AT500019B1

AT500019B1 - Verwendung in vitro des transkriptionsfaktors nak-1 oder von nak-1 regulierten genen zur diagnose von entzündlichen und malignen erkrankungen

Info

Publication number: AT500019B1
Application number: AT0100401A
Authority: AT
Original assignee: Inst Gefaessbiologie Und Throm
Priority date: 2001-06-27
Filing date: 2001-06-27
Publication date: 2007-06-15
Also published as: WO2003003017A3; EP1407275A2; AT500019A1; WO2003003017A2; AU2002322140A1; US20040152102A1

Description

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Die Erfindung betrifft die Verwendung in vitro des Transkriptionsfaktors NAK-1 oder von NAK-1 regulierten Genen zur Diagnose von entzündlichen und malignen Erkrankungen.

Philips, A. et al., Molecular and Cellular Biology, Oktober 1997, Bd. 17, nr. 10, S. 5952-5959 5 zeigt eine Interaktion von NAK-1 mit dem Immunsystem. Die WO 01/87923 A1 zeigt, dass NAK-1 durch CRH lokal induziert wird und dass die NAK-1 Expression durch Glucocorticoide gehemmt wird, wobei Antagonisten zur Hemmung der NAK-1 transkriptioneilen Aktivität genannt werden. io Rikers, Anke, Diss. an der Math.-Naturw. Fakultät 1 d. Humboldt-Universität, Berlin, 27.10.1998, zeigt lediglich, dass bei anti-lgM induzierter Apoptose NAK-1 hochreguliert wird. Die WO 98/26063 A1 beschreibt die Verwendung von NBRE sides zur Hemmung der NAK-1 transkriptionellen Aktivität analog der vorgenannten WO 01/87923 A1. Die WO 99/41364 A2 offenbart schließlich eine Methode zum Auffinden von Genen, z.B. NAK-1, die bei der be-15 schleunigten Wundheilung eine Rolle spielen können.

Beim Entzündungsgeschehen im menschlichen oder tierischen Organismus spielen Transkriptionsfaktoren eine entscheidende Rolle. Diese Proteine, die an DNA binden können und damit die Regulation ihrer Zielgene beeinflussen, leiten Informationen über den inneren Zustand der 20 Zelle sowie über die Umgebung der Zelle bzw. Faktoren die an die Zelle binden an die Gene weiter, die dadurch auf diese Zustände bzw. Zustandsänderungen reagieren können.

Ein Transkriptionsfaktor, der bei Entzündungsgeschehen zentrale Funktionen übernimmt, ist NFkB - ein Protein, das bei Aktivierung der Zelle durch Mediatoren der Entzündung wie IL-1, 25 TNF oder LPS in den Zellkern transportiert wird und „Zielgene“ einschalten kann. Diese Gene enthalten in ihrer Kontrollregion Bindungsstellen für NFkB; durch den Kontakt des Proteins mit diesen Bindungsstellen wird signalisiert, dass diese Zielgene in erhöhtem Maße produziert werden sollen, was die Antwort der Zelle auf den Entzündungsstimulus darstellt. 30 Nun können nicht alle Antworten der Zelle auf Entzündungsstimuli durch den Transkriptionsfaktor NFkB erklärt werden, da einige Gene auch hochreguliert werden, obwohl sie nicht über eine NFkB Bindungsstelle verfügen. In diesen Fällen kann die Hochregulation des Gens dadurch erklärt werden, dass entweder andere Transkriptionsfaktoren direkt auf den Entzündungsstimulus reagieren und dann an diese Gene binden, oder dass als sekundäre Antwort von NFkB ein 35 weiterer Transkriptionsfaktor induziert wurde, welcher nun seinerseits „sekundäre Zielgene“ hochreguliert. Diese Prozesse können auch gleichzeitig in der Regulation von bestimmten Genen auftreten. Die Gruppe der Gene, welche indirekt über sekundäre durch NFkB induzierte Transkriptionsfaktoren angeschaltet werden, stellen möglicherweise eine wichtige Untergruppe von Genen dar, die erst verzögert angeschalten werden und möglicherweise modulierend auf 40 das Entzündungsgeschehen wirken.

Ein wichtiges bei Entzündungsprozessen wie auch der Atherosklerose angeschaltenes Gen ist der Plasminogenaktivator Inhibitor 1, PAI-1. 45 Das PAI-1 Protein ist ein Schlüsselfaktor für die Kontrolle der Fibrinablagerungen in und um Blutgefäße(n). Außerdem reguliert es die Bildung und den Abbau der extrazellulären Matrix, ist also in plastische Modifikationen von Geweben im Bereich der Blutgefäße involviert. PAI-1 spielt auch bei Tumorprozessen eine Rolle, da PAI-1 mit der Malignität von Tumoren korreliert und mit der Bildung von Metastasen assoziiert ist. 50

Mehrere Forschungsgruppen haben an Patientenmaterial und auch bei Versuchen mit Zellen in Kultur gezeigt, dass PAI-1 in atherosklerotischen Gefäßen hochreguliert ist, und durch Entzündungsmediatoren wie TNFa und IL-1 stimuliert werden kann. Es gibt keine komplette NFkB Bindungsstelle in der Regulationsregion von PAI-1, also muss einer der oben genannten Älteres nativmechanismen aktiviert sein, um den PAI-1 bei Entzündungsprozessen hoch zu regulieren. 3 AT 500 019 B1

Die Erfindung stellt sich nun zur Aufgabe, ein neues diagnostisches und therapeutisches Target auf Basis von NAK-1 zu finden.

