DE2928594A1

DE2928594A1 - Neue verbindungen mit immunopotenzierender wirkung, arzneimittel, dieselben enthaltend, sowie verfahren zur herstellung derselben

Info

Publication number: DE2928594A1
Application number: DE19792928594
Authority: DE
Inventors: Takaaki Aoyagi; Masaaki Hosoi; Masaaki Ishizuka; Ikuo Matsumoto; Hajime Morishima; Tomio Takeuchi; Hamao Umezawa; Takuzo Yamamoto; Junji Yoshizawa
Original assignee: Banyu Phamaceutical Co Ltd
Current assignee: MSD KK
Priority date: 1978-07-17
Filing date: 1979-07-14
Publication date: 1980-02-07
Also published as: FR2431480A1; JPS5513238A; GB2025410A; FR2431480B1; US4335250A; JPS6319499B2; GB2025410B; CA1135277A; IT1165981B; DE2928594C2; IT7909486A0

Description

BREMEN

PATENTANWÄLTE DIPL.-ING. HANS MEISSNER - DIPL.-INC. ERICH BOLTE

Anmelder: BANYU PHARMACEUTICAL CO., LTD. 7-8, 2-chome, Nihonbashi Honcho, Chuo-ku_{b 2800 BREMEN}

Tokyo, Japan sievogtsu.ee21

Bundesrepublik Deutfdiland

Telefon 0421-34 201; Telegramme: PATMEIS BREMEN Telex: 246157 (meibo d)

Hamao UMEZAWA, 23, Toyotama Kita 4-chome,

Nerima-ku, Tokio, Japan j ^Datum 9. JuIi 1979

Tomio TAKEUCHI, 1-11, Higashi Gotanda uns.r zeichen 1511

5-chome, Shinagawa-ku, Tokio, Japan

Takaaki AOYAGI, 3-6, Hon Kugenuma ihrzei*.n 3-chome, Fujisawa-shi, Kanagawa-ken, Japan

Masaaki ISHIZUKA, 3-17, Denenchofu Honcho, Ohta-ku, Tokio, Japan

Hajime MORISHIMA, 25-8, Okusawa 8-chome, Setagaya-ku, Tokio, Japan

Takuzo YAMAMOTO, 1-1-303, Komaba 1-chome,

Meguro-ku, Tokio, Japan

Junji YOSHIZAWA, 2130, Yamazaki-cho,

Machida-shi, Tokio, Japan

Masaaki HOSOI, 1-51, Kajigaya 5-chome,

Takatsu-ku, Kawasaki-shl, Kanagawa-ken, Japan

Ikuo MATSUMOTO, 23-14, Takaido Nishi 1-chome,

Suginami-ku, Tokio, Japan

Neue Verbindungen mit immunopotenzierender Wirkung, Arzneimittel, dieselben enthaltend, sowie Verfahren zur Herstellung derselben

Die Erfindung betrifft neue Verbindungen mit immunopotenzierender Wirkung, Arzneimittel, welche dieselben enthalten, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich zur Verwendung als Immunopotentiatoren zur Erhöhung der immunologischen Reaktionen bei Tieren und Menschen.

Es wurden Untersuchungen an Derivaten einer bekannten

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Eingesandte Modalle werden nadt 2 Monaten, falls nicht zurOdcgefordcrt. vernichtet. Mündliche Abreden, inibeiondere durch Fernsprecher, bedürfen schriftlicher lMtailgung. — Die In Rechnung gestellten Kosten Und mit Recnnungsdotum ohne Abzug fällig. — Bei vergüteter Zahlung werden Bankzinsen berechnet.

Gerichtsstand und Erfüllungsort Bremen. Bremer Bank, Bremen, Nr. 2310028 Die Sparkasse in Bremen, Nr. 104 5855 · Postscheckkonto: Hamburg 33952-202

-Z- 9. Juli 1979

Verbindlang, nämlich Forphenicin, welches der Strukturformel

HOOC-CH - (' \> -CHO

ι
ilH.,

entspricht, durchgeführt.

