DE68911061T2

DE68911061T2 - Mittel zur Kontrolle von Thrombenbildungen.

Info

Publication number: DE68911061T2
Application number: DE89115562T
Authority: DE
Inventors: Masayoshi Ono; Koichiro Tsuji
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1988-08-24
Filing date: 1989-08-23
Publication date: 1994-03-24
Anticipated expiration: 2009-08-24
Also published as: CA1339071C; EP0355811A3; US5202117A; KR900002800A; AU4014789A; AU625914B2; EP0355811B1; EP0355811A2; DE68911061D1; KR950003492B1; IL91423A; ATE97813T1; IL91423A0; ZA896463B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines menschliche Granulocyten-koloniestimulierenden Faktors (nachstehend als "menschlicher G-CSF" abgekürzt) zur Herstellung eines Thrombus-Kontrollmittels.
Die vorliegende Erfindung zielt ab auf die Behandlung arterieller und venöser Thromben durch die Anwendung von menschlichem G-CSF, der einer der humoralen Faktoren ist, die die Blutbildungsfähigkeit des menschlichen Körpers, insbesondere die Zellteilung, die Vermehrung und die Ausdifferenzierung von Neutrophilen, erhöhen. Keiner der bisher veröffentlichten wissenschaftlichen Berichte offenbart einen direkten Zusammenhang zur Verwendung von menschlichem G-CSF als Thrombus- Kontrollmittel.
Menschlicher G-CSF ist bekannt gewesen als humoraler blutbildender Faktor, der auf Vorläufer-Zellen der Granulocyten in experimentellen in vito- Systemen wirkt, wobei ihr Wachstum und ihre Differenzierung in Granulocyten gefördert wurden [siehe z.B.: Metcalf et al., Exp. Hematol., 1,(1973), 185]. Dennoch sind Untersuchungen über den Nutzen oder die Wirksamkeit von menschlichem G-CSF als Heilmittel wegen der außergewöhnlichen Schwierigkeit, der man bisher bei seiner Gewinnung begegnet ist, nicht ausreichend durchgeführt worden und es ist völlig unbekannt gewesen, daß menschlicher G-CSF die Fähigkeit besitzt, bei der Thromben-Behandlung Verwendung zu finden, worin das Hauptziel der vorliegenden Erfindung besteht.
Herkömmlich sind Heparin und Sigmarol in verschiedenen Dosierungsformen als Thrombus-Kontrollmittel, die die Blutgerinnung verzögern, verwendet worden, aber ein Bedarf für die Entwicklung von Arzneimitteln, die Fibringerinnsel auflösen, hat ebenfalls bestanden. Kürzlich ist die Herstellung von Urokinase und eines Plasminogenaktivators (PA), die zur Aktivierung des fibrinolytischen Systems fähig sind, im großtechnischen Maßstab etabliert worden und diese Stoffe sind als Thrombus-Kontrollmittel zum Einsatz gekommen.
Zur gleichen Zeit haben die jüngsten Fortschritte in der Technologie, insbesondere in der Gentechnologie, die Entwicklung eines Verfahrens ermöglicht, durch das ein reiner und homogener menschlicher G-CSF in großen Mengen hergestellt werden kann (vgl. EP-A-0169566 und Japanische Patentveröffentlichungen Nr. 62-236497 und 62-236488). Die EP-A-0169566 beschreibt einen koloniestimulierenden Faktor (CSF), der verwendet werden kann, um die Differenzierung und Vermehrung menschlicher Knochenmarkszellen zu Neutrophilen zu fördern.
Basierend auf diesem Stand der Technik, führten die hier genannten Erfinder Untersuchungen über mögliche Wirkungen von menschlichem G-CSF auf vasculäre Endothelialzellen durch, die PA produzieren, das zur Aktivierung des fibrinolytischen Systems fahig ist. Als Ergebnis haben die hier genannten Erfinder gefunden, daß der menschliche G-CSF die Produktion von PA erhöht, das zur Aktivierung des fibrinolytischen Systems fähig ist. Deshalb kann er als Thrombus-Kontrollmittel, welches eine hohe Wirksamkeit hat und nur begrenzte Nebenwirkungen verursacht, verwendet werden.
Mit der Absicht, das vorstehend beschriebene Ziel zu erreichen, führten die hier genannten Erfinder intensive Untersuchungen unter Verwendung von Säugetier-Endothelialzellen durch. Bei den Untersuchungen, durchgeführt an Rinder-Carotis-Endothelialzellen und Rhesusaffen, wurden die folgenden Tatsachen festgestellt:
(1) Rinder-Carotis-Endothelialzellen (nachstehend vereinfacht als "Endothelialzellen" bezeichnet), die mit menschlichem G-CSF vorinkubiert wurden, synthetisierten und sezernierten etwa fünfmal soviel PA wie Zellen, die ohne menschlichen G-CSF vorinkubiert wurden.
(2) Die PA-Produktion erreichte das Maximum, wenn G-CSF in einer Konzentration von etwa 50 ng/ml zugesetzt wurde, was im wesentlichen einer optimalen Konzentration für die Ziel-Zellen im blutbildenden System gleichkommt.
(3) Betreffs der Förderung der PA-Synthese und PA-Sekreüon durch die Endothelialzellen, die mit menschlichem G-CSF vorinkubiert wurden, besteht eine signifikante Korrelation zwischen der Konzentration der GCSF-Zugabe und dem Zeitraum der Vorinkubation.
(4) Wenn man ein Fibrin-Gel in einer Petrischale herstellte und vasculäre Endothelialzellen auf diesem Gel gezüchtet wurden, wurde PA proportional dazu sezerniert, wie die Zellen mit G-CSF wuchsen und das Plasminogen in der Flüssigkultur in Plasmin, welches das Fibrin-Gel lysierte, umgewandelt wurde; und
(5) wenn menschlicher G-CSF kontinuierlich an Rhesus-Affen, die dem Menschen eng verwandt sind, verabreicht wurde und eine Thromboelastogramm-Analyse von nach zwei Wochen entnommenem Frischblut durchgeführt wurde, konnte das Auftreten der Fibrinolyse unmittelbar nach der Blutgerinnung beobachtet werden. Das läßt sich wallrscheinlich auf die Aktivierung des fibrinolytischen Systems zurückführen.
Diese Ergebnisse legen die Möglichkeit nahe, daß der menschliche GCSF auf arterielle und venöse vasculäre Endothelialzellen wirkt und ihre PA-Synthese und PA-Sekretion dadurch fördert, daß das in großen Mengen im Blut vorhandene Plasminogen in Plasmin umgewandelt wird, wobei das so erhaltene Plasmin selektiv Fibrin-Gerinnsel im Blut lysiert. Die vorliegende Erfindung ist auf der Grundlage dieses Mechanismus zustande gekommen und stellt ein Thrombus-Kontrollmittel bereit, das den menschlichen G-CSF als Wirkstoff enthält.
