MX2014009512A - Translocaciones de la r-espondina y sus metodos de uso. - Google Patents

Abstract

Se proveen terapias relacionadas con el tratamiento de condiciones patológicas, tales como cáncer.

Description

TRANSLOCACIONES DE LA R-ESPONDINA Y SUS MÉTODOS DE USO REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio bajo el Código Estadounidense 35 § 119 de la Solicitud de Patente Estadounidense N.° 61/597.746, presentada el 11 de febrero de 2012 y de la N.° 61/674.763, presentada el 23 de julio de 2012, que se incorporan en la presente en su totalidad por referencia.

LISTADO DE SECUENCIAS La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias presentado mediante EFS-Web y que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. Dicha copia de ASCII, creada el 1 de febrero de 2013, lleva el nombre de P4853R1AR_Sequence_Listing.txt y tiene un tamaño de 58.973 bytes.

CAMPO Se proveen terapias relacionadas con el tratamiento de afecciones patológicas, tales como cáncer.

ANTECEDENTES El cáncer colorrectal (CRC, por sus siglas en inglés Colorectal ????ß? con más de 100.000 casos nuevos informados anualmente, es el cuarto cáncer más frecuente y representa más de 50.000 muertes al año en los Estados Unidos (Siegel, R- et al. , CA: A Cáncer Journal for Clinicians 61 :212-236 (2011 )). Aproximadamente 15% de los CRCs exhiben inestabilidad microsatelital (MSI, del inglés Microsatellite Instability) que se genera a partir de los defectos en el sistema de reparación por apareamiento incorrecto de ADN (MMR, del inglés Mismatch Repa/'r) (Fearon, E. R., Annu. Rev. Pathol. 6:479-507 (2011)). El otro -85% de los CRCs con estabilidad microsatelital (MSS) son el resultado de la inestabilidad cromosómica (CIN, del inglés Chromosomal Instability) (Fearon, E. R., Annu. Rev. Pathol. 6:479-507 (2011)). Los estudios genómicos han identificado la adquisición de mutaciones en genes tales como APC, KRAS y TP53 durante el progreso del CRC (Fearon, E. R., Annu. Rev. Pathol. 6:479-507 (2011)). El secuenciamiento de exones de codificación de proteínas en cáncer de colon y genomas completos en un número reducido de muestras ha identificado varias mutaciones adicionales y variantes estructurales cromosómicas que posiblemente contribuyan a la oncogénesis (Wood, L. D. et al., Science 318:1108-111 j3 (2007); Timmermann, B. et al., PloS One 5:e15661 (2010)). No obstante, exámenes recientes de mutagénesis de inserción en modelos de cáncer de colon en ratones sugirieron la participación de genes y vías adicionales en el desarrollo del CRC (Starr, T. K. et al., Science 323:1747-1750 (2009); March, H. N. et ai, Nat. Genet. 43:1202-1209 (201 1)).

Persiste la necesidad de comprender de mejor modo la patogénesis de los cánceres; en particular, cánceres de colon en humanos, y también identificar nuevos blancos terapéuticos.

SÍNTESIS La invención provee antagonistas de la vía wnt que incluyen antagonistas de la translocación de la R-espondina y métodos para usar los mismos.

En la presente se proveen métodos para inhibir la proliferación celular de una célula cancerosa que comprende poner en contacto la célula cancerosa con una cantidad efectiva de un antagonista de la translocación de la R-espondina. En la presente también se proveen métodos para tratar cáncer en un individuo que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de la translocación de la R-espondina. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, el cáncer o la célula cancerosa comprende una translocación de la R-espondina.

En la presente se proveen métodos para tratar cáncer en un individuo, que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de la vía wnt, en donde el tratamiento se basa en que el individuo tiene cáncer que comprende una translocación de la R-espondina. En la presente se proveen métodos para tratar una célula cancerosa, en donde la célula cancerosa comprende una translocación de la R-espondina, y en donde el método comprende proveer una cantidad efectiva de un antagonista de la vía wnt. También se proveen en la presente métodos para tratar cáncer en un individuo siempre que se haya encontrado que el individuo tiene cáncer que comprende una translocación de la R-espondina, donde el tratamiento comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de la vía wnt.

Asimismo, en la presente se proveen métodos para tratar cáncer en un individuo; dicho método comprende: determinar que una muestra obtenida del individuo comprende una translocación de la R-espondina, y administrar una cantidad efectiva de una terapia anticáncer que comprende un antagonista de la vía wnt al individuo, mediante la cual el cáncer es tratado.

En la presente se proveen métodos para tratar cáncer, que comprenden: (a) seleccionar un individuo que tiene cáncer, en donde el cáncer comprende una translocación de la R-espondina; y (b) administrar al individuo seleccionado de esta manera una cantidad efectiva de un antagonista de la vía wnt, mediante la cual el cáncer es tratado.

En la presente también se proveen métodos para identificar un individuo con cáncer que tiene más posibilidades o menos posibilidades de beneficiarse del tratamiento con una terapia anticáncer que comprende un antagonista de la vía wnt, donde el método comprende: determinar la presencia o ausencia de una translocación de la R-espondina en una muestra obtenida del individuo, en donde la presencia de la translocación de la R-espondina en la muestra indica que el individuo tiene más posibilidades de beneficiarse del tratamiento con la terapia anticáncer que comprende el antagonista de la vía wnt o la ausencia de la translocación de la R-espondina indica que el individuo tiene menos posibilidades de beneficiarse del tratamiento con la terapia anticáncer que comprende el antagonista de la vía wnt. En algunas formas de realización, el método además comprende administrar una cantidad efectiva de la terapia anticáncer que comprende un antagonista de la vía wnt.

En la presente se proveen métodos para predecir si un individuo con cáncer tiene más o menos posibilidades de responder de manera efectiva al tratamiento con una terapia anticáncer que comprende un antagonista de la vía wnt, donde el método comprende determinar una translocación de la R-espondina, por lo cual la presencia de la translocación de la R-espondina indica que el individuo tiene más posibilidades de responder de manera efectiva al tratamiento con el antagonista de la vía wnt y la ausencia de la translocación de la R-espondina indica que el individuo tiene menos posibilidades de responder de manera efectiva al tratamiento con el antagonista de la vía wnt. En algunas formas de realización, el método además comprende administrar una cantidad efectiva de la terapia anticáncer que comprende un antagonista de la vía wnt.

En la presente también se proveen métodos para predecir la respuesta o falta de respuesta de un individuo con cáncer a una terapia anticáncer que comprende un antagonista de la vía wnt que comprende detectar en una muestra obtenida del individuo la presencia o ausencia de una translocación de la R-espondina, en donde la presencia de la translocación de la R-espondina predice la respuesta del individuo a la terapia anticáncer que comprende el antagonista de la vía wnt y la ausencia de la translocación de la R-espondina predice la falta de respuesta del individuo a la terapia anticáncer que comprende el antagonista de la vía wnt. En algunas formas de realización, el método además comprende administrar una cantidad efectiva de la terapia anticáncer que comprende un antagonista de la vía wnt.

En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, la translocación de la R-espondina es una translocación de RSP01 , translocación de RSP02, translocación de RSP03 y/o translocación de RSP04. En algunas formas de realización, la translocación de la R-espondina es una translocación de RSP02. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 comprende EIF3E y RSP02. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 comprende exón 1 de EIF3E y exón 2 de RSP02. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 comprende exón 1 de EIF3E y exón 3 de RSP02. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 comprende la SEC ID NO: 71 En algunas formas de realización, la translocación de la R-espondina es una translocación de RSPO3. En algunas formas de realización, la translocación de RSPO3 comprende PTPRK y RSP03. En algunas formas de realización, la translocación de RSPO3 comprende exón 1 de PTPRK y exón 2 de RSP03. En algunas formas de realización, la translocación de RSPO3 comprende exón 7 de PTPRK y exón 2 de RSP03. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 comprende la SEC ID NO: 72 y/o la SEC ID NO: 73. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, la translocación de la R-espondina se detecta a nivel cromosómico (por ejemplo, FISH), nivel de ADN, nivel de ARN (por ejemplo, transcripto de fusión de translocación de RSP01), y/o nivel proteico (por ejemplo, polipéptido de fusión de translocación de RSPO1).

