DE3789870T3

DE3789870T3 - Von thrombin abstammende polypeptid-zusammensetzungen und methoden für ihre benutzung.

Info

Publication number: DE3789870T3
Application number: DE3789870T
Authority: DE
Inventors: Darrell Carney; Kevin Glenn
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1986-10-31
Filing date: 1987-10-30
Publication date: 1997-10-02
Anticipated expiration: 2007-10-31
Also published as: JP3054150B2; US5352664A; EP0328552B2; WO1988003151A3; AU8239987A; EP0328552B1; WO1988003151A2; EP0328552A1; DE3789870T2; US6627731B1; US5500412A; JPH02501028A; DE3789870D1; ATE105842T1

Description

Die vorliegende Erfindung ist auf chemische Verbindungen, deren Verwendung und Verfahren gerichtet, die sich zur Regulation der vom Thrombinrezeptor vermittelten Zellstimulation eignen. Insbesondere richtet sich die Erfindung auf von Prothrombin abgeleitete Peptide, deren Verwendung und Verfahren, bei denen derartige Peptide zur Förderung der Wundheilung und Hemmung von Narbenbildung, Gewebeadhäsionen, Blutgerinnung, Tumorangiogenese, Tumormetastase und Lungenödemen eingesetzt werden.
Menschliches α-Thrombin scheint eine wachstumsfördernde Aktivität für eine Reihe von Zellen aus verschiedenen Geweben aufzuweisen. Zum Beispiel ist gezeigt worden, daß α-Thrombin die Proliferation von Fibroblastenzellen in Kultur ohne Zugabe von Serum oder anderen gereinigten Wachstumsfaktoren einleitet, eine synergistische Wirkung zusammen mit epidermalem Wachstumsfaktor in bestimmten Hamsterfibroblastenzellen und menschlichen Endothelzellen aufweist und die Zellteilung oder DNA-Synthese in Säugerlinsenepithelzellen und Säugermilzzellen einleitet. Dennoch ist die Verwendung von Thrombin als Wachstumsfaktor und seine mögliche Bedeutung bei der Wundheilung noch nicht allgemein anerkannt. Dies mag zum Teil seine Ursache in der Komplexität der Beteiligung von Thrombin an der Gerinnung, der Blutplättchenaktivierung und der Einleitung der Zellproliferation sowie der komplexen Regulation von Thrombin und thrombinähnlichen Molekülen durch Serumproteaseinhibitoren und durch von Zellen abgesonderte Proteasenexine haben. Diese Komplexität und der hohe Grad der physiologischen Regulation stutzen jedoch die mögliche Bedeutung dieses Initiationsweges der Wundheilung.
Thrombin kann auch eine Rolle bei der Metastase und Angiogenese von Tumoren spielen. Im allgemeinen ist für ein Wachstum des Tumors auf eine Größe von mehr als wenigen Millimetern Durchmesser eine Proliferation des Gefäßendothels und die Bildung von Vesikelwänden daraus erforderlich, um die Zellen im Innern der Tumormasse mit Blut und Nährstoffen zu versorgen. Thrombin verstärkt wahrscheinlich diesen Prozeß aufgrund seiner Fähigkeit, die Proliferation von Endothelzellen zu induzieren. Ferner ist gezeigt worden, daß Thrombin die normalen interzellulären Endothelzellkontakte unterbricht, die wichtig sind, um zu verhindern, daß Zellen und Plasmafaktoren die Mikrogefäße verlassen oder in diese eindringen. Die vorliegende Hypothese, daß Thrombin möglicherweise die Metastase durch Unterbrechen dieser Kontakte fördert, wird durch Untersuchungen gestützt, die eine Korrelation zwischen einem verringerten Spiegel von Antithrombin III (das Thrombin und andere Proteasen aus dem Plasma entfernt) und einer verstärkten Tumormetastase zeigen.
Verschiedene Untersuchungen haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung zu dem Schluß geführt, daß Zelloberflächen-Thrombinrezeptoren mit hoher Affinität (vgl. Carney und Cunningham, Cell, Bd. 15 (1978), S. 1341) möglicherweise an der Tumormetastase und -angiogenese beteiligt sind. Zum Beispiel haben Untersuchungen gezeigt, daß Thrombinrezeptoren als Bindungsstellen für Gewebeplasminogenaktivator dienen können, wobei dieses Molekül von metastatischen Tumorzellen abgesondert wird. Darüber hinaus zeigen andere Untersuchungen die Beteiligung von Gewebeplasminogenaktivator an der Metastase und der Angiogenese. Viele wirkungen von Plasminogenaktivator sind also möglicherweise durch seine Wechselwirkung mit dem Zelloberflächen-Thrombinrezeptor vermittelt. Es wird daher vorgeschlagen, daß die Stimulierung des Thrombinrezeptors dazu dient, die Tumormetastase zu fördern, während die Hemmung des Rezeptors die metastatische Aktivität verringert.
Es ist auch gezeigt worden, daß Thrombin zu Veränderungen in der Struktur und Funktion von Zellen führt, die die Endothelgefäße bilden. Diese Untersuchungen deuten darauf hin, daß Thrombin möglicherweise eine zentrale Rolle bei der Entwicklung von Lungenödemen sowie Ödemen anderer Gewebe spielt. Zum Beispiel ist gezeigt worden, daß Thrombin die Durchlässigkeit von Endothelzell-Monoschichten für Makromoleküle erhöht, den arteriellen Druck erhöht und den Lungengefäßwiderstand erhöht, die Kontraktion der glatten Muskulatur induziert und die transkapillare Fluidfiltration erhöht. Alle diese Wirkungen werden möglicherweise durch die Wechselwirkung von Thrombin mit den Zelloberflächen-Thrombinrezeptoren vermittelt.
In einer Reihe neuerer Untersuchungen ist versucht worden, den Mechanismus für die durch Thrombin vermittelte Zellstimulation aufzuklären. Diese Untersuchungen haben für die Erfinder der vorliegenden Anmeldung gezeigt, daß die Initiation der Zellproliferation durch Thrombin zwei Signale erfordert. Das erste Signal scheint von der Bindung des Thrombinmoleküls an den Zelloberflächen-Thrombinrezeptor hoher Affinität abzuhängen, während das zweite Signal aus der enzymatischen Aktivität des Thrombinmoleküls resultiert. So können im Gegensatz zu α-Thrombin weder DIP-α- Thrombin (ein proteolytisch inaktives Thrombinderivat, das seine Rezeptorbindungsaktivität behält) noch gammα-Thrombin (ein esterolytisch aktives, jedoch nicht bindendes Thrombinderivat) die DNA-Synthese oder die Zellteilung initiieren. Die gleichzeitige Zugabe dieser beiden nicht-mitogenen Thrombinderivate initiiert jedoch die DNA-Synthese und die Zellteilung auf einem Niveau, das dem durch α-Thrombin initiierten vergleichbar ist.
Die gleichen Thrombinderivate sind verwendet worden, um intrazelluläre Ereignisse, die durch die Besetzung des Thrombinrezeptors hoher Affinität stimuliert werden, von Ereignissen zu unterscheiden, die aus der proteolytischen Spaltung resultieren. α-Thrombin und gammα-Thrombin stimulieren beide eine Na&spplus;/K&spplus;-Atpase-Aktivität, die Phosphoinosit-Umsetzung und den Ca²&spplus;-Metabolismus, während DIP-α-Thrombin nicht stimulierend wirkt. Diese Ereignisse können also der enzymatischen Aktivität von Thrombin zugeschrieben werden und nicht der Besetzung des Rezeptors. Ferner können diese Signale (die Freisetzung von Diacylglycerin und Inosittriphosphat, die eine Ca²&spplus;-Mobilisierung bewirken) wiederum Proteinkinase C aktivieren. Dementsprechend ist gezeigt worden, daß Phorbolmyristatacetat (PMA), das Proteinkinase C aktiviert, als Ersatz für enzymatisch aktives gammα-Thrombin dienen und die Zellteilung in Gegenwart von den Rezeptor sättigenden Mengen an DIP-α-Thrombin oder monoklonalen Antikörpern gegen den Thrombinrezeptor initiieren kann. Daß enzymatisch aktives Thrombin erforderlich ist, steht also möglicherweise indirekt in Beziehung zu seiner Aktivierung von Proteinkinase C.
Die genauen Signale, die durch die mit hoher Affinität erfolgende Wechselwirkung von Thrombin mit seinem Rezeptor erzeugt werden, sind schwieriger zu definieren. Es ist jedoch kürzlich gezeigt worden, daß DIP-α-Thrombin einen vorübergehenden Anstieg an intrazellulärem cAMP stimuliert. Im Gegensatz zu den Ionenflüssen und der Umsetzung von Phosphoinositid werden die cAMP-Spiegel durch DIP-α-Thrombin maximal stimuliert, sie werden jedoch nicht durch gammα-Thrombin stimuliert. Versuche, DIP-α- Thrombin durch cAMP-Analoga zu ersetzen, waren jedoch nicht erfolgreich. Daher ist es möglich, daß die Besetzung des Thrombinrezeptors eine Anzahl von Signalen zusätzlich zu den Veränderungen der cAMP-Spiegel erzeugt.
Butkowski et al., The Journal of Biological Chemistry, Bd. 252/14 (1977) , S. 4942-4957, zeigen die Primärstrukturen von menschlichem α- Thrombin und seinem Vorläufer, Prä-Thrombin 2, die aus NH&sub2;-terminalen Sequenzdaten und der Sequenz der Bromcyanpeptide bestimmt wurden. Menschliches Thrombin ist wie Rinderthrombin ein zweikettiges Molekül, das aus Prä-Thrombin 2 durch Faktor Xa-Spaltung einer Arg-Ile-Bindung (Reste 49 und 50) erzeugt wird. Die Einwirkung von Thrombin auf menschliches Prä- Thrombin 2 führt zu einem Molekül, das an seinem NH&sub2;-Terminus um 13 Reste kürzer ist als sein Gegenstück aus Rind.
Ein Problem, das mit der klinischen Anwendung von Thrombin, um direkt derartige Vorteile zu nutzen, verbunden ist, besteht in seiner Empfindlichkeit gegenüber einer Proteaseinhibition durch Serumantithrombine. Derartige Probleme haben bisher die Verwendung von Thrombin in der Klinik verhindert und dazu geführt, daß die Erfinder der vorliegenden Anzahl kleinerer Thrombin-aktive und Thrombin-antagonistische Polypeptide identifiziert haben, die gegenüber den Hemmwirkungen von Thrombininhibitoren nicht empfindlich sind.
Mit der vorliegenden Erfindung wird eine Anzahl von kleineren Polypeptiden bereitgestellt, die so zurechtgeschnitten worden sind, daß sie mit dem Thrombinrezeptor in Wechselwirkung treten, um selektiv die mit der Besetzung des Thrombinrezeptors verbundenen Signale zu stimulieren Man nimmt an, daß diese Polypeptide sich als nützlich bei einer Reihe von klinischen Zuständen erweisen werden, bei denen eine erfolgreiche Erholung durch Ereignisse, die durch den Thrombinrezeptor vermittelt werden, beeinflußt wird. Ferner ist die Verwendung von kleineren Polypeptiden vorgesehen, die dazu befähigt sind, die mit der Besetzung der Thrombinrezeptoren verbundenen Signale zu hemmen.
Mit der vorliegenden Erfindung wird eine Anzahl von Thrombinderivaten und Verfahren bereitgestellt, die sich zur Stimulierung der Zellproliferation und zur Förderung der Wundheilung eignen, sowie Verfahren, die sich zur Hemmung der Wundheilung, der Narbengewebebildung, der Bildung von Gewebeadhäsionen und der Tumormetastase und -angiogenese eignen. Die Erfindung basiert auf dem Befund, daß man Polypeptidthrombinderivate oder ihre physiologisch funktionellen Äquivalente formulieren kann, die selektiv die Wechselwirkung zwischen Thrombin und seinem Rezeptor hoher Affinität hemmen oder die die stimulierenden Wirkungen von Thrombin nachahmen.
Dementsprechend betrifft die Erfindung in ihrem allgemeinsten und breitesten Umfang synthetische oder natürlich abgeleitete Polypeptid-Agonisten und von durch den Thrombinrezeptor vermittelten Ereignissen sowie die Verwendung von synthetischen oder natürlich abgeleiteten Polypeptid Antagonisten von durch den Thrombinrezeptor vermittelten Ereignissen. Diese beiden Klassen von Mitteln besitzen eine Thrombinrezeptor-Bindungsdomäne, die ein Segment eines Polypeptids einschließt, das zur selektiven Bindung an den Thrombinrezeptor hoher Affinität imstande ist. Dieses Segment des Polypeptids schließt eine Sequenz von Aminosäuren ein, die homolog zu einer Tripeptid-Zellbindungsdomäne von Fibronectin ist.
