DE2600323A1

DE2600323A1 - Verfahren zur herstellung eines produkts mit biologischer aktivitaet

Info

Publication number: DE2600323A1
Application number: DE19762600323
Authority: DE
Inventors: Auf Nichtnennung Antrag
Original assignee: ANI
Current assignee: ANI
Priority date: 1975-01-08
Filing date: 1976-01-07
Publication date: 1976-08-26
Also published as: SE7600075L; AU8769575A; DK143248C; GB1531812A; DK143248B; AT341663B; CH592735A5; SE436365B; FR2357643B1; DK4076A; US4030976A; FR2357643A1; CA1060368A; BE837303A; AU503045B2; JPS6147516B2; ATA989675A; NL7600166A; JPS5191395A

Description

u.Z.s L 542 (Vo/ho/kä)
Fall 1

AMI
Vaduz, Liechtenstein

" Verfahren zur Kerste3.1ung eines Produkts mit bloioglscher-Aktivität » ■ ■ ■ ■

Priorität: 8. Januar 1975, Schveiz, Kr. 129/75

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Produktes mit biologischer Aktivität gegenüber tierischem, Kenschliciiem und pflanzlichen Gewebe duroli Isolieren eines Bairter.Lcnstamiaes aus der Barmflora eines niederen 'Tieres, Mutieren des Bakterlenstaamies In elnsia flüssigen iiähnaDdium_} Vieiterzüchten der erhaltenen Kutante In eines ijREtoniuiaeis«nc !trat und mindestens ein Phosphat enthaltenden stlekstoffrelchen Kährmediiua, wobei der Stickstoff in diesen riahrisediura teilweise aus einem tierischen, iaenschllchert oder pflanzlichen Gewebe entsprechend deia zu behandelnden Gev/ebe starbst,, das dadurch gekennzeichnet ist, daß aisuEi als Hutante In dem Kährmedlupi das Bakterium Kr. KClB 11 144 züchtet.

BAD ORIGINAL

609835/0897

Da sich die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren: : Stoffe chemisch nicht genau bezeichnen lassen Und auch keine Gemische darstellen, können sie nur durch das entsprechende Herstellungsverfahren und ihre biologischen Eigenschaften gekennzeichnet werden.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise als niederes Tier eine Larve eines Stachelhäuters, insbesondere eines Ringelwurins verwendet. Besonders bevorzugt sind die Larven des Blutegels (hirudo medicinalis).

Die Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, daß ein gramnegativer, fakultativ aerober Bakterienstaima von poly- * Biorpher, sehr kurzer Gestalt, der aus der Darmflora eines Blutegels isoliert wurde, durch Mutieren und l/eiterzüchtung die Herstellung eines Produktes mit zahlreichen spezifischen biologischen Eigenschaften ermöglicht.

Nachstehend und in den Patentansprüchen wird diese Bakterienart, die zur Familie der Enterobakteriaceen gehört, sowie das erfindungsgeinäße Verfahren zur Herstellung der Mutante beschrieben. Weiterhin werden das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Produkts und seine biologischen Eigenschaften beschrieben.

Zur Isolierung des als Äusgangsmaterial verwendeten Bakterienstammes wird eine Probe aus dem Darmtrakt eines Blutegels auf ein liährmeditm in einem Reagenzglas oder einer Petrischale über»

L J

803835/0897

^Γ ■ - 3 -

impft und bei 13 Ms 22° C 2 Ms 3 Tage inkubiert. Nach einigen Überimpfungen läßt sich ein gramnegativer Bakterienstamm von coccus-ähnlicher Gestalt und mit äußerst geringer Länge leicht isolieren. Frisch hergestellt sind die Keime sehr beweglich, einzeln und beliebig orientiert. Der reine, isolierte Bakterienstamm wird hierauf bei etwa 18⁰C drei bis fünf Tage in einem speziellen Nährmedium inkuMert. Anschließend wird die erhaltene Mutante weitergezüchtet.