En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, el cáncer es cáncer colorrectal. En algunas formas de realización, el cáncer es cáncer de colon o cáncer rectal. 1) En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, el antagonista de la vía wnt es un anticuerpo, polipéptido de unión, molécula pequeña, o polinucleótido. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía wnt es un antagonista de la R-espondina. En algunas formas de realización, el antagonista de la R-espondina es un antagonista de la RSPO1, antagonista de la RSPO2, antagonista de la RSPO3, y/o antagonista de la RSPO4. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía wnt es un anticuerpo monoclonal aislado que une R-espondina. En algunas formas de realización, la R-espondina es RSPO2 y/o RSPO3. En algunas formas de realización, el antagonista de la R-espondina es un antagonista de la translocación de la R-espondina. En algunas formas de realización, el antagonista de la translocación de la R-espondina une un polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO1-, polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO2, polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSP03 y/o polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO4. En algunas formas de realización, el antagonista de la translocación de la R-espondina une un polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO2. En algunas formas de realización, el polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO2 comprende EIF3E y RSP02. En algunas formas de realización, el polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO2 comprende exón 1 de EIF3E y exón 2 de RSP02. En algunas formas de realización, el polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO2 comprende exón 1 de EIF3E y exón 3 de RSP02. En algunas formas de realización, el polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO2 comprende la SEC ID NO: 71. En algunas formas de realización, polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la R-espondina es un polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO3. En algunas formas de realización, el polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO3 comprende PTPRK y RSP03. En algunas formas de realización, el polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSP03 comprende exón 1 de PTPRK y exón 2 de RSP03. En algunas formas de realización, el polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO3 comprende exón 7 de PTPRK y exón 2 de RSP03. En algunas formas de realización, el polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO3 comprende la SEC ID NO: 72 y/o la SEC ID NO: 73. En algunas formas de realización, el método además comprende un agente terapéutico adicional.

En la presente, se proveen antagonistas de la translocación de la R-espondina aislados, en donde el antagonista de la translocación de la R-espondina es un anticuerpo, polipéptido de unión, molécula pequeña, o polinucleótido. En algunas formas de realización, el antagonista de la translocación de la R-espondina une un polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO1, polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO2, polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO3 y/o polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO4. En algunas formas de realización, el antagonista de la translocación de la R-espondina une un polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO2. En algunas formas de realización, el polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO2 comprende EIF3E y RSP02. En algunas formas de realización, el polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO2 comprende exón 1 de EIF3E y exón 2 de RSP02. En algunas formas de realización, el polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO2 comprende exón 1 de EIF3E y exón 3 de RSP02. En algunas formas de realización, el polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO2 comprende la SEC ID NO: 71. En algunas formas de realización, el polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la R- espondina es un polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSP03. En algunas formas de realización, el polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSP03 comprende PTPRK y RSP03. En algunas formas de realización, el polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSP03 comprende exón 1 de PTPRK y exón 2 de RSP03. En algunas formas de realización, el polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO3 comprende exón 7 de PTPRK y exón 2 de RSP03. En algunas formas de realización, el polipéptido y/o polinucleótido de fusión de translocación de la RSP03 comprende la SEC ID NO: 72 y/o la SEC ID NO: 73.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1A La activación de un exón 5' alternativo novedoso de MRPL33 de manera específica a nivel tumoral altera el extremo N-terminal de MRPL33 y alarga la proteína. Figura 1B El diagrama muestra los recuentos leídos para el exón corriente arriba normalizado por el número total de lecturas en alineación con MRPL33 para cada muestra. Figura 1C También se ilustra la evidencia de una región promotora de MRPL33 corriente arriba alternativa que muestra H3K27Ac mediante marcación por visualizador de genoma de USCS así como también un mapeo de EST en el exón corriente arriba. Secuencia de aminoácidos de MRLP33 MFLSAVFF A S SWETKSPLRGKEKNTLPLNGGLKMTLIYKEKTEGG DTDSEIL (SEC ID NO: 9); Secuencia de aminoácidos promotora alternativa de MRLP33 MMAHLDFFLTYKWRAPKSKSLDQLSPNFLLRGRS ETKSPLRGKEKNTLPLNGGLKMTLIYKEKTEGGDTDSEIL (SEC ID NO: 10).

Figura 2A-E Translocaciones de la R-espondina alternativas. (Fig.2A) Lista del tipo y la frecuencia de las fusiones génicas de la R-espondina en cáncer de colon. (Fig.2B) Esquema que ilustra la ubicación, orientación y arquitectura exón-intrón de la fusión de EIF3E-RSP02 en el genoma. Se muestra la evidencia de lectura para la fusión de EIF3E(e1)-RSP02(e2) identificada usando datos de ARN-sec. (Fig.2C) Productos derivados de RT-PCR independientes que confirman la fusión somática de EIF3E-RSP02 resuelta sobre gel de agarosa. Los productos de RT-PCR se secuenciaron según Sanger para confirmar la unión de la fusión, y se presenta un cromatograma representativo relevante. (Fig.2D) Esquema de la proteína de fusión de EIF3E-RSP02 resultante. (Fig.2E) Tumores que alojan fusiones de R-espondina muestran expresión elevada del correspondiente gen RSPO en un gráfico. La Figura 2A-E revela las SEC ID NOS 85-92 y 71, respectivamente, por orden de aparición.

Figura 3A-C Recurrencia de la fusión génica de PTPRK-RSP03. (Fig.3A) Esquema que ilustra la ubicación, orientación y arquitectura exón-intrón de la fusión de la fusión génica de PTPRK-RSP03 en el genoma. Se muestra la evidencia de lectura para la fusión de PTPRK(e1)-RSP03(e2) identificada usando datos de ARN-sec. (Fig.3B) Productos derivados de RT-PCR independientes que confirman la fusión somática de PTPRK-RSP03 resuelta sobre gel de agarosa. Los productos de RT-PCR se secuenciaron según Sanger para confirmar la unión de la fusión, y se presenta un cromatograma representativo relevante. (Fig.3C) Esquema de PTPRK, RSP03 y la proteína de fusión de PTPRK-RSP03 resultante. La Figura 3A-C revela las SEC ID NOS 93-99 y 72, respectivamente, por orden de aparición.

Figura 4A fusión de PTPRK(e7)-RSP03{e2). (Fig.4B) Gel que muestra la validación de esta fusión por RT-PCR. (Fig.4C) Diagrama esquemático de las proteínas nativas y de fusión. La Figura 4A-C revela las SEC ID NOS 100-104 y 73, respectivamente, por orden de aparición.

Figura 5A-E Los productos de fusión de RSPO activan la señalización de Wnt.

(Fig.5A) Proteínas de fusión de RSPO segregadas detectadas mediante análisis Western blot en medios de células 293T transfectadas con constructos de expresión que codifican las proteínas de fusión. El producto esperado es RSPO 1-387. (Fig.5B y 5C) Las proteínas de fusión de RSPO activan y potencian la señalización de Wnt según se mide usando un ensayo de luciferasa como reportero. Los datos que se exhiben son de los medios de condición derivados de las células transfectadas con los constructos de expresión o directamente transfectadas en la célula junto con el constructo reportero. Se ilustran los datos representativos de al menos tres experimentos. (Fig.5D) Esquema que representa la activación de la vía de señalización de Wnt mediada por la R-espondina. (Fig.5E) Diagrama que ilustra las fusiones de RSPO y las mutaciones somáticas a través de un conjunto selecto de genes de las vías de señalización de Wnt.

Figura 6A Las mutaciones de KRAS se superponen con las fusiones de los genes de RSPO. (Fig.6B) Alteraciones de la vía de RAS/RTK en cáncer de colon.

Figura 7 Esquema de coordenadas y secuencias de EIF3E-RSPO2 en el genoma completo. La Figura 7 revela las SEC ID NOS 105-108, respectivamente, por orden de aparición.

Figura 8 Esquema de coordenadas y secuencias de EIF3E-RSP02 en el genoma completo. La Figura 8 revela las SEC ID NOS 109-111 , respectivamente, por orden de aparición.

Figura 9 Esquema de coordenadas y secuencias de PTPRK-RSPO3 en el genoma completo. La Figura 9 revela las SEC ID NOS 112-116, respectivamente, por orden de aparición.

Figura 10 Esquema de coordenadas y secuencias de PTPRK-RSPO3 en el genoma completo. La Figura 10 revela las SEC ID NOS 112 y 117-120, respectivamente, por orden de aparición.

