JP2571908B2 - 高分子量ヒアルロン酸ナトリウムの製造に用いる連鎖球菌及びその選択方法 - Google Patents

高分子量ヒアルロン酸ナトリウムの製造に用いる連鎖球菌及びその選択方法

Info

Publication number
JP2571908B2
JP2571908B2 JP6141201A JP14120194A JP2571908B2 JP 2571908 B2 JP2571908 B2 JP 2571908B2 JP 6141201 A JP6141201 A JP 6141201A JP 14120194 A JP14120194 A JP 14120194A JP 2571908 B2 JP2571908 B2 JP 2571908B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sodium hyaluronate
hyaluronic acid
medium
microorganism
molecular weight
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP6141201A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH0787962A (ja
Inventor
アブラハム・ニムロツド
ベンジヤミン・グリーンマン
ドヴ・カンナー
モシユ・ランズバーグ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BAIO TEKUNOROJII JENERARU CORP
Original Assignee
BAIO TEKUNOROJII JENERARU CORP
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US06/692,692 external-priority patent/US4784990A/en
Application filed by BAIO TEKUNOROJII JENERARU CORP filed Critical BAIO TEKUNOROJII JENERARU CORP
Publication of JPH0787962A publication Critical patent/JPH0787962A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2571908B2 publication Critical patent/JP2571908B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/73—Polysaccharides
    • A61K8/735—Mucopolysaccharides, e.g. hyaluronic acid; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/74—Biological properties of particular ingredients
    • A61K2800/75—Anti-irritant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/803—Physical recovery methods, e.g. chromatography, grinding
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/818—Aeration or oxygen transfer technique
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/885—Streptococcus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、微生物の大規模発酵に
よる高分子量ヒアルロン酸のナトリウム塩の製造に用い
るための連鎖球菌(Streptococcus) 属の微生物及びその
選択方法に係る。
【０００２】
【従来の技術及び発明の解決しようとする課題】ヒアル
ロン酸は、 50000〜13000000ドルトンの分子量の線状高
分子から構成される天然に存在するグリコサミノグリカ
ンである。ヒアルロン酸は、交互に1-3及び1-4 の結合
により結合されたグルクロン酸及びN-アセチルグルコサ
ミンの繰り返し単位から形成される多糖である。
【０００３】ヒアルロン酸は、皮膚や軟骨のような動物
の種々の結合組織中に存在している。臍帯、滑液、硝子
体液及びニワトリのトサカのような特定の器官は、ヒア
ルロン酸を特に多量に含有している。更に、ヒアルロン
酸はA 型及びC 型連鎖球菌のような種々の微生物により
産生される。
【０００４】皮膚及び軟骨中におけるヒアルロン酸の役
割は、水分を結合させ、組織の張度及び弾性を保持する
ことにある。関節液中において粘性のヒアルロン酸溶液
は、細胞に保護環境を与える潤滑剤として機能する。ニ
ワトリのトサカから抽出した超純粋ヒアルロン酸溶液
は、例えばE.A. Balazs 名義の米国特許第4141973 号
（1979年）に開示されているように、数年来眼科手術用
の支持媒体として使用されている。同様の製剤が競争馬
の膝関節炎症の治療に有効であるとして報告されてい
る。ヒアルロン酸の別の用途はその親水性の高さを利用
するものであり、例えばE. Balazs 名義の米国特許第43
03676 号（1981年）に開示されているように、化粧品用
としてモイスチャーローションの理想的な成分を構成す
る。
【０００５】ヒアルロン酸は、上述のように微生物培養
液を含む各種の生物ソースから単離されている。ヒアル
ロン酸の単離及び特徴付けについては、Meyer 他, J.Bi
ol.Chem. 107, 629(1934) 、J. Biol. Chem. 114,689
(1936)に記載されており、最近ではMethods in Enzymo
l. 28,73(1972) 中で考察されている。ヒアルロン酸の
構造は、Weissman他, J.Am. Chem. Soc. 76 , 1753(195
4)及びMeyer, Fed. Proc. 17, 1075(1958)により解明さ
れている。
【０００６】連鎖球菌によるヒアルロン酸の製造は、Fo
rrest 他, J. Biol. Chem. 118, 61(1937)により最初に
示され、その後、多くの研究者によってはさらに研究さ
れており、例えばRoseman 他, J. Biol. Chem. 203,213
(1953)、Pierce and White,Proc. Soc. Exp. Biol. Me
d. 87 , 50(1954)、G.H. Warren の米国特許第2975104
号(1961)及びSunghara他, J. Biol. Chem. 254,6252(19
79) が、動物及び微生物ソースに由来するヒアルロン酸
を示している。A 型連鎖球菌のバッチ式発酵及びヒアル
ロン酸の単離に関する小規模から中規模の方法について
は、Thonard 他, J. Biol. Chem. 239, 726(1964) 、Ho
lmstrom and Ricica, Appl. Microbio.15,1409(1967)
、Kjems and Lebech, Acta Path. Microbiol. Scand.
84 , 162(1976) 中に発表されている。これらの方法に
は病原性細菌の嫌気的発酵が含まれており、700000以下
の分子量のヒアルロン酸が 0.4〜1 g/l の収率で製造さ
れている。
【０００７】別の方法としては、1983年4 月4 日付で公
開された発明者Akasaka H 他による日本特許公開第58-0
56692 号に開示されているように、ヒアルロン酸を製造
するために連鎖球菌の好気的発酵を使用する方法があ
る。その他の刊行物として、E.A. Balazs 名義の1979年
2 月27日付米国特許第4141973 号は、動物結合組織のよ
うなソースからヒアルロン酸を製造及び精製する方法に
ついて記載している。しかしながら、従来技術中に開示
されているヒアルロン酸の製造及び精製方法では、 2.0
