AT500019A1 - Verwendung des transkriptionsfaktors nak-1 oder von nak-1 regulierten genen zur diagnose und/oder therapie von entzündlichen und malignen erkrankungen - Google Patents

Description

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Verwendung des Transkriptionsfaktors NAK-1 oder von NAK-1 regulierten Genen zur Diagnose und/odef Therapie von entzündlichen und malignen Erkrankungen • · 0 0 • 0 • · • · t *

Stand des Wissens: :* . · 0 t <0 • 4 0 0 0 0 • 0· 0 0 0

Beim Entzündungsgeschehen im menschlichen oder tierischen Organismus spielen Transkriptj-'·.·. • 0 · onsfaktoren eine entscheidende Rolle. Diese Proteine, die an DNA binden können und damit die l 7 ·· 0 • # ♦

Regulation ihrer Zielgene beeinflussen, leiten Informationen über den inneren Zustand der Zelle • · sowie über die Umgebung der Zelle bzw. Faktoren die an die Zelle binden an die Gene weites·, die dadurch auf diese Zustände bzw. Zustandsänderungen reagieren können.

Ein Transkriptionsfaktor, der bei Entzündungsgeschehen zentrale Funktionen übernimmt, ist NFkB - ein Protein, das bei Aktivierung der Zelle durch Mediatoren der Entzündung wie IL-1, TNF oder LPS in den Zellkern transportiert wird und „Zielgene“ einschalten kann. Diese Gene enthalten in ihrer Kontrollregion Bindungsstellen für NFkB; durch den Kontakt des Proteins mit diesen Bindungsstellen wird signalisiert, daß diese Zielgene in erhöhtem Maße produziert werden sollen, was die Antwort der Zelle auf den Entzündungsstimulus darstellt.

Nun können nicht alle Antworten der Zelle auf Entzündungsstimuli durch den Transkriptionsfaktor NFkB erklärt werden, da einige Gene auch hochreguliert werden, obwohl sie nicht über eine NFkB Bindungsstelle verfugen. In diesen Fällen kann die Hochregulation des Gens dadurch erklärt werden, daß entweder andere Transkriptionsfaktoren direkt auf den Entzündungsstimulus reagieren und dann an diese Gene binden, oder daß als sekundäre Antwort von NFkB ein weiterer Transkriptionsfaktor induziert wurde, welcher nun seinerseits „sekundäre Zielgene“ hochreguliert. Diese Prozesse können auch gleichzeitig in der Regulation von bestimmten Genen auftreten.

Die Gruppe der Gene, welche indirekt über sekundäre durch NFkB induzierte Transkriptionsfaktoren angeschaltet werden, stellen möglicherweise eine wichtige Untergruppe von Genen dar, die erst verzögert angeschalten werden und möglicherweise modulierend auf das Entzündungsgeschehen wirken. • · · · «····· · « ······· · • · · · · · · ······· #· 2

Ein wichtiges bei Entzündungsprozessen wie auch der Atherosklerose angeschaltenes Gen ist der Plasminögenaktivator Inhibitor 1, PAI-1. ♦ · ♦ ♦

Das PAI-1 Protein ist ein Schlüsselfaktor für die Kontrolle der Fibrinablagerungen in und utn : • · · ·

Blutgefäße(n). Außerdem reguliert es die Bildung und den Abbau der extrazellulären Matrix, ist . · • · · ♦ also in plastische Modifikationen von Geweben im Bereich der Blutgefäße involviert. PAKl : j • · · spielt auch bei Tumorprozessen eine Rolle, da PAI-1 mit der Malignität von Tumoren korreliert v. • ♦ · und mit der Bildung von Metastasen assoziiert ist. ;/ ·

Mehrere Forschungsgruppen haben an Patientenmaterial und auch bei Versuchen mit Zellen ln Kultur gezeigt, daß PAI-1 in atherosklerotischen Gefäßen hochreguliert ist, und durch Entzündungsmediatoren wie TNFa und EL-1 stimuliert werden kann. Es gibt keine komplette NFkB Bindungsstelle in der Regulationsregion von PAI-1, also muß einer der oben genannten Altema-tivmechanismen aktiviert sein um den PAI-1 bei Entzündungsprozessen hoch zu regulieren.

Auffindung des Transkriptionsfaktors NAK-1 als Entzündungsmediator

Um den Mechanismus der Stimulation von PAI-1 durch Entzündungsmediatoren aufzuklären, wurde ein „genetischer screen“ durchgeführt, der Proteine identifizieren sollte, die mit gewissen Abschnitten der PAI-1 Regulationsregion interagieren. Als „Köder“ wurde die Region -250 bis -270 vom Transkriptionsstart eingesetzt, da in Reportergenanalysen gezeigt werden konnte, daß dort Regulationselemente für PAI-1 bei der Entzündungsreaktion vorhanden sein könnten. Unerwarteter Weise konnten wir den Transkriptionsfaktor NAK1 in zwei unabhängigen Klonen als Interaktionspartner dieser DNA-Region identifizieren. NAK1 (NR4A1) ist das erste Mitglied der „Nuclear Receptor Subfamily 4 / GroupA“; die homologen Gene in Maus und Ratte werden Nur77 bzw. NGFI-B genannt. Erstmals identifiziert wurde es als N10 von Ryseck, et al. 1989, die es auf das humane Chromosom 12 (12ql3) lokalisierten. Chang, et al. klonierten es im selben Jahr als weiteres Mitglied der „Steroid Receptor Superfamily“ unter dem Namen TR3. Nakai et al demonstrierten 1990, daß NAK1 durch Serum und einige Mitogene induzierbar ist und damit in die Familie der „Immediate Early Response Genes“ gereiht werden kann. 3

Um nachzuweisen, ob NAK-1 auch durch Entzündungsmediatoren induziert werden kann wurden Endothelzellen mit TNFa aktiviert und NAK-1 mittels Relative Quantitative PCR nachgewiesen.