DESCRIPCIÓN DETALLADA /. Definiciones Los términos "R-espondina" y "RSPO" se refieren, en la presente, a una R-espondina nativa de cualquier fuente vertebrada, con inclusión de mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratas y ratones), a menos que se indique lo contrario. El término engloba la R-espondina sin procesar, de longitud completa, así como también cualquier forma de R-espondina que se genera del procesamiento en la célula. El término también abarca las variantes de origen natural de la R-espondina, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. La R-espondina es una familia de cuatro proteínas, la R-espondina 1 (RSPO1), la R-espondina 2 (RSPO2), la R-espondina 3 (RSPO3) y la R-espondina 4 (RSPO4). En algunas formas de realización, la R-espondina es RSPO1. La secuencia de una secuencia de ácido nucleico de RSPO1 humana de ejemplo es la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos de RSPO1 humana de ejemplo es la SEC ID NO: 2. En algunas formas de realización, la R-espondina es RSPO2. La secuencia de una secuencia de ácido nucleico de RSPO2 humana de ejemplo es la SEC ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos de RSPO2 humana de ejemplo es la SEC ID NO: 4. En algunas formas de realización, la R-espondina es RSPO3. La secuencia de una secuencia de ácido nucleico de RSPO3 humana de ejemplo es la SEC ID NO: 5 o una secuencia de aminoácidos de RSPO3 humana de ejemplo es la SEC ID NO: 6. En algunas formas de realización, la R-espondina es RSPO4. La secuencia de una secuencia de ácido nucleico de RSPO4 humana de ejemplo es la SEC ID NO: 7 o una secuencia de aminoácidos de RSPO4 humana de ejemplo es la SEC ID NO: 8.

"Variante de R-espondina", "variante de RSPO" o sus variaciones, hace referencia a un polipéptido o polinucleótido de R-espondina, que generalmente es o codifica un polipéptido de R-espondina activo que, según se define en la presente, tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de las R-espondinas, según se revelan en la presente. Tales variantes de R-espondina incluyen, por ejemplo, la R-espondina en donde se agregan o delecionan uno o más residuos de ácido nucleico o aminoácido. Comúnmente, una variante de R-espondina tendrá al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad de secuencia, con la R-espondina tal como se revela en la presente. Comúnmente, la variante de R-espondina tiene al menos aproximadamente 10 residuos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 de longitud o más. Opcionalmente, la variante de R-espondina tendrá o codificará una secuencia que tiene más de una sustitución de aminoácido conservativa en comparación con la R-espondina, alternativamente no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 sustituciones de aminoácidos conservativas en comparación con la R-espondina.

Los términos "translocación de la R-espondina" y "translocación de la RSPO" hacen referencia en la presente a una R-espondina, en donde una porción de un cromosoma roto que incluye, por ejemplo, R-espondina, variante, o fragmento de la misma, o un segundo gen, variante, o fragmento de la misma, se vuelve a unir en una ubicación cromosómica diferente, por ejemplo, una ubicación cromosómica diferente de la ubicación nativa de la R-espondina o una ubicación cromosómica en y/o alrededor de la ubicación nativa de la R-espondina que es diferente de la segunda ubicación nativa del gen. La translocación de la R-espondina puede ser una translocación de la RSP01, translocación de la RSP02, translocación de la RSP03, y/o translocación de la RSP04.

Los términos "polinucleótido de fusión de translocación de la R-espondina" y "polinucleótido de fusión de translocación de la RSPO" se refieren en la presente a la secuencia de ácido nucleico de un polinucleótido de fusión o producto génico de translocación de la R-espondina. El polinucleótido de fusión de translocación de la R-espondina puede ser un polinucléotido de fusión de translocación de la RSP01, polinucléotido de fusión de translocación de la RSP02, polinucléotido de fusión de translocación de la RSP03 y/o polinucléotido de fusión de translocación de la RSPO4. Los términos "polipéptido de fusión de translocación de la R-espondina" y "polipéptido de fusión de translocación de la de la RSPO" se refieren, en la presente, a la secuencia de aminoácidos de un polinucléotido de fusión o producto génico de translocación de la R-espondina. El polipéptido de fusión de translocación de la R-espondina puede ser un polipéptido de fusión de translocación de la RSP01, polipéptido de fusión de translocación de la RSP02, polipéptido de fusión de translocación de la RSP03 y/o polipéptido de fusión de translocación de la RSP04.

El término "antagonista de la translocación de la R-espondina", según se define en la presente, es cualquier molécula que bloquea, inhibe o neutraliza, de manera parcial o total, una actividad biológica mediada por un polipéptido de fusión de translocación de la R-espondina. En algunas formas de realización, dicho antagonista se une a un polipéptido de fusión de translocación de la R-espondina. De acuerdo con una forma de realización, el antagonista es un polipéptido. De acuerdo con otra forma de realización, el antagonista es un anticuerpo de antitranslocación de la R-espondina. De acuerdo con otra forma de realización, el antagonista es un antagonista de molécula pequeña. De acuerdo con otra forma de realización, el antagonista es un antagonista de polinucleótido. El antagonista de la translocación de la R-espondina puede ser un antagonista de la translocación de la RSP01, antagonista de la translocación de la RSP02, antagonista de la translocación de la RSP03, y/o antagonista de la translocación de la RSP04.

El término "antagonista de la vía wnt", según se define en la presente, es cualquier molécula que bloquea, inhibe o neutraliza, de manera parcial o total, una actividad biológica mediada por la vía de wnt (por ejemplo, polipéptido de la vía de wnt). En algunas formas de realización, dicho antagonista se une a un polipéptido de la vía de wnt. De acuerdo con una forma de realización, el antagonista es un polipéptido. De acuerdo con otra forma de realización, el antagonista es un antagonista de anticuerpo. De acuerdo con otra forma de realización, el antagonista es un antagonista de molécula pequeña. De acuerdo con otra forma de realización, el antagonista es un antagonista de polinucleótido.

"Polinucleótido" o "ácido nucleico", según se usa de manera intercambiable en la presente, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados, y/o sus análogos, o cualquier substrato que pueda ser incorporado en un polímero mediante reacción de ADN o ARN polimerasa o mediante una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Una secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no-nucleotídicos. Un polinucleótido puede comprender una o más modificaciones hechas después de la síntesis, tales como conjugación a un marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "casquetes", sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, aquéllas con enlaces no cargados (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquéllas que contienen fracciones pendientes, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, ply-L-lisina, etc.), aquéllas con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralén, etc.), aquéllas que contienen queladores (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellas que contienen alquiladores, aquéllas con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como también formas no modificadas del(los) polinucleótido(s). Además, cualquiera de los grupos hidroxilo comúnmente presentes en los azúcares pueden ser reemplazados, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores estándares, o activados para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o pueden conjugarse a soportes sólidos o semisólidos. El OH 5' y 3' terminal puede fosforilarse o sustituirse con aminas o fracciones de grupos con casquetes orgánicos que tienen desde 1 hasta 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también se pueden derivar en grupos protectores estándares. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares ribosa o desoxirribosa que generalmente son conocidos en el arte, con inclusión, por ejemplo, de 2'-O-metilo-, 2'-O-alilo-, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclicos, azúcares a-anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares piranosa, azúcares furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos, y análogos de nucleósidos básicos tales como metilribósido. Uno o más enlaces fosfodiéster pueden ser reemplazados por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, mas no se limitan a, las formas de realización en donde el fosfato es reemplazado por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (0)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(0)OR', CO, o CH2 ("formacetal"), en los cuales cada R o R' es independientemente H o alquilo (1-20 C) sustituido o no sustituido, que opcionalmente contiene un enlace éter (-0-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No es necesario que todos los enlaces en un polinucleótido sean idénticos. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos referidos en la presente, con inclusión de ARN y ADN.

"Oligonucleótido", tal como se usa en la presente, por lo general se refiere a polinucleótidos monocatenarios sintéticos que generalmente, mas no necesariamente, tienen alrededor de 200 nucleótidos de longitud. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente excluyentes. La descripción anterior para los polinucleótidos se aplica equitativa y completamente a los oligonucleótidos.

El término "cebador" se refiere a un polinucleótido monocatenario que es capaz de hibridarse con un ácido nucleico y seguir la polimerización de un ácido nucleico complementario, por lo general al brindar un grupo 3-OH libre.

El término "molécula pequeña" se refiere a cualquier molécula con un peso molecular de aproximadamente 2000 Daltons o menos; con preferencia, de aproximadamente 500 Daltons o menos.

Los términos "célula huésped" "línea celular césped" y "cultivo celular huésped" se usan en forma indistinta y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la progenie de tales células Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen las células primarias transformadas y la progenie derivada de ellas sin tener en cuenta el número de pasajes. La progenie puede no ser exactamente idéntica en el contenido de ácido nucleico a una célula progenitora, pero puede contener mutaciones. Se incluyen en la presente la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica identificada o seleccionada en la célula originalmente transformada.

El término "vector" como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al que se ha unido. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico auto-replicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en que se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se unen operativamente. Tales vectores se denominan en la presente como "vectores de expresión".

Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido separado de un componente de su ambiente natural. En algunas formas de realización, un anticuerpo se purifica a más del 95% o del 99% de pureza determinado, por ejemplo, por métodos electroforéticos (por ejemplo, SDS-PAGE, ¡soelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatográficos (por ejemplo, intercambio iónico o fase inversa HPLC). Para la revisión de los métodos para la evaluación de la pureza del anticuerpo, ver, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

Una molécula de ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que ha sido separada de un componente de su ambiente natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en la células que normalmente expresa la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente en forma extracromosómica o en una ubicación cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.