×106 ドルトンを越える平均分子量のヒアルロン酸を製
造することができない。これは主に、ヒアルロン酸が剪
断により分解し易いことあるいはヒアルロン酸組成中に
存在している不純物又は金属イオンによる触媒反応で酸
化し易いという事実に起因している。
【０００８】
【課題解決のための手段】本発明は微生物を用いること
により、嫌気的発酵の場合約2 g/l 、好気的発酵の場合
約 4〜6 g/l の収率で約1 ×106 〜約 4.0×106 ドルト
ンの分子量のヒアルロン酸を製造することができる。こ
の新規な微生物は、ヒアルロン酸の高度な産生菌であり
且つ溶血素マイナス即ち病原性の殆どないC 型Streptoc
occus zooepidemicus, HA-116, ATCC39920 の突然変異
株である。
【０００９】S. zooepidemicus, HA-116, ATCC39920 の
好気的発酵及びそれに続くヒアルロン酸塩の精製の結
果、 3.5×106 ドルトンを越える平均分子量を有するヒ
アルロン酸ナトリウムのバッチが得られた。本発明の微
生物は、このような高分子量のヒアルロン酸ナトリウム
を製造し得る最初の微生物である。
【００１０】本発明の微生物を用いた発酵法でヒアルロ
ン酸を得、得られたヒアルロン酸を精製することによ
り、非発熱性及び非刺激性のヒアルロン酸が得られる。
本発明の細菌からは、臨床用に好適な超純粋非炎症性ヒ
アルロン酸を製造することができる。
【００１１】本発明は、Streptococcus zooepidemicus
種, HA-116, ATCC39920 の微生物、及び該微生物に由来
し、発酵によりヒアルロン酸ナトリウムを産生して周囲
培地中にこれを分泌することの可能な突然変異体に係
る。
【００１２】本発明はまた、大量のヒアルロン酸を産生
し且つ溶血活性をもたない微生物を選択するための方法
に係る。該方法は、突然変異体を形成するべくヒアルロ
ン酸産生微生物を好適な突然変異誘発物質で処理する段
階と、好適な固形培地上で突然変異体を増殖させる段階
とを含んでいる。ムコイドコロニーを同定し、回収す
る。回収したコロニーを血液寒天培地上で増殖させ、ヘ
モグロビンを溶解させないコロニーを選択する。
【００１３】本発明の微生物の増殖に好適な培地は、炭
素源として約 0.2〜10g/l の実質的に一定濃度の糖成分
を含んでおり、約 6.5〜7.5 の範囲の実質的に一定のpH
を有しており、更に0.05g/l を越える実質的に一定のマ
グネシウムイオン濃度を有している。本発明の微生物は
ヒアルロン酸ナトリウムを産生し、培地中にこれを分泌
する。ヒアルロン酸ナトリウムはその後、培地から回収
される。
【００１４】ヒアルロン酸ナトリウムは、微生物及び培
地中の不溶性の他の物質を除去するべく微生物を含んで
いる培地を処理する段階と、例えば有機溶媒により培地
からヒアルロン酸ナトリウムを沈降させる段階と、沈降
物を回収する段階とから成る方法により培地から回収さ
れる。次に沈降物は粉砕及び乾燥され得る。以上の方法
により、発熱性及び炎症性のないことを特徴とするヒア
ルロン酸ナトリウム組成物を製造することができる。
【００１５】以下、本発明の微生物を選択する方法及び
本発明の微生物を用いてヒアルロン酸ナトリウムを製造
する方法について具体的に説明する。
【００１６】本発明の微生物を選択するにあたっては、
ヒアルロン酸を産生する任意の連鎖球菌種を使用するこ
とができ、例えばS. zooepi -demicus、S. equisimilis
又はS. pyogenes を使用することができる。好適な種は
S. zooepidemicusであり、その菌株としては、大量のヒ
アルロン酸を産生する微生物を獲得するために下記の方
法に従って製造される突然変異株であるS. zooepidemic
us HA-116 ATCC39920が挙げられる。
【００１７】該微生物は、大量のヒアルロン酸ナトリウ
ムを産生し且つ溶血活性をもたない微生物を選択する方
法により得られる。該方法は、連鎖球菌属の微生物のよ
うなヒアルロン酸産生微生物を、例えばニトロソグアニ
ジンのような生物の突然変異体を産生することの可能な
好適な突然変異誘発物質と接触させることから成る。例
えばTodd-Hewit寒天培地のような好適な固形培地上で突
然変異体を増殖させ、ムコイドコロニーを同定する。こ
れらのコロニーを固形培地から回収し、血液寒天培地上
で増殖させる。次にヘモグロビンを溶解させないコロニ
ーを選択し、本発明の方法に従ってヒアルロン酸を製造
するために使用する。
【００１８】本発明の微生物、即ち連鎖球菌属の微生
物、 例えばS. zooepidemicus又はS. equisimilisからは
高分子量のヒアルロン酸ナトリウムが得られる。該方法
は、好適な条件下で好適な栄養培地中で本発明の連鎖球
菌属の微生物を強い撹拌下に増殖させる段階を含んでい
る。培地は、炭素源として約 0.2〜10g/l の実質的に一
定濃度の糖成分で含んでおり、約0.05g/l を越える実質
的に一定のマグネシウムイオン濃度を有しており、約
6.5〜7.5 の実質的に一定のpHを有している。微生物
は、ヒアルロン酸ナトリウムを産生しこれを培地中に分
泌する。ヒアルロン酸ナトリウムはその後、培地から回
収される。
【００１９】以下、本発明の微生物を用いてヒアルロン
酸ナトリウムを製造する方法につて説明する。
【００２０】本発明の微生物の好適な増殖条件は、毎分
培地容量当たり空気約0.5 容量(vvm) を越える速度で培
地を曝気することを含む。一般には1 〜2vvmの曝気速度
が使用されるが、曝気速度は高いほうが望ましい。この
好適具体例において、好適な栄養培地は1 mg当たり約10
〜30g のカゼイン加水分解物と、約 5〜15g の酵母エキ
スと、約2gのNaClと、約0.5gを越えるMgSO4 ・7H2 O
と、約2.5gの K2 HPO4 と、約 2〜15g のグルコースと
を含んでいる。
【００２１】ヒアルロン酸ナトリウムは、好気性又は嫌
気性条件下で本発明の微生物を増殖させることにより得
られる。
【００２２】ヒアルロン酸ナトリウムは、例えば濾過又
は遠心分離により微生物及び培地中の不溶性の他の物質
を除去するべく微生物を含んでいる培地を処理すること
により回収され得る。次にヒアルロン酸ナトリウムは培
地から沈降及び回収される。沈降物はその後均等な寸法
の粒子に粉砕及び乾燥され得る。
【００２３】ヒアルロン酸ナトリウムは、微生物を含ん
でいる培地のpHを約5.0 のpHに調整し、次に好適な時間
約80℃〜95℃の温度に培地を加熱し、例えば20分間約90
℃の温度に加熱するか又は好ましくは40分間80℃に加熱
ことにより回収される。加熱後、微生物及び他の不溶性
物質を除去する。好適な除去方法は、ケイソウ土のよう
な濾過助剤を使用した濾過により行なうものである。
尚、微生物を除去するために培地を処理する段階に先立
ち、微生物を含んでいる培地のpHを約7.0 に調整し、培
地を約 4℃〜20℃、好ましくは約 4℃〜15℃の温度に冷
却する。次に、3％水性酢酸ナトリウムを使用して、そ
の後の処理を可能とするのに必要な程度、例えば 3倍〜
4倍に培地を希釈してもよい。
【００２４】培地、又はこのようにして得られた濾液に
イソプロパノールのような第１の有機溶媒を加えること
により、ヒアルロン酸ナトリウムを沈降させることがで
きる。沈降物を 3％水性酢酸ナトリウムに再溶解させ、
次いでエタノールのような第２の有機溶媒で沈降させ
る。第２の沈降物を 3％水性酢酸ナトリウムに再溶解さ
せ、活性炭を加えて懸濁液を形成する。懸濁液を濾過
し、例えばアセトンのような第３の有機溶媒を加えてヒ
アルロン酸ナトリウムの沈降物を形成する。第１、第２
及び第３の有機溶媒は、夫々イソプロパノール、エタノ
ール又はアセトンであり得る。あるいは各段階で同一の
有機溶媒を使用することによりヒアルロン酸ナトリウム
を沈降させてもよく、例えば3 つの沈降段階のいずれに
おいてもイソプロパノールを使用することにより培地又
は濾液からヒアルロン酸ナトリウムを沈降させてもよ
い。
【００２５】又、ヒアルロン酸ナトリウム沈降物を0.15
M NaCl水溶液に再溶解させ、塩化セチルピリジニウムを
添加してヒアルロン酸のセチル- ピリジニウム塩を形成
し、このセチルピリジニウム塩をNaCl水溶液及び15％エ