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, welche die Wirkung des menschlichen G-CSF auf die PA-Produktion durch vasculäre Rinder-Endothelialzellen zeigt;
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, welche die Korrelation zwischen der Vorinkubationszeit mit menschlichem G-CSF und der PA-Produktion durch Rinder-Endothelialzellen zeigt;
Fig. 3 zeigt die Wirkung des menschlichen G-CSF auf die Förderung der fibrinolytischen Aktivität von Endothelialzellen; und
Fig. 4 zeigt die zeitabhängigen Veränderungen im TEG-Muster nach fortgesetzter Verabreichung von menschlichem G-CSF an Rhesus-Affen für 13 Wochen.
Der menschliche G-CSF, der als Wirkstoff des erfindungsgemäßen Thrombus-Kontrollmittels verwendet wird, kann aus jeder beliebigen Quelle stammen, sofern er eine hohe Reinheit besitzt. Z.B. kann der menschliche G-CSF durch Extrahieren, Trennen und Aufreinigen aus einer menschlichen, lebensfähigen Probe hergestellt werden. Ein menschlicher G-CSF kann aus dem Kulturüberstand von menschlichen G-CSF-produzierenden Zellen isoliert werden. In einer anderen Ausführungsform kann ein menschlicher G-CSF aus menschlichen G-CSF-produzierenden Hybridom-Zellen, hergestellt durch Zellfusion, gewonnen werden. Die rekombinante Gentechnologie kann dadurch nutzbar gemacht werden, daß ein Wirt, wie E.coli oder tierische Zellen, einer Transformation unterzogen wird und ein menschlicher G-CSF im Transformanten produziert und daraus isoliert und aufgereinigt wird. Falls gewünscht, kann die Aminosäure-Sequenz des nativen menschlichen G-CSF chemisch verändert werden, um einen gewünschten menschlichen G-CSF herzustellen.
Besonders bevorzugte Beispiele von menschlichen G-CSF, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind die folgenden zwei, welche einen hohen Reinheitsgrad besitzen und in großem Volumen hergestellt werden können:
(1) menschlicher G-CSF, der die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist:
i) Molekulargewicht: etwa 19 000 ± 1000, gemessen durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese;
ii) isoelektrischer Punkt weist mindestens einen der drei isoelektrischen Punkte pI= 5,5 ± 0,1 , pI= 5,8 ± 0,1 und pI= 6,1 ± 0,1 auf
iii) UV-Absorption: weist ein Absorptionsmaximum bei 280 nm und ein Absorptionsminimum bei 250 nm auf;
iv) Aminosäuresequenz der 21 Reste am N-Terminus:
(2) menschlicher G-CSF, der entweder ein Polypeptid enthält, das die Aktivität des menschliche Granulocyten-koloniestimulierenden Faktors aufweist, verkörpert durch die gesamte oder durch einen Teil der nachstehend gezeigten Aminosäuresequenz, oder ein Glycoprotein enthält, das sowohl das Polypeptid als auch einen Zuckeranteil aufweist:
(mit der Maßgabe, daß m 0 oder 1 und n 0 oder 1 ist).
Die vorstehend beschriebenen menschlichen G-CSFs können durch die in den Referenzbeispielen gezeigten Verfahren, welche nachstehend wiedergegeben werden, hergestellt werden. Wie genau dargelegt, kann der menschliche G-CSF unter (1) durch das in Referenzbeispiel 1 beschriebene Verfahren hergestellt werden, während der menschliche CCSF unter (2) durch das im Referenzbeispiel 2 beschriebene Verfahren hergestellt werden kann ( wenn m=0, wird der menschliche G-CSF bequemerweise als -VSE bezeichnet, und wenn m=1, wird er als +VSE bezeichnet).
Für Detalls der besonderen, in diesen Verfahren anzuwendenden Verfahrensbedingungen vgl. die Beschreibungen der gemeinsam übertragenen japanischen Patentveröffentlichungen Nr. 61-22752, 62-236497 und 62-236488.
Ein anderes Verfahren, das angewendet werden kann, besteht in der Durchführung einer Fusion einer G-CSF-produzierenden Zelle mit einer sich selbst vermehrenden malignen Tumorzelle und der Züchtung der so erhaltenen Hybridom-Zelle zusammen mit oder ohne Mitogen.
Alle menschlichen G-CSFs, die durch die vorstehend beschriebenen Verfahren gewonnen werden, sind im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten.
Die gewonnene, menschlichen G-CSF enthaltende Lösung kann in gefrorenem Zustand nach einer Sterilfiltration durch ein geeignetes Filtermedium, wie einen Millipore-Filter, gefolgt von einer weiteren Reinigung und Konzentrierung, die je nach Erfordernis mit beliebigen bekannten Verfahren durchgeführt werden können, aufbewahrt werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Lösung nach einer Dehydratation mit solchen Methoden wie Gefriertrocknung oder Vakuumtrocknung aufbewahrt werden.
Falls gewünscht, kann der menschliche G-CSF für die Injektion nach Auflösen in destilliertem Wasser oder in einer geeigneten Pufferlösung verwendet werden.
Um das erfindungsgemäße Thrombus-Kontrollmittel in einer Dosierungsform, die der Verabreichung an Menschen und Tiere angepaßt ist, zu formulieren, können einer oder mehrere der folgenden Zusatzstoffe zugegeben werden: ein pharmazeutischer Träger und Excipient, sowie ein Stabilisator und ein Antiadsorptionsmittel.
Die Dosis des im erfindungsgemäßen Thrombus-Kontrollmittel enthaltenen menschlichen G-CSF und die Häufigkeit seiner Verabreichung kann mit Rücksicht auf die Schwere der zu behandelnden Krankheit bestimmt werden.
Als Richtwert kann eine Formulierung die menschlichen G-CSF in einer Menge von 0,1 - 1,000 ug, vorzugsweise 1-500 ug pro Erwachsener enthält, 1 -7 mal pro Woche verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend detaillierter unter Bezugnahme auf Referenzbeispiele (zur Herstellung von menschlichem G-CSF), Experimentalbeispiele (um die pharmazeutische Wirksamkeit von menschlichem G-CSF zu zeigen) und Beispiele (von pharmazeutischen Dosierungsformen) beschrieben.
Referenzbeispiel 1

