideoxykanamycin B(US-PS 3 753 973); 6^f-N-Methyl-3' ^'-dfideoxykanamycin B

I ö I 8 ■ 1 7 / 1 Ö 7

(GB-PS 1 384 221); l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin A und. -kanamycin B ( US-PS 3 781 268); l-N-(a-Hydroxy-ir-amino- ^J alkanoyl)-3',4'-dideoxykanamycin B ( DT-OS 2 350 169). Diese halbsynthetischen Kanamycinderivate sind, wie sich gezeigt hat, gegenüber einem Teil der kanamycin-resistenten Bakterien wirksam.

Gemäß der der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Aufgabe sollten neue und wertvolle Derivate des 3',4'-Dideoxykanamycin B hergestellt werden, die nicht nur gegen gram-negative und gram-positive Bakterien,die auf Kanamycine ansprechen, sondern auch gegen kanamycin-resistente Bakterien wirksam sind. Erfindungs-gemäß konnte jetzt festgestellt werden, daß durch selektive Acylierung der 1-Aminogruppe von 6'-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin B mit einer oc-Hydroxy-ar-aminocarbonsäure,bei der es sich um Isoserin, 4-Amino-2-hydroxybuttersäure oder 5-Amino-2-hydroxyvaleriansäure, entweder in racemischer Form oder in Form des L-Isomeren oder in F orm des D-Isomeren handeln kann, neue und wertvolle Derivate des Kanamycins B hergestellt werden können, die ein breites antibakterielles Wirkungsspektrum gegen gram-negative und gram-positive Bakterien, die auf Kanamycine ansprechen, wie auch gegen kanamycin-resistente Bakterien aufweisen.

Die erfindungsgemäßen neuen Derivate des Kanamycins B sind auch gegen die kanamycin-resistenten Bakterien, die die eingangs erwähnten inaktivierend wirkenden Enzyme prodzieren, wirksam. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der neuen Derivate des Kanamycins B aus 6^!-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin B ist in einfacher Weise durchführbar und liefert das gewünschte Produkt in guter Ausbeute.

Unter Berücksichtigung des vorstehend gesagten bilden den Gegenstand der vorliegenden Erfindung neue l-N-(a-Hydroxy-w-amino-

609817/ 1079

P43535

alkanoyl)-6·-N-methyl-3¹,4'-dideoxykanamycine B der Formel

η_ονΛ^^^"

2 ₃„

(I)

CHOH (CH₂)_n

NH₂

in welcher η 1,2 oder 3 bedeutet, einschließlich der pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalze derselben. Der a-Hydroxy-iiT-aminoalkanoylteil, d.h. die Isoserylgruppe, 4-Amino-2-hydroxy-butyrylgruppe oder 5-Amino-2-hydroxyvalerylgruppe, die im Molekül der neuen Verbindungen gemäß vorstehender Formel (I) enthalten ist, kann entweder in der DL-Form ( d.h. in der racemisehen Form) oder in der L-Form oder in der D-Form vorliegen.

Beispiele für die neuen Verbindungen gemäß vorstehender Formel (I) sind nachfolgend aufgeführt:

(1) 1-N-(DL,-Isoseryl)-6'-N-methyl-3¹,4·-dideoxy-kanamycin B.

(2) l-N-(L-Isoseryl)-6'-N-methyl-3',4·-dideoxy-kanamycin B.

(3) 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6^f-N-methyl-3',4·-dideoxykanamycin B.

(4) l-N-(L-5-Amino-2-hydroxyvaleryl)-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B.

Beispiele für pharmazeutisch akzeptable Säureanlagerungssalze der neuen Verbindungen gemäß vorstehender Formel (I) sind die

§098 17/1079

25^3535

Hydrochloride, Hydrobromide, Sulfate, Phosphate, Nitrate, Carbonate, Acetate, Maleate, Fumarate, Succinate, Tartrate, Oxalate, Citrate, Hethansulfonate, Äthansulfonate, Ascorbate u.a., wobei es sich um die Mono-, Di-, Tri-, Tetra- oder P_entasalze handeln kann, die durch Umsetzung von 1 Mol der neuen Verbindung gemäß Formel (I) mit 1-5 Mol einer nicht-toxischen, pharmazeutisch akzeptablen Säure gebildet werden. Für die Zwecke der Erfindung verwendbare pharmazeutisch akzeptable Säuren sind Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Essigsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Oxalsäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Ascorbinsäure u.a.

Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen weisen folgende physikalische, chemische und biologische Eigenschaften auf:

1-N-(DL-Isoseryl)-6'-N-meftiyl-3',4'-dideoxykanamycin B liegt in Form eines farblosen kristallinen Pulvers mit einem Zersetzungspunkt von 165-169° C vor, (Ct)²Jj = +96° ( c 1,175^ Wasser). Die Elementaranalyse stimmt mit den theoretischen Werten für C₂₂H^₄N₆O₁₀ ( C 47,81%; H 8,03%; N 15,21%) überein. Die Substanz gibt einen Einzelfleck ( der positiv gegenüber der Ninhydrin-Reaktion ist) bei Rf 0,51 , wenn Inan dieselbe mittels der Dünnschicht-Chromatographie an Silikagel ( "ART 5721", ein von der Firma Merck, Deutschland, unter dieser Bezeichnung vertriebenes Produkt) prüft und mit einem Gem isch aus n-Butanol-Äthanol-Chloroform-28 %-igem wässrigem Ammoniak im Volumenverhältnis 4:5:2:8 entwickelt.

l-N-(L-Isoseryl)-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B ist eine Substanz, die in Form eines farblosen kristallinen Pulvers vorliegt, einen Zersetzungspunkt von 162 -166° C und (a)^ = +80° (c 1,02, H₂O) aufweist. Ihre Elementaranalyse stimmt m it den theoretischen Werten für C₂₂H₄₄N₆O₁₀ ( C 47,81%; H 8,03%; N 15,21%) überein. Die Substanz ergibt einen Einzelfleck (positiv gegenüber Ninhydrin) bei Rf 0,51 bei der vorstehend

609817/1079

- 6 erwähnten Silikagel-Dünnschicht-Chromatographie,

l-N- (L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6' -N-me.thyl-3', 4' -dideoxykanamycin B liegt in Form eines farblosen kristallinen Pulvers mit einem Zersetzungspunkt von 158-161° C und (a)^ = + 71° (c 0,8, H₂O) vor. Die Elementaranalyse stimmt mit den theoretischen Werten für C₂₃H₄₆N₆O₁₀ ( C 48,75 %; H 8,18 %; N 14,83%) überein. Die Substanz ergibt einen Einzelfleck ( positiv gegenüber Ninhydrin) bei Rf 0,38 bei der vorstehend erwähnten Dünnschicht—Chromatographie an Silikagel.

l-N- (L-5-Amino-2-hydroxyvaleryl)-6 · -N-methyl-3', 4' -dideoxykanamycin B liegt in Form eines farblosen kristallinen Pulvers mit einem Zersetzungspunkt von 152-155° C und (a)_D = + 79° (c 0,71, H₂O) vor. Ihre Elementaranalyse stimmt mit den theoretischen Werten für C₂₄H₄₈N₆O₁₀ ( C 49,64%; H 8,33 %; N 14,47%) überein. Die Substanz ergibt einen Einzelfleck (positiv gegenüber Ninhydrin) bei Rf 0,39 bei der vorstehend erwähnten Silikagel - Dünnschicht—Chromatographie.

Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen der Formel (T) zeichnen sich dadurch aus, daß sie in keiner Weise für die enzymatischen Inaktivierungsreaktionen durch die eingangs erwähnten verschiedenen Enzyme, die die Stammkanamycine A und Kanamycin B inaktivieren, anfällig sind. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden weder durch 6'-Acetyltransferasen inaktiviert, weil die 6'-Aminogruppe in den erfindungsgemäßen neuen Derivaten methyliert ist, noch durch 2"-Nucleotidyltransferase noch durch 3'-Phosphotransferase inaktiviert, weil die l-Anuinogruppe der erfindungsgemäßen neuen Derivate durch die <x-Hydroxy-4>'- aminoacylgruppe acyliert ist, noch unterliegen sie einer Inaktivierung durch irgendeine andere Art von 3^f-Phosphotransferase, weil die 3¹- und 4'-Hydroxylgruppen, die ursprünglich in der Stammverbindung Kanamycin B vorhanden sind, aus den erfindungsgemäßen neuen Derivaten entfernt worden sind. Die erfindungsgemäßen neuen Derivate sind den bisher bekannten Derivaten

609817/1079

£543535

infolgedessen weit überlegen, da sie eine starke antibakterielle Wirkung nicht nur gegenüber den verschiedenen Arten von gram-negativen und gram-positiven Bakterien, die für Kanamycin empfindlich sind, sondern auch gegenüber den kanamycinresistenten Stämmen dieser Bakterien, insbesondere gegen die kanamycin-resistenten Stämme Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa aufweisen.

Die Mindesthemmkonzentrationen ( mcg/ml) von l-N-(DL-Isoseryl)-6'-N-me.thyl-3' ,4'-dideoxykanamycin B (abgekürzt DL-IS-MDKB), l-N-(L-Isoseryl)-6'-N-metnyl-3',4'-dideoxykanamycin B (abgekürzt L-IS-MDKB), l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B (abgekürzt AHB-MDKB) und l-N-(L-5-Amind-2-hydroxyvaleryl)-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B (abgekürzt AHV-MDKB) gegen verschiedene Organismen wurde nach der seriellen Verdünnungsmethode unter Verwendung von Nähragar als Medium bei 37°C bestimmt, wobei die Beurteilung nach achtzehnstündiger Bebrütung erfolgte. Zum Vergleich wurden auch die Mindesthemmkonzentrationen (mcg/ml) von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin A (abgekürzt AHB-KMA) und l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin B (abgekürzt AHB-KMB) in derselben Weise bestimmt; diese letztgenannten Verbindungen sind aus der US-PS 3 781 268 bekannt.

Die antibakteriellen Wirkungsspektren der genannten Verbindungen sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt.

60 98 17/1079

Tabelle

m ο co co

Test—Organismen	Mindesthemmkönzenträtionen <	DL-IS-MDKB	L-IS-MDKB '	AHB-MDKB	AHV-MDKB	;mcg/mi.)	AHB-KMB
Staphylococcus aureus Smith	<0.20	<0.20	<0.20	<0.20	AHB-KMA	<0.20
Staphylococcus aureus FDA 209P	0.78	<0.20	0.78	0.39	<0.20	O.78
Staphylococcus aureus Terajima	<0.20	<0.20	<0.20	<0.20	0.39	0.20
Sarcina lutea PCI 1001	6.25	3.13	3.13	12.5	<0.20	3.13
Bazillus anthracis	<0.20	<0..20	< 0.20	<0.20	3.13	<0.20
Bacillus subtilis PCI 219	<0.20	<0.20	<0.20	<0.20	<0.20	<0.20
Bacillus subtilis NRRL B-558	<0.20	<0.20	<0.20	<0.20	< 0.20	<0.20
Bacillus cereus ATCC 10702	3.13	I.56	3.13	I.56	<0.20	I.56
Corynebacterium bovis l8lO	3.13	0.78	3.13	6.25	O.7S	0.39
Mycobacterium smegmatis ATCC 607	0.39	0.39	0.20	O.78	' 0.78	O.78
Shigella dysenteriae JS 11910	6.25	3.13	3.13	3.13	<0.20	3.13
Shigella flexneri 4b JS Il8ll	3.13	I.56	3.13	3.13	3.13	3.13
Shigella sonnei JS 11746	3.13	3.13	6.25	3.13	3.13	I.56
Salmonella typhosa T-63	1.56	0.39	3.13	O.78	I.56	0.39
Salmonella enteritidis I891	3.13	O.78	1.56	O.78	0.39	3.13
Proteus vulgaris OX 19	1.56	0.78	I.56	O.78	0.78	1.56
Klebsiella pneumoniae PCI 602	I.56	O.78	0.78	O.78	O.78	0.39
Klebsiella pneumoniae 22 #3038	'3.13	I.56	3.13	3.13	0.39	6.25
Escherichia coil NIHJ	I.56	1.56	I.56	O.78	I.56	O.78
Escherichia coil K-12	I.56	O.78	0.78	O.78	O.78	0.78
Sscherichia coli K-12 R5	3.13	I.56	I.56	1.56	O.78	O.78
Escherichia coli K-12 ML l629	I.56	I.56	I.56	0.78	0.39	1.56
Escherichia coli K-12 ML I63O	3.13	I.56	0.78	I.56	O.78	1.56
Sscherichia coli K-12 ML l4lO	3.13	I.56	I.56	I.56	0.78	3.13
Escherichia coli K-12 ML l4lO R81	3.13	I.56	I.56	I.56	O.78	I.56
Escherichia coli LA 290 Π55	3.13	1.56	O.78	O.78	I.56	I.56
Escherichia coli LA 290 R56	O.78	0.78	0.78	0.39	0.78	0.39
Escherichia coli LA 290 R64	O.78	0.39	O.78	0.39	0.39	Ο.39_Ί
Escherichia coli W677	I.56	O.78	0.78	O.78	0.39	0.39 <
Eüchcrichia coli JR66/W677	3.13	I.56	3.13	I.56	<0.20	3.13 .
Pseudomonas aeruginosa A3	3.13	3.13	3.13	3.13	I.56	6.25 ■
Pseudomonas aeruginosa No.12	6.25	25	3.13	25	3.13	6.25 ■
Pseudomonas aeruginosa TI-13	12.5	6.25	6.25	6.25	3.13	6.25 '
Pseudomonas aeruginosa GN315	12.5	25	6.25	12.5	3.13	50
Pseudomonas aeruginosa 99	25	• 25	25	25	100	25
6.25

Die neuen Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung, nämlich. l-ir-(<x-Hydroxy-v-aminoalkanoyl)-6'-IT-methyl-3' ,4'-dideoxykanamycin B gemäß Formel (I) besitzen für Tiere und Menschen nur eine geringe Toxieität, denn ihr EDj-Q-Wert beträgt bei intravenöser Injektion bei Mäusen mehr als 100 mg/kg. Wegen ihrer bereits mehrfach erwähnten starken antibakteriellen Wirkung sowohl gegen gram-negative als auch gegen gram-positive Bakterien, die gegenüber Kanamycinen ansprechen, als auch, gegenüber kanamycin-resistenten Stämmen, sind die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen in hervorragender Weise zur therapeutischen Behandlung von durch solche gram-negativen und gram-positiven Bakterien in hervorgerufenen Infektionen geeignet.