In dieser Richtung besteht die Erfindung in der Verwendung in vitro von NAK-1 antisense RNA 5 oder antisense Oligonukleotiden bzw. anderen NAK-1 spezifischen Sonden, bzw. Antikörpern gegen NAK-1 zum Nachweis von NAK-1 mRNA bzw. NAK-1 Protein in Geweben bzw. Einzelzellen zur Diagnose einer Entzündungsreaktion, vorzugsweise einer vaskulären Entzündung, insbesondere einer Atherosklerose. io Die Erfindung umfasst ferner die Verwendung in vitro von antisense RNA oder antisense Oligonukleotiden bzw. anderen spezifischen Sonden, bzw. Antikörpern gegen Gene, die durch NAK-1 reguliert werden, bzw. die respektiven Genprodukte (Proteine) in Geweben bzw. Einzelzellen oder Körperflüssigkeiten zur Diagnose einer Entzündungsreaktion, vorzugsweise einer vaskulären Entzündung, insbesondere einer Atherosklerose. 15

Weitere Lösungen der erfindungsgemäßen Aufgabe besteht darin, NAK-1 zur Behandlung einer Entzündung zu verwenden (als Plasmid DNA, verpackt in ein Adeno- oder Retrovirales Gentransfervehikel, als Protein mit einem transduziernenden Peptid oder einem anderen Vehikel) oder NAK-1 zur Behandlung einer vaskulären Entzündung, insbesondere einer Atherosklerose 20 zu verwenden (als Plasmid DNA, verpackt in ein Adeno- oder Retrovirales Gentransfervehikel, als Protein mit einem transduziernenden Peptid).

Um den Mechanismus der Stimulation von PAI-1 durch Entzündungsmediatoren aufzuklären, wurde ein „genetischer screen“ durchgeführt, der Proteine identifizieren sollte, die mit gewissen 25 Abschnitten der PAI-1 Regulationsregion interagieren. Als „Köder“ wurde die Region -250 bis -270 vom Transkriptionsstart eingesetzt, da in Reportergenanalysen gezeigt werden konnte, dass dort Regulationselemente für PAI-1 bei der Entzündungsreaktion vorhanden sein könnten.

Unerwarteter Weise konnten wir den Transkriptionsfaktor NAK1 in zwei unabhängigen Klonen 30 als Interaktionspartner dieser DNA-Region identifizieren. NAK1 (NR4A1) ist das erste Mitglied der „Nuclear Receptor Subfamily 4 / GroupA“; die homologen Gene in Maus und Ratte werden Nur77 bzw. NGFI-B genannt. Erstmals identifiziert wurde es als N10 von Ryseck, et al. 1989, die es auf das humane Chromosom 12 (12q13) lokalisierten. Chang, et al. klonierten es im selben Jahr als weiteres Mitglied der „Steroid Receptor Superfamily“ unter dem Namen TR3. 35 Nakai et al. demonstrierten 1990, dass NAK1 durch Serum und einige Mitogene induzierbar ist und damit in die Familie der „Immediate Early Response Genes“ gereiht werden kann.

Um nachzuweisen, ob NAK-1 auch durch Entzündungsmediatoren induziert werden kann wurden Endothelzellen mit TNFa aktiviert und NAK-1 mittels Relative Quantitative PCR nachgewie-40 sen. Fig. 1 zeigt, dass NAK-1 durch TNFa in Endothelzellen induzierbar ist.

Um nachzuweisen, dass NAK-1 seinerseits von NFkB abhängig ist, wurden Endothelzellen durch Entzündungsmediatoren stimuliert und gleichzeitig die NFkB Aktivierung durch Transfek-tion mit einem Adenovirus der für eine dominat negative Form der NFkB induzierenden Kinase 45 IKK-2 codiert gehemmt. Fig. 2 zeigt, dass NAK-1 mRNA seinerseits nur dann hochreguliert wird, wenn bei Entzündungsstimulation der Zellen die NFkB Signaltranduktionskaskade intakt ist. Der Entzündungsstimulus LPS stimuliert die Expression von NAK1 in untransfizierten Endothelzellen und Kontrollvirus infizierten Endothelzellen, jedoch nicht von solchen, die mit dominant negativem IKK2 transfiziert sind und somit keine NFkB Signaltransduktion besitzen. 50

