DE3751748T2

DE3751748T2 - Enkephalinase für therapeutische Verwendung

Info

Publication number: DE3751748T2
Application number: DE19873751748
Authority: DE
Inventors: Daniel B Borson; Malfroy-Camine Malfroy-Camine; Jay A Nadel
Original assignee: Genentech Inc; University of California
Current assignee: Genentech Inc; University of California
Priority date: 1986-12-24
Filing date: 1987-12-23
Publication date: 1996-11-14
Anticipated expiration: 2007-12-24
Also published as: IL84929A; DK684487D0; DK684487A; DE3751748D1; CA1322160C; NZ223029A; IE873536L

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Enkephalinase (E.C. 3.4.24.11) und neue Formen davon zur Behandlung pathologischer Zustände, die mit verschiedenen endogenen Peptiden in Zusammenhang stehen.
Es sind verschiedene endogene Peptide entdeckt worden, die in verschiedenen physiologischen Systemen aktiv zu sein scheinen. Beispielsweise wurden zwei Pentapeptide, die als Enkephaline bezeichnet werden, aus dem Gehirn extrahiert. Zu den Wirkungen von Enkephalinen zählen Analgesie, Temperaturregulierung, Beruhigung, gastrointestinale Funktionen und die Wirkung als Appetitanreger. Bis zur vorliegenden Erfindung wurde die Spaltung von Enkephalinen im Zentralnervensystem als einzige physiologische Wirkung von Enkephalinase angesehen (Schwartz, J.C. et al., "Trends Pharmacol. Sci." 6, 472-476 [1985]), von der bisher nicht bekannt ist, ob sie mit irgendeiner pathologischen Störung im Zusammenhang steht. Da eine derartige Wirkung zu einer Verstärkung von Schmerz führt, war die wissenschaftliche Forschung darauf konzentriert, Enkephalinase zu hemmen. Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich erstmals mit der therapeutischen Verwendung von Enkephalinase.
Von einem weiteren endogenen Peptid, Angiotensin II, wird angenommen, daß es einen Krankheitserreger für den pathologischen Zustand renaler Hypertonie darstellt. Bradykinin und Kallidin stehen mit anderen pathologischen Zuständen in Zusammenhang, wie mit akuter Entzündung in Verbindung mit Verbrennungen, rheumatischer Arthritis, Ödemen, Karzinoidsyndrom, Pankreatitis, Migräne, Reaktionen nach Transfusionen mit Plasmaprodukten, allergischen Erkrankungen, endotoxischem Schock und anaphylaktischem Schock.
Eine weitere Klasse endogener Peptide sind die Tachykinine, die teilweise die gleiche physiologische Wirkung haben. Zu den Tachykininen gehören Substanz P, Eledoisin, Neurokinin A und B, Physalaemin und Kassinin. Es wurde gezeigt, daß Substanz P mit der Kontraktion glatter Muskeln, Reizleitung, Schmerz, Husten, exokriner Sekretion, Gefäßerweiterung, erhöhter Gefäßdurchlässigkeit, erhöhtem Festsetzen von Leukozyten an Venolen, Stimulation polymorphnuklearer Leukozyten, Makrophagen, T-Lymphozyten und Degranulation von Mastzellen in Zusammenhang steht. Es wurde festgestellt, daß endogene Peptide, wie z. B. Bombesin, in endokrinen Zellen in normalen Lungen vorhanden ist (Cutz et al., "Experientia" 37, 765-767 [1981]), die von Karzinoidtumoren freigesetzt werden, und in den damit verbundenen Hautrötungen, Teleangiektasie, Diarrhoe und Bronchienverengung zum Ausdruck kommen.
Bombesin fungiert als Wachstumsfaktor für Atemwegsepithelzellen (Willey et al., "Exp. Cell Res." 153, 245-248 [1984]) und für Kleinzellen-Lungenkrebs beim Menschen (Cuttitta, F. et al., "Nature" 316, 823-826 [1985]). Es wurde gezeigt, daß Substanz P und Bombesin neben ihren mit Tumoren in Zusammenhang stehenden Wirkungen die Pulmonalarterie und die Atemwege verengen. Im Lichte der Beobachtungen der vorliegenden Erfindung können diese endogenen Peptide verschiedene pathophysiologische Erkrankungen, einschließlich von Asthma bronchiale und hypoxische Lungengefäßverengung, mildern. Einige Peptide sind chemotaktisch, z. B. eosinophiler chemotaktischer Faktor, C&sub3;a und Substanz P. Sie werden an der Entzündungsstelle erzeugt und ziehen verschiedene immunologische Zellen, einschließlich von Neutrophilen, zu dieser Stelle hin. Schließlich haben auch andere Peptide, wie Cholezystokinin, Somatostatin, Oxytocin und Caerulin starke Wirkungen auf verschiedene Gewebe, die andere pathologische Störungen verursachen können.
Enkephalinase wurde aus der Niere (Kerr, M.A. und Kenny, A.J., "Biochem. J." 477-488 [1974], Gafford, J. et al., "Biochemistry" 22, 3265-3271 [1983] und Malfroy, B. und Schwartz, J.C., "Life Sci." 31, 1745-1748 [1982]), aus dem Darm (Danielsen, E.M. et al., "Biochem. J." 191, 545-548 [1980]), aus der Hypophyse (Orlowski, M. und Wilk, S., "Biochemistry" 20, 4942-4945 [1981]), aus dem Gehirn (Relton, J.M. et al., "Biochem. J." 215, 755-762 [1983]) und aus den Lymphknoten (Bowes, M.A. und Kenny, A.J., "Biochem. J." 236, 801-810 [1986]) isoliert. Enkephalinase wurde in vielen peripheren Organen (Llorens, C. und Schwartz, J.C., "Eur. J. Pharmacol." 69, 113-116 [1981]) und in menschlichen Neutrophilen (Connelly, J.C. et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. [USA]" 82, 8737-8741 [1985]) nachgewiesen. Die Verteilung von Enkephalinase im Gehirn ist weitgehend parallel zu jener von Enkephalinen (Llorens, C. et al., "J. Neurochem." 39, 1081-1089 [1982]). Aus den Beobachtungen der vorliegenden Erfindung geht hervor, daß Enkephalinase auch in jenen peripheren Geweben und Zellen vorhanden ist, die auf endogene Peptide ansprechen. Enkephalinase ist ein membrangebundenes Glykoprotein mit Untereinheit Mr-Werten im Bereich von 87.000 bis 94.000. Schwankungen bei den Mr-Werten sind Unterschieden im Ausmaß und Muster der Glykosylierung zuzuschreiben.
Die Substratspezifität von Enkephalinase wurde unter Verwendung des Enzyms aus der Niere von Ratten und des Menschen untersucht. Malfroy, B. und Schwartz, J.C., "J. Biol. Chem." 259, 14365-14370 (1984); Gafford et al., "Biochemistry" 22, 3265-3271 (1983); und Pozsgay, M. et al., "Biochemistry" 25, 1292-1299 (1986). Diese Untersuchungen weisen darauf hin, daß Enkephalinase vorzugsweise Peptidbindungen von Aminogruppen hydrophober Reste hydrolysiert, eine deutliche Preferenz für kurze Peptide aufweist und am effizientesten ist, wenn sie als Dipeptidylcarboxypeptidase wirkt, die ein Dipeptid mit Carboxy-Terminus freisetzt. Enkephalinase, die in zerebralen synaptischen Membranen nachgewiesen wurde, spaltet effizient die Gly³-Phe&sup4;-Amidbindung von Enkephalinen (Malfroy, B. et al., "Nature" (Lond.) 276, 523-526 [1978]). Es wurde auch festgestellt, daß Enkephalinase das Heptapeptid (Met&sup5;)-Enkephalin-Arg&sup6;-Phe&sup7; (Schwartz, J.C. et al., in "Proceedings International Union of Pharmacology 9th Congress of Pharmacology" 3, J.F. Mitchell et al. (Hrsg.), 277-283, Mc Millan Press Ltd., London, [1984]) sowie eine Vielzahl anderer Neuropeptide spaltet, wie z. B. Cholezystokinin (Zuzel, K.A. et al., "Neuroscience" 15, 149-158 [1985]), Substanz P (Horsthemke, B. et al., "Biochem. Biophys. Res. Comm." 125, 728-733 [1984]), Neurotensin (Checler et al., 1983), Angiotensin I und Angiotensin II (Matsas et al., Biochem. J." 223, 433 [1984] und Gafford et al., "Biochemistry" 22, 3265 [1983]), Kinine, z. B. Bradykinin (Gafford, J.T. et al., "Biochemistry 22, 3265-3271 [1983]), Oxytocin (Johnson et al., 1984) und Somatostatin (Mumford, R.A. et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. [USA]" 78, 6623-6627 [1981]). Während Enkephalinase zwar fähig ist, viele biologische Peptide in vitro zu hydrolysieren (Kenny, A.J., "Trends in Biochem. Sci." 11, 40-42 [1986]), war Enkephalinase in vivo bisher nur an der Hydrolyse von endogenen Enkephalinen bei Freisetzung im Gehirn beteiligt (Schwartz, J.C. et al., "Life Sciences" 29, 1715-1740 [1981] und Lecomte, J.M. et al., "J. Pharmacol. Exp. Ther." 237, 937-944 [1986]). Obwohl die Mengen an Enkephalinase im Blut normalerweise sehr gering sind (Connelly et al., siehe oben), wurde Enkephalinase in hohen Mengen im Serum von Patienten nachgewiesen, die an Adult-Respiratory-Distress-Syndrom leiden (Connelly et al., siehe oben). Enkephalinase spaltet das chemotaktische Tripeptid fMet-Leu-Phe (ebenda). Es wurde auch beobachtet, daß Neutrophile von Spendern, die Raucher waren, etwa doppelt so hohe Enkephalinase-Aktivitäten aufwiesen wie jene von Nichtrauchern (ebenda). Enkephalinase wurde auch in großen Mengen in den Microvilli von menschlicher Plazenta gefunden (Johnson, A.R. et al., "Peptides" 5, 789-796 [1984]).
Die vorliegende Erfindung basiert auf den neuen Beobachtungen, daß spezifische Inhibitoren von Enkephalinase, Thiorphan, Leucin-Thiorphan und Phosphoramidon die durch endogene Peptide, wie z. B. Substanz P und andere Tachykinine, sowie Kinine, wie z. B. Bradykinin, hervorgerufene Atemwegs-Schleimabsonderung und die Kontraktion glatter Muskeln verstärken. Die Erfindung basiert auch auf der neuen Beobachtung, daß Enkephalinase in vivo von Substanz P herbeigeführte Zunahmen der Gefäßdurchlässigkeit hemmt. Es ist bekannt, daß Enkephalinase Substanz P in zwei Fragmente spaltet, von denen beobachtet wurde, daß sie nicht die Schleimabsonderung und/oder die Kontraktion glatter Muskeln stimulieren. Die Erfindung basiert auch auf der Beobachtung, daß Enkephalinase chemotaktische Moleküle spaltet und so die Anziehung verschiedener Entzündungszellen, einschließlich von Neutrophilen, zur Stelle der Verletzung hemmen kann.
Gemäß vorliegender Erfindung kann Enkephalinase verwendet werden, um eine therapeutische Zusammensetzung zur Behandlung pathologischer Zustände bereitzustellen, an denen endogene Peptide beteiligt sein können. Im speziellen kann Enkephalinase als Therapiemittel verwendet werden, um die negativen Wirkungen von Substanz P oder anderer Neuropeptide aufzuheben. Im speziellen kann Enkephalinase verwendet werden, um peptid-vermittelte Schleimabsonderung und Bronchienverengung in den Atemwegen als Folge verschiedener Erkrankungen, wie z. B. Asthma, chronischer Bronchitis, Mukoviszidose und viralen Infektionen, herabzusetzen. Enkephalin kann auch als Therapiemittel zur Behandlung verschiedener Tumore, wie z. B. Karzinoidtumore und Kleinzellen-Karzinom der Lunge, eingesetzt werden. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Enkephalinase-Derivaten zur Behandlung verschiedener pathologischer Störungen, die durch bestimmte endogene Peptide vermittelt werden. Andere peptid-vermittelte Störungen können im Magen-Darm-Trakt, in den Sehorganen, im Harntrakt, im Kreislaufsystem, in den Fortpflanzungsorganen und den Gelenken entstehen. Die in der Zytoplasma- und/oder in der Transmembran-Domäne gelöschte oder substituierte Enkephalinase kann zur Behandlung verschiedener pathologischer Störungen eingesetzt werden, die durch bestimmte endogene Peptide vermittelt werden.
Die vorliegende Erfindung basiert auf den neuen Beobachtungen, daß die Wirkungen endogener Peptide, wie z. B. Substanz P und anderer Tachykinine, und/oder von Bradykinin auf die Schleimabsonderung und die Kontraktion glatter Muskeln in den Atemwegen durch spezifische Enkephalinase-Inhibitoren verstärkt werden. Die Erfindung betrifft die Verabreichung therapeutischer Zusammensetzungen, die Enkephalinase oder Derivate davon umfassen, zur Behandlung bestimmter pathologischer Störungen, die durch verschiedene endogene Peptide vermittelt werden, wie beispielsweise Bronchienverengung, Hypersekretion in den Atemwegen, akute Entzündung oder Hyperimmunreaktionen, systemischer Bluthochdruck, Husten, Unfruchtbarkeit oder Krebs.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1:

Konzentrationsabhängigkeit der durch Substanz P (SP) herbeigeführten Sekretion (Mittelwert ± SD), gemessen als Freisetzung von ³&sup5;SO&sub4;-markierten Makromolekülen (Sulfatfluß). Gewebe von 6 Frettchen wurden mit SP in den angegebenen Konzentrationen inkubiert, und die Änderung im Sulfatfluß für jedes Gewebe wurde berechnet, indem der Fluß von gebundenem SO&sub4; einer unmittelbar vor der Zugabe von SP gezogenen Probe vom Fluß von gebundenem SO&sub4; einer entweder 15 oder 30 min nach der Zugabe von SP gezogene Probe, je nachdem, welcher größer war, subtrahiert wurde. Als Vergleich (B) wird die durchschnittliche Änderung der Grundlinien-Sekretion (B) innerhalb der 15 min vor der Zugabe von SP angegeben. SP stimulierte die Freisetzung von ³&sup5;SO&sub4;-markierten Makromolekülen in Abhängigkeit von der Dosis.

Fig. 2:

Auswirkungen von Fragmenten von Substanz P (SP) auf den Sulfatfluß von zwei Körperteilen eines Frettchens. Gewebe wurden in Kammern mit ³&sup5;SO&sub4; auf der Luminalseite inkubiert, und nach 3 h wurden SP-Fragmente den Schleimhautseiten der Kammern zugegeben. Links: C-terminales Fragment, SP 6-11 (10&supmin;&sup5; M), stimulierte Sekretion. Rechts: N-terminales Fragment, SP 1-9 (10&supmin;&sup5; M), hatte keine wesentliche Auswirkung auf die Sekretion.

Fig. 3:

Auswirkung von Proteinase-Inhibioren auf die durch Substanz P (SP) induzierte Änderung im Sulfatfluß eines Frettchen-Gewebes. Links: Vergleichsgewebe, inkubiert mit ³&sup5;SO&sub4; und mit SP (10&supmin;&sup6; M) versetzt. Rechts: mit der im Text beschriebenen Kombination von 9 Proteinase-Inhibitoren (9 INHIB) vorbehandeltes Gewebe verstärkte die Sekretionsreaktion auf SP (10&supmin;&sup6; M).