Forphenicin ist eine bekannte Substanz, die zum ersten Mal aus der Kulturbrühe eines Stammes von Actinomycetes von H. Umezawa et al Isoliert worden ist. Sie ist ein starker Inhibitor der alkalischen Phosphatase und erhöht eine Hypersensivität vom verzögerten Typ; außerdem vergrößert sie die Zahl der antikörperbildenden Zellen (Japan. Patent-Vorveröffentlichung "Kokai" Nr. 116685/75, "Journal of Antibiotics», Bd. 31, Nr. 3, Seiten 244-246 und Bd. 31, Nr. 5, Seiten 483-484 (1978) sowie Bd. 30, Zusatz, S-153 (1977)).

Es ist auch bereits ein brauchbares Derivat des Forphenicins der Strukturformel

HOOC-CH

OH

entdeckt worden. Diese Verbindung ist als Forphenicinol zu bezeichnen. Es hat sich gezeigt, daß auch diese Verbindung eine immunopotenzierende Wirkung aufweist (vergl. japan. Patent-Vorveröffentlichung

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- J - 9. Juli 1979

Nr. 44632/79, veröffentlicht am 9. April 1979 bzw. die dieser entsprechende US-Patentanmeldung Ser. No. 21222).

Im Verlauf weiterer Untersuchungen konnten jetzt verwandte Verbindungen gefunden werden, die der allgemeinen Formel

HO χ ,<HOCH₂'

entsprechen, in welcher R ein Wasserstoffatom oder eine lineare oder verzweigte niedere Alkylgruppe bedeutet. Zur Gruppe der in Betracht gezogenen Verbindungen gehören auch die Salze und Hydrate derselben. Diese Verbindungen besitzen, wie festgestellt werden konnte, eine immunopotenzierende Wirkung, so daö sie als Immunopotentiatoren zur Vergrößerung der Immunreaktionen bei lebenden Tieren und Menschen brauchbar sind.

Aufgabe der Erfindung ist infolgedessen die Bereitstellung neuer Verbindungen mit immunopotenzierender Wirkung, von Arzneimitteln, welche diese Verbindungen enthalten, sowie von geeigneten Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen.

Diese Aufgabe wird in erster Linie durch die Bereitstellung neuer Verbindungen der allgemeinen Formel

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einschließlich der pharmazeutisch akzeptablen Salze, Hydrate und Hydratsalze derselben gelöst; in der vorstehenden Formel bedeutet R ein Wasserstoffatom oder eine lineare oder verzweigte niedere Alkylgruppe, z.B. Methyl, Äthyl oder Propyl. Der Ausdruck "niedere Alkylgruppe" bedeutet im vorliegenden Zusammenhang eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.

Typische Beispiele für Verbindungen der Formel I sind 3-Hydroxy-4-(hydroxymethyl)-benzoesäure (R = Wasserstoff), Methyl-3-hydroxy-4-(hydroxymethyl)-benzoat (R ■ Methyl) und Äthyl-3-hydroxy-4-(hydroxymethyl)-benzoat (R · Äthyl).

Zu den pharmazeutisch akzeptablen Salzen der Verbindüngen I gehören die Alkalimetallsalze wie Natrium- und Kaliumsalze, die Erdalkalimetallsalze wie Calcium- und Magnesiumsalze sowie die Salze mit organischen Aminen wie Trialkylamin, Dicyclohexylamin u.a..

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I, welches dadurch gekeniizelehnet 1st, daß man selektiv eine Verbindung der allgemeinen Formel

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g - 9. Juli 1979

(ID

reduziert; in der Formel II bedeutet R eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe und R stellt ein Wasserstoffatom oder eine lineare oder verzweigte niedere Alkylgruppe dar, so daß die Carbonsäureestergruppe neben der Hydroxylgruppe (vergl. die Formel II) in eine Hydroxymethylgruppe umgewandelt wird.

Beispiele für die Ausgangsverbindung II sind Dimethylhydroxyterephthalat und Diäthylhydroxyterephthalat.

Die Reduktion kann unter geeigneten Reaktionsbedingungen durchgeführt werden, wobei als Reduktionsmittel ein Metallhydridkomplex, beispielsweise Natriumborhydrid, Natriumdihydro-bis-(2-methoxy-äthoxy)-aluminat oder Lithiumaluminiumhydrid verwendet wird.