Das zur Mutation verwendete Nährmedium enthält nur eine geringe Menge Stickstoff, ist jedoch verhältnismäßig reich an schwefelhaltigen Aminosäuren. Dies ist unerläßlich zur erfindungsgemäßen Herstellung der Bakterienstämme, die sich in dem nachstehend beschriebenen Medium zur Weiterzüchtung am aktivsten erweisen.

Das Mutationsmedium wird mit Natriumchlorid isotonisch eingestellt. Es kann .beispielsweise folgende Zusammensetzung aufweisen:

Pepton 2 g

Methionin 0,5 ~ 1 g

Cystin 0,5 - 1 g

NaCl 5g

Wasser 1000 ml

Als Pepton wird vorzugsweise kein unter. Vervrendung von Pepsin gewonnenes Pepton, sondern ein unter Verwendung von Pancreatin, • Trypsin oder Papain aus Fleisch oder Casein gewonnenes Pepton verwendet. Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid auf 6,8 eingestellt .

609835/0897

Anstelle des im Mutationsmedium verwendeten Peptons kann eine beliebige andere geeignete Stickstoffquelle tierischer oder · pflanzlicher Herkunft verwendet werden; wichtig ist nur, daß das Medium relativ reich an schwefelhaltigen Aminosäuren ist.

Das Methionin und Cystin kann ganz oder teilweise (in etwa gleichen Mengen) durch andere schwefelhaltige Aminosäuren, wie Glutathion, Cystein oder Homocystein, ersetzt werden.

Das vorstehend beschriebene Mutationsmedium wird dadurch hergestellt, daß man die einzelnen Bestandteile in Wasser auflöst. Vorzugsweise wird das Medium hierauf filtriert; der ρΗ-ΐ/ert wird gemessen und, falls erforderlich, auf 6,8 eingestellt. Anschließend wird .das Medium etwa 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert, abkühlen gelassen und mit einer Probe des reinen, als Ausgangsmaterial verwendeten Bakterienstammes beimpft, der wie vorstehend beschrieben auf einem festen, tierisches Eiweiß enthaltenden Nährmedium gezüchtet und 3 bis 5 Tage inkubiert worden war.

Die Mutation kann in üblichen Gefäßen, v/ie Reagenzgläsern oder Erlenmeyerkolben, durchgeführt werden. Die Kultur entwickelt sich schnell. Nach 9 bis 12 Tagen Inkubation bei 18 bis 22⁰C ist die Mutation erfolgt. Die erhaltene Mutante wird wöchentlich auf frischen Blutagar überimpft und bei 18⁰C (+ 2°C) gezüchtet. Die Kulturen können gefriergetrocknet oder im Kühlschrank über längere Zeit, sogar über Jahre, aufbewahrt werden, wodurch der Fortbestand der Stämme gesichert ist, was auch dadurch erleich-

609835/0897

^Γ -5-

tert wird, daß sie immer wieder von neuem, wie vorstehend beschrieben, auf das Mutationsmedium überimpft und so gegebenen falls regeneriert und verjüngt v/erden können. Bei der anschließenden Weiterzüchtung kann beispielsweise ein Nälmnedium der folgenden Zusammensetzung verwendet werden:

Pepton	Aminoniumeisencitrat-	1	8	bis 20 g
NaCl	Monokaliumpho sphat-		5	g
1prozentige lösung	Dinatr iurnpho sphat-		4	ml
1prozentige lösung			1	ml
1proζentige lösung		4	ml
Wasser		1	000 ml

Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid auf 6,8 eingestellt»

Dieser Gehalt an Mineralsalzen ist ein wesentliches Element der Zusammensetzung des Nährmediums. Als Pepton wird vorzugswei se kein unter Verwendung von Pepsin gewonnenes, sondern ein unter Verwendung von Pankreatin, Trypsin oder Papain aus Fleisch oder Casein gewonnenes Pepton verwendet. Anstelle des verwendeten Peptons kann eine beliebige andere geeignete Stickstoffquelle tierischen oder pflanzlichen Ursprungs verwendet v/erden, wichtig ist nur, daß die vorstehend genannte Zusammensetzung hinsichtlich des Gehalts an Mineralsalzen eingehalten wird. Das Pepton kann gegebenenfalls teilweise durch die vorstehend bei der Herstellung des Mutationsmediums genannten freien Aminosäuren ersetzt werden.