Fig. 4:

Auswirkungen von Proteinase-Inhibitoren auf durch Substanz P (SP) herbeigeführte Änderung des Sulfatflusses (Mittelwert ± SD) von Luftröhren-Geweben von Frettchen. Leere Balken: Reaktion auf SP (10&supmin;&sup6; M) in den Vergleichsgeweben jeder Gruppe. Schraffierte Balken: Reaktion auf SP 10&supmin;&sup6;M in mit 9 Proteinase-Inhibitoren (9 INHIB; 10 µg/ml), Phosphoramidon (10&supmin;&sup5; M; PHOSP), Thiorphan (10&supmin;&sup4; M; THIOR), Captopril (10&supmin;&sup4; M; CAPTO), Teprotid (10&supmin;&sup4; M; TEPRO) oder anderen Inhibitoren (ANDERE), einschließlich von Leupeptin, Aprotonin, Bacitracin, Rinderserumalbumin (jeder Inhibitor 10 µg/ml) oder Bestatin (10- M), vorbehandelten Geweben. *: p < 0,05. Nur Phosphoramidon und Thiorphan (Enkephalinase-Inhibitoren) verstärkten die sekretionsfördernden Wirkungen von SP.

Fig. 5:

Auswirkungen erhöhter Konzentrationen des Enkephalinase-Inhibitors Thiorphan auf den durch Substanz P (SP) herbeigeführten Sulfatfluß von Luftröhrensegmenten von 6 Frettchen (Mittelwert ± SD). Volle Balken: Zunahme des Sulfatflusses während der 15 min vor der Wirkstoff-Zugabe. Gepunktete Balken: Zunahme des Sulfatflusses nach der Zugabe von Thiorphan in den angegebenen Konzentrationen. Schraffierte Balken: Zunahme des durch SP (10.6 M) herbeigeführten Sulfatflusses. *: p < 0,05; verglichen mit der spontanen Zunahme des Sulfatflusses; n=6. **: p < 0,05; verglichen mit der Reaktion auf SP in Vergleichsgeweben; n=6. Thiorphan verstärkte die durch SP herbeigeführte Wirkung auf die Sekretion in Abhängigkeit von der Dosis.

Fig. 6:

Auswirkungen von Tachykininen plus Enkephalinase-Inhibitor Phosphoramidon auf die Freisetzung von ³&sup5;SO&sub4;-markierten Makromolekülen aus Frettchen-Luftröhren. Voller Balken: Änderung des Sulfatflusses während eines 15-minütigen Grundlinienzeitraums (BL) ohne Wirkstoff. Leere Balken: Reaktionen auf die Tachykinine: Substanz P (SP), Neurokinin A (NK-A), Neurokinin B (NK-B), Physalaemin (PHYS), Eledoisin (ELED) und Kassinin (KASS) (jeder Wirkstoff: 10&supmin;&sup5; M). Schraffierte Balken: Reaktionen auf Tachykinine nach der Vorbehandlung der Gewebe mit Phosphoramidon (10&supmin;&sup5; M). *: p < 0,05 verglichen mit der Grundlinie. **: p < 0,05 verglichen mit der Reaktion auf die gleichen Tachykinine in Abwesenheit von Phosporamidon. Phosphoramidon verstärkte die sekretionsfördernde Wirkung jedes Tachykinins.

Fig. 7:

Auswirkungen von Trypsin auf die Enkephalinase-Aktivität und durch Substanz P herbeigeführte Schleimabsonderung bei 3 Frettchen. Oben: Enkephalinase-Aktivität in Lungen-Homogenaten, ausgedrückt als Abbau von (³H-Tyr¹, DAla², Leu&sup5;)-Enkephalin. Unten: Voller Balken: Änderung der Schleimabsonderung während eines 15-minütigen Grundlinien-Zeitraums ohne Wirkstoff. Leerer Balken: Reaktion auf Substanz P (SP). Gepunkteter Balken: Änderung der Schleimabsonderung nach der Zugabe von Trypsin. Schraffierter Balken: Änderung der durch SP herbei geführten Schleimabsonderung in mit Trypsin vorbehandelten Geweben. Daten sind Mittelwerte ± SD. Trypsin senkt die Enkephalinase-Aktivität und verstärkt die durch Substanz P herbeigeführte Sekretion.

Fig. 8:

Auswirkungen von Substanz P (SP) plus Enkephalinase-Inhibitor Leu-Thiorphan auf die aktive Spannung in isolierten Segmenten in glatten Luftröhren-Muskeln eines Frettchens. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD von 12 Frettchen (SP ≤ 10&supmin;&sup6; M) oder 6 Frettchen (SP ≥ 5 · 10&supmin;&sup6; M) angegeben. Wesentliche Unterschiede zu entsprechenden Vergleichswerten sind gekennzeichnet durch: * = p < 0,05; ** = p < 0,01; *** = p < 0,001. Substanz P alleine (leere Quadrate) erhöhte die Spannung, aber nur in Konzentrationen von 5 · 10&supmin;&sup6; M und darüber. Leu-Thiorphan (volle Kreise) verursachte eine Verschiebung der Dosis/Reaktion-Kurve zu niedrigeren SP-Konzentrationen.

Fig. 9:

Auswirkungen von Rezeptor-Antagonisten auf die durch Substanz P (10&supmin;&sup6; M) in Gegenwart des Enkephalinase-Inhibitors Leu-Thiorphan (10&supmin;&sup5; M) in isolierten Segmenten glatter Frettchen-Luftröhrenmuskeln hervorgerufene, aktive Spannung. Jeder Punkt ist der Mittelwert ± SD der von jedem Antagonisten hervorgerufenen Abnahmen der Spannung verglichen mit den entsprechenden Vergleichsreaktionen auf SP plus Leu-Thiorphan. Wesentliche Unterschiede zu Vergleichswerten werden gekennzeichnet durch: * = p < 0,05; *** = p < 0,01. Der Muscarin-Antagonist Atropin (10&supmin;&sup5; M), der SP-Antagonist (DPro², DTrp7,9)-SP (10&supmin;&sup5; M) und eine Kombination beider Wirkstoffe verringerte die durch SP plus LeuThiorphan herbeigeführten Kontraktionen beträchtlich; die Wirkung des SP-Antagonisten war stärker als jene von Atropin.

Fig. 10:

Auswirkungen von Substanz (SP) plus Enkephalinase-Inhibitor Leu-Thiorphan auf die durch Stimulation durch ein elektrisches Feld (5 Hz) in isolierten Segmenten von glatten Frettchen-Luftröhrenmuskeln hervorgerufene, aktive Spannung. Die Daten werden als Prozentsatz der Vergleichsreaktionen auf die Stimulation durch ein elektrisches Feld ohne Zugabe von Wirkstoffen ausgedrückt und werden als Mittelwert ± SD (n=10 bei 10&supmin;&sup5; M; n=4 bei 10&supmin;&sup4; M) angegeben. Wesentliche Unterschiede zu SP allein oder SP plus Leu-Thiorphan sind gekennzeichnet durch: * = p < 0,05; *** = p < 0,001. Substanz P allein verstärkte die Kontraktionsreaktionen auf Stimulation durch ein elektrisches Feld, und diese Verstärkung wurde durch Leu-Thiorphan noch erhöht.

Fig. 11:

Auswirkungen des Enkephalinase-Inhibitors Leu-Thiorphan und des Substanz P-(SP-)Antagonisten (DPro², DTrp7,9)-SP auf die durch Stimulation durch ein elektrisches Feld (5 Hz) in isolierten Segmenten von glatten Frettchen-Luftröhrenmuskeln hervorgerufene, aktive Spannung. Die Daten werden als Prozentsatz der Vergleichsreaktionen auf Stimulation durch ein elektrisches Feld ohne Zugabe von Wirkstoffen ausgedrückt und als Mittelwert ± SD (n=10) angegeben. Wesentliche Unterschiede zu den Vergleichswerten sind gekennzeichnet durch: *** = p < 0,01. Leu-Thiorphan verstärkte die durch Stimulation durch ein elektrisches Feld erzeugten Kontraktionen, und diese Verstärkung wurde durch den SP-Antagonisten (10&supmin;&sup5; M) gehemmt.

Fig. 12:

Auswirkung von Substanz P (SP) (Dreiecke), Neurokinin A (NK-A) (Kreise) und Neurokinin B (NK-B) (Quadrate) sowie des Enkephalinase-Inhibitors Leu-Thiorphan auf die aktive Spannung in isolierten Segmenten von glatten Luftröhrenmuskeln von Frettchen. Die Daten werden als Prozentsatz der Reaktion auf Actylcholin (10&supmin;³ M) ausgedrückt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD von 10 Frettchen (10&supmin;&sup6; M) und 5 Frettchen (10&supmin;&sup5; M) angegeben. Es wurden für jedes Tachykinin wesentliche Unterschiede zwischen den Kontraktionen mit und ohne Leu-Thiorphan (10&supmin;&sup5; M) erzielt. Leu-Thiorphan (volle Symbole) verursachte eine Verschiebung der Dosis/Reaktion-Kurven zu niedrigeren Konzentrationen. Obwohl NK-A in Abwesenheit von Leu- Thiorphan wirksamer war als NK-B, gab es in Gegenwart von Leu-Thiorphan (10&supmin;&sup5; M) keine wesentlichen Unterschiede zwischen NK-A und NK-B in der Muskelkontraktion.

Fig. 13:

Auswirkung zunehmender Konzentrationen des Enkephalinase-Inhibitors Leu-Thiorphan auf die durch Substanz P (SP), Neurokinin A (NK-A) und Neurokinin B (NK-B) in isolierten Segmenten von glatten Frettchen-Luftröhrenmuskeln herbeigeführte, aktive Spannung. Die Daten werden als Prozentsatz der Reaktion auf Acetylcholin (10&supmin;³ M) ausgedrückt und als Mittelwert ± SD (n=5 bei 10&supmin;&sup5; M; n=3 bei 3 · 10&supmin;&sup5; M) angegeben. Leu-Thiorphan verstärkte die durch jedes Tachykinin induzierten Kontraktionen in Abhängigkeit von der Dosis.

Fig. 14:

Auswirkung von Substanz P (SP), Neurokinin A (NK-A) und Neurokinin B (NK-B) sowie des Tachykinin-Rezeptor-Antagonisten (DPro², DTrp7,9)-SP auf die durch Stimulation durch ein elektrisches Feld (5 Hz) in isolierten Segmenten von glatten Frettchen-Luftröhrenmuskeln hervorgerufene, aktive Spannung. Die Daten werden als Prozentsatz der Vergleichsreaktionen auf die Anregung durch ein elektrisches Feld ohne Zugabe von Wirkstoffen ausgedrückt. Jedes Tachykinin verstärkte die elektrisch herbeigeführte Kontraktion. SP hatte die stärkste Wirkung. Der Tachykinin-Rezeptor-Antagon ist hemmte diese Verstärkung.

Fig. 15:

Auswirkung zunehmender Konzentrationen von Bradykinin (A) oder Lys-Bradykinin (B) und des Enkephalinase-Inhibitors Leu-Thiorphan (10&supmin;&sup5; M) auf die aktive Spannung in isolierten Segmenten von glatten Frettchen-Luftröhrenmuskeln. Die Daten sind als Prozentsatz der Reaktion auf Acetylcholin (10&supmin;³) ausgedrückt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD angegeben. Wesentliche Unterschiede zwischen den Kontraktionen mit und ohne Leu-Thiorphan werden durch * = p < 0,05 gekennzeichnet. Bradykinin und Lys-Bradykinin erhöhten die aktive Spannung in Abhängigkeit von der Dosis. Leu-Thiorphan verursachte eine Verschiebung beider Dosis/Reaktion-Kurven zu niedrigeren Konzentrationen.

Fig. 16:

Auswirkung erhöhter Konzentrationen von Substanz P und des Enkephalinase-Inhibitors Leu-Thiorphan (10&supmin;&sup5; M) auf die aktive Spannung in isolierten Längssegmenten von glatten Frettchen-Ileummuskeln. Substanz P alleine (leere Dreiecke) verursachte eine erhöhte Spannung in Abhängigkeit von der Dosis. Der Enkephalinase-Inhibitor Leu-Thiorphan (volle Dreiecke) verstärkte die durch Substanz P herbeigeführten Kontraktionen.

Fig. 17a-b:

Fig. 17a und 17b werden nachstehend als Fig. 17 bezeichnet. Aminosäuresequenz von Ratten-Enkephalinase.

Fig. 18a-b:

Fig. 18a und 18b werden nachstehend als Fig. 18 bezeichnet. Aminosäuresequenz von menschlicher Enkephalinase.
Enkephalinase hydrolysiert vorzugsweise Peptidbindungen der Aminogruppe eines hydrophoben Rests, wobei kurze Peptide deutlich bevorzugt sind. Die Verwendung von Enkephalinase als Therapiemittel für pathologische Zustände ergibt sich aus den Beobachtungen der vorliegenden Erfindung, wobei als Beispiele die Luftwegsreaktionen und die Auswirkungen auf die Kapillardurchlässigkeit herangezogen werden, die aus der Freisetzung endogener Peptide, wie z. B. Substanz P oder Bradykinin, resultieren. Enkephalinase, die auch als neutrale Endopeptidase oder neutrale Nieren-Bürstenbesatz-Proteinase (E.C. 3.4.24.11, empfohlener Name der Enzyme Comission) bekannt ist, sowie Derivate davon können als Therapiemittel zur Behandlung dieser verschiedenen pathologischen Zustände verwendet werden. Die Versuche werden nachstehend im Detail beschrieben.
Endogene Peptide, wie z. B. Enkephaline, Angiotensin I und Angiotensin II, Cholezystokinin, Tachykinine, wie z. B. Substanz P, Neurokinin A oder B, Physalaemin, Eledoisin, Kassinin, Kinine, wie z. B. Bradykinin, Lys-Bradykinin (Kallidin), andere Peptide, wie Neurotensin, Oxytocin, Somatostatin, Bombesin und chemotaktische Faktoren, beispielsweise eosinophile chemotaktische Faktoren, sind bei verschiedenen physiologischen und pathologischen Zuständen involviert. Beispiele für die Wirkungen sind Hautrötungen, Telangiectasie, Diarrhoe und Bronchienverengung, die aus der Freisetzung verschiedener Peptide, wie z. B. Substanz P, Bradykinin und Bombesin, aus Karzinoidtumoren resultieren.
Zirkulierendes Angiotensin I wird von angiotensin-konvertierendem Enzym (ACE) in Angiotensin II, ein starkes gefäßverengendes Mittel, umgewandelt. Systemische Hypertonie kann durch die Auswirkungen von Angiotensin II entstehen. Die gegenwärtige Therapie für systemische Hypertonie umfaßt die Verhinderung der Umwandlung von Angiotensin I in Angiotensin II durch Hemmung von ACE. Husten ist eine Nebenwirkung dieser Behandlung mit ACE-Inhibitoren, und es wird angenommen, daß er auf die Hemmung der Zerstörung von Husten erzeugenden Peptiden (z. B. Bradykinin) zurückzuführen ist. Enkephalinase baut Angiotensin I und II ab, und kann daher als Antihypertonikum dienen. Enkephalinase sollte durch die Spaltung Husten erzeugender Peptide, wie z. B. Bradykinin, als Nebenwirkung der Antihypertonie-Therapie Husten ausschalten. Ein weiterer pathologischer Zustand ist die durch Tachykinin vermittelte übermäßige Schleimabsonderung durch die submukösen Drüsen der Trachea nach Reizung des Atemwegsepithels, beispielsweise durch ein Allergen. Zusätzlich zur Schleimabsonderung besteht eine gewisse Wahrscheinlichkeit des Auftretens von: Entzündung, erhöhte Kapillardurchlässigkeit, Neutrophilchemotaxis, Ödem und Kontraktion der glatten Bronchienmuskeln (Bronchienverengung). In der Haut erzeugen erhöhte Mengen von Tachykininen oder Kininen Abfolgen von Symptomen, die allgemein als Dermatitis bezeichnet werden, einschließlich von Schmerz, jucken, Rötung sowie Hitzegefühl und Blasenbildung. Tachykinine, die im Magen-Darm- und im Harntrakt freigesetzt werden, sind mit der Absonderung von z. B. Speichel aus der Ohrspeicheldrüse, Kontraktion der glatter Muskeln von Ileum und Ösophagus, Einflüssen auf die Häufigkeit des Urinierens, Stimulation der Abscheidung von Wasser und Elektrolyten aus dem Jejunum und der exokrinen Pankreassekretion in Zusammenhang gebracht worden. Tachykinine fördern auch die Embryoeinnistung.
Die in dieser Beschreibung angeführten Daten beweisen, daß Enkephalinase innerhalb der Atemwege Substanz P und andere endogene Peptide zu inaktiven Metaboliten zersetzt. Diese Inaktivierung ist ein Mechanismus zur Abschwächung der Auswirkungen endogener Peptide auf Schleimabsonderung und Bronchienverengung. Das basiert auf der Beobachtung, daß Thiorphan und Phosphoramidon, spezifische Inhibitoren von Enkephalinase, die Sekretions- und Kontraktionsreaktionen auf Substanz P und andere Peptide in Abhängigkeit von der Konzentration verstärkten. Es wurde gezeigt, daß die Inhibitoren von Enkephalinase keine direkten Auswirkungen auf die Schleimabsonderung oder Muskelkontraktion haben. Die Wirkungen der Enkephalinase-Inhibitoren und exogener Tachykinine auf die Schleimabsonderung wurden beobachtet, nachdem diese an die submuköse Oberfläche von Luftröhrengewebe verabreicht wurden. Inhibitoren anderer Enzymsysteme veränderten die endogene, peptidinduzierte Sekretion nicht. Beispielsweise ist bekannt, daß angiotensin-konvertierendes Enzym (ACE) in der Lunge vorhanden ist und Substanz P abbaut. Spezifische Inhibitoren von ACE verstärken die durch Substanz P herbeigeführte Sekretion oder Bronchienverengung allerdings nicht. Auf ähnliche Weise verstärkten Inhibitoren von Serinproteasen, d. h. Proteasen, die von verschiedenen Zellen (einschließlich von Neutrophilen und Mastzellen) ausgeschieden werden, die durch Substanz P vermittelte Schleimabsonderung von Luftröhrengewebe nicht. Es wurde auch beobachtet, daß Leu- Thiorphan die durch Substanz P herbeigeführte Kontraktion glatter Muskeln von Ileumgewebe verstärkt, was darauf hinweist, daß in Magen-Darm- Ileum-)Gewebe vorhandene Enkephalinase die durch Substanz P induzierten Effekte hemmt. Es wurde auch beobachtet, daß der Enkephalinase-Inhibitor Leu-Thiorphan die durch Bradykinin und Kallidin (Lys-Bradykinin) herbeigeführte Kontraktion der glatten Muskeln des Atemwegsgewebes hemmt. Das zeigt, daß endogene Enkephalinase Kinine und Tachykinine inaktiviert. Somit scheint Enkephalinase eine Rolle bei der Modulation der durch endogenes Peptid vermittelten Schleimabsonderung und/oder Kontraktion der glatten Muskeln in den Atemwegen zu spielen. Es wurde gezeigt, daß intravenös injizierte Enkephalinase die durch Substanz P herbeigeführte Extravasation von Farbstoff bei Ratten hemmt. Das liefert einen direkten Hinweis darauf, daß dem Körper verabreichte Enkephalinase peptid-induzierte Effekte verhindern kann. Die Verabreichung von Enkephalinase oder Derivaten davon als Aerosol würde das Therapiemittel der Luftröhre lokal zuführen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Enkephalinase" oder "Enkephalinase-Derivate" auf Proteine, die enzymatisch aktiv oder mit enzymatisch aktiver Enkephalinase immunologisch kreuzreaktiv sind. In einem Assay, wie von Llorens et al. (1982) beschrieben, kann enzymatisch funktionelle Enkephalinase die Gly³-Phe&sup4;-Amidbindung von ³H-(DAla², Leu&sup5;)-Enkephalin spalten.
Enkephalinase oder Enkephalinase-Derivate können unter Anwendung bereits beschriebener Reinigungsverfahren, siehe z. B. Malfroy und Schwartz, "J. Biol. Chem." 259, 14365-14370 (1984), oder auf rekombinantem Weg hergestellt werden, wie in der gleichzeitig mit vorliegender Anmeldung eingereichten, parallelen EP-Anmeldung mit Priorität der US-Anmeldung Nr. 06/946.566 vom 24. Dezember 1986, beschrieben.
Der Begriff Enkephalinase, wie hierin verwendet, umfaßt Enkephalinase mit nativer Glykosylierung und die Aminosäuresequenzen der Enkephalinase von Ratten und Menschen, wie in Fig. 17 oder 18 dargelegt, analoge Enkephalinasen von anderen Tierarten, wie z. B. Rind, Schwein und dergleichen, deglykosylierte oder unglykosylierte Derivate derartiger Enkephalinasen, Aminosäuresequenzvarianten von Enkephalinase und in vitro erzeugte, kovalente Derivate von Enkephalinasen. Alle diese Enkephalinase-Formen sind enzymatisch aktiv.
Aminosäuresequenz-Varianten von Enkephalinase fallen in eine oder mehrere von drei Klassen: Substitutions-, Einfügungs- oder Löschungsvarianten. Aminosäuresequenzvarianten sind durch die vorbestimmte Art der Variation gekennzeichnet, ein Merkmal, das sie von der natürlich auftretenden, Allel- oder Interspezies-Variation der Enkephalinase-Aminosäuresequenz unterscheidet. Die Varianten weisen typischerweise die gleiche qualitative biologische Aktivität auf wie das natürlich auftretende Analog, obwohl Varianten auch so gewählt werden, daß sie die Eigenschaften von Enkephalinase modifizieren, wie nachstehend detaillierter beschrieben wird.
Aminosäuresubstitutionen umfassen typischerweise einzelne Reste; Einfügungen liegen üblicherweise in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten; und Löschungen liegen im Bereich von etwa 1 bis 30 Resten. Löschungen oder Einfügungen werden üblicherweise an benachbarten Paaren vorgenommen, d. h. eine Löschung von 2 Resten oder eine Einfügung von 2 Resten. Es können Substitutionen, Löschungen, Einfügungen oder beliebige Kombination davon kombiniert werden, um ein fertiges Derivat zu erreichen.
Substitutionsvarianten sind jene, bei denen zumindest ein Rest in den Sequenzen aus Fig. 17 oder 18 entfernt und ein anderer Rest an seiner Selle eingefügt wurde. Derartige Substitutionen werden im allgemeinen, falls gewünscht wird, die Eigenschaften von Enkephalinase leicht zu modulieren, gemäß folgender Tabelle 1 durchgeführt.

TABELLE 1

Ursprünglicher Rest Beispiel für die Substitution

Ala ser
Arg lys
Asn gln; his
Asp glu
Cys ser
Gln asn
Glu asp
Gly pro
His asn; gln
Ile leu; val
Leu ile; val
Lys arg; gln; glu
Met leu; ile
Phe met; leu; tyr
Ser thr
Thr ser
Trp tyr
Tyr trp; phe
Val ile; leu
Änderungen in der Funktion oder immunologischen Identität werden durch Substitution durchgeführt, indem Substitutionen gewählt werden, die weniger konservativ sind als jene in Tabelle 1, d. h., indem Reste gewählt werden, die sich in ihrer Auswirkung auf die Beibehaltung (a) der Struktur des Polypeptid-Rückgrats im Bereich der Substitution, beispielsweise als Faltblatt- oder Helix-Konformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der Sperrigkeit der Seitenkette unterscheiden.
Die Substitutionen, von denen im allgemeinen erwartet wird, daß sie die stärksten Veränderungen in den Eigenschaften von Enkephalinase hervorrufen, sind jene, bei denen (a) ein hydrophiler Rest, wie z. B. Seryl oder Threonyl, einen hydrophoben Rest, wie z. B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl, ersetzt (oder durch diesen ersetzt wird); (b) ein Cystein oder Prolin einen anderen Rest ersetzt (oder durch diesen ersetzt wird); (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, wie z. B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, einen elektronegativen Rest, wie z. B. Glutamyl oder Asparagyl, ersetzt (oder durch diesen ersetzt wird); oder (d) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette, wie z. B. Phenylalanin, einen ohne Seitenkette, wie z. B. Glycin, ersetzt (oder durch diesen ersetzt wird).
Eine Hauptklasse von Substitutions- oder Löschungsvarianten sind jene, welche den Transmembran- und/oder den Zytoplasma-Bereich von Enkephalinase umfassen. Die Zytoplasma-Domäne von Enkephalinase ist jene Sequenz von Aminosäureresten, die an einem von zwei in Fig. 17 gezeigten Methioninresten beginnt (Met&supmin;&sup8; oder Met&supmin;¹) und sich etwa 21-24 weitere Reste lang fortsetzt. Es wird angenommen, daß bei der Sequenz von Ratten und Menschen die Pro-Lys-Pro-Lys-Lys-Lys-Domäne als Stop-Transfer-Sequenz dient; die durch die Prolylreste bewirkten Konformationskrümmungen und der von den Lysylresten erzeugte elektropositive Charakter blockieren zusammen mit der nachstehend beschriebenen Transmembran-Domäne den Durchtritt von Enkephalinase durch die Zellmembran.
Die Transmembran-Domäne von Enkephalinase befindet sich in der Rattensequenz etwa bei den Resten 21-44 (wobei Asp +1 ist, wie in Fig. 17 gezeigt), und in der menschlichen Sequenz an der analogen Stelle. Dieser Bereich ist eine in hohem Maße hydrophobe Domäne, die die richtige Größe zum Überspannen der Lipid-Doppelschicht der Zellmembran aufweist. Es wird angenommen, daß er in Verbindung mit der Zytoplasma-Domäne Enkephalinase in der Zellmembran verankert.
Die Löschung oder Substitution einer oder beider Zytoplasten- und Transmembran-Domäne verringert die Lipidaffinität des Proteins und verbessert seine Wasserlöslichkeit, so daß keine Detergenzien erforderlich sind, um Enkephalinase in wäßriger Lösung zu halten. Die Löschung der Zytoplasma-Domäne alleine unter Beibehaltung der Transmembransequenz erzeugt Enkephalinase, die mit Detergens zu solubilisieren wäre, aber therapeutische Vorteile bietet. Die Enkephalinase mit gelöschter Zytoplasma-Domäne wird mit höherer Wahrscheinlichkeit in Membranen eingefügt, wenn sie als Therapiemittel verabreicht wird, wodurch ihre Aktivität auf jenes unmittelbare extrazelluläre Milieu gerichtet wird, in dem sie üblicherweise aktiv ist, und erleichtert ihre Formulierung in Salben- oder Liposom-Zusammensetzungen, die hydrophobe Mizellen enthalten. Vorzugsweise wird die Zytoplasma- oder Transmembran-Domäne gelöscht und nicht substituiert, um die Einführung potentiell immunogener Epitope zu vermeiden.
Zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung können Enkephalinase oder deren Derivate entweder zu einem injizierbaren oder einem topischen Präparat formuliert werden. Auch parenterale Formulierungen sind bekannt und sind zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung geeignet, vorzugsweise zur intramuskulären oder intravenösen Verabreichung. Intramuskuläre oder intravenöse therapeutische Präparate können vorzugsweise Enkephalinase-Derivate enthalten, worin die Transmembran- oder die Zytoplasma- und die Transmembran-Domäne gelöscht ist/sind. Die Formulierungen enthalten therapeutisch wirksame Mengen von Enkephalinase oder Derivaten davon, sind entweder sterile, flüssige Lösungen, flüssige Suspensionen oder lyophilisierte Versionen davon und enthalten gegebenenfalls Stabilisatoren oder Exzipienten. Lyophilisierte Zusammensetzungen werden mit geeigneten Verdünnern (wie z. B. Wasser zur Injektion, Salzlösung und dergleichen) in einer Menge von etwa 0,01 mg/kg bis 25 mg/kg rekonstituiert, wenn die biologische Aktivität 10 nM/mg/min beträgt, untersucht mittels (³H-DAla², Leu&sup5;)-Enkephalin als Substrat bei 25ºC in 50 mM HEPES-Puffer (pH 7,4) mit 0,1% Tween 20. Typischerweise werden die Enkephalinase enthaltenden, lyophilisierten Zusammensetzungen in einem Bereich von etwa 0,01 mg/kg bis etwa 20 mg/kg des behandelten Tieres verabreicht. Vorzugsweise werden die Enkephalinase enthaltenden, lyophilisierten Zusammensetzungen in einem Bereich von etwa 0,1 mg/kg bis etwa 10 mg/kg des behandelten Tieres verabreicht.
Enkephalinase wird zu topischen Präparaten zur lokalen Therapie formuliert, indem eine therapeutisch wirksame Konzentration von Enkephalinase in ein dermatologisches Vehikel miteinbezogen wird. Derartige topische Präparate können vorzugsweise das Enkephalinase-Derivat mit gelöschter Zytoplasma-Domäne umfassen. Die durch die topischen Formulierungen zu verabreichende Menge und Konzentration der Enkephalinase hängt vom gewählten Vehikel, dem klinischen Zustand des Patienten, der verwendeten Enkephalinase und der Stabilität der Enkephalinase in der Formulierung ab. So verwendet der Arzt notwendigerweise jenes geeignete Präparat, das die entsprechende Konzentration von Enkephalinase in der Formulierung enthält, sowie die geeignete Menge der verabreichten Formulierung je nach der klinischen Erfahrung mit dem fraglichen Patienten oder mit ähnlichen Patienten. Die Konzentration von Enkephalinase für topische Formulierungen liegt typischerweise im Bereich von mehr als etwa von 0,1 mg/ml bis etwa 25 mg/ml. Es können feste Dispersionen von Enkephalinase sowie solubilisierte Präparate verwendet werden. Somit unterliegt die genaue Konzentration, die im Vehikel zu verwenden ist, mäßiger experimenteller Manipulation, um die therapeutische Reaktion zu optimieren. Bei der Behandlung von Hautentzündung können mehr als etwa 10 mg Enkephalinase/100 g Vehikel mit 1 Gew.-% Hydrogel-Vehikeln nützlich sein. Geeignete Vehikel sind neben Gelen Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsionen, bei denen Mineralöle, Petrolatum und dergleichen verwendet werden.
Enkephalinase wird gegebenenfalls unter Verwendung eines transdermalen therapeutischen Systems (Barry, 1983, "Dermatological Formulations", S. 181 und die darin zitierte Literatur) topisch verabreicht. Bevorzugte topische Präparate umfassen Enkephalinase, welche die Zytoplasma- und die Transmembran-Domäne enthält. Die am meisten bevorzugten topischen Präparate umfassen Enkephalinase, der die Zytoplasma-Domäne fehlt. Obwohl derartige topische Abgabesysteme großteils zur transdermalen Verabreichung von Wirkstoffen mit geringem Molekulargewicht bestimmt waren, sie sind jedoch per definitionem auch zur perkutanen Abgabe befähigt. Sie können durch entsprechende Wahl der die Rate regulierenden, mikroporösen Membran leicht an die Abgabe von Enkephalinase oder Derivaten davon und zugehörigen therapeutischen Proteinen angepaßt werden.
Es können topische Präparate von Enkephalinase, entweder zur systemischen oder zur lokalen Abgabe, eingesetzt werden; diese können oben beschriebene Exzipienten zur parenteralen Abgabe und andere Exzipienten enthalten, die in einem topischen Präparat verwendet werden, wie z. B. Co-Lösungsmittel, Tenside, Öle, Feuchthaltemittel, Weichmacher, Konservierungsmittel, Stabilisatoren und Antioxidantien. Es kann jeder pharmakologisch verträgliche Puffer verwendet werden, z. B. Tris- oder Phosphatpuffer. Die topischen Formulierungen können gegebenenfalls auch ein oder mehrere Agentien umfassen, die verschiedentlich als Verstärker, Tenside, Beschleuniger, Adsorptionspromotoren oder Penetrationsförderer bezeichnet werden, wie z. B. ein Mittel zum Verstärken der perkutanen Penetration von Enkephalinase oder anderer Mittel. Derartige Agentien sollte wünschenswerterweise einige oder alle der folgenden Merkmale besitzen, wie dem Fachmann bekannt ist: sie sollten pharmakologisch inert sein, Verluste an Körperflüssigkeit oder Elektrolyt nicht fördern, mit Enkephalinase kompatibel (nicht-inaktivierend) sein und wie gewünscht zu Cremen, Gelen oder anderen topischen Abgabesystemen formuliert werden können.
Enkephalinase kann auch als Aerosol verabreicht werden, um eine lokale Abgabe an die Lungen zu erreichen. Das erfolgt durch Herstellung eines wäßrigen Aerosol, eines Liposom-Präparats oder fester Teilchen, die Enkephalinase oder Derivate davon enthalten. Normalerweise wird ein wäßriges Aerosol hergestellt, indem eine wäßrige Lösung oder Suspension von Enkephalinase zusammen mit herkömmlichen, pharmazeutisch annehmbaren Trägern und Stabilisatoren formuliert wird. Die Träger und Stabilisatoren variieren je nach den Anforderungen an die jeweilige Enkephalinase, umfassen aber typischerweise nichtionogene Tenside (Tweens, Pluronics oder Polyethylenglykol), unschädliche Proteine, wie z. B. Serumalbumin, Sorbitester, Ölsäure, Lezithin, Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Puffer, Salze, Zucker oder Zuckeralkohole. Die Formulierungen können auch mukolytische Mittel sowie Bronchiendilatoren umfassen. Die Formulierungen sind steril. Aerosole werden im allgemeinen aus isotonischen Lösungen hergestellt. Die Teilchen umfassen gegebenenfalls normale Lungentenside.
Aerosole können aus Teilchen in wäßriger oder nichtwäßriger (z. B. Fluorkohlenstoff-Treibmittel)-Suspension gebildet werden. Derartige Teilchen sind, beispielsweise, intramolekulare Aggregate von Enkephalinase oder Derivaten davon oder in Liposome oder Mikrokapseln eingeschlossene Enkephalinase oder Derivate davon. Die Aerosole sollten frei von Lungenreizmitteln sein, d. h. frei von Substanzen, die akute Bronchienverengung, Husten, Lungenödem oder Gewebezerstörung verursachen. Allerdings eignen sich nichtreizende Absorptionsverstärker zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung. Zur Herstellung von Aerosolen werden vorzugsweise Schallzerstäuber verwendet. Schallzerstäuber minimieren die Scherwirkung für Enkephalinase oder deren Derivate, die zu einem Abbau von Enkephalinase führen kann.
Enkephalinase kann anstelle von topischer Verabreichung systemisch, durch intramuskuläre oder subkutane Injektion oder Injektion in Gefäßzwischenräume, insbesondere in die Gelenke, z. B. durch Intraartikulärinjektion in einer Dosis von mehr als etwa 1 µg/cm³ Gelenksflüssigkeit/Tag, verabreicht werden. Die Dosis hängt von den Eigenschaften der eingesetzten Enkephalinase ab, z. B. von deren Aktivität und biologischen Halbwertszeit, der Konzentration von Enkephalinase in der Formulierung, der Stelle und Rate der Dosierung, der klinischen Toleranz des betroffenen Patienten, der pathologischen Störung, an der der Patient leidet, und dergleichen, was einem Arzt wohlbekannt ist.
Die Enkephalinase gemäß vorliegender Erfindung kann in Lösung verabreicht werden. Vorzugsweise wird zur Verabreichung in Lösung Enkephalinase verwendet, der die Transmembran-Domäne oder die Zytoplasma- und die Transmembran-Domäne fehlen. Der pH-Wert der Lösung sollte im Bereich von 5 bis 9,5, vorzugsweise 6,5 bis 7,5, liegen. Die Enkephalinase oder deren Derivate sollten in einer Lösung mit einem geeigneten, pharmazeutisch annehmbaren Puffer vorliegen, wie z. B. Phosphat, Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl oder Citrat und dergleichen. Die Pufferkonzentrationen sollten im Bereich von 1 bis 100 mM liegen. Die Enkephalinase-Lösung kann auch ein Salz, wie z. B. Natriumchlorid oder Kaliumchlorid, in einer Konzentration von 50 bis 150 mM enthalten. Eine wirksame Menge eines Stabilisators, wie z. B. Albumin, eines Globulins, einer Gelatine, eines Protamins oder eines Salzes von Protamin kann ebenfalls enthalten sein und einer Lösung, die Enkephal in enthält, oder der Zusammensetzung, aus der die Lösung hergestellt wird, zugegeben werden.
Die systemische Verabreichung von Enkephal in erfolgt täglich, im allgemeinen durch intramuskuläre Injektion, obwohl auch intravaskulare Infusion akzeptabel ist. Die Verabreichung kann auch intranasal oder auf andere nicht-parenterale Weise erfolgen. Enkephalinase kann auch über Mikrokugeln, Liposome oder andere Mikroteilchen-Abgabesysteme verabreicht werden, die in bestimmten Blut enthalten Geweben angeordnet werden. Topische Präparate werden täglich direkt auf die Haut oder Schleimhaut aufgetragen und dann vorzugsweise eingeschlossen, d. h. durch Auflegen eines Verbands, eines Polyolefinfilms oder einer anderen Barriere, die für das topische Präparat undurchlässig ist, geschützt.
Das Verfahren wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.