In einer typischen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Reduktion bei Umgebungstemperatur oder bei erhöhter Temperatur in einem inerten Lösungsmittel, vorzugsweise einem niederen Alkanol wie Methanol oder Äthanol, durchgeführt, und zwar unter Verwendung von Natriumborhydrid als Reduktionsmittel. Verwendet man Natriumdihydro-bis-(2-methoxyäthoxy)-aluminat als Reduktionsmittel, so kann die Reaktion bei Umgebungstemperatur oder bei niedrigerer Temperatur in einem organischen Lösungsmittel, welches unter den Reaktionsbedingungen inert

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■ . 3

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ist, beispielsweise Benzol oder Toluol, durchgeführt werden. Bei Verwendung von Lithiumaluminiumhydrid führt man die Reduktion vorzugsweise unter Eiskühlung in einem für das Reduktionsmittel inerten Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran oder Äthyläther durch.

Die Menge des Reduktionsmittels ist Je nach Art desselben variabel; sie hängt auch von der angewandten Reaktionstemperatur und von der Art des benutzten Lösungsmittels ab. Die geeignete Menge eines bestimmten Reduktionsmittels kann durch einfache Routineversuche ermittelt werden. Ganz allgemein kann jedoch gesagt werden, daß beispielsweise Natriumborhydrid in der etwa ein- bis zehnmolaren Menge, vorzugsweise etwa fünf- bis zehnmolaren Menge, bezogen auf die Ausgangsverbindung II, verwendet werden kann; Natriumdihydrobis-(2-methoxyäthoxy)-aluminat und Lithiumaluminiumhydrid können in etwa ein- bis zweimolarem Verhältnis, bezogen auf die Ausgangsverbindung II, eingesetzt werden. Auf diese Weise wird die Carbonsäureestergruppe neben der Hydroxylgruppe in der Verbindung II bevorzugt In eine Hydroxymethylgruppe umgewandelt.

Die Verbindung der Formel I, in welcher R ein Wasser st off atom ist, nämlich 3-Hydroxy-4-(hydroxymethyl)~ benzoesäure kann hergestellt werden, indem man die Ausgangsverbindung II mit einem Metallhydridkomplex, in welchem R ein Wasserstoffatom ist, in der vorstehend beschriebenen Weise reduziert oder indem man alternativ eine selektive Reduktion der Ausgangsverbindung der Formel II mit einem Metallhydridkomplex durchführt, in welchem sowohl R als auch R lineare oder verzweigte niedere Alkylgruppen darstellen, so daß bevorzugt die Carbonsäure-

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estergruppe neben der Hydroxylgruppe in eine Hydroxymethylgruppe umgewandelt wird, worauf sich eine Hydrolyse der verbleibenden Estergruppe in eine Carboxylgruppe anschließt. Die Hydrolyse kann in üblicher Weise durchgeführt werden, beispielsweise mit Hilfe einer Methode unter Verwendung eines Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxyds wie Natrium- oder Bariumhydroxid in einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel wie Methanol bei Umgebungstemperatur oder erhöhter Temperatur.

Alternativ kann die Verbindung der allgemeinen Formel I, in welcher R eine lineare oder verzweigte niedere Alkylgruppe ist, auch durch Veresterung der entsprechenden Carbonsäure der Formel

HO

HOCH₂ - - ·>-

hergestellt werden. Die Veresterung kann mit einem Alkenol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in üblicher, dem Fachmann bekannten Weise durchgeführt werden.

Wie bereits festgestellt, weisen die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I einschließlich der pharmazeutisch Akzeptablen Salze und Hydrate derselben immunopotenzierende Wirkung auf. Man erkennt deutlich aus den Testergebnissen, die in den folgenden Beispielen aufgeführt sind, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen einen starken inhibierenden Effekt auf das Wachstum verschiedener transplantierbarer Tumo-

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ren bei Tieren haben. Da die Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung keine Cytotoxizität aufweisen, kann angenommen werden, daß die inhibierende Wirkung der Verbindungen auf das Tumorwachstum auf eine Aktivierung der Abwehrmechanismen in den Patienten zurückzuführen ist.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen einen LDeq-Wert von mehr als 500 mg/kg bei intraperitonealer Injektion bei Mäusen auf.