Neben der Thrombinrezeptor-Bindungsdomäne besitzen die stimulierenden (agonistischen) Polypeptide eine Sequenz von Aminosäuren mit Sequenzen, die von den N-terminalen Aminosäuren eines Dodecapeptids abgeleitet sind, von dem zuvor gezeigt wurde, daß es unter Serinproteasen hochgradig konserviert ist. Die inhibitorischen Polypeptide enthalten diese bei Serinesterasen konservierten Sequenzen jedoch nicht.
Die vorliegende Erfindung wird beschrieben, indem gezeigt wird, daß in Gegenwart einer nicht-mitogenen (d. h. nicht-stimulierenden) Konzentration an α-Thrombin, gammα-Thrombin oder PMA die Wechselwirkung zwischen stimulierenden Polypeptiden und Zelloberflächen-Thrombinrezeptoren der Zelle ein Signal zur Proliferation gibt. Es ergibt sich jedoch kein Proliferationssignal, wenn die Zelloberflächen-Thrombinrezeptoren in Wechselwirkung mit den inhibitorischen Polypeptiden treten. Im Gegenteil, die Zellen werden widerstandsfähiger gegenüber einer nachfolgenden Behandlung mit den stimulierenden Polypeptiden. Man nimmt an, daß dieses Ergebnis auftritt, da die hemmenden Polypeptide, die selbst nicht imstande sind, ein Proliferationssignal zu erzeugen, die Bindung der Stimulierenden Polypeptide blockieren.
Wie vorstehend angedeutet wurde, erfordert die praktische Durchführung der erfindungsgemäßen zellstimulierenden Verfahren das Vorhandensein eines sekundären Signals, z. B. in Form einer nicht-mitogenen Konzentration von α-Thrombin, gammα-Thrombin oder PMA, um den Zellen das proteolytische Spaltungssignal geringer Affinität zu geben. Dementsprechend werden erfindungsgemäß pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren bereitgestellt, bei denen diese Verbindungen zugegeben worden sind. Der Fachmann erkennt jedoch, daß, wenn die Erfindung in vivo durchgeführt wird, natives α-Thrombin, das endogen im Wirt vorhanden ist, typischerweise geeignet ist, dieses sekundäre Signal zu geben.
Da Thrombin an einer Anzahl bioregulatorischer Wirkungen beteiligt ist, hat die vorliegende Erfindung, die es erlaubt, diese Wirkungen selektiv zu fördern oder zu hemmen, eine Anzahl klinischer Anwendungen. Zum Beispiel werden erfindungsgemäß eine Anzahl von Polypeptiden bereitgestellt, die sich zur Förderung der Wundheilung eignen. Für derartige Anwendungen wird erfindungsgemäß ein Polypeptidderivat von Thrombin (oder ein funktionelles Äquivalent eines derartigen Derivats) bereitgestellt, das eine Thrombinrezeptor-Bindungsdomäne sowie eine Domäne mit einer bei Serinesterasen konservierten Sequenz von mindestens 12 Aminosäuren aufweist. Erfindungsgemäß wird ferner eine Polypeptidverbindung von mindestens 23 L-Aminosäuren bereitgestellt, die sowohl eine Thrombinrezeptor- Bindungsdomäne als auch eine Domäne mit einer bei Serinesterasen konservierten Aminosäuresequenz aufweist.
Gemäß einer Ausführungsform werden erfindungsgemäß mehrere Polypeptide bereitgestellt, die spezifische Aminosäuresequenzen enthalten, wie eine Polypeptidverbindung, in der die Thrombinrezeptor-Bindungsdomäne die L-Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp-Ala zusammen mit der bei Serinesterasen konservierten Aminosäuresequenz Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro- Phe-Val umfaßt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Polypeptidverbindung die L-Aminosäuresequenz Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly- Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Gys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val.
Erfindungsgemäß wird auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Förderung der Wundheilung bereitgestellt, die eine therapeutisch wirksame Konzentration einer beliebigen der vorstehend beschriebenen Verbindungen in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt. Typischerweise umfassen derartige Zusammensetzungen z. B. ausreichende Konzentrationen der Polypeptide, um eine stimulierende Wirkung auf den Thrombinrezeptor auszuüben, wie in dieser Anmeldung gezeigt wird. So sollten derartige Zusammensetzungen typischerweise ausreichende Konzentrationen enthalten, um Spiegel der Polypeptide im Wundbereich zu erhalten, von denen in vitro gezeigt ist, daß sie den Rezeptor stimulieren. Wenn man annimmt, daß den endogenen Spiegel eines sekundären Signals unzureichend sind, dann können Zusammensetzungen eingesetzt werden, die ferner die Zugabe einer therapeutisch wirksamen Konzentration an α-Thrombin oder gammα-Thrombin umfassen.
In dieser Anmeldung ist eine therapeutisch wirksame Konzentration als eine Konzentration eines bestimmten Mittels definiert, die eine zufriedenstellende Steigerung der Geschwindigkeit der Wundheilung bereitstellt. Man nimmt wiederum an, daß derartige Konzentrationen ausreichenden Spiegeln entsprechen, um in vitro eine Stimulation des Thrombinrezeptors hervorzurufen. Man nimmt jedoch an, daß sich die Zusammensetzungen dann als am wirksamsten erweisen, wenn die stimulierenden (agonistischen) Polypeptide in einer Konzentration von 0,1 mikromolar bis 10 mikromolar vorliegen.
Wenn ferner α-Thrombin oder gammα-Thrombin auch eingesetzt werden, dann werden Konzentrationen von 0,1 mikromolar bis 10 mikromolar als wirksam angesehen. Es können jedoch empirische Verfahren, wie sie dem Fachmann bekannt sind, zur genaueren Bestimmung der geeigneten therapeutischen Dosis für eine gegebene Zusammensetzung, die in einer bestimmten Weise verabreicht wird, angewandt werden.
Darüber hinaus werden Verfahren bereitgestellt, bei denen Thrombinagonisten eingesetzt werden, um die Wundheilung zu fördern. Ein derartiges Verfahren umfaßt das Auftragen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Polypeptidderivats von Thrombin oder eines physiologisch funktionellen Äquivalents davon, das sowohl eine Thrombinrezeptor-Bindungsdomäne als auch eine Domäne mit einer bei Serinesterasen konservierten Aminosäuresequenz aufweist, auf die Wunde. Im allgemeinen wird Thrombin in einer ausreichenden Menge aufgetragen, um eine Fibroblastenstimulierung zu erzielen und dabei die Geweberegenerierung zu stimulieren. Da derartige Verfahren typischerweise die topische Auftragung auf eine Wunde beinhalten, nimmt man an, daß eine mögliche systemische Toxizität kein Problem darstellt Daher kann praktisch eine beliebige Konzentration eingesetzt werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Wunde jedoch so behandelt, daß ein Bereich von etwa 1 ng/cm² - 10 µg/cm² an der Wundenoberfläche erzielt wird.
Erfindungsgemäß wird ferner ein Verfahren zur Förderung der Wundheilung bereitgestellt, bei dem eine therapeutisch wirksame Menge an α- Thrombin (1 µg/cm² - 10 µg/cm² der Wundenoberfläche) oder gammα-Thrombin (1 µg/cm² - 10 µg/cm² der Wundenoberfläche) auf die Wunde zusammen mit den vorstehend genannten Thrombinderivaten aufgetragen wird. Natürlich können die speziellen Polypeptide und pharmazeutischen Zusammensetzungen, die erfindungsgemäß bereitgestellt werden, auch zur Förderung der Wundheilung verwendet werden. Man nimmt an, daß diese Methoden besonders vorteilhaft bei Patienten mit schweren Unfällen (insbesondere bei Patienten mit Verbrennungen), Patienten, die sich chirurgischen Eingriffen unterzogen haben, und Patienten mit einer schlechten Wundheilung, wie alten Menschen und Diabetikern, sind.
Ferner ist die Verwendung von den Thrombinrezeptor hemmenden Polypeptiden vorgesehen, um Arzneimittel zur Hemmung der Einflüsse von Thrombin auf Zellen herzustellen. Zum Beispiel werden erfindungsgemäß Verfahren bereitgestellt, durch die die Narbengewebebildung gehemmt werden kann, indem für die Wunde oder das Narbengewebe eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptidderivats von Thrombin oder eines physiologischfunktionellen Äquivalents davon, das eine Thrombinrezeptor-Bindungsdomäne aufweist, das jedoch keine bei Serinesterasen konservierte Sequenz aufweist, verabreicht wird. Typischerweise sind Konzentrationen geeignet, die ausreichen, um vom Thrombinrezeptor vermittelte Ereignisse zu hemmen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden Mengen im Bereich von 1 ng/cm² - 10 µg/cm² der Wundenoberfläche als geeignet angesehen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist das Polypeptidderivat von Thrombin die L-Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp-Ala auf.
Im allgemeinen können diese Verfahren in allen Fällen verwendet werden, in denen eine Narbenbildung unerwünscht ist, wie bei Patienten mit Verbrennungen oder Patienten, die sich augenärztlichen chirurgischen Eingriffen unterzogen haben. Ferner eignen sich die Verfahren auch zur Verhinderung der kebidalen Narbenbildung. Es ist zu erwarten, daß das Aufsprühen auf die Wunde mit einem Aerosolspray eine besonders sterile und wirksame Weise der Verabreichung der Polypeptidverbindung auf die Wunden bei Patienten mit Verbrennungen darstellt.
Die Verwendung der hemmenden Polypeptide sollte sich auch als geeignet zur Hemmung der Bildung von Gewebeadhäsionen eignen, die als anomale Vereinigungen zwischen Körperorganen durch Bildung von fibrösem Gewebe definiert sind. Es ist bekannt, daß eine Fibroblastenproliferation für die Bildung derartiger Adhäsionen erforderlich ist. Da bekannt ist, daß α-Thrombin die Fibroblastenproliferation induziert, folgt, daß die Hemmung der durch Thrombin vermittelten Mitogenese durch die erfindungsgemäßen Peptide die Adhäsionsbildung verringern kann. Man nimmt an, daß die Verabreichung derartiger inhibitorischer Polypeptide auf die Oberfläche der betroffenen Organe sich als besonders geeignet nach bestimmten chirurgischen Verfahren, wie der Thoraxchirurgie, eignet, wobei Darmadhäsionen oftmals zu postoperativen Komplikationen führen.
Ferner wird vorgeschlagen, daß sich die Verwendung der inhibitonschen Peptide als nützlich bei der Behandlung von Säugern mit Tumoren erweist, um dadurch die Tumormetastase oder -angiogenese zu hemmen. Diese Ansicht wird durch Untersuchungen gestützt, die zeigen, daß α-Thrombin imstande ist, normale Interendothelzellkontakte, die bei der Verhinderung der Metastase wichtig sind, zu unterbrechen, sowie durch Studien, die zeigen, daß α-Thrombin die Proliferation von Endothelzellen, die für die Angiogenese erforderlich ist, induzieren kann. Dementsprechend wird erfindungsgemäß ein Verfahren bereitgestellt, bei dem Säuger mit derartigen Tumoren eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptidderivats von Thrombin oder eines funktionellen Äquivalents davon erhalten, das eine Thrombinrezeptor-Bindungsdomäne aufweist, das jedoch keine bei Serinesterasen konservierte Sequenz aufweist. Zwar kann die exakte Dosis, die erforderlich ist, durch empirische Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, bestimmt, werden, es läßt sich jedoch abschätzen, daß eine ausreichende Menge, um eine Konzentration von 0,1 mikromolar bis 10 mikromolar an der zu behandelnden Stelle zu erzielen, erforderlich ist. Die Verwendung eines Polypeptids, in dem die Thrombinbindungsdomäne eine L- Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp-Ala aufweist, ist besonders bevorzugt. Es wird angenommen, daß die Polypeptide in dieser Hinsicht besonders wirksam sind, wenn sie intravenös verabreicht werden. Wahrscheinlich erweisen sich jedoch auch andere Verfahren der Verabreichung als wirksam.