J 609835/0897

Dem Nährmedium wird außerdem "tierisches Gewebe" zugesetzt. Dieser Ausdruck soll im vorliegenden Fall im weitesten Sinne gelten, also sowohl das "Blutgewebe", d.h., das Blut insgesamt sowie seine einzelnen Komponenten, wie Blutzellen, Serum, Plasma oder Fibrin, als auch jedes andere tierische Gegeben umfassen, z.B. Muskel-, Organ-, Drüsen- oder Knochengewebe.

Das Gewicht des Trockenextraktes des tierischen Gewebes beträgt 10 bis 50 ¹Zi des für die Grundzusammensetzung des Nähr me drums für die leiterZüchtung verwendeten Peptons.

Gernäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäi3en Verfahrens kann das tierische Gewebe durch innere Sekrete, ζ«3. Amnionflüssigkeitj tierischer Herkunft ersetzt werden. In diesem Fall setzt man zusätzliches Pepton ein, um den gleichen Gosamtstickstoffgehalt zu erzielen.

Das tierische Gewebe wird gemäß den üblichen Methoden zur Herstellung von organtherapeutischen Präparaten hergestellt, d.h. entfettet und bis zum Gebrauch bei niedriger Temperatur gelagert .

Bei Verwendung von "Blutgewebe" v/ird das Blut entweder als solches (gegebenenfalls in stabilisierter Form) eingesetzt, oder es werden eine oder mehrere Blutkomponenten verwendet. Das tierische Gewebe wird erst unmittelbar vor dem Gebrauch zerkleinert, wobei auf größtmögliche Keimfreiheit zu achten ist. Gemäß einer v/eiteren Ausführungsform des erfindungs gemäß en Verfahrens kann gefriergetrocknetes, keimfreies tierisches Gewebe anstelle des frischen verwendet werden.

L _l

609835/0897

Das tierische Gewebe wird zu dem wie vorstehend beschrieben hergestellten und mit dem Pepton versetzten Nährmedium gegeben. Der .pH-Wert wird überprüft und erforderlichenfalls auf etwa 6,8 eingestellt.

Zur Weiterzüchtung können die üblichen Gefäße, wie Erlenmeyerkolben, verwendet werden. Zur Erzielung hoher Ausbeuten wird die Züchtung vorzugsweise in -sterilisierbaren Gefäßen durchgeführt, in denen die verschiedenen Vorgänge (Beimpfung, Probenentnahme und Einstellen des pH-Werts) aseptisch durchgeführt werden können.

Das Nährraedium wird im Autoklaven etwa 30 Hinuten bei 120⁰C sterilisiert,.abkühlen gelassen und mit einer Impfprobe beimpft, deren Volumen vorzugsweise 1/20 bis 1/200 des Nährmediums beträgt. Die Impf probe hat eine ähnliche Zusammensetzung wie das Nährmedium, - enthält jedoch kein tierisches Gewebe, und stammt aus einer Erhaltungskultur der Mutante.

Die Züchtung wird 15 Tage bei einer Temperatur von 18 bis 20⁰C durchgeführt.

Die zur Züchtung verwendete Nährbrühe dient dazu, ein Produkt mit biologischer Aktivität herzustellen.

Zu diesem Zweck wird die Nährbrühe beispielsweise mittels eines Filters oder einer Membran aseptisch filtriert.

weiteren

Gemäß einer / Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Nährbrühe in an sich bekannter Weise durch

609835/0897

Papier, Gewebe oder unter vermindertem Druck filtriert und mit einem üblichen Antiseptikum versetzt. .

