DE69434135T2

DE69434135T2 - Rekombinante DNase B stammend von Streptococcus Pyogenes

Info

Publication number: DE69434135T2
Application number: DE69434135T
Authority: DE
Inventors: Craig W. Adams; Patty P.Y. Pang; Marina C. Belei
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1994-08-18
Filing date: 1994-08-18
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2014-08-19
Also published as: JP3742896B2; EP0726957A1; DE69434135D1; WO1996006174A1; ATE282701T1; JPH09504962A; EP0726957B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Diese Erfindung ist auf rekombinante DNase B, die von dem pathogenen Bakterium Streptococcus pyogenes stammt, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verfahren zu ihrer Verwendung gerichtet.
Trotz Fortschritten in der Vermeidung und Behandlung von bakteriellen Infektionen bleiben eine Reihe von bakteriellen Pathogenen ernsthafte Probleme in der medizinischen Praxis und fahren fort schwere, sogar tödliche Erkrankungen zu verursachen. Eines dieser Pathogene ist S. pyogenes. Unter den Erkrankungen, die durch S. pyogenes verursacht werden, sind Streptococcenpharyngitis ("Strephals"), Scharlachfieber und deren eitrige Komplikationen, einschließlich zervikale Lymphknotenentzündung, Mittelohrentzündung, Warzenfortsatzentzündung, Peritonsillarabszesse, Hirnhautentzündung, Pneumonitis, Lungenentzündung, Puerperalsepsis, Zellgewebsentzündung der Haut, Impetigo, Lymphgefäßentzündung, Wundrose, akute Glomerulonephritis, und rheumatisches Fieber.
Solche Infektionen treten oft in Krankenhäusern auf (Nosocomialinfektion), insbesondere bei Patienten, deren normale Immunsystemfunktion unterdrückt ist. Die letztere Kategorie schließt Patienten mit AIDS, Patienten, die immunsuppressive Arzneimittel für Krebs einnehmen oder um eine Transplantatabstoßung zu verhindern, und Patienten, die eine schlechte Zirkulation aufweisen, z. B. Patienten mit Diabetes, ein.
Weil diese Erkrankungen eine schnelle und wirksame Behandlung erfordern, um die eitrigen Wunden auszuheilen und um Spätschäden zu verhindern, die durch immunologische Reaktionen auf weiterbestehende eitrige Wunden verursacht werden, ist eine schnelle Diagnose des Vorhandenseins von S. pyogenes in sol chen Patienten notwendig, in denen eine Infektion vermutet wird. Das Versäumen S. pyogenes schnell zu diagnostizieren, kann die Behandlung stark verkomplizieren oder sogar unmöglich machen.
Obwohl Nachweisverfahren für S. pyogenes gegenwärtig erhältlich sind, weisen diese Verfahren Schwächen auf, insbesondere bei klinischen Anwendungen.
Unter den Nachweisverfahren für S. pyogenes ist der Nachweis für das Vorhandensein von Antikörpern gegen DNase B, ein DNA-abbauendes Enzym, das durch S. pyogenes produziert wird. Dieses Enzym, das von S. pyogenes während einer Infektion abgesondert wird, löst die Entwicklung von substanziellen Antikörpertitern in Patienten aus, die dann akutes rheumatisches Fieber und akute Glomerulonephritis entwickeln.
Obwohl andere Serum-basierte, diagnostische Tests für diese rheumatischen Fieber und Glomerulonephritis erhältlich sind, einschließlich des Nachweises von Antikörpern gegen Streptolysin O und gegen Hyaluronidase, bieten Tests für Anti-DNase B-Antikörper bestimmte Vorteile, weil DNase B in nahezu allen Stämmen der betahämolytischen Streptokokken der Gruppe A gefunden wird und weil hohe DNase B-Titer in Patienten mit Infektionen der Haut und Kehlkopfes gefunden werden.
Obwohl es eine Reihe von kommerziell erhältlichen Tests für den Assay auf Anti-DNase B-Antikörper gibt, weisen diese Tests Schwächen auf. Wie oben angedeutet, wird ein verbesserter Test dringend benötigt.
Die kommerziell erhältlichen Tests fallen in drei Kategorien: (1) ein DNase B inhibitionsbasierter Assay unter Verwendung der Fähigkeit des Antikörpers enzymatische Aktivität zu inhibieren; (2) ein Latexagglutinations-Assay für Antikörper gegen eine Vielzahl von S. pyogenes Antigenen; und (3) ein trübungsmessender Inhibitionsassay. ELISA-Assay sind ebenfalls im Forschungslabor verwendet worden, aber wie unten näher beschrieben, haben sie sich bis jetzt nicht als für routinemäßige klinische Anwendung geeignet erwiesen.
Der DNase B-Inhibitionsassay ist sehr langsam und erfordert typischerweise 4–8 Stunden zur Ausführung. In Situationen, in denen eine Bestätigung von Anti-DNase B-Antikörpern schnell erforderlich ist, um so die Behandlung sobald wie möglich beginnen zu können, sollte somit die Anwesenheit von S. pyogenes bestätigt werden, ist der Enzym-Inhibitionsassay nicht besonders nützlich.
Der Latexagglutinations-Assay ist ausgestaltet, um Antikörper gegen fünf S. pyogenes Antigene nachzuweisen. Testergebnisse deuten jedoch eine schlechte Übereinstimmung zwischen den Latexagglutinations-Assay und einem spezifischen Anti-DNase B Test an. In einer Studie, G. C. Klein & W. L. Jones, "Comparison of the Streptozyme Test with the Antistreptolysin O, Antidesoxyribonuclease B, and Antihyaluronidase Tests," App. Microbiol. 21: 257–259 (1971), waren 12 von 80 Patienten, die negativ im Latexagglutinations-Assay getestet wurden, tatsächlich positiv für Anti-DNase B-Antikörper. Diese hohe Rate von falsch-negativen Ergebnissen bedeutet, dass der Test für eine klinische Anwendung nicht wünschenswert ist.
Der trübungsmessende Inhibitionsassay hängt von der Inhibition der Agglutination von Latexpartikeln, die mit Anti-DNase B-Antikörper beschichtet sind, durch eine begrenzende Menge einer rohen Präparation von DNase B ab, in der Anwesenheit von Serum, das einen Anti-DNase B-Antikörper enthält, der mit dem Antikörper auf den Latexpartikeln konkurriert. Dieser Assay, der im US Patent Nr. 5,055,395 beschrieben ist, das hier durch Bezugnahme eingeschlossen wird, ist relativ unempfindlich. Daher ist er nicht zur Verwendung in den frühen Stadien einer S. pyogenes Infektion geeignet, und dies ist exakt der Zeitraum, wenn ein akkurater Nachweis des Anti-DNase B-Antikörpers am wichtigsten ist. Zusätzlich sind die Reagenzien, die in dem trübungsmessenden Inhibitionstest verwendet werden, schwierig herzustellen.
Über ELISA-basierte Assays für Anti-DNase B-Antikörper wurde in M. A. Gerber et al., "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay of Antibodies in Human Sera to Streptococcal DNase B", J. Lab. Clin. Med. 95: 258–265 (1980) berichtet. Obwohl sich diese Assays als wirksame Forschungsmittel erwiesen haben, war ihre maßstabsgerechte Vergrößerung für kommerzielle Verwendung, insbesondere in der klinischen Praxis, nicht durchführbar. Dies ist der Fall, weil eine solche maßstabsgerechte Vergrößerung die Herstellung und Aufreinigung des DNase B-Enzyms von Strepfococcus pyogenes erfordern würde, das wie oben beschrieben, ein ernsthaftes Pathogen ist. Es würden nicht nur extrem kostspielige Eindämmungsverfahren zum Züchten dieses pathogenen Bakteriums in der Menge, die erforderlichen ist, um ausreichend Enzym für die Kommerzialisierung des ELISA-Assays herzustellen benötigt werden; das Medium, das für das Züchten von S. pyogenes erforderlich ist, ist sehr komplex und teuer. Diese Bedenken haben die Entwicklung einer kommerziellen Version des ELISA-Tests für Anti-DNase B-Antikörper ernsthaft behindert.
Es gibt daher einen Bedarf für einen verbesserten, schnellen und spezifischen Assay für Anti-DNase B-Antikörper. Vorzugsweise wäre ein solcher Assay durch einen Arzt in seinem Büro verwendbar und würde eine minimale Ausrüstung erfordern. Dies ist der Fall, weil Patienten mit Erkrankungen wie Strephals oder Scharlachfieber typischerweise ihren Hausart vor der Einweisung ins Krankenhaus besuchen, und eine akkurate Diagnose einer S. pyogenes Infektion zu diesem Zeitpunkt wäre einer nachfolgenden Diagnose, die nur gemacht wird, wenn der Patient ins Krankenhaus eingewiesen wurde, vorzuziehen.
Die Entwicklung eines solchen verbesserten Assay ist von der Verfügbarkeit von großen Mengen des DNase B-Enzyms selbst abhängig. Daher gibt es auch einen Bedarf für ein Verfahren zur Herstellung von S. pyogenes DNase B-Enzym, unter Verwendung eines Verfahrens, das maßstabsgerecht vergrößert werden kann, um kommerzielle Mengen des Enzyms herzustellen ohne komplexe, unhandliche und teure Eindämmungsmaßnahmen zu erfordern.
ZUSAMMENFASSUNG
Wir haben das Gen für S. pyogenes DNase B in Escherichia coli kloniert und exprimiert, was eine bequeme und wirksame Herstellung des DNase B-Enzyms ermöglicht, ohne das Züchten von S. pyogenes zu erfordern.
Dieses Klonierungsverfahren ergibt ein genetisches Konstrukt der DNA-Sequenz von Streptococcus pyogenes DNase B, die ein Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz von 4 aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das Arginin (R) am Aminosäureterminus des Proteins deletiert ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind Expressionsvektoren für Streptococcus pyogenes DNase B-Enzym, umfassend die DNA-Sequenz, die oben beschrieben wurde, funktionell verknüpft mit mindestens einer Kontrollsequenz, die mit einer geeigneten bakteriellen Wirtszelle kompatibel ist. Vorzugsweise ist der Expressionsvektor ein Plasmidvektor. Typischerweise ist die DNA, die das Streptococcus pyogenes DNase B-Enzym kodiert, mit mindestens einer Sequenz des Bakteriophagen λ verknüpft.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine bakterielle Wirtszelle, transformiert, transfiziert oder infiziert mit einem Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Weise, die es ermöglicht, dass die transformierte bakterielle Wirtszelle, die Streptococcus pyogenes DNase B, kodiert durch die innerhalb des Expressionsvektors eingebaute DNA, in einer nachweisbaren Menge exprimiert. Die exprimierte S. pyogenes DNase B kann durch die intakte Zelle, die das Enzym herstellt, entweder ausgeschieden oder nicht ausgeschieden werden, und kann in einer löslichen oder einer nicht löslichen Form vorliegen.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen von im Wesentlichen gereinigtem Streptococcus pyogenes DNase B-Enzym, das umfasst:

(1) Züchten der bakteriellen Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert wurde;
(2) Verwenden der gezüchteten bakteriellen Wirtszelle, um das DNase B-Enzym zu exprimieren; und
(3) Aufreinigen des Enzyms aus der gezüchteten bakteriellen Wirtszelle.

Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung ist die Transkriptionsfusion, umfassend die rekombinante Streptococcus pyogenes DNase B-DNA-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung, fusioniert mit einem anderen Gen, wobei die Fusion eine nachweisbare, von der Eigenschaft der Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung oder von der Eigenschaft des Proteins, kodiert durch die Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung, veränderte Eigenschaft aufweist, wobei die veränderte Eigenschaft aus der Gruppe bestehend aus (1) hochgradiger RNA-Expression; (2) hochgradiger Protein-Expression, (3) einem zweiten funktionellen Enzym, Rezeptor oder anderen aktiven Protein in der Fusion; (4) einer Fusion mit DNase B an einen Affinitätsliganden; (5) der Herstellung eines Proteins mit einem höheren Molekulargewicht und (6) einer erhöhten Immunreaktivität, ausgewählt ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Translationsfusion, umfassend das Protein, das von der Streptococcus pyogenes DNase B rekombinanten DNA-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert wird, fusioniert mit einem anderen Protein, wobei die Fusion eine nachweisbare, von der Eigenschaft des Proteins, das durch die DNA-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert wird, veränderte Eigenschaft aufweist, wobei die veränderte Eigenschaft ausgewählt ist aus (1) hochgradiger RNA-Expression; (2) hochgradiger Protein-Expression; (3) einem zweiten funktionellen Enzym, Rezeptor oder anderen aktiven Protein in der Fusion; (4) einer Fusion mit der DNase B an einem Affinitätsliganden; (5) der Herstellung eines Proteins mit einem höheren Molekulargewicht und (6) einer erhöhten Immunreaktivität, ausgewählt ist.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis und/oder Bestimmen des Anti-Streptococcus pyogenes DNase B-Antikörpers in einer Testprobe. Das Verfahren umfasst die Schritte von:

(1) Bereitstellen einer Testprobe, die unter Verdacht steht Anti-Streptococcus pyogenes DNase B-Antikörper zu enthalten;
(2) Hinzufügen einer Menge von Strepfococcus pyogenes DNase B-Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung, zur Testprobe, wobei die Menge ausreichend ist, um einen nachweisbaren Grad von enzymatischer Aktivität, in der Abwesenheit einer Inhibition der enzymatischen Aktivität durch Anti-DNase B-Antikörper in der Testprobe herzustellen; und
(3) Bestimmen eines Grades der Aktivität des DNase B-Enzyms in der Testprobe durch das Durchführen eines Enzym-Assays zum Nachweisen und/oder Bestimmen des Anti-Streptococcus pyogenes DNase B-Antikörpers in der Testprobe.

Ein alternatives Verfahren zum Nachweisen eines Anti-DNase B-Antikörpers umfasst die Schritte:

(1) Binden des Streptococcus pyogenes DNase B-Enzyms gemäß der vorliegenden Erfindung, an einen festen Träger, wie Latexpartikel;
(2) Reagieren einer Testprobe, die unter Verdacht steht, Anti-Streptococcus pyogenes DNase B-Antikörper zu enthalten, mit dem Streptococcus pyogenes DNase B-Enzym, das an den festen Träger gebunden ist, um den Antikörper an das Enzym und somit an den festen Träger zu binden; und
(3) Nachweisen des an den festen Träger gebundenen Antikörpers zum Nachweisen und/oder Bestimmen des Antikörpers in der Testprobe.