BEISPIEL 1

Messung von Substanz P

Der Gehalt an Substanz P-artiger Immunreaktivität in Frettchen-Luftröhren wurde ermittelt, indem die Trachea im 10-fachen des Gewebegewichts an 2 N Essigsäure zerkleinert, über Nacht extrahiert, die Gewebefragmente zentrifugiert und der Überstand auf eine C-18-säule (Sep-Pak; Waters and Associates) aufgebracht wurde, die mit Wasser äquilibriert worden war, das 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) enthielt und mit 0,2 ml von 0,5 µg/ml Poly-L-Lysin (Sigma) in 0,1% TFA vorbehandelt worden war. Die Sep-Pak-Säule wurde dann nacheinander mit einem Stufengradienten gewaschen, der aus jeweils 4,0 ml von 0, 20, 40 und 60% Methanol in 0,1% TFA in Wasser bestand, wobei Substanz P bei 60% Methanol eluierte. Das Methanol wurde unter N&sub2; abgedampft, anschließend die Proben lyophilisiert und in Assaypuffer rekonstituiert, bevor sie dem Assay unterzogen wurden. Der Assaypuffer bestand aus 0,5% 2-Mercaptoethanol, 0,25% Rinderserumalbumin (BSA), 0,03% NaN&sub3; in 0,05 M NaPO&sub4;-Puffer mit einem pH von 7,4. Direkt aus Ussing-Kammern erhaltene Mediumsproben und die Gewebeextrakte wurden unter Anwendung eines Voräquilibrierungs-Radioimmunoassays untersucht. Die Trennung der freien, radiomarkierten Substanz P von der an Antikörper gebundenen, radiomarkierten Substanz P wurde unter Verwendung von mit Dextran T70 beschichteter Holzkohle (Pharmacia) erreicht.
Die radiomarkierte Substanz P wurde hergestellt, indem Substanz P an Bolton-Hunter-Reagens (Bolton, A.E. und Hunter, W.M., "Biochem. J." 133, 529-539 [1973]) gekoppelt und das gekoppelte Produkt dann unter Einsatz von HPLC (Hewlett Packard Modell 1090) gereinigt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine 10 µm C-18-RP-HPLC-Säule (Waters and Associates) aufgebracht und mit einer Flußrate von 1 ml/min unter Verwendung von 55% Methanol und 0,045% TFA in Wasser isokratisch aus der Säule eluiert. Die monoderivatisierte Substanz P wurde unter Verwendung von Chloramin-T radioiodiert (McConahey, P. und Dixon, R., "Methods in Enzymology" 70, 210-213 [1980]). Das Reaktionsgemisch wurde auf eine Sep-Pak-C18-säule aufgebracht, und das iodierte Bolton-Hunter-Derivat von Substanz P mit 60% Methanol eluiert.
Kaninchen wurden mit einem Gemisch aus vollständigem Freund'schem Adjuvans, gepufferter Salzlösung und Substanz P, die unter Einsatz von Glutaraldehyd an gereinigtes BSA gekoppelt worden war, immunisiert. Substanz P wurde konjugiert, indem 25 mg monomeres BSA und 5 mg Substanz P in 1,0 ml 0,1 M NaPO&sub4;-Puffer mit einem pH-Wert von 6,8 gelöst und dann unter konstantem Rühren langsam 0,1 ml 0,5% Glutaraldehyd in NaPO&sub4;-Puffer zugegeben wurden. Das Gemisch-wurde zumindest 2 Stunden lang inkubiert, woraufhin die Reaktion durch Zugabe von 1,00 ml 0,1 M (NH&sub3;)&sub2;CO&sub3; gequencht wurde. Nach Rühren über weitere 30 Minuten wurde das Gemisch ausgiebig gegen dest. H&sub2;O dialysiert, lyophilisiert und ausgewogen.
Es wurde Serum abgenommen, lyophilisiert und eingefroren. Das Serum wurde für Radioimmunoassays in dest. Wasser rekonstituiert. Das Substanz P-Antiserum wurde auf Kreuzreaktivität gegenüber anderen Peptiden, einschließlich von Bradykinin, Lysyl-Bradykinin, vasoaktivem Intestinalpeptid, Somatostatin, Cholezystokinin-8, Gastrin, Bombesin und Neurotensin (Peninsula Labs, Belmont, CA), getestet. Außerdem wurden mehrere Proteinase-Inhibitoren (siehe unten), das N-terminale Fragment von Substanz P, Substanz P&sub1;&submin;&sub9;, und das C-terminale Fragment, Substanz P&sub6;&submin;&sub1;&sub1; (Peninsula Labs), getestet.
Die Frettchen-Luftröhrensegmente enthielten durchschnittlich 0,58 (0,230 pMol Substanz P-artige Immunreaktivität pro g Naßgewicht (n=3), was darauf hinweist, daß Substanz P in den Atemwegen von Frettchen vorhanden ist.