El término "anticuerpo" se usa en la presente en el sentido más amplio y cubre varias estructuras de anticuerpo, que incluyen pero sin limitación anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpo siempre que ellos exhiban la actividad de unión a antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula diferente de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto, que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; -anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena única(por ejemplo scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo.

Un "anticuerpo que se une con el mismo epitope" como un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia con su antígeno en un ensayo de competencia en un 50% o más y, por el contrario, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo con su antígeno en un ensayo de competencia en un 50% o más. Un ensayo de competencia de ejemplo se proporciona en la presente.

Los términos "anticuerpo de longitud completa" "anticuerpo intacto" y "anticuerpo total" se usan en forma indistinta para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura del anticuerpo nativo o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fe como se definió en la presente.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epitope, excepto por posibles variantes de anticuerpos, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que se originan durante la producción de una preparación de un anticuerpo monoclonal, tales variantes en general están presentes en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpo policlonal, que normalmente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epitopes), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante en el antígeno. En consecuencia, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se interpreta que requiere la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales usados de acuerdo con la presente invención se pueden obtener por una variedad de técnicas, que incluyen, pero sin limitación, el método del hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de despliegue en fagos y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen el total o parte del locus de inmunoglobulina humana, tales métodos y otros ejemplos de métodos para obtener anticuerpos monoclonales se describen en la presente.

"Anticuerpos nativos" se refieren a moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variadas. Por ejemplo, los anticuerpos IgG nativos son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas livianas idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están unidas por disulfuro. Desde el extremo N- a C-terminal, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada un dominio pesado variable o un dominio variable de la cadena pesada, seguida por tres dominios constantes (CH1 , CH2, y CH3). De modo similar, desde el extremo N- a C-terminal, cada cadena liviana tiene una región variable (VL), también llamada dominio liviano variable o un dominio variable de la cadena pesada, seguido por un dominio liviano constante (CL). La cadena liviana de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (?) y lambda (?), sobre la base de las secuencias de aminoácidos de su dominio constante.

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o de la cadena liviana se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o de la cadena liviana se deriva de una fuente o especie diferente.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde al de un anticuerpo producido por un ser humano y/o una célula humana derivado de una fuente humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión al antígeno no humano.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácidos de HVR no humanas y residuos de aminoácidos de FR humanas. En ciertas formas de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente el total de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que el total o sustancialmente el total de las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las del anticuerpo no humano, y el total o sustancialmente el total de las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante del anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha experimentado la humanización.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseída por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de estos se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGi, lgG2, lgG3, lgG4, IgAi e lgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las clases diferentes de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ?, y µ, respectivamente.

Las "funciones efectoras" se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fe de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de las funciones efectoras del anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC); unión al receptor de Fe; citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B); y activación de células B.

El término "región Fe" de la presente se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de la inmunoglobulina, que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fe de la secuencia nativa y regiones Fe de la variante. En una forma de realización, la región Fe de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxilo terminal de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) de la región Fe puede estar presente o no. A menos que se especifique lo contrario en la presente, la numeración de los residuos de aminoácidos de la región Fe o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado el índice EU, que se describe en Kabat et al., Sequences of Proteíns of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, Nacional Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

"Estructura" o residuos de "FR" se refieren a los residuos del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable generalmente consiste en cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3, y FR4. Por consiguiente, las secuencias de HVR y FR generalmente aparecen en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Una "estructura de consenso humana" es una estructura que representa los residuos de aminoácidos más comunes en una selección de secuencias estructurales VL o VH de la inmunoglobulina humana. En general, la selección de las secuencias estructurales VL o VH de la inmunoglobulina humana es de un subgrupo de las secuencias del dominio variable. En general, el subgrupo de las secuencias es un subgrupo de Kabat ef al., Sequences of Proteíns of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publicación 91-3242, Bethesda MD (1991), vol. 1-3. En una forma de realización, para la VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I de Kabat et al., supra. En una forma de realización, para la VH, el subgrupo es el subgrupo III de Kabat et al., supra.

Una "estructura humana aceptora" para los fines de la presente es una estructura que comprende la secuencia de aminoácidos de una estructura del dominio de cadena variable (VL) o una estructura del dominio de cadena pesada (VH) derivada de una estructura de inmunoglobulina humana o una estructura de consenso humana, como se define a continuación. Una estructura humana aceptora "derivada de" una estructura de inmunoglobulina humana o una estructura de consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de esta, o puede contener cambios de la secuencia de aminoácidos. En algunas formas de realización, el número de cambios de aminoácidos preexistentes son 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. En algunas formas de realización, la estructura humana aceptora VL es idéntica en secuencia a la estructura de la secuencia de inmunoglobulina humana aceptora o secuencia de la estructura de consenso humana.

La expresión "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o liviana del anticuerpo que está involucrada en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena liviana (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente tienen estructuras similares, con cada dominio que comprende cuatro regiones estructurales conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR). (Ver, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman y Co., página 91 (2007).) Un dominio VH o VL único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión al antígeno. Por otra parte, los anticuerpos que unen a un antígeno particular se puede aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para seleccionar una biblioteca de dominios de VL o VH complementarios, respectivamente. Ver, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

El término "región hipervariable" o "HVR" como se usa en la presente se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable del anticuerpo que son hipervariables en la secuencia y/o forman bucles definidos estructuralmente. En general, los anticuerpos nativos de cuatro cadenas comprenden seis HVR; tres en la VH (H1 , H2, H3) y tres de la VL (L1 , L2, L3). Las HVR generalmente comprenden residuos de aminoácidos de los bucles hipervariables y/o de las "regiones determinantes de complementariedad" (CDR), estas últimas son de la mayor variabilidad de secuencia y/o están involucradas en el reconocimiento del antígeno. Los ejemplos de bucles hipervariables ocurren en los residuos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), y 96-101 (H3). (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) Los ejemplos de CDR (CDR-L1 , CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1 , CDR-H2, y CDR-H3) ocurren en los residuos de aminoácidos 24-34 de L1, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de H1 , 50-65 de H2, y 95-102 de H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Con la excepción del CDR1 en VH, las CDR generalmente comprenden los residuos de aminoácidos que forman los bucles hipervariables. Las CDR también comprenden "residuos determinantes de especificidad" o "SDR" que son residuos que se ponen en contacto con el antígeno. Los SDR están contenidos dentro de las regiones de las CDR llamadas CDR abreviadas, o a-CDR. Los ejemplos de a-CDR (a-CDR-L1 , a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1 , a-CDR-H2, y a-CDR-H3) ocurren en los residuos de aminoácidos 31-34 de L1 , 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1 , 50-58 de H2, y 95-102 de H3. (Ver Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008).) A menos que se indique lo contrario, los residuos de HVR y otros residuos del dominio variable (por ejemplo, residuos FR) se numeran en la presente de acuerdo con Kabat et al., supra.

"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en la presente, la "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1 :1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y en general se puede representar con una constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir por métodos comunes en la técnica, que incluyen los que se describen en la presente. Los ejemplos de realizaciones ilustrativas y específicas para medir la afinidad de unión se describen a continuación.

Un anticuerpo "con maduración de la afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVRs, Hypervariable Regions), en comparación con un anticuerpo parental que no posee dichas alteraciones, las cuales generan una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.

Los términos "anticuerpo de antitranslocación de la R-espondina" y "un anticuerpo se une al polipéptido de fusión de translocación de la R-espondina" se refieren a un anticuerpo que es capaz de unir el polipéptido de fusión de translocación de la R-espondina con suficiente afinidad de tal manera que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en dirigir la translocación de la R-espondina. En una forma de realización, el grado de unión de un anticuerpo de antitranslocación de la R-espondina a un polipéptido de fusión de no translocación de la R-espondina no relacionado, y/o polipéptido de R-espondina no translocada es menos de aproximadamente 10% de la unión del anticuerpo a los polipéptidos de fusión de translocación de la R-espondina medidos, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA). En ciertas formas de realización, un anticuerpo que se une a un polipéptido de fusión de translocación de la R-espondina tiene una constante de disociación (Kd) de= 1µ?,= 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM,= 0,01 nM, o= 0,001 nM (por ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10"13 M, por ejemplo, de 10"9 M a 10~13 M). En ciertas formas de realización, un anticuerpo de antitranslocación de la R-espondina se une a un epítope de translocación de la R-espondina que es único entre las translocaciones de la R-espondina.

Un anticuerpo de "bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es aquél que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno que une. Los anticuerpos o anticuerpos antagonistas preferidos inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno.