Gemäß der allgemeinsten Ausführungsform wird erfindungsgemäß für die Verwendung von inhibitorischen Polypeptiden, die die Zellproliferation hemmen, gesorgt. Dieses Verfahren umfaßt, ohne Beschränkung hierauf, Fälle, bei denen man die Zellproliferation in vitro hemmen möchte. Natürlich kann das inhibitorische Polypeptid, das eine Thrombinbindungsdomäne mit der spezifischen Sequenz Arg-Gly-Asp-Ala aufweist, auch als allgemeiner Inhibitor für die Zellproliferation verwendet werden.
Gemäß einer weiteren allgemeinen Ausführungsform umfaßt die Erfindung Verfahren, bei denen die stimulierenden Polypeptide verwendet werden, um das Zellwachstum zu fördern. Ein Polypeptid unter Einschluß der Sequenz Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys -Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser- Gly-Gly-Pro-Phe-Val wird speziell bereitgestellt. Dieses Verfahren umfaßt, ohne Beschränkung hierauf, Fälle, bei denen man das Zellwachstum in vitro verstärken möchte. Derartige zellstimulierende Verwendungen können verstärkt werden, indem ferner eine wirksame Menge an α-Thrombin (0,1 µg/ml - 10 µg/ml), gamma-Thrombin (0,1 µg/ml - 10 µg/ml) oder Phorbolmyristatacetat (10 ng/ml - 100 ng/ml) zusammen mit dem stimulierenden Polypeptid bereitgestellt wird.
Für den Zweck der vorliegenden Erfindung wird ein Thrombinderivat als ein beliebiges Molekül mit einer Aminosäuresequenz definiert, die mindestens zum Teil von der Sequenz von Thrombin abgeleitet ist, und zwar unabhängig davon, ob es in vivo oder in vitro synthetisiert wurde. Dement sprechend bezeichnet ein Thrombinderivat in der vorliegenden Anmeldung ein Polypeptidmolekül, das weniger Aminosäuren als Thrombin umfaßt.
Ein physiologisch-funktionelles Äquivalent eines Thrombinderivats umfaßt Moleküle, die in bestimmten Einzelheiten von den Thrombinderivaten abweichen, die die Funktion der Thrombinrezeptor-Bindungsdomäne oder der bei Serinesterasen konservierten Aminosäuresequenz nicht beeinträchtigen. Derartige Einzelheiten umfassen, ohne Beschränkung hierauf, konservative Aminosäuresubstitutionen und Modifizierungen, z. B. die Amidierung des carboxyterminus, die Acetylierung des Aminoterminus, die Konjugation des Polypeptids an ein physiologisch inertes Trägermolekül oder Sequenzänderungen gemäß den bei Serinesterasen konservierten Sequenzen.
Eine Thrombinrezeptor-Bindungsdomäne ist als eine Polypeptidsequenz definiert, die direkt an den Thrombinrezeptor bindet und/oder kompetitiv die Bindung zwischen den Thrombinrezeptoren hoher Affinität und α-Thrombin hemmt.
Eine Domäne mit einer bei Serinesterasen konservierten Sequenz umfaßt eine Polypeptidsequenz, die mindestens 12 der N-terminalen Aminosäuren des Dodecapeptids enthält, von dem bereits gezeigt wurde, daß es hochgradig konserviert unter Serinproteasen ist (Asp-X&sub1;-Cys-X&sub2;-Gly-Asp-Ser-Gly- Gly-Pro-X&sub3;-Val); worin X, entweder Ala oder Ser bedeutet; X&sub2; entweder Glu oder Gln bedeutet; und X&sub3; entweder Phe, Met, Leu, His oder Val bedeutet.
Ein stimulierendes Polypeptid ist als ein Polypeptidderivat von Thrombin oder ein physiologisch funktionelles Äquivalent davon mit der Fähigkeit definiert, sowohl an den Thrombinrezeptor zu binden als auch diesen zu stimulieren. Daher umfassen die stimulierenden Peptide sowohl eine Thrombinrezeptor-Bindungsdomäne als auch eine Domäne mit einer bei Serinproteasen konservierten Aminosäuresequenz.
Ein inhibitorisches Polypeptid ist als ein Polypeptidderivat von Thrombin oder ein physiologisch funktionelles Äquivalent davon mit einer Thrombinrezeptor-Bindungsdomäne, jedoch ohne eine bei Serinproteasen konservierte Aminosäuresequenz definiert.
Fig. 1. Computergestützte Analyse der Hydropathie, Löslichkeit und vorhergesagten Sekundärstruktur für die Reste 489 bis 548 von menschlichem Prothrombin. Fig. 1A: Hydropathieprofil; Fig. 1B: Löslichkeitsprofil; Fig. 1C: Vorhergesagte Tendenz für flexible Schleifen; Fig. 1D: Vorhergesagte Tendenz für α-Helix und β-Faltblatt.
Fig. 2. Eine dreidimensionale Darstellung der röntgenkristallographi schen Daten von Trypsin mit den folgenden, computergestützten (Proteus) Substitutionen von thrombinspezifischen Resten: Gly&sub1;&sub8;&sub7;-Lys; Lys&sub1;&sub8;&sub8;-Arg; Ser&sub1;&sub9;&sub0;-Ala; Gln&sub1;&sub9;&sub2;-Glu; und Val&sub1;&sub9;&sub9;-Phe ist in Fig. 2A und Fig. 2D gezeigt. Fig. 2B und Fig. 2C zeigen nur die drei Reste des aktiven Zentrums (His&sub5;&sub7;, Asp&sub1;&sub0;&sub2;, Ser&sub1;&sub9;&sub5;) und die Reste 183 bis 200 von Trypsin, die sich in der homologen Region als Thrombinreste 510 bis 530 befinden. Diese Peptide sind in der gleichen Position wie im rotierten Modell in Fig. 2A und Fig. 2D orientiert.
Fig. 3. Hemmung der Bindung von [¹²&sup5;I]-α-Thrombin an Mäuseembryo-Zellen (ME-Zellen) durch das synthetische Peptid p508-530. Die spezifische Bindung von 0,3 nanomolar [¹²&sup5;I]-α-Thrombin an ME-Zellen in Gegenwart der angegebenen Konzentration des Peptids wurde gemessen, wie es in der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen beschrieben ist.
Fig. 4. Einfluß von p508-530 auf den Einbau von [³H]-Thymidin allein oder in Kombination mit einer niedrigen Konzentration an α-Thrombin. Serumfreie Kulturen von ME (Fig. 4A) oder NIL (eine Hamsterfibroblastenzellinie; Fig. 4β) im Ruhezustand wurden mit den angegebenen Konzentrationen an p508-530 allein (0) oder in Kombination mit Konzentrationen von α-Thrombin, die ungefähr ein Drittel des maximalen Ansprechens zeigten, behandelt; 2 nanomolar für ME-Zellen (Fig. 4A) und 4 nanomolar für NIL- Zellen (Fig. 4B). Der [³H]-Thymidin-Einbau wurde nach 24 Stunden bestimmt, wie es in der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen beschrieben ist.
Fig. 5. Einfluß von p508-530 auf den Einbau von [³H]-Thymidin in Kombination mit PMA. Kulturen von NIL-Zellen im Ruhezustand wurden mit p508- 530 allein (O) oder in Kombination mit 25 ng/ml PMA inkubiert. Der Einbau von [³H]-Thymidin wurde bestimmt, wie es in der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen beschrieben ist.
Fig. 6. Vergleich zwischen den Wirkungen von Peptiden auf den durch Thrombin stimulierten Thymidin-Einbau. Kulturen von NIL-Zellen im Ruhezustand wurden mit steigenden Konzentrationen von p508-530, p519-530 oder p517-520 in Gegenwart von 1 nanomolar α-Thrombin (eine geringfügig mitogene Konzentration) inkubiert. Die Daten sind für jede Konzentration als Prozentsatz der Wirkung von α-Thrombin allein ausgedrückt.
Fig. 7. Einfluß von p517-520 auf die Thrombinstimulierung des Einbaus von [³H]-Thymidin. Kulturen von ME-Zellen im Ruhezustand wurden mit steigenden Konzentrationen von α-Thrombin allein oder in Kombination mit 625 nanomolar p517-520 inkubiert. Der Einbau von [³H]-Thymidin wurde bestimmt, wie es in der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen beschrieben ist.
Von Thrombin, von dem einmal angenommen worden ist, daß es nur im Zusammenhang mit der Blutgerinnung von Bedeutung ist, ist nun gezeigt worden, daß es eine Anzahl möglicher biologischer Wirkungen, die nicht direkt mit der Blutgerinnung verknüpft sind, vermittelt. Viele dieser Wirkungen haben, mindestens zum Teil, ihre Ursache in Signalen, die durch die Wechselwirkung zwischen Thrombin oder thrombinähnlichen Molekülen und Thrombinrezeptoren hoher Affinität, die auf der Oberfläche vieler Zellen vorhanden sind, erzeugt werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung durchgeführte Untersuchungen deuten darauf hin, daß eine selektive Regulation der durch Thrombin vermittelten Ereignisse möglicherweise durch Formulierung und Synthese von Polypeptiden erzielt werden kann, die besonders entworfen wurden, um derartige Ereignisse entweder nachzuahmen oder zu hemmen. Die Entwicklung kleiner, gegen Proteaseinhibitoren beständiger Polypeptide, die zur Ausführung dieser Funktionen imstande sind, war besonders wünschenswert im Hinblick auf die Empfindlichkeit von Thrombin gegenüber proteolytischen Enzyminhibitoren, wie Antithrombin.
Eine Anzahl von Peptiden, die auf der Sequenz von menschlichem Prothrombin basieren, wurde synthetisiert und auf ihre Fähigkeit zur Bindung an den Rezeptor und zur Erzeugung von Proliferationssignalen untersucht. Die Auswahl der Peptide konzentrierte sich auf die Aminosäuresequenz der Region von Thrombin in der Nähe des Serins des aktiven Zentrums. Diese Region enthält eine Domäne (die durch die Reste 517-520 von menschlichem Prothrombin dargestellt wird) mit einer Sequenz, die homolog zur Tripeptid-Zellbindungsdomäne von Fibronectin ist, (Arg-Gly-Asp] . Diese Tripeptidsequenz ist einer Anzahl von Proteinen gemeinsam, die mit Zellen in Wechselwirkung treten können (vgl. den Öbersichtsartikel von Rouslahti und Peirschbacher, Cell, Bd. 44 (1985), S. 517-518). Darüber hinaus ist gezeigt worden, daß ein Peptid, das die Reste 517-520 von menschlichem Prothrombin (p517-520) darstellt, und Peptide, die die Reste 516-522 und 510-526 von menschlichem Prothrombin (p516-522 bzw. p510-526) darstellen, imstande sind, eine Fibroblastenanheftung vergleichbar zu der, die von Fibronectin-spezifischen Peptiden induziert wird, zu fördern.
Die ausgewählte Region besitzt auch eine Domäne (dargestellt durch die Reste 519-530 von menschlichem Prothrombin) mit einem hohen Grad an Homologie zu einer Anzahl von Serinesterasen.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben festgestellt, daß ein synthetisches Peptid, das sowohl die Fibronectin-homologe Domäne als auch die Serinprotease-homologe Domäne (Reste 508-530 von menschlichem Prothrombin) enthält, an Thrombinrezeptoren hoher Affinität bindet und einen Ersatz für DIP-α-Thrombin als einen Initiator der mit der Besetzung des Rezeptors verbundenen mitogenen Signale darstellt. Im Gegensatz dazu bindet ein synthetisches Peptid, das nur die Fibronectin-homologe Domäne (p517-520) enthält, an den Thrombinrezeptor, ohne eine Mitogenese zu induzieren. Ein Zwischenpeptid (p519-530) behält die Fähigkeit, eine Mitogenese zu vermitteln, jedoch in einem wesentlich geringeren Grad als p508-530.