Der als Ausgangsmaterial verwendete Bakterienstamm und die Mutante haben die nachstehend angegebenen Eigenschaften. Die erfindungsgemäß verwendete Mutante wurde unter der Nummer .
NCIB 11144 bei der National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen, Schottland, hinterlegt.

Tabelle Aktivität der Kulturen bei verschiedenen Temperaturen

Ausgangs- Mutante
material,. mutante

+ 15°C + ++

+ 25°C +

+ 30⁰C - +

+ 37⁰C - .

+ 42⁰C

Morphologische Kennzeichen '

Aus gangsmaterial Mutante

Leichter Polyinorphismus zwischen Ausgeprägter Polymorphisrius = coccenähnlicner Gestalt und zwischen kurz, und länglich
sehr kurz; beweglich, meist (Länge variiert zwischen 3 und einzelne Keime in beliebiger 6 Mikron) mit einigen "bacillen-Orientierung - gramnegativ- ähnlichen" Formen, die eine
fakultativ aerob. Länge von 10 Mikron haben kön

nen; beweglich. Gramnegativ fakultativ aerob.

609835/0897

Katalase Oxydase Harnstoff Glucose Lactose ONPG

- Q

biochemische Kennzeichen

Aus^angsraaterial

Mutante

ohne Gas +

mit Gas +

Mannit Beweglichkeit LDC

Indol NO₂

Citrat Simons Xylose Arabinose Lävulose Gelatine frischer Blutagar

Albumin von koaguliertem HühnereiweiS

koaguliertes Rindergrau-braune, flä- hellere graue Kolonien, chige Kolonien - Kultur dick und cremigkeine oder nur ge- vollständige Haemolyse ringe Haemolyse innerhalb von 12 bis

24 Std.

ohne Viirkung

Rasche Lysis mit Verflüssigung, die sich über einen großen Bereich erstreckt.

nicht sehr tief tiefgehende Furchen, gehende Furchen, die sich rasch entsehr geringe Lysis wickeln, starke Lysis

Entwicklung der pH-".ierte bei der Mutationskultur und bei der Veitorzüchtun^

pH-Wert

Muta ti onslcultur 6,8 bis 7,2 Weit erZüchtung 6,8 bis 8,8

609835/0897

Γ ~

Nachstehend sind einige Kennzeichen der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Komplexe mit biologischer Aktivität angegeben:

Ninhydrin-Reaktion: negativ

Biuret-Reaktion: positiv

Farbreaktion mit heißer Schwefelsäure: dunkel orangefarben.

Die Untersuchung der Komplexe mit biologischer Aktivität erfolg te in vitro. Tests haben außerdem ergeben, daß die antimikro» Meile und die antivirale Aktivität des erfindungsgemäß hergestellten Produkts in vivo wesentlich erhöht werden kann, wenn dem Nährmedium für die Weiter Züchtung zerkleinertes tierisches Gewebe zugesetzt wird, das dem Gewebe der Organe entspricht, die vor allem behandelt v/erden sollen.

en
Die Farbreaktion/des erfindungsgemäß erhaltenen Produkts mit Ninhydrin und Biuret zeigen, daß die Proteine nur teilweise abgebaut worden, da keine Aminosäuren freigesetzt werden. Es findet vielmehr ein Abbau zu Peptiden statt, die eine ausreichende zifizität behalten, so daß sie als "Übertrager" ("Vektoren") wirken, jedoch weder bei intravenöser, noch bei intramuskulärer Injektion einen Eiweißschock (Anaphylaxie) hervorrufen.

Diese Peptide wirken als "spezifische Stimulatoreii" und "Vektoren" von bestimmten immunologischen Faktoren. Ihre Eigenschaft als »Vektoren" läßt sich bei allen Arzneistoffen, denen sie zugesetzt werden, nutzen.