Dieser Ansatz kann für nephelometrische, trübungsmessende, Agglutinierungs-, oder ELISA-Verfahren zur Quantifizierung verwendet werden.
Ein alternatives Verfahren zum Nachweisen eines S. pyogenes DNase B-Antikörpers umfasst:
(1) das Herstellen einer gepufferten Lösung von DNase B; (2) das Reagieren der gepufferten DNase B-Lösung mit einer Testprobe, die unter Verdacht steht S. pyogenes DNase B-Antikörper zu enthalten; und (3) das Nachweisen einer Reaktion zwischen der DNase B und dem Anti-DNase B-Antikörper durch Beobachten und/oder Messen einer Veränderung der Lichtabsorption und/oder Lichtstreuung in der Lösung.
Ein anderes alternatives Verfahren zum Nachweisen eines Anti-DNase B-Antikörpers ist Kapillarelektrophorese.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Impfstoff zum Immunisieren eines Säugers gegen eine Infektion mit S. pyogenes, umfassend eine Menge von gereinigtem S. pyogenes DNase B-Enzym, die zum Stimulieren der Erzeugung von für S. pyogenes DNase B spezifischen Antikörpern ausreicht, wobei das gereinigte S. pyogenes DNase B-Enzym von der DNA-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Impfstoff zum Immunisieren eines Säugers gegen eine Infektion mit S. pyogenes, umfassend eine Menge von gereinigtem S. pyogenes DNase B-Enzym, die zum Stimulieren der Erzeugung von für S. pyogenes DNase B spezifischen Antikörpern ausreicht, wobei das gereinigte S. pyogenes DNase B-Enzym das ist, welches durch

(a) das Züchten einer bakteriellen Wirtszelle, die mit einem, die DNA-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung umfassenden Expressionsvektor für das S. pyogenes DNase B-Enzym transformiert ist, wobei die DNA-Sequenz mit mindestens einer, mit der bakteriellen Wirtszelle kompatiblen Kontrollsequenz derart funktionell verknüpft ist, dass es der transformierten bakteriellen Wirtszelle ermöglicht wird, Streptococcus pyogenes DNase B, welches durch die in den Expressionsvektor eingebaute DNA kodiert wird, in einer nachweisbaren Menge zu exprimieren,
(b) das Verwenden der gezüchteten bakteriellen Wirtszelle zur Expression des DNase B-Enzyms, und
(c) das Reinigen des Enzyms von der gezüchteten bakteriellen Wirtszelle

Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Impfstoff zum Immunisieren eines Säugers gegen eine Infektion mit S. pyogenes, umfassend eine Menge von gereinigter S. pyogenes DNase B, die zum Stimulieren der Erzeugung von für S. pyogenes DNase B spezifischen Antikörpern ausreicht, wobei das gereinigte S. pyogenes DNase B-Enzym das Protein ist, das unter Verwendung des genetischen Konstrukts gemäß der vorliegenden Erfindung in einem geeigneten Expressionsvektor erhältlich ist.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Arzneimittelverabreichung, umfassend ein enzymatisch aktives DNase B-Enzym und Mittel zur Generierung eines, ein enzymatisch aktives DNase B-Enzym enthaltendes, Aerosols zur Verwendung für das Behandeln einer zystischen Fibrose in einem Patienten mit zystischer Fibrose, umfassend die Zuführung des Aerosols in einer zur Reduktion der Lungenflüssigkeitsviskosität in dem Patienten ausreichenden Menge, wobei das gereinigte S. pyogenes DNase B-Enzym von der DNA-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert wird.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Arzneimittelverabreichung, umfassend ein enzymatisch aktives DNase B-Enzym und Mittel zur Generierung eines, ein enzymatisch aktives DNase B-Enzym enthaltendes, Aerosols zur Verwendung für das Behandeln einer zystischen Fibrose in einem Patienten mit zystischer Fibrose, umfassend die Zuführung des Aerosols in einer zur Reduktion der Lungenflüssigkeitsviskosität in dem Patienten ausreichenden Menge, wobei das gereinigte S. pyogenes DNase B-Enzym das ist, welches durch

(a) das Züchten einer bakteriellen Wirtszelle, die mit einem, die DNA-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung umfassenden, Expressionsvektor für das Streptococcus pyogenes DNase B-Enzym transformiert ist, wobei die DNA-Sequenz mit mindestens einer, mit der bakteriellen Wirtszelle kompatiblen, Kontrollsequenz derart funktionell verknüpft ist, dass es der transformierten bakteriellen Wirtszelle ermöglicht wird, die Streptococcus pyogenes DNase B, welche durch die rekombinante, in den Expressionsvektor eingebaute DNA kodiert wird, in einer nachweisbaren Menge zu exprimieren,
(b) das Verwenden der gezüchteten bakteriellen Wirtszelle zur Expression des DNase B-Enzyms, und
(c) das Reinigen des Enzyms von der gezüchteten bakteriellen Wirtszelle

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Diese und andere Eigenschaften, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden mit Bezugnahme auf die folgende Beschreibung, angehängten Ansprüche und die begleitenden Zeichnungen besser verstanden werden, wobei:
1 eine partielle Restriktionskarte der Region zeigt, welche die klonierte DNase B enthält, wobei die Region der chimären DNA im Klon und die Stelle für das Gen von DNase B angegeben wird;
2 die Stellen von Subklonen der klonierten DNA von 1 und eine Angabe der Nukleaseaktivität, die durch die Subklone erzeugt wird, zeigt;
3 die DNA-Sequenz des Klons, dessen partielle Restriktionskarte in 1 gezeigt wird, zeigt;
4 die Aminosäuresequenz des rekombinanten DNase B-Enzyms, stammend von der DNA-Sequenz von 3 zeigt, wobei der Aminoterminus als das Ergebnis des Sequenzierens der gereinigten rekombinanten DNase B bestimmt wurde;
5 die DNA-Sequenz eines Konstrukts zeigt, um den Bakteriophage λ Promotor an die DNA, die für die DNase B-Sequenz kodiert, zu fusionieren, zusammen mit den Primern, die für die PCR zur Bildung des Konstrukts verwendet wurden;
6 eine Graphik ist, welche die Inaktivierung der rekombinanten DNase B durch menschliches Anti-DNase B-Serum darstellt;
7 die DNA-Sequenz stromaufwärts vom offenen Leserahmen in der klonierten DNA und die Konsensussequenz eines E. coli Promotors zeigt;
8 eine Korrelationskurve ist, welche die Übereinstimmung zwischen der Bestimmung des Anti-DNase B-Antikörpers im menschlichen Serum, unter Verwendung eines rekombinanten DNase B-Enzyms und unter Verwendung von kommerziell erhältlichem DNase B-Enzym, das aus S. pyogenes isoliert wurde, angibt; und
9 eine Graphik ist, die das wesentliche Fehlen von mitogener Aktivität sowohl von rekombinanter DNase B als auch von gereinigten Präparationen von natürlich vorkommender DNase B angibt.
10 zeigt die DNA-Sequenz eines genetischen Konstrukts, das ein Bestandteil eines Vektors ist, der DNase B in Escherichia coli exprimiert, welches identisch zur nativen S. pyogenes DNase B (SEQ ID. NR.: 14) prozessiert wird, sowie die sich ergebende Proteinsequenz (SEQ ID NR.: 15).
BESCHREIBUNG
Um den Bedarf an einer kommerziell verwendbaren Quelle von Streptococcus pyogenes DNase B-Enzym zu decken, haben wir das Gen für DNase B von S. pyogenes genomischer DNA in Escherichia coli kloniert. Trotz des beträchtlichen evolutionären Unterschieds zwischen S. pyogenes und E. coli, wie durch die beträchtliche Divergenz in der Sequenz der 18 S ribosomalen RNAs der beiden Spezies deutlich wird, sowie die substanziellen Unterschiede in Morphologie und anderen taxonomischen Eigenschaften (E. coli ist ein Gram-negativer Bazillus, während S. pyogenes ein Gram-positiver Coccus ist), haben wir einen solch hohen Spiegel in der Expression des klonierten Gens in E. coli und der Aktivität des exprimierten Proteins erzielt, dass ein Screening durch einen enzymatischen Assay durchgeführt werden konnte, welcher von der Aktivität des exprimierten Proteins abhängig ist.
I. KLONIERUNG UND EXPRESSION DES STREPTOCOCCUS DNASE B-GENS IN E. COLI
Die Klonierung und Expression des Strepfococcus pyogenes DNase B-Gens in E. coli erfordert die folgenden Schritte, die sorgfältig optimiert sind, um die Klonierung des intakten Gens in einer Form zu erreichen, in welcher aktives Enzym vom Gen exprimiert wird:

(1) Isolierung von genomischer DNA;
(2) Präparation von Fragmenten der genomischen DNA zum DNA-Klonieren;
(3) Einbau der DNA-Fragmente in Klonierungsvektoren;
(4) Infektion von Bakterien und Selektion; und
(5) Expression und Screening;
(6) Charakterisierung des Klons und DNA-Sequenzierung.

A. Isolierung von genomischer DNA
Genomische DNA wird vorzugsweise aus S. pyogenes unter Bedingungen isoliert, welche die Aktivität von endogenen Nukleasen sowie anderen Faktoren, die DNA abbauen oder denaturieren können, minimieren. Dies erfordert eine Zelllyse und Abbau von Protein. Ein bevorzugtes Verfahren zum Lysieren von Zellen ist die Inkubation mit dem proteolytischen Enzym Achromopeptidase bei 65°C, gefolgt von Inkubation mit dem chaotropischen Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS). Dieses Verfahren wird weiter bevorzugt in der Gegenwart eines Chelatierungsmittels wie EDTA durchgeführt. Als Alternative können andere Proteasen wie Pronase und Proteinase K dazu verwendet werden, die Zellen zu lysieren. Andere Lysierungsverfahren sind im Stand der Technik bekannt. (S. Horinouchi et al., "A New Isolation Method of Plasmid Deoxyribonucleic Acid from Staphylococcus aureus Using a Lytic Enzyme of Achromobacter lyticus," Agric. Biol. Chem. 41: 2487–2489 (1977)).
Vorzugsweise wird die DNA dann mit Phenol oder Phenol/Chloroform extrahiert, und die extrahierte DNA wird mit Ethanol ausgefällt. Eine geeignete Extraktionsabfolge betrifft zwei Extraktionen mit einem gleichen Volumen von Phenol, gefolgt durch eine Extraktion mit einer 1 : 1 Mischung von Phenol/Chloroform (Beispiel 1). Der Extraktionspuffer enthält vorzugsweise ein Chelatierungsmittel wie EDTA, um Nukleaseaktivität zu minimieren. Solche Techniken sind gut bekannt und werden zum Beispiel in D. M. Wallace, "Large- and Small-Scale Phenole Extractions," Meth. Enzymol. 152: 33–40 (1987) und in D. M. Wallace, "Precipitations of Nucleic Acid," Meth. Enzymol. 152: 41–48 (1987) beschrieben.
Eine geeignete Quelle für DNA ist der Stamm ATCC Nr. 14289 von S. pyogenes, auch bekannt als C203S, eine nicht-M enthaltende Variante von Stamm C203. Ähnliche Techniken können jedoch auch für andere Stämme von S. pyogenes, die das Gen für DNase B enthalten, verwendet werden.
Vorzugsweise wird die isolierte DNA nach der Extraktion und Ethanolpräzipitation mit RNase A behandelt, dann in einem Cäsiumchloridgradienten weiter aufgereinigt.
B. Präparation von DNA-Fragmenten zum Klonieren
Die isolierte genomische DNA wird vorzugsweise vor der Klonierung fragmentiert. Am meisten bevorzugt wird die Fragmentierung durchgeführt, indem die DNA durch die Nadel einer Spritze hindurchgedrückt wird, am meisten bevorzugt eine Spritzennadel mit 25er Durchmesser, ungefähr 300 mal. Dies ergibt eine gescherte DNA, die eine durchschnittliche Größe von ungefähr 6–8 kb aufweist.
In einer weniger bevorzugten Alternative kann ein partieller Verdau mit einer Restriktionsendonuklease verwendet werden, wie Sau 3A oder Mbo I. Dies wird zum Beispiel in A.-M. Frischauf, "Digestion of DNA: Size Fractionation," Meth. Enzymol. 152: 183–189 (1987), durch diese Bezugnahme hier eingeschlossen, beschrieben.
C. Einbau von DNA-Fragmenten in Klonierungsvektoren
Der nächste Schritt ist der Einbau der DNA-Fragmente in den geeigneten Klonierungsvektor. Solch ein Klonierungsvektor umfasst typischerweise die DNA-Sequenz, die für S. pyogenes DNase B kodiert, funktionell verknüpft mit mindestens einer Kontrollsequenz, die mit einer geeigneten bakteriellen Wirtszelle kompatibel ist. Solche Kontrollsequenzen schließen Operatoren und Promotoren ein. Geeignete Promotoren schließen den Bakteriophage λ P_L Promotor, einen Hybrid trp-lac Promotor und einen Bakteriophagen T7 Promotor ein. Der Klonierungsvektor umfasst vorzugsweise auch eine geeignete Ribosomenbindungsstelle zur Expression. Ein bevorzugter Klonierungsvektor ist λgt11 (R. A. Young and R. W. Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1194 (1983), welcher eine Expression ermöglicht, die durch einen lac Promotor kontrolliert wird, der in den Vektor eingebaut und funktionell mit der klonierten DNA verknüpft ist. Andere geeignete Klonie rungsvektoren sind im Stand der Technik gut bekannt und werden zum Beispiel in J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989), Vol. 3, Kapitel 17, betitelt "Expression of Cloning Genes in Escherichia coli", beschrieben und hier durch diese Referenz eingeschlossen. Für den Phagen λgt11 wird die DNA in eine Eco RI Stelle eingefügt. Für eine solche Klonierung wird die gescherte DNA vorzugsweise unter Verwendung von E. coli Ligase und dann T4 DNA Polymerase repariert, gefolgt durch die Zugabe von Eco RI Verknüpfungssequenzen. Diese Fragmente mit Eco RI-Enden können nach dem Verdau mit Eco RI Restriktionsendonuklease an λgt11-Arme ligiert werden. Vorzugsweise werden während dieses Verdauvorgangs die internen Eco RI Stellen durch die Verwendung von Eco RI-Methylase blockiert, da die Restriktionsendonuklease die durch die Methylase am Adeninrest in der Erkennungsstelle methylierte DNA nicht verdaut.
Nach Beenden der Ligationsreaktion wird die DNA in Bakteriophage λ Köpfe in vitro verpackt, unter Verwendung einer Mischung von Extrakten, die aus Bakterien präpariert wurden, welche mit Bakteriophage λ Mutanten in Genen, die für den Zusammenbau von Phagenpartikeln benötigt werden, infiziert waren. Verpackungsverfahren sind im Stand der Technik gut bekannt und werden z. B. in Sambrook et al., supra, Vol. 1, S. 2.95–2.108 beschrieben.
D. Infektion von Bakterien und Selektion
Die Phagenpartikel, die durch in vitro Verpackung zusammengebaut wurden, werden zum Infizieren von empfänglichen E. coli Bakterien verwendet. Ein besonders bevorzugter Stamm bakterieller Wirtszellen ist Y1090 (-pMC9), welchem das pMC9 Plasmid fehlt. Ein geeignetes Verfahren besteht darin, die Plaques mit einem Topagar-Überzug aus DNase Testagar (Difco, Detroit, Michigan), enthaltend 0,01% Toluidin Blau 0 als Farbindikator, zu beschichten. Dies ermöglicht den Nachweis von Plaques, die das DNase B-Gen exprimieren.
Der unerwartet hohe Expressionsspiegel des DNase B-Gens in diesem System ermöglichte den direkten Nachweis von positiven Klonen durch direkten Nachweis der sich ergebenden enzymatischen Aktivität, ohne eine Notwendigkeit für immunologisches Screening, das normalerweise für den Nachweis von klonierten Genprodukten benötigt wird.
Ein Verfahren für die Herstellung von im Wesentlichen gereinigtem Streptococcus pyogenes DNase B-Enzym, unter Verwendung von transfizierten Wirtszellen, kann umfassen:

(a) Züchten einer bakteriellen Wirtszelle, transformiert mit einem geeigneten Expressionsvektor, der ein Bakteriophage λ-Derivat sein kann;
(b) Verwenden der gezüchteten transformierten bakteriellen Wirtszelle, um das DNase B-Enzym zu exprimieren; und
(c) Aufreinigen des Enzyms aus der gezüchteten, transformierten bakteriellen Wirtszelle.