Herstellung von menschlichem G-CSF durch die Züchtung G-CSFproduzierender Zellen:

Die aus menschlichen Oralkarzinom-Zellen stammende, G-CSF-produzierende Zellinie CHU-1 wurde durch das Verfahren etabliert, welches in Beispiel 1 in der Beschreibung der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 61-227526 beschrieben ist. Die ähnliche Zellinie CHU-2 ( CNCM-Hinterlegungsnummer I- 483) wurde durch das gleiche Verfahren etabliert. Jede dieser Zellinien wurde in einer Flüssigkultur RPMI 1640, enthaltend foetales Rinderserum, suspendiert, in eine Rollerflasche überführt und unter Drehen gezüchtet. Wenn die Zellen so wuchsen, daß sie eine zusammenhängende Schicht auf der inneren Oberfläche der Rollerflasche bildeten, wurde die Kulturlösung durch ein serumfreies RPMI 1640 ersetzt. Nach 4 Tagen Züchtung wurde der Kulturüberstand entnommen und die Züchtung wurde unter Zugabe eines serumhaltigen RPMI 1640 fortgesetzt. Nach 3 Tagen Züchtung wurde die Kulturlösung wieder durch ein serumfreies RPMI 1640 ersetzt und der Kulturüberstand wurde 4 Tage später entnommen. Durch Wiederholung dieser Verfahren wurde der Kulturüberstand gewonnen. Der so erhaltene, serumfreie Kulturüberstand wurde etwa 1000-fach durch Ultrafiltration konzentriert und anschließend einer Aufreinigung und Prufung durch die gleichen Verfahren unterzogen, wie sie in den Beispielen der Beschreibung der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 61-227 beschrieben wurden.