BEISPIEL 2

Schleimabsonderung aus Lungengewebe

Unter Einsatz bereits beschriebener Verfahren (Borson, D.B. et al., "J. Appl. Physiol." 57, 457466 [1984]) wurde die Schleimabsonderung von Luftröhrensegmenten von 36 Frettchen gemessen. Kurz zusammengefaßt wurde erwachsenen männlichen Frettchen mit einem Gewicht von 1-2 kg nach Anästhesie mit Natriumpentobarbital (45-60 mg/kg, ip) die Trachea entfernt und diese bei 38ºC in Medium 199/Earles HCO&sub3; gewaschen, durch das 95% - O&sub2; - 5% CO&sub2; durchgeleitet wurde. Die Luftröhrensegmente wurden in Ussing-Kammern aus Kunststoff montiert, die an Perfusionskammern aus siliziertem Glas angeschlossen waren (MRA Inc., Clearwater, Florida). Nachdem beide Seiten Medium 199 ausgesetzt worden waren, wurden der submukösen Seite 0,167 mCi Na&sub2;³&sup5;SO&sub4; zugesetzt. In Intervallen von 15 min wurde das Medium an der Luminalseite abgelassen und durch frisches, unmarkiertes Medium ersetzt. Jede Probe wurde in einen Dialyseschlauch gefüllt (Spectropore Nr. D1615-1; MG-Cutoff: 12-14.000) und zusammen mit dem Rest der Proben aus diesem Versuch ausgiebig gegen zumindest 6-mal ausgetauschtes dest. Wasser (jeweils 4 I), das einen Überschuß an unmarkiertem SO&sub4; und Natriumazid (10 mg/l) enthielt, dialysiert, um bakteriellen Abbau der Makromoleküle zu verhindern. Nach der Dialyse wurde die gebundene Radioaktivität einer jeden Probe unter Verwendung eines β-Zählers von Beckman Instruments (Modell LS 7500) ermittelt. Die Molekulargewichtsprofile der sekretierten Materialien wurden ermittelt, indem Proben zunächst unter Verwendung einer Sephadex G-50-Säule entsalzt, die Kohlenhydrat enthaltenden Moleküle dann auf DEAE-Sephacel aufkonzentriert und unter Denaturierungsbedingungen (4 M Guanidin, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1% Triton X-100) und Einsatz einer Sepharose CL-6B-Säule die scheinbare Molekülgröße ermittelt wurde. Frühere Untersuchungen zeigten, daß die Analyse von Proben unter Einsatz von Dialyse und Säulenchromatographie in quantitativer Hinsicht ähnliche Ergebnisse lieferte (Borson et al., "J. Appl. Physiol." 57, 457-466 [1984]).
Es wurde die Charakteristik der Reaktion auf Substanz P, einschließlich des Zeitverlaufs, der Konzentrationsabhängigkeit und der Reproduzierbarkeit, untersucht. Luftröhrensegmente von 8 Frettchen wurden in Gegenwart einer Radiomarkierung 3 Stunden lang inkubiert, und es wurden unterschiedliche Konzentrationen an Substanz P (10&supmin;&sup9; M bis 10&supmin;&sup5; M; Peninsula Labs, Belmont, CA) zugegeben. Die Reproduzierbarkeit der Reaktion auf Substanz P wurde festgestellt, indem zweimal 10&supmin;&sup6; M Substanz P, das erste Mal nach 3-stündiger und erneut nach 4-stündiger Inkubation, zugegeben wurden. Alle Behandlungen erfolgten hinsichtlich der Stelle der Probenentnahme in der Trachea nach dem Zufallsprinzip, um systembedingte Verzerrungen zu vermeiden.
Nach der Anordnung des Gewebes in den Kammern und dem Hinzufügen der Radiomarkierung nahm die Rate der Ausscheidung von ³&sup5;SO&sub4;-Makromolekülen in die Luminalseite des Gewebes zu, und nach zwei bis drei Stunden nahm die Ausscheidung in einer in etwa linearen Weise zu. Nach 3-stündiger Markierung schieden die Gewebe mit einer durchschnittlichen Rate von 111,8 ± 15,6 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h aus. Zu diesem Zeitpunkt betrug die durchschnittliche Zunahme des Flusses an gebundenem SO&sub4; pro Probenintervall 117 ± 2 5 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h (10,5% der Grundlinie). Bei Zugabe an der submukösen Seite der Gewebe erhöhte Substanz P die Ausscheidung innerhalb von 15 min, wonach die Ausscheidung zur Grundlinie zurückkehrte und schließlich jene Werte erreichte, die durch Extrapolation der Grundlinie vor der Stimulation entlang der Zeitachse erzielt wurden. Gelpermeationschromatographie (GPC) zeigte, daß 85% der radiomarkierten Materialien, die als Reaktion auf Substanz P ausgeschieden worden waren, ein Molekulargewicht von über 10&sup6; aufwiesen, was darauf hindeutet, daß die meisten wahrscheinlich Mucine oder Proteoglykane waren. Substanz P erhöht den Fluß von gebundenem SO&sub4; in Abhängigkeit von der Konzentration mit einem Schwellenwert von 10&supmin;&sup9; M und einer Reaktion auf 10&supmin;&sup5; M Substanz P von 156,4 ± 261 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h oder 155 ± 42% über der Grundlinie vor der Stimulierung (Fig. 1). Die durch Substanz P herbeigeführte Sekretion war bei allen Konzentrationen der Substanz P von über 10&supmin;&sup9; M (p < 0,05; n jeweils gleich 6) deutlich stärker als die bloße Zunahme mit der Zeit. Weiters verursachte wiederholte Stimulation wiederholte Reaktionen. Die zweite Reaktion betrug durchschnittlich 71,4 ± 24,2% der ersten Reaktion (p > 0,1; n=4). Entfernen der Substanz P aus dem Medium nach der ersten Anregung erhöhte das Ausmaß der zweiten Reaktion leicht auf 91,1 ± 48,3% der ersten Reaktion, was sich nicht nennenswert von der zweiten Reaktion der Gewebe, die kontinuierlich Substanz P ausgesetzt worden waren (p > 0,2; n jeweils gleich 4) unterschied.
Das C-terminale Fragment, Substanz P&sub6;&submin;&sub1;&sub1;, (10&supmin;&sup5; M) verursachte eine starke Freisetzung von gebundenem SO&sub4;, während das N-terminale Fragment, Substanz P&sub1;&submin;&sub9;, dies nicht tat (369,4 ± 18,3 gegenüber 33,7 ± 24,7 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h; p < 0,05; n jeweils gleich 4) (z. B. Fig. 2). Die Reaktion auf Substanz P&sub6;&submin;&sub1;&sub1; war bei gleicher Konzentration (156,4 ± 26,1 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h; p < 0,001; n=4) deutlich stärker als die Reaktion auf Substanz P&sub1;&submin;&sub1;&sub1;. Die von Substanz P&sub1;&submin;&sub9; hervorgerufene Sekretion unterschied sich in diesen Geweben nicht von der spontanen Änderung des Grundlinienflusses mit der Zeit alleine (-18,4 ± 16,8 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h, p > 0,1; n=4).

BEISPIEL 3

Wirkung von Proteinase-Inhibitoren auf durch Substanz P herbeigeführte Schleimabsonderung

In der nächsten Versuchsreihe wurden die Auswirkungen des Substanz P-Stoffwechsels auf die Sekretionsreaktionen auf Substanz P untersucht. Unterschiedliche Enzyme spalten Substanz P an unterschiedlichen Stellen. Der aktive Anteil des Peptids, das C-terminale Fragment, verursacht Sekretionsaktivität. Es wurde gezeigt, daß Enkephalinase Substanz P in das inaktive Fragment, Substanz P&sub1;&submin;&sub9;, spaltet.
Die Auswirkungen endogener Proteinasen wurden untersucht, indem jeweils zumindest zwei Gewebe von 4 Frettchen 30 min lang in Medium 2,5 h lang inkubiert und eine Kombination von 9 Proteinase-Inhibitoren jedem Gewebe an der submukösen Seite (jeweils 10 µg/ml) zugeführt wurde. Die verwendeten Inhibitoren umfaßten Leupeptin, Antipain, Pepstatin A, Thiorphan, Substanz P&sub1;&submin;&sub9; (Growcott, J.W. und Tarpey, A.V., "Eur. J. Pharm" 84, 107-109 [1982]) und den Inhibitor für Angiotensin konvertierendes Enzym, Teprotid (Peninsula Labs), Aprotonin, BSA und Bacitracin (Sigma). 30 min nach der Zugabe von Inhibitor wurde Substanz P (10&supmin;&sup6; M) an der submukösen Seite zugeführt. In Abwesenheit von Proteinase-Inhibitoren verursachte diese Konzentration von Substanz P beständige und submaximale Wirkungen. In manchen der Gewebe stimulierte die Kombination von Inhibitoren die Sekretion, und erreichte, sofern vorhanden, die Wirkung innerhalb von 30 min nach der Zugabe der Inhibitoren ein Maximum. Die mittleren Reaktionen auf Substanz P in Gegenwart von Inhibitoren wurden mit den mittleren Reaktionen auf zwei Vergleichssegmente von jedem der Versuchstiere verglichen. In darauffolgenden Versuchen wurden die Wirkungen der einzelnen Proteinase-Inhibitoren, Thiorphan, Teprotid, Phosporamidon (Sigma), Captopril (Squibb Pharmaceuticals, Inc.), Teprotid, Rinderserumalbumin, Bacitracin, Leupeptin, Aprotonin und Bestatin (Sigma), eines Inhibitors einer Aminopeptidase im Gehirn, der Enkephaline abbaut (Chaillet, P. et al., "Eur. J. Pharmacol" 86, 329-336 [1983]), getestet.
Die Konzentrationsabhängigkeit der Enkephalinase-Hemmung wurde untersucht, indem Thiorphan in unterschiedlichen Konzentrationen zu unterschiedlichen Geweben zugegeben wurde. Um zu ermitteln, ob die Sekretionswirkung von Substanz P vielleicht indirekt über die Freisetzung von endogenen Enkephalinen vermittelt wird, wurden die Auswirkungen von Met-Enkephalin (Peninsula Labs) auf die Sekretionsreaktionen getestet.
Der Fluß an gebundenem SO&sub4; (JSOt) wurde aus den cpm in den dialysierten Proben mittels einer modifizierten Form der Gleichung von Corrales, R.J. et al., "J. Appl. Physiol." 56, 1076-1082 [1985]), berechnet:
JSO&sub4; (pMol SO&sub4;/cm²/h) = (erhaltene cpm/15 min · 4) · (811 · 10&sup6; pMol kaltes SO&sub4;/5 ml)/0,5 cm² · cpm in 5,0 ml Medium der heißen Seite
Die Änderungen des Flusses aufgrund von Wirkstoffen wurden berechnet, indem der Fluß während des 15-minütigen Zeitraums vor Zugabe der Wirkstoffe von jenem Fluß subtrahiert wurde, der für dieses Gewebe entweder 15 oder 30 min nach Zugabe der Wirkstoffe beobachtet wurde, je nachdem, welcher größer war. Mittlere Flüsse oder Änderungen der Flüsse für alle Bedingungen wurden durch Einfach-Varianzanalyse miteinander verglichen. Es wurde der Newman-Keuls-Test für Mehrfachvergleiche eingesetzt, um die Unterschiede zwischen den Gruppen zu ermitteln (Zar, J.H., "Multiple Comparison" in "Biostatistical Analysis" [Prentice Hall, Englewood Cliffs, N.J., 1974]).
Bei Zufuhr an den submukösen Seiten der Gewebe erhöhte die Kombination von 9 Proteinase-Inhibitoren den Fluß von gebundenem SO&sub4; in das Lumen im Vergleich zur Zunahme aufgrund der Zeit alleine (12,3 ± 6,2 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h) ein wenig, aber nicht wesentlich (45,8 ± 28,2 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h). Nach der Zugabe von Substanz P zu den submukösen Seiten dieser Gewebe erhöhte sich der Fluß von gebundenem SO&sub4; um durchschnittlich 383,5 ± 148 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h oder 438,6 ± 105,2% der Reaktion auf Substanz P von Vergleichsgeweben derselben Tiere (83,7 ± 21,4 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h; p < 0,05; n=4) (Fig. 3 und 4). Die verstärkte Reaktion auf Substanz P war nicht auf additive Effekte der Inhibitoren und Substanz P zurückzuführen, da die Summe der einzelnen Effekte 83,7 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h (Substanz P) plus 45,8 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h (Inhibitoren) 129,5 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h oder nur 34% der Reaktion auf Substanz P in Gegenwart der Inhibitoren (383,5 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h) betrug.
Von den einzelnen untersuchten Inhibitoren verstärkten nur Thiorphan und Phosphoamidon, Inhibitoren von Enkephalinase, die durch Substanz P herbeigeführte Sekretion (Fig. 4 und 5). Bei Zugabe an der submukösen Seite der Gewebe in 10&supmin;&sup4; M erhöhte Thiorphan selbst den Fluß von gebundenem SO&sub4; in das Lumen um durchschnittlich 57 ± 17,8 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h. Das war deutlich höher als die spontane Zunahme des Flusses in denselben Geweben vor Zugabe von Thiorphan (20,5 ± 6,3 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h; p < 0,05; n=6). Bei geringeren Konzentrationen stimulierte Thiorphan die Sekretion nicht wesentlich. Thiorphan verstärkte die Sekretionsreaktion auf Substanz P jedoch in Abhängigkeit von der Konzentration mit einem Schwellenwert von etwa 10&supmin;&sup8; M (Fig. 5). Bei mit Thiorphan (10&supmin;&sup4; M) vorbehandelten Geweben erhöhte Substanz P den Fluß von gebundenem SO&sub4; um durchschnittlich 268,0 ± 58,0 pMol/cm²/h (502 ± 147% des Vergleichs; p < 0,05; n=6). Diese durchschnittliche Reaktion war deutlich höher als jene von Vergleichsgeweben derselben Tiere (79,2 ± 13,0 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h; p < 0,05; n=6). Die Zunahme der durch Substanz P herbeigeführten Sekretion war kein additiver Effekt von Thiorphan und Substanz P: die Summe der einzelnen Effekte, 79,2 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h (Substanz P) plus 57,0 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h (Thiorphan), d. h. 136,2 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h, machte nur 51% der Reaktion auf Substanz P in Gegenwart von Thiorphan aus (268,0 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h). Bei mit Phosphoramidon (10- M) behandelten Geweben erhöhte Substanz P (10&supmin;&sup6; M) den Fluß um durchschnittlich 357 ± 91,9 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h, was deutlich höher ist als die Reaktionen der Vergleichsgewebe derselben Tiere (62,3 ± 248 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h; p < 0,05; n jeweils gleich 4).
Im Gegensatz zu den Enkephalinase-Inhibitoren verstärkten Inhibitoren anderer Proteinasen die durch Substanz P herbeigeführte Sekretion nicht (Fig. 4). So verstärkten Captopril und Teprotid, Inhibitoren von Kininase II (Angiotensin konvertierendes Enzym), die durch Substanz P herbeigeführte Sekretion leicht (um 44 ± 27% bzw. 49 ± 39%), die Zunahmen unterschieden sich jedoch nicht wesentlich von den Reaktionen von Vergleichsgeweben derselben Tiere (p > 0,2; n jeweils gleich 4). Auf ähnliche Weise gelang es Leupeptin, Aprotonin, Bacitracin, BSA und Bestatin nicht, die durch Substanz P herbeigeführt Sekretion zu verstärken.
Es wurden Versuche durchgeführt, um zu untersuchen, ob die Sekretionsreaktion auf Substanz P durch engogen freigesetzte Enkephaline vermittelt werden kann. Met-Enkephal in stimulierte die Sekretion nicht wesentlich. Nach der Zugabe von Met-Enkephalin (10&supmin;&sup4; M) betrug die Änderung des Flusses von gebundenem SO&sub4; 6,7 ± 4,2 pMol/cm²/h, was keinen Unterschied zu der Änderung des Flusses in Vergleichsgeweben von 70 ± 1,5 pMol an gebundenem SO&sub4;/cm²/h (p > 0,5; n=4) in vergleichbarer Zeit macht. Diese Untersuchungen weisen darauf hin, daß in Atemwegsgewebe vorhandene Enkephalinase die durch Substanz P herbeigeführte Sekretion hemmt.

BEISPIEL 4

Auswirkungen von Enkephalinase-Inhibitoren auf die Sekretionsreaktionen auf Tachykinine

In dieser nächsten Versuchsreihe wurden die Auswirkungen verschiedener Tachykinine und des Enkephalinase-Inhibitors Phosphoramidon verglichen. Gewebe von Frettchen-Luftröhren wurden in Kammern -angeordnet und unter Einsatz bereits beschriebener Verfahren (Beispiel 2) markiert. Die Gewebe wurden dann einem der Tachykinine Substanz P (SP), Neurokinin A (NK-A), Neurokinin B (NK-B), Eledoisin (ELED), Physalaemin (PHYS) oder Kassinin (KASS) ausgesetzt. Jedes Tachykinin wurde mit 10&supmin;&sup5; M in Abwesenheit oder Gegenwart von Phosphoramidon (10&supmin;&sup5; M, 30 min; Sigma) verabreicht. Die Freisetzung von hochmolekularem ³&sup5;SO&sub4; wurde wie oben in Beispiel 2 beschrieben ermittelt. Die Daten werden in Fig. 6 gezeigt. In Abwesenheit von Phosphoramidon stimulierte ein Großteil der Tachykinine die Sekretion in folgender Reihung der Stärke nach:
Substan P > Physalaemin = Eledoisin = Kassinin > Neurokinin A
(p < 0,05, n jeweils gleich 5). Neurokinin B war in Abwesenheit von Phosphoramidon unwirksam. Allerdings waren die Sekretionsreaktionen auf jedes Tachykinin bei mit Phosphoramidon vorbehandelten Geweben deutlich erhöht (P < 0,05, n jeweils gleich 5). Weiters änderte sich die Reihenfolge der Stärke in Gegenwart von Phosphoramidon:
Substanz P = Neurokinin A = Physalaemin = Eledoisin = Kassinin > Neurokinin B.
In Abwesenheit von Enkephalinase-Hemmung war die Wirkung von Substanz P größer als jene von Neurokinin A. Nach der Enkephalinase-Hemmung waren die Wirkungen von Substanz P und Neurokinin A gleich. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß Enkephalinase Neurokinin A effizienter spaltet als sie Substanz P spaltet. Sie weisen auch darauf hin, daß in Atemwegsgewebe vorhandene Enkephalinase die durch verschiedene Tachykinine herbeigeführte Sekretion hemmt.