Beispiel 1: Auswahl von Domänen von menschlichem α-Thrombin, die an der Bindung von Thrombin an seinen Rezeptor hoher Affinität beteiligt sind.

Um die Auswahl von Peptidsequenzen, die möglicherweise an der Rezeptorbindung beteiligt sind, zu unterstützen, wurde eine Computeranalyse herangezogen, um die gesamte Hydropathie, Löslichkeit und Sekundärstrukturmerkmale für die 60 Aminosäurereste um das Serin des aktiven Zentrums von α-Thrombin auf der Basis der Sequenz von menschlichem Prothrombin (Degen et al., Biochem., Bd. 22 (1983), S. 2087-2097) vorherzusagen. Wie in den Figg. 1A und 1B gezeigt ist, scheint diese Region hochgradig hydrophil und löslich zu sein, insbesondere nahe der Region, die homolog zu der Zellanheftungsdomäne von Fibronectin ist (Reste 517 bis 520). Die Analyse der Sekundärstrukturmerkmale zeigte, daß die Region von Thrombin von Rest 511 bis 526 eine starke Tendenz aufweist, als flexible Schleifenregion vorzuliegen, und zwar mit sehr geringer Tendenz sowohl für α- helikale Strukturen als auch für β-Faltblattstrukturen (Figg. 1C und 1D) Zusammengenommen deuten die verschiedenen computergestützten Analysen stark darauf hin, daß diese Region von Thrombin von außen zugänglich ist und daher für eine Wechselwirkung mit dem Thrombin-Zelloberflächenrezeptor zur Verfügung steht. Ferner befindet sich die Region von Thrombin, die homolog zur Zellanheftungsdomäne von Fibronectin ist, in der Mitte dieser hydrophilen flexiblen Schleife von Thrombin oder sehr nahe zum mittleren Bereich.
Unter Verwendung der dreidimensionalen Röntgenstrukturdaten für Trypsin (Marquart et al., Acta Crystallogr., Bd. 39 (1983), S. 480) und Durchführung der entsprechenden Aminosäuresubstitutionen, um die Thrombinsequenz in der Nähe des Serinbereichs des aktiven Zentrums von Trypsin wiederzugeben, sagte eine graphische Computeranalyse voraus, daß sich die Reste 510 bis 530 von Thrombin entlang der Kante der Tasche, die zur Spalte des aktiven Zentrums führt, befinden (Fig. 2). In Übereinstimmung mit den Vorhersagen der Sekundärstruktur, die vorstehend erörtert wurden, befinden sich die Aminosäurereste 517 bis 520 von Thrombin an der äußersten Ecke dieser Region der vorgeschlagenen Trypsin/Thrombin-Struktur. Es erschien als vernünftig, daß diese Region von Thrombin an der Bindung an seinen Rezeptor beteiligt sein könnte.