Un "anticuerpo desnudo" se refiere a un anticuerpo que no se conjuga a una fracción heteróloga (por ejemplo, una fracción citotóxica) o radiomarcador. El anticuerpo desnudo puede estar presente en una formulación farmacéutica.

Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado a una o más moléculas heterólogas, que incluyen, mas no se limitan a, un agente citotóxico.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia del polipéptido de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos de la secuencia del polipéptido de referencia, después de alinear las secuencias e introducir las brechas, si es necesario, para obtener el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna de las sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para los fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede obtener de varias maneras que están dentro de la experiencia del arte, por ejemplo, usando un programa de computación disponible al público tal como el programa de computación BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, que incluyen algunos algoritmos necesarios para obtener el alineamiento máximo respecto de la longitud completa de las secuencias comparadas. Para los fines de la presente, sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa de computación de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa de computación de comparación de secuencias ALIGN-2 fue creado por Genentech, Inc., y el código fuente ha sido presentado con la documentación del usuario en U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, donde se registra bajo U.S. Copyright Registration No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible en Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar del código fuente. El programa ALIGN-2 se podría compilar para usar en un sistema operativo UNIX, con preferencia UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen para el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones en que se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de las secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada (que se puede expresar alternativamente como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y donde X es el número de residuos de aminoácidos clasificados como coincidencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 es este alineamiento del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos de B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no equivaldrá al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A. A menos que se indique específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en la presente se obtienen en como se describió en el párrafo inmediatamente anterior usando el programa de computación ALIGN-2.

El término "detección" incluye cualquier medio de detección, con inclusión de detección directa y detección indirecta.

El término "biomarcador", tal como se usa en la presente, se refiere a un indicador, por ejemplo, de predicción, diagnóstico y/o pronóstico, que se puede detectar en una muestra. El biomarcador puede servir como un indicador de un subtipo particular de una enfermedad o un trastorno (por ejemplo, cáncer) caracterizado por ciertas características moleculares, patológicas, histológicas y/o clínicas. En algunas formas de realización, el biomarcador es un gen. En algunas formas de realización, el biomarcador es una variación (por ejemplo, mutación y/o polimorfismo) de un gen. En algunas formas de realización, los biomarcadores constituyen una translocación. Los biomarcadores incluyen, mas no se limitan a, polinucleótidos (por ejemplo, ADN y/o ARN), polipéptidos, modificaciones de polipéptidos y polinucleótidos (por ejemplo, modificaciones postraducción), carbohidratos y/o marcadores moleculares basados en glicolípidos.

La "presencia", "cantidad" o "nivel" de un biomarcador asociado con un beneficio clínico incrementado para un individuo es un nivel detectable en una muestra biológica. Estos se pueden medir a través de métodos conocidos para la persona versada en el arte, y también revelados en la presente. El nivel de expresión o la cantidad de biomarcador evaluados pueden utilizarse para determinar la respuesta al tratamiento.

El término "nivel de expresión", en general, se refiere a la cantidad de un biomarcador en una muestra biológica. La "expresión" generalmente se refiere al proceso mediante el cual la información (por ejemplo, codificada genéticamente y/o epigenética) es convertida en las estructuras presentes y operantes en la células, por lo tanto, tal como se usa en la presente, "expresión" puede hacer referencia a la transcripción en un polinucleótido, traducción en un polipéptido, o incluso modificaciones de polinucleótidos y/o polipéptidos (por ejemplo, modificación postraducción de un polipéptido). Los fragmentos del polinucleótido transcripto, el polipéptido traducido, o las modificaciones de polinucleótidos y/o polipéptidos (por ejemplo, modificación postraducción de un polipéptido) también serán considerados como expresados si se originan a partir de un transcripto generado mediante el empalme alternativo o un transcripto degradado, o de un procesamiento postraducción del polipéptido, por ejemplo, mediante proteolisis. "Genes expresados" incluyen aquellos que son transcriptos en un polinucleótido como ARNm y luego traducidos en un polipéptido, y también aquéllos que son transcriptos en ARN pero no traducidos en un polipéptido (por ejemplo, ARNs de transferencia y ribosomales).

"Expresión elevada", "niveles de expresión elevados" o "niveles elevados" se refiere a una expresión incrementada o a niveles incrementados de un biomarcador en un individuo con relación a un control, tal como un individuo o individuos que no padecen de la enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer) o un control interno (por ejemplo, biomarcador de mantenimiento).

"Expresión reducida", "niveles de expresión reducidos", o "niveles reducidos", se refiere a una expresión reducida o a niveles reducidos de un biomarcador en un individuo con relación a un control, tal como un individuo o individuos que no padecen de la enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer) o un control interno (por ejemplo, biomarcador de mantenimiento).

El término "biomarcador de mantenimiento" se refiere a un biomarcador o a un grupo de biomarcadores (por ejemplo, polinucleótidos y/o polipéptidos) que típicamente están presentes en forma similar en todos los tipos de células. En algunas formas de realización, el biomarcador de mantenimiento es un "gen de mantenimiento". Un "gen de mantenimiento" se refiere, en la presente, a un gen o a un grupo de genes que codifican proteínas cuyas actividades son esenciales para el mantenimiento de la función de la célula y que típicamente están presentes en forma similar en todos los tipos de células.

"Amplificación", tal como se usa en la presente, por lo general se refiere al proceso de producir múltiples copias de una secuencia deseada. "Múltiples copias" significan al menos dos copias. Una "copia" no necesariamente se refiere a la complementariedad o identidad de la secuencia con la secuencia molde. Por ejemplo, las copias pueden incluir análogos de nucleótidos tales como desoxiinosina, alteraciones de las secuencias intencionales (tales como alteraciones de las secuencias a través de un cebador que comprende una secuencia que es hibridable, pero no complementaria, con el templado), y/o errores de secuencia que ocurren durante la amplificación.

El término "PCR múltiple" se refiere a una única reacción de PCR, llevada a cabo sobre el ácido nucleico obtenido a partir de una única fuente (por ejemplo, un individuo) usando más de un conjunto de cebadores con el objeto de amplificar dos o más secuencias de ADN en una única reacción.

La "rigurosidad" de las reacciones de hibridación es fácilmente determinada por la persona versada en el arte, y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas superiores para el recocido apropiado, mientras que las sondas más cortas necesitan menores temperaturas. La hibridación generalmente depende de la habilidad del ADN desnaturalizado para recocerse cuando las hebras complementarias están presentes en un ámbito por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseado entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor es la temperatura relativa que se puede usar. Como resultado, se entiende que las temperaturas relativas superiores tenderían a tornar las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que las temperaturas inferiores lo harían en menor medida. Para mayores detalles y explicación de la rigurosidad de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

"Condiciones rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad", tal como se definen en la presente, se pueden identificar por aquellas que: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo, cloruro de sodio 0,015/citrato de sodio 0,0015 M /dodecilsulfato de sodio al 0,1% a 50 °C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, 50% (v/v) de formamida con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/ polivinilpirrolidona al 0,1% /50 mM de tampón de fosfato de sodio a pH 6,5 con 750 mM de cloruro de sodio, 75 mM de citrato de sodio a 42 °C; o (3) hibridación toda la noche en una solución que emplea 50% de formamida, 5 x SSC (NaCI 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), 50 mM de fosfato de sodio (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 pg/ml), SDS al 0,1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42 °C, con un lavado de 10 minutos a 42 °C en 0,2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) seguido de un lavado de alta rigurosidad de 10 minutos que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55 °C.

Las "condiciones moderadamente rigurosas" se pueden identificar según lo descrito por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica, y % de SDS) menos rigurosas que las descritas con anterioridad, un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación toda la noche a 37 °C en una solución que comprende: 20% de formamida, 5 x SSC (150 mM de NaCI, 15 mM de citrato trisódico), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7,6), 5 x de solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado, seguido del lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50 °C. La persona versada en el arte reconocerá cómo ajusfar la temperatura, la fuerza iónica, etc. según sea necesario para adaptar los factores tales como longitud de la sonda y similares.

El término "diagnóstico" se usa en la presente para hacer referencia a la identificación o clasificación de un estado, enfermedad o afección moleculares o patológicos (por ejemplo, cáncer). Por ejemplo, "diagnóstico" puede hacer referencia a la identificación de un tipo particular de cáncer. "Diagnóstico" también puede hacer referencia a la clasificación de un subtipo particular de cáncer, por ejemplo, mediante criterios histopatológicos, o mediante características moleculares (por ejemplo, un subtipo caracterizado por la expresión de un biomarcador o una combinación de biomarcadores (por ejemplo, genes particulares o proteínas codificadas por dichos genes)).