BEISPIEL 5

Lokalisierung und funktionelle Eigenschaften von Enkephalinase in den Atemwegen

In dieser Versuchsreihe wurden die Position von Enkephalinase im Gewebe ermittelt.
Enkephalinase wurde aus der Frettchen-Niere unter Einsatz bekannter Verfahren bis nahe zur Homogenität gereinigt (Malfroy und Schwartz, siehe oben). Es wurde die Enkephalinase-Aktivität in Membranfraktionen ermittelt, die von Vagusnerv, Luftröhrenepithel, -submukosa und -muskel, Lungen und Nieren von Frettchen stammten. Die Frettchen wurden anästhesiert und der Vagusnerv, die Luftröhre, die Lunge und die Nieren entfernt. Luftröhrenepithel, -submucosa und -muskel wurden durch 15-minütiges Inkubieren der Trachea in Ca&spplus;&spplus;-freiem Medium voneinander getrennt, woraufhin das Epithel leicht zu entfernen war. Der Muskel wurde dann von der Drüsen enthaltenden Submucosa getrennt. Jedes Gewebe wurde zerkleinert und dann unter Verwendung eines Polytron-Homogenisators in 50 mM HEPES-Puffer (pH 7,4) homogenisiert.
Die Enkephalinase-Aktivität wurde gemessen, indem die Raten der Spaltung von (³H-Tyr¹, DAla², Leu&sup5;)-Enkephal in (Research Products International) durch Membranfraktionen oder gereinigte Enkephalinase ermittelt wurden. 50 µl Membranfraktion wurden 40 min lang bei Raumtemperatur mit 50 µl Puffer inkubiert, der (³H-Tyr¹, DAla², Leu&sup5;)-Enkephalin (20 nM) enthielt, woraufhin die Reaktion durch Zugabe von 50 µl 2N HCl gequencht wurde.
75 µl dieser Lösung wurden auf Polystyrol-Perlen (Poropak-Q) enthaltende Säulen aufgebracht, der charakteristische Metabolit ³H-Tyr-DAla-Gly mit Wasser eluiert und die Radioaktivität ermittelt. Die Proteinkonzentrationen wurden nach dem Bradford-Verfahren ermittelt (Bradford, M. M. "Analytical Biochem." 72, 248-254 [1976]), und die Ergebnisse der Enkephalinase-Aktivitäten wurden als fMol gespaltenes Substrat pro min pro mg Protein ausgedrückt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2 Lokalisierung von Atemwegs-Enkephalinase und Wechselwirkungen mit Leu-Thiorphan und Substraten Gewebe Enkephalinase-Aktivität** Vagus/N. Epithel Submucosa Muskel Lunge Niere Leu-Thiorphan Enkephalin Substanz P Neurokinin * Mittelwert einer Dreifachbestimmung eines Versuchs ** Daten ausgedrückt als fMol/min/mg Protein
Jedes Gewebe spaltete das Substrat, wobei die höchste Aktivität in den Atemwegen in der Submucosa vorhanden war. Leucin-Thiorphan (Leu-Thiorphan, ein Enkephalinase-Inhibitor) hemmte die Substratspaltung mit Affinitätskonstanten (KI) im Nanomol-Bereich für jedes Gewebe. Im Gegensatz zu Leu-Thiorphan wiesen andere Proteinase- oder Peptidase-Inhibitoren (10&supmin;&sup5; M) keine Substratspaltung durch irgendein Gewebe auf. Diese Inhibitoren umfaßten: Captopril, einen Inhibitor für Angiotensin konvertierendes Enzym; Bestatin, einen Inhibitor für Aminopeptidasen; Aprotonin, einen Inhibitor für Serin-Proteinasen; oder Leupeptin, einen Inhibitor von Serin- oder Thiol-Proteinasen. Daher ist die Substratspaltung ausschließlich auf die Wirkung von Enkephalinase zurückzuführen. Die Peptide, (DAla², Leu&sup5;)-Enkephalin, Substanz P und Neurokinin A hemmten die Substratspaltung auch mit Affinitätskonstanten (KI), die bei jedem Substrat für alle Gewebe gleich groß waren (siehe Tabelle 2). Die Affinität von Enkephalinase für Substanz P und für Neurokinin A ist etwa 10 Mal so hoch wie die Affinität von Enkephalinase für (DAla², Leu&sup5;)-Enkephalin. Da die Affinitätskonstanten für Substanz P und für Neurokinin A gleich hoch sind, sind die Unterschiede in den Aktivitäten dieser Peptide hinsichtlich der Schleimabsonderung (Beispiel 4) und der Muskelkontraktion (Beispiel 8) vermutlich auf die unterschiedlichen Wechselzahlen (Kcat) und nicht auf die unterschiedlichen Affinitäten von Enkephalinase für die Substrate zurückzuführen.

BEISPIEL 6

Auswirkung von Trypsin auf die Enkephalinase-Aktivität und die durch Substan P herbeigeführte Schleimabsonderung

In dieser Versuchsreihe wurden die Auswirkungen einer extrazellulären Prototyp-Proteinase auf die durch Enkephalinase und Substanz P vermittelte Schleimabsonderung untersucht. Die Überlegungen, die diesen Untersuchungen zugrunde liegen, sind die, daß vielerlei Proteinasen von verschiedenen Zellen und Geweben (z. B. Neutrophil-Elastase, alkalische Proteinase, Mastzellen-Tryptase und -chymase) freigesetzt werden, und wenn diese Proteinasen Enkephalinase zerstören, Änderungen in der peptidinduzierten Sekretion beobachtet werden sollten. Diese Hypothese wurde unter Verwendung von Trypsin (10&supmin;¹¹ bis 10&supmin;&sup5; M; 15 min), einer Prototyp-Serinproteinase, getestet. Es wurde der Effekt von Trypsin auf die Enkephalinase-Aktivität von Lungen-Homogenaten, gemessen als Abbau von (³H-Tyr¹-DAla²-Leu)-Enkephalin, und die Schleimabsonderung von Luftröhren von 3 Frettchen ermittelt.
Trypsin-Inkubation (15 min) verringerte die Enkephalinase-Aktivität in Homogenaten der Lungen (Fig. 7) in Abhängkeit von der Konzentration, mit einem Schwellenwert von über 10&supmin;¹¹ M und einer Maximalwirkung bei 10&supmin;&sup5; M. Außerdem erhöhte Trypsin (10&supmin;&sup5; M, 30 min) an sich die Schleimabsonderung nicht mehr als die Zunahme mit der Zeit alleine. Allerdings verstärkte Trypsin die Sekretionsreaktion auf Substanz P. Somit ist die durch Trypsin verursachte Abnahme der Enkephalinase-Aktivität, wie im Fall von Enkephalinase-Inhibitoren (z. B. Thiorphan), mit verstärkten Sekretionsreaktionen auf Substanz P verbunden. Daher ist es wahrscheinlich, daß andere Proteinasen (z. B. jene von Entzündungszellen, Mastzellen, Neutrophilen usw.) die peptid-induzierten Rekationen indirekt ebenfalls ändern können, indem die Menge oder die Aktivität von Enkephalinase im Gewebe reguliert wird.

Beispiel 7

Auswirkung von Proteinase-Inhibitoren auf durch Substanz P herbeigeführte Kontraktion glatter Muskeln der Atemwege

27 Frettchen wurden mit Pentobarbital-natrium (45-60 m/kg, i.p.) narkotisiert und die Luftröhren entfernt. Querringe (8 mm lang) wurden von der Trachea abgeschnitten und in Glaskammern eingebracht, die mit 14 ml Krebs-Henseleit-Lösung der folgenden Zusammensetzung (in mMol/l) gefüllt waren: NaCl 118; KCl 5,9; CaCl&sub2; 2,5; MgSO&sub4; 1,2; NaH&sub2;PO&sub4; 1,2; NaHCO&sub3; 25,5; Glucose 5,6; 0,1% Rinderserumalbumin und Penicillin-Streptomycin (100 U/ml). Die Lösung wurde bei 37ºC gehalten und kontinuierlich mit einem Gemisch aus 95% O&sub2; - 5% CO&sub2; belüftet, was einen pH-Wert von 7,4 ergab. Es wurden 6 Luftröhrenringe gleichzeitig untersucht.
Die Luftröhrenringe wurden zur kontinuierlichen Aufzeichnung der isometrischen Spannung an Dehnungsmeßgeräte (Grass FTO3) angeschlossen und zur Stimulation durch ein elektrisches Feld zwischen zwei rechteckigen Platinelektroden (6 · 40 mm) angeordnet. Die Ringe wurden anfänglich 30 s lang auf eine Spannung von 20 g gedehnt und dann 1 h lang zur Äquilibrierung stehengelassen, wobei die Ruhespannung auf 4 g eingestellt wurde (Skoogh, B-E. et al., "J. Appl. Physiol." 53, 253-257 [1982]). Während der Äquilibrierung wurde das Medium alle 15 min ausgetauscht. Vorbereitende Studien zeigten, daß mit 4 g Ruhespannung die Maximalreaktionen auf die Anregung durch ein elektrisches Feld (zweiphasig, Pulsdauer 0,5 ms; 20 V für 20 s, Frequenz 20 Hz) erzielt wurden (ebenda).
Es wurden die Reaktionsfähigkeit auf Substanz P (unter Einsatz von Konzentrationen im Bereich von 10&supmin;&sup8; M bis 10&supmin;&sup5; M) und auf Leu-Thiorphan sowie kumulative Dosis/Reaktion-Kurven auf Substanz P (Peninsula Labs) erhalten. Jede nachfolgende Konzentration von Substanz P wurde hinzugefügt, nachdem die Konzentration ein Plateau erreicht hatte. Nach dem Abschluß der ersten Dosis/Reaktion-Kurve auf Substanz P wurde Leu-Thiorphan (10&supmin;&sup5; M, Squibb Pharmaceuticals) dem Organbad zugegeben. Nach 15-minütiger Inkubation wurde eine zweite Dosis/Reaktion-Kurve auf Substanz P erhalten.
Das N-terminale Fragment, Substan P&sub1;&submin;&sub9;, wurde untersucht, weil Enkephalinase Substanz P zwischen den Positionen 9 und 10 spaltet (Matsas, R. et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. [USA]" 80, 3111-3115 [1983]), wodurch dieses Fragment erzeugt wird (10&supmin;&sup5; M, Peninsula Labs). Versuche wurden auch mit (DPro², DTrp7,9)-Substanz P (10&supmin;&sup5; M) (Peninsula Labs) durchgeführt, einem Substanz P-Antagonisten, (Hakanson, R et al., "Br. J. Pharmac." 77, 697-700 [1982]), indem der Antagonist zugegeben wurde, nachdem die Reaktion auf Substanz P (10.6 M) und Leu-Thiorphan (10- M) ein Plateau erreicht hatte.
Substanz P wurde in 0,1 M Essigsäure und Leu-Thiorphan in 1%-igem Ethanol gelöst, um Stammlösungen mit etwa 10&supmin;³ M zu ergeben. Diese Wirkstoff-Lösungen wurden bei -25ºC gelagert und für jeden Versuch Aliquote aufgetaut und in Krebs-Henseleit-Lösung verdünnt.
Die Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Für die Dosis/Reaktion-Kurven auf Substanz P wurden die Mittelwerte zwischen den beiden Gruppen in jeder Konzentration mittels eines gepaarten t-Tests verglichen. Für die Untersuchungen der Stimulation durch ein elektrisches Feld wurden die Reaktionen mittels Einfach-Analyse der Varianz und Newman-Keuls-Mehrfachbereichstest verglichen. Signifikanz wurde bei p < 0,05 angenommen.
Substanz P alleine verursachte eine erhöhte Muskelspannung, allerdings nur bei Konzentrationen von 5 · 10&supmin;&sup6; M oder darüber (Fig. 8). Die Zugabe von Leu-Thiorphan (10&supmin;&sup5; M) hatte keine wesentliche Auswirkung auf die Ruhespannung, sie verschob jedoch den Zusammenhang zwischen Dosis und Reaktion für Substanz P zu um etwa eine log-Einheit niedrigeren Konzentrationen (Fig. 8). Im Gegensatz zu Substanz P hatte das N-terminale Fragment, Substanz P&sub1;&submin;&sub9;, (10&supmin;&sup5; M) keine wesentliche Auswirkung auf die Ruhespannung (n=3).
Die durch Substanz P (10&supmin;&sup6; M) in Gegenwart von Leu-Thiorphan erzeugte Kontraktion wurde durch den Substanz P-Antagonisten (DPro², DTrp7,9)-Substanz P (10&supmin;&sup5; M) verringert (36,0 ± 10,0% des Vergleichs). Der Substanz P-Antagonist verringerte durch Substanz P induzierte Kontraktionen deutlich stärker als Atropin alleine (p < 0,01) (Fig. 9).
Es wurde die durch Anregung mit elektrischem Feld induzierte Kontraktion in Gegenwart von Substanz P (5 · 10&supmin;¹¹ M) und entweder Captopril (Squibb Pharmaceutical) (10&supmin;&sup5; M), Bestatin (Sigma) (10&supmin;&sup5; M) oder Leupeptin (Peninsula Labs) (10&supmin;&sup5; M) gemessen, um zu ermitteln, ob die Hemmung von Angiotensin konvertierendem Enzym (ACE), Aminopeptidasen und Serin- oder Thiol-Proteinasen für die Verstärkung der Reaktionen auf die Stimulation mit elektrischem Feld verantwortlich war. Erhöhte Konzentrationen an Leu-Thiorphan (10&supmin;¹¹ bis 10&supmin;&sup4; M) wurden zugegeben und die Anregung wiederholt, um zu ermitteln, ob Leu-Thiorphan die durch Stimulation mit elektrischem Feld herbeigeführten Kontraktionen modulierte. Die Auswirkungen von Leu-Thiorphan auf elektrisch induzierte Kontraktion wurde unter Verwendung von 5 weiteren Frettchen untersucht. Nachdem die Vergleichsreaktionen auf die Stimulation mit elektrischem Feld (5 Hz) ermittelt worden waren, wurde Leu-Thiorphan (10&supmin;&sup5; M; 15 min) zugegeben, die Anregung wiederholt, (DPro², DTrp7,9)-Substanz P, der Substanz P-Antagonist, zugegeben (1&supmin;&sup5; M; 15 min; Peninsula Labs) und die Anregung wiederholt.
Substanz P alleine, selbst in sehr geringen Konzentrationen (5 · 10&supmin;¹¹ M), verstärkte die Reaktionen auf die Stimulation mit elektrischem Feld (Fig. 10). Substanz P (10&supmin;¹¹ oder 10&supmin;¹&sup0; M) verstärkte die durch Stimulation mit elektrischem Feld herbeigeführte Kontraktion ohne wesentliche Tachyphylaxe der Effekte, selbst nach 5 Reaktionen (n=3), reproduzierbar. Leu-Thiorphan in Konzentrationen von bis zu 10&supmin;&sup4; M änderte die Ruhespannung in keinem der Versuche. Allerdings erzeugte die Zugabe steigender Konzentrationen an Leu-Thiorphan dosisabhängige Verstärkungen der Reaktionen auf die Stimulation mit elektrischem Feld, mit einem Schwellenwert von etwa 10&supmin;&sup9; M und einem Maximaleffekt bei 10&supmin;&sup5; M (Fig. 10).
Leu-Thiorphan verstärkte die Reaktion auf die Stimulation mit elektrischem Feld in Abhängigkeit von der Konzentration (Fig. 11). (DPro²,DTrp7,9)-Substanz P (10- M) hemmte die durch Leu-Thiorphan herbeigeführte Zunahme der Reaktion auf die Stimulation mit elektrischem Feld (101,6 ± 1,7% im Vergleich zu 118 ± 1,7% in Gegenwart von Leu-Thiorphan; p > 0,01; n=5).
Im Gegensatz zu den Auswirkungen von Leu-Thiorphan verstärkte keiner der anderen verwendeten Peptidase-Inhibitoren die Reaktion auf die Stimulation mit elektrischem Feld in Gegenwart von Substanz P (5 · 10&supmin;¹¹ M) (p > 0,5; n=3).
Diese Untersuchungen zeigen, daß Enkephalinase in Atemwegsmuskeln und -nerven vorhanden ist und daß sie die durch Substanz P induzierten Wirkungen abschwächt, einschließlich von Bronchienverengung und der Verstärkung der Neurotransmission auf die glatte Muskulatur der Atemwege.
Enkephalinase ist an der Verringerung der durch Substanz P herbeigeführten Wirkungen beteiligt, da Leu-Thiorphan die durch Substanz P induzierten Wirkungen verstärkte, während andere Proteinase und Peptidase-Inhibitoren, wie Captopril, ein Inhibitor für Angiotensin konvertierendes Enzym (Turner, A.J. et al., "Biochem. Pharmacol." 34, 1347-1356 [1985]), Bestatin, ein Inhibitor für Aminopeptidase, oder Leupeptin, ein Inhibitor für Serin- oder Thiol-Proteinasen, keine Wirkung zeigten.