Die erfindungsgemäßeη Verbindungen können oral, intraperitoneal, intravenös, subkutan oder intramuskulär verabreicht werden, wobei alle beliebigen bekannten pharmazeutischen Verabreichungsformen verwendet werden können. Mir die orale Verabreichung der Verbindungen der Formel (I) eignen sich beispielsweise Pulver, Kapseln, Tabletten, Sirupe u.a. Eine ausreichende Dosis ar wirksamen Behandlung bakterieller Infektionen liegt beispielsweise bei 0,25 -2 g pro person und Tag, wenn die Verabreichung oral erfolgt. Vorzugsweise erfolgt die orale Verabreichung in drei oder vier gleichen Teilmengen pro Tag. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden, und zwar in einer Dosis von 50-500 mg pro Person, die in zwei bis vier Einzeldosen pro Tag aufgeteilt wird. Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen können auch in Salben für die äußere Anwendung eingearbeitet werden, die dann die erfindungsgemäßen Verbindungen^einer Konzentration von 0,5 -5 Gewichtsprozent in einer bekannten Salbengrundlage wie Polyäthylenglycol enthalten. Darüberhinaus können die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen auch zum Sterilisieren chirurgischer Instrumente verwendet werden, vorausgesetzt, daß die Sterilisation von einer ausreichenden mechanischen Reinigung begleitet ist.

109817/1079

Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen der Formel (i) können aus einer bekannten Verbindung nämlich 6'-U^--Methy 1-3', 4'-dideoxykanamycin B

(ID

hergestellt werden, indem man die 1-Aminogruppe dieser Ausgangsverbindung selektiv mit einer a-Hydroxy-u-aminoearbonsäure der Formel

H₂lT-( CH₂ )_a-CH (OH)-COOH

in welcher η die Zahl 1,2 oder 3 bedeutet, in für die Acylierung von Aminogruppen bei der Peptidsynthese bekannter Weise acyliert. Die vorstehend genannte Ausgangsverbindung, d.h. das ö'-U-Methyl-J¹,4'-dideoxykanamycin B der Formel (II) enthält vier freie Aminogruppen, d.h. Aminogruppen in 1-,3-»2'- und 3"-Stellung, sowie eine Methylaminogruppe in der 6'-Stellung des Moleküls. Zur Bildung des l-lT-(a-Hydroxy-w-aminoalkanoyl)-6'-lT-methyl-3^l ,^-dideoxykanamycira B der Formel (I) gemäß vorliegender Erfindung ist es erforderlich, daß nur die 1-Aminogruppe des als Ausgangsmaterial eingesetzten 6'-F-Metbyl-3¹ ^'-dideoxykanamycin B selektiv durch die a-Hydroxy-»^- aminocarbonsäure der Formel (III) acyliert wird, ohne daß eine Acylierung der anderen drei Aminog-ruppen und der •e'-Methyl-

809817/1079

aminogruppe erfolgt. Es ist für den Fachmann, ohne weiteres ersichtlich, daß die neue Verbindung der Formel (I) sich dann ^J in größter Ausbeute gewinnen läßt, wenn die a-Hydroxy-*ii-aminocarbonsäure der Formel (III) mit einem solchen Derivat der Ausgangsverbindung der Formel (II) umgesetzt wird, in welchem die 6^f-Methylaminogruppe und alle freien Aminogruppen ( d.h. 3-, 2'- und 3ⁿ- Aminogruppen) außer der 1-Aminogruppe durch ein bekanntes, aminogruppenschützendes Mittel blockiert worden sind, so daß nur die 1-Aminog-ruppe freibleibt. Die Herstellung eines solchen Derivates mit geschützten Aminogruppen ist nur unter Anwendung einer sehr komplizierten Methode, die eine Reihe von aufeinanderfolgenden Reaktionsstufen einschließt, möglich. Man zieht es infolgedessen vor, ein Derivat der Ausgangsverbindung der Formel (II) herzustellen, in dem nur die 6'~ Methylaminogruppe und gegebenenfalls die 2'-Aminogruppe durch eine Schutzgruppe blockiert sind, während die anderen Aminogruppen in freiem Zustand verbleiben. Die Herstellung eines solchen Derivates aus der genannten Ausgangsverbindung ist sehr viel leichter und einfacher möglich, und zwar infolge der Satsache, daß die 6'-Methylaminogruppe und die 2'-Aminogruppe die reaktivsten unter denv. Aminogruppen der Ausgangsverbindung der Formel (II) sind und infolgedessen vorzugsweise durch das aminogruppenschützende Mittel blockiert werden, während die anderen Aminogruppen, unblockiert bleiben. Da die Reaktivität der 2'-Aminogruppe etwas geringer ist als die der 6'-Methylaminogruppe, aber höher ist als die der 1-, 3 - und 3"-Aminogruppen, kann die 2'-Aminogruppe gegebenenfalls auch blockiert werden.

Wird ein solches Derivat der Ausgangsverbindung der Formel (II), in welchem die 6'-Methylaminogruppe und gegebenenfalls die 2'-Aminogruppe blockiert worden sind, mit der a-Hydroxy-w-aminocarbonsäure (III), deren «Kfiminogruppe vorzugsweise ebenfalls durch ein aminogruppenchützendes Mittel blockiert ist, umgesetzt, so bildet sich als Reaktionsprodukt das gewünschte l-U-monoacylierte Derivat, in dem nur die 1-Aminogruppe durch

609817/1079

die a-Hydroxy-v-aminoearbonsäure (III) acyliert worden ist, und zwar zusammen mit den unerwünschten mono- und poly-ET-acylierten Derivaten, in welchen eine oder mehrere der anderen ( als der 1-Aminogruppe) Aminogruppen und gegebenenfalls die 2'-Ami no gruppe durch die a-Hyäroxy-ii/-aminocarbonsäure (III) acyliert worden sind. Das Acylierungsprodukt bei der vorstehend beschriebenen Umsetzung besteht also tatsächlich aus einer Mischung unterschiedlich N-aeylierter Derivate, zu denen auch das gewünschte 1-F-monoaeylierte Derivat gehört. Gegebenenfalls ist es möglich, dieses gewünschte 1-N-monoacylierte Derivat aus der Mischung der H-acylierten Derivate zu isolieren, und zwar mit Hilfe eines chromatographischen Trennverfahrens. Andererseits ist es auch möglich, die Mischung der N-acylierten Derivate direkt zu behandeln, um die die aminogruppenschützenden Gruppen zu entfernen,wenn eine Mischung aus dem gewünschten l-isr-monoacylierten Produkt der Formel (I) mit den im übrigen unerwünschte Hebenprodukte darstellenden mono- und poly-ET-acylierten Derivaten der Ausgangsverbindung der (II) vorliegt. Das gewünschte Produkt (I) kann von den unerwünschten Nebenprodukten abgetrennt werden, in dem man die Mischung einem chromatographischen Trennverfahren unterwirft.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Herstellung von l-H-(a-Hydroxy-w-aminoalkanoyl)-6¹-E-methyl-3^l,4^l-dideoxykanamycin B der Formel (I) in der Weise, daß man selektiv die 1-Aminogruppe eines geschützte Aminogruppen aufweisenden Derivates des 6^l-N-methyl-3^l,4^l-dideoxykanamycin B der Formel

(IV)

609817/1079

■/54353b

in welcher R.. ein. "bekanntes einwertiges aminogruppenschiitzendes Mittel ist und R₂ ein Wasserstoffatom oder ein bekanntes einwertiges aminogruppenschützendes Mittel darstellt, mit einer a-Hydroxy-u-aminocarbonsäure der Formel

υ-(0Η₂)_α -CH (OH)-COOH

(V)

B-A

in welcher R* ein bekanntes einwertiges aminogruppenschützendes Mittel und R. ein Wasserstoffatom darstellen oder R, und R, zusammen eine bekannte zweiwertige aminogruppenschiitzende Gruppe bilden und η die Zahl 1, 2 oder 3 bedeutet, zu einem Reaktionsprodukt umsetzt, welches aus dem 1-N-acylierten Derivat der Formel

besteht, in welcher R-j, RgjR«^^ und η die bereits angegebene Bedeutung haben, und aus dem so gewonnenen 1-H-acylierten Derivat

609817/1079

die aminogruppenschützenden Gruppen entfernt, so daß man die gewünschte Verbindung der formel (i) erhält. An diese vorstehend beschriebene zweite Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann sich die Abtrennung der gewünschten Verbindung der Formel (i) von den unerwünschten N-aeylierten Nebenprodukten anschließen.