Beispiel 2: Synthese von Peptiden

Peptide wurden gemäß dem Festphasenverfahren (Erickson und Merrifield, The Proteins, Bd. 2 (1976), S. 255-257) unter Verwendung von Automaten (Applied Biosystems Peptide Synthesizer Modell 430A) synthetisiert und durch HPLC (Beckman) über eine C-18-Säule, die mit einem linearen Acetonitril-Gradienten mit einem Gehalt an 0,5 % (Vol./Vol.) TFA (Trifluoressigsäure) eluiert wurde, gereinigt.

Beispiel 3: Demonstration, daß die Thrombinderivate selektiv an den Thrombinrezeptor hoher Affinität binden

Dieses Beispiel zeigt, daß die erfindungsgemäßen Peptide imstande sind, selektiv an die Thrombinrezeptoren hoher Affinität, die auf der Oberfläche von vielen Zelltypen vorhanden sind, zu binden. Gemäß der vorliegenden Ausführungsform wurde diese Aktivität nachgewiesen, indem gezeigt wurde, daß die erfindungsgemäßen Peptide kompetitiv die Bindung von [¹²&sup5;I)-αThrombin an Thrombinrezeptoren, die auf zwei Stämmen von gezüchteten Fibroblasten vorhanden waren, hemmte. Dementsprechend stellt die nachstehend beschriebene spezifische Technik die beste Art und Weise, die den Erfindern gegenwärtig bekannt ist, dar, um diese Aktivität nachzuweisen.

a. Züchtung von Fibroblasten mit Thrombinrezeptoren hoher Affinität

Wie vorstehend angegeben wurde, wurden aus zwei Quellen stammende Fibroblasten verwendet, um die Bindung von erfindungsgemäßen Peptiden an die Thrombinrezeptoren hoher Affinität zu zeigen. Diese Zellinien wurden wie folgt hergestellt:
Primäre Kulturen von Fibroblasten wurden aus 9 bis 13 Tage alten Embryonen von durch Kreuzung gezüchteten NIH-Swiss-Mäusen hergestellt, wie es von Carney und Cunningham, Cell, Bd. 15 (1978), S. 1341-1349, beschrieben wurde. NIL-Zellen, ein etablierter Stamm von Hamsterfibroblasten, wurde als Stammkultur gehalten und alle 4 Tage subkultiviert. Alle Zellen wurden in nach Dulbecco-Vogt modifiziertem Eagle-Medium (DV), das mit 10 % (Vol./Vol.) Kälberserum (CS) angereichert war, in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO&sub2; in Luft bei 37ºC gezüchtet.
Kulturen im Ruhestand wurden durch Subkultivieren von Stammzellen aus 100 mm-Schalen unter Verwendung von 0,05 % (Gew./Vol.) Trypsin und 0,02 % EDTA (Gew./Vol.) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Plattieren in Kulturschalen mit 24 Vertiefungen in DV-Medium, das mit 10 % (Vol./Vol.) CS angereichert war, bei 6 x 10&sup4; Zellen/cm² hergestellt. Nachdem man die Zellen über Nacht sich anheften ließ, wurde das Medium entfernt, und die Zellen wurden mit DV-Medium gespült, das kein Serum enthielt. Die Zellen wurden in diesem serumfreien Medium 48 Stunden inkubiert, bevor die angegebenen Versuche durchgeführt wurden. Es ist gezeigt worden, daß dieses Verfahren zu nicht-proliferierenden Populationen von Mäuse- und NIL-Zellen führt, die zu 90 bis 95 % an der G&sub1;/G&sub0;-Zellzyklus- Grenzfläche festgehalten werden.

b. Assay zur Messung der spezifischen Bindung von Thrombin und Thrombinderivaten an den Zelloberflächen-Thrombinrezeptor

Wie vorstehend angegeben wurde, wurde in der vorliegenden Ausführungsform die spezifische Bindungsaktivität der Thrombinderivate an den Thrombinrezeptor als eine Funktion ihrer Fähigkeit, kompetitiv die Bindung zwischen nativem [¹²&sup5;I]-Thrombin und den Thrombinrezeptor zu hemmen, gemessen. Die speziellen Techniken, nach denen die kompetitiven Bindungsstudien durchgeführt wurden, sind nachstehend erläutert.
Menschliches α-Thrombin wurde in Gegenwart von Benzamidin (ein kompetitiver Inhibitor des aktiven Zentrums), Lactoperoxidase und Na[¹²&sup5;I] iodiert. Nach Gelfiltration und Dialyse wies das [¹²&sup5;I]-α-Thrombin eine spezifische Aktivität von 1 bis 3 x 10&supmin;&sup7; CPM/µg auf und wanderte zusammen mit nicht-markiertem α-Thrombin als eine einzelne Bande auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelen (SDS-Polyacrylamidgelen). Diese iodierten Zubereitungen behielten ungefähr 80 % ihrer Fibrinogen-Gerinnungsaktivität.
Die Fähigkeit der synthetischen Peptide, um die spezifische [¹²&sup5;I] Thrombin-Bindung an Fibroblasten zu konkurrieren, wurde auf nicht-proliferierenden, hinsichtlich der Mitogenese ansprechenden Kulturen in Platten mit 24 Vertiefungen (Falcon) bei einer Zelldichte von ungefähr 5 x 10&sup4; Zellen/cm² gemessen, wie es zuvor beschrieben wurde (Carney und Cunningham, Cell, Bd. 15 (1978), S. 1341-1349). Das Medium auf den Zellen wurde gegen Bindungsmedium (serumfreies DV-Medium mit einem Gehalt an 0,5 % (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin, gepuffert mit 15 millimolar HEPES bei pH-Wert 7,0) ausgetauscht. Die Zellen wurden 30 Minuten bei 23ºC äquilibriert, und das Medium wurde gegen Bindungsmedium mit einem Gehalt an [¹²&sup5;I] -α-Thrombin (10 ng/ml) mit den angegebenen Konzentrationen der Peptide ausgetauscht. Nach 2 Stunden bei 23ºC wurde der Assay beendet, indem die Zellen rasch 4 mal mit eisgekühlter PBS gespült wurden. Die Zellen wurden in 1 ml 0,5 n NaOH gelöst, und die Gesamtradioaktivität wurde unter Verwendung eines Beckman-gamma-Zählers gemessen. Die nichtspezifische Bindung wurde als die Radioaktivität gemessen, die an Kulturen nach Inkubation in Bindungsmedium mit einem Gehalt an einem 100-fachen Überschuß an nicht-markiertem α-Thrombin gebunden war. Die spezifische Bindung wurde durch Abziehen der nicht-spezifischen Bindung von der Gesamtradioaktivität, die an die Kulturen gebunden war, berechnet.