E. Charakterisierung des Klons und DNA-Sequenzierung
Der λgt11 Phage, der das S. pyogenes Gen enthält (bezeichnet als 2–6) wurde isoliert, und die DNA wurde aus dem Phagen präpariert. Dieser Klon wurde durch Restriktionsanalyse analysiert, und die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Die Analyse von Eco RI und Eco RI/Sac I Subklonen auf die Anwesenheit von Nukleaseaktivität gibt an, dass ein Teil des DNase B-Gens innerhalb der internen Sac I bis Eco RI Region lag, wie in 2 gezeigt.
Die Sequenzierung der klonierten DNA kann unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt werden, z. B. das Sanger-Didesoxynukleotidketten-Beendigungsverfahren. Die Sequenzanalyse kann durch Starten der Synthese innerhalb des λgt11 Phagen durch die vermutete Region der DNase-Aktivität hindurch begonnen werden. Die Ergebnisse einer solchen Sequenzierung sind in 3 gezeigt.
Die klonierte DNA, deren Sequenz in 3 gezeigt ist, enthält einen langen offenen Leserahmen (ORF). Die Aminosäuresequenz, die von der Translation dieses ORF abgeleitet ist, ist in 3 und 4 gezeigt. Die Aminosäuresequenz des 5'-terminalen Anteils dieses ORFs, beginnend mit Aminosäure 44 (Gln), stimmt mit der Aminosäuresequenz, die durch Sequenzieren von gereinigter natürlich vorkommender S. pyogenes DNase B abgeleitet wurde (Abschnitt IV), überein.
Entsprechend umfasst die DNA im Wesentlichen gereinigte DNA, umfassend eine DNA, die eine Aminosäuresequenz kodiert, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Aminosäuresequenz von (i) Streptococcus pyogenes DNase B-Enzym, wie in 4 gezeigt; und (ii) eine Sequenz, die ein funktionelles Äquivalent des S. pyogenes DNase B-Enzyms kodiert. Die DNA ist im Wesentlichen frei von DNA, die nicht die Aminosäuresequenz von 4 oder ein funktionelles Äquivalent des S. pyogenes DNase B-Enzyms kodiert, abgesehen von einem Leaderpeptid, das an den Aminoterminus des S. pyogenes DNase B-Enzyms fusioniert ist. Wie unten diskutiert, enthält das Translationsprodukt, das durch den offenen Leserahmen erzeugt wird, ein Leaderpeptid.
In diesem Zusammenhang betrifft der Begriff "funktionelles Äquivalent" ein Protein, das DNase-Aktivität besitzt, die durch die im Allgemeinen verwendeten Assays für S. pyogenes DNase B nachweisbar ist und mindestens in einem nachweisbaren Ausmaß mit Antikörpern gegen im Wesentlichen gereinigtes DNase B kreuzreagiert. Der Begriff "funktionelles Äquivalent" schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf, Proteine, deren Sequenz sich von der Sequenz der 4 durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheidet. Solche konservative Aminosäuresubstitutionen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, irgendein Ersetzen von Isoleucin (I), Valin (V) und Leucin (L) gegen eine andere dieser Aminosäuren; Asparaginsäure (D) mit Glutaminsäure (E) und umgekehrt; Glutamin (Q) mit Asparagin (N) und umgekehrt; und Serin (S) mit Threonin (T) und umgekehrt. Die oben erwähnten Substitutionen sind nicht die einzigen Aminosäuresubstutionen, die als "konservativ" betrachtet werden können. Andere Substitutionen können ebenfalls als konservativ betrachtet werden, abhängig von der Umgebung der bestimmten Aminosäure. Zum Beispiel können Glycin (G) und Alanin (A) häufig austauschbar sein, wie auch Alanin und Valin (V). Methionin (M), das relativ hydrophob ist, kann häufig gegen Leucin und Isoleucin, und manchmal gegen Valin ausgetauscht werden. Lysin (K) und Arginin (R) sind häufig an Stellen austauschbar, an denen die entscheidende Eigenschaft des Aminosäurerests seine Ladung ist und die unterschiedlichen pKs dieser beiden Aminosäurereste nicht signifikant sind. Noch weitere Änderungen können in bestimmten Umgebungen als "konservativ" betrachtet werden.
Die DNA kann auch DNA-Sequenzen einschließen, die einen Anteil der Sequenz von 3 in ausreichender Größe und Spezifität umfassen, um als Reaktionsteilnehmer in einer Reaktion, die spezifische Basenhybridisierung erfordert, zu dienen. Solch eine DNA-Sequenz kann ein Primer für eine Vermehrungsreaktion sein, wie die Polymerasekettenreaktion (PCR), die Ligasekettenreaktion (LCR) oder andere Vermehrungsreaktionen. Als Alternative kann die DNA eine Hybridisierungssonde sein. Die DNA-Sequenz kann mindestens 10 Basen lang sein; oder die DNA-Sequenz ist mindestens 50 Basen lang.
F. Einfügen des klonierten Gens für S. pyogenes DNase B in das E. coli Expressionsplasmid Δ33, das DNase B unter der Regulation des Bakteriophaqen λpL Promotors bildet
Das klonierte Gen für S. pyogenes DNase B kann in das E. coli Expressionsplasmid Δ33 übertragen werden, welches das klonierte Gen unter der Kontrolle des Bakteriophagen λ Promotors pL exprimiert. Das S. pyogenes DNase B-Gen wird vorzugsweise unter Verwendung von PCR in das Expressionsplasmid eingefügt, um modifizierte Enden an das DNase B-Gen des λ2–6 Klons anzuheften. Die folgenden Nukleotide können als Primer für die PCR Reaktion verwendet werden, wobei Standard PCR-Verfahren mit Thermus aquaticus DNA Polymerase verfolgt werden:
A: 5'-T-A-A-C-G-G-A-T-C-C-G-A-A-T-C-T-A-C-T-T-G-G-A-T-C-A-A-G-A-C-G-G-G-T-T-T-T-T-T-C-T-3' (SEQ ID NR.: 2)
B: 3'-T-C-T-T-T-T-T-C-G-T-T-A-C-T-A-A-C-G-G-C-A-G-T-A-A-C-G-G-G-G-C-C-C-A-G-C-T-G-G-G-C-C-5' (SEQ ID NR.: 3)
Diese Primer können mit der λgt11 DNase B-Klon 2–6 DNA als Matrize für die Vermehrung verwendet werden. Die sich ergebenden Vermehrungsprodukte können vor dem Einfügen in den Δ33 Expressionvektor mit der Endonuklease Bam HI und Sal I verdaut werden. Dies schafft eine Translationsfusion, die durch den pL Promotor reguliert wird. Ein geeigneter E. coli Stamm (C60001⁺, gal K^–) wird mit der eingefügten DNA transformiert, und Bakterien, die das Plasma enthalten, können durch Selektion mit Ampicillin selektioniert werden. DNA kann aus diesen Kolonien durch Standard-Minipräparationstechniken präpariert werden, z. B. solchen, die in F. M. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons, New York, (1987) § 1.6 beschrieben sind, gefolgt durch Schneiden des isolierten Plasmids mit der entsprechenden Restriktionsendonuklease (Bam HI und Sal I), um zu bestimmen, ob das Plasmid das gewünschte rekombinante Fragment umfasst. Plasmide des gewünschten Konstrukts können in einen E. coli Wirtsstamm eingeführt werden, der einer Induktion gemäß dem Nalidixinsäureprotokoll ausgesetzt wird, wie beschrieben in J. E. Mott et al., "Maximizing Gene Expression from Plasmid Vectors Containing the λpL Promotor: Strategies for Overproducing Transcription Termiation Factor ρ," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 88–92 (1985), das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Im Stand der Technik ist bekannt, dass Nalidixinsäure DNA beschädigt und das recA Protein, ein Rettungsprotein für E. coli, induziert. Das recA Protein weist Proteaseaktivität auf, die zur Inaktivierung des λCl⁺ Repressors führt; diese Inaktivierung führt zur Überexpression durch den pL Promotor. Andere Verfahren zur Aktivierung der Transkription vom pL Promotor können ebenfalls verwendet werden. Wenn die Nalidixinsäureinduktion verwendet wird, werden beträchtliche Mengen von DNase B außerhalb der Zelle sezerniert.
II. EIGENSCHAFTEN DES REKOMBINANT HERGESTELLTEN ENZYMS
Das rekombinant hergestellte Enzym aus λ 2–6 Phagen enthält ein Leaderpeptid, das an den Aminoterminus der DNase fusioniert ist. Dieses Leaderpeptid weist die Sequenz M-N-L-L-G-S-R-R-V-F-S-K-K-C-R-L-V-K-F-S-M-V-A-L-V-S-A-T-M-A-V-T-T-V-T-L-E-N-T-A-L-A-R (SEQ ID Nr.: 1) auf.
Immunoinhibitions-Assays (Beispiel 7) zeigen, dass rekombinantes S. pyogenes DNase B durch Anti-DNase-Enzym in menschlichem Serum in einer Weise inhibiert wird, die identisch zu nicht-rekombinantem DNase B-Enzym ist, basierend auf der Fähigkeit der DNase, einen DNA-Farbstoffkomplex als Substrat zu verwenden.
III. MUTANTEN DES REKOMBINANT HERGESTELLTEN DNASE B-ENZYMS
Mutanten oder Varianten des S. pyogenes DNase B-Gens können veränderte DNase B-Aktivität aufweisen. Solche mutierten DNase B-Enzyme können eine höhere oder geringere Nukleaseaktivitätsrate aufweisen, und diese Mutanten können Mutanten des Proteins einschließen, dessen Aminosäuresequenz in 4 gezeigt ist, in denen mindestens eine der folgenden Mutationen auftritt:

(a) eine Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren der Sequenz von 4;
(b) eine Insertion einer oder mehrerer natürlich vorkommender L-Aminosäuren in die Sequenz von 4; und
(c) Ersetzen mindestens einer der Aminosäuren von 4 durch eine alternative, natürlich vorkommende, L-Aminosäure.

Solche mutierten DNase B-Proteine, kodiert durch mutierte DNase B-Gene, können wegen ihrer Nukleaseaktivität oder wegen ihrer Immunogenität verwendet werden. Wenn sie wegen ihrer Immunogenität verwendet werden, enthalten diese Mutanten vorzugsweise einzelne Aminosäureaustausche, die jegliche Nukleaseaktivität entfernen, aber alle wichtigen Immunepitope erhalten, so dass sie im Wesentlichen die antigene Reaktivität des natürlichen S. pyogenes DNase B- Enzyms beibehalten. So kann mit der veränderten DNase B eine hochgradige Expression in E. coli erreicht werden, ohne menschliche Antikörperreaktivität zu verändern. Solche Mutanten oder Varianten können nach Techniken hergestellt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, wie solche, die in Sambrook et al., supra, Kap. 15, betitelt mit "Site-Directed Mutagenesis of Cloned DNA" beschrieben sind. Solche Techniken schließen Linkerinsertionsmutagenese, Linkerscanningmutagenese, Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese mit der Polymerasekettenreaktionstechnik (PCR) und Züchten in hochmutagenen Stämmen, ein. Wenn sie wegen ihrer Nukleaseaktivität verwendet wird, werden die mutierten Proteine typischerweise ein funktionelles Äquivalent des rekombinanten DNase Enzyms von 4 sein, so wie dieser Begriff oben definiert ist, jedoch nicht notwendigerweise darauf beschränkt.
IV. VERWENDUNG EINES LEADERPEPTIDS FÜR S. PYOGENESE DNASE B-ENZYM
Das Leaderpeptid für DNase B mit einer Aminosäuresequenz von M-N-L-L-G-S-R-R-V-F-S-K-K-C-R-L-V-K-F-S-M-V-A-L-V-S-A-T-M-A-V-T-T-V-T-L-E-N-T-A-L-A-R (SEQ ID NR.: 1) kann zur Expression und Herstellung des rekombinanten Proteins in Bakterien verwendet werden. Ein geeignetes Verfahren für die Verwendung des Leaderpeptids umfasst:

(1) Fusionieren der DNA, die das Protein kodiert, an DNA, die ein Leaderpeptid mit einer Aminosäuresequenz von M-N-L-L-G-S-R-R-V-F-S-K-K-C-R-L-V-K-F-S-M-V-A-L-V-S-A-T-M-A-V-T-T-V-T-L-E-N-T-A-L-A-R (SEQ ID NR.: 1) kodiert, so dass die fusionierte DNA ein rekombinantes Protein mit einem einzelnen Leserahmen bildet, wobei das Leaderpeptid am Aminoterminus des Proteins liegt;
(2) Einführen der fusionierten DNA in den Prokaryoten; und
(3) Exprimieren der fusionierten DNA im Prokaryoten, so dass das rekombinante Protein in einer gewinnbaren Menge hergestellt wird.

Das Bakterium kann Escherichia coli oder, als Alternative, ein Gram-positives Bakterium wie Staphylococcus, Streptococcus und Streptomyces sein.
Vorzugsweise wird das rekombinante Protein durch den Prokaryoten in sein Kulturmedium sezerniert, so dass es aus dem Kulturmedium gewonnen werden kann.
Verfahren zum Fusionieren des DNA-Segments, welches das Leaderpeptid kodiert, an das Gen für das herzustellende Protein, sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen Ligation mit stumpfen Enden ein. Ligation mit stumpfen Enden wird typischerweise mit T4 Ligase durchgeführt (V. Sgaramella & H. G. Khorana, "Studies on Polynucleotides. CXII. Total Synthesis of the Structural Gene for an Alanine Transfer RNA from Yeast. Enzymic Joining of the Chemically Synthesized Polydeoxynucleotides to Form the DNA Duplex Representing Nucleotide Sequence 1 to 20," J. Mol. Biol. 72: 427 (1972); V. Sgaramella & S. D. Ehrlich, "Use of the T4 Polynucleotide Ligase in the Joining of Flush-Ended DNA Segments Generated by Restriction Endonucleases," Eur. J. Biochem. 86: 531 (1978)) und wird vorzugsweise in der Gegenwart von kondensierenden Mitteln, wie Polyethylenglykol oder Hexamincobaltchlorid, durchgeführt.
Falls alternativ eine geeignete Restriktionsendonuklease vorhanden ist, die kohäsive Enden erzeugt und sowohl den Anteil der DNA, der den Linker kodiert, der dem Carboxylterminus des Linkers entspricht, als auch den Anteil des Gens, der das Protein kodiert, das dem Aminotermius des Proteins entspricht, schneiden kann, kann die Restriktionsendonuklease dazu verwendet werden, kohäsive Enden für eine Ligation zu erzeugen.
V. REINIGUNG DES S. PYOGENES DNASE B ENZYMS
A. Reinigung von natürlicher S. pyogenes DNase B
Dieses Verfahren verwendet Polyacrylamid-Gelanalyse von DNase B, die in dem kommerziellen Assayreagens gefunden wird, und einen Vergleich zum Verhalten des natürlichen Enzyms in der Gelelektrophorese. Das Reinigungsverfahren wendet die folgenden Schritte an, beginnend mit einem rohen Extrakt oder einer anderen Quelle für das Enzym: (1) Absorption an und Elution von Diethylaminoethylcellulose, um ein erstes Eluat zu bilden; (2) Chromatographie des ersten Eluats auf Phenylagarose, um ein zweites Eluat zu bilden; (3) Chromatographie des zweiten Eluats auf Heparinagarose, um ein drittes Eluat zu bilden; und (4) Chromatofokussieren des dritten Eluats, um im Wesentlichen gereinigtes DNase B-Enzym zu bilden. Die Chromatofokussierung wird vorzugsweise auf einer Mono-P Säule durchgeführt. Die gereinigte DNase wird weiter fraktioniert, um Ampholyte zu entfernen, die während des Chromatofokussierens unter Verwendung von Reverse-Phase High-Pressure Liquid Chromatographie, auf C4 mit einem Gradienten von 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser und 0,08% Trifluoressigsäure in Acetonitril verwendet wurden.
Das Aufreinigungsverfahren ergibt im Wesentlichen gereinigtes Streptococcus pyogenes DNase B-Enzym, das im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, als Streptococcus DNase B-Enzym und, an seinem Aminoterminus mit einem Leaderpeptid fusioniertes, Streptococcus DNase B-Enzym, ist. Das im Wesentlichen gereinigte Protein ist im Wesentlichen frei von mitogener Aktivität (siehe Beispiel 6 unten).
Die Reinigung ergibt zwei im Wesentlichen gereinigte DNase B-Fraktionen, die sich in der Ladung unterscheiden. Jede der Fraktionen ist im Wesentlichen frei von der anderen Fraktion und anderen Proteinen. Die Fraktionen werden als Fraktion I, die von der Chromatofokussierungssäule bei pH 8,55–8,4 eluiert, und Fraktion II, die von der Chromatofokussierungssäule bei pH 8,22–8,13 eluiert, bezeichnet. Molekulargewichtsdaten, die durch Massenspektroskopie (Beispiel 3) erhalten wurden, weisen darauf hin, dass der Unterschied in den Molekulargewichten zwischen Fraktionen I und II des gereinigten natürlichen DNase B-Enzyms mit einer kleinen Modifikation einer ansonsten identischen Aminosäuresequenz übereinstimmt. Eine mögliche Modifizierung ist Deaminierung, die eine entsprechende Verschiebung des pI bewirken würde.
Das gereinigte Protein kann sequenziert werden. Die ersten 23 Aminosäuren von beiden Fraktionen I und II ergaben die folgende lesbare Sequenz: Q-T-Q-V-S-N-D-V-V-L-N-D-G-A-S-X-Y-L-N-E-A-L-A (SEQ ID NR.: 4), worin X Tryptophan oder Lysin darstellt.
Wie unten weiter ausgeführt, stellt diese Sequenz ein Mittel zum Entwerfen von Sonden dar, die zur Hybridisierung mit mindestens einer DNA-Sequenz geeignet sind, welche die aminoterminale Sequenz des Gens kodiert.
B. Reinigen von rekombinant hergestellten S. pyogenes DNase B-Enzym
Rekombinante S. pyogenes DNase B, die in hohem Grade in den chimären Zellen vorhanden ist, kann durch ähnliche Techniken gereinigt werden. Zum Beispiel kann die rekombinante DNase B aus Phagenlysat gereinigt werden, das aus E. coli gesammelt wurde, das mit λDNase B 2–6 Phagen infiziert war, durch Chromatographie auf Q-Sepharose (Trimethylaminomethylagarose), Ammoniumsulfatpräzipitation, Chromatographie auf Heparinsepharose, und Chromatographie auf Q-Sepharose. Die rekombinante DNase B, die in E. coli hergestellt wird, welche mit rekombinantem Plasmid Δ33 transfiziert wurden, das S. pyogenes DNase B vom pL Promotor exprimiert, können durch Chromatographie auf Heparinsepharose, Chromatographie auf Q-Sepharose und Reverse-Phase High Pressure Liquid Chromatographie gereinigt werden. Andere Reinigungsverfahren sind bekannt und können durch den Fachmann angewendet werden.
VI. PRÄPARATION VON DNA-SONDEN, DIE IN DER LAGE SIND, AN KLONIERTE DNA ZU HYBRIDISIEREN
Man kann sich die Präparation einer einzelsträngigen Nukleinsäuresonde vorstellen, die mit der DNA-Sequenz, welche die aminoterminalen 23 Aminosäuren des S. pyogenes DNase B-Enzyms kodiert, mit nicht mehr als einer ungefähr 30 Fehlpaarung hybrisiert. Die Nukleinsäuresonde kann RNA oder DNA sein. Wenn die Sonde DNA ist, ist der Grad der Fehlpaarung nicht größer als ungefähr 10% unter stringenten Standardbedingungen, d. h. solche, die in F. Ausubel et al., in Current Protocols in Molecular Biology (Wiley-Interscience, New York, 1990), beschrieben sind.
Geeignete Sequenzen solcher Sonden können unter Verwendung der Codongebrauchstabellen für Gene von Darmbakterien abgeleitet werden, die für die relevanten Aminosäuren in Tabelle 1 angegeben sind.
TABELLE 1 CODONGEBRAUCH FÜR AMINOSÄUREN IN DER AMINOTERMINALEN REGION VON S. PYOGENES DNASE
Ein Beispiel für eine solche Sonde ist unten gezeigt:
Sonde 1: C-A-P-U-A-C-N-C-A-R-T-N-W-S-N-A-A-Y-G-A-Y-G-T (SEQ ID NR.: 5)
In dieser Sequenz stellt R ein Purin dar (d. h. A oder G), Y stellt ein Pyrimidin dar (T oder C), S stellt G oder C dar, W stellt A oder T dar und N stellt eine der vier gewöhnlichen Desoxyribonukleotide dar (d. h. A, G, C oder T).
Diese Sonde und andere Sonden können durch Verfahren synthetisiert werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, wie Festphasen-DNA-Synthese durch das Phosphotriester- oder Phosphittriester-Verfahren, wie z. B. in "Nucleic Acids in Chemistry and Biology" (G. M. Blackburn & M. J. Gait, Hrsg., IRL Press, Oxford, 1990), Kapitel 3, S. 106–123 offenbart.
VII. VERWENDUNG EINES STROMAUFWÄRTS-PROMOTORS. DER MIT S. PYOGENES DNASE B VERBUNDEN IST
Ebenfalls beschrieben wird die Isolierung und die Verwendung eines Stromaufwärts-Promotors, der ursprünglich mit dem S. pyogenes DNase B-Gen verbunden ist, um ein anderes Protein als DNase B zu exprimieren. Der Nachweis dieser Promotorsequenz wird unten in Beispiel 9 beschrieben.
Die Promotorsequenz wird in dem λ 2–6 Klon beibehalten. Diese Sequenz schließt eine Startstelle für die Transkription und Stellen ein, die im Wesentlichen homolog zu den Konsensusstellen –10 und –35 für bakterielle Promotoren sind (Beispiel 9). Ein Verfahren zum Verwenden dieser Promotorsequenz zum Exprimieren eines anderen Proteins als DNase B umfasst:

(1) Trennen des Promotors, der ursprünglich mit dem S. pyogenes DNase B-Gen verbunden war, vom S. pyogenes DNase B-Gen;
(2) funktionelles Verknüpfen des Promotors mit einem anderen Strukturgen für ein S. pyogenes Protein, als das Gen für DNase B; und
(3) Exprimieren des Proteins, das durch das Strukturgen kodiert wird.

Das Protein kann in S. pyogenes oder in einem anderen Prokaryoten als S. pyogenes, wie E. coli, exprimiert werden. Der Promotor kann in einen Vektor oder in ein Plasmid zur Expression eines Gens, das funktionell in dem Vektor oder Plasmid mit dem Promotor verknüpft ist, eingebaut werden.
VIII. VERWENDUNG DES IM WESENTLICHEN GEREINIGTEN DNASE B-ENZYMS
Die vorliegende Erfindung umfasst auch einige Verwendungen des im Wesentlichen gereinigten S. pyogenes DNase B-Enzyms, ob aus natürlichen Quellen gereinigt oder durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt.
A. Verwendung des Enzyms für die Herstellung von Antikörpern
Unter den Verwendungen für das Enzym, das entsprechend der Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, ist die Herstellung von Antikörpern. Die Antikörper können entweder polyklonal oder monoklonal sein. Präparation von sowohl polyklonalen als auch monoklonalen Antikörpern werden in E. Harlow und D. Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988), S. 53–318 beschrieben. Die sich ergebenden Antikörper können zum Nachweis des S. pyogenes Enzyms verwendet werden, d. h. in unter Verdacht stehenden Kulturen.
B. Verwendung des Enzyms zum Nachweis von Anti-DNase B-Antikörper
Eine wichtige Verwendung für das im Wesentlichen gereinigte S. pyogenes DNase B-Enzym der vorliegenden Erfindung ist der Nachweis von Anti-S. pyogenes DNase B-Antikörpern, wie in Serum. Wie oben beschrieben, ist das Vorhandensein von solchen Antikörpern ein Zeichen für eine aktive S. pyogenes Infektion und ein Warnsignal dafür, dass ernsthafte eitrige Spätschäden auftreten können.
Ein Verfahren zum Nachweis des Anti-DNase B-Antikörpers wendet die Tatsache an, dass der Antikörper in der Lage ist, die Aktivität des Enzyms zu hemmen. Solch ein Verfahren kann die folgenden Schritte umfassen:

(1) Bereitstellen einer Testprobe, die unter Verdacht steht, Anti-S. pyogenes DNase B-Antikörper zu enthalten;
(2) Hinzufügen einer Menge des S. pyogenes DNase B-Enzyms gemäß der vorliegenden Erfindung zur Testprobe, wobei die Menge ausreichend ist, um einen nachweisbaren Grad enzymatischer Aktivität bei Fehlen einer Inhibition der enzymatischen Aktivität durch den Anti-DNase B-Antikörper in der Testprobe herzustellen, und
(3) Bestimmen des Grades der Aktivität des DNase B-Enzyms in der Testprobe durch das Durchführen eines Enzym-Assays zum Nachweisen und/oder Bestimmen des Anti-S. pyogenes DNase B-Antikörpers in der Testprobe.

Der Enzym-Assay kann mit Standardverfahren durchgeführt werden, wie dem DNA-Farbstoffkomplex-Abbauassay der Wampole Laboratories (Cranbury, NJ). Dieser Assay basiert auf der Fähigkeit der DNase einen DNA-Farbstoffkomplex als Substrat zu verwenden. Dieser Komplex zeigt eine maximale Absorptionswellenlänge von 642 nm. Wenn der DNA-Farbstoffkomplex durch die DNase abge baut wird, gibt es jedoch eine Verschiebung in der maximalen Absorptionswellenlänge und eine Abnahme der Absorption bei 642 nm. Andere enzymatische Assays sind erhältlich, wie viskosimetrische Assays, welche die Fähigkeit des Enzyms messen, lange DNA-Moleküle zu depolymerisieren, wodurch die Viskosität der DNA-enthaltenden Lösungen stark verringert wird. Als Alternative können Assays unter Verwendung von radioaktiver DNA als Substrat durchgeführt und die Freisetzung von Radioaktivität nach Inkubation gemessen werden. Andere Verfahren für den Desoxyribonukleaseassay sind im Stand der Technik gut bekannt.
Ein alternativer Assay für Anti-DNase B-Enzym Antikörper im Serum ist ein ELISA-Assay. Dieser Assay umfasst:

(1) Binden des S. pyogenes DNase B-Enzyms der vorliegenden Erfindung an einen festen Träger;
(2) Reagieren einer Testprobe, die unter dem Verdacht steht, Anti-S. pyogenes DNase B-Antikörper zu enthalten, mit dem an einen festen Träger gebundenen S. pyogenes DNase B-Enzym, um den Antikörper an das Enzym und somit an den festen Träger zu binden, und
(3) Nachweisen des an den festen Träger gebundenen Antikörpers zum Nachweisen und/oder zum Bestimmen des Antikörpers in der Testprobe.

ELISA-Verfahren sind im Stand der Technik gut bekannt und werden z. B. in P. Tijssen, "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays" (Elsevier, Amsterdam, 1985) beschrieben. Der verwendete feste Träger ist typischerweise Plastik, wie Polystyrol, aber auch andere feste Träger, wie Nitrocellulose, können verwendet werden. Der Nachweis des gebundenen Antikörpers wird typischerweise durch Zugeben eines zweiten Antikörpers, der spezifisch für den ersten Antikörper ist, durchgeführt; der zweite Antikörper bindet das S. pyogenes DNase B-Enzym nicht. Solch ein Antikörper kann, z. B. enzymmarkiertes anti-menschliches Immunglobulin G sein. Die Enzymmarkierung ist typischerweise alkalische Phospha tase, λ-Galactosidase, Glucoseoxidase oder Meerrettichperoxidase. Solche Enzyme ergeben Produkte, die optische Absorption im sichtbaren Spektrum aufweisen und entweder visuell oder mit einem Spektrophotometer nachgewiesen werden können.
Andere Techniken zum Nachweisen und/oder Bestimmen der Bildung von Antigen-Antikörperkomplexen können ebenfalls verwendet werden, um Anti-DNase B-Antikörper im Serum zu testen. Diese Techniken weisen einen aggregierten Antigen-Antikörperkomplex nach, hier einen Enzym-Antikörperkomplex, durch eine Änderung in der Lichtabsorption oder -streuung. Im Allgemeinen umfasst ein solcher Assay:

(1) Herstellen einer gepufferten Lösung der DNase B der vorliegenden Erfindung;
(2) Reagieren der gepufferten DNase B-Lösung mit einer Testprobe, die unter Verdacht steht, Anti-S. pyogenes DNase B-Antikörper zu enthalten; und
(3) Nachweisen einer Reaktion zwischen der DNase B und dem Anti-DNase B-Antikörper durch Beobachten und/oder Messen einer Veränderung der Lichtabsorption und/oder der Lichtstreuung in der Lösung.

Die DNase B kann an Träger mit höherem Molekulargewicht gebunden werden, wie Latexpolymere, Plastik- oder Gelkügelchen und Ähnliches.
In einer Reihe von Anwendungen ist es besonders vorteilhaft, das Enzym an Latexpartikel zu binden. Dies kann mehrere Vorteile liefern, einschließlich Stabilisierung des Enzyms und erhöhter Nachweissensitivität, entweder durch Trübungsmessung oder Nephelometrie. Das Latexagglutinations-Assayformat ist populär bei klinischen Immunoassays.
Viele verschiedene Beschichtungsverfahren können beim Binden von DNase B an Latexpartikel verwendet werden. Einige der häufig verwendeten Verfahren sind:
(1) Binden durch Adsorption an Latexpartikel; (2) Binden durch kovalente Kopplung über Carboxylgruppen auf den Latexpartikeln; und (3) Binden durch kovalente Kopplung über Aldehydgruppen auf den Latexpartikeln.
Die Größe der Latexpartikel, die zum Binden verwendet werden, kann von ungefähr 15 nm bis ungefähr 1000 nm im Durchmesser, abhängig von der Anwendung, reichen.
Die Reaktion zwischen der DNase B und der Anti-DNase B kann durch Nephelometrie oder Trübungsmessung nachgewiesen werden. Ein anderes alternatives Verfahren zum Nachweis von Anti-DNase B-Antikörper ist Kapillarelektrophorese.
C. Andere Verwendungen
Das rekombinante Protein kann zur Impfstoffentwicklung verwendet werden, um gegen S. pyogenes in empfänglichen Individuen zu immunisieren, und es kann auch als ein Aerosol in der Behandlung von Lungenviskositätssymptomen bei Erkrankungen wie zystischer Fibrose verwendet werden, wenn die Viskosität auf Absonderungen beruht, die hohe Konzentrationen von DNA enthalten.
Zur Verwendung als ein Impfstoff wird eine Menge des gereinigten S. pyogenes DNase B-Enzyms gemäß der vorliegenden Erfindung einem Säuger verabreicht. Die Menge ist ausreichend, um die Bildung von Antikörpern, die spezifisch für S. pyogenes DNase B sind, zu stimulieren. Die Verabreichung erfolgt typischerweise durch Injektion, und kann intravenös, intramuskulär, subkutan, intradermal oder über andere Wege erfolgen. Das DNase B-Enzym kann mit einem Adjuvans verabreicht werden, um die Immunantwort zu erhöhen. Geeignete Adjuvanzien sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen vollständiges und unvollständiges Freundsches Adjuvans ein, sowie Aluminiumhydroxid mit oder ohne, durch Hitze abgetötete, Bordetella pertussis Bakterien. Das Enzym kann aggregiert, ausgefällt oder an unlösliche Matrizes gekoppelt sein.
Ein zur Verwendung bei Impfungen besonders geeignetes Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein mutiertes Enzym, in dem die DNase-Aktivität vollständig oder im Wesentlichen beseitigt ist und die Antigenität vollständig oder im Wesentlichen beibehalten wird.
Ein Verfahren zur Verwendung von enzymatisch aktivem DNase B-Enyzm kann umfassen:

(1) Bilden eines Aerosols aus gereinigtem, enzymatisch aktivem DNase B-Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung; und
(2) Verabreichen des Aerosols an einen Patienten mit zystischer Fibrose, in einer Menge, die ausreicht, um die Lungenflüssigkeitsviskosität in dem Patienten zu verringern.