Um die zeitliche Abfolge einer NAK-1 induzierten Regulation von PAI-1 bei der Entzündungsreaktion nachzuweisen, wurden Endothelzellen mit TNFa durch verschiedene Zeiten stimuliert und NAK-1 sowie PAI-1 mittels quantitativer PCR gemessen. Abb. 3 zeigt eine solche Kinetik. Das zeitliche Hintereinander der Induktion von zunächst NAK-1 und PAI-1 weisen auf eine 55 solche Reihenfolge der Ereignisse hin. NAK-1 mRNA erreicht bereits nach einer Stunde TNFa-

Claims

4 AT 500 019 B1 Stimulierung ein Maximum, während PAI-1 erst nach 2 bis 3 Stunden maximal exprimiert wird. Um den Nachweis zu erbringen, dass tatsächlich bei der Entzündungsreaktion auch NAK-1 sich vermehrt an den PAI-1 Promoter bindet, wurden sogenannte electrophoretic mobility shift expe-5 rimente (EMSA) durchgeführt. In Abb. 4a kann gezeigt werden, dass ein dsOligonucleotid, welches sich über die im Screen verwendete Region erstreckt, in EMSA eine spezifische Bande produziert. Diese Bande kann durch Mutation der Konsensusbindungsstelle verhindert werden. Diese Bande kann durch Mutation einer Adenin Base 5' der Konsensus-Bindungsstelle verhindert werden, die für die Bindung von NAK-1 als Monomer wichtig zu sein scheint. In dieser io Abbildung sieht man, dass ein nukleares Protein spezifisch an die betreffende DNA-Region bindet, und dass die Mutation der Konsensusbindungsstelle für NAK1 durch eine Punktmutation diese Bindung verhindert. Ein identes Ergebnis kann auch in der Modellzelllinie HepG2 beobachtet werden (Abb. 4b). 15 Um den Nachweis zu erbringen, dass NAK-1 auch beim Entzündlichen Geschehen beim Menschen in vivo hochreguliert wird, wurden normale und atherosklerotische Gefäße mit einem Antikörper gegen NAK-1 gefärbt. Es zeigt sich, dass in dem atherosklerotischen Gefäß NAK-1 hoch exprimiert ist, während das Signal im normalen Gefäß zu fehlen scheint (Fig. 5). Fig. 5 zeigt links ein normales Gewebe, in dem wenig NAK-1 Antigen detektiert wird. In Fig. 5 ist 20 rechts ein atherosklerotisches Gewebe gezeigt, wobei die Zellen, die NAK-1 Antigen exprimie-ren, dunkel gefärbt sind. Aus diesen Daten zeigt sich, dass NAK-1 einer der NFkB abhängigen Transkriptionsfaktoren ist, die sekundär wiederum abhängige Gene wie z. B. PAI-1 bei der Entzündungsreaktion anschal-25 ten können. Durch Bestimmung von NAK-1 oder spezifischer NAK-1 abhängiger Gene kann man daher erwarten, Entzündungsreaktionen nachweisen zu können. Ebenso kann man erwarten, solche Entzündungsreaktionen durch Beeinflussung der NAK-1 induzierten Transkription modulieren zu können. 30 Patentansprüche: 1. Verwendung in vitro von NAK-1 antisense RNA oder antisense Oligonukleotiden bzw. anderen NAK-1 spezifischen Sonden, bzw. Antikörpern gegen NAK-1 zum Nachweis von 35 NAK-1 mRNA bzw. NAK-1 Protein in Geweben bzw. Einzelzellen zur Diagnose einer Ent zündungsreaktion.
2. Verwendung in vitro von antisense RNA oder antisense Oligonukleotiden bzw. anderen spezifischen Sonden, bzw. Antikörpern gegen Gene, die durch NAK-1 reguliert werden, 40 bzw. die respektiven Genprodukte (Proteine) in Geweben bzw. Einzelzellen oder Körper flüssigkeiten zur Diagnose einer Entzündungsreaktion.
3. Verwendung in vitro von NAK-1 antisense RNA oder antisense Oligonukleotiden bzw. anderen NAK-1 spezifischen Sonden, bzw. Antikörpern gegen NAK-1 zum Nachweis von 45 NAK-1 mRNA bzw. NAK-1 Protein in Geweben bzw. Einzelzellen zur Diagnose einer vaskulären Entzündung, insbesondere einer Atherosklerose.
4. Verwendung in vitro von antisense RNA oder antisense Oligonukleotiden bzw. anderen spezifischen Sonden, bzw. Antikörpern gegen Gene, die durch NAK-1 reguliert werden, so bzw. die respektiven Genprodukte (Proteine) in Geweben bzw. Einzelzellen oder Körper flüssigkeiten zur Diagnose einer vaskulären Entzündung insbesondere einer Atherosklerose.
5. NAK-1 zur Behandlung einer Entzündung. 55 5 AT 500 019 B1
6. NAK-1 zur Behandlung einer vaskulären Entzündung insbesondere einer Atherosklerose. Hiezu 6 Blatt Zeichnungen 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55