タノール、例えば少なくとも1MのNaCl水溶液に溶解さ
せ、例えばヒアルロン酸ナトリウムを沈降させるエタノ
ールのような有機溶媒を添加することによりヒアルロン
酸ナトリウムを回収してもよい。
【００２６】このヒアルロン酸ナトリウム沈降物を0.15
M NaCl水溶液中に再溶解させ、塩化セチルピリジニウム
を添加して再びヒアルロン酸のセチルピリジニウム塩を
形成する。ヒアルロン酸塩をNaCl（少なくとも約1M）水
溶液及びエタノールに溶解させ、有機溶媒を添加するこ
とによりヒアルロン酸ナトリウムを回収してもよい。
【００２７】その後沈降物を無菌水性1M NaCl 水溶液に
溶解させ、得られた溶液をケイ酸マグネシウム吸着剤、
例えばフロリジルと接触させ、不純物及び残留セチルピ
リジニウムイオンを除去する。次に溶液を滅菌し、無菌
有機溶媒例えば無菌イソプロパノールを添加することに
よりヒアルロン酸ナトリウムを沈降させる。こうして製
造されたヒアルロン酸ナトリウムを、無菌条件下で空気
乾燥すればよい。
【００２８】更に、次の方法によっても培地からヒアル
ロン酸ナトリウムを回収できる。即ち、発酵及び加熱段
階以後で且つ微生物除去段階以前の培地を第１の有機溶
媒で処理する。こうして沈降したヒアルロン酸ナトリウ
ムを回収し、 3％水性酢酸ナトリウムに再溶解させ、次
に活性炭を加えて懸濁液を形成する。懸濁液をケイソウ
土のような濾過助剤を使用して濾過し、有機溶媒を加え
てヒアルロン酸ナトリウムの沈降物を形成する。この沈
降物をその後粉砕及び乾燥する。
【００２９】又、培地の処理に先立ち、微生物を含んで
いる培地のpHを約7.0 に調整し、培地を約 4℃〜20℃の
温度に冷却してもよい。
【００３０】好ましい回収方法としては、次のようなも
のがある。先ず、微生物を含んでいる培地にエタノール
のような有機溶媒を加え、更に有機溶媒を使用して沈降
物を収集し完全に洗浄する。ヒアルロン酸ナトリウム沈
降物を0.15M NaCl水溶液に再溶解させ、活性炭を加え
る。得られた懸濁液をケイソウ土濾過助剤を使用して濾
過し、活性炭、微生物及び他の不溶性物質を除去する。
次に清澄な濾液を塩化セチルピリジニウムで処理し、不
溶性のヒアルロン酸のセチルピリジニウム塩を形成す
る。セチルピリジニウム塩を収集し、10％(v/v) エタノ
ールを含有する水性NaCl、例えば少なくとも1MのNaCl水
溶液に溶解させ、例えばエタノールのような有機溶媒を
添加することによりヒアルロン酸ナトリウムを回収す
る。
【００３１】このヒアルロン酸ナトリウムを0.15M NaCl
水溶液に再溶解させればよい。塩化セチルピリジニウム
を添加して再びヒアルロン酸のセチルピリジニウム塩を
形成する。10％エタノールを含むNaCl（少なくとも約1
M）水溶液にヒアルロン酸塩を溶解させ、有機溶媒を添
加することによりヒアルロン酸ナトリウムを回収する。
その後、無菌水性1M NaCl 水溶液中に沈降物を溶解さ
せ、得られた溶液を例えばフロリジルのようなケイ酸マ
グネシウム吸着剤と接触させて不純物及び残留セチルピ
リジニウムイオンを除去する。次に溶液を濾過滅菌し、
無菌エタノールのような無菌有機溶媒を添加することに
よりヒアルロン酸ナトリウムを沈降させる。こうして製
造されたヒアルロン酸ナトリウムを無菌条件下で空気乾
燥すればよい。 このヒアルロン酸ナトリウムは、化粧
品グレード及び臨床用グレードのヒアルロン酸ナトリウ
ム組成物中で、あるいは他の好適なキャリヤー、例えば
グリセロール、ポリプロピレングリコール、ソルビトー
ル、コラーゲン、ポリエチレングリコールと共に使用す
るのに適している。
【００３２】本発明の微生物により製造される化粧品グ
レードのヒアルロン酸ナトリウム組成物は、皮膚に刺激
を与えないことを特徴とする。該組成物は、分子量が約
700000〜1500000 ドルトンの範囲であり且つグルクロン
酸とN-アセチルグルコサミンとの比が1:1 であるような
ヒアルロン酸ナトリウムを約87％〜91％含有しており、
更に約 8〜約12重量％の水と、約 4〜約5 重量％のナト
リウムイオンと、約0.1 重量％未満のタンパク質と、約
0.05重量％未満の硫酸塩と、約0.5 重量％未満の核酸と
を含有している。
【００３３】本発明の微生物を用いた発酵により製造さ
れる臨床用グレードのヒアルロン酸ナトリウム組成物
は、発熱性及び炎症性をもたないことを特徴とする。該
組成物は、平均分子量が約 2〜3.5 ×106 ドルトンであ
り且つグルクロン酸とN-アセチルグルコサミンとの比が
1:1 であるようなヒアルロン酸ナトリウムを約88〜約92
重量％含有しており、更に約 8〜約12重量％の水と、約
4〜約6 重量％のナトリウムイオンと、約0.01重量％未
満のタンパク質と、約 0.001重量％未満の硫酸塩と、約
0.02重量％未満の核酸と、約 0.2重量％未満の中性糖と
を含有している。
【００３４】本発明の微生物により製造される好適な超
純粋ヒアルロン酸ナトリウム組成物は、最小限界粘度約
3.5m3 /kg 、最小平均分子量約 3.5×106 ドルトンであ
り、25℃及び波長436nm で測定した比旋光度が約 155°
〜 165°であり、タンパク質含有量が約 1mg/gであり、
波長257nm の吸光度が約0.5 未満であり、内毒素含有量
が約0.05ng/ml 未満、鉄含有量約0.2 mg/g、銅含有量約
0.02mg/g未満であり、生理的緩衝液中に溶解した 1％組
成物溶液1 mlをフクロウザルの硝子体液の約 2分の1 と
置換するように注入した場合、このフクロウザルの眼の
水性体液mm3 当たり約 200個未満の白血球が浸透するこ
とを特徴とする。
【００３５】3.5×106 ドルトンを越える平均分子量と
各種の純度グレードとを有する高分子量ヒアルロン酸ナ
トリウム組成物もまた、本発明の微生物により製造され
る。
【００３６】
【実施例】以下、本発明の微生物の選択方法、及び本発
明の微生物を用いてヒアルロン酸を製造するプロセスの
具体例について説明する。
【００３７】尚、フクロウザルの眼の硝子体試験は、本
質的にE.A.Balazsの米国特許第4141973 号(1979 年) の
記載に従って実施した。
【００３８】細菌選択及び突然変異 ニトロソグアニジン突然変異誘発 連鎖球菌属の細菌をトリス- マレイン酸緩衝液pH6.0 中
の100 mg/ml のN-メチル-N′- ニトロ-N- ニトロソグア
ニジンで40分間処理し、高度産生体を選択するためのTo
dd-Hewitt 寒天プレート又は溶血素マイナス選択用の血
液寒天プレート上で分離させた。細菌の生存率は一般に
約 0.1％であった。病院収蔵試料から得た各種のC 型連
鎖球菌を前記のように処理した。
【００３９】高度産生物質の選択 クローンの視覚評価により、大きなムコイドコロニーを
選択した。このようなコロニーの一例は、C 型Streptoc
oc-cus equisimilisの変異体(HA-100 と呼称)としてイ
スラエル保健省の国立連鎖球菌リファレンスセンターに
より分類されている菌株の単離体から得られた。連鎖球
菌株の同定に用いる“API 20 Strep”試験（フランスAP
I SYSTEM社）に基づくその後の試験の結果、HA-100はS.
zooepidemicusと密接に関連していることがわかった。
【００４０】溶血素マイナス突然変異体の選択 菌株HA-100を上記の突然変異誘発手順で処理し、溶血素
マイナス[hem.(−)]コロニーについて、溶血素活性及び
試験管発酵におけるヒアルロン酸生成を試験した。ヒア
ルロン酸の高度産生菌でありhem.（−）である突然変異
体を一つ選択し、大規模ヒアルロン酸製造に使用した。
この突然変異体をHA-116と呼称した。“API 20 Strep”
試験の結果、HA-116はS. zooepidimicusの菌株であるこ
とがわかった。Streptococcus zooepidemicus HA-116
は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダ
ペスト条約の規定に従って12301 Parklawn Drive, Rock
ville, Md 20852 に所在のAmerican Type Culture Coll
ectionに寄託されており、寄託番号ATCC 39920を付与さ
れている。