Die Verabreichung des Aerosols kann unter Verwendung von Inhalationsvorrichtungen durchgeführt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind und häufig verwendet werden, um Steroide und andere Arzneimittel durch Inhalation zum Atemwegstrakt zu bringen.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sind für Illustrationszwecke vorgesehen und sind nicht dafür vorgesehen, die Erfindung einzuschränken.
Beispiel 1
Klonierung des Streptococcus pyogenes DNase B-Gens
Das S. pyogenes DNase B-Gen wurde durch einen auf Aktivität basierenden kolometrischen Nachweis der Nukleaseaktivität, die von einem rekombinanten λ Bakteriophagen gebildet wurde, identifiziert. Der Phage war ein Produkt einer λ Bibliothek, die gescherte DNA enthielt, die aus S. pyogenes (Lancefield Group ATCC Nr. 14289) genomischer DNA gereinigt worden war.
Herstellung von chromosomaler DNA aus S. pyogenes
S. pyogenes Stamm ATCC 14289 wurde auf Todd Hewitt Agarplatten ausgestrichen und bei 37°C für zwei Tage inkubiert. Eine einzelne Kolonie wurde verwendet, um einen Liter Todd Hewitt Brühe mit 10% Kalbsserum anzuimpfen. Die Kultur wurde bei 37°C unter Schütteln für ungefähr 36 Stunden bis zu einer hohen Dichte wachsen gelassen.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation in einer Beckman J6 Zentrifuge bei 3500 UpM bei 4°C für 45 Minuten gesammelt. Das Zellpellet wurde in 25 ml 40 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA resuspendiert. Das proteolytische Enzym Achromopeptidase (60 mg) (Wampole), in 1 ml Puffer, wurde zugefügt, und die Mischung wurde bei 65°C für eine Stunde inkubiert. Es war keine Lyse war sichtbar. Eine Gesamtmenge von 20 ml 10% SDS wurde dann zugefügt, und die Inkubation wurde für eine Stunde fortgesetzt. Die Lyse war sehr offensichtlich. Fünfzig Milliliter Puffer wurden dann hinzufügt, um die Konzentration von SDS auf 2,5% zu verringern.
Die Mischung wurde zweimal mit einem gleichen Volumen von Phenol extrahiert, gefolgt durch eine Extraktion mit Phenol/Chloroform (1 : 1). Die DNA in der wässrigen Phase wurde durch Ethanol ausgefällt. Die DNA wurde durch Zentrifugation gewonnen. Das Pellet wurde in 4 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA (TE) resuspendiert. RNase A (50 μl bei 10 mg/ml) wurden zugefügt, und die Mischung wurde bei 37°C für drei Stunden inkubiert.
Die DNA wurde weiter in einem Cäsiumchloridgradienten gereinigt. Die Endkonzentration der DNA betrug ungefähr 0,5 mg/ml.
Konstruktion der S. pyogenes Bibliothek in λgt11
Die isolierte chromosomale DNA (300 μl) wurde zu 200 μl TE Puffer zugefügt. Die Mischung wurde dann ungefähr 300 mal durch eine 1 ml Spritze mit einer Nadel mit 25er Durchmesser durchgepresst, um die DNA auf eine durchschnittliche Größe von 6 kb zu scheren.
Die gescherte DNA (150 μl) wurde mit E. coli Ligase behandelt, um bestehende Einzelstrangbrüche in der DNA zu reparieren, die anderenfalls bei nachfolgenden Manipulationen zu Lücken hätten werden können. Zu 150 μl DNA wurden 20 μl 10 × E. coli Ligasepuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 7,6, 100 mM MgCl₂, 100 mM Dithiothreitol und 500 μg/ml Rinderserumalbumin), 20 μl NAD⁺ (36 mM) und 7 μl E. coli Ligase (New England Biolabs, Beverly, Mass., 4 Einheiten/μl) zur DNA hinzugefügt, und die Mischung wurde für vier bis fünf Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Ligase wurde bei 65°C für 15 Minuten durch Hitze abgetötet. Die DNA wurde mit Ethanol ausgefällt.
Eco RI Stellen in der ligasebehandelten DNA wurden mit Eco Methylase methyliert, unter Befolgung des Protokolls des Herstellers (Promega, Madison, Wis.). Dies wurde getan, um interne Eco RI Stellen zu blockieren, deren Spaltung das Klonierungsverfahren stören würde.
Die gescherten Enden der DNA wurden mit T4 DNA-Polymerase durch Zufügen von 30 μl von 0,1 M MgCl₂, 20 μl 2,5 mM von jedem der vier Desoxyribonukleosidtriphosphate und 2 μl T4 DNA-Polymerase (3000 Einheiten/ml) zu der DNA-Mischung nach Methylierung repariert. Die Reaktion wurde für 15 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Mischung wurde einmal mit Phenol/Chloroform und dann mit Ether extrahiert. Die DNA in der wässrigen Fraktion wurde dann mit Ethanol ausgefällt.
Eco RI Verknüpfungssequenzen wurden an die DNA ligiert. Die verwendeten Verknüpfungssequenzen waren Oktamere von New England Biolabs. Nach Ligation der Verknüpfungssequenzen wurde die DNA mit einem Überschuss von Eco RI Restriktionsendonukleaseenzym verdaut. DNA des gewünschten Größenbereichs, nämlich 6–8 kb, wurde nach Elektrophorese aus einem Agarosegel gereinigt. Die DNA wurde durch Ethanolausfällung konzentriert und war dann fertig für die Ligation in λgt11.
Ungefähr 2 μg gescherter DNA wurden mit 1 μg λgt11 Armen ligiert, die vorher mit Eco RI Restriktionsendonuklease verdaut und in welchen der terminale Phosphatrest durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase entfernt worden war. Die Ligation wurde mit Bakteriophage T4 Ligase in einem Gesamtvolumen von 5 μl durchgeführt. Die Ligationsreaktion wurde bei 4°C über Nacht ausgeführt.
Die gesamte Ligationsmischung wurde in vitro unter Verwendung des Promega (Madison, Wis.) Verpackungsextrakts verpackt. Ein μl der verpackten Phagen wurde auf einen Rasen von Y 1090 E. coli in Anwesenheit von Isopropylthio-β-D-Galactosid (IPTG) und dem chromogenen Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) (Xgal) ausplattiert, ungefähr 5% der Plaques waren blau. Die Verpackungseffizienz betrug ungefähr 10⁶ Plaques pro μg DNA.
Screening nach rekombinanten λ Klonen mit Nukleaseaktivität
Die nichtvermehrte Bibliothek (10 μl) wurde mit 0,1 ml einer Übernachtkultur von LE 392 ausplattiert. Nach fünf Stunden wurden die Platten mit 0,5 × BBL DNase Testagar plus 0,01% Toluidin Blau plus 10 mM MgCl₂ überschichtet. Eine Gesamtmenge von 10 Platten wurde gescreent. Vierundvierzig pinkfarbene Plaques (möglicherweise Nuklease positiv) wurden erneut gescreent. Neun der 44 pinkfarbenen Plaques erwiesen sich bei erneutem Screening als dauerhaft positiv für Endonukleaseaktivität.
Weil die Produktion der S. pyogenes DNase nachteilig für das E. coli Wirtsbakterium ist, war die Plaquegröße dieser Nuklease positiven Klone sehr viel kleiner als die der Nuklease negativen Klone. Entsprechend gab es einen Selektionsdruck zum Anhäufen von Mutationen, welche die Nukleaseaktivität verringern würden, was die Aufgabe des Isolierens von stabilen Nuklease positiven Klonen verkompliziert.
Einer der Vorteile des Selektions- und Screeningverfahrens der vorliegenden Erfindung ist das Verringern des Selektionsdrucks, was stabile Nuklease positive Klone ermöglicht. Um dies zu tun wurde der E. coli Stamm Y1090 ohne das Plasmid pMC9 als Wirt für die Nuklease tragenden Phagen verwendet. Plattenlysate wurden zum Bilden von Stammlösungen verwendet, um die Klone über Plaques aufzureinigen. Für dieses Verfahren wurden der Wirt und der Phage direkt auf 0,5 × BBL DNase-Testagar plus 0,01% Toluidin Blau plus 10 mM MgCl₂ ausplattiert, anstatt einer Überschichtung nach fünf Stunden Inkubation.
Lysate der neun rekombinanten Klone wurden auf SDS-Polyacrylamidgelen, die DNA enthielten, analysiert. Die Nuklease in allen neun Klonen behielt ihre Aktivität nach SDS-Denaturierung, und alle weisen das gleiche scheinbare Molekulargewicht, ungefähr 25 kd, auf.
Diese neun Lysate wurden auf dem PhastGel System mit IEF 3–9 Gelen zur Elektrofokussierung analysiert. Nach Elektrophorese wurden die Gele mit 3,5 ml DNase-Substrat (Streptonase B Kit) (Difco, Detroit, Michigan) in 1% Agarose in TAE (40 mM Tris, 5 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA, pH 8) überschichtet. Die Aktivitätsbanden für alle 9 Lysate an der Kante des basischen Endes des Gels legte einen sehr hohen pI für die klonierte Nuklease nahe. Außerdem legte dies nahe, dass alle neun Klone das gleiche Gen enthielten.
Im Einzelnen wurde ein Phage, der DNase-Aktivität zeigte, der als 2–6 bezeichnet wird, weiter analysiert. Der λ DNase 2–6 Klon wurde mit Restriktionsendonukleaseanalyse analysiert, um das DNA-Fragment zu charakterisieren. Die Einfügung von S. pyogenes genomischer DNA in den λ Vektor im 2–6 Klon betrug ungefähr 5,2 kb. Die Lage des Nukleasegens wurde durch Subklonieren von kleineren Regionen des DNase 2–6 Klons zurück in λgt11 und Testen der Subklone auf Nukleaseaktivität bestimmt. 2 zeigt die Lage der verschiedenen Subklone und deren Nukleaseaktivität. Subklone 1 und 4 bildeten Nukleaseaktivität, waren aber sehr instabil. Subklone 2 und 3 wiesen keine Nukleaseaktivität auf, aber waren stabil. Die Ergebnisse dieser Subklonierung geben an, dass mindestens ein Teil des DNase B-Gens im inneren Sac I/Eco RI Fragment liegt. Die aminoterminale Sequenz des DNase B-Proteins wurde zusammen mit dem genetischen Code dazu verwendet, einen Satz von degenerierten Oligonukleotiden zu erzeugen, der verwendet wurde, um das DNase 2–6 Insert und einige der Subklone zu hybridisieren. Diese Oligionukleotide hybridisierten an das 3–5 kb Eco RI Fragment in DNase B 2–6 und an das Sac I/Eco RI Fragment in Subklon 3. Diese Daten, zusammen mit den Subklonierungsdaten, legen nahe, dass die Transkription des Nukleasegens sehr wahrscheinlich von links nach rechts im Diagramm läuft, und dass die Sac I Stelle innerhalb des DNase B-Gens liegt.
Eine Kartierung der S. pyogenes DNA, die zum 5,2 kb Insert benachbart ist, wurde durch Blothybridisierung von genomischer DNA durchgeführt. Die 3,5 kb und 1,5 kb Eco RI Fragmente der λ DNase 2–6 DNA wurden gelgereinigt und mit ³²P durch Random Priming markiert. Die gleichen genomischen Blots wurden mit den beiden Proben nacheinander hybridisiert. Eine teilweise Restriktionsendonukleasekarte des Inserts und seiner benachbarten Regionen im S. pyogenes Chromosom ist in 1 gezeigt.
Beispiel 2
Sequenzierung des 2–6 Klons, der S. pyogenes DNase B enthält
Eine Nukleotidsequenzanalyse wurde am Klon 2–6 durch das Didesoxynukleotid-Kettenbeendungsverfahren nach Sanger et al., supra, durchgeführt. Die Sequenzanalyse wurde durch Starten der Synthese innerhalb des λgt11 Phagen des Klons 2–6 begonnen, durch die Region hindurch, von der vermutet wurde, dass sie die DNase-Aktivität enthält. Die Ergebnisse der Sequenzierung werden in 3 ge zeigt. Die S. pyogenes DNase B liegt innerhalb des ersten vollen offenen Leserahmens der Sequenz.
Beispiel 3
Reinigung der nativen S. pyogenes DNase B
Native S. pyogenes DNase B wurde unter Verwendung eines kommerziellen DNase B-Assayreagens als Marker für die richtige Nuklease gereinigt. In anderen Worten, Polyacrylamid-Gelelektrophoreseergebnisse, die mit DNase B aus dem kommerziellen Kit erhalten wurden, wurden mit den Ergebnissen der Gelelektrophorese von Extrakten verglichen, die von S. pyogenes ATCC Nr. 14289 gebildet wurden. Das Reinigungsverfahren schloss ein: Batchabsorption an DE-23 Diethylaminoethylcellulose (Whatman) (2) Chromatographie auf Phenyl-Sepharose^® (Pharmacia, Uppsala, Schweden); (3) Chromatographie auf Heparin-Sepharose^® (Pharmacia, Uppsala); und (4) mono-P Chromatofokussierung (Pharmacia).
Bakterielle Kulturen
Streptococcus pyogenes ATCC Nr. 14289 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland), die von A. Bernheimer C203S (nicht-M enthaltende Variante von C203) abstammt, wurde als bakterielle Quelle für die Sammlung von DNase B-enthaltendem Kulturmedium verwendet, wobei das Enzym durch die Bakterien in das Kulturmedium sezerniert wird. Volumen von Hirn-Herz-Infusionsmedien (1 Liter) (Difco Laboratories, Detroit, Michigan), ergänzt mit 0,01% gewaschenen roten Blutzellen der Ziege, wurden mit 1 ml einer frischen Übernachtkultur angeimpft. Diese Kulturen wurden für 20 Stunden bei mittlerem Schütteln (300 UpM) bei 37°C in 2 Liter Erlenmeyer Flaschen wachsen gelassen. Vor der Reinigung wurde das Kulturmedium geklärt und durch Filtration unter Verwendung eines Pelliconfilters (0,22 μm Durapore GVLP Membran) sterilisiert, gefolgt von Filtration durch einen 0,45 μm Einwegfiltrationsapparat (Nalgene, Nalge Co., Rochester, New York). Ungefähr 105 Liter Kulturmedien wurden mit diesem Verfahren verarbeitet.
Batchabsorption an Diethylaminoethylcellulose
Das geklärte Medium wurde durch Ultrafiltration konzentriert, unter Verwendung des Pelliconapparats und einer 10 K Membran (PLGC, regenerierte Cellulose) mit einer Filterfläche von ungefähr 0,46 m² bei einer Fließgeschwindigkeit von 120 ml/min, und einem Druck von 20 lbs pro Quadratinch (1,4 kg/cm²). Das anfängliche Volumen von 105 Liter Medium wurde schließlich auf 4 Liter mit einer Proteinkonzentration von 2,3 mg/ml konzentriert.