c. Thrombinbindungsaktivität von ausgewählten Thrombinderivaten

Um die Thrombinrezeptor-Bindungsaktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide zu zeigen, wurden die Peptide, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt worden waren, auf die Thrombinrezeptor-Aktivität unter Verwendung des unmittelbar vorstehend beschriebenen Assaysystems untersucht.
Genauer gesagt wurden, um zu zeigen, daß p508-530 an Thrombinrezeptoren bindet, konfluente Kulturen von ME-Zellen mit 0,3 nanomolar [¹²&sup5;I]-α- Thrombin und Konzentrationen an p508-530 im Bereich von 8 bis 4000 nanomolar für 90 Minuten bei 23ºC inkubiert. Wie in Fig. 3 gezeigt ist, konkurrierte p508-530 um 30 bis 70 % der spezifischen Bindung von [¹²&sup5;I] α-Thrombin an ME-Zellen. Die Scatchard-Analyse der direkten Bindung von [¹²&sup5;I)-markiertem p508-530 zeigte einen KD-Wert von ungefähr 6 x 10&supmin;&sup8; m (Daten nicht gezeigt) . Darüber hinaus konnte die spezifische Bindung von [¹²&sup5;I]-p508-530 an ME-Zellen sowohl durch einen Überschuß an p508-530 als auch durch einen Überschuß an menschlichem α-Thrombin verdrängt werden. Es scheint also, daß die Konkurrenz von p508-530 um die [¹²&sup5;I]-α- Thrombin-Bindung die Bindung von p508-530 an die gleiche Stelle wie α- Thrombin darstellt, jedoch mit einer Affinität, die ungefähr eine Größenordnung geringer ist.
Um zu zeigen, daß die Bindung und die mitogene Aktivität von p508-530 spezifisch waren, wurden ferner zwei synthetische Peptide mit physikalischen Eigenschaften, die denen von p508-530 ähnlich waren, die jedoch keine Sequenzhomologie zu menschlichem α-Thrombin aufwiesen, auf ihre Bindungseigenschaften untersucht. Diese beiden Peptide (eines mit 12 Aminosäuren (33 % hydrophobe Reste und eine Nettoladung von -3) und ein zweites mit 18 Aminosäuren (39 % hydrophobe Reste und eine Nettoladung von 0)) hemmten die Bindung von [¹²&sup5;I]-α-Thrombin weniger als 5 % bei Konzentrationen bis zu 5 mikromolar.
Um ferner Regionen von Thrombin zu identifizieren, die an der Bindung hoher Affinität und der Erzeugung mitogener Signale beteiligt waren, wurden zwei Peptide untersucht, die spezifische Domänen innerhalb von p508- 530 darstellten. Das erste Peptid stellte die Reste 519 bis 530 der B- Kettenregion von menschlichem Prothrombin dar, eine Region von Thrombin, die hochgradig konserviert unter Serinproteasen ist. Das zweite Peptid stellte die Reste 517 bis 520 von Prothrombin dar, eine Region von Thrombin, die homolog zur Fibronectin-Zellbindungsdomäne ist.
Diese beiden Peptide waren imstande, um 30 bis 50 % der Bindung von [¹²&sup5;I]-α-Thrombin an ME-Zellen zu konkurrieren, beide erforderten jedoch höhere Konzentrationen als die, die für das anfängliche Peptid p508-530 erforderlich waren (Tabelle 1). Zum Beispiel erforderte eine 30 %-ige Hemmung der [¹²&sup5;I]-α-Thrombin-Bindung 33- bis 50-fach höhere Konzentrationen an p519-530 bzw. p517-520 als an p508-530. Diese beiden Peptide scheinen also in Wechselwirkung mit Thrombinrezeptoren zu treten, jedoch mit einer geringeren Affinität als p508-530. Da p517-520 homolog zur Fibronectin-Zellbindungsdomäne ist, wurde auch ein Peptid mit der Sequenz Arg-Gly-Ala-Ser (die Sequenz des Fibronectin-spezifischen Peptids) auf seine Fähigkeit, um die [¹²&sup5;I]-α-Thrombin-Bindung zu konkurrieren, untersucht. Bei einer Konzentration von 1,3 mikromolar konkurrierte dieses Peptid nicht mit [¹²&sup5;I]-α-Thrombin um die Bindung. Der Rezeptor für αThrombin ist also nicht das gleiche Membranprotein, das spezifisch mit Fibronectin in Wechselwirkung tritt und die scheinbare wachstumsfördernde Wirkung von Fibronectin verursacht. Außerdem zeigen diese Ergebnisse, daß Alanin innerhalb der Thrombinrezeptor-Bindungsdomäne erforderlich ist, da die Substitution von Alanin durch Serin die Fähigkeit des synthetischen Peptids beseitigte, um die α-Thrombin-Bindung zu konkurrieren. Tabelle 1. Vergleich der Peptidkozikurrenz für die [¹²&sup5;I]-α-Thrombinbindung an NE-Zellen
Verschiedene Konzentrationen an Peptiden und [¹²&sup5;I] -α-Thrombin (1 nanomolar) wurden mit ME-Zellen im Ruhezustand für 90 Minuten bei 23ºC inkubiert. Die spezifische Bindung von [¹²&sup5;I]-α-Thrombin wurde definiert, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist.

Beispiel 4: Stimulierung der DNA-Synthese durch ausgewählte Thrombinderivate

Dieses Beispiel zeigt, daß die Bindung zwischen stimulierenden (agonistischen) Polypeptiden und Thrombinrezeptoren ein Rezeptorbesetzungssignal erzeugt, das die DNA-Synthese und die Zellteilung induziert. Gemäß der vorliegenden Ausführungsform wurden die DNA-Synthese und die Zellproliferation als eine Funktion der Aufnahme von [³H] -Thymidin durch gezüchtete Fibroblasten, die den ausgewählten Polypeptiden in Gegenwart von nicht-mitogenen Konzentrationen an α-Thrombin oder PMA ausgesetzt wurden, gemessen. Obwohl die nachstehend beschriebenen in vitro-Techniken die beste Art und Weise darstellen, um die stimulierende Aktivität von ausgewählten Polypeptiden zu zeigen, erkennt der Fachmann, daß die Prinzipien, die unmittelbar nachstehend an dem in vitro-System gezeigt werden, auch in vivo anwendbar sind.

a. Techniken zur Messung der DNA-Synthese

Die Wirkungen der synthetischen Polypeptide auf die DNA-Synthese wurde durch Messung des Einbaus von Methyl-(³H)-Thymidin (TDR, ICN Pharmaceuticals, Irvine, Ca.) während einer 2-stündigen Inkubation im allgemeinen 22 Stunden nach der Zugabe von Peptiden und/oder Thrombin (Stiernberg et al., J. Cell Physiol., Bd. 120 (1984), S. 208-285) bestimmt. Nach der Inkubation wurden die Zellen extrahiert und mit eiskalter 10 %-iger (Gew./Vol.) Trichloressigsäure (TCA) gespült. Das mit Säure ausfällbare Material wurde über Nacht in 0,5 ml 0,5 n KOH bei 23ºC gelöst. 0,25 ml HCl (l n) wurden zugegeben, und die Lösung wurde in 10 ml RediSolv-HPB-Scintillationsflüssigkeit (Beckman Instruments, Houston, TK) vermessen.

b. Mitogene Aktivität von ausgewählten Thrombinderivaten

Jedes der synthetisierten Thrombinderivate wurde auf die mitogene Aktivität untersucht. Diese Untersuchung wurde auch mit den beiden Nicht- Thrombinpeptiden, die in Beispiel 3 (c) beschrieben wurden, durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind nachstehend beschrieben.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung untersuchten zuerst die Fähigkeit von p508-530, die DNA-Synthese, in nicht-proliferierenden Kulturen von ME- oder NIL-Zellen zu stimulieren. Wie in Fig. 4 gezeigt ist, war p508-530 selbst nicht ausreichend, den Einbau von [³H]-Thymidin in DNA zu stimulieren. In Kombination mit 2 nanomolar α-Thrombin stimulierten jedoch 0,1 mikromolar p508-530 einen 6-fachen oder mehr als 2-fachen Anstieg des Einbaus von [³H] -Thymidin in DNA in ME-Zellen im Vergleich mit Parallelkulturen, die unbehandelt blieben oder mit α-Thrombin allein behandelt wurden (Fig. 4A). Eine ähnliche mitogene Stimulation wurde auch in NIL-Hamsterzellen beobachtet, wobei sie jedoch eine geringfügig höhere Konzentration an Thrombin und den Peptiden erforderte (Fig. 4B). Das Ansprechen beider Zelltypen war äquivalent zum mitogenen Ansprechen, die durch eine maximal wirksame Konzentration von α-Thrombin (10 nanomolar) stimuliert wurde. Es ist bemerkenswert, daß für ME-Zellen die Stimulation durch p508-530 zwischen 12,5 nanomolar und 100 nanomolar (Fig. 4A) beobachtet wurde, Konzentrationen, die recht gut denen entsprechen, die erforderlich waren, um die Bindung von [¹²&sup5;I]-α-Thrombin an ME-Zellen zu hemmen (Fig. 3). Bei NIL-Zellen wurde eine entsprechende Korrelation zwischen den mitogenen Konzentrationen von p508-530 und den Konzentrationen, die zur Hemmung der Thrombinbindung erforderlich waren, beobachtet, wobei jedoch höhere Konzentrationen als bei ME-Zellen erforderlich waren.
Obwohl diese Ergebnisse darauf hindeuten, daß p508-530 mitogene Signale durch seine Wechselwirkung mit den Thrombinrezeptoren hoher Affinität erzeugt, war es möglich, daß das Peptid lediglich die wirksame Konzentration von α-Thrombin erhöhte. Kürzlich ist gezeigt worden, daß Phorbolmyristatacetat (PMA) die Wirkungen von gammα-Thrombin nachahmt und die DNA-Synthese und die Zellproliferation in Kombination mit DIP-α-Thrombin oder mit monoklonalen Antikörpern gegen den Thrombinrezeptor stimuliert. Es wurde daher vorhergesagt, daß, wenn p508-530 ein mit der Rezeptorbesetzung verbundenes Signal erzeugt, seine Zugabe zu Zellen in Kombination mit PMA die Mitogenese stimulieren sollte. Wie in Fig. 5 gezeigt ist, stimulierte p508-530 in Gegenwart von 25 ng/ml PMA (dies ist eine nichtmitogene Menge) einen 3,5-fachen Anstieg der DNA-Synthese gegenüber Kontrollen. Diese Stimulierung trat bei ungefähr der gleichen Konzentration des Peptids auf, die erforderlich war, um die DNA-Synthese in Gegenwart von geringen Konzentrationen an α-Thrombin zu stimulieren. Da aktives Thrombin bei diesen Versuchen nicht vorhanden war, scheint es, daß p508- 530 selbst ein mitogenes Signal erzeugt, das die Wirkung der DIP- oder α- Thrombin-Bindung an Thrombinrezeptoren hoher Affinität nachahmt.
Um sicherzustellen, daß die Stimulierung der DNA-Synthese durch p508- 530 durch seine Fähigkeit vermittelt wurde, mit dem Thrombinrezeptor hoher Affinität in Wechselwirkung zu treten, wurden die synthetischen, nicht von Thrombin abgeleiteten, nicht an den Rezeptor bindenden Polypeptide, die in Beispiel 3(c) beschrieben wurden, auf ihre mitogene Aktivität untersucht. Keines dieser Peptide erzeugte ein mitogenes Ansprechen in Gegenwart von 1 nanomolar α-Thrombin. Es ist also weder die Bindungsaktivität noch die mitogene Aktivität von p508-530 auf eine nicht-spezifische Wechselwirkung des Polypeptids mit den Zellen zurückzuführen.
Die Erfinder haben dann die mitogene Aktivität von kleineren Thrombinderivaten, nämlich p519-530 und p517-520, untersucht. Wie im vorstehenden Beispiel 3(c) angegeben ist, binden diese beiden Peptide an den Thrombinrezeptor hoher Affinität. In diesen Versuchen wurden steigende Konzentrationen an p519-530 und p517-520 zu NIL-Zellen im Ruhezustand in Gegenwart von 2 bis 4 nanomolar α-Thrombin gegeben. Wie in Fig. 6 gezeigt ist, verstärkte p519 die DNA-synthese über einen Bereich von Konzentrationen, während p517-520 keine Verstärkung hervorrief. p517-520 hemmte sogar die DNA-Synthese.