L -J

609835/0897

-I₁-

Von den biochemischen"Eigenschaften des erhaltenen Produkts im allgemeinen ist nachstehend dargelegte proteolytische Eigenschaft besonders hervorstehendί

1. Das Produkt mit biologischer Aktivität wird zunächst mit der der Mindestmenge eines Antiseptikums, die zur Zerstörung der durch Mutation erhaltenen Bakterien führt, sterilisiert;

2. ein Platindraht (oder ein anderer Draht aus einem nicht-

ein

oxidierenden Metall), ζ IB. /zur Beimpfung eines Mediums verwendeter Draht, wird in der Mitte des sterilisierten Mediums eingeführt;

3. unter aseptischen Bedingungen wird mit dem Platindraht ein Einstich in den Gelatine-Mährboden einer Kultur vorgenommen, die nicht mit einem Antiseptikurn behandelt wurde;

4. die Kultur wird bei 18°C gehalten.

Selbst bei dieser Temperatur, bei der die Aktivität der Enzyme stark vermindert ist, läßt sich eine Verflüssigung feststellen, die zunächst an der Oberfläche rund um die Einstichstelle auftritt und dann sackförmig fortschreitet; es kann sogar eine völlige Verflüssigung eintreten.

Die Verflüssigung aufgrund von Proteolyse entspricht einer Art "begrenzter Lysis". Es entsteht eine vollkommen transparente, zähflüssige Flüssigkeit, die mit einer aufgrund von bakteriolytiseher Verflüssigung entstandenen Flüssigkeit keine Ähnlichkeit hat, da diese wesentlich leichtflüssiger und trübe ist.

609835/0897

Dieses Kennzeichen des erhaltenen Produkts ergänzt die vorstehend beschriebenen Reaktionen mit Ninhydrin, Biuret und Schwefelsäure .

Das Beispiel erläutert die Erfindung.

B e i's ρ i e 1

Herstellung eines Produktes unter Verwendung.von tierischem Pankreas gey/ebe
2 Liter eines Nährmediums werden wie folgt hergestellt:

Peptone 36 g

Iprozentige Ammoniumeisencitrat- 8 ml lösung

Iprozentige Monokaliumphosphat- 2 ml lösung

Iprozentige Dinatriurnphosphat- 8 ml lösung

destilliertes Wasser auf 2000 ml

Pankreas (Schwein, entfettet und zerkleinert) 40 g

ρΗ-ΐ/ert eingestellt auf 6,8

Das Nährmedium wird 20 Hinuten bei 120⁰C sterilisiert, abkühlen gelassen und hierauf mit etwa 50 ml Kulturbrühe der Bakterienmutante (20 bis 36-stündige Züchtung) beimpft.

Nach 15-tägiger Züchtung bei 18°C wird die Kulturbrühe mit 30prozentiger Formaldehydlösung auf eine Formaldehydkonzentration von höchstens 1 ^c/o eingestellt und die Züchtung beendet. Die Brühe wird sodann einige Stunden gerührt und hierauf filtriert. Das erhaltene transparente FiItrat wird vorzugsweise

609835/0897

bei Temperaturen von 4 bis 1G^UC unter Lichtausschluß gelagert.

Mit dem er.f inclungs gemäß hergestellten Produkt werden folgende Versuche durchgeführt:

a) Zunächst wird bei zwei Kaninchen durch Einführung einer 20pi^lo".entigen Glucoselösung in einer Dosis von 4 ml/kg Körpergewicht in den ifegen ein erhöhter Blutzuckerspiegel hervorgerufen. Die Blutzuckor^orte sind in Tabelle 1 zusam

mengefaßt.

nachträglich JBeändert

TgIkO. la I

Versuchstier Nr. 1
1.4 k'f

Versuchstie
1 5

tier Nr. 2

20prozcntigG· Crlucoöelösung, lal

5,6

tern

0,96

OnI, s ι "!-

1,99

1,70

60 rain

0,92

0,00

90 rain

1,10

0-, 95

120 Hin

0,90

0,70

b) Nach vier Tagen wird den beiden Kaninchen, die gleiche Reaktion zeigen, noch einmol die gleiche liongc plucoso gegeben. Jeweils eine halbe· Stunde vor dor Glucoc.ogs.be werden dom Versuchstier Nr. 1 0,23 Einheiten Insulin (0^7 nl einer auf das 50-fache verdünnten Lösung von 20 Hinheiten/inl) und dem Versuchstier Nr. 2 0,75 ml des mit physiologischer Kochsalzlösung auf das 100-fache verdünnten, unter Verwendung von Pankreas erhaltenen Produkts i.v. injiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zußoioraong&faßt.