Zur Herstellung der Verbindungen der Formel (IV) mit blockierter ö'-Methylaminogruppe und gegebenenfalls blockierter 2¹-Aminogruppe, die als Ausgangsmaterial für die zweite Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens benutzt werden, wird ein 6'-IT-Methyl-3' ,4'-diäeoxykanamycin B der Formel (II) mit einem Reagenz umgesetzt, wie es üblicherweise in der Peptidsynthese zur Einführung einer bekannten aminogruppenschützenden Gruppe in die Aminosäure verwendet wird. Für das erfindungsgemäße Verfahren können infolgedessen alle bekannten aminogruppenschützenden Gruppen verwendet werden, die man auch üblicherweise für die Peptidsynthese verwendet, vorausgesetzt, daß sie leicht wieder aus dem bei der erfindungsgemäßen Acylierung entstehenden Produkt entfernbar sind.Wird das acylierte Derivat mit den blockierten Aminogruppen in entsprechender Weise behandelt, damit die aminogruppenschützenden Gruppen wieder entfernt werden, so muß darauf geachtet werden, daß die Amidbindung, die sich zwischen dem cc-Hydroxy-v-aminoalkanoylrest und der 1- Aminogruppe in dem acylierten Derivat gebildet hat, nicht angegriffen wird.

Beispiele für einwertige Schutzgruppen, die E^,Rp»IU und R, erfindungsgemäß sein können, sind Alkyloxycarbonyl-Gruppen mit 2-6 KoHß&stoffatomen wie A'thoxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl und t-AmyJLoxycarbonyl^ycloalkyloxycarbonylgruppen mit 4-7 Kohlenstoff at omen wie Cyclopentyl- und Cyclohexyloxycarbonyl, Aralkyloxycarbonylgruppen wie Benzyl- und p-Nitrobenzyloxycarbonyl, Aryloxycarbonylgruppen wie Phenoxycarbonyl und Furfuryloxycarbonyl sowie Acylgruppen wie o-Fitrophenoxyacetyl u.a.

609817/107

Bildet ein Paar der Gruppen FU und R^ zusammen eine bekannte zweiwertige Aminogruppen schützende Gruppe, so kann diese zweiwertige Schutzgruppe aus einer Phthaloylgruppe oder einer > Salicylidengruppe, allgemein gesprochen aus einer Alkylidengruppe oder Arylidengruppe der Formel =CHRc bestehen, wobei in der letztgenannten Formel Rc eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen wie Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl, Butyl oder Pentyl oder eine Arylgruppe wie Phenyl, Tolyl, p-Methoxyphenyl oder o-Hydroxylphenyl darstellt.

Bekannte einwertige Aminogruppen schützende Gruppen wie Alkyloxycarbonyl, Aralkyloxycarbonyl oder Aryloxycarbonyl können durch die Formel -CO-ORg dargestellt werden, in welcher Rg folgende Bedeutung hat: eine Alkylgruppe mit 1-5 Kohlenstoffatomen wie Methyl, Äthyl, t-Butyl und t-Amyl; Cycloalkylgruppen mit 3-6 Kohlenstoffatomen wie Cyclopentyl und Cyclohexyl; Aralkylgruppen wie Phenyl-alkyl mit 1-4 Kohlenstoffatomen in der Alkylgruppe, beispielsweise Benzyl und p-Nitrobenzyl; Arylgruppen wie Phenyl oder heterocyclische Gruppen wie Furfuryl.

Für die Herstellung des Derivates des 6'-N-Methyl-3',4^f-dideoxykanamycin B (IV), in welchem die 6'-Methylaminogruppe und die 2'-Aminogruppe durch ein einwertiges, Aminogruppen schützendes Mittel der Formel -CO-ORg blockiert sind, setzt man 6'-Hi-Methyls' ,4'-dideoxykanamycin B (II) mit der zwei- bis dreifachen Molmenge eines Chlorformiats der Formel

Cl-CO-ORg (VII)

oder eines p-Nitrophenylcarbonats der Formel

P-NO₂-C₆H₅-O-CO-ORg (VII«)

oder eines N-Hydroxysuccinimidesters der Formel

N-O-CO-OR_{6 (VIItt)}

£09817/1079

- 16 oder eines Azidoformiats der Formel

N₃ -CO-OR₆ (VII '")

oder eines S-4,6-Dimeftiylpyrimid-2-ylthiocarbonats der Formel

H₃C

( Vs-CO-OR. (VII"")

N '

in welcher Rg die angegebene Bedeutung hat, in einem geeigneten Lösungsmittel wie Wasser, Äthanol, Aceton und/oder Dimethoxyäthan unter neutralen oder basischen Bedingungen in der bei der Synthese von Peptiden bekannten Art um« Die auf diese Weise gewonnenen Reaktionsprodukte bestehen im allgemeinen aus einer Mischung verschiedener, geschützte bzw. blockierte Aminogruppen aufweisende Derivate der Verbindung (II), wobei der Hauptteil aus einem Derivat besteht, in dem ausschließlich die 6·-Mdhylaminogruppe und die 2'-Aminogruppe durch die Schutzgruppe -CO-ORg blockiert sind, während ein kleinerer Teil aus einem Derivat besteht, in dem nur die 6'-Methylaminogruppe blockiert ist; daneben liegen außerdem kleinere Anteile an unerwünschten Nebenprodukten vor, in denen neben den anderen Aminogruppen auch die 1-Aminogruppe blockiert ist. Wird die Verbindung (II) mit den Acylierungsmitteln (VII), (VII'), (VII ") oder (VII"') in im wesentlichen äquimolekularen Mengen umgesetzt, so erhöht sich der Anteil an dem Derivat, in dem nur die 6'-Methylam .inogruppe blockiert ist.

Bevorzugt werden als Aminoschutzgruppe die t-Butoxycarbonylgruppe und die Benzyloxycarbonylgruppe, weil diese die Fähigkeit besitzen, in erster Linie mit der 6'Methylaminogruppe und nur

609817/1079

gelegentlich mit der 2'-Aminogruppe des 6^!-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin B (II) zu reagieren und sich außerdem leicht aus dem Acylierungsprodukt wieder abspalten lassen.

Das 2', 6'-N-Di-t-butoxycarbonyl-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B, welches vorzugsweise als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren benutzt wird, läßt sich beispielsweise in hoher Ausbeute herstellen, wenn man β'-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin B in Lösung in einer Mischung aus Pyridin, Wasser und Triäthylamin mit der zwei- bis dreifachen Molmenge t-Butoxycarbonylazid tropfenweise unter Rühren versetzt, die entstandene Mischung bei Umgebungstemperatur über Nacht rührt, das Reaktionsgemisch im Vakuum zur Trockne einengt und den verbleibenden festen Rückstand durch Säulenchromatographie reinigt; andererseits ist es auch möglich, 6'-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin B in Form einer wässrigen Lösung mit der zwei- bis dreifachen Molmenge t-Butyl S-4,6-dimethyl-pyrimid-2-ylthiocarbonat unter Rühren zu versetzen, das Rühren über Nacht bei Umgebungstemperatur fortzusetzen, das Reaktionsgemisch dann im Vakuum zur Trockne einzuengen und den verbleibenden festen Rückstand wiederum durch Säulenchromatographie zu reinigen. Die Reinigung des festen Rückstandes durch Säulenchromatographie kann unter Verwendung eines Kationen-Austauscherharzes mit Carboxylfunktion durchgeführt werden; beispielsweise eignet sich zu diesem Zweck ein Copolymer der Methacrylsäure mit Divinylbenzol, z.B. das unter der Handelsbezeichnung "Amberlite CG 50" ( Ammoniumform.) bekannte und von der Firma Rohm & Haas, U.S.A. vertriebene Produkt. Der gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren gewonnene feste Rückstand besteht aus dem gewünschten 2¹,6^f-N-Di-t-butoxycarbonyl-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin und 6'-N-Mono-t-butoxycarbonyl-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B und kann direkt als Ausgangsmaterial für die Acylierung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.