Es hat sich also gezeigt, daß die Verbindungen für die Immunotherapie und Chemotherapie von Krebserkrankungen, zur Verbesserung der mangelhaften Immunreaktionen bei von Tumoren befallenen Patienten und zur Unterdrückung der Bildung von Metastasen bei Krebserkrankungen geeignet sind. Weiterhin lassen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen in wirksamer Weise zur Behandlung von Krankheiten und Mangelzuständen, die auf einer Immunodefizlenz beruhen, einsetzen, beispielsweise bei rheumatoiden Erkrankungen, multipler Sklerose, Kollagenerkrankungen und systemischem Lupus erythematodes.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in geeigneten Formen lebenden Tieren und Menschen oral oder parenteral verabreicht werden; hierfür eignen sich auch die pharmazeutisch akzeptablen Salze oder Hydrate der Verbindungen der Formel I.

Zum Gegenstand der Erfindung gehören infolgedessen auch Arzneimittel, die als Immunopotentiatoren und Antitumormittel verwendbar sind und die aus einer Verbindung der allgemeinen Formel I oder einem pharmazeutisch akzeptablen Salz oder Hydrat oder Hydrat-

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salz derselben als aktivem Bestandteil in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägermaterial oder Streckmittel bestehen. Das Arzneimittel kann den aktiven Bestandteil in einer Konzentration zwischen 1 und 90 Gewichtsprozent enthalten.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können in Formen für die orale oder parenterale Verabreichung gebracht werden. In Form von injizierbaren Lösungen können die Arzneimittel 0,1 bis 10 Gewichtsprozent an aktivem Bestandteil enthalten sowie einen oder mehrere pH-Regulatoren, Puffermittel, Stabilisatoren, Streckmittel, lokal wirkende Anästhetika sowie weitere Zusätze, die die Lösungen isotonisch machen. Injizierbare Lösungen können für die subkutane, die intramuskuläre und die intravenöse Injektion hergestellt werden. Gegebenenfalls können die Lösungen in üblicher Weise lyophilisiert werden.

Feste Arzneimittel für die orale Verabreichung können in Form von Tabletten, überzogenen Tabletten, Körnchen, Pulvern und Kapseln vorliegen; sie können Streckmittel für das aktive Material sowie weiterhin, falls erforderlich Bindemittel, den Zerfall beschleunigende Mittel, Gleitmittel, Farbstoffe, Süßstoffe und Aromastoffe enthalten.

Flüssige Arzneimittel für die orale Verabreichung können in Form von Syrupen oder Trockensyrupen vorliegen; auch diese können Süßstoffe, Puffermittel, Stabilisatoren, Aromastoffe u. ä. enthalten.

Suppositorien können, falls erforderlich, neben den aktiven Bestandteilen und den übrigen Zusätzen auch oberflächenaktive Mittel enthalten.

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Die Dosierung der Verbindungen I hängt natürlich in erster Linie von dem zu behandelnden Fall ab. Bei Menschen liegt die Dosis im allgemeinen bei 0,02 bis 200 mg, die als tägliche Einzeldosis oder in zwei oder mehr Teildosen über den Tag verteilt verabreicht werden kann.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung von Methyl-3-hydroxy-4-(hvdroxymethvl)-benzoat

580 mg Dimethylhydroxyterephthalat wurden in 30 ml absolutem Methanol gelöst; die Lösung wurde langsam mit 2,5 g Natriumborhydrid versetzt. Nach Beendigung der Zugabe wurde die Mischung eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt, anschließend unter Eiskühlung mit 6n Chlorwasserstoffsäure auf pH 1,95 eingestellt und dann mit Butanol extrahiert. Der Extrakt wurde eingedampft, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde in Benzol aufgenommen und die Lösung wurde über eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 100 ml entsprechende Menge an Silikagel