BEISPIEL 8

Auswirkung von Proteinase-Inhibitoren auf durch Tachykinin herbeigeführte Kontraktion der glatten Muskulatur der Atemwege

Die Verfahren, die eingesetzt wurden, um Luftröhrengewebe herauszuschneiden, das Gewebe anzuordnen und elektrisch zu stimulieren, waren mit den oben beschriebenen identisch. Die Reaktionen auf Tachykinine und auf Leu-Thiorphan, kumulative Dosis/Reaktion-Kurven auf Substanz P (Peninsula Labs), Neurokinin A (Peninsula Labs) und Neurokinin B (Peninsula Labs) wurden unter Einsatz von Konzentrationen im Bereich von 10&supmin;¹¹ M bis 10&supmin;&sup5; M in Gegenwart und Abwesenheit von Leu-Thiorphan (10&supmin;&sup5; M, 15 min; Squibb Pharmaceutical) erhalten. Jede der nachfolgenden Konzentrationen von Tachykinin wurde zugegeben, nachdem die vorhergehende Kontraktion ein Plateau erreicht hatte.
Durch Stimulation mit elektrischem Feld herbeigeführte Kontraktionen wurden in Gegenwart von Substanz P (10&supmin;¹&sup0; M), Neurokinin A (10&supmin;¹&sup0; M) und Neurokinin B (10&supmin;¹&sup0; M) in Kombination mit entweder Captopril (10&supmin;&sup5; M; 15 min; Squibb Pharmaceutical), Bestatin (10&supmin;&sup5; M; 15 min; Sigma) oder Leupeptin (10&supmin;&sup5; M; 15 min; Peninsula Labs) gemessen, um zu ermitteln, ob die Hemmung von Angiotensin konvertierendem Enzym (ACE), Aminopeptidasen oder Serin- oder Thiol-Proteinasen für die Verstärkung der Reaktionen auf die Stimulation mit elektrischem Feld verantwortlich waren.
Die Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Für die Dosis/Reaktion-Kurven auf Tachykinine wurden die Mittelwerte zwischen zwei Gruppen in jeder Konzentration mittels eines ungepaarten t-Tests analysiert. Zur Untersuchung der Stimulation mit elektrischem Feld wurden die Reaktionen durch Einfach-Analyse der Varianz und Newman-Keuls-Mehrfachbereichstest verglichen. Signifikanz wurde bei p < 0,05 angenommen.
Substanz P, Neurokinin A und Neurokinin B alleine verursachten eine Kontraktion der glatten Muskulatur, jedoch nur in Konzentrationen von 10.6 M oder darüber für Neurokinin A und 10&supmin;&sup5; M für Substanz P und Neurokinin B (Fig. 12). Die durch Tachykinine herbeigeführten Kontraktionen wurden bei 10&supmin;&sup6; M und 10&supmin;&sup5; M verglichen, was auf folgende Reihung der Stärke nach hinweist:
Neurokinin A > Substanz P > Neurokinin B,
wobei jedoch bei 10&supmin;&sup6; M nur zwischen Neurokinin A und Substanz P (p < 0,05) oder bei 10&supmin;&sup5; M nur zwischen Neurokinin A und Neurokinin B (p < 0,01) statistisch signifikante Unterschiede erzielt wurden. Die Zugabe von Leu-Thiorphan (10&supmin;&sup5; M) alleine hatte keine wesentliche Auswirkung auf die Ruhespannung, verschob jedoch die Dosis/Reaktion-Kurven für Substanz P, Neurokinin A und Neurokinin B um etwa eine log-Einheit für Substanz P, zwei log-Einheiten für Neurokinin A und drei log-Einheiten für Neurokinin B zu niedrigeren Konzentrationen (Fig. 12). Die Reihung der Tachykinine nach der Stärke in Gegenwart von Leu-Thiorphan war:
Neurokinin A = Neurokinin B > Substanz P.
Leu-Thiorphan verstärkte die Reaktionen auf Tachykinine in Abhängigkeit von der Konzentration, mit einem Schwellenwert von etwa 10&supmin;&sup7; M und einer Maximalwirkung bei 10&supmin;&sup5; M (Fig. 13). Im Gegensatz zu den Auswirkungen von Leu-Thiorphan verstärkte keiner der anderen Peptidase-Inhibitoren die Reaktion auf die Stimulation mit elektrischem Feld in Gegenwart von Substanz P, Neurokinin A oder Neurokinin B (10&supmin;&sup7; M).
Substanz P, Neurokinin A und Neurokinin B verstärkten die Reaktionen auf die Stimulation mit elektrischem Feld jeweils in Abhängigkeit von der Konzentration. Substanz P verstärkte die Reaktion auf die Stimulation mit elektrischem Feld wesentlich stärker als Neurokinin A und Neurokinin B. (DPro², DTrp7,9)-Substanz P (10&supmin;&sup5; M; ein spezifischer Tachykinin-Antagonist) hemmte die durch Substanz P und Neurokinin A und Neurokinin B herbeigeführten, verstärkenden Reaktionen auf die Stimulation mit elektrischem Feld (Fig. 14).
Diese Untersuchungen beweisen, daß Substanz P, Neurokinin A und Neurokinin B die Kontraktion der glatten Muskeln verursachen und die Reizleitung zur glatten Muskulatur der Atemwege in unterschiedlichem Ausmaß verstärken. In den Atemwegen vorhandene Enkephalinase ist ein wichtiger Inhibitor für durch Tachykinin herbeigeführte Effekte. Der Mechanismus, nach dem Leu-Thiorphan die durch Tachykinin induzierten Wirkungen verstärkt, besteht höchstwahrscheinlich darin, den Abbau der Peptide durch Enkephalinase zu verhindern. Die Anfälligkeit verschiedener Tachykinine gegenüber Hydrolyse durch Enkephalinase kann die Erklärung für die Änderung in der Reihung der Stärke bei durch Tachykinin herbeigeführten Effekten sein.
Der Substanz P-Antagonist (DPro², DTrp7,9)-Substanz P hemmte die durch Stimulation mit elektrischem Feld herbeigeführte Kontraktion, was darauf hinweist, daß die Wirkungen von Tachykininen über Tachykinin-Rezeptoren vermittelt werden, weil dieser Antagonist für Tachykinine selektiv ist (Leander, S.R. et al., "Nature" 294, 467-469 [1981]).
Wie oben gezeigt, können die durch Tachykinin herbeigeführten Wirkungen in der Frettchen-Trachea durch Enkephalinase vermittelt werden, weil Leu-Thiorphan die durch Tachykinin herbeigeführten Wirkungen verstärkte, während andere Inhibitoren von Proteinasen und Peptidasen dies nicht taten. Zu den oben beschriebenen Inhibitoren gehören: Captopril, ein Inhibitor für Angiotensin konvertierendes Enzym; Bestatin, ein Inhibitor für Aminopeptidasen; und Leupeptin, ein Inhibitor für Serin- oder Thiol-Proteinasen. Weiters waren die Auswirkungen von Leu-Thiorphan auf die durch Tachykinin herbeigeführten Kontraktionen von der Konzentration abhängig (Fig. 13), was darauf hinweist, daß die Aktivität von endogener Enkephalinase in engem Zusammenhang mit den durch Tachykinin induzierten Wirkungen steht.

BEISPIEL 9

Wirkungen von Enkephalinase-Inhibitoren auf durch Bradykinin herbeigeführte Kontraktion der glatten Muskulatur der Atemwege

Es wurden die gleichen Verfahren angewandt, wie in Beispiel 7 beschrieben. Bradykinin (Sigma) und Lys-Bradykinin (Kallidin; Sigma) verursachten eine dosisabhängige Kontraktion (10&supmin;¹¹ bis 10&supmin;&sup5; M) (Fig. 15). In Abwesenheit von Enkephalinase-Inhibitoren war Bradykinin wirksamer als Lys-Bradykinin. Leu-Thiorphan (10&supmin;&sup6; M) verschob die Dosis/Reaktion-Kurven um 1 bis 1,5 log-Einheiten zu niedrigeren Konzentrationen. In Gegenwart von Leu-Thiorphan war die Kontraktionswirkung von Bradykinin und Lys-Bradykinin gleich stark. Diese Untersuchung zeigt, daß in Atemwegsgewebe vorhandene Enkephalinase die Wirkung der kinin-induzierten Kontraktion der glatten Muskulatur verstärkt.

BEISPIEL 10

Wirkungen von Enkephalinase-Inhibitoren auf durch Substanz P herbeigeführte Kontraktion der glatten Muskulatur des Ileums

Unter Anwendung ähnlicher Verfahren wie in Beispiel 7 beschrieben für die glatte Muskulatur von Frettchen-Atemwegen wurden die glatte Längsmuskulatur des Ileums untersucht. Im Vergleichszustand verursachte Substanz P in Abwesenheit von Enkephalinase-Inhibitoren eine dosisabhängige, tonische Kontraktion (Fig. 16). Leu- Thiorphan (10&supmin;&sup5; M) verschob die Dosis/Reaktion-Kurve um eine 1 log-Einheit zu niedrigeren Konzentrationen. Diese Untersuchung zeigt, daß im Gastrointestinal- (Ileum-)Gewebe vorhandene Enkephalinase die Wirkung der durch Substanz P herbeigeführten Kontraktion der glatten Muskulatur verringert.

BEISPIEL 11

Chemotaktischer Assay

Die normalen Funktionen von reifen Neutrophilen sind Chemotaxis, Phagozytose, mikrobizide Wirkung und Spaltung von Fremdmaterial. Am Ort der Entzündung werden chemotaktische Faktoren erzeugt, die verschiedene immunologische Zellen, einschließlich von Neutrophilen, an diese Stelle ziehen. Der Mechanismus, welcher der chemotaktischen Anziehung von Neutrophilen an die Entzündungsstelle zugrunde liegt, ist nicht vollständig geklärt. Enkephalinase wurde mit dem Mechanismus in Zusammenhang gebracht. Connelly, J.C. et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)" 82, 8737-8741 (1985). In bestimmten Fällen von Hyperimmunreaktionen kann eine abnormale Zufuhr von Neutrophilen und anderen Immunzellen zusätzliche Gewebeschädigung verursachen.
Es wurde festgestellt, daß Enkephalinase an die Zellmembran von menschlichen Neutrophilen gebunden wird. Connelly et al., siehe oben. An die Membran von Neutrophilen gebundene Enkephalinase spaltet das chemotaktische Peptid fMet-Leu-Phe (ebenda). Neutrophil-Degranulation und Chemotaxis erfordern die Spaltung chemotaktischer Peptide (Smith, R. et al., "Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol." 44, 576 [1985]) und Aswanikumar, S. et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)" 73, 2439-2442 [1976]). Daher ist vermutet worden, daß an die Neutrophil-Membran gebundene Enkephalinase mit dem chemotaktischen Signal assoziiert werden kann, indem fMet-Leu-Phe in unmittelbarer Nähe des Neutrophil-Rezeptors gespalten wird. Dieser Abbau würde die lokale Konzentration des chemotaktischen Peptids regulieren.
Es wurde ein Assay eingesetzt, um die Auswirkungen von Enkephalinase auf Neutrophil-Chemotaxis zu testen. Ein im Handel erhältlicher chemotaktischer Assay (Chemotaxis Kit, Neuroprobe, Cabin John, Md) wurde verwendet und wie nachstehend beschrieben modifiziert. Neutrophile wurden durch Sedimentation über Dextran aus dem peripheren Blut menschlicher Spender isoliert. Eine Probe von Neutrophilen wird auf einem 5 µm-Filter in einer Chemotaxis-Kammer angeordnet, die Aliquote an Testmaterial enthält. Jeder Test wurde 1 h lang bei 37ºC mit 3 bis 6 Wiederholungen durchgeführt. Anschließend wurde die Anzahl an wandernden Neutrophilen in jeder Kammer gezählt. Das chemotaktische Potential wird durch die Anzahl an Zellen in 5 ausgewählten Flächeneinheiten bestimmt.
Es wurden verschiedene spezifische Inhibitoren von Enkephalinase verwendet, um die Rolle von Enkephalinase bei der Chemotaxis von Neutrophilen zu ermitteln. Die chemotaktische Aktivität wird als Gesamtanzahl an Neutrophilen berichtet, die unter 100-facher Vergrößerung in 5 Feldern der Set-Membran zu beobachten sind. Somit ist eine bestimmte Testzusammensetzung umso stärker chemotaktisch, je größer diese Anzahl ist.

Tabelle 3

Chemotaktische Aktivität

Neutrophil-Migration (% des Vergleichs)
Formyl-Met-Leu-Phe, 1 µM 100
Formyl-Met-Leu-Phe + Thiorphan, 10 µM 29 ± 19 (n=5)
Formyl-Met-Leu-Phe + Phosphoramidon, 10 µM 65 (n=1)
Somit moduliert Neutrophil-Enkephalinase die chemotaktische Aktivität.

BEISPIEL 12

Enkephalinase-Spaltung von Bombesin

Es wurde gezeigt, daß Bombesin und bombesin-artige Peptide als Wachstumsfaktoren für Atemwegs-Epithelzellen (Willey et al., siehe oben) und bei Kleinzellen-Lungenkrebs beim Menschen (SCLC) (Cuttitta et al., "Nature" 316, 823-826 [1985]) fungieren. Es zeigte sich, daß ein monoklonaler Antikörper für Bombesin das Wachstum von SCLC-Zellen bei Mäusen in vivo hemmte (ebenda).
Bombesin (10&supmin;&sup4; M) und (Leu&sup5;)-Enkephalin (10- M) wurden zu gereinigter Ratten-Nieren-Enkephalinase (50 ng in 150 µl 50 mM, pH 7,4, HEPES-Puffer, der 0,02% Triton X-100 enthielt) zugegeben. Nach 30 min bei 37ºC wurden 50 µl 2 N HCl zugegeben, und das Inkubationsmedium mittels HPLC (C18-µBondapak-Säule, 30 min linearer Gradient von 0 bis 75% Acetonitril in 0,1%-iger Trifluoressigsäure) analysiert. Obwohl festgestellt wurde, daß 15% des (Leu&sup5;)-Enkephalins abgebaut war, waren nicht weniger als 80% des Bombesins hydrolysiert. Bombesin scheint ein gutes Substrat für Enkephalinase zu sein. Die Verabreichung therapeutisch wirksamer Mengen an Enkephalinase kann das Wachstum eines Tumors, der Bombesin zur Zellvermehrung braucht, verzögern.