El término "diagnóstico auxiliar" se usa en la presente para hacer referencia a los métodos que ayudan a formular una determinación clínica con respecto a la presencia, o naturaleza, de un tipo particular de síntoma o condición de una enfermedad o un trastorno (por ejemplo, cáncer). Por ejemplo, un método para ayudar al diagnóstico de una enfermedad o un trastorno (por ejemplo, cáncer) puede comprender detectar ciertos biomarcadores en una muestra biológica obtenida de un individuo.

El término "muestra", tal como se usa en la presente, se refiere a una composición que es obtenida o derivada de un sujeto y/o individuo de interés que contiene una entidad celular y/u otra entidad molecular que ha de ser caracterizada y/o identificada, por ejemplo, sobre la base de características físicas, bioquímicas, químicas y/o fisiológicas. Por ejemplo, la frase "muestra de enfermedad" y sus variaciones se refiere a cualquier muestra obtenida de un sujeto de interés para la cual se esperaría que contuviera o que se sabe que contiene la entidad celular y/o molecular que ha de ser caracterizada. Las muestras incluyen, mas no se limitan a, células o líneas celulares primarias o cultivadas, sobrenadantes celulares, lisados celulares, plaquetas, suero, plasma, fluido vitroso, fluido linfático, fluido sinovial, fluido folicular, fluido seminal, fluido amniótico, leche, sangre entera, células derivadas de la sangre, orina, fluido cerebroespinal, saliva, esputo, lágrimas, transpiración, moco, lisados tumorales, y medio de cultivo tisular, extractos tisulares tales como tejido homogeneizado, tejido tumoral, extractos celulares, y combinaciones de los mismos.

Por "muestra de tejido" o "muestra de célula" se hace referencia a una colección de células similares obtenidas a partir de un tejido de un sujeto o individuo. La fuente de la muestra de tejido o de célula puede ser un tejido sólido tal como de un órgano freso, congelado y/o conservado, muestra de tejido, biopsia y/o aspirado; sangre o cualesquiera constituyentes de la sangre tales como plasma; fluidos corporales tales como fluido espinal, fluido amniótico, fluido peritoneal o fluido intersticial; células de cualquier tiempo de gestación o desarrollo del sujeto. La muestra de tejido también puede ser células o líneas celulares primarias o cultivadas. Opcionalmente, la muestra de tejido o de célula se obtiene a partir de un tejido/órgano enfermo. La muestra de tejido puede contener compuestos que no están intermezclados naturalmente con el tejido en la naturaleza, tales como conservantes, anticoagulantes, tampones, fijadores, nutrientes, antibióticos, o similares.

Una "muestra de referencia", "célula de referencia", "tejido de referencia", "muestra de control", "célula de control", o "tejido de control", tal como se usa en la presente, se refiere a una muestra, célula, tejido, estándar o nivel que es útil a los fines comparativos. En una forma de realización, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control se obtiene de una parte sana y/o no enferma del cuerpo (por ejemplo, tejido o células) del mismo sujeto o individuo. Por ejemplo, las células o tejidos sanos y/o no enfermos adyacentes a las células o los tejidos enfermos (por ejemplo, células o tejidos adyacentes a un tumor). En otra forma de realización, una muestra de referencia se obtiene a partir de un tejido y/o célula no tratados del cuerpo del mismo sujeto o individuo. En incluso otra forma de realización, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control se obtiene de una parte sana y/o no enferma del cuerpo (por ejemplo, tejido o células) de un individuo que no es el sujeto o individuo. En incluso otra forma de realización, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control se obtiene de un tejido y/o célula sin tratar del cuerpo de un individuo que no es el sujeto o individuo.

Para los fines de la presente, el término "sección" de una muestra de tejido hace referencia a una parte o pieza única de una muestra de tejido, por ejemplo, una fina sección de tejido o células cortada de una muestra de tejido. Se entiende que es posible tomar múltiples secciones de muestras de tejidos y someterlas a análisis, siempre que se entienda que la misma sección de muestra de tejido se puede analizar tanto a nivel morfológico como a nivel molecular, o analizar con respecto tanto a polipéptidos como a polinucleótidos.

Por "correlacionar" o "correlación" se hace referencia a comparar, en cualquier forma, el rendimiento y/o los resultados de un primer análisis o protocolo con el rendimiento y/o los resultados de un segundo análisis o protocolo. Por ejemplo, es posible usar los resultados de un primer análisis o protocolo al llevar a cabo un segundo protocolo y/o es posible usar los resultados de un primer análisis o protocolo para determinar si debería llevarse a cabo un segundo análisis o protocolo. Con respecto a la forma de realización del análisis o protocolo de polinucleótidos, es posible usar los resultados del análisis o protocolo de expresión de polinucleótidos para determinar si debería llevarse a cabo un régimen terapéutico específico.

La "respuesta individual" o "respuesta" se pueden evaluar usando cualquier criterio de valoración que indique un beneficio para el individuo, que incluye, mas no se limita a: (1) inhibición, hasta cierto punto, del avance de la enfermedad (por ejemplo, avance del cáncer), que incluye la lentificación y el arresto completo; (2) una reducción en el tamaño del tumor; (3) inhibición (es decir, reducción, lentificación o detención completa) de la infiltración de las células cancerosas en los órganos periféricos y/o tejidos adyacentes; (4) inhibición (es decir, reducción, lentificación o detención completa) de metástasis; (5) alivio, hasta cierto punto, de uno o más síntomas asociados con la enfermedad o el trastorno (por ejemplo, cáncer); (6) incremento en la duración de la supervivencia libre de avance; y/o (9) mortalidad reducida en un determinado tiempo después del tratamiento.

La frase "sustancialmente similar", tal como se usa en la presente, se refiere a un grado suficientemente alto de similitud entre dos valores numéricos (generalmente uno asociado con una molécula y el otro asociado con una molécula de referencia/comparación) de tal manera que la persona versada en el arte consideraría que la diferencia entre los dos valores no tiene importancia a nivel estadístico dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd). La diferencia entre dichos dos valores puede ser, por ejemplo, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 10%, y/o menos de aproximadamente 5% como función del valor de referencia/comparación. La frase "sustancialmente similar" se refiere a que es sustancialmente similar a una referencia (por ejemplo, referencia normal).

La frase "sustancialmente diferente" se refiere a un grado suficientemente alto de diferencia entre dos valores numéricos (generalmente, uno asociado con una molécula y el otro asociado con una molécula de referencia/comparación) de tal manera que la persona versada en el arte consideraría que la diferencia entre los dos valores tiene importancia a nivel estadístico dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd). La diferencia entre dichos dos valores puede ser, por ejemplo, mayor a aproximadamente 10%, mayor a aproximadamente 20%, mayor a aproximadamente 30%, mayor a aproximadamente 40%, y/o mayor a aproximadamente 50% como función del valor para la molécula referencia/comparación.

La palabra "marcador", cuando se usa en la presente, se refiere a un compuesto o composición detectable. El marcador se conjuga o fusiona típicamente ya sea en forma directa o indirecta a un reactivo, tal como una sonda de polinucleótido o un anticuerpo, y facilita la detección del reactivo al cual se conjuga o fusiona. El marcador puede ser detectable en sí misma (por ejemplo, marcadores radioisotópicos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición substrato que genera un producto detectable.

Una "cantidad efectiva" de un agente se refiere a una cantidad efectiva en dosis y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o preventivo deseado.

Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de una sustancia / molécula de la invención, agonista o antagonista puede variar de acuerdo con factores tales como el estado patológico, la edad, el sexo y el peso del individual, y la capacidad de la sustancia / molécula, agonista o antagonista de producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la sustancia / molécula, agonista o antagonista son ponderados por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad de eficacia preventiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosis y para períodos de tiempo necesarios para lograr el resultado preventivo deseado. Típica pero no necesariamente, si bien se usa una dosis preventiva en sujetos antes o en un estadio temprano de la enfermedad, la cantidad de eficacia preventiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en forma tal que permite que la actividad biológica contenida en este sea efectiva, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se debe administrar la formulación.

Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, diferente de un ingrediente activo, que es no tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, pero sin limitación, un buffer, excipiente, estabilizantes, o conservante.

Tal como se usa en la presente, "tratamiento" (y sus variaciones gramáticas tales como "tratar" o "tratando") se refiere a la intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo que está siendo tratado, y puede ser realizado ya sea para prevención o bien durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, mas no se limitan a: evitar la ocurrencia o recurrencia de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevenir la metástasis, reducir la velocidad del avance de la enfermedad, mejorar o paliar el estado de la enfermedad, y remisión o pronóstico mejorado. En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se usan para retardar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar el avance de una enfermedad.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la afección fisiológica en los mamíferos que típicamente se caracteriza por la proliferación/crecimiento no regulado de las células. Los ejemplos de cáncer incluyen, mas no se limitan a: carcinoma, linfoma (por ejemplo, linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin), blastoma, sarcoma, y leucemia. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cánceres de pulmón de células pequeñas, cánceres de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, leucemia y otros trastornos linfoproliferativos, y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello.