【００４１】発酵プロセス 本発明の微生物HA-116の使用に加えて、発明者らは細菌
発酵により製造されるヒアルロン酸の収率及び分子量を
増加させると共に発酵時間を短縮するための他の幾つか
の独自の方法を発明した。この発明は、（ｉ）マグネシ
ウムイオン濃度を高レベルに維持すること、及び（ii）
高い曝気速度で強い撹拌下に好気性発酵を実施すること
を含んでいる。
【００４２】本発明の微生物を用いた発酵の一好適具体
例において、発酵培地の組成は以下の通りである。
【００４３】
【表１】 より好適な発酵培地の具体例において、発酵培地中のMg
SO4 ・7H2 O の濃度は1.0 g/l であり、グルコースの濃
度は10g/l であり、他の成分の濃度は上記の通りであ
る。
【００４４】培地のpHはpHコントローラの必要に応じて
5N NaOH を連続的に添加することにより約7.0 に維持す
る。等量の50％(w/v) グルコースの同時添加は、コント
ローラに並列に接続されたポンプにより実施する。
【００４５】微生物の培養は曝気下に行っても非曝気下
に行ってもよい。いずれの場合も強い撹拌下で培養する
ことが好ましい。曝気は毎分培地容量当たり空気約 1〜
2 容量の速度で実施することが好ましい。非曝気下の発
酵器の収率は、約 1.5〜 2×106 の平均M.W でヒアルロ
ン酸約 2〜3 g/l であった。曝気下発酵の収率は、約2.
2〜3.3 ×106 の平均M.W でヒアルロン酸約 4〜6 g/l
であった。平均M.W は、当業者に既知の粘度測定に基づ
いて決定した。どちらの場合も、660nm で測定したO.D.
単位が 2.0〜2.5 まで増殖した5 ％(w/v) 微生物接種材
料を使用した時、インキュベーション時間は約12時間と
した。発酵の終了時に、生物集団の密度はO.D.単位8 〜
13の濁度に相当した。
【００４６】ヒアルロン酸の単離及び精製 ヒアルロン酸は3 種類の異なる手順Ｉ、II及びIII によ
り精製され得る。
【００４７】精製手順Ｉ 精製手順ＩはA 及びB の2 段階に分けることができる。
段階A では「化粧品グレード」のヒアルロン酸ナトリウ
ムを生成し、段階B では段階A で得られた化粧品グレー
ドを更に精製し、臨床用に好適な高純度の非炎症性材料
を生成する。
【００４８】段階Ａ この段階は、微生物及び他の不溶性物質を濾過により除
去し、その後、イソプロパノールで3 回連続的に沈降さ
せ、活性炭で処理することから成る。
【００４９】化粧品グレードのみの材料が生成された
ら、濾過する前に温度約90℃及びpH約5.0 で発酵培養液
を20分間加熱する。この時、希釈は不要である。臨床用
グレードの高分子量材料を生成するためには、発酵培養
液を約10℃〜約15℃の温度に氷冷し、 3％酢酸ナトリウ
ムで 3倍〜4 倍に希釈し、pHを約7.0 に調整し、その後
濾過する。真空式又は圧力式濾過器と、ケイソウ土型の
濾過助剤、例えばオハイオ州、シンシナチー、Eagle-Pi
cker Industries のCelatom FW-14 を0.5 g/l 使用す
る。1 容量のイソプロパノールを添加することにより濾
液からヒアルロン酸ナトリウムを沈降させる。沈降物を
等量の 3％酢酸ナトリウムに再溶解させ、材料を再びイ
ソプロパノールで沈降させる。第２の沈降物を3 ％酢酸
ナトリウムに再溶解させ、次に 1 g/lの活性炭を加え、
混合物を約1 時間撹拌する。この懸濁液を濾過し、イソ
プロパノールを添加することによりヒアルロン酸ナトリ
ウムを沈降させ、イソプロパノールで洗い、最後に粉砕
及び空気乾燥して「化粧品グレード」の製品を得る。
【００５０】段階Ｂ 化粧品グレードのヒアルロン酸ナトリウムのセチルピリ
ジニウム塩を2 回連続的に沈降させた後、例えばフロリ
ジルのようなケイ酸マグネシウムのカラムに不純物を吸
着させることにより化粧品グレードのヒアルロン酸ナト
リウムを精製する。フロリジル(Florisil)は、ウェスト
バージニア州、バークレー・スプリングス、Floridin社
の登録商標である。
【００５１】塩化セチルピリジニウム(CPC) 沈降： 段
階A で得られた化粧品グレードの材料を0.15M NaClに溶
解させ、約0.25％の濃度のヒアルロン酸塩溶液を得る。
0.15M NaCl 中の10％CPC1容量を約8 容量の0.25％ヒア
ルロン酸塩溶液に加える。セチルピリジニウム塩をデカ
ンテーション及び遠心分離により分離し、0.15M NaClで
洗った後、15％エタノールを含有する2M NaCl 中に再溶
解させ、約 0.2％のヒアルロン酸塩溶液を得る。1 容量
のイソプロパノールを添加することにより、ヒアルロン
酸をナトリウム塩として沈降させる。ペレットをイソプ
ロパノールで洗い、上記のように0.15M NaClに再溶解さ
せ、CPC 沈降プロセスを繰り返す。次に、２度目のCPC
沈降により得られたイソプロパノール沈降物を、フロリ
ジル処理のために1M NaCl に再溶解させる。
【００５２】フロリジル吸着： ピロゲンを含まない1M
NaCl 中の約0.25％ヒアルロン酸ナトリウム溶液を30〜
60メッシュの活性化フロリジル、例えば溶液10mg当たり
200gのフロリジルのカラムに通す。次に0.2mフィルタで
濾過することにより溶液から細菌を除去する。濾過滅菌
したイソプロパノール(1容量) によりヒアルロン酸ナト
リウムを沈降させた後、無菌分析用グレードエタノール
で洗う。最後に沈降物を無菌空気流により乾燥する。
【００５３】この手順によるヒアルロン酸の収率は約60
〜70％である。
【００５４】精製手順II及びIII 別の方法として、2 つの異なる精製方法を用いて化粧品
グレード及び臨床グレードのヒアルロン酸ナトリウムを
製造することができる。これらの手順はヒアルロン酸ナ
トリウムを得るための好ましい手順である。手順IIによ
って低分子量の「化粧品グレード」のヒアルロン酸ナト
リウムが製造され、手順III によって臨床使用に適した
高純度高分子量の非炎症性ヒアルロン酸ナトリウムが製
造される。
【００５５】手順 II 発酵が終了すると、発酵培養液を約90℃に加熱し、次に
pHを約5.0 に調整し、培地を80℃で40分間維持した。pH
を7.0 に調整し約20℃に冷却することによってこのステ
ップを終了する。この加熱プロセスでヒアルロン酸塩の
分子量が約 1−1.5 ×106 ドルトンまで減少する。
【００５６】1.5 倍容のエタノールを添加しヒアルロン
酸ナトリウムを発酵混合物から沈澱させる。更に、沈澱
物をエタノールで洗浄して微生物の大部分を除去する。
この粗材料を、0.1％のパラヒドロキシ安息香酸メチルエ
ステル含有の 3％酢酸ナトリウム水溶液に再度溶解す
る。 2〜3 g/l ヒアルロン酸塩を含むように容量を調整
する。1 g/l の活性炭と40g/l のけい藻土タイプの濾過
助剤例えばCelatom FW-1、Eagle-Picker Industries In
c.、Cincinnati、Ohio、とを溶液に添加し1 時間以上撹
拌する。次に濾過助剤ケーキで混合物を濾過する。1.5
倍容のエタノールを添加してヒアルロン酸ナトリウムを
沈澱させ、沈澱物を等容の 3％酢酸ナトリウムに再度溶
解する。この溶液を微孔コットンカートリッジで濾過
し、次に 1.5倍容のエタノールで処理する。沈澱した精
製ヒアルロン酸ナトリウムを粉砕し最後に風乾して「化
粧品グレード」の生成物を得る。
【００５７】手順 III この手順では発酵終了直後に発酵培養液を1.5 倍容のエ
タノールで処理する。沈澱したヒアルロン酸ナトリウム
をエタノールで洗浄して微生物の大部分を除去し、次に
0.1％のパラヒドロキシ安息香酸メチルエステル含有の
0.15M のNaC mg水溶液に再度溶解する。 1〜2 g/l のヒ
アルロン酸塩が含まれるように容量を調整する。1 g/l
の活性炭と40g/l のCelatom FW-14 とを溶液に添加し、
混合物を1 時間撹拌する。懸濁液を濾過助剤ケーキで濾
過する。
【００５８】塩化セチルピリジニウム(CPC) 沈澱 0.15M のNaCl中のCPC の10％溶液を透明なヒアルロン酸
塩溶液に添加する。CPC 溶液の添加量はヒアルロン酸の
5倍の重量になるように計算する。沈澱したセチルピリ
ジニウム塩を傾瀉及び遠心分離によって分離し、次に10
容量％のエタノール含有の1MのNaClに再度溶解して約 1