BEISPIEL 13

In vivo-Untersuchungen der Auswirkungen von Enkephalin auf durch Substanz P herbeigeführte Extravasation

Diese Untersuchung zeigt, daß die Injektion von Substanz P die Extravasation von Evans Blue-Farbstoff verstärkt. Eine Vorbehandlung von Tieren mit Enkephalinase verringerte diese Effekte.
Für diese Untersuchung wurden männliche Long Evans-Ratten verwendet. Jede Ratte (250 g) wurde durch Injektion von Natriummethylhexabarbital (75 mg/kg, i.p.) anästhesiert und in Rückenlage gebracht. Für intravaskuläre Injektionen wurden venöse Einschnitte in die Jugular- oder die Oberschenkelvene vorgenommen.
Die Extravasation von Evans Blue-Farbstoff wurde gemessen, um Änderungen der Gefäßdurchlässigkeit zu untersuchen. Nach intravaskulärer Injektion vermischt sich der Farbstoff rasch im Gefäßsystem, wo er sich an Serumalbumin bindet, wodurch ein Farbstoff-Protein-Komplex mit hohem Molekulargewicht gebildet wird. Der Farbstoff- Protein-Komplex verbleibt im Gefäßsystem, solange die Blutgefäß-Durchlässigkeit nicht erhöht wird. Änderungen der Durchlässigkeit wurden durch Injektion von Evans Blue- Farbstoff-Lösung (0,250 ml einer 30 mg/ml Lösung in Salzlösung) in das venöse Kreislaufsystem aufgezeichnet. Nach 1 min wurde Substanz P (1 µg/kg in Salzlösung) injiziert. 5 min später wurde das Tier 2 min lang mit einer Fixierlösung perfundiert, die aus 0,05 M Citratpulver (pH 3,5) bestand, der 1% Paraformaldehyd enthielt. Das saure Fixiermittel verhindert, daß der Evans Blue-Farbstoff aus den Geweben diffundiert. Nach der Fixierung wurde die Haut der Pfoten und der Nase vom darunterliegenden Bindegewebe abgetrennt, gewogen und in 2,0 ml Formamid (50ºC, 24 h) eingelegt, um den Farbstoff zu extrahieren. Die aus jedem Gewebe extrahierte Farbstoffmenge wurde ermittelt, indem das Absorptionsvermögen bei 620 nm gemessen und die Ergebnisse mit einer Standardkurve bekannter Farbstoffkonzentrationen verglichen wurden. Der Gehalt an Evans Blue wird als ng Farbstoff/g Gewebe (Naßgewicht) ausgedrückt.
Erste Versuche waren dazu bestimmt, die Dosis an Substanz P zu ermittelt, die reproduzierbare, mäßige Reaktionen bewirkte. Versuche zeigten, daß 1 µg/kg eine zufriedenstellende Dosis war. Darauffolgende Versuche waren dazu bestimmt, zu ermittelt, ob Enkephalinase die Reaktionen auf Substanz P hemmt.
Enkephalinase wurde unter Einsatz bekannter Verfahren (Malfroy und Schwartz, "J. Biol. Chem." [1984]) aus Ratten-Nieren gereinigt und die Konzentration zur Verwendung mit 1 mg/ml Puffer gewählt. Der Puffer bestand aus 5 mM HEPES (pH 7,4), das 0,1% Triton X-100 und 500 mM Methyl-α-D-glucopyranosid enthielt. Die Auswirkung von Enkephalinase auf die Reaktion auf Substanz P wurde durch Injektion des Enzyms (100 µg i.v. pro Tier) 15 min vor der Injektion von Substanz P untersucht.
Die Ergebnisse dieser Versuche werden in Tabelle 4 gezeigt. Diese Untersuchungen zeigen, daß Substanz P die Gefäßdurchlässigkeit in der Haut der Nase und Pfoten erhöhte. Untersuchungen zeigten, daß 1,0 µg/kg an Substanz P (intravenös) die Durchlässigkeit für Evans Blue-Farbstoff erhöhte und daß Enkephalinase (100 µg) die Gefäßreaktionen auf Substanz P in der Haut in drei von vier Experimenten hemmte. TABELLE 4 Auswirkung von Enkephalinase auf die Gefäßdurchlässigkeit Versuch Nr. Vergleich Enkenhalinase % des Vergleichs Nase Versuch Nr. R-4 Versuch Nr. R-6 Pfoten Versuch Nr. R-4 Versuch Nr. R-6 * Evans Blue-Gehalt in ng/g Naßgewicht

BEISPIEL 14

In Vivo-Auswirkungen von Enkephal in auf den Luftstromwiderstand

Die Auswirkung von Enkephal in auf die glatte Muskulatur der Atemwege in vivo wird unter Anwendung bereits veröffentlichter Verfahren (Holtzman et al., "Am. Rev. Respirat. Disease" 127, 686 [1983]) untersucht. Der Luftströmungswiderstand wird bei anästhesierten Tieren (Natriumpentobarbital, 30 mg/kg, i.p., oder Chloralose, 40 bis 60 mg/kg, i.v.) gemessen. Ein Trachealtubus wird in die obere Trachea eingeführt und das Tier entsprechend seiner Größe mit einem Ventilator mit einem konstanten Volumen an Luft versorgt. Große Tiere, wie z. B. Hunde, erfordern Beatmungsvolumina von 10 ml/kg bei einer Frequenz von 30 Atemzügen pro Minute. Der Ösophagealdruck wird unter Verwendung eines Ballonkatheters gemessen, der in die Mitte des Ösophagus eingeführt wird. Der Transpulmonaldruck ist die Druckdifferenz zwischen dem Trachealtubus und dem Ösophagealkatheter. Die Luftstromraten werden mit einem empfindlichen Pneumotachographen gemessen, und der Luftstromwiderstand wird nach einem elektrischen. Subtraktionsverfahren berechnet.
Tachykinine, wie z. B. Substanz P, werden als Aerosol, durch Intratrachealinstillation oder intravenös verabreicht. Für nachfolgende Untersuchungen der Reaktionsfähigkeit der Atemwege wird eine Dosis an Vermittlerpeptid eingesetzt, das den Luftstromwiderstand um etwa das Doppelte erhöht. Es erfolgt ein Vergleich der Reaktion auf den Peptid-Agonisten in Abwesenheit und Gegenwart verschiedener Dosen von Enkephalinase.

BEISPIEL 15

in vivo-Messung der Entzündungszellen-Reaktionen

Neutrophil-Chemotaxis, das Vorhandensein von Eosinophilen und anderer Entzündungszellen sowie die Mastzellen-Degranulation in vivo wird in Biopsie-Proben von Atemwegs- und anderen Geweben gemessen. Die Gewebe werden von Vergleichstieren, von mit Substanz P oder anderen endogenen Peptidvermittlern behandelten Tieren sowie von Tieren, die mit Enkephalinase behandelt wurden, bevor oder nachdem die Tiere endogenen Peptiden ausgesetzt wurden, entnommen. Die Proben werden in 10%-igem, gepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet; es werden von jedem Gewebe 3 Schnitte mit einer Dicke von 4 mm erhalten. Die Schnitte werden mit Hematoxylin-Eosin, gefolgt von Naphthol-AS-D-Chloracetat-Esterase eingefärbt. Die Anzahl an Neutrophilen oder anderen Zellen wird für jeden Schnitt jeder Biopsie-Probe ermittelt, um die Atemwegsentzündung zu bestimmen. Die Zellzählungen erfolgen bei 630facher Vergrößerung. Das Volumen an Epithel oder anderem Gewebe wird unter Verwendung eines Digitizers (Modell 614B; Talos Inc.) ermittelt, um die Fläche und die Dicke des Schnitts (4 mm) zu erhalten, und die Daten werden als die Anzahl an Zellen pro Gewebevolumen ausgedrückt.

BEISPIEL 16

Wirkungen von Enkephalinase auf die Kontraktion der glatten Muskulatur des Ösophagus in vivo

Die Kontraktion des unteren Ösophagus-Schließmuskels bei anästhesierten Tieren wird unter Einsatz von Modifikationen bereits veröffentlichter Verfahren (Reynolds, et al., "Am. J. Physiol." [Gastrointestinal Physiology] 246, 346 [1984]) gemessen. Ein Kathetersystem aus zwei Schläuchen (aus einem zum Aufzeichnen des Drucks und zur Infusion von Fluid oder Wirkstoff, und einem anderen zur Rückgewinnung des Fluids im Ösophagus) wird in den Ösophagus eingeführt und Wasser durch den Katheter gepumpt (Flußrate: etwa 0,75 ml/min). Das Fluid wird kontinuierlich aus dem Ösophagus abgezogen, um das Fluidvolumen im Ösophagus konstant und den Ösophagus offen zu halten. Durch Fixieren des unteren Endes des Ösophagus, um eine Verkürzung der Längsmuskeln zu verhindern, werden nur Zirkularmuskelkontraktionen verzeichnet. Der Katheter zur Druckmessung wird an einen Meßwandler (z. B. von Statham, Modell P23) angeschlossen und der Druck auf einem Schreiber aufgezeichnet.

BEISPIEL 17

Auswirkung von Enkephalinase auf renale Hypertonie bei Ratten

Erhöhter Arteriendruck oder Hypertonie kann durch Nierenerkrankungen verursacht werden. Eine Art von renaler Hypertonie ist auf die Aktivierung des Renin-Angiotensin-Systems zurückzuführen. Renin, ein proteolytisches Enzym, das von der Niere erzeugt wird, wandelt Angiotensinogen in das Decapeptid, Angiotensin I, um, das wiederum in Angiotensin II konvertiert wird. Angiotensin II ist eine wirksame blutdruckerhöhende Verbindung (Pressor) und übt diese Pressorwirkung direkt auf die glatte Arteriolenmuskulatur aus. Enkephalinase spaltet Angiotensin I, wodurch dessen Umwandlung in Angiotensin II verhindert wird, und ist daher wahrscheinlich ein wirksames Therapeutikum zur Behandlung von renaler Hypertonie.
Die Auswirkungen von Enkephalinase auf renale Hypertonie wird gemäß folgender Vorgangsweise untersucht: eine Nierenschlagader wird verengt, wodurch hohe Renin-Konzentrationen, gefolgt von hohen Mengen an Angiotensin, erzeugt werden, was zu systemischer Hypertonie führt.
Der systemische Blutdruck wird überwacht, indem durch chirurgischen Eingriff ein Katheter in eine Oberschenkelarterie eingesetzt und über den Rücken aus dem Körper heraus geführt wird. Das ermöglicht die präzise Überwachung des Blutdrucks bei nicht anästhesierten und in ihrer Freiheit nicht eingeschränkten Tieren. Die Auswirkungen von Enkephalinase und Enkephalinase-Inhibitoren auf den arteriellen Blutdruck und die Mengen an Renin, Angiotensin I und Angiotensin II im Blut werden überwacht.

Claims

1. Enkephalinase und funktionelle Derivate davon zur pharmazeutischen Verwendung.

2. Pharmazeutisches Präparat, das eine Enkephalinase mit gelöschter Zytoplasma-Domäne umfaßt.

3. Präparat nach Anspruch 2, das eine Salbe zur epidermalen Anwendung umfaßt.

4. Pharmazeutisches Präparat, das eine Enkephalinase mit gelöschter Transmembran-Domäne umfaßt.

5. Verwendung einer Enkephalinase oder eines funktionellen Derivats davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Störungen, die mit endogenen Peptiden in Zusammenhang stehen, die durch Enkephalinase spaltbar sind.

6. Verwendung nach Anspruch 5, worin die endogenen Peptide Tachykinine sind.

7. Verwendung nach Anspruch 6, worin das endogene Peptid Substanz P ist.

8. Verwendung nach Anspruch 6, worin das endogene Peptid Neurokinin A ist.

9. Verwendung nach Anspruch 6, worin das endogene Peptid Neurokinin B ist.

10. Verwendung nach Anspruch 6, worin das endogene Peptid Physalaemin ist.

11. Verwendung nach Anspruch 6, worin das endogene Peptid Kassinin ist.

12. Verwendung nach Anspruch 6, worin das endogene Peptid Eledoisin ist.

13. Verwendung nach Anspruch 5, worin das endogene Peptid ein chemotaktisches Peptid ist.

14. Verwendung nach Anspruch 5, worin das endogene Peptid Angiotensin i ist.

15. Verwendung nach Anspruch 5, worin das endogene Peptid Bombesin ist.

16. Verwendung nach Anspruch 5, worin die endogenen Peptide Kinine sind.

17. Verwendung nach Anspruch 16, worin das endogene Peptid Bradykinin ist.

18. Verwendung nach Anspruch 16, worin das endogene Peptid Kallidin ist.

19. Verwendung nach Anspruch 5, worin die pathologische Störung eine Entzündung ist.

20. Verwendung nach Anspruch 5, worin die Störung allergische Dermatitis ist.

21. Verwendung nach Anspruch 5, worin die Störung eine Atemwegserkrankung ist.

22. Verwendung nach Anspruch 21, worin die Atemwegserkrankung Asthma ist.

23. Verwendung nach Anspruch 5, worin die Störung ein mit Tachykininen und/oder Kininen in Zusammenhang stehender Husten ist.

24. Verwendung nach Anspruch 5, worin die Störung ein Tumor ist.

25. Verwendung nach Anspruch 24, worin die Störung mit einem karzinoiden Tumor in Zusammenhang steht.

26. Verwendung nach Anspruch 24, worin der Tumor Kleinzellen-Lungenkrebs ist.

27. Verwendung nach Anspruch 5, worin die Störung renale Hypertonie ist.

28. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 27, worin der Enkephalinase die Zytoplasma- und die Transmembran-Domäne fehlen.

29. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 27, worin der Enkephalinase die Transmembran-Domäne fehlt.

30. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 27, worin der Enkephalinase die Zytoplasma-Domäne fehlt.

31. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 30, worin die Enkephalinase nicht von damit in Zusammenhang stehender nativer Glykosylierung begleitet ist.

32. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 31, worin das Medikament zur intramuskulären Verabreichung bestimmt ist.

33. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 31, worin das Medikament zur intravenösen Verabreichung bestimmt ist.

34. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 31, worin das Medikament zur Verabreichung durch Intrapulmonalinhalation bestimmt ist.

35. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 31, worin das Medikament zur topischen Anwendung bestimmt ist.

36. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 31, worin das Medikament zur Verabreichung von Enkephalinase in einer therapeutisch wirksamen Dosis von 0,001 mg/kg bis 25 mg/kg bestimmt ist.

37. Verwendung einer Enkephalinase oder eines funktionellen Derivats davon bei der Herstellung eines Medikaments zur topischen Anwendung in einer therapeutisch wirksamen Dosis von 0,01 mg/kg bis 20 mg/kg zur Behandlung von Störungen, die mit endogenen Peptiden in Zusammenhang stehen, die durch Enkephalinase spaltbar sind.