Cn)

enthielt (Kieselgel 60 ^K&J ), welches zuvor in Benzol suspendiert worden war. Die Kolonne wurde mit 1000 ml einer Mischung aus Benzol undÄthylacetat (VoIu_menverhältnis 9*1) gewaschen und mit 150 ml einer Mischung aus Benzol und Äthylacetat (Volumenverhältnis 4:1) eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 15 g aufgefangen und die Fraktionen Nr. 41 bis 85, die die gewünschte Verbindung enthielten, wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt. Man er-

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hielt auf diese Weise 418 mg (83 %) des gewünschten Produktes. Durch Umkristallisieren aus einer Mischung aus Benzol, Methanol und Äthyläther konnten 320 mg der Titelverbindung in Form farbloser Kristalle mit

einem Schmelzpunkt von 104,5 - 105 den.

Infrarotabsorptionsspektrum: C gewonnen wer-

ν ^KBr ( cm"¹) max

: 3430, 3200, 2920, 1708, 1695, 1612,

1590, 1517, 1440, 1420, 1370, 1360,

1310, 1295, 1280, 1255, 1235, 1220,

1190, 1178, 1110, 1095, 1030, 978,

950, 923, 880, 872, 840, 805,

790, 756

Kernmagnetisches Resonanzspektrum bzw. NMR-Spektrum (60 HHz, in Deutero-methanol):

S : 3,88 (3H. S); 4,72 (2H. S); 7,3-7,7 (3H) ppm

Beispiel 2

Herstellung von 3-Hydroxy-4-(hydroxymethyl)-benzoesäure

316 mg 3-Hydroxy-4-(hydroxymethyl)-benzoat, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden in 1 ml Methanol gelöst; die Lösung wurc|e mit 5 ml 1n wässrigem Natriumhydroxid versetzt. Die Mischung ließ man bei Raumtemperatur 1,5 Stunden stehen, damit die Verseifung ablaufen konnte. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch mit Wasser verdünnt, mit 5 ml 1n Chlorwasserstoffsäure vermischt und mit Äthylacetat

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extrahiert. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingedampft; nach Entfernung des Lösungsmittels lagen 272 mg (93 %) des gewünschten Produktes vor. Durch Umkristallisieren aus einer Mischung aus Benzol und Äthanol erhielt man 154 mg der Titelverbindung in Form von farblosen Kristallen.
F.: 173,5 - 174,5° C (unter Zersetzung).

I0R0-Spektrums
i>X-^Br (cm"¹) : 3390, 3080, 2960, 2880, 2800, 2700 —

IUaX

2150, 1660, 1615, 1588, 1520» 1425,

1395, 1365, 1303, 1248, 1195, 1125, 1098, 1033, 982, 940, 888, 850,

793_S 770, 760,

N.M.R.-Spektrum (60 MHz, in Deutero-dioxan + Deuterowasser )

Beispiel 5 Herstellung von 3-Hydroxy-4-(hydroxymethyl)-benzoat

Die vorstehend angegebene Verbindung wurde in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise aus Diäthylhydroxyterephthalat hergestellt. ' F.: 92 - 94° C. .

Gewichtsanalyse für ^cio^Hi2°4^:

Berechnet: C 61,21; H 6,17 % Gefunden: C 61,14; H 6,24 %

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Ultraviolettabsorptionsspektrum:

λ ^E*^0H (NM) : 213 ( ^ε 25000), 245 (ε IOOOO), 300(e 3500)

IB ei X

I.R.-Spektrum:
"¹

(cm"¹) : 3430, 3140, 1675, 1585, 1420, 1290, 1235, 1090, 1035, 1010, 985, 945-,

890, 825, 765

N.M.R.-Spektrum (60 MHz, in Deutero-dimethylsulfoxid ) δ ^iUb : 1,30 (3H, t)i 4,26 (2H, q), 4,55 (2H, s), 5,10 (IH, s), 7,44 (3H, s), 9,70 (IH, s)

Beispiel 4

10 g einer Verbindung der Formel I wurden in destilliertem Wasser gelöst, so daß 1000 ml der fertigen Lösung vorlagen, die dann in üblicher Weise sterilisiert wurden. Die sterilisierte Lösung wurde in 2 ml-Portionen in Ampullen abgefüllt und lyophilisiert. Das so gewonnene Präparat wurde vor der Verwendung als injizierbares Arzneimittel mit destilliertem Wasser verdünnt.