〜2 g/l の溶液を調製する。 1.5倍容のエタノールを添
加してヒアルロン酸ナトリウムを沈澱させる。
【００５９】沈澱物を0.15M のNaClに再度溶解し、前の
段落に記載したCPC 沈澱プロセスを繰り返す。第2 のCP
C プロセス後に得られたエタノール沈澱物を最終精製ス
テップで処理する。
【００６０】フロリジル吸着 発熱物質を含まない無菌の1MのNaCl中の約 0.1〜0.15％
のヒアルロン酸ナトリウム溶液を、30〜60メッシュの活
性フロリジルカラムに通す。例えば溶液1 ｌ当たり20g
のフロリジルを用いる。次に0.2 μm のフィルタで濾過
して溶液を無菌にする。ヒアルロン酸ナトリウムをエタ
ノール(1.5倍容) 沈澱させ、分析グレードのエタノール
で洗浄する。最後に沈澱物を無菌窒素流で乾燥する。
【００６１】この手順によるヒアルロン酸ナトリウムの
収率は約70〜80％である。
【００６２】産生ヒアルロン酸ナトリウムの特性 グレードＩのヒアルロン酸ナトリウム グレードＩのヒアルロン酸ナトリウムは手順Ｉによる精
製ステップA または手順IIの後に得られる「化粧品グレ
ード」のヒアルロン酸ナトリウムである。その特性を以
下に示す。
【００６３】ａ．ヒアルロン酸ナトリウムの含量 87〜91％。これは参照標準としてSigma ヒアルロン酸Ty
peＩ、cat.＃H1751 を使用し、カルバゾール法、Bitter
及びMuir、Anal.Biochem. 4、330(1962) の変法で検
定。
【００６４】ｂ．平均分子量 約 700,000〜約1,500,000 ドルトン。これは本質的にLa
u-rent等、Biochem.Biophys.Acta 42、476(1960) によ
って記載された極限粘度数から計算。固有粘度と分子量
との代表的計算を以下に示す。
【００６５】固有粘度及び分子量 ヒアルロン酸ナトリウム(NaHA)溶液の粘度を毛管粘度計
によって測定した。サンプルの流動時間(t) を測定し純
溶媒の流動時間(t) と比較した。
【００６６】粘度計：Cannon-Ubbelohde希釈粘度計 サイズ100(Cannon Instrument Co.) 溶液 ：0.2M塩化ナトリウム中の 0.1％ヒアルロン酸ナ
トリウム 温度 ：25℃±0.01固有粘度の計算 ηrel.−純溶媒に対する溶液粘度の変化を示す相対粘度
【００６７】
【数１】 ηsp −比粘度。単位1 に比較した粘度増加の測定値。
【００６８】
【数２】 （η） −固有粘度（極限粘度数）
【００６９】
【数３】 固有粘度（）の決定 0.1％ヒアルロン酸ナトリウム溶液とこの溶液の2 倍、3
倍及び4 倍希釈溶液との粘度を測定した。ヒアルロン
酸ナトリウムの濃度はカルバゾール法で測定した。sp/C
をC に対してプロットし、 C＝0 まで直線状に外挿し
た。この線とY 軸との交点から（η）を決定した。
【００７０】分子量の決定 実験的に確定したMark-Houwink関係式 （η）＝0.0403・ M0.775 （式中のM は分子量をドルトンで示す）からヒアルロン
酸ナトリウムの分子量を決定した。この関係式を使用し
て産生NaHAの種々のロットを分子量を決定した。関係式
を表Ｉに示す。
【００７１】
【表２】 ｃ．グルクロン酸／N-アセチルグルコサミン(NAG) の
比:1/1。Morgan and Elson法、Methods in Carbohydrate
Chemistry 8、89(1980)の変法によってNAG を検定し
た。
【００７２】ｄ．含水量:10 ％±2 ％ ｅ．タンパク質:0.1％未満。BradfordのCoomasie blue
法(Anal.Biochem.72、248(1976))で検定。
【００７３】 ｆ．ナトリウムイオン:5％±1 ％。炎光分析で検定。
【００７４】ｇ．硫酸塩含量：0.05％未満。塩酸中で加
水分解後にRoden 等の濁り測定法、Mothods Enzymol ．
28、73(1972)で測定。
【００７５】ｈ．核酸:0.5％未満。波長260mで1 ％溶液
の吸光度の測定により検定。
【００７６】ｉ．皮膚刺激の有無：この測定には1 ％溶
液に対して以下の方法を用いる。(i)ウサギのDraize皮
膚刺激テスト、J.H.Draize、「食品、薬物及び化粧品中
の化学物質の安全性の査定 Appraisal of the Safety o
f Chemicals in Foods、Drugsand Cosmetics 」、Assoc
iation of Food and DrugOfficials of the United Sta
tes、Austin、Texas 、pp.46-49(1959)；（ii）モルモ
ットの遅延接触過敏性テスト、Magnusons 及びKligman
、J.Invest.Dermatol.52、268(1969) 。
【００７７】グレードIIのヒアルロン酸ナトリウム グレード II のヒアルロン酸ナトリウムは手順Ｉの段階
B による精製又は手順III の精製後に得られる「臨床用
グレード」のヒアルロン酸ナトリウムである。その特性
を以下に示す。
【００７８】 ａ．ヒアルロン酸ナトリウム含量：88〜92％。
【００７９】ｂ．平均分子量:7×105 ドルトンより大き
い。通常は手順Ｉの段階B で精製されたNaHAの分子量は
約 2〜約 3.5×106 ドルトンの範囲であり手順III で精
製されたNaHAの分子量は約 2〜約 4.4×106 ドルトンの
範囲である。これらの分子量範囲は前記のごとく極限粘
度数から計算した。
【００８０】ｃ．グルクロン酸/N- アセチルグルコサミ
ンの比：1/1 。
【００８１】ｄ．含水量：10％±2 ％。
【００８２】 ｅ．タンパク質：検出不能(0.01 ％未満) 。
【００８３】ｆ．ナトリウムイオン：５％±１％ ｇ．硫酸塩含量：検出不能（０．００１％未満） ｈ．核酸：検出不能（０．０２％未満） ｉ．中性糖：検出不能（０．２％未満） 中性糖は加水分解後のサンプルで測定した。２Ｎトリフ
ルオロ酢酸中で１２０℃で１時間加水分解し次に減圧し
た。０．０２Ｎ酢酸ナトリウムで予め処理したシリカゲ
ル薄層プレート（０．２ｍｍ）を用いて薄層クロマトグ
ラフィーを行った。加水分解したサンプルと参照標準サ
ンプルとをスポットし９０：１０のアセトン：水で展開
する。硫酸で炭化して糖スポットを検出した。
【００８４】ｊ．発熱性：無。１％溶液をウサギに注射
し当業者に公知の標準方法で発熱性を測定した。
【００８５】ｋ．炎症活性の非存在：この特性はマウス
を用いた感受性アッセイ法で測定した。この方法は炎症
性物質の導入後の腹膜内への白血球特に多形核白血球及
びマクロファージの遊走に基づく。これら細胞は超酸化
ラジカルを生じるように炎症プロセスで感化される。遊
走と感化とを以下の手順で検定する。マウス２〜３ひき
づつのグループに１ｍｌのサンプルを腹膜内注射する。
２４時間後に各動物の腹膜を５ｍｌのＥａｒｌｅ培地で
３回洗浄する。同グループのマウスの洗浄物を合わせ
る。細胞を１，５００ｒｐｍで１０分間沈降させ１ｍｌ
に再度懸濁させて計数する。次にサンプルの容量を４×
１０6 細胞／ｍｌになるように調整し０．２５ｍｌずつ
のサンプルを０．５ｍｌの２ｍｇ／ｍｌのシトクロムＣ
と勾配量の（０．２、１０、及び最終２０ｍｇ）酢酸ミ
リスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）とによって９０分間イ
ンキュベートする。ＰＭＡは酸化性「放出」系の活性化
因子である。培地を１，５００ｒｐｍで１５分間遠心
し、上澄の吸光度を５５０ｎｍで測定する。
【００８６】腹膜細胞数の増加とＰＭＡに反応しシトク
ロムＣを減少させる最大能の増加と双方とによって炎症
が示される。従って、炎症指数は１ぴきのマウスから得
られた白血球全体の活性（形成された超酸化物ラジカル
のナノモル）として定義される。炎症指数が生理食塩水
だけを注射したマウスに比較して優位に増加していない
ときはサンプルが非炎症性であると判定する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:46） (72)発明者 ドヴ・カンナー イスラエル国、レホヴオツト、ゴード ン・ストリート・21 (72)発明者 モシユ・ランズバーグ イスラエル国、ペタ・テイクヴア、ザー ル・ストリート・２