Beispiel 5: Hemmung der durch den Thrombinrezeptor vermittelten Mitogenese durch p517-520

Die Beobachtung, daß p517-520 die durch α-Thrombin stimulierte Mitogenese hemmt, war überraschend im Hinblick auf vorhergehende Untersuchungen, die zeigten, daß mitogene Effekte und Transmembran-Signal-Effekte von Thrombin durch DIP-α-Thrombin, ein Thrombinderivat, das um die aktive α-Thrombinbindung konkurriert, nicht gehemmt wurden. Auf diese Weise erkannten die Erfinder, daß p517-520, das imstande ist, mit nativem α- Thrombin um die Bindung an Zelloberflächen-Thrombinrezeptoren hoher Affinität zu konkurrieren, das jedoch nicht imstande ist, ein mitogenes Rezeptor-Besetzungssignal zu erzeugen, Eigenschaften aufweist, die bisher dem Fachmann nicht bekannt waren.
Um den Mechanismus zu erklären, durch den p517-520 imstande war, die durch Thrombin vermittelte Mitogenese zu hemmen, haben die Erfinder die Fähigkeit steigender Konzentrationen an α-Thrombin zur Stimulierung der DNA-Synthese in Kulturen, zu denen eine konstante Konzentration (625 nanomolar) an p517-520 gegeben worden war, gemessen (Fig. 7). Diese Versuche zeigten, daß p517-520 signifikant die Dosis-Ansprech-Kurve der Zellen auf α-Thrombin verschob. Zum Beispiel wurde bei den beiden Konzentrationen von α-Thrombin von 0,8 und 13,0 nanomolar die DNA-Synthese um ungefähr 75 % bzw. 35 % gehemmt. Die Hemmung der α-Thrombin-Stimulation durch p517-520 scheint also einen 500- bis 1000-fachen molaren Überschuß des Peptids zu erfordern. Dieser Befund ist konsistent mit der Beobachtung, daß p517-520 eine niedrigere kompetitive Bindungsaffinität für Thrombinrezeptoren auf ME-Zellen aufweist als p508-530.
Die Identifizierung von p517-520 als Bindungsdomäne hoher Affinität von Thrombin hat mehrere Auswirkungen im Hinblick auf den Mechanismus der Thrombinmitogenese. Vorhergehende Untersuchungen haben die proteolytische Abspaltung und das Verschwinden eines Moleküls von der Oberfläche von Hühnerembryozellen, die mit Thrombin behandelt wurden, gezeigt. In Vernetzungsstudien mit aktivem oder inaktivem Thrombin sind ebenfalls zwei verschieden große Rezeptormoleküle oder Substrate identifiziert worden. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß die Bindungsdomäne hoher Affinität von Thrombin sich sehr nahe der Spalte des aktiven Zentrums befindet; es sollte daher für Thrombin möglich sein, seinen Rezeptor zu spalten. Vorläufige Daten aus der Affinitätsreinigung des Thrombinrezeptors stützen die Hypothese, daß der Rezeptor selbst proteolytisch durch aktives Thrombin gespalten wird. Es ist möglich, daß die Thrombinrezeptor-Besetzung eine Veränderung der Rezeptorkonformation stimuliert, die für die Spaltung erforderlich ist. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Peptide p508-530, p519-530 oder α-Thrombin selbst zur Bindung an den Thrombinrezeptor in einer Weise imstande sind, die eine derartige Konformationsänderung induziert. Im Gegensatz dazu scheint p517-520 nur imstande, an den Rezeptor zu binden. Auf diese Weise hemmt p517-520 selektiv durch den Thrombinrezeptor vermittelte Ereignisse aufgrund seiner Fähigkeit, selektiv in Wechselwirkung mit Thrombinrezeptoren in einer Weise zu treten, die der Zelle ein Nulisignal gibt.

Beispiel 6: Verwendung stimulierender Peptide zur Förderung des Zellwachstums in vitro

Eine Anzahl an experimentellen und diagnostischen Verfahren erfordern es, daß Zellen in vitro gezüchtet werden. Da die stimulierenden Peptide die Proliferation von Fibroblastenzellen, die Thrombinrezeptoren hoher Affinität tragen, verstärken, stellt das Einverleiben derartiger Stimulierender Moleküle in das Kulturmedium eine wirksame Maßnahme zur Verstärkung des Zellwachstums dar. Da Thrombin außerdem die Proliferation weiterer Zellen unter Einschluß von Endothelzellen stimuliert, sind diese Peptide möglicherweise wirksam bei der Förderung des Wachstums einer Anzahl von Zelltypen. Die Verwendung der synthetischen Peptide als Wachstumszusätze hat eine Anzahl von Vorteilen Es ist weit weniger teuer, die Polypeptide zu synthetisieren, als natürlich vorkommendes Thrombin zu reinigen. Ferner sind die Polypeptide im Gegensatz zu natürlich vorkommendem Thrombin vergleichsweise unempfindlich gegen eine Hemmung durch Serumproteaseinhibitoren.
Zahlreiche Verfahren zur Herstellung von Zellen für die Züchtung sind dem Fachmann bekannt. Von einem derartigen Verfahren, das von Carney et al., (J. Cell. Physiol., Bd. 95 (1978), S. 13-22, wobei diese Druckschrift durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird) beschrieben wird, nimmt man an, daß es sich besonders gut für die Ausführung dieses Aspekts der Erfindung eignet.
Dem Fachmann ist klar, daß die erfindungsgemäßen stimulierenden Polypeptide zusammen mit einem beliebigen geeigneten Zellkulturmedium eingesetzt werden können, um die Vorteile ihrer zellstimulierenden Wirkungen zu erzielen. Zum Beispiel haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung festgestellt, daß ein Gemisch aus nach Dulbecco-Vogt modifiziertem Eagle- Medium und Ham-F12-Medium besonders geeignet als Grundmedium ist. Um die Erfindung auszuführen, gibt man 0,1 µg/ml bis 10 µl/ml des stimulierenden Polypeptids Ala-Gly-Tyr-Lys- Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Gys-Glu- Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val in das Kulturmedium. Die Zellen werden dann in einer geeigneten angefeuchteten Atmosphäre, z. B. mit einem Gehalt an 5 % CO&sub2; in Luft bei 37ac, inkubiert. In regelmäßigen Zeitabschnitten (3 bis 4 Tage) wird verbrauchtes Medium von der Zellkultur entfernt und durch frisches Medium, das, wie vorstehend beschrieben, formuliert wurde, ersetzt.