Diethylaminoethylcellulose (DEAE-Cellulose) (DE23, Whatman, England) wurde durch Waschen mit 15 Volumina 0,5 M HCl, gefolgt durch einen zweiten Waschschritt mit 15 Volumina 0,5 M NaOH regeneriert. Nach Wiederholung des Waschschrittes mit Natriumhydroxid wurde die DEAE Cellulose mit Wasser gewaschen, bis sie neutral war. Schließlich wurde die Cellulose über Nacht in TMC Puffer (1 mM Tris, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, pH 7,5) äquilibriert.
Die äquilibrierte, nasse Cellulose (100 g) wurde zu 500 ml des konzentrierten S. pyogenes Medienüberstands hinzugefügt. Die Mischung wurde bei 300 UpM für 20 Minuten bei 4°C vor der Zentrifugation bei 3500 UpM für 45 Minuten geschüttelt. Die Cellulose wurde mit 450 ml TMC Puffer gewaschen, und die beiden Überstände wurden vereinigt.
Chromatographie auf Phenylsepharose
Die Überstände aus der Diethylaminoethylcellulose Batchabsorption wurden durch Filtration durch eine 0,45 μm Membran geklärt. Ammoniumsulfat wurde bis auf 0,8 M zugefügt, vor dem Durchgang durch Phenylsepharose CL 45 (Pharmacia, Uppsala, Schweden), die mit 0,8 M Ammoniumsulfat, 20 mM Natriumphosphat (pH 8,0) äquilibriert war.
Die 80 ml Phenylsepharose-Säule wurde bei 1,85 ml/min mit 1100 ml Probe in einer Konzentration von 258 μg/ml beladen. Die DNase-Aktivität wurde im Durchfluss gesammelt, vor der Konzentration durch Ultrafiltration unter Verwendung einer 10 kd Membran (Diaflo YM10, Amicon Division, W. R. Grace & Co.). Die Endkonzentration des Proteins betrug 0,245 mg/ml in 55 ml.
Chromatographie auf Heparinsepharose
Der konzentrierte Durchfluss aus der Phenylsepharose-Säule wurde gegen Heparin Puffer A (20 mM HEPES, pH 7,9, 2 mM Dithiothreitol, 10 mM MgCl₂, 0,2 mM EDTA, 0,1 NaCl, 10% Glycerol) dialysiert. Eine Heparinsepharose CL-6B-Säule (Pharmacia) (80 ml) wurde vor dem Beladen mit dem Heparin-Puffer A mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min äquilibriert. Nach Waschen der Säule mit drei Volumen Heparin-Puffer A wurde ein Gradient zwischen 0% und 100% Puffer B bei einer Fließgeschwindigkeit von 2,2 ml/min laufen gelassen. Puffer B war der gleiche Puffer wie Puffer A mit der Ausnahme, dass die Konzentration von Natriumchlorid 1,0 mol/l betrug. Die DNase-Aktivität eluierte bei 350 mM NaCl in einem Volumen von ungefähr 250 ml. Die DNase-Aktivität wurde durch Ultrafiltration konzentriert.
Mono-P Chromatofokussierung
Die konzentrierte DNase-Fraktion wurde vor dem Chromatofokussieren gegen 25 mM Diethanolamin, pH 9,5 dialysiert. Die Mono-P 5/20-Säule (Pharmacia, Piscataway, N. J.), äquilibriert im Beladungspuffer (25 nM Ethanolamin, pH 9,5), wurde mit 500 μl der Probe injiziert und mit 9 ml des Beladungspuffers gewaschen. Die Säule wurde mit 100% Puffer B (10% Polypuffer 96 (Pharmacia), pH 6,0) eluiert. Das eluierte Gesamtvolumen betrug 34 ml; Fraktionen von 0,5 ml wurden gesammelt. Zwei Aktivitätspeaks wurden bei pH 8,55–8,4 (Fraktionen 25–29), hier als Fraktion I bezeichnet, und 8,22–8,13 (Fraktionen 34–35), hier als Fraktion II bezeichnet, gesammelt. Die gesammelten Fraktionen wurden durch Aktivitätsgele mit isoelektrischer Fokussierung, Silberfärbung und durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert.
Reverse-Phase High-Pressure Liquid Chromatographie
Die Peakfraktionen aus der Chromatofokussierungssäule wurden weiter aufgereinigt, um die Ampholyte, die zum Chromatofokussieren verwendet wurden, durch Reverse-Phase High-Pressure Liquid Chromatographie unter Verwendung einer C4-Säule (Beckman System Gold Instrument, Beckman Instruments, Fullerton, California) zu entfernen. Proben wurden in Puffer A geladen (0,1% Trifluoressigsäure in Wasser), und ein Gradient von 0%–100% Puffer B (0,8% Trifluoressigsäure in Acetonitril) wurde verwendet, um die Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min zu eluieren. Jene Proteine eluierten bei 65% Puffer B in einem Volumen von ungefähr 1 ml.
SDS und isoelektrische Analyse
Die SDS-Polyacrylamid-Gelanalyse aller Proben wurde unter Verwendung eines automatischen Instruments des PHAST Systems (Pharmacia LKB, Piscataway, New Jersey) durchgeführt. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde auf den Phast Gel 10–15%-Gelen durchgeführt. Isoelektrische Gele wurden unter Verwendung der PhastGel IEF 3–9-Gelen laufen gelassen. Silberfärbung von sowohl den SDS- als auch den isoelektrischen Gelen wurde unter Verwendung der PhastSystem automatischen Färbevorrichtung (Pharmacia LKB) durchgeführt. Aktivitätsassays der DNase-Proben auf den isoelektrischen Fokussierungsgelen wurden durch Überschichten der Gele nach Elektrophorese mit 5 ml einer 1% geschmolzenen Agaroselösung, die phosphatgepufferte Salze und 1 ml des rekonstituierten DNase-Substratfarbstoffes (Wampole) enthielt, durchgeführt. Inkubation der IEF-Gele mit dem Substratüberzug bei Raumtemperatur ergab den Aktivitätsnachweis durch Umsetzen des blauen Substratfarbstoffes zu einer pinken Farbe, die sich rund um die Nukleaseaktivität zentrierte. Aktivitätsassays von mit SDS denaturierten Proben wurden unter Verwendung eines 14% SDS- Polyacrylamidgels durchgeführt, das in der Anwesenheit von 500 μg/ml Heringssperma-DNA polymerisiert worden war. Nach Elektrophorese wurden die Gele mit Wasser gewaschen und mit 40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM MgCl₂, 0,02% Natriumazid für 2 Stunden bei 37°C äquilibriert. Ethidiumbromid wurde auf 1 μg/ml zugefügt, um die Nukleaseaktivität zu beobachten, die als Ergebnis des Abbaus von DNA durch die Nuklease sichtbar war.
Proteinsequenzierung
Die aminoterminalen Sequenzen der Fraktionen I und II der gereinigten DNase wurden unter Verwendung eines Applied Biosystems 477 Sequenziergerätes (Foster City, Kalifornien) bestimmt. Proben von jedem der gereinigten Enzyme (Fraktionen I und II) wurden auf einen Applied Biosystems (Foster City, CA) 470 Proteinsequenzierer geladen. Die ersten 23 Aminosäuren von beiden Fraktionen I und II ergaben die folgende lesbare Sequenz: Q-T-Q-V-S-N-D-V-V-L-N-D-G-A-S-X-Y-L-N-E-A-L-A (SEQ ID NR.: 4), worin X für eine Aminosäure steht, die nicht definitiv identifiziert werden kann, aber sehr wahrscheinlich Tryptophan oder Lysin ist.
Massenspektroskopieanalyse
Eine Ionenspray-Massenspektralanalyse wurde mit rekombinanter DNase B (Beispiel 1) und den Fraktionen I und II des gereinigten nativen Dnase B-Enzyms unter Verwendung des Finnigan MAT TSQ 700 vierpoligen Dreiphasen-Massenspektrometers, ausgerüstet mit dem Finnigan Elektrospray-Ionisierungssystem, durchgeführt. Proben wurden durch Reverse Phase Fraktionierung unter Verwendung einer C4-Säule, wie oben beschrieben, präpariert. Die DNase B-Proteine eluierten bei 65% Puffer B und wurden zur Lagerung lyophilisiert. Vor der Injektion bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 μl/min wurden die Proben in Acetonitril-Wasser-Essigsäure (50 : 50 : 1) gelöst.
Die durch massenspektrometrische Analyse bestimmten Molekulargewichte sind wie folgt: rekombinante DNase B (Beispiel 1) – 25.549; Fraktion I der gereinigten natürlichen DNase B – 25.390; Fraktion II der gereinigten natürlichen DNase B – 25.397. Diese Ergebnisse stimmen mit den Nukleotid- und Aminosäure-Sequenzierungsergebnissen überein, welche angeben, dass die rekombinante DNase B eine zusätzliche Aminosäure am Aminoterminus aufweist. Der Unterschied in den Molekulargewichten zwischen Fraktion I und II der gereinigten natürlichen DNase B stimmt mit einer geringen Modifikation einer andernfalls identischen Aminosäuresequenz überein. Eine mögliche Modifikation ist Desaminierung, die eine entsprechende Verschiebung des pI bewirken würde.
Beispiel 4
Reinigung und aminoterminale Sequenzanalyse der rekombinanten S. pyogenes DNase B, die von Bakteriophagen λ 2–6 Klon gebildet wurde
Das rekombinante DNase B-Protein im λ DNase B 2–6 Phagenlysat wurde auf einem SDS-Polyacrylamidgel durch Western-Blot Analyse identifiziert. Kaninchen-Antikörper gegen kommerzielle DNase B wurde verwendet, um das Vorhandensein der rekombinanten DNase B nachzuweisen. Es war nur eine Proteinbande nachweisbar. Coomassie-Blaufärbung eines SDS-Polyacrylamidgels legt nahe, dass das rekombinante DNase B-Protein ungefähr 5% der gesamten Proteine des Lysats ausmachte. Nur eine Nuklease wurde in einem SDS-DNA-Polyacrylamid-Gelsystem nachgewiesen. Die Nuklease wies ein scheinbares Molekulargewicht von 25.000 Daltons auf.
Die Reinigung des rekombinanten DNase B-Proteins wurde unter Verwendung von SDS-Polyacrylamidgel und eines Nukleaseaktivitätsassays, unter Verwendung des Substrats, das als Kontrolle im kommerziellen DNase B-Assay Kit verwendet wird, überwacht. Das Reinigungsverfahren schloss ein: (1) Chromatographie auf Q-Sepharose (Trimethylaminomethylagarose); (2) Ammoniumsulfatausfällung; (3) Chromatographie auf Heparinagarose; und (4) Chromatographie auf Q-Sepharose. Zwei Liter des λ DNase B 2.6 Phagenlysats wurden als eine Übernachtkultur in Luria-Brühe, ergänzt mit 10 mM MgCl₂, hergestellt. Der Überstand wurde nach Zentrifugation der Kultur in einer Beckman Instruments (Fullerton, CA) Zentrifuge bei 3635 × g bei 4°C für 45 Minuten, um alle Zelltrümmer zu entfernen (das Volumen des Überstands betrug 1900 ml), gesammelt.
Das Lysat wurde durch eine 0,45 μm Filtrationseinheit gefiltert, um restliche Bakterien und Zelltrümmer zu entfernen. Dieses Filtrat wurde dann durch eine ungefähr 200 ml Säule Q-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ, die mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA äquilibriert worden war) gegeben. Der Durchfluss der Säule wurde gesammelt. Zu dieser Fraktion wurde Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 80% bei Raumtemperatur langsam zugefügt, um das Lysat zu konzentrieren. Die entsalzten Proteine wurden bei 15.000 × g für 30 Minuten zentrifugiert.
Glycerol wurde zu den dialysierten Proteinen bis zu einer Endkonzentration von 10% hinzugefügt. Diese Präparation wurde durch eine 0,45 μm Filtrationseinheit gefiltert. Die Leitfähigkeit der Proteinpräparation wurde bestimmt, und die Proteinpräparation wurde mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 verdünnt, so dass die Leitfähigkeit die gleiche war, wie die der Lösung aus 20 mM Tris pH 7,5, 25 mM NaCl, 10% Glycerol (Puffer A). Das Endvolumen betrug 1800 ml.
Diese Probe wurde auf eine Heparinsepharose-Säule (ungefähr 100 ml) auf einem Pharmacia FPLC System mit einer Fließgeschwindigkeit von 120 ml/Std. geladen. Die Säule wurde mit 400 ml Puffer A gewaschen. Die DNase B wurde mit einem Liter eines Gradienten von 25 mM bis 500 mM NaCl in Puffer A eluiert. Die DNase-Aktivität eluierte bei ungefähr 125 mM NaCl in einem Volumen von ungefähr 175 ml.
Die von der Heparinagarose-Säule eluierte DNase-Fraktion wurde gegen 20 mM Tris-HCl, pH 8,5 dialysiert und wurde auf eine ungefähr 175 Milliliter Q-Sepharose-Säule geladen, die mit 20 mM Tris-HCl, pH 8,5 äquilibriert worden war. Der Durch fluss der Q-Sepharose-Säule wurde gesammelt und durch Aktivitätsgele mit isoelektrischer Fokussierung, Silberfärbung und durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Die Präparation des rekombinanten DNase B-Proteins war zu 99% homogen. Die Proteinkonzentration im Endeluat (110 ml) betrug ungefähr 100 μg/ml. Dies entspricht einer Ausbeute von ungefähr 5,5 mg/Liter Kultur. Das Endprodukt wurde dann einer Reverse-Phase High-Pressure Liquid Chromatographie unterzogen, wie oben in Beispiel 3 beschrieben.
Die aminoterminale Sequenz der gereinigten rekombinanten DNase B wurde unter Verwendung eines Beckman Mikrosequenzierungssystems 2020/Gold bestimmt. Die Aminosäuresequenz war identisch zu jener der natürlichen S. pyogenes DNase B, mit der Ausnahme, dass der Aminoterminus Arginin (R) war, und R-Q-T-Q-V-S-N-D-V-V-L-N-D-G-A-S-K-Y-L-N-E-A-L-A-W-T-F-N-D-S-P-N-Y-Y-K-T-L-G (SEQ ID NR.: 6) war. Dieses Arginin stammte aus dem Verfahren zum Herstellen der rekombinanten DNase B.
Massenspektroskopische Analyse der DNase B zeigte, dass die DNase homogen war, mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 25.549.
Beispiel 5
Klonierung und Expression von S. pyogenes DNase B-Enzym in einem Escherichia coli Plasmid unter der Regulation des pL Promotors
Ein zusätzlich genetisches Konstrukt wurde hergestellt, um die regulierte Expression des S. pyogenes DNase B-Gens, unter Verwendung eines Plasmidvektors zu zeigen, der den Bakteriophage λ Promotor pL enthält. Dieses Konstrukt wurde unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt, um modifizierte Enden an das DNase B-Gen im λ 2–6 Klon einzubauen. Die folgenden Oligonukleotide wurden entworfen und auf dem Pharmacia Gene Assembler Plus DNA Synthesegerät synthetisiert, unter Befolgung der Empfehlungen des Herstellers:

A: 5'-T-A-A-C-G-G-A-T-C-C-G-A-A-T-C-T-A-C-T-T-G-G-A-T-C-A-A-G-A-C-G-G-G-T-T-T-T-T-T-C-T-3' (SEQ ID NR.: 2)
B: 3'-T-C-T-T-T-T-T-C-G-T-T-A-C-T-A-A-C-G-G-C-A-G-T-A-A-C-G-G-G-G-C-C-C-A-G-C-T-G-G-G-C-C-5' (SEQ ID NR.: 3).

Diese Oligonukleotide wurden als Primer in einer PCR-Reaktion, unter Verwendung des AmpliTaq Kits (Perkin-Elmer-Cetus, Norwalk, CT) gemäß der Anleitung des Herstellers, verwendet. Die Endkonzentration von MgCl₂ wurde auf 4 mM eingestellt, und eine 20 Zyklus Reaktion wurde (37°C, 2 Minuten; 72°C, 3 Minuten; 95°C, 2 Minuten) unter Verwendung des Perkin-Eimer 480 Thermocyclers durchgeführt. DNA des λgt11 Klons 2–6 (100 ng) wurde als Matrize, zusammen mit 200 μM jedes Primers verwendet. Das sich ergebende vermehrte Produkt wurde vor der Insertion in den Δ33 Expressionsvektor weiter mit Bam HI und Sal I verdaut. Diese Manipulationen erzeugten eine Translationsfusion mit der Sequenz, wie in 5 gezeigt, die durch den λ pL Promotor reguliert wird.
C 600 C1⁺, galK^– Bakterien wurden mit der Ligationsmischung transformiert und auf LB-Amp Platten ausplattiert. Danach wurde eine Minipräparation der DNA durchgeführt (F. M. Ausubel et al., Hrsg., "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley, 1987), Abschnitt 1.6), gefolgt durch Schneiden des Plasmids mit den Enzymen Bam HI und Sal I, um zu bestimmen, ob das Plasmid das rekombinante DNase-Fragment enthielt. Plasmide der gewünschten Konstruktion wurden weiter in den AR120 Wirtsstamm transformiert. Diese Wirtszellen mit Plasmiden, welche die rekombinante DNase B umfassen, wurden dann einer Induktion gemäß dem Nalidixinsäureprotokoll ausgesetzt (Mott et al., supra). Kolonien, die den transformierten AR120 enthielten, wurden von den Agarplatten abgehoben, und damit wurde Superbroth (Basis: 12 g Trypton, 24 g Hefeextrakt, 5 ml Glycerol, 900 ml destilliertes H₂O; Salze pro Liter Basis: 1,7 g KH₂PO₄, 15,8 g K₂HPO₄ (wasserfrei), 100 ml destilliertes H₂O) plus 100 μg/ml Ampicillin angeimpft und bei 37°C wachsen gelassen, bis die optische Dichte der Kultur bei 650 nm gleich 0,4 war.
Danach wurde Nalidixinsäure zu der angeimpften Mischung, bis zu einer Endkonzentration von 60 μg/ml zugefügt. Die Kultur wurde bei 37°C für ungefähr 8 Stunden oder, als Alternative, über Nacht (ungefähr 16 Stunden) inkubiert. Alle Zellfraktionen wurden auf DNase B-Aktivität getestet, einschließlich des Überstands der Kultur, der mit Ultraschall behandelten Zellpellets, und der Überstände der mit Ultraschall behandelten Zellpellets.
Für die Übernacht-Induktion wurde DNase B außerhalb der E. coli Zellen sezerniert. Bei der 8 Stunden Induktion war das meiste der DNase B außerhalb der Zellen sezerniert, mit ungefähr 30% innerhalb, gewonnen aus dem mit Ultraschall behandelten Überstand. Die DNase B-Mengen waren groß genug, um durch Coomassie-Brilliant-Blau-Farbstoff auf Polyacrylamid-Gelelektrophorese sichtbar gemacht zu werden.
Beispiel 6
Reinigung von rekombinanter S. pyogenes DNase B, die in E. coli unter der Regulation des pL Promotors gebildet wurde
Eine Menge (6 Liter) eines rekombinanten DNase B-Klons wurde in Superbroth wachsen gelassen und über Nacht, wie in Beispiel 5 beschrieben, induziert. Der Überstand wurde geerntet und mit einem Pellicon Konzentrator unter Verwendung einer 10K Membran konzentriert; die Konzentration ergab ein Volumen von 600 ml.
Der konzentrierte Extrakt wurde gegen Heparin-Puffer A (20 mM HEPES, pH 7,9, 2 mM Dithiothreitol, 10 mM MgCl₂, 0,2 mM EDTA, 0,1 M NaCl, 10% Glycerol) dialysiert. Die Heparinsäule wurde beladen, laufen gelassen und wie in Beispiel 3 eluiert.
Das Eluat aus der Heparinsäule wurde in 20 mM Ethanolamin, pH 8,5 dialysiert. Kleine Mengen des fremden Proteins wurden aus der DNase B-Präparation durch Batchabsorption an Q-Sepharose absorbiert. Eine Menge Q-Sepharose (100 ml) wurde mit 20 nM Ethanolamin, pH 8,5, äquilibriert und dann zu 100 ml der Heparin DNAse B-Fraktion zugefügt. Die Q-Sepharose wurde für 20 Minuten bei 4°C in einem Batchverfahren an den Extrakt binden gelassen. Nach Bindung wurde die Q-Sepharose durch eine 0,45 um Filtrationseinheit gefiltert. Das Harz wurde schließlich mit 50 ml 20 mM Ethanolamin, pH 8,5 für 20 Minuten, vor der Abtrennung durch Zentrifugation, gewaschen. Die zwei Eluate aus diesem Verfahren wurden vereinigt und durch Reverse-Phase Chromatographie, Aminosäure-Sequenzierung und massenspektroskopische Analyse analysiert. Für die Reverse-Phase Chromatographie wurde 1 ml der gereinigten DNase B durch eine C4-Säule geschickt und bei 65% Puffer B in einem Volumen von 1 ml eluiert. Die gleichen Puffer wurden für die Reinigung der nativen DNase B in Beispiel 3 verwendet.
Die Aminosäuresequenz wurde unter Verwendung eines Beckman Mikrosequenzierungssystems 2020/Gold bestimmt. Die Aminosäuresequenz war R-Q-T-Q-V-S-N-D-V-V-L-N-D-G-A-S-K-Y-L-N-E-A-L-A-W-T-F-N-D-S-P-N-Y-Y-K-T-L-G (SEQ ID NR.: 6).
Beispiel 7
Präparation einer DNA-Sonde, die der aminoterminalen Sequenz des DNase B-Enzyms entspricht
Unter Verwendung des Codongebrauchs für hochexprimierte Gene in Darmbakterien aus dem VAX GCG Prgramm (Tabelle 1) wurde die folgende degenerierte Sonde hergestellt: C-A-P-U-A-C-N-C-A-R-T-N-W-S-N-A-A-Y-G-A-Y-G-T (SEQ ID NR.: 5). In dieser Sequenz ist R ein Purin (d. h. A oder G), Y ist ein Pyrimidin (T oder C), S ist G oder C, W ist A oder T, und N ist jede der vier allgemeinen Desoxyribonukleotide. Diese Sonde hybridisiert wirksam an den λgt11 Klon 2.6, was bestätigt, dass das native DNase B-Protein vom klonierten Gen abgeleitet wurde.
Beispiel 8
Inhibition von rekombinanter DNase B durch Anti-DNase B-Antikörper
Um zu zeigen, dass die rekombinante S. pyogenes DNase B in ihren Eigenschaften der natürlichen DNase B gleicht, wurde ein Immunoinhibitionsassay durchgeführt. Die rekombinante DNase B wurde mit kommerziell erhältlicher natürlicher DNase B in einem Inhibitionsassay, unter Verwendung von positivem, menschlichem Kontrollserum, das Anti-DNase B-Antikörper enthielt, verglichen. Der verwendete Assay basierte auf der Fähigkeit der DNase B einen DNA-Farbstoffkomplex als Substrat zu verwenden. Dieser Komplex zeigt eine maximale optische Absorption bei 642 nm. Wenn der DNA-Farbstoffkomplex jedoch durch die DNase abgebaut wird, gibt es eine Verschiebung in der maximalen Absorptionswellenlänge, und die Enzymaktivität wird durch eine Verringerung in der bei 642 nm gemessenen Absorption angezeigt. Wie in 6 gezeigt, wird das rekombinante Enzym in einer identischen Weise wie die natürliche S. pyogenes DNase B durch menschliches Serum inaktiviert, das Anti-DNase B-Enzym als Ergebnis einer Immunreaktion gegen die natürlich vorkommende S. pyogenes DNase B enthält.
Beispiel 9
Bestimmung, dass die Transkription des DNase B-Gens von einem Streptococcus Promotor im Δ2–6 Klon stattfindet
Wie in Beispiel 4 gezeigt, gab es einen hohen Grad an Expression des DNase B-Gens vom λ2–6 Klon. Um die Startstelle des starken bakteriellen Promotors, der für diese Expression verantwortlich ist, zu bestimmen, wurde ein in vitro Runoff-Transkriptionsassay unter Verwendung von E. coli RNA Polymerase durchgeführt. Dieser Assay ermöglicht es einem, die exakte Base des Transkriptionsstarts durch Vergleich der Längen eines transkriptionellen RNA-Runoffs mit einer Sanger-Didesoxysequenzierungsleiter zu bestimmen. Dieser Assay stellt einen guten Be weis für die Transkriptionsstartstelle in E. coli bereit. Der Vergleich mit den bekannten Transkriptionsstartstellen einer Vielzahl von Streptococcus bestätigt weiter, dass diese Stelle die Region ist, die für die Streptococcustranskription verantwortlich ist ("J. Ferretti & R. Curtiss, "Streptococcal Genetics" (1987), S. 293 ("Compilation of Nucleotide Sequences that Signal the Initiation of Transcription and Translation in Streptococci.")).
In einer Runoff-Transkriptionsreaktion erkennt die RNA Polymerase Promotorregionen und startet die Transkription. Das Enzym fällt schließlich vom Ende der Matrize, so dass dies eine Runoff-Transkription ist. Dies ist ein Standardverfahren zum Studieren von Transkriptionsstartstellen.
Ein PCR-Fragment, das die Stromaufwärtsregion des DNase B-Gens einschließt, wurde als Matrize für eine in vitro Runoff-Transkriptionsreaktion mit E. coli RNA Polymerase hergestellt. Unter Verwendung zweier Oligonukleotide, Oligonukleotid #246 an den Positionen 298 bis 280 und Oligonukleotid #267 (nicht in 3 gezeigt), wurde ein PCR DNA Produkt von ungefähr 290 Basenpaaren hergestellt, und das Fragment wurde nach Gelelektrophorese gereinigt. Die Runoff-Transkriptionsreaktion wurde in 30 mM Tris pH 8, 120 mM KCl, 4 mM MgCl₂, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 4 mM Spermidin, 0,4 mM ATP, 0,4 mM CTP, 0,4 mM GTP, 0,08 mM UTP, 80 Einheiten RNAsin (Promega), 1 Einheit RNA Polymerase (Promega) und 5 μl [³²P] UTP in einem Gesamtvolumen von 100 μl durchgeführt. Die Mischung wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Um die Reaktion abzustoppen, wurden 10 μl 0,5 M EDTA zugefügt.
Die Probe wurde verdünnt und auf einem Sequenzierungsgel elektrophoriert. Um die Größe des Transkripts genau zu bestimmen, wurde eine Sequenzierungsreaktion unter Verwendung von Oligonukleotid 246 an 2–6 DNA durchgeführt. Die Reaktion wurde unter Verwendung des GIBCO/BRL (Bethesda, MD) Cycle-Sequenzierungskits durchgeführt. Der Startpunkt der Sequenzierungsleiter ist der gleiche wie der Endpunkt des Runoff-Transkripts. Durch Analysieren des Transkriptionsprodukts zusammen mit der Sequenzierungsleiter in einem Harnstoff-Polyacrylamidgel wurde die Lage der Transkriptionsstartstelle bestimmt.
7 zeigt die DNA-Sequenz stromaufwärts vom offenen Leserahmen und die Konsensussequenz eines E. coli Promotors (D. K. Hawley & W. R. McClure, Nucl. Acids Res. 11: 2237–2255 (1983)). Die Tanskriptionsdaten legen nahe, dass es zwei mögliche Startstellen für die RNA Polymerase Position 96 und 97, gibt. Diese Stellen sind durch einen Stern in 7 gekennzeichnet. Die –35 und –10 Regionen sind unterstrichen.
Beispiel 10
Äquivalenz von gereinigter, rekombinanter S. pyogenes DNase B mit natürlicher DNase B bei Reaktion mit Anti-DNase-Antikörper in menschlichen Serumproben
Um zu zeigen, dass rekombinante DNase B in ihrer Reaktion mit Anti-DNase-Antikörper in menschlichen Serumproben im Wesentlichen mit natürlicher DNase B in Form der kommerziellen Streptonase B äquivalent ist, wurde das gereinigte DNase B-Enzym anstelle der kommerziellen Streptonase B im Streptonase B-Assay verwendet. Zehn Patientenproben von Boston Biomedica (Boston, MA) wurden unter Befolgung der Anleitungen, die im Streptonase B diagnostischen Kit bereitgestellt wurde, getestet. Die gleichen Proben wurden auch unter Verwendung von gereinigter rekombinanter DNase B, die verdünnt war, um ähnliche Nukleaseaktivität wie die rekonstituierte Streptonase B zu ergeben, ebenfalls getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt und sind in der Form einer Korrelationskurve in 8 aufgezeichnet.
TABELLE 2
ÄQUIVALENZ VON REKOMBINANTER DNASE B ZU ISOLIERTER DNASE B BEI DER BESTIMMUNG VON ANTI-DNASE B-ANTIKÖRPERTITER
Wie man sehen kann, ist die Korrelation zwischen den Ergebnissen unter Verwendung kommerzieller Streptonase B und der gereinigten, rekombinanten DNase sehr hoch. Daher reagiert gereinigte, rekombinante DNase B im Wesentlichen in der gleichen Weise mit Anti-DNase-Antikörpern, die im Serum gefunden werden, wie auch kommerzielle Streptonase B.
Beispiel 11
Fehlen der mitogenen Aktivität von gereinigter natürlicher DNase B
Um zu bestimmen, ob die gereinigte natürliche DNase B mitogene Aktivität in einem Mitogenassay mit menschlichen Lymphozyten aufweist, wurden verschiedene Fraktionen der gereinigten natürlichen S. pyogenes DNase B in einem Mitogenassay getestet, der ähnlich dem Verfahren ist, das von T. Yutsudo et al., "A New Type of Mitogenic Factor Produced by Streptococccus pyogenes," FEBS Lett. 308: 30–34 (1992) verwendet wurde. Für das Testen auf mitogene Aktivität von DNase B wurden menschliche Lymphozyten unter Verwendung eines Ficoll-Paque (Pharmacia)-Einschritt-Gradientenverfahrens isoliert, das wie durch den Hersteller beschrieben, durchgeführt wurde. Lymphozyten wurden in einer Mikrotiterplatte (96 Vertiefungen) in einer Konzentration von 10⁵ Zellen/Vertiefung ausplattiert. Nach drei Tagen Wachstum in einer angefeuchteten Atmosphäre: 37°C, 5% CO₂, wurde 1 μCi Tritium-markiertes Thymidin (Amersham, Arlington Heights, IL, bei 1 mCi/ml) zu jeder Vertiefung zugefügt. Nach zusätzlichen 24 Stunden Wachstum wurden die Zellen unter Verwendung von 20 μl 100 mM EDTA, gelöst in MEM Medium, mit 10% fötalem Kälberserum, in Glasröhrchen übertragen. Nach Waschen der Vertiefungen mit zusätzlichen 200 μl MEM mit 10% fötalem Kälberserum, wurden 500 μl 10% Trichloressigsäure (TCA) zu jedem Glasröhrchen zugefügt, um das eingebaute Tritium-markierte Thymidin auszufällen. Die TCA/Zellenmischung wurde auf Eis für 20 Minuten vor Filtration durch Glasfilter (Schleicher und Schuell, Keene, NH) inkubiert. Die Filter wurden weiter mit 5% TCA und 100% Ethanol, vor dem Trocknen und Zählen durch Szintillation, gewa schen. Concanavalin A (1 μg/ml bis 100 μg/ml, wie angegeben) wurde als eine positive Kontrolle für mitogene Aktivität verwendet.
Die Ergebnisse werden für E. coli DNase I, die Heparinsepharose-Fraktion von Beispiel 3, gereinigte Fraktionen I und II aus Beispiel 4, und die rekombinante S. pyogenes DNase B aus Beispiel 4, in 9 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl die gereinigten Fraktionen I und II, wie auch die rekombinante DNase B im Wesentlichen frei von mitogener Aktivität sind. Die Heparinsepharose-Fraktion wies nachweisbare mitogene Aktivität auf, die durch weitere Aufreinigung entfernt wurde. Dies zeigt, dass jede mitogene Aktivität nicht im DNase B-Protein vorhanden war, sondern in einer oder mehreren Kontaminationen.
Beispiel 12
Konstruktion eines Vektors der DNase B in E. coli exprimiert, die identisch zur nativen DNase B prozessiert wird
Das genetische Konstrukt, das in Beispielen 5 und 6 beschrieben ist, bildete ein rekombinantes DNase Protein in E. coli, das sich von dem natürlichen DNase B Protein dadurch unterschied, dass das Protein an einer Aminosäure prozessiert wurde, die eine Aminosäure aufwärts von der natürlichen Prozessierungsstelle lag. Um eine rekombinante DNase B in E. coli zu produzieren, die absolut identisch zur vollständig prozessierten und natürlichen DNase B ist, wurde ein genetisches Konstrukt hergestellt, das dieses "extra" Arginin bei Aminosäure 43 (Ala-Arg-Gln-Thr-Gln-Val) deletiert. Dieses Konstrukt wurde unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt, um modifizierte Enden an das DNase B-Gen im λ 2–6 Klon einzubauen. Die folgenden Oligonukleotide wurden entworfen und auf dem Pharmacia Gene Assembler Plus DNA Synthesegerät, unter Befolgung der Empfehlungen des Herstellers, synthetisiert:

A. 5'-A-G-G-C-A-A-T-G-G-A-T-C-C-G-A-A-C-C-T-G-C-T-G-G-G-T-T-C-C-C-G-T-C-G-T-G-T-T-T-T-C-T-C-C-A-A-A-A-A-A-T-G-C-C-G-T-C-T-G-G-T-T-A-A-A-T-T-C-T- CC-A-T-G-G-T-T-G-C-T-C-T-G-G-T-T-T-C-C-G-C-T-A-C-C-A-T-G-G-C-T-G-T-T-A-C-C-A-C-C-G-T-T-A-C-C-C-T-G-G-A-A-A-A-C-A-C-C-G-C-T-C-T-G-G-C-T-C-A-G-A-C-A-C-A-G-G-T-C-T-C-A-A-A-T-G-A-T-G-T-T-G-T-T-C-T-A-A-A-T-G-A-T-G-G-C-G-C-A-A-G-C-3' (SEQ ID NR.: 12)
B. 3'-T-C-T-T-T-T-C-G-T-T-A-C-T-A-A-C-G-G-C-A-G-T-A-A-C-G-G-G-G-C-C-C-A-G-C-T-G-G-G-C-C-S' (SEQ ID NR.: 13)