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅ
    ｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ＨＡ−１１６ ＡＴＣＣ Ｎｏ．
    ３９９２０なる微生物。
  2. 【請求項２】 ヒアルロン酸を産生するＳｔｒｅｐｔｏ
    ｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓに属する微
    生物を適当な突然変異誘発物質で処理してその変異体を
    産生し、変異体を適当な固体培地で増殖させ、ムコイド
    コロニーを同定し、かかるコロニーを回収し、回収コロ
    ニーを血液寒天培地で増殖させ、ヘモグロビンを溶解し
    ない微生物コロニーを選択するステップを含む、ヒアル
    ロン酸を多量に産生し溶血活性をもたない微生物Ｓｔｒ
    ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ
    ＨＡ−１１６ ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９９２０の取得方
    法。
JP6141201A 1985-01-18 1994-05-31 高分子量ヒアルロン酸ナトリウムの製造に用いる連鎖球菌及びその選択方法 Expired - Lifetime JP2571908B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/692,692 US4784990A (en) 1985-01-18 1985-01-18 High molecular weight sodium hyaluronate
US692692 1985-01-18
US06/815,957 US4780414A (en) 1985-01-18 1986-01-09 Method of producing high molecular weight sodium hyallronate by fermentation of streptococcus
US815957 1986-01-09

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP61500791A Division JP2677553B2 (ja) 1985-01-18 1986-01-16 連鎖球菌の発酵による高分子量ヒアルロン酸ナトリウムの製造方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH0787962A JPH0787962A (ja) 1995-04-04
JP2571908B2 true JP2571908B2 (ja) 1997-01-16