Beispiel 7: Behandlungsvorschriften

Aufgrund von Vorsichtsmaßnahmen, die notwendigerweise bei der Entwicklung jedes neuen Arzneistoffs eingehalten werden müssen, sind die erfindungsgemäßen Polypeptide bis jetzt nicht in klinischen Studien an Menschen getestet worden. Man nimmt jedoch an, daß die in vitro-Aktivität dieser Polypeptide hinsichtlich einer selektiven Förderung oder Hemmung der durch Thrombin vermittelten Mitogenese die Brauchbarkeit der vorliegenden Erfindung in dieser Hinsicht zeigt. Die nachstehenden, vorhergesagten Ausführungsformen stellen die beste Art und Weise dar, die von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung in Betracht gezogen wird, um die Erfindung in verschiedenen klinischen Untersuchungen in die Praxis umzusetzen.

a. Wundheilung

Man nimmt an, daß die stimulierenden Polypeptide sich als nützlich in zahlreichen klinischen Fällen erweisen, bei denen es wünschenswert ist, die Wundheilung zu verstärken. Insbesondere umfassen diese Fälle die Behandlung von Patienten mit Verbrennungen, von Patienten, die an schweren Unfällen beteiligt waren, von Patienten, die sich verschiedenen chirurgischen Eingriffen unterzogen haben, und von Patienten mit einer schlechten Wundheilung, wie alten Patienten und Diabetikern. Die beste Art und Weise der Verabreichung der Polypeptide hängt zwar von der besonderen klinischen Situation ab, man nimmt jedoch an, daß ihre Verabreichung in Form eines Aerosolsprays sich als besonders vorteilhaft in einer Reihe derartiger Situationen erweist. Verfahren, um therapeutische Mittel in Aerosolsprays einzuverleiben, sind dem Fachmann bekannt. Daher wird angenommen, daß Formulierung und Verwendung dieser stimulierenden Polypeptide in derartigen Aerosolsprays im Bereich des Könnens des Fachmanns im Licht der vorliegenden Offenbarung liegt.
Die stimulierenden Polypeptide können auf die Wunde auch in Form einer Salbe oder Lotion aufgetragen werden. Alternativ dazu können sie dem Material einverleibt werden, das zum Verbinden der Wunde verwendet wird. Techniken zum Einverleiben von therapeutischen Mitteln in Salben, Lotionen und Wundverbände sind dem Fachmann bekannt und liegen innerhalb des Könnens des Fachmanns im Licht der vorliegenden Anmeldung.
Man nimmt an, daß eine wirksame Dosis des Polypeptids ungefähr zwischen 0,5 mikromolar und 50 mikromolar liegt. Die genaue Dosierung ist jedoch natürlich empirisch durch experimentelle Verfahren zu bestimmen, die dem Fachmann im Bereich der Pharmazie bekannt sind.

b. Verwendung der inhibitorischen Polypeptide

1. Hemmung der Narbenbildung und der Bildung von Gewebeadhäsionen Man nimmt ferner an, daß die inhibitorischen Polypeptide sich als nützlich in einer Reihe von Fällen erweisen, z. B. wenn eine Inhibition der Fibroblastenproliferation erwünscht ist. Diese Fälle umfassen die Verhinderung von Narbenbildung und Gewebeadhäsionen.
Eine Art, in der die Erfindung in die Praxis umgesetzt werden kann, besteht im Einverleiben des inhibitorischen Polypeptids Arg-Gly-Asp-Ala in einen geeigneten Träger zum Auftragen auf eine Wunde, einen chirurgischen Schnitt oder die Oberfläche eines Körperorgans. Diese Träger umfassen Aerosolsprays, Salben und Lotionen, die für die direkte Auftragung auf Gewebe geeignet sind, sowie Lösungen, die für intravenöse oder subkutane Injektionen geeignet sind. Verfahren zum Einverleiben therapeutischer Mittel in pharmazeutische Träger, wie sie vorstehend beschrieben wurden, liegen innerhalb des Könnens des Fachmanns, was auch für Verfahren zum Auftragen der resultierenden Zusammensetzungen gilt.
Es wird vorgeschlagen, daß eine wirksame Dosis des Polypeptids 1 ng/cm² - 10 µg/cm² beträgt, wenn die Verbindung topisch aufgetragen wird. Wenn sie injiziert wird, dann ist eine wirksame Dosis die Dosis, die ausreicht, um eine Konzentration der Polypeptide von 0,1 mikromolar bis 10 mikromolar an der Stelle, wo sie benötigt werden, zu erzielen. Die genaue Dosierung sollte jedoch nach anerkannten pharmazeutischen Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Pharmazie bekannt sind, bestimmt werden.

2. Tumortherapie

Man nimmt an, daß die inhibitorischen Polypeptide sich als nützlich bei der Behandlung von verschiedenen Tumoren, insbesondere bei der Verhinderung der Metastase und der Angiogenese, erweisen. Es ist vorauszusehen, daß die inhibitorischen Peptide am besten durch intravenöse Verabreichung gegeben werden können.
Die inhibitorischen Peptide können täglich durch kontinuierliche Infusion oder an alternierenden Tagen, wobei an den Zwischentagen eine traditionellere Chemotherapie verabreicht wird, gegeben werden. Während die exakten Dosierungen der inhibitorischen Peptide empirisch nach Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, bestimmt werden müssen, ist abzuschätzen, daß eine wirksame Dosis einer Menge entsprechen würde, um eine Konzentration von 0,1 mikromolar bis 10 mikromolar an der Stelle, wo sie erforderlich ist, zu erzielen. Wie bei einem Arzneistoff eines beliebigen Typs sind klinische Untersuchungen erforderlich, um die Konzentrationen festzulegen, bei denen eine nicht mehr in Kauf zu nehmende Toxizität erreicht wird.
Die Erfindung ist in Form von speziellen Ausführungsformen beschrieben worden, von denen der Erfinder annimmt, daß es sich um die beste Art der Ausführung der Erfindung handelt. Im Licht der hier vorgelegten Offenbarung erkennen Fachleute auf verschiedenen Gebieten, daß Modifizierungen durchgeführt werden können, ohne vom beabsichtigten Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. Zum Beispiel können beliebige dieser Peptide nach einer Anzahl von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, verabreicht werden. Ferner ist zu erwarten, daß zukünftige Untersuchungen zur Herstellung von Thrombinderivaten mit einer verstärkten stimulierenden oder inhibitorischen Aktivität führen werden. Diese und alle anderen Modifizierungen und Ausführungsformen sollen innerhalb des Schutzumfangs der Patentansprüche liegen.

Claims

1. Polypeptid von 23 L-Aminosäuren mit einer Aminosäuresequenz, die mindescens teilweise von menschlichem Thrombin abgeleitet ist. und mit einer Thrombinrezeptor-Bindungsdomäne und einer bei Serinesterasen konservierten Sequenz von mindestens 12 Aminosäuren.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Thrombinrezeptor-Bindungsdomäne die folgende Sequenz von L-Aminosäuren umfaßt: Arg-Gly-Asp-Ala.

3. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Thrombinrezeptor-Bindungsdomäne Arg-Gly-Asp-Ala und die bei Serinesterasen konservierte Aminosäuresequenz Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly- Pro-Phe-Val umfaßt.

4. Polypeptid nach Anspruch 1 mit der folgenden Sequenz von L-Aminosäuren: Ala-Gly-Tyr-Lys -Pro-Asp-Glu-Gly-Lys -Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu- Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Gehalt an einem therapeutisch aktiven Mittel und einem pharmazeutisch verträglichen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem therapeutisch aktiven Mittel um ein Polypeptid handelt, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie als weiteres therapeutisch aktives Mittel eine Verbindung enthält, die unter α-Thrombin und gammα-Thrombin ausgewählt ist.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6 zur Verwendung bei einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung des Säugerkörpers.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der therapeutischen Behandlung um ein Verfahren zur Förderung der Wundheilung handelt.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der therapeutischen Behandlung um ein Verfahren zur Förderung der Zellproliferation handelt.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der therapeutischen Behandlung um ein Verfahren handelt, um die Wirkungen von Thrombin auf Zellen nachzuahmen.

11. Verwendung eines Polypeptidderivates von menschlichem Thrombin, das weniger Aminosäuren als menschliches Thrombin enthält und das eine Thrombinrezeptor Bindungsdomäne, jedoch keine bei Serineste rasen konservierte Aminosäuresequenz aufweist, zur Kerstellung eines Medikaments zur Hemmung der Wirkungen von Thrombin auf Zellen.

12. Die Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Rezeptorbindungsdomäne von menschlichem Thrombin L-Aminosäuren mit der Sequenz Arg-Gly-Asp-Ala umfaßt.

13. Die Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Polypeptid um ein Tetrapeptid mit der L-Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp- Ala handelt.

14. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Wirkung von Thrombin um die Bildung von Narbengewebe handelt.

15. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Wirkung von Thrombin um die Bildung von Gewebeadhäsionen handelt.

16. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Wirkung von Thrombin um die Zerstörung normaler interendothelialer Zellkontakte, die wichtig für die Tumormetastase ist, handelt, oder daß es sich bei der Wirkung von Thrombin um die Induktion der Angiogenese handelt.

17. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Wirkung von Thrombin um die Zellproliferation handelt.

18. Verfahren zur Hemmung der Wirkung von Thrombin auf die Zellproliferation in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen einem Polypeptidderivat von menschlichem Thrombin mit weniger Aminosäuren als menschliches Thrombin und mit einer Thrombinrezeptor-Bindungsdomäne, jedoch ohne eine bei Serinesterasen konservierte Aminosäuresequenz, ausgesetzt werden.

19. Verfahren nach Anspruch 18; dadurch gekennzeichnet, daß die Thrombinrezeptor-Bindungsdomäne die L-Aminosäuren mit der Sequenz Arg-Gly-Asp-Ala umfaßt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei es sich bei dem Polypeptid um ein Tetrapeptid mit der L-Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp-Ala handelt.

21. Verfahren zur Förderung der Zeliproliferation in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen einem Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert ist, ausgesetzt werden.

22. Verfahren nach Anspruch 21, ferner dadurch gekennzeichnet, daß Zellen einer Verbindung ausgesetzt werden, die unter α-Thrombin, gamma- Thrombin und Phorbolmyristatacetat ausgewählt ist.

23. Verfahren zur Nachahmung der Wirkungen von Thrombin auf Zellen in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen einem Polypeptid ausgesetzt werden, wie es in einem der Anspruche 1 bis 4 definiert ist.

24. Verfahren zur Hemmung der Wirkungen vonthrotoin auf Zellen In vitro, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen einem Folypeptidderivat von menschlichem Thrombin ausgesetzt werden, das weniger Aminosäuren als menschliches Thrombin enthält und eine Rezeptorbindungsdomäne von menschlichem Thrombin, jedoch keine bei Serinesterasen konservierte Aminosäuresequenz, aufweist.