Referenzbeispiel 2

Herstellung von menschlichem GCSF durch die rekombinante Gentechnologie:

Die folgende Beschreibung kommt für die Herstellung von +VSE oder -VSE in Frage, abhängig davon, ob, wie vorstehend beschrieben, m=1 oder 0 in der Aminosäuresequenz ist.
Ein cDNA-Fragment mit dem Gen für den menschlichen G-CSF, das aus dem Escherichia coli (E.coli)-Stamm 1766 ausgeschnitten wurde, der von dem Rechtsnachfolger beim "Fermentation Research Institute, the Agency of Science and Technology" hinterlegt wurde (FERM BP-955 für -VSE und FERM BP-954 für +VSE), wurde in den Vektor pdKCR eingebaut, wobei das Plasmid pHGV2 (im Fall von -VSE) oder pHGG4 (im Fall von +VSE) hergestellt wurde. Die Plasmide wurden mit Sal I behandelt und anschließend mit dem Klenow- Fragment der DNA-Polymerase umgesetzt.
Nach dem Anknüpfen eines EcoRI-Unkerfragmentes wurde diese DNA erneut mit EcoRI partiell gespalten und ein Fragment von ca. 2.7 Kb wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gewonnen.
In einem getrennten Schritt wurde das Plasmid pAdD26SVpA [Kaufman,R.G. & Sharp,P.A., Mol.Cell. Biol.,2, (1982), 13041319] mit EcoRI behandelt und durch Behandlung mit BAP dephosphoryliert. Anschließend wurde ein EcoRI-Fragment von pAdD26SVpA nach Phenolbehandlung durch Elektrophorese gewonnen.
Die so erhaltenen 2.7 Kb- und pAdD26SVpA-Fragmente wurden verknüpft und zur Transformation des E.coli-Stammes DHI mit dem Rubidiumchlorid- Verfahren verwendet, wobei das Plasmid pHGV2-dhfr (im Fall von -VSE) oder pHGG4-dhfr (im Fall von +VSE) hergestellt wurde.
CHO-Zellen (dhfr&supmin;-Linie, mit freundlicher Genehmigung von Dr. L.Chasin von der Columbia University) wurden zum Wachsen in 10% Kälberserum enthaltendem alpha-Minimal-Grundmedium (α- MEN, erganzt durch Adenosin, Desoxyadenosin und Thymidin) auf Platten gezüchtet (9 cm Durchmesser, Nunc). Die gezüchteten Zellen wurden mit dem Calciumphosphat-Verfahren [Wigler et al., Cell, 14, (1978), 725) in folgender Weise transformiert.
Eine Träger-DNA (Kalbsthymus-DNA) wurde in einer geeigneten Menge 1ug des vorher hergestellten Plasmides pHGV2-dhfr (im Fall von -VSE) oder pHGG4dhfr (+VSE) zugefügt und das Gemisch wurde in 375 ul einer TE-Lösung gelöst, gefolgt von der Zugabe von 125 ul 1M CaCl&sub2;. Nach Abkühlen der Lösung auf Eis für 3-5 Minuten wurden der Lösung 500 ul 2x HBS (50 mM Hepes, 280 mM NaCl und 1,5 mM Phosphat-Puffer) zugefügt. Nach erneutem Kühlen auf Eis wurde die Lösung mit 1 ml der CHO-Zellkultur vermischt, auf Platten übertragen und 9 Stunden in einem CO&sub2;-Brutschrank bebrütet.
Nach Waschen mit TBS (Tris-gepufferte physiologische Kochsalzlösung), Zugabe von 20 % Glycerin enthaltendem TBS und erneutem Waschen wurde ein nichtselektives Medium (das vorstehend beschriebene α-MEN-Medium, das zusätzlich mit Nucleotiden ergänzt worden war) zugefügt. Nach 2 Tagen Bebrütung wurde eine 10-fache Verdünnung der Kultur auf ein selektives Medium (ohne Nucleotide) übertragen. Die Züchtung wurde fortgesetzt, wobei das Medium alle 2 Tage durch ein frisches selektives Medium ersetzt wurde. Die so erhaltenen Kolonien wurden selektiert und auf frische Platten übertragen, wo die Zellen in Gegenwart von 0,02 uM Methotrexat (MTX) wuchsen, gefolgt von einer Clonierung durch Wachstum in Gegenwart von 0,1 uM MTX.
Als Ergebnis weiterer Clonierungsverfahren wurde bestätigt, daß menschlicher G-CSF in einer Menge von mindestens 10 mg/L (im Fall von -VSE) oder mindestens 1 mg/L (im Fall von +VSE) produziert worden war.
Die Reinigung des menschlichen GCSF und die Prüfung seiner Aktivität wurden mit Verfahren durchgeführt, die in den Beispielen der Beschreibung der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 62-236488 beschrieben wurden.