Family

ID=27105017

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP6141201A Expired - Lifetime JP2571908B2 (ja) 1985-01-18 1994-05-31 高分子量ヒアルロン酸ナトリウムの製造に用いる連鎖球菌及びその選択方法
JP08273821A Expired - Lifetime JP3081544B2 (ja) 1985-01-18 1996-10-16 高分子量ヒアルロン酸ナトリウム組成物

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP08273821A Expired - Lifetime JP3081544B2 (ja) 1985-01-18 1996-10-16 高分子量ヒアルロン酸ナトリウム組成物

Country Status (10)

Country Link
US (1) US4780414A (ja)
EP (2) EP0211037B1 (ja)
JP (2) JP2571908B2 (ja)
AT (1) ATE72835T1 (ja)
AU (1) AU600888B2 (ja)
CA (1) CA1336177C (ja)
DE (1) DE3683969D1 (ja)
HK (1) HK117496A (ja)
IL (1) IL77625A (ja)
WO (1) WO1986004355A1 (ja)

Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5093487A (en) * 1986-01-06 1992-03-03 Mobay Corporation Low viscosity high molecular weight filter sterilizable hyaluronic acid
US4784990A (en) * 1985-01-18 1988-11-15 Bio-Technology General Corporation High molecular weight sodium hyaluronate
US5023175A (en) * 1986-05-01 1991-06-11 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Novel production process of hyaluronic acid and bacterium strain therefor
JPH072117B2 (ja) * 1986-10-09 1995-01-18 三菱レイヨン株式会社 ヒアルロン酸の製造法
US6174999B1 (en) * 1987-09-18 2001-01-16 Genzyme Corporation Water insoluble derivatives of polyanionic polysaccharides
US6610669B1 (en) 1987-09-18 2003-08-26 Genzyme Corporation Water insoluble derivatives of polyanionic polysaccharides
US4946780A (en) * 1988-10-12 1990-08-07 Denkl Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Method for producing sodium hyaluronate by fermentation method
US4897349A (en) * 1989-04-28 1990-01-30 Medchem Products, Inc. Biosynthesis of hyaluronic acid
US5102783A (en) * 1990-01-12 1992-04-07 Vetrepharm, Inc. Composition and method for culturing and freezing cells and tissues
GB9024223D0 (en) * 1990-11-07 1990-12-19 Fermentech Ltd Production of hyaluronic acid
US5492936A (en) * 1990-11-30 1996-02-20 Allergan, Inc. Bimodal molecular weight hyaluronate formulations and methods for using same
US5629287A (en) * 1991-01-18 1997-05-13 University College London Depot formulations
US5610148A (en) * 1991-01-18 1997-03-11 University College London Macroscopically oriented cell adhesion protein for wound treatment
US5496726A (en) * 1993-04-16 1996-03-05 Lucky Limited Streptococcus zooepidemicus medium and process for preparing hyaluronic acid
IT1263393B (it) * 1993-07-30 1996-08-05 Fidia Advanced Biopolymers Srl Processo per la preparazione e purificazione di acido ialuronico ad alto peso molecolare
US6455304B1 (en) * 1994-07-01 2002-09-24 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Hyaluronate synthase gene and uses thereof
US6951743B2 (en) 1997-10-31 2005-10-04 University Of Oklahoma Board Of Regents Hyaluronan synthase genes and expression thereof in bacillus hosts
US7091008B1 (en) 1994-07-01 2006-08-15 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Hyaluronan synthase genes and expression thereof in Bacillus hosts
DE19712931B4 (de) * 1997-03-27 2004-08-05 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren zur Gewinnung von Hyaluronsäure
DE69828193T2 (de) * 1997-10-31 2005-12-01 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma, Norman Hyaluronan synthase gen und seine verwendung
CN101113436B (zh) * 1997-10-31 2013-02-06 俄克拉何马大学董事会 透明质酸合酶基因及其应用
US20080108110A1 (en) * 1998-04-02 2008-05-08 Deangelis Paul L Targeted glycosaminoglycan polymers by polymer grafting and methods of making and using same
US7223571B2 (en) * 1998-04-02 2007-05-29 The Board Of Regents Of The Universtiy Of Oklahoma Targeted glycosaminoglycan polymers by polymer grafting and methods of making and using same
US20060188966A1 (en) * 1998-04-02 2006-08-24 Deangelis Paul L Natural, chimeric and hybrid glycosaminoglycan polymers and methods of making and using same
US6987023B2 (en) * 1998-04-02 2006-01-17 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma DNA encoding hyaluronan synthase from Pasteurella multocida and methods of use
US6630457B1 (en) * 1998-09-18 2003-10-07 Orthogene Llc Functionalized derivatives of hyaluronic acid, formation of hydrogels in situ using same, and methods for making and using same
US7094581B2 (en) * 1998-10-26 2006-08-22 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Hyaluronan synthases and methods of making and using same
US6521223B1 (en) 2000-02-14 2003-02-18 Genzyme Corporation Single phase gels for the prevention of adhesions
US20050287638A1 (en) * 2000-04-25 2005-12-29 Weigel Paul H Hyaluronan receptor for endocytosis, variants thereof, and methods of making and using same
EP1305064B1 (en) 2000-07-28 2008-04-23 Anika Therapeutics Inc. Bioabsorbable composites of derivatized hyaluronic acid
JP5024497B2 (ja) * 2001-03-27 2012-09-12 キユーピー株式会社 経口用肌改善剤、肌改善方法及び肌改善用食品組成物
US20070020737A1 (en) * 2001-12-03 2007-01-25 Pummill Philip E Hyaluronan synthases and methods of making and using same
GB0130603D0 (en) * 2001-12-20 2002-02-06 Renaissance Healthcare Europ L Improvements in or relating to ophthalmic solutions
US20040126853A1 (en) * 2002-06-20 2004-07-01 Novozymes A/S Flocculation with divalent salt
KR101023049B1 (ko) 2002-06-20 2011-03-24 노보자임스 바이오파마 디케이 에이/에스 2가 염을 사용한 응집 방법
WO2004016771A1 (en) * 2002-08-19 2004-02-26 Kolon Ind. Inc. Microorganism producing hyaluronic acid and purification method of hyaluronic acid
US8124120B2 (en) 2003-12-22 2012-02-28 Anika Therapeutics, Inc. Crosslinked hyaluronic acid compositions for tissue augmentation
US7002007B2 (en) * 2004-05-28 2006-02-21 Calcigen Corporation Production of high molecular weight hyaluronates
ES2281265B1 (es) 2005-11-24 2008-08-16 Bioiberica, S.A. Composiciones para el tratamiento de la artrosis.
EP3028677A1 (en) 2005-12-14 2016-06-08 Anika Therapeutics Inc. Treatment of arthritis and other musculoskeletal disorders with crosslinked hyaluronic acid
US20090162905A1 (en) * 2006-06-07 2009-06-25 Hideki Murata Method for Purification of Hyaluronic Acid Salt
CA2657162A1 (en) 2006-07-06 2008-03-27 Reliance Life Sciences Pvt Ltd Efficient process for purification of high molecular weight hyaluronic acid
ES2327480B1 (es) 2007-06-15 2010-08-10 Bioiberica, S.A. "disacaridos para el tratamiento de tendones, ligamentos y huesos".
US20110130473A1 (en) 2007-11-13 2011-06-02 Bio-Technology General (Israel) Ltd. Dilute filtration sterilization process for viscoelastic biopolymers
US8624077B2 (en) 2008-10-02 2014-01-07 L.R.R.&D. Ltd. Interface layer wound dressing
KR101132114B1 (ko) * 2009-09-15 2012-04-05 일동제약주식회사 히알루론산의 분자량을 조절하는 방법
JP5659483B2 (ja) * 2009-12-01 2015-01-28 三菱化学フーズ株式会社 多糖類の製造方法
FR2963240B1 (fr) * 2010-07-28 2013-03-15 Horus Pharma Composition a usage topique sans conservateur comprenant de l'acide hyaluronique
KR101577127B1 (ko) 2011-06-09 2015-12-11 산요가세이고교 가부시키가이샤 다당의 제조 방법
ES2440390B1 (es) 2012-07-25 2014-11-13 Bioibérica, S.A. Composiciones para el tratamiento del sobrepeso y de la obesidad
CA2896038C (en) * 2015-07-03 2022-08-09 Glycobiosciences Inc. Polymer matrix compositions comprising a high concentration of bio-fermented sodium hyaluronate and uses thereof
ES2638195B1 (es) 2016-04-18 2018-08-02 Bioiberica, S.A. Composiciones para la piel
IT201600079633A1 (it) * 2016-07-28 2018-01-28 Fidia Farm Spa Procedimento di preparazione e purificazione del sale sodico dell’acido ialuronico
CA3046725A1 (en) 2017-01-11 2018-07-19 Ferring B.V. A fast disintegrating pharmaceutical composition
WO2019158541A1 (en) 2018-02-14 2019-08-22 Frieslandcampina Nederland B.V. Nutritional compositions for musculoskeletal support for athletes
WO2020016820A1 (en) 2018-07-18 2020-01-23 Bio-Technology General (Israel) Ltd. Process of, and arrangement for, sterile filtering a non-newtonian liquid and formulation of a liquid obtainable thereby