Diese Oligonukleotide wurden als Primer in einer PCR-Reaktion, unter Verwendung des AmpliTaq Kits (Perkin-Elmer-Cetus, Norwalk, CT) gemäß den Anweisungen des Herstellers, verwendet. Die Endkonzentration von MgCl₂ wurde auf 4 mM eingestellt, und eine 20 Zyklenreaktion wurde (37°C, 2 Minuten; 72°C, 3 Minuten; 95°C, 2 Minuten) unter Verwendung des Perkin-Eimer 480 Thermocyclers, durchgeführt. DNA des λgt11 Klons 2–6 (100 ng) wurde als Matrize, zusammen mit 200 μM jedes Primers, verwendet. Das sich ergebende vermehrte Produkt wurde weiter mit Bam HI und Sal I vor der Insertion in den Δ33 Expressionsvektor verdaut. Diese Manipulation erzeugte eine Translationsfusion mit der Sequenz wie in 10 gezeigt (SEQ ID NR.: 14), die durch den λ pL Promotor reguliert wird.
C 600 C1+, gal K-Bakterien wurden mit der Ligationsmischung transformiert und auf LB-Amp Platten plattiert. Danach wurde eine Minipräparation von DNA gemacht (F. M. Ausubel et al., Hrsg., "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley, 1987), Abschnitt 1.6), gefolgt durch Schneiden des Plasmids mit den Enzymen Bam HI und Sal I, um zu bestimmen, ob das Plasmid das rekombinante DNase B-Fragment enthält. Plasmide des gewünschten Konstrukts wurden weiter in den AR 120 Wirtsstamm transformiert. Diese Wirtszellen mit Plasmiden, welche die rekombinante DNase B umfassen, wurden dann einer Induktion gemäß dem Nalidixinsäureprotokoll ausgesetzt (Mott et al., supra). Kolonien, welche die transformierten AR120 umfassten, wurden von den Agarplatten abgehoben und in Superbroth angeimpft (Basis: 12 g Hefeextrakt, 5 ml Glycerol, 900 ml destilliertes H₂O; Salze pro Liter Basis: 1,7 g KH₂PO₄ und 15,8 g K₂HPO₄ wasserfrei in 100 ml deionisiertem H₂O plus 100 μg/ml Ampicillin) und bei 37°C wachsen gelassen, bis die optische Dichte der Kultur bei 600 nm gleich 0,4 war.
Danach wurde Nalidixinsäure zur angeimpften Mischung bis zu einer Endkonzentration von 60 μg/ml zugefügt. Die Kultur wurde bei 37°C für ungefähr 8 Stunden oder, als Alternative, über Nacht (ungefähr 16 Stunden) inkubiert. Alle Zellfraktionen wurden auf DNase B-Aktivität getestet, einschließlich des Überstands der Kultur, der mit Ultraschall behandelten Zellpellets und der Überstände der mit Ultraschall behandelten Zellpellets. Bei der Übernacht-Induktion wurde DNase B außerhalb der E. coli Zelle sezerniert. Die Mengen an DNase B waren hoch genug, um durch Coomassie-Färbung auf Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) sichtbar gemacht zu werden. Ein IEF (3–9)-Gel wurde laufen gelassen und mit Silber gefärbt. Im Vergleich zum vorherigen Klon unter dem pL Promotor gab es eine klare Verschiebung des pI auf die mehr saure Seite.
Beispiel 13
Reinigung des Arginin-Deletionskonstrukts und Aminosäure-Sequenzanalyse
Das Züchten und Reinigen des in Beispiel 12 beschriebenen rekombinanten DNase B-Klons, wurde wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt. Die Aminosäuresequenz wurde unter Verwendung eines Beckman Mikrosequenzierungssystems 2020/Gold bestimmt. Die Aminosäuresequenz wurde als Q-T-Q-V-S-N-D-V-V-L-N-D-G-A-S-K-Y-L-N-E-A-L-A-W-T-F-N-D-S-P-N-Y (SEQ ID NR.: 16) bestimmt. Diese Sequenzanalyse zeigt, dass das Spaltungsprodukt des Arginin-deletierten Konstrukts zum natürlichen in Streptococcus pyogenes gebildeten DNase B-Protein identisch ist.
Beispiel 14
Kopplung von DNase B an Carboxylat-Latexpartikel
Zukünftiges Beispiel
Carboxylat-Latexpartikel (Interfacial Dynamics Corp.) werden an DNase B gekoppelt. Die Partikel werden als Carboxylat-Latexpartikel mit hoher Dichte beschrieben. Die Latexpartikel liegen typischerweise als ungefähr 4% Feststoff in destilliertem Wasser vor, das frei von Benetzungsmitteln ist. Sowohl die Partikel mit 29 nm als auch die mit 17 nm Durchmesser können verwendet werden.
Latexpartikel (5 ml) werden 2 × mit 0,1 M Natriumbicarbonat Puffer, pH 7,75 verdünnt. Die Carboxylgruppen der Latexpartikel werden auf Eis unter Rühren unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC) aktiviert. Eine 20 mg/ml EDAC Lösung wird hergestellt und zu den Latexpartikeln bis zu einer Endkonzentration von 10 mM unter konstantem Rühren zugefügt. Nach Zugabe des EDAC wird N-Hydroxysuccinimid (NHS) (80 mg/ml Lösung) bis zu einer Endkonzentration von 70 mM zugefügt. Die Latexpartikellösung wird nach Zugeben der Kopplungsreagenzien trübe. Die Lösung wird dann für 1 Stunde auf Eis gerührt.
Die überschüssigen Reagenzien werden durch Zentrifugation in einer Beckman J2-21M, JA 20 Rotor bei 18.000 UpM für 30 Minuten bei 10°C entfernt. Der Überstand wird dekantiert. Die Latexpartikel werden in 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) resuspendiert, die 1% Tween-20 und 5 mg/ml rekombinante DNase B enthält. Kleine Klümpchen werden durch sanfte Ultraschallbehandlung für ungefähr 1 bis 2 Minuten mit einem Heat Systems-Ultrasonics Inc. Ultraschallgerät, Modell W-385, dispergiert. Die Einstellung steht auf 2 bei Verwendung einer Mikrospitze. Die Reaktionsmischung wird leicht bei Raumtemperatur für ungefähr 20 Stunden bewegt.
Die nicht gebundene DNase B wird durch Ultrazentrifugation in einer Beckman L8-70, Ti60 Rotor, bei 30.000 UpM für 30 Minuten entfernt. Der Überstand wird entfernt. Die Latexpartikel werden in 10 ml PBS resuspendiert. Kleine Klümpchen werden durch Ultraschallbehandlung, bei der gleichen Einstellung wie oben, für ungefähr 1 bis 2 Minuten dispergiert. Das PBS wird durch Ultrazentrifugation, wie oben beschrieben, entfernt. Die gewaschenen Latexpartikel werden in 10 ml PBS plus 0,01% Natriumazid resuspendiert. Als Alternative kann nicht gebundene DNase B durch Größenausschluss-Chromatographie entfernt werden. Die Endstammlösung von DNase B-Latexpartikeln (ungefähr 2%) wird bei 4°C, bis zur weiteren Verdünnung zur Verwendung in einem Assay, gelagert.
VORTEILE DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Erlangen von hoch gereinigtem S. pyogenes DNase B-Enzym bereit, ohne die Notwendigkeit große Mengen von S. pyogenes in einem teuren und risikoreichen Verfahren zu züchten. Das Enzym kann erlangt werden, ohne dass man es von anderen Proteinen von S. pyogenes reinigen muss; vielmehr kann das Enzym aus rekombinanten Phagen-infizierten Escherichia coli oder von E. coli, die mit einem entsprechenden Expressionsvektor transfiziert wurden, aufgereinigt werden. Der Expressionsvektor kann so gewählt werden, dass die Expression optimiert wird.
Die S. pyogenes DNase B kann dann dazu verwendet werden, auf Anti-DNase B-Antikörper in Serum zu testen, in einem Assay, der spezifisch für DNase B ist. Insbesondere ermöglicht das Vorhandensein von gereinigter DNase B die Verwendung eines ELISA-Assays unter Verwendung von gereinigtem Enzym, das an die Festphase absorbiert ist, was einen Assay darstellt, der für eine breite Verwendung geeignet und leicht und bequem auszuführen ist. Der Assay ist auch von hoher Sensitivität und Spezifität. Solch ein Assay ist besonders für eine klinische Verwendung zum Nachweisen einer S. pyogenes Infektion geeignet.
Obwohl die vorliegende Erfindung mit Hinblick auf bestimmte bevorzugte Versionen davon in beträchtlichem Detail beschrieben wurde, sind andere Versionen möglich.
SEQUENCE LISTING

Claims

Genetisches Konstrukt der DNA-Sequenz für Streptococcus pyogenes DNase B, das ein Protein mit der Aminosäuresequenz von 4 kodiert, wobei das Arginin (R) am Aminoende des Proteins deletiert ist.
Expressionsvektor für das Streptococcus pyogenes DNase B-Enzym, umfassend die DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die mit mindestens einer mit einer geeigneten bakteriellen Wirtszelle kompatiblen Kontrollsequenz funktionell verknüpft ist.
Vektor nach Anspruch 2, wobei die das Streptococcus pyogenes DNase B-Enzym kodierende DNA-Sequenz mit mindestens einer Sequenz von Bakteriophage λ verknüpft ist.
Bakterielle Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 2 derart transformiert ist, daß es der transformierten bakteriellen Wirtszelle ermöglicht wird, Streptococcus pyogenes DNase B, welche durch die rekombinante, in den Expressionsvektor nach Anspruch 2 eingebaute DNA kodiert wird, in einer nachweisbaren Menge zu exprimieren.
Verfahren zum Herstellen von im wesentlichen gereinigtem Streptococcus pyogenes DNase B-Enzym, welches (a) das Züchten der bakteriellen Wirtszelle nach Anspruch 4, (b) das Verwenden der gezüchteten bakteriellen Wirtszelle zur Expression des DNase B-Enzyms und (c) das Reinigen des Enzyms von der gezüchteten bakteriellen Wirtszelle umfaßt.
Transkriptionsfusion, umfassend die rekombinante, mit einem weiteren Gen fusionierte Strepfococcus pyogenes DNase B DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die Fusion eine nachweisbare, von der Eigenschaft der Sequenz nach Anspruch 1 veränderte oder von der Eigenschaft des von der Sequenz nach Anspruch 1 kodierten Proteins veränderte Eigenschaft aufweist, wobei die veränderte Eigenschaft aus der Gruppe, bestehend aus (1) hochgradiger RNA-Expression, (2) hochgradiger Protein-Expression, (3) einem zweiten funktionellen Enzym, Rezeptor oder anderen aktiven Protein in der Fusion, (4) einer Fusion der DNase B an einen Affinitätsliganden, (5) der Herstellung eines Proteins mit einem höheren Molekulargewicht und (6) einer erhöhten Immunreaktivität, ausgewählt ist.
Translationsfusion, umfassend das von der Streptococcus pyogenes DNase B rekombinanten DNA-Sequenz nach Anspruch 1 kodierte, mit einem weiteren Protein fusionierte Protein, wobei die Fusion eine nachweisbare, von der Eigenschaft der Sequenz nach Anspruch 1 veränderte oder von der Eigenschaft des von der Sequenz nach Anspruch 1 kodierten Proteins veränderte Eigenschaft aufweist, wobei die veränderte Eigenschaft aus der Gruppe, bestehend aus (1) hochgradiger RNA-Expression, (2) hochgradiger Protein-Expression, (3) einem zweiten funktionellen Enzym, Rezeptor oder anderen aktiven Protein in der Fusion, (4) einer Fusion der DNase B an einen Affinitätsliganden, (5) der Herstellung eines Proteins mit einem höheren Molekulargewicht und (6) einer erhöhten Immunreaktivität, ausgewählt ist.
Verfahren zum Nachweisen und/oder Bestimmen eines Anti-Streptococcus pyogenes DNase-Antikörpers in einer Testprobe, welches die Schritte (a) des Bindens eines durch das Verfahren nach Anspruch 5 erzeugten Streptococcus-pyogenes DNase-Enzyms nach Anspruch 4 an einen festen Träger, (b) des Reagierens einer Testprobe, die unter dem Verdacht steht, Anti-S. pyogenes DNase B-Antikörper zu enthalten, mit dem an einen festen Träger gebundenen S. pyogenes DNase B-Enzym, um den Antikörper an das Enzym und somit an den festen Träger zu binden, und (c) des Nachweisens des an den festen Träger gebundenen Antikörpers zum Nachweisen und/oder zum Bestimmen des Antikörpers in der Testprobe, umfaßt.
Verfahren zum Nachweisen und/oder Bestimmen eines Anti-Streptococcus pyogenes DNase B-Antikörpers in einer Testprobe, welches die Schritte (a) des Bereitstellens einer Testprobe, die unter Verdacht steht, Anti-S. pyogenes DNase B-Antikörper zu enthalten, (b) des Hinzufügens einer Menge des nach dem Verfahren nach Anspruch 5 erzeugten S. pyogenes DNase B-Enzyms nach Anspruch 4 zur Testprobe, wobei die Menge ausreichend ist, um einen nachweisbaren Grad enzymatischer Aktivität bei Fehlen einer Inhibition der enzymatischen Aktivität durch den Anti-DNase B-Antikörper in der Testprobe herzustellen, und (c) des Bestimmens eines Grades der Aktivität des DNase B-Enzyms in der Testprobe durch das Durchführen eines Enzym-Assays zum Nachweisen und/oder Bestimmen des Anti-S. pyogenes DNase B- Antikörpers in der Testprobe umfaßt.
Verfahren zum Nachweisen und/oder Bestimmen eines Anti-Streptococcus pyogenes DNase B-Antikörpers in einer Testprobe, welches die Schritte (a) des Herstellens einer gepufferten Lösung des mit dem Verfahren nach Anspruch 5 erzeugten DNase B-Enzyms nach Anspruch 4, (b) des Reagierens der gepufferten DNase B-Lösung mit der Testprobe, die unter Verdacht steht, Anti-S. pyogenes DNase B-Antikörper zu enthalten, und (c) des Nachweisens einer Reaktion zwischen der DNase B und dem Anti-DNase B-Antikörper durch Beobachten und/oder Messen einer Veränderung der Lichtabsorption oder der Lichtstreuung in der Lösung umfaßt.
Impfstoff zum Immunisieren eines Säugers gegen eine Infektion mit S. pyogenes, umfassend eine Menge von gereinigtem S. pyogenes DNase B-Enzym, die zum Stimulieren der Erzeugung von für S. pyogenes DNase B spezifischen Antikörpern ausreicht, wobei das gereinigte S. pyogenes DNase B-Enzym von der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 kodiert wird.
Impfstoff zum Immunisieren eines Säugers gegen eine Infektion mit S. pyogenes, umfassend eine Menge von gereinigtem S. pyogenes DNase B-Enzym, die zum Stimulieren der Erzeugung von für S. pyogenes DNase B spezifischen Antikörpern ausreicht, wobei das gereinigte S. pyogenes DNase B-Enzym, das ist, welches durch (a) das Züchten einer bakteriellen Wirtszelle, die mit einem die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 umfassenden Expressionsvektor für das Streptococcus pyogenes DNase B-Enzym transformiert ist, wobei die DNA-Sequenz mit mindestens einer mit der bakteriellen Wirtszelle kompatiblen Kontrollsequenz derart funktionell verknüpft ist, daß es der transformierten bakteriellen Wirtszelle ermöglicht wird, Streptococcus pyogenes DNase B, welche durch die rekombinante, in den Expressionsvektor eingebaute DNA kodiert wird, in einer nachweisbaren Menge zu exprimieren, (b) das Verwenden der gezüchteten bakteriellen Wirtszelle zur Expression des DNase B-Enzyms und (c) das Reinigen des Enzyms von der gezüchteten bakteriellen Wirtszelle erhältlich ist.
Impfstoff zum Immunisieren eines Säugers gegen eine Infektion mit S. pyogenes, umfassend eine Menge von gereinigter S. pyogenes DNase B, die zum Stimulieren der Erzeugung von für S. pyogenes DNase B spezifischen Antikörpern ausreicht, wobei das gereinigte S. pyogenes DNase B-Enzym das Protein ist, das unter Verwendung des genetischen Konstrukts nach Anspruch 1 in einem geeigneten Expressionsvektor erhältlich ist.
Arzneimittelverabreichung, umfassend ein enzymatisch aktives DNase B-Enzym und Mittel zur Generierung eines ein enzymatisch aktives DNase B-Enzym enthaltendes Aerosols zur Verwendung für das Behandeln einer zystischen Fibrose in einem Patienten mit zystischer Fibrose, umfassend die Zuführung des Aerosols in einer zur Reduktion der Lungenflüssigkeitsviskosität in dem Patienten ausreichenden Menge, wobei das gereinigte S. pyogenes DNase B-Enzym von der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 kodiert wird.
Arzneimittelverabreichung, umfassend ein enzymatisch aktives DNase B-Enzym und Mittel zur Generierung eines ein enzymatisch aktives DNase B-Enzym enthaltendes Aerosols zur Verwendung für das Behandeln einer zystischen Fibrose in einem Patienten mit zystischer Fibrose, umfassend die Zuführung des Aerosols in einer zur Reduktion der Lungenflüssigkeitsviskosität in dem Patienten ausreichenden Menge, wobei das gereinigte S. pyogenes DNase B-Enzym das ist, welches durch (a) das Züchten einer bakteriellen Wirtszelle, die mit einem die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 umfassenden Expressionsvektor für das Streptococcus pyogenes DNase B-Enzym transformiert ist, wobei die DNA-Sequenz mit mindestens einer mit der bakteriellen Wirtszelle kompatiblen Kontrollsequenz derart funktionell verknüpft ist, daß es der transformierten bakteriellen Wirtszelle ermöglicht wird, Streptococcus pyogenes DNase B, welche durch die rekombinante, in den Expressionsvektor eingebaute DNA kodiert wird, in einer nachweisbaren Menge zu exprimieren, (b) das Verwenden der gezüchteten bakteriellen Wirtszelle zur Expression des DNase B-Enzyms und (c) das Reinigen des Enzyms von der gezüchteten bakteriellen Wirtszelle erhältlich ist.