60983570897

BAD ORIGINAL

w g

Γί •r-l

C) Ci ¹

Γ!	C\\|
•Η	co
γ;
	O
ο
m
κ"	-ei-
•rl	ff·.
	O
O
OJ
el

r-l θΓ

e Oj

•Htfj Oi c-j t ο J-. S ^v-3 c

O*. O

ti

in co

tv

f ο } ο

r-!

Ö O •H

^>r? H

(D

IJ {H

O r ! U 2 C₁) N fcO-P -P ö,s4

(Xj LO "j:1

!A O

CM*

•Η ί-Ί

3« Γ' Cv! SI H

ρ κ Ei u U ω o-.-i ί-'-Ρ ί

.A.

CA

CO	C3	ta	C
fi)	r - "
	\j		7.3
	'Ci		C=ί
	O
P'	U	C-J
CO			ό
-O			O
H-!	•	r-i	V"
	C-J	R
r-i	f, I^- »	■■^
}.;	O	-d
	Si
LA	Gi
i>-	!>

CO O

	«
si
O
Ά	M
U	O)
*(·}*	•r-l
U	P

609835/0897

BAD ORIGINAL

Durch das Insulin wird nach einer gewissen Verzögerung ein plötzlicher Abfall des Blutzuckerspiegels hervorgerufen, , ' während das erfindungsgemäße, unter Verwendung von Pankreas erhaltene Produkt regulierend wirkt. Der Blutzuckerspiegel wird nicht merklich gesenkt und bei erhöhtem Blutzuckerspiegel tritt kein plötzlicher Abfall auf,.

2. Versuch am Menschen

Bei einer gesunden Versuchsperson wird in einem Zeitabstand von 48 Stunden jeweils der durch eine Dosis von 50 g Glucose hervorgerufene erhöhte Blutzuckerspiegel festgestellt. Vor der zweiten Untersuchung des Blutzuckerspiegels werden der Versuchsperson am Abend vorher sowie eine Stunde vor der Einnahme der Glucose jeweils 2 Tropfen des unter Vervendung von „ Pankreasgewebe erhaltenen Produkts verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.

Tabelle III

	nüch tern	30	Blutzuckerspiegel, g/Liter	min	60	min	90	min	120 min	180	min
1. Unter suchung	0,92	1,	45	1	20	1	05	0,80	1,	08
2. Unter- ' suchung (nach 48 Std.)	0,80	■1,	15	1	00	0	96	0,80	o,	88

Bei dem vorstehenden Versuch zeigt sich die stimulierende Wirkung des unter Verwendung von Pankreasgewebe erhaltenen Produkts r

603835/0891

Bei dem Versuch an Kaninchen zeigt sich außerdem noch eine regulierende Wirkung, vas besonders bei der Behandlung von Diabetes wichtig ist, da ein geringeres Risiko des plötzlichen Abfalls des Blutzuckerspiegels in die Hypoglykämie besteht.