Bei der oc-Hydroxy-w-aminocarbonsäure (V), die als Acylierungs-

609817/1079

254353b

mittel bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, kann die Amino schutzgruppe für die R^-Gruppe aus einer üblicherweise bei der Peptidsynthese benutzten Schutzgruppe bestehen. Vorzugsweise sollte die Aminoschutzgruppe, die in dem Acylierungsmittel der Formel (V) vorliegt, dieselbe sein, die auch in dem eingesetzten Ausgangsmaterial, d.h. dem 6'-N-Methyl-3' ,4'-dideoxykanamycin-B-derivat (IV) vorliegt. Die Herstellung einer a-Hydroxy-v-aminocarbonsäure (V),in welcher die v-Aminogruppe durch eine einwertige Aminoschutzgruppe blockiert ist, kann in derselben Weise durchgeführt werden, wie dies bei dem 6-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin-B-derivat (IV) geschieht. In den Fällen, in denen die Gruppen FU und R-zusammen eine zweiwertige Aminoschutzgruppe bilden, soll diese vorzugsweise aus einer Phthaloyl- oder Salicylidengruppe, ganz allgemein aus einer Alkyliden- oder Arylidengruppe der Formel =CHRc bestehen, wobei in der letztgenannten Formel Rc eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen wie Methyl,Äthyl, Propyl, Isopropyl, Butyl oder Pentyl oder eine Arylgruppe wie Phenyl, Tolyl, p-Methoxyphenyl oder ο-Hydroxyphenyl ist. Die Herstellung einer oc-Hydroxy-ur- amino carbonsäure (V), in welcher die v-Aminogruppe durch eine zweiwertige Aminoschutzgruppe der Formel =CHR_C blockiert ist, kann durchgeführt werden, in dem man die oc-Hydroxy-w-aminocarbonsä ure (V) , mit im wesentlichen äquimolekularen Mengen eines Aldehyds der Formel

OHC-R₅ (VIII)

in welcher R₅ die angegebene Bedeutung hat, in der für die Herstellung von Schiffsehen Basen bekannten Weise umsetzt. Für diesen Zweck geeignete Aldehyde sind Acetaldehyd, Anisaldehyd, Tolualdehyd, p-Nitrobenzaldehyd und Salicylaldehyd.

Die a-Hydroxy-ur- amino carbonsäure (V), die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet wird, kann entweder in racemischer Form oder in optisch aktiver Form, d.h. als L-Isomer oder als

609817/1079

D-Isomer vorliegen. Vorzugsweise sollen jedoch a-Hydroxy-Y-aminobuttersäure, welche eine Verbindung derFormel ( III) mit η = 2 ist und cc-Hydroxy-i-aminovaleriansäure, welche eine Verbindung der Formel (III) mit n=3 ist, in Form des optisch aktiven L-Isomeren vorliegen, weil sich die von diesen Derivaten ableitenden Endprodukte eine höhere antibakterielle Aktivität aufweisen als die von den D-Isomeren abgeleiteten Endprodukte.

Bei der Acylierungsstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das 6'-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin-B-derivat (IV) mit geschützten Aminogruppen mit der oc-Hydroxy-ur-aminocarbonsäure (V) in der für die Herstellung von Amiden üblichen Weise umgesetzt. D.h. die Ausgangsverbindung (IV) kann mit dem Acylierungsmittel (V) in Lösung in wässrigem Dimethylformamid, Aceton oder Tetrahydrofuran unter Eiskühlung und in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels wie Dicyclohexylcarbodiimid umgesetzt werden. Die a-Hydroxy-w-aminocarbonsäure (V) kann auch in Form eines funktionell äquivalenten reaktiven Derivats, z.B. als Säurechlorid, als gemischtes Anhydrid, als aktiver Ester oder als Azid eingesetzt werden. So kann man beispielsweise die a-Hydroxy-u/'-aminocarbonsäure (V) zunächst mit N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart von Dicyclohexyl-carbodiimid als Dehydratisierungsmittel zu dem aktiven Ester der Formel

R₃

N-OOC-CH(OH)-(CH₂)_n W (V)

0 ^R4

umsetzen, der dann seinerseits mit der Ausgangsverbindung (IV) zur N-Acylierung der letzteren umgesetzt wird. Vorzugsweise setzt man die Ausgangsverbindung (IV) mit der 0,5 bis dreifachen Molmenge, noch besser mit der 0,5 bis 1,5-fachen Molmenge des aktiven Esters der oc-Hydroxy-aminocarbonsäure (V)

60981 7/ 1 079

um, und zwar in einem Reaktionsmedium, welches aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel wie Dimethoxyäthan besteht.

In der Acylierungsstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens bildet sich ein Gemisch von N-acylierten Derivaten der Ausgangsverbindung (IV); diese Mischung besteht im allgemeinen aus dem erwünschten 1-N-mono-acylierten Derivat sowie den übrigen unerwünschten mono-N-acylierten Derivaten und den unerwünschten poly-N-acylierten Derivaten. Die gewonnene Mischung der N-acyiierten Derivate kann dann direkt behandelt werden, um die übrigen Aminoschutzgruppen zu entfernen, d.h. um die Aminoschutzgruppen in Wasserstoffatome umzuwandeln.

Die Entfernung der verbliebenen Aminoschutzgruppen aus dem bei der erfindungsgemäßen Acylierung gebildeten Gemisch der N-acylierten Derivate kann auf folgenden verschiedenen an sich bekannten Wegen erfolgen. Besteht die Amino,s;chutzgruppe aus einer Alkyloxycarbonylgruppe wie t-Butoxycarbonyl, einer Cycloalkyloxycarbonylgruppe, einer Aryloxycarbonylgruppe, einer Alkyliden- oder Arylidengruppe, so erreicht man die Entfernung dieser Art von Aminoschutzgruppen, in dem man das Gemisch der N-acylierten Derivate einer milden Hydrolyse mit einer Säure wie wässriger Trifluoressigsäure, wässriger Essigsäure oder verdünnter Chlorwasserstoffsäure unterwirft. Handelt es sich bei der Aminos .chutzgruppe um eine Aralkyloxycarbonylgruppe wie Benzyloxycarbonyl, so erreicht man die Entfernung dieser Art von Aminoschutzgruppe, in dem man die Mischung der N-acylierten Derivate einer Hydrogenolyse in Gegenwart eines Palladium-Kohle- oder eines Platinschwarz- Katalysators oder der Behandlung mit Bromwasserstoff in Essigsäure bei niedriger Temperatur unterwirft. Eine aus o-Nitrophenoxyacetyl bestehende Aminoschutzgruppe kann durch eine reduktive Behandlung entfernt werden. Handelt es sich bei der Aminoschutzgruppe um eine Phthaloylgruppe, so erreicht man deren Entfernung durch eine

609817/1079

Behandlung der Mischung der N-acylierten Derivate mit Hydrazin-Hydrat in Äthanol. Enthält die Mischung der N-acylierten Derivate verschiedene Arten von Aminoschutzgruppen, so kann das Gemisch gleichzeitig oder nacheinander verschiedenen Methoden zur Entfernung der Aminoschutzgruppen unterworfen werden.