El término "terapia anticáncer" se refiere a una terapia útil para tratar cáncer. Los ejemplos de agentes terapéuticos anticáncer incluyen, mas no se limitan a: por ejemplo, agentes quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos, agentes usados en terapia de radiación, agentes antiangiogénicos, agentes apoptóticos, agentes antitubulina, y otros agentes para tratar cáncer, anticuerpos anti-CD20, inhibidores del factor de crecimiento derivados de plaquetas (por ejemplo, Gleevec™ (Imatinib Mesilato)), un inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib), interferones, citoquinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que se unen a uno o más de los siguientes blancos: PDGFR-beta, BlyS, APRIL, receptor(es) de BCMA, TRAIIJApo2, y otros agentes químicos orgánicos y bioactivos, etc. Las combinaciones de los mismos también están incluidas en la invención.

El término "agente citotóxico", tal como se usa en la presente, se refiere a una sustancia que inhibe o evita una función celular y/o causa muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, mas no se limitan a: isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterapéuticos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, vinca alcaloides (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina u otros agentes intercaladores); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de los mismos tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas activas a nivel enzimático de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, con inclusión de fragmentos y/o variantes de las mismas; y los varios agentes antitumor o anticáncer revelados a continuación.

Un "agente quimioterapéutico" se refiere a un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN®); alquil sulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol; colquicinas; ácido betulínico; una camptotecina (que incluye el análogo sintético topotecán (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina, y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (que incluye sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (que incluye los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos tales como el antibiótico enedina (por ejemplo caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamal l y caliqueamicina omegah (véase, por ejemplo, Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, e inhibidor de la alfa-4 integrina oral; dinemicina, que incluye dinemicina A; una esperamicina; así como también cromóforo neocarzinostatina y cromóforos de antibiótico enedina de cromoproteína relacionada), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (con inclusión de ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2— pirrolino— doxorrubicina, inyección de doxorrubicina HCI liposomal (DOXIL®), doxorrubicina liposomal TLC D-99 (MYOCET®), doxorrubicina liposomal pegilada (CAELYX®), y desoxidoxorrubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), epotilona, y 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reestablecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; epotilona; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinán; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxana; rizoxina; sizofirán; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2'-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromán; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); tiotepa; taxoid, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®), formulación de nanopartículas diseñadas de albúmina de paclitaxel (ABRAXANE™), y docetaxel (TAXOTERE®); cloranbucil; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platino tales como cisplatino, oxaliplatino (por ejemplo, ELOXATIN®), y carboplatina; vincas, que evitan que la polimerización de tubulina forme microtúbulos, que incluyen vinblastina (VELBAN®), vincristina (ONCOVIN®), vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®), y vinorelbina (NAVELBINE®); etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico, que incluye bexaroteno (TARGRETIN®); bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE- 58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®), o risedronato (ACTONEL®); troxacitabina (un análogo de citosina nucleósido de 1 ,3-dioxolano); oligonucleótidos antisentido, particularmente los que inhiben la expresión de genes en las vías de señalización implicadas en la proliferación de células aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R, del inglés Epidemial Growth Factor Receptc-? vacunas tales como la vacuna THERATOPE® y las vacunas de terapia génica, por ejemplo, vacunas ALLOVECTIN®, vacunas LEUVECTIN®, y vacuna VAXID®; inhibidor de la topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por ejemplo, ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer); perifosina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib o etoricoxib), inhibidor de proteosoma (por ejemplo, PS341); bortezomib (VELCADE®); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; inhibidor de Bcl-2 tal como oblimersén sódico (GENASENSE®); pixantrona; inhibidores de EGFR (ver la definición a continuación); inhibidores de tirosina quinasa (ver la definición a continuación); inhibidores de serina-treonina quinasa tales como rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®); inhibidores de farnesiltransferasa tales como lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™); y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualesquiera de los anteriores; así como también combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura para la terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, y prednisolona; y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina.

Los agentes quimioterapéuticos, tal como se definen en la presente, incluyen "agentes antihormonales" o "terapéuticos endocrinos" que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de las hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer. Pueden ser hormonas propiamente dichas, que incluyen, mas no se limitan a: antiestrógenos con perfil mixto agonista/antagonista, con inclusión de tamoxifeno (NOLVADEX®), 4-hidroxitamoxifeno, toremifeno (FARESTON®), idoxifeno, droloxifeno, raloxifeno (EVISTA®), trioxifeno, ceoxifeno, y moduladores de los receptores de estrógeno selectivos (SERMs, del inglés Selective Estrogen Receptor Modulators) tales como SERM3; antiestrógenos puros sin propiedades agonistas, tales como fulvestrant (FASLODEX®), y EM800 (dichos agentes pueden bloquear la dimerización del receptor de estrógeno (ER, del inglés Estrogen Receptor), inhibir la unión a ADN, incrementar la remodelación de ER, y/o suprimir los niveles de ER); inhibidores de aromatasa, con inclusión de inhibidores de aromatasa esteroideos tales como formestano y exemestano (AROMASIN®), e inhibidores de aromatasa no esteroideos tales como anastrazol (ARIMIDEX®), letrozol (FEMARA®) y aminoglutetimida, y otros inhibidores de aromatasa incluyen vorozol (RIVISOR®), megestrol acetato (MEGASE®), fadrozol, y 4(5)-¡midazoles; agonistas de hormonas de liberación de hormonas de lutenización, que incluyen leuprolide (LUPRON® y ELIGARD®), goserelina, buserelina y tripterelina; esferoides sexuales, que incluyen progestinas tales como acetato de megestrol y acetato de medroxiprogesterona, estrógenos tales como dietilstilbestrol y premarina, y andrógenos/retinoides tales como fluoximesterona, ácido transretiónico y fenretinida; onapristona; anti-progesteronas; reguladores descendientes de receptores de estrógeno (ERDs, del inglés Estrogen Receptor Down-Regulators); anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como también combinaciones de dos o más de los anteriores.

El término "profármaco", tal como se usa en esta solicitud, se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales en comparación con el fármaco madre y es capaz de ser activada a nivel enzimático o convertida en la forma madre más activa. Véase, por ejemplo, Wilman, Prodrugs in Cáncer Chemotherapy, Biochemical Society Transactions, 14, páginas 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al., Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), páginas 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de esta invención incluyen, mas no se limitan a: profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos con aminoácidos D modificados, profármacos glicosilados, profármacos que contienen ß-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituidos o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituidos, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco libre de citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivar en una forma de profármaco para uso en esta invención incluyen, mas no se limitan a, los agentes quimioterapéuticos descritos con anterioridad.

Un "agente inhibidor del crecimiento", tal como se usa en la presente, se refiere a un compuesto o una composición que inhibe el crecimiento de una célula (por ejemplo, una célula cuyo crecimiento depende de la expresión de un gen de la vía wnt y/o translocación de la R-espondina ya sea in vitro o in vivo). Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean el avance del ciclo celular (en un lugar distinto de la fase S), tales como agentes que inducen arresto de G1 y arresto de fase M. Los clásicos bloqueadores de fase M incluyen vincas (vincristina y vinblastina), taxanos, e inhibidores de la topoisomerasa II tales como doxorrubicina, epirubicina, daunorubicina, etopósido, y bleomicina. Aquellos agentes que arrestan G1 también alcanzan el arresto de fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Es posible encontrar información adicional en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1 , intitulada Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs, de Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente la página 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticáncer derivados, ambos, del árbol tejo. El docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético del paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). El paclitaxel y el docetaxel promueven el ensamblaje de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos al evitar la despolimerización, lo que genera la inhibición de la mitosis en las células.

Por "terapia de radiación" se alude al uso de rayos gamma o rayos beta dirigidos para inducir daño suficiente a una célula de tal manera que se limite su habilidad para funcionar normalmente o destruir la célula en un todo. Ha de apreciarse que existirán muchas maneras en el arte para determinar la dosis y la duración del tratamiento. Los tratamientos típicos se brindan como una administración de una única vez y las dosis típicas oscilan entre 10 y 200 unidades (Grays) por día.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, mas no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, humanos y primates no humanos tales como monos), conejos, y roedores (por ejemplo, ratas y ratones). En ciertas formas de realización, el individuo o sujeto es un humano.

El término "concurrentemente" se usa en la presente para hacer referencia a la administración de dos o más agentes terapéuticos, donde al menos parte de la administración se superpone en el tiempo. Por consiguiente, la administración concurrente incluye un régimen de dosificación cuando la administración de uno o más agente(s) continúa después de interrumpir la administración de uno o más agente(s).