Experimentalbeispiel 1

G-CSF verursachte die Erhöhung der Plasminogenaktivator (PA)- Produktion durch Rinder-Carotis-Endothelialzellen:

Vasculäre Endothelialzellen, entnommen aus der Rinder-Halsschlagader, wurden in Eagle-Minimal-Grundmedium verteilt, das 20% foetales Rinderserum, 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 ug/ml Streptomycin enthielt. Die Züchtung der ersten Generation wurde in einer Petrischale bei 37ºC in einer Atmosphäre aus 95% Luft und 5% CO&sub2; durchgeführt. Nachdem sich eine zusammenhängende Schicht auf dem Boden der Petrischale gebildet hatte, wurden die Zellen in einer 0.05 %igen Trypsin-Lösung verteilt und weitergezüchtet. In der nächsten Stufe wurde eine serienmäßige Züchtung unter den gleichen Bedingungen wie bei der Züchtung der ersten Generation durchgeführt, außer daß die Konzentration des foetalen Rinderserums auf 10% abgeändert wurde. Das so erhaltene große Volumen an Zellen wurde 2 Tage in einer Petrischale unter Verwendung des bereits beschriebenen Eagle-Minimal- Grundmediums, enthaltend 10% foetales Rinderserum, zusammen mit dem im Referenzbeispiel 2 hergestellten G-CSF gezüchtet, wobei dessen Konzentration von 0 bis 300 ng/ml variert wurde. Später wurden die Zellen mit einem Medium, das weder G-CSF noch Serum enthielt, gewaschen und 8 Stunden in einem ähnlichen Medium weitergezüchtet, wobei ein konditioniertes Medium hergestellt wurde. Die Aktivität des PA, der in dieses konditionierte Medium sezerniert wurde, wurde mit einem gekoppelten fluorometrischen Verfahren geprüft. Im ersten Schritt wurde Plasminogen durch PA zu Plasmin aktiviert, und im zweiten Schritt wurde die Aktivität des so erhaltenen Plasmins unter Verwendung von t-Butyloxycarbonyl-L-Valyl-L-Leucyl-Lysin-4- Methylcoumaryl-7-amid (BOC-Val-Leu-Lys-MCA) als synthetischem Substrat gemessen. Die PA-Aktivität wurde in der Maßeinheit der Internationalen Urokinase-Einheit (I.U.) angegeben.
Wie aus Fig.1 deutlich wird, erhöhte sich die PA-Aktivität dramatisch mit der steigenden Zugabe an G-CSF und erreichte ein Plateau bei einer Konzentration von 50 ng/ml. Wie Fig. 2 zeigt, erhöhte sich die PA-Produktion im Verlauf der Vorinkubationszeit und erreichte im wesentlichen in 12 Stunden ein Maximum. Die Aktivitätserhöhung war fünfmal so groß wie bei der Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse zeigen, daß G-CSF auf vasculäre Endothelialzellen wirkt, wobei ihre PA-Produktion deutlich gefördert wurde.
Zur Bestätigung, daß sich die PA-Produktion nicht nur extrazellulär, sondern auch intrazellulär erhöhte, wurde das folgende Experiment ebenfalls durchgeführt. Nach 2 Tagen Züchtung mit G-CSF wurden die Zellen gewaschen, die eine Hälfte von ihnen mit 0.5% Triton X-100 homogenisiert und der gewonnene Zellextrakt wurde auf seine intrazelluläre PA-Aktivität geprüft. Die andere Hälfte der Zellen wurde in der bereits beschriebenen Weise 8 Stunden gezüchtet und die so erhaltene Kultur wurde auf die Aktivität des extrazellulären PA-Sekretes geprüft. Die Ergebnisse werden nachstehend in Tabelle 1 gezeigt, aus der man ersehen kann, daß die intrazelluläre PA- Aktivität sich genauso erhöhte wie die extrazelluläre Aktivität. Wenn der Proteinsynthese-Inhibitor Cycloheximid dem Medium während der 2 Tage Züchtung zugesetzt wurde, wurden sowohl die intrazelluläre als auch die extrazelluläre PA-Produktion in der anschließenden Züchtungsperiode von 8 Stunden vollständig inhibiert.
Diese Tatsachen zeigen, daß die PA-Produktion durch vasculäre Endothelialzellen beträchtlich durch die Zugabe von G-CSF ins Medium erhöht wurde Tabelle 1 Intrazelluläre und extrazelluläre PA-Aktivitäten von Endothelialzellen, die mit menschlichem G-CSF behandelt wurden Behandlung PA-Aktivität (Urokinase I.U./10&sup8;Zellen) Extrazellularer Überstand Intrazellulär Kontrolle