Nach der Entfernung der verbleibenden Aminoschutzgruppen liegt v eine Mischung verschieden N-acylierter Produkte, die sich vom 6'-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin B ableiten, zu denen das gewünschte Endprodukt, l-N-(a-Hydroxy-^-aminoalkanoyl)-6'-N-methyl-3¹,4'-dideoxykanamycin B, dessen Stellungsisomere und dessen poly-N-acylierte Derivate sowie nicht umgesetztes 6'-N-Methyl-3'_f4'-dideoxy-kanamycin B gehören. Die Isolierung des gewünschten Endproduktes der Formel (I) kann am wirksamsten erreicht werden, in dem man die Mischung der Säulenchromatographie unterwirft, wobei man mit Silikagel oder einem Kationen austauscherharz mit Carboxylfunktion wie "Amberlite IRC 50" oder "Amberlite CG 50" ( Produkte der Firma Rohm & Haas, Co., U.S.A.), einem schwachen Kationenaustauscherharz wie "CM-Sephadex C-25" ( Produkt der Firma Pharmacia Co., Schweden) oder CM-Cellulose arbeitet. Das bei der Chromatographie anfallende Eluat wird in Fraktionen aufgefangen, deren antibakterielle Wirkung unter Verwendung sensitiver und resistenter Bakterien als Testmikroorganismen bestimmt wird. Durch diese Bestimmung kann die antibakterielle Wirkung jeder Fraktion festgestellt werden, so daß es leicht ist, die aktiven Fraktionen herauszufinden, die die gewünschte Verbindung der Formel (I) enthalten. Ein Teil dieser aktiven Fraktionen wurde abgenommen und der Dünnschichtchromatographie an Silikagel unterworfen, wobei man ein Lösungsmittelgemisch aus Butanol, Äthanol, Chloroform und 17 %-igem.wässrigem. Ammoniak benutzte. Auf diese Weise ist es möglich, die Fraktionen herauszufinden, die bei einem typischen Rf-Wert einen Einzelfleck ergeben, der dem gewünschten 1-N- (a-Hydroxy-^-aminoalkanoyl)-6' -N-methyl-3', 4' dideoxykanamycin B der Formel (I) entspricht.

609817/1079

Diese Fraktionen können vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt werden; man erhält auf diese Weise die gewünschte Verbindung ( I).

Die neuen Verbindungen der Formel (I) gemäß vorliegender Erfindung sind wertvolle Mittel zur therapeutischen Behandlung von bakteriellen Infektionen. Sie lassen sich in Form üblicher pharmazeutischer Präparate zur Behandlung bakterieller Infektionen bei lebenden Tieren und auch bei Menschen verwenden. In geeigneten pharmazeutischen Präparaten liegt ein l-N-(oc-Hydroxy-v-aminoalkanoyl)-6' -N-methyl-3', 4' -dideoxykanamycin B der Formel (I) gemäß vorliegender Erfindung oder ein pharmazeutisch akzeptables Säureanlagerungssalz einer solchen Verbindung, welches den aktiven Bestandteil bildet, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägermaterial vor.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Synthese von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)- MDDKB * (Formel I; η = 2)

(a) Zu einer Lösung von 930 mg ( 2 Millimol) MDDKB* in 5 ml Wasser wurde eine Lösung von 960 mg ( 4 Millimol) 5-Butyl S-4,6-dimethylpyrimid-2-ylthiocarbonat in 5 ml Dioxan gegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt, um die t-Butoxycarbonylierung durchzuführen. Das Reaktionsgemisch wurde dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei man einen festen Rückstand erhielt. Dieser feste Rückstand wurde in 40 ml Wasser aufgenommen, aus der

*MDDKB= 6'-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin B

609817/1079

Lösung wurde das unlösliche Material abfiltriert. Die Lösung (das Filtrat) wurde über eine Kolonne (2Ox 290 mm) geleitet, die mit einer 100 ml entsprechenden Menge eines Kationenaustauscherharzes, Amberlite CG 50 (NH^-Form) gefüllt war, um die A sorption der t-Butoxycarbonylierungsprodukte an das Harz zu bewirken. Die Harzkolonne wurde mit Wasser ( 500 ml) gewaschen und mit 0,1 η wässrigem Ammoniak eluiert. Die Fraktionen des Qiates, die sich gegenüber der Ninhydrin- und der Rydon- Smith- Reaktion positiv verhielten und auch einen Hauptfleck bei Rf 0,60 bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel unter Verwendung von Butanol-Äthanol-Chloroform- 17 %-iges Ammoniak ( 4 : 5 : 2: 3 Volumenverhältnis) als Entwicklungs-Lösungsmittelgemisch ergaben » wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt; man erhielt so 538 mg eines farblosen Pulvers, welches hauptsächlich aus 2',6'-N-Dit-butoxy-carbonyl-MDDKB * (A), bestanä. Ausbeute: 41 #.

(b) Dieses farblose Pulver ( 100 mg), welches hauptsächlich aus der vorstehend genannten Verbindung (A) bestand (0,15 Millimol), wurde in einer Mischung aus 1 ml Wasser und 1 ml Dimethoxyäthan gelöst. Die so entstandene Lösung wurde zu einer weiteren Lösung von 54 mg ( 0,17 Millimol)des N-HydroxysuccininÜ-esters der L-4-t-Butoxycarbonylamido-2-hydroxybuttersäure in 2 ml Dimethoxyäthan gegeben. Die Mischung wurde 22 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt, um die Acylierung des MDDKB* mit geschützten Aminogruppen durchzuführen. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise einen festen Rückstand, der aus einer Mischung der N-acylierten Deri\ä:e des N-geschützten MDDKB* bestand.

*MDDKB « 6^I-N-Methyl-3^t,4'-dideoxykanamycin B

60981 7/1079

(c) Der feste Rückstand wurde in 2,4 ml 90 96-iger wässriger Trifluoressigsäure gelöst. Man ließ die Lösung 1 Stunde bei Umgebungstemperatur stehen, damit die t-Butoxycarbonylgruppe abgespalten werden konnte. Das Reaktionsgemisch wurde dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und der Rückstand wurde in 4 ml Wasser aufgenommen. Die Lösung wurde durch Zugabe von konzentriertem wässrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 8 eingestellt und dann durch eine Kolonne ( 8 χ 400 mm) geleitet, die mit einer 20 ml entsprechenden Menge eines Kationenaustauscherharzes, Amberlite CG 50 (NH^-Form) gefüllt war, um die Absorption der gemischten N-acylierten MDDKB*-Produkte an dem Harz zu erreichen. Die Harzkolonne wurde nacheinander mit 100 ml Wasser, 100 ml 0,3 η wässrigem Ammoniak und 0,5 η wässrigem Ammoniak gewaschen und dann mit 0,75 η wässrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 2 ml-Fraktionen aufgefangen und jede Fraktion wurde mit Hilfe der üblichen Plattenmethode auf ihre antibakterielle Wirkung gegenüber dem kanamycinempfindlichen Stamm Bacillus subtilis PCI 219 und dem kanamycinresistenten Stamm Escherichia coli JR66/W677 geprüft. Die Fraktionen, die eine hohe antibakterielle Wirkung gegenüber beiden genannten Stämmen zeigten, wurden vereinigt ( auf ein Volumen von 26 ml) und dann zur Trockne eingeengt. Man erhielt so 39 mg eines farblosen Pulvers, welches im wesentlichen aus dem gewünschten Produkt nämlich l-N-(L-4-Amino-2-hydroxy-butyryl)-MDDKB* bestand. Zur weiteren Reinigung wurde das farblose Pulver in 0,5 ml einer Mischung aus Methanol , Chloroform und 17 96-igem wässrigem Ammoniak ( Volumenverhältnis 4:1:2) gelöst und die entstandene Lösung wurde der Säulenchromatographie über 3 g Silikagel unterworfen, wobei wiederum eine Mischung aus Methanol, Chloroform und 17 %-igem wässrigem Ammoniak (Volumenverhältnis 4:1:2) als Eluierungsmittel verwendet wurde. Das Eluat wurde in 1 ml-Fraktionen aufgefangen; es zeigte sich, daß die Fraktionen Nr . 46 -78 ausschließlich l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-MDDKB* (B) enthielten, welches bei der Dünnschicht-