Fig. 1 zeigt, daß NAK-1 durch TNFa in Endothelzellen induzierbar ist. • · • · • * · · • *

Um nachzuweisen, daß NAK-1 seinerseits von NFkB abhängig ist, wurden Endothelzellen durdh ^. ί

Entzündungsmediatoren stimuliert und gleichzeitig die NFkB Aktivierung durch Transfektidn : : • * · mit einem Adenovirus der für eine dominat negative Form der NFkB induzierenden Kinase IKK- : : • · · 2 codiert gehemmt. Fig.2 zeigt, daß NAK-1 mRNA seinerseits nur dann hochreguliert wirft. ‘j • ·« wenn bei Entzündungsstimulation der Zellen die NFkB Signaltranduktionskaskade intakt ist. Der^.^ Entzündungsstimulus LPS stimuliert die Expression von NAK1 in untransfizierten Endothelzellen und Kontrollvirus infizierten Endothelzellen, jedoch nicht von solchen, die mit dominant negativem IKK2 transfiziert sind und somit keine NFkB Signaltransduktion besitzen.

Um die zeitliche Abfolge einer NAK-1 induzierten Regulation von PAI-1 bei der Entzündungsreaktion nachzuweisen, wurden Endothelzellen mit TNFa durch verschiedene Zeiten stimuliert und NAK-1 sowie PAI-1 mittels quantitativer PCR gemessen. Abb. 3 zeigt eine solche Kinetik. Das zeitliche Hintereinander der Induktion von zunächst NAK-1 und PAI-1 weisen auf eine solche Reihenfolge der Ereignisse hin. NAK-1 mRNA erreicht bereits nach einer Stunde TNFa-Stimu-lierung ein Maximum, während PAI-1 erst nach 2 bis 3 Stunden maximal exprimiert wird.

Um den Nachweis zu erbringen, daß tatsächlich bei der Entzündungsreaktion auch NAK-1 sich vermehrt an den PAI-1 Promoter bindet, wurden sogenannte electrophoretic mobility shift expe-rimente (EMSA) durchgeführt. In Abb. 4a kann gezeigt werden, daß ein dsOligonucleotid, welches sich über die im Screen verwendete Region erstreckt, in EMSA eine spezifische Bande produziert. Diese Bande kann durch Mutation der Konsensusbindungsstelle verhindert werden. Diese Bande kann durch Mutation einer Adenin Base 5’ der Konsensus-bindungsstelle verhindert werden, die für die Bindung von NAK-1 als monomer wichtig zu sein scheint. In dieser Abbildung sieht man, daß ein nukleäres Protein spezifisch an die betreffende DNA-Region bindet, und daß die Mutation der Konsensusbindungsstelle für NAK1 durch eine Punktmutation diese Bindung verhindert. Ein identes Ergebnis kann auch in der Modellzellinie HepG2 beobachtet werden (Abb. 4b) * * · Μ • · · · • · · · • · · · · • · M« · · 4

Um den Nachweis zu erbringen, daß NAK-1 auch beim Entzündlichen Geschehen beim Menschen in vivo hochreguliert wird, wurde Normale und atherosklerotische Gefäße mit einem Antikörper gegen NAK-1 gefärbt. Es zeigt sich daß in dem atherosklerotischen Gefäß NAK-1 hiocjf **’; • * * * exprimiert ist, während das Signal im normalen Gefäß zu fehlen scheint (Fig. 5). : ® ♦ · · • · « ·

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Fig. 5 zeigt links ein normales Gewebe, wenig NAK-1 Antigen detektiert. In Fig. 5 ist rechts ein!! .* • · · atherosklerotisches Gewebe gezeigt, wobei die Zellen, die NAK-1 Antigen exprimieren, sin{f ‘ * ·♦ * dunkel gefärbt sind. * *··*

Aus diesen Daten zeigt sich, daß NAK-1 einer der NFkB abhängigen Transkriptionsfaktoren ist, die sekundär wiederum abhängige Gene wie z. B. PAI-1 bei der Entzündungsreaktion anschalten können. Durch Bestimmung von NAK-1 oder spezifischer Nak-1 abhängiger Gene kann man daher erwarten Entzündungsreaktionen nachweisen zu können. Ebenso kann man erwarten solche Entzünungsreaktionen durch Beeinflussung der NAK-1 induzierten Transkritpion modulieren zu können.

Claims (6)

1. • · · ·« • V t I • « » · · • · · · ♦ · · 5 Patentansprüche: Entzündung?- 1. Verwendung von NAK-1 oder NAK-1 abhängiger Gene zum Nachweis einer reaktion.
2. 2. Verwendung von NAK-1 oder NAK-1 abhängiger Gene zum Nachweis einer Atherosklerose.
3. 3. Verwendung von NAK-1 oder NAK-1 abhängiger Gene zur Behandlung einer Entzündungsreaktion.
4. 4. Verwendung von NAK-1 oder NAK-1 abhängiger Gene zur Behandlung einer Atherosklerose.
5. 5. Verwendung von NAK-1 oder NAK-1 abhängiger Gene zum Nachweis einer Tumorerkrankung.
6. 6. Verwendung von NAK-1 oder NAK-1 abhängiger Gene zur Behandlung einer Tumorerkrankung