Beispiel 5

Ein Teil einer Verbindung der Formel I, 200 Teile Lactose und 40 Teile Maisstärke wurden zusammengemischt und unter Zugabe von Äthanol granuliert, getrocknet und gesiebt. Das so erhaltene Granulat wurde mit 0,5 % Magnesiumstearat als Gleitmittel ver- mischt. Die Mischung wurde zu Tabletten gepreßt, von denen jede ein Gewicht von 3,6 mg aufwies.

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ORIGINAL INSPECTED

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Ein Teil einer Verbindung der Formel I wurde sorgfältig mit 900 Teilen Lactose vermischt. Die Mischung wurde durch ein Prüfsieb mit 50 Maschen gesiebt, so daß ein gleichmäßiges Pulver vorlag.

Die folgenden Beispiele 7 bis 10 erläutern die immunopotenzierenden Eigenschaften von 3-Hydroxy-4-(hydroxymethyl)-benzoesäure (imfolgenden als BF-127 bezeichnet), welche als typischer Vertreter der Verbindungen der Formel I gemäß vorliegender Erfindung angesehen werden kann.

Beispiel 7

Die Wirkung von BF-127 auf die zellulare Immunität (zellenvermittelte Immunität) wurde nach der bekannten DHT-Technik (Hypersensitivität vom verzögerten Typ) bestimmt (vergl. P.H. Lagragne, G.B. Mackaness und T.E. Mille, "J. Exp. Med.", 139, 1529-1539 (1974)), und zwar unter Verwendung von Mäusen, die mit roten Blutkörperzellen von Schafen als Antigen immunisiert worden waren.

10 rote Blutkörperzellen von Schafen (SRBC), suspendiert in 0,05 ml physiologischer Salzlösung, wurden subkutan zum Zeitpunkt der Immunisierung in den rechten Hinterfußballen jeder zum Versuch gehörenden ICR-Maus (weibliche Mäuse, 6 Wochen alt) injiziert, um eine verzögerte Hypersensitivität auszubilden. Gleichzeitig mit der Immunisierung wurden unterschiedliche Dosen von BF-127 jeder Testmaus dntraperitoneal injiziert. Vier Tage später wurden 10 rote Blutkörperzellen von Schafen subkutan in den linken Hinterfußballen jeder Testmaus injiziert, um die DTH-Reaktion auszulösen. 24 Stunden nach der Auslösungsinjektion

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wurde die Dicke des linken Hinterfußballens mit einer Lehre gemessen, um den Umfang des in dem Fußballen ausgebildeten Ödems festzustellen. Das Ausmaß der Schwellung diente zur Bestimmung der jeweiligen zellularen Immunität. Die gewonnenen Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt. In der Tabelle ist das Ausmaß der Schwellung in Werten ausgedrückt, die nach folgender Gleichung berechnet wurden:

Dicke des Fußballens einer mit

BF-127 behandelten Maus
χ 100

Dicke des Fußballens einer unbehandelten Maus

	Tabelle 1	Grad der
BF-127-Dosis	Zunahme der Dicke	Schwellung
	des Fußballens
	(x 0,1 mm)	-
0 (Kontrolle)	8,3 + 1,0	158
1 mg/Haus	13,1 + 0,4	189
100 yug/Maus	15,7 + 0,3	187
10 /ug/Maus	15,5 + 1,3	234
1 /ug/Maus	19,4 + 1,8	172
0,1 yug/Maus	14,3 + 1,1

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die Verabreichung von BF-127 in einer Dosis von 1 mg bis 0,1 /ug/Maus die DTH-Reaktion um 58 bis 134 %, verglichen mit dem Kontrollversuch, potenziert; das beweist, daß die BF-127 einen intensiven potenzierenden Effekt auf die Ausbildung einer Zellularimmunitat hat.

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Eine solche potenzierende Wirkung konnte in gleicher Weise bei oraler Verabreichung wie auch bei intravenöser oder subkutaner Injektion von BF-127 beobachtet werden. Zum Vergleich sind daher die Versuchsergebnisse, die in der gleichen Weise wie vorstehend beschrieben, nur mit der einzigen Ausnahme, daß BF-127 oral zugeführt wurde, durchgeführt wurden, in Tabelle 2 zusammengestellt.