*MDDKB = 6^I-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin B

609817/107 9

Chromatographie an Silikagel ( "ART" 5721) unter Verwendung von Butanol-Äthanol-Chloroform - 28 %-igem wässrigem Ammoniak (Volumenverhältnis 4:5:2:8) als Eluierungsmittel einen Einzelfleck bei Rf 0,38 ergab. Die genannten Fraktionen wurden vereinigt und .zur Trockne eingeengt, wodurch man 15 mg der vorstehend genannten Verbindung (B) als reines Produkt in Form eines farblosen Pulvers erhielt. Zersetzungspunkt: 158-161° C.

Beispiel 2

Synthese von l-N-(DL-Isoseryl)- MDDKB-* (Formel (Ι); η = 1)

(a) Das farblose Pulver ( 403 mg), welches hauptsächlich aus 2',6'-N-Di-t-butoxycarbonyl-MDDKB* (0,6 Millimol) bestand und welches gemäß Beispiel 1(a) erhalten worden war, wurde in einer Mischung aus 4 ml Wasser und 4 ml Dimethoxyäthan gelöst. Die gewonnene Lösung wurde mit einer weiteren Lösung von 221 mg (0,66 Millimol) des N-Hydroxy-succinimidesters des N-t-Butoxycarbonyl-DL-isoserins in 8 ml Dimethoxyäthan vermischt. Die Mischung wurde 23»5 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt, um die Acylierung durchzuführen. Danach wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wodurch man einen festen Rückstand erhielt, der hauptsächlich aus den gemischten N-acylierten Derivaten des 2',6'-N-Di-t-butoxycarbonyl-MDDKB* bestand.

(b) Dieses feste, als Rückstand gewonnene Produkt wurde in 7,5 ml 90 %-iger wässriger Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wurde 1 Stunde bei Umgebungstemperatur abgestellt, damit die Abspaltung der t-Butoxycarbonylgruppe eintreten konnte. Danach wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der verbleibende Rückstand wurde in 16 ml Wasser gelöst. Die so gewonnene wässrige Lösung wurde durch Zugabe von konzentriertem wässrigem Ammoniak auf pH 8

*MDDKB = 6'-N-Methyl-3',4^l-dideoxykanamycin B

609817/1079

eingestellt und dann über eine Kolonne (10 χ 560 nun) geleitet, die in einer 43 ml entsprechenden Menge mit einem Kationenaustauscherharz, Amberlite CG 50 (NH^-Form) gefüllt war, um die Absorption der gemischten N-acylierten Produkte zu erreichen. Die Harzkolonne wurde zunächst mit 200 ml Wasser und dann mit 400 ml 0,3 η wässrigem Ammoniak gewaschen und anschließend 0,5 η wässrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 4 ml-Fraktionen aufgefangen und jede einzelne Fraktion wurde nach der üblichen Plattenmethode auf ihr antibakterielle Wirkung gegenüber Bacillus subtilis PCI 219 und Escherichia coli JR 66/W677 getestet. Die Fraktionen, die eine hohe antibakterielle Wirkung gegenüber beiden Stämmen zeigten, wurden vereinigt ( auf ein Volumen von 100 ml) und dann zur Trockne eingeengt. Man erhielt so 135 mg eines farblosen Pulvers, welches hauptsächlich aus dem gewünschten Produkt, nämlich 1-N-(DL-Isoseryl)-MDDKB* (C) bestand. Zur weiteren Reinigung wurde dieses farblose Pulver in 2,6 ml einer Mischung aus Methanol, Chloroform und 17 96-igem wässrigem Ammoniak ( Volumenverhältnis 4:1:2) gelöst und die entstandene Lösung wurde der Säulenchromatographie an Silikagel ( 8g) unterworfen, wobei eine Mischung aus Methanol, Chloroform und 17 %-igem wässrigem Ammoniak ( Volumenverhältnis 4:1:2) als Eluierungsmittel verwendet wurde. Das Eluat wurde in 2 ml-Fraktionen aufgefangen, wobei sich zeigte, daß die Fraktionen Nrn. 20 -27 allein das gewünschte Produkt enthielten, welches bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel ("ART" 5721) unter Verwendung eines Gemisches aus Butanol,Äthanol, Chloroform und 28 %-igens wässrigem Ammoniak (Volumenverhältnis 4:5:2:8) als Eluierungsmittel einen Einzelfleck bei 0,51 ergab. Diese Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt; man erhielt so 38 mg der vorstehend genannten Verbindung (C) als reines Produkt in Form eines farblosen Pulvers. Zersetzungspunkt: 165 -169° C.

*MDDKB = o'-N-Methyl^¹,4'-dideoxykanamycin B

80981 7/1079

Beispiel 3

Synthese von. 1-N-(L-Isoseryl)-MDDKB (Formel (I); η = 1)

(a) t-Butoxyearbonylazid (465 mg; 3,2 Millimol) wurde zu einer lösung von 500 mg (1,1 Millimol) MDDKB in einer Mischung aus 21 ml Pyridin, 21 ml Triäthylamin und 12,6 ml Wasser gegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt um die t-Butoxycarbonylierung durchzuführen. Danach wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 727 mg eines farblosen Pulvers, welches hauptsächlich aus einer Mischung von 2',6'-U-Di-tbutoxycarbonyl-MDDKB (D) und 6^!-I-t-Butoxycarbonyl-MDDKB (E) bestand.

(b) Das in der vorstehend beschriebenen Weise gewonnene farblose Pulver (510 mg), welches hauptsächlich aus einer Mischung der teilweise aminogeschützten Derivate des MDDKB bestand, wurde ohne weitere Reinigung in einer Mischung aus 5 ml Wasser und 5 ml Dirnethoxyäthan gelöst. Zu der entstandenen Lösung wurde eine weitere Lösung von 254 mg (0,84 Millimol) des N-Hydroxysuccinimidesters des U-t-Butoxycarbonyl-L-isoserins in 10 ml Dimethoxyäthan gegeben. Die Mischung wurde 19 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt, um die Acylierung durchzuführen. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, so daß man 794 mg eines festen Rückstandes erhielt, der aus einer Mischung der H-acylierten Derivate der vorstehend genannten Verbindungen (D) und (E) bestand.