Experimentalbeispiel 2

Förderung der fibrinolytischen Aktivität vasculärer Endothelialzellen durch G-CSF:

Einhundert Mikroliter Thrombin (5 u/ml) wurden 2,4 ml einer Fibrinogenlösung (13,5 mg/ml) in einer Kulturschale zugefügt und die Bebrütung wurde bei 37ºC für 3 Stunden durchgeführt, wodurch sich ein Fibringel bildete. Auf dem Gel ließ man Rinder-Carotis-Endothelialzellen in Eagle-Minimal-Grundmedium, enthaltend 10% foetales Rinderserum, Penicillin (50 u/ml) und Streptomycin (50 ug/ml), zusammen mit 500 ng/ml des im Referenzbeispiel 2 gewonnenen G-CSF wachsen. Eine unbehandelte Kontrollgruppe wurde unter den gleichen Bedingungen gezüchtet. Nach 43 Stunden Züchtung wurde eine kleine Lysezone bei der Kontrollgruppe beobachtet, wie in Fig. 3 gezeigt, und das spiegelt eine geringe Sekretion von PA aus den Zellen der Kontrollgruppe wider. Eine größere und deutlich ausgeprägtere Lysezone wurde bei den Zellen der behandelten Gruppe beobachtet. G-CSF stimulierte diese Zellen, mehr PA zu synthetisieren und zu sezernieren, mit einer nachfolgenden Aktivierung des Plasminogens in der Kultur, wobei Plasmin erzeugt wurde, welches das Fibringel lysierte.
Diese Ergebnisse zeigen, daß menschlicher G-CSF auf vasculare Endothelialzellen wirkt, wobei die PA-Synthese und PA-Sekretion gefördert werden und das sezernierte PA das Plasminogen aus der Umgebung aktiviert, wobei Plasmin erzeugt wird, welches dann Fibrin als Hauptbestandteil des Thrombus lysiert.
Die vorhergehenden Daten beweisen, daß menschlicher G-CSF die vasculären Endothelialzellen stimuliert, wobei die PA-Freisetzung gefördert und dadurch die fibrinolytische Aktivität dieser Zellen erhöht wird.

Experimentalbeispiel 3

Erhöhung der fibrinolytischen Aktivität bei Rhesus-Affen durch fortgesetzte Verabreichung von menschlichem G-CSF:

Nach der kontinuierlichen Verabreichung von menschlichem G-CSF an Rhesus-Affen wurde eine Probe peripheren Blutes entnommen und dessen fibrinolytische Aktivität mit einem Thromboelastogramm (TEG) unter Verwendung eines Blutgerinnsel-Indikators, Modell TE-400 (Elmer), geprüft. Das Ergebnis wird in Fig. 4a gezeigt aus der ersehen werden kann, daß in der Kontrollgruppe die Amplitude eines TEG-Musters zunahm, wenn die Gerinnung startete, und daß die Maximalamplitude (MA) des Musters allmählich abnahm, wenn sich die fibrinolytische Aktivität zu einem späteren Zeitpunkt entwickelte. Im Gegensatz dazu trat bei Tieren, denen eine subcutane Injektion des menschlichen G-CSF in einer Menge von 1 ug/kg gegeben worden war, eine deutliche Erhöhung der fibrinolytischen Aktivität im TEG-Muster bereits zwei Wochen nach der Injektion auf (vgl. Fig. 4b; vgl. auch Referenz 1, "JISSEN SHlKETSU GYOKOGAKU", herausgegeben von M.Fujimaki et al., S. 189- 191), was die Abnahme der Elastizität des Gerinnsels und des Fibringerinnsels im Verlauf der Blutgerinnung offenbart. Wie Fig. 4c zeigt, war die Erhöhung der fibrinolytischen Aktivität bei Tieren deutlicher ausgeprägt, denen fortgesetzt menschlicher G-CSF in einer Menge von 10 ug/kg verabreicht worden war [vgl. Referenz 2, "Analysis of Clot Tracer Patterns" in: KISO TO RINSHO. BAND 12, NR. 6, Juni (1978), S. 76-78]. Wie Referenz 2 zeigt, tritt bei Zugabe von Urokinase zu einer geronnenen Probe normalen menschlichen Blutes eine Lyse auf, die ein Muster mit einer einzelnen Linie erzeugt. Eine zu diesem Thromboelastogramm vollkommen identische Tendenz wurde in fast allen Fällen beobachtet, bei denen menschlicher G-CSF verabreicht worden war.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß menschlicher G-CSF nicht nur in vitro, sondern auch in vivo fähig war, eine Erhöhung der fibrinolytischen Aktivität herbeizuführen.