	Tabelle 2	der Schwellung
BF-127-Dosis	Ausmaß	133 148 146
1 mg/Maus 100 /ug/Maus 10 /Ug/Maus

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die DTH-Reaktion bei oraler Verabreichung von BF-127 in Dosen von 1 mg bis 10 /ugZMaus um 30 bis 50 % erhöht wird.

Beispiel 8

In diesem Beispiel wird gezeigt, daß die immunopotenzierende Wirkung von BF-127 auch an anderen Mäusestammen bei Mäusen unterschiedlichen Alters auftritt.

Das gleiche Testverfahren wie in Beispiel 7 beschrieben, wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß männliche CDF₁ (DBAZ^xBALBZCF,, ) - Mäuse (9 Wochen alt) verwendet wurden, denen unterschiedliche Dosen an BF-127 intraperitoneal injiziert oder oral verabreicht wurden. Die Ergebnisse der Versuche sind in Tabelle 3 zusammengestellt; die das Ausmaß der Schwellung betreffenden Werte haben dieselbe Bedeutung wie in Beispiel 7.

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	ao	Ausmaß der	2928594
	-Yl -	IP-Injektion
	Tabelle 3	125	9. Juli 1979
	133
BF-127-Dosis	131	Schwellung (%)
	129	orale Verabrei chung
1 mg/Maus	119	138
5 100 /Ug/Maus		142
10 /ug/Maus	122
1 /ug/Maus	115
0,1 /ug/Maus	103
Beispiel 9

Dieses Beispiel erläutert die Wirkung von BF-127 auf transplantierbare tierische Tumoren.

ΙΟ·' Gardner Lymphoma-Zellen wurden subkutan jeder zur Versuchsreihe gehörenden C3H/He-Maus (weiblich, 10 Wochen alt, 5 Mäuse pro Gruppe) in die Leiste eingepflanzt. 7 Tage nach der Transplantation wurden unterschiedliche Dosen BF-127 jeder zur Versuchsreihe gehörenden Maus einmal pro Tag an fünf aufeinanderfolgenden Tagen intrperitoneal injiziert. 30 Tage nach der Transplantation wurden die ausgebildeten Tumoren entfernt und gewogen, um die inhibierende Wirkung von BF-127 auf das Tumorwachstum an Hand des durchschnittlichen Gewichtes der in fünf Mäusen ausgebildeten Tumoren zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 zusammengestellt. Zu vergleichszwecken sind auch die Ergebnisse mit aufgenommen, die mit Bleomycin (einem,Antitumor-Antibiotikum, welches von der japanischen Firma Nihon Kayaku K.K. hergestellt wird) anstelle von BF-127 erhalten worden sind.

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	- W -	9. Juli 1979
	Tabelle 4
BF-127-Dosis	durchschnittl.	Inhibierung
	Gewicht der	00 - . ■
	Tumoren (mg)
O (unbehandelt)	1310	- —
10 mg/Maus	570	56,5
1 /ug/Maus	930	29,0 .
0,1 /ug/Maus	950	27,5
Bleomycin
100 /ug/Maus	760	42,0
(Kontrolle)

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die Verabreichung von BF-127 in einer Dosis von 10 /ug/Maus das Wachstum von Tumoren weit stärker inhibieren kann als Bleomycin.

Beispiel 10

In diesem Beispiel wird die inhibierende Wirkung von BF-127 auf IMC-Karzinom gezeigt. IMC-Karzinom ist von der Microbial Chemistry Research Foundation, Tokio, Japan erhältlich; es handelt sich dabei um eine Art von Ascites hervorrufenden Tumoren, welche spontan in CDF₁-Mäusen entstanden waren und die anschließend in demselben Mäusestamm sukzessiv transplant!ert worden sind. Pathologische Untersuchungen haben gezeigt, daß es sich bei den vorstehend genannten Tumoren um eine Art von undifferenzierten Epithelialtumoren handelt.