(c) Der feste Rückstand wurde mit wässriger 90$iger Trichloressigsäure behandelt, um die t-Butoxyearbonylgruppe zu entfernen. D_anach wurde zur Isolierung eine Säulenchromatographie mit "Amberlite OG- 50" und anschließend zur Reinigung eine Säulenchromatographie an Silikagel in der in Beispiel 2 (b) beschriebenen Weise durchgeführt. Das reine I-U-(L-Isoseryl)-MDDKB wurde in Form eines farblosen Pulvers gewonnen; Ausbeute:

609817/1079

34 mg; Zersetzungspunkt: 162 bis 166⁰C. Beispiel 4

Synthese von 1-N-(l-5-Amino-2-hydroxyvaleryl)-MDDKB (Formel (I); η = 3)

(a) Das farblose Pulver (510 mg), welches hauptsächlich aus einer Mischung der Verbindungen (D) und (E), die gemäß Beispiel 3 (a) erhalten worden war, bestand, wurde ohne weitere Reinigung in einer Mischung aus 5 ml Wasser und 5 ml Dimethoxyäthan gelöst. Zu der entstandenen lösung wurde eine weitere lösung von 278 mg (0,84 Hillimol) des IT-Hydroxysuccinimidesters der L-5-t-Butoxycarbonylamido-2-hydroxyvaleriansäure in 10 ml Dimethoxyäthan gegeben. Die Mischung wurde 18 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt, um die Acylierung durchzuführen. Danach wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, so daß man 834 mg eines festen Γ Rückstandes erhielt, der aus den gemischten N-acylierten Derivaten der vorstehend genannten Ver-= bindungen (D) und (E) bestand.

(b) Das so gewonnene feste Produkt-wurde in 8 ml wässriger 90$iger Trifluoressigsäure gelöst; die Lösung wurde bei Umgebungstemperatur 1 Stunde abgestellt, um die Entfernung der t-Butoxycarbonylgruppe zu erreichen. Das Reaktionsgemisch wurde danach unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und der Rückstand wurde in 60 ml Wasser aufgenommen. Die entstandene wässrige Lösung wurde durch Zugabe von konzentriertem wässrigen Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,4 eingestellt und dann an einer Kolonne (10 χ 560 mm), welche eine 40 ml entsprechende Menge "Amberlite GG 50"-Harz (NH^-Porm) enthielt, adsorbiert. Anschließend wurde die Kolonne nacheinander mit 200 ml Wasser, 250 ml 0,3n wässrigem Ammoniak und 240 ml 0,5n wässrigem Ammoniak gewaschen und anschließend mit O,75n wässrigem Ammoniak eluiert.

6098 17/1079

Das Eluat wurde in 4 ml-Fraktionen aufgefangen und die Fraktionen, die eine hohe antibakterielle Wirkung gegen Bacillus subtilis PCI 219 und Escheriehia coli JR66/W677 aufwiesen, wurden bestimmt, vereinigt (auf ein Volumen von 60 ml), zur Trockne eingeengt und dann über eine Silikagelkolonne in der in Beispiel 1 (c) beschriebenen Weise chromatographiert. Man erhielt auf diese Weise reines 1-3J-(Ir-5-Amino-2-hydroxyvaleryl)-MDDKB in Form eines farblosen Pulvers. Ausbeute: 29 mg. Zersetzungspunkt: 152 bis 155⁰C.

609817/1079

Claims

- 30 MEISSNER & BOLTE

BREMEN

Anmelder; ZAIDAlJ HOJIN

BISEIBITTSU KAGAKU KENKYTJ KAI

No. 14-23, 3-chome, Kami Ohsaki,
Shinagawa-ku, Tokyo/Japan.

PATENTANWÄLTE DIPL.-ING. HANS MEISSNER DIPL.-ING. ERICH BOLTE

D 28 BREMEN, 22.9.1975 Slovogtstraße 21 Bundesrepublik Deutschland Telefon 0421-34 2019 Telegramme: PATMEIS BREMEN

Unser Zeichen

1511

Patentansprüche

1-N-(a-Hydroxy-w-aminoalkanoyl)-6'-N-methyl-3', 4' dideoxykanamycine B der Formel

in welcher η 1,2 oder 3 ist, sowie die pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalze dieser Verbindungen.

609817/1079

Gerichtsstand und Erfüllungsort Bremen. Bremer Bank, Bremen, Nr. 23100 28 · Die Sparkesse In Bremen, Nr. 104 5855 · AIIg. Deutsche Cred.t-Anstalt, Bremen, Nr. 202 598 · Postscheckkonto: Hamburg 33952-202
2.) Verbindungen gemäß Anspruch 1, nämlich 1-N-(3DL-isoseryl)-6'-]J-methyl-3' ,4'-dideoxykanamycin B einschließlich der pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalze derselben.
3.) Verbindungen gemäß Anspruch 1, nämlich i-H-methyl-3¹,4^f-dideoxykanamycin B einschließlich der pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalze derselben.
4.) Verbindungen gemäß Anspruch 1, nämlich 1-N-(Ir-4-amino-2-hydroxybutyryl)-6'-ir-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B einschließlich der pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalze derselben.
5.) Verbindungen gemäß Anspruch 1, nämlich 1-lT-(Ii-5-amino-2-hyäroxyvaleryl)-6^l-N-methyl-3^lf4-^!~^^^eoxy^^al:lamyci°· B ein schließlich der pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalze derselben.
6.) Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man selektiv die 1-Aminogruppe eines aminogeschützten Derivates des 6^l-H-Hethyl-3',4^l-dideoxykanamyein B der allgemeinen Formel

Ip

(IV)

60981 7/1079

in welcher R- eine "bekannte einwertige Aminoschutzgruppe und R₂ ^eia Wasserstoffatom oder eine bekannte einwertige Aminoschutzgruppe darstellen,

mit einer a-Bydroxy-iu-aminocarbonsäure der allgemeinen ]?ormel

R.

Ri

-CH(OH)-COOH

(V)

in welcher R eine bekannte einwertige Aminoschutzgruppe und R^ ein Wasserstoffatom oder R, und R, zusammen eine bekannte zweiwertige Aminoschutzgruppe und η

die Zahl 1, 2 oder 3 bedeuten,

umsetzt, so daß man ein Reaktionsprodukt erhält, welches ein 1-F-acyliertes Derivat der Formel

Jf¹

609817/1079

in welcher R-, Rg > R3» ^ra ^ur1^ ⁿ ^ ie vorstehend angegebene Bedeutung haben,

ist und dann die Aminoschutzgruppe aus dem 1-H-acylierten Derivat wieder entfernt, so daß man das gewünschte 1 -H"-(a-Hydroxy-w-aminoalkanoyl )-6 · -Mi-methyl-3', 4' dideoxykanamycin B der 3?ormel (I) gemäß Anspruch 1 erhält.
7.) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das zu acylierende aminogeschützte Derivat des 6'-N-Methyl-3^f ,^-dideoxykanamycin B aus 2' ,6^f-H-Di-t-butoxycarbonyl-6¹-li-methyl-3^l^'-dideoXykanamycin B und/oder 6 '-N-t-Butoxycarbonyl-e ^I-M"-methyl-3^! ^'-dideoxykanamycin B besteht.
8.) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeümet, daß die a-Bydroxy-w-aminocarbonsäure in lorm ihres IT-Hyäroxysuccinimiäesters verwendet wird.
9.) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sich als weiterer Verfahrensschritt die Isolierung des gewünschten 1-F-(oc-Hydroxy-w-aminoalkanoyl)-6'-!T-methyl-3',4·'-dideoxykanamycin B aus dem nach der Entfernung der Aminosehutzgruppe vorliegenden Reaktionsprodukt durch Chromatographieren anschließt.
10.) Pharmazeutisches Präparat zur Behandlung von Infektionen bei lebenden Eieren und Menschen, bestehend aus einer therapeutisch wirksamen Dosis einer Verbindung der

609817/10 79

Formel (I) gemäß Anspruch 1 oder eines pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalzes derselben in' Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägermaterial.

Für den Anmelder:

Meissner & Bolte Patentanwälte

Bremen, den 22.September 1975

609817/10 7 9