Zusammenfassung:

(1) Vasculäre Endothelialzellen, die zusammen mit menschlichem G-CSF vorinkubiert wurden, synthetisierten und sezernierten etwa 5-mal soviel PA als wenn sie ohne menschlichen G-CSF vorinkubiert wurden;
(2) bei Züchtung von menschlichem G-CSF und vasculären Endothelialzellen auf einem Fibringel wurde die Synthese und Sekretion von PA durch die Endothelialzellen gefördert, mit einer nachfolgenden Aktivierung des gleichzeitig vorhandenen Plasminogens zu Plasmin, welches das Gel, bestehend aus Fibrin, dem Thrombus- Hauptbestandteil, lysierte (das heißt: menschlicher G-CSF stimulierte die vasculären Endothelialzellen, PA freizusetzen, wodurch eine erhöhte fibrinolytische Aktivität erzeugt wurde); und
(3) die Analyse eines Thromboelastogramms einer Probe peripheren Blutes, die einem Rhesus-Affen entnommen wurde, dem kontinuierlich menschlicher G-CSF verabreicht worden war, offenbarte eine Erhöhung der fibrinolytischen Aktivität des Tieres.
Folglich wurde bewiesen, daß menschlicher G-CSF fähig ist, eine deutliche Erhöhung der fibrinolytischen Aktivität sowohl in vitro als auch in vivo herbeizuführen.

Beispiel 1

Polysorbat 20 (Tween 20 : Polyoxyethylensorbitanmonolaurat), ein nichtionisches grenzflächenaktives Mittel, wurde einer 50 ug/ml Lösung von menschlichem G-CSF, hergestellt und gereinigt im Referenzbeispiel 1, in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7), so zugefügt, daß die Polysorbat 20- Endkonzentration 0,1 mg/ml war. Nachdem der osmotische Druck so eingestellt war, daß er dem der physiologischen Kochsalzlösung entsprach, wurde die Lösung durch ein Membranfilter mit einer Porengröße von 0.22 um zur Entfernung von Mikroorganismen gefiltert und in vorher sterilisierte Ampullen abgefüllt. Den Ampullen wurden sterilisierte Gummiverschlüsse aufgesetzt und dann wurden sie mit Aluminiumdeckeln abgedichtet, wodurch ein Injektions-Flüssigpräparat erhalten wurde. Die Ampullen wurden in der Dunkelheit bei einer Temperatur unter 10 ºC aufbewahrt.

Beispiel 2

Polysorbat 80 (Tween 80 : Polyoxyethylensorbitanmonooleat), ein nichtionisches grenzflächenaktives Mittel, wurde einer100 ug/ml-Lösung von menschlichem G-CSF, hergestellt und gereinigt im Referenzbeispiel 2, in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7), so zugefügt daß die Endkonzentration von Polysorbat 80 0,1 mg/ml betrug. Nachdem der osmotische Druck so eingestellt war, das er dem der physiologischen Kochsalzlösung entsprach, wurde die Lösung durch ein Membranfilter mit einer Porengröße von 0.22 um zur Entfernung von Mikroorganismen gefiltert und in vorher sterilisierte Ampullen abgefüllt. Den Ampullen wurden sterilisierte Gummiverschlüsse aufgesetzt und dann wurden sie mit Aluminiumdeckeln abgedichtet, wobei ein Injektionspräparat erhalten wurde. Die Ampullen wurden in der Dunkelheit bei einer Temperatur unter 10 ºC aufbewahrt.

Beispiel 3

Polysorbat 20 (Tween 20 : Polyoxyethylensorbitanmonolaurat), ein nichtionisches grenzflächenaktives Mittel, HSA und Mannit wurden einer 50 ug/ml-Lösung von menschlichem G-CSF, hergestellt und gereinigt in Referenzbeispiel 1, in 10mM Phosphatpuffer (pH 7), zugefügt so daß die Endkonzentrationen von Polysorbat 20, HSA und Manmt 0,1 mg/ml, 10 mg/ml bzw. 50 mg/ml waren. Die Lösung wurde durch ein Membranfiker mit einer Porengröße von 0.22 um zur Entfernung von Mikroorganismen gefiltert und in vorher sterilisierte Ampullen abgefüllt. Die Gummiverschlüsse wurden durch die Gummiinsertions-Maschine locker aufgesetzt, so daß zwei Öffnungen des Gummiverschlusses freiliegend waren und dadurch das Verfahren des Gefriertrocknens erlaubten. Die abgefüllte Lösung wurde gefriergetrocknet. Die Ampullen wurden dann mit den Gummiverschlüssen und danach mit den Aluminiumdeckeln abgedichtet, wobei ein gefriergetrocknetes Injektionspräparat erhalten wurde. Das Präparat in den Ampullen, das bei Raumtemperatur aufbewahrt werden kann, wird für eine Injektion verwendet, nachdem es wieder mit destilliertem Wasser versetzt wurde.