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4141973A (en) * 1975-10-17 1979-02-27 Biotrics, Inc. Ultrapure hyaluronic acid and the use thereof
US4303676A (en) * 1980-03-21 1981-12-01 Balazs Endre A Hyaluronate based compositions and cosmetic formulations containing same
JPS5837001A (ja) * 1981-08-27 1983-03-04 Green Cross Corp:The ヒアルロン酸の製造法
JPS5856692A (ja) * 1981-09-26 1983-04-04 Shiseido Co Ltd ヒアルロン酸の製造方法
US4517295A (en) * 1983-02-18 1985-05-14 Diagnostic, Inc. Hyaluronic acid from bacterial culture
NO161573C (no) * 1983-11-25 1989-08-30 Miles Inc Fremgangsmaate til fremstilling av hyaluronsyre.
NO160722C (no) * 1983-11-25 1989-05-24 Miles Inc Fremgangsmaate for fremstilling av ultraren hyaluronsyre.
DE3531612A1 (de) * 1984-09-04 1986-03-27 Chisso Corp., Osaka Verfahren zur herstellung von hyaluronsaeure

Also Published As

Publication number Publication date
WO1986004355A1 (en) 1986-07-31
EP0455263A3 (en) 1991-12-11
IL77625A (en) 1991-04-15
JPH09143078A (ja) 1997-06-03
JPH0787962A (ja) 1995-04-04
EP0211037B1 (en) 1992-02-26
ATE72835T1 (de) 1992-03-15
HK117496A (en) 1996-07-12
JP3081544B2 (ja) 2000-08-28
EP0211037A1 (en) 1987-02-25
DE3683969D1 (de) 1992-04-02
AU5359986A (en) 1986-08-13
CA1336177C (en) 1995-07-04
EP0455263A2 (en) 1991-11-06
EP0211037A4 (en) 1988-09-07
US4780414A (en) 1988-10-25
AU600888B2 (en) 1990-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2571908B2 (ja) 高分子量ヒアルロン酸ナトリウムの製造に用いる連鎖球菌及びその選択方法
JP2677553B2 (ja) 連鎖球菌の発酵による高分子量ヒアルロン酸ナトリウムの製造方法
EP0137786B1 (en) Hyaluronic acid from bacterial culture
EP0144019B1 (en) Ultrapure hyaluronic acid and method of making it
EA039615B1 (ru) Способ получения и очистки натриевой соли гиалуроновой кислоты
EP0266578B1 (en) Method of producing hyaluronic acid
DE3531612C2 (ja)
JP4106361B2 (ja) ヒアルロン酸産生微生物菌株及び精製ヒアルロン酸の製造方法
JPS6279790A (ja) 改質されたヒアルロン酸の製造法
KR100250573B1 (ko) 신규 스트렙토코커스속 미생물 및 그로부터 제조되는 히아루론산
JPH1025234A (ja) 化粧料
KR100472007B1 (ko) 히아루론산 생산 균주 및 상기 균주를 이용한 히아루론산 생산방법
JPWO2002086116A1 (ja) 硫酸化フコグルクロノマンナン
JP4693014B2 (ja) グリコサミノグリカン二糖の製造方法。
KR100494808B1 (ko) 다당류를 생산하는 균주인 바실러스 속 에이８, 이 균주로부터생산되는 다당류 및 이의 용도
JPH062073B2 (ja) ヒアルロン酸の製造法
JPH0144721B2 (ja)
JPH027631B2 (ja)
KR920009494B1 (ko) 신규 스트렙토코커스속 미생물 및 이를 이용한 고분자량의 히아론산의 제조방법
KR100236766B1 (ko) 히아루론산 또는 그 염의 정제방법
JPH0630604B2 (ja) ヒアルロン酸の製造法
JPH08280396A (ja) トレハロースの製造法
Jacobson Bracke et a1.
JPS63129991A (ja) ヒアルロン酸の製法
Dunleavy et al. Method of Extracting Starch from Bacteria

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

S531 Written request for registration of change of domicile

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

EXPY Cancellation because of completion of term