5 χ 10 IMC-Tumorzellen wurden hypodermal in den Leistenbereich jeder zur Versuchsreihe gehörigen CDF₁-Maus (weiblich, 14 Wochen alt, 5 Mäuse pro Gruppe) transplantiert. 8 Tage nach der Transplantation wurden unterschiedliche Dosen an BF-127 jeder zur Versuchs-

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'Vd-

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reihe gehörenden Maus einmal pro Tag an fünf aufeinander folgenden Tagen intrperitoneal injiziert. 30 Tage nach der Transplantation wurden die gebildeten Tumoren entfernt und gewogen, um das Ausmaß der inhibierenden Wirkung von BF-127 auf das Tumorwachstum aus dem Durchschnittsgewicht der in 5 Mäusen gebildeten Tumoren zu bestimmen.

Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle 5A zusammengestellt. Zu Vergleichszwecken sind auch die Ergebnisse festgehalten worden, die mit bekannten Antitumormitteln, nämlich Mytomycin (MMC) und Bleomycin (BLM) anstelle von BF-127 erhalten worden sind.

Weitere Versuche wurden in derselben Weise wie vorstehend beschrieben durchgeführt; es wurden 1 χ 10 IMC-Tumorzellen eingeimpft und anschließend BF-127 intraperitoneal injiziert(IP) oder oral verabreicht (PO). Die Ergebnisse sind in Tabelle 5B zusammengestellt.

Tabelle 5A

BF-127-Dosis	durchschnittl.	Inhibierung
	Gewicht der	(#)
	Tumoren (mp)
0 (unbehandelt)	12380	-
100 /Ug/Maus	7970	35,6
10 /Ug/Maus	6190	50,0
1 /Ug/Maus	5740	53,6
BLM 100 /ug/Maus (Kontrolle)	5770	53,4
MMC 20 /Uff/Maus	5510	55.5

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- 20 - 9. Juli 1979

Tabelle 5B

BF-127-Dosis durchschnittl. Inhibierung

Gewicht der (%) Tumoren (mg)

O (unbehandelt) 5635

10 /ug/Maus (IP) 1312 76,8

1 /ug/Maus (IP) 2206 60,8

10 /ug/Maus (PO) 2638 53,0 ". ""

1 /ug/Maus (PO) 2538 55,0

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Claims

- £T - 9. Juli 1979 Patentansprüche

1.) Verbindungen der allgemeinen Formel χ

^₂R (I)

HOCH₂/^^

in welcher R ein Wasserstoffatom oder eine lineare oder verzweigte niedere Alkylgruppe darstellt, einschließlich der pharmazeutisch akzeptablen Salze, Hydrate und Hydratsalze derselben.

2.) Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der Formel I R ein Wasserstoffatom ist.

3.) Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der Formel I R eine Methylgruppe ist.

4.) Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der Formel I R eine Äthylgruppe ist.

5.) Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Ester der allgemeinen,, Formel II

(II)

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INSPECTED

- 22 - 9. Juli 1979 in welcher R eine lineare oder verzweigte Alkylgrup-

pe und R ein Wasserstoffatom oder eine lineare oder verzweigte niedere Alkylgruppe bedeuten, reduziert und anschließend gegebenenfalls das entstandene Reaktionsprodukt hydrolysiert, um die verbliebene Carbonsäureestergruppe in eine Carboxylgruppe umzuwandeln.

6.) Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion unter Verwendung von Natriumborhydrid in einem niederen Alkohol durchgeführt wird.

7.) Verfahren zur Herstellung von Verbindungen gemäß Anspruch 1, entsprechend der allgemeinen Formel

CO₂R

HOCH₂

in welcher R eine lineare oder verzweigte niedere Alkylgruppe bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man 3-Hydroxy-4-(hydroxymethyl)-bezoesäure mit einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen verestert.

8.) Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung der Formel I gemäß Anspruch 1 oder ein'pharmazeutisch akzeptables Salz oder Hydrat oder Hydratsalz einer solchen Verbindung als aktiven Bestandteil in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägermaterial oder Streckmittel.

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9.) Verwendung der Arzneimittel gemäß Anspruch 8 als Inununopotentiatoren und Antitumormittel für lebende Tiere und Menschen.

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