Beispiel 4

Polysorbat 80 (Tween 80 : Polyoxyethylensorbitanmonooleat), ein nichtionisches grenzflächenaktives Mittel, Gelatine und Mannit wurden einer 100 ug/ml-Lösung von menschlichem G-CSF, hergestellt und gereinigt in Referenzbeispiel 2, in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7), zugefügt, so daß die Endkonzentrationen von Polysorbat 80, Gelatine und Mannit 0,1 mg/ml, 10 mg/ml bzw. 50 mg/ml waren. Die Lösung wurde durch ein Membranfilter mit einer Porengröße von 0.22 um zur Entfernung von Mikroorganismen gefiltert und in vorher sterilisierte Ampullen abgefüllt. Die Gummiverschlüsse wurden durch die Gummiinsertions-Maschine locker aufgesetzt, so daß zwei Öffnungen des Gummiverschlusses freiliegend waren und dadurch das Verfahren des Gefriertrocknens erlaubten. Die abgefüllte Lösung wurde gefriergetrocknet. Die Ampullen wurden dann mit den Gummiverschlüssen und danach mit den Aluminiumdeckeln abgedichtet, wodurch ein gefriergetrocknetes Injektionspräparat erhalten wurde. Das Präparat in den Ampullen, das bei Raumtemperatur aufbewahrt werden kann, wird für eine Injektion verwendet, nachdem es wieder mit destilliertem Wasser versetzt wurde.
Das erfindungsgemäße Thrombus-Kontrollmittel, das menschlichen GCSF als Wirkstoff enthält, erhöht die Fähigkeit von vasculären Endothelialzellen des Menschen, PA zu produzieren, wobei diese Fähigkeit zur Natur des menschlichen Körpers gehört, und wodurch das Plasminogen im Blut in seine aktivierte Form (Plasmin) umgewandelt wird, welche dann die fibrinolytische Aktivität mit nachfolgender Thrombus-Auflösung ergibt. Weiter wächst die Zahl der Neutrophilen als Ergebnis der G-CSF-Verabreichung an. Diese wirken dadurch, daß sie den Abbau des lysierten Thrombus fördern. Diese zwei Wirkungen vereinigen sich, wodurch Thromben wirksam aufgelöst und beseitigt werden. Deshalb stellt die vorliegende Erfindung ein zweckdienliches Thrombus- Kontrollmittel mit verminderten Nebenwirkungen bereit.

Claims

1. Verwendung eines menschliche Granulocyten koloniestimulierenden Faktors zur Herstellung eines Thrombus-Kontrollmittels.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Thrombus-Kontrollmittel auf alle Thromben anwendbar ist, die sich in den arteriellen und venösen Blutgefäßen eines lebenden Körpers bilden.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der menschliche Granulocyten koloniestimuiierende Faktor die Synthese und Sekretion von Plasminogenaktivator durch arterielle und venöse vaskuläre Endothelialzellen fördert, wobei der Plasminogenaktivator Plasmin zur Erhöhung der fibrinolytischen Aktivität der Endothelialzellen bildet.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der menschliche Granulocyten koloniestimulierende Faktor vom Überstand einer Kultur von Zellen, die menschliche Granulocyten koloniestimulierenden Faktor produzieren, erhalten wird.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der menschliche Granulocyten koloniestimulierende Faktor die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist:

i) Molekulargewicht: etwa 19 000 ± 1000, gemessen durch Elektrophorese in einem Natriumdodecylsulfat-Polyacryiamidgel;

ii) isoelektrischer Punkt: weist mindestens einen der drei isoelektrischen Punkte pI = 5,5 ± 0,1, pI = 5,8 ± 0,1 und pI = 6 1 ± 0,1 auf;

iii) UV-Absorption: weist ein Absorptionsmaximum bei 280 nm und ein Absorptionsminimum bei 250 nm auf;

iv) Aminosäuresequenz der 21 Reste am N-Terminus:

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der menschliche Granulocyten koloniestimulierende Faktor ein Polypeptid oder Glycoprotein mit einer Aktivität des menschliche Granulocyten koloniestimulierenden Faktors ist, das von einem Transformanten produziert wird, der einen rekombinanten Vektor mit einem Gen enthält, das ein Polypeptid mit einer Aktivität des menschliche Granulocyten koloniestimulierenden Faktors codiert.

7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Polypeptid mit einer Aktivität des menschliche Granulocyten koloniestimulierenden Faktors die gesamte oder einen Teil der nachstehenden Aminosäuresequenz aufweist:

mit der Maßgabe, daß m 0 oder 1 und n 0 oder 1 ist.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Protein mit einer Aktivität des menschliche Granulocyten koloniestimulierenden Faktors ein Glycoprotein ist, das ein Polypeptid enthält, das durch die gesamte oder einen Teil der nachstehend gezeigten Aminosäuresequenz und einen Zuckeranteil charakterisiert ist:

mit der Maßgabe, daß m 0 oder 1 und n 0 oder 1 ist.