Die Zusammensetzung der Medien zur Züchtung der Mutante und zur Weiterzüchtung sind nur beispielshalber angegeben, wobei das Mutationsmedium einen verhältnismäßig geringen Gehalt an Stickstoff aufweist und verhältnismäßig reich an schwefelhaltigen Aminosäuren ist und das Medium zur Weiterzüchtung hinsichtlich der Mineralsalze eine besondere Zusammensetzung aufweist. In beiden Fällen kann statt der Peptone eine andere Stickstoffquelle, z.B.eine Nährbouillon verwendet werden." Weiterhin kann in beid.en Fällen statt Amniönflüssigkeit jedes andere innere Körpersekret tierischer Herkunft verwendet werden. Die Züchtung kann im Brutschrank, im Wasserbad oder in einer klimatisierten Umgebung erfolgen. Die Mutation und/oder die Weiterzüchtung kann in üblichen Behältern, gegebenenfalls unter Rühren, mit Belüftung unter einem Schutzgas oder unter¹ einer isolierend.en Flüssigkeitsschicht erfolgen. Die Mutanten sind fakultative Aerobier. In den einzelnen Stadien der Inkubation können die Temperaturen um + 2⁰C gegenüber den vorstehend angegebenen variieren. Die pH-Werte der Endprodukte können je nach dem beabsichtigten therapeutischen Verwendungszweck entsprechend eingestellt werden. Die Produkte können zur Minderung oder Unterdrückung ihrer infektionsvorhindernden Wirkung physikalisch oder chemisch behandelt v/erden, wobei sie jedoch ihre Eigenschaften als »Vektoren" und/oder "Stimulatoren" beibehalten.

L ^J

609835/0897

Wie bereits erwähnt, weist das erfindungsgemäß hergestellte Produkt eine besondere Affinität und Spezifizität (selbst bei oraler Verabreichung, noch mehr jedoch bei parenteralcr Gabe) gegenüber den Geweben, Drüsen oder Organen auf, von denen es zumindest teilweise herstammt, was darauf zurückzuführen ist, daß dem Weiterzüchtungsmedium entsprechende Gewebe, Drüsen oder Organe tierischer Herkunft zugesetzt worden waren. Das Produkt ist daher (infolge seiner Wirkung als "Vektor") auf die entsprechenden Gewebe, Drüsen oder Organe "gerichtet", und die

■Wirksamkeit seiner verschiedenen biologischen und infektionsverhindernden Faktoren wird dadurch erheblich erhöht.

Demzufolge eignet sich ein unter Verwendung von Leber tierischer Herkunft erhaltenes Produkt als Wirkstoff zur Behandlung von Lebererkrankungen und wirkt als solches darüberhinaus stimulierend auf die Leber.

Die Wirkung als "Vektor" kann also in einer stimulierenden oder heilende Wirkung auf das zu behandelnde Organ und in einer synergistischen Wirkung zusammen mit möglicherweise zugesetzten weiteren Wirkstoffen bestehen.

Das erfindungsgemäß hergestellte Produkt kann in geeigneter Verdünnung als Lösung oral oder parenteral verabreicht werden.

Darüberhinaus kann das erfindungsgemäß hergestellte Produkt nach der Beendigung der WeiterZüchtung direkt zur Herstellung von Präparaten in fester Form, z.B. Dragees, Pillen oder Tabletten, zur oralen Verabreichung verwendet werden. _j

609835/0897

Ira gleichen Zustand oder in verdünnter Form kann das erfindungsgemäß hergestellte Produkt zu Suppositorien verarbeitet werden, wenn der Wirkstoff unter Umgehung des Verdauungstraktes und des parenteralen Weges verabreicht v/erden soll.

Darüberhinaus kann das erfindungsgemäß hergestellte Produkt auch gefriergetrocknet werden, wenn es als Grundbestandteil von komplexen Zubereitungen verwendet oder erst vor Gebrauch in Lösung gebracht werden soll.

Bei Verwendung als Kosmetika kann das Produkt Cremes oder Salben einverleibt werden.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Produkt mit biologischer v/irkung auf tierisches Gewebe eignet sich für zahlreiche therapeutische Verwendungszwecke. Es kann insbesondere Wirkstoffen zugesetzt werden, um deren Wirksamkeit zu erhöhen. Ss eignet sich zur Herstellung von allen Arzneimitteln, die parenteral oder oral verabreicht werden.

Beispielsweise kann man zur Behandlung einer Lungentuberkulose ein unter Verwendung von Lungengewebe und gleichzeitig ein unter Verwendung von Blut nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestelltes Produkt verwenden; bei einer Nierentuberkulose verwendet man ebenfalls ein unter Verwendung von Nierengewebe und gleichzeitig ein unter Verwendung von Blut nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestelltes Produkt.

_J 609835/0897

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Produkt läßt sich auch in der Kosmetik verwenden, ein Bereich, in dem seine Wirkung als "vektor" und Stimulator " besonders beachtlich ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich sogar zur Herstellung von pflanzenvaichsfordernden Mitteln verwenden. Im vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren werden dem Peptone enthaltenden Medium anstelle des tierischen Gewebes zerkleinerte junge Pflanzenkeimlinge zugesetzt. Dem Medium wird nach der Züchtung ein Antiseptikum zugesetzt; bei sehr schwacher Verdünnung in Wasser wird ein pflanz envaichsf orderndes Mittel erhalten.

609835/0897

Claims

Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung eines Produktes mit biologischer Aktivität gegenüber tierischem, menschlichem und pflanzlichen Gewebe durch Isolieren eines Bakterienstammes aus der Darmflora eines niederen Tieres, Mutieren des Bakterienstammes in einem flüssigen Nährmedium, Weiterzüchten der erhaltenen Mutante in einem Ammoniumaisen ei trat und mindestens ein Phosphat enthaltenden stickstoffreichen Nährmedium, wobei der Stickstoff in diesem Nährmedium teilweise aus einem tierischen, menschlichen oder pflanzlichen Gewebe entsprechend dem zu behandelnden Gewebe stammt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutante in dem Nährmedium das Bakterium Nr. NCIB 11 züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial einen Bakterienstamm aus der Darmflora eines Blutegels (hirudo medicinalis) oder dessen Larve verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Isolierung des als Ausgangsmaterial verwendeten Bakterienstammes frischen Blutagar mit einer Probe aus dem Darmtrakt des Blutegels beimpft und 2 bis 3 Tage bei 18 bis 22⁰C inkubiert, den als Ausgangsmaterial verwendeten Bakterienstamm isoliert und 3 bis 5 Tage bei 18 bis 22°c auf einem proteinhaltigen festen Medium züchtet.

609835/0897

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

man die Mutation des als Ausgangsmaterial verwendeten Bakterienstammes durch 9- bis 12-tägige Züchtung "bei Temperaturen von 17 bis 18°C in einem flüssigen Medium auslöst, das aus 2 g Pepton, 0,5 bis 1 g Methionin, 0,5 bis 1 g Cystin, 5 g Natriumchlorid und 1000 ml Wasser besteht, wobei der pH-v/ert des Mediums durch Zugabe von Natriumhydroxid auf 6,8 eingestellt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den durch die Mutation erhaltenen Bakterienstamm zur Erhaltung der Kultur periodisch alle 5 bis 8 Tage bei Temperaturen von 17 bis 18⁰C auf frischen Blutagar überimpft.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man die Mutante weiterzüchtet, indem man sie auf ein stickstoffreiches, vorher sterilisiertes Nähraedium überimpft, dessen Stickstoffgehalt 18 bis 20 g/Liter Pepton entspricht und das 5 g/Liter Natriumchlorid, 4 ml/Liter AEnnonrumeisencitrat in Iprozentiger Lösung, 1 ml/Liter Monokaliumphosphat in 1prozentiger Lösung und 4 ml/Liter Dinatriumphosphat in Iprozentiger Lösung sowie zerkleinertes tierisches Gewebe und/oder innere Sekrete tierischer Herkunft enthält, und 15 bis 20 Tage bei Temperaturen von 18 bis 20⁰C züchtet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet., daß man die erhaltene Kulturbrühe filtriert und mit einem Antiseptikum versetzt.'

ORIGINAL INSPECTED J

609835/0897