Por "reducir" o "inhibir" se hace referencia a la habilidad para causar una reducción total del 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o más. "Reducir" o "inhibir" pueden referirse a los síntomas del trastorno que está siendo tratado, la presencia o el tamaño de las metástasis, o el tamaño del tumor primario.

El término "prospecto" se usa para hacer referencia a las instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de los productos terapéuticos, que contienen información en relación con las indicaciones, el uso, la dosis, la administración, la terapia de combinación, las contraindicaciones y/o las advertencias con respecto al uso de dichos productos terapéuticos.

Un "artículo fabricado" es cualquier artículo (por ejemplo, un envase o recipiente) o kit que comprende al menos un reactivo, por ejemplo, un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno (por ejemplo, cáncer), o una sonda para detectar específicamente un biomarcador descrito en la presente. En ciertas formas de realización, el artículo o kit es promocionado, distribuido o vendido como una unidad para llevar a cabo los métodos descritos en la presente.

Una "audiencia blanco" es un grupo de personas o una institución para la cual un medicamento particular está siendo promocionado o está destinado a ser promocionado, a través de marketing o publicidad, especialmente para usos, tratamientos o indicaciones particulares, tales como individuos, poblaciones, lectores de periódicos, literatura médica y revistas, espectadores de televisión o Internet, oyentes de radio o Internet, médicos, compañías farmacéuticas, etc.

Tal como lo entiende la persona versada en el arte, la referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en la presente incluye (y describe) formas de realización que están dirigidas a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que se refiere a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".

Se entiende que los aspectos y las formas de realización de la invención descritos en la presente incluyen "consistir" y/o "consistir esencialmente en" los aspectos y las formas de realización. Tal como se usa en la presente, la forma singular "un", "una", "el" y "la" incluye las referencias en plural, a menos que se indique lo contrario.

//. Métodos y Usos En la presente se proveen métodos que utilizan un antagonista de la vía wnt.

En particular, en la presente se proveen métodos que utilizan un antagonista de la translocación de la R-espondina. Por ejemplo, en la presente se proveen métodos para inhibir la proliferación celular de una célula cancerosa que comprende poner en contacto la célula cancerosa con una cantidad efectiva de un antagonista de la translocación de la R-espondina. También se proveen en la presente métodos para tratar cáncer en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de la translocación de la R-espondina. En algunas formas de realización, el cáncer comprende una translocación de la R-espondina.

En la presente también se proveen métodos para tratar cáncer en un individuo, que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de una terapia anticáncer, en donde el tratamiento se basa en que el individuo tiene cáncer que comprende uno o más biomarcadores. En algunas formas de realización, la terapia anticáncer comprende un antagonista de la vía wnt. Por ejemplo, se proveen métodos para tratar cáncer en un individuo, que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de la vía wnt, en donde el tratamiento se basa en que el individuo tiene cáncer que comprende una translocación de la R-espondina. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía wnt es un antagonista de la R-espondina (por ejemplo, antagonista de RSP01, RSP02, RSPO3 y/o RSP04). En algunas formas de realización, el antagonista de la vía wnt es un antagonista de la translocación de la R-espondina. En algunas formas de realización, el antagonista de la R-espondina y/o antagonista de la translocación de la R-espondina es un anticuerpo aislado que une la R-espondina (por ejemplo, RSP01 , RSP02, RSP03 y/o RSPO4).

En la presente también se proveen métodos para tratar cáncer en un individuo siempre que se haya encontrado que el individuo tiene cáncer que comprende uno o más biomarcadores, donde el tratamiento comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de una terapia anticáncer. En algunas formas de realización, la terapia anticáncer comprende un antagonista de la vía wnt. Por ejemplo, en la presente se proveen métodos para tratar cáncer en un individuo siempre que se haya encontrado que el individuo tiene cáncer que comprende una translocación de la R-espondina, donde el tratamiento comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de la vía wnt. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía wnt es un antagonista de la R-espondina (por ejemplo, antagonista RSP01, RSP02, RSP03 y/o RSP04). En algunas formas de realización, el antagonista de la vía wnt es un antagonista de la translocación de la R-espondina. En algunas formas de realización, el antagonista de la R-espondina y/o antagonista de la translocación de la R-espondina es un anticuerpo aislado que une la R-espondina (por ejemplo, RSP01 , RSP02, RSP03 y/o RSP04).

En la presente se proveen métodos para tratar una célula cancerosa, en donde la célula cancerosa comprende uno o más biomarcadores, donde el método comprende proveer una cantidad efectiva de un antagonista de la vía wnt. Por ejemplo, en la presente se proveen métodos para tratar una célula cancerosa, en donde la célula cancerosa comprende una translocación de la R-espondina, donde el método comprende proveer una cantidad efectiva de un antagonista de la vía wnt. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía wnt es un antagonista de la R-espondina (por ejemplo, antagonista de la RSP01, RSP02, RSP03 y/o RSP04). En algunas formas de realización, el antagonista de la vía wnt es un antagonista de la translocación de la R-espondina. En algunas formas de realización, el antagonista de la R-espondina y/o antagonista de la translocación de la R-espondina es un anticuerpo aislado que une la R-espondina (por ejemplo, RSP01 , RSP02, RSP03, y/o RSP04).

En la presente se proveen métodos para tratar cáncer en un individuo, donde el método comprende: determinar que una muestra obtenida del individuo comprende uno o más biomarcadores, y administrar una cantidad efectiva de una terapia anticáncer que comprende un antagonista de la vía wnt al individuo, mediante la cual el cáncer es tratado. Por ejemplo, en la presente se proveen métodos para tratar cáncer en un individuo, donde el método comprende: determinar que una muestra obtenida del individuo comprende una translocación de la R-espondina, y administrar una cantidad efectiva de una terapia anticáncer que comprende un antagonista de la vía wnt al individuo, mediante la cual el cáncer es tratado. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía wnt es un antagonista de la R-espondina (por ejemplo, antagonista de la RSP01 , RSP02, RSP03 y/o RSP04). En algunas formas de realización, el antagonista de la vía wnt es un antagonista de la translocación de la R-espondina. En algunas formas de realización, el antagonista de la R-espondina y/o antagonista de la translocación de la R-espondina es un anticuerpo que une la R-espondina (por ejemplo, RSP01 , RSP02, RSP03 y/o RSP04).

En la presente también se proveen métodos para tratar cáncer, que comprenden: (a) seleccionar un individuo que tiene cáncer, en donde el cáncer comprende uno o más biomarcadores; y (b) administrar al individuo seleccionado de esta manera una cantidad efectiva de un antagonista de la vía wnt, mediante la cual el cáncer es tratado. Por ejemplo, en la presente también se proveen métodos para tratar cáncer, que comprenden: (a) seleccionar un individuo que tiene cáncer, en donde el cáncer comprende una translocación de la R-espondina; y (b) administrar al individuo seleccionado de esta manera una cantidad efectiva de un antagonista de la vía wnt, mediante la cual el cáncer es tratado. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía wnt es un antagonista de la R-espondina (por ejemplo, antagonista de la RSP01, RSP02, RSP03 y/o RSP04). En algunas formas de realización, el antagonista de la vía wnt es un antagonista de la translocación de la R-espondina. En algunas formas de realización, el antagonista de la R-espondina y/o antagonista de la translocación de la R-espondina es un anticuerpo aislado que une la R-espondina (por ejemplo, RSP01 , RSP02, RSP03 y/o RSP04).

En la presente también se proveen métodos para identificar un individuo con cáncer que tiene más o menos posibilidades de beneficiarse del tratamiento con una terapia anticáncer, donde el método comprende: determinar la presencia o ausencia de uno o más biomarcadores en una muestra obtenida del individuo, en donde la presencia de dichos uno o más biomarcadores en la muestra indica que el individuo tiene más posibilidades de beneficiarse del tratamiento con la terapia anticáncer o la ausencia de dichos uno o más biomarcadores indica que el individuo tiene menos posibilidades de beneficiarse del tratamiento con la terapia anticáncer. En algunas formas de realización, la terapia anticáncer comprende un antagonista de la vía wnt. Por ejemplo, en la presente se proveen métodos para identificar un individuo con cáncer que tiene más o menos posibilidades de beneficiarse del tratamiento con una terapia anticáncer que comprende un antagonista de la vía wnt, donde el método comprende: determinar la presencia o ausencia de una translocación de la R-espondina en una muestra obtenida del individuo, en donde la presencia de la translocación de la R-espondina en la muestra indica que el individuo tiene más posibilidades de beneficiarse del tratamiento con la terapia anticáncer que comprende el antagonista de la vía wnt o la ausencia de la translocación de la R-espondina indica que el individuo tiene menos posibilidades de beneficiarse del tratamiento con la terapia anticáncer que comprende el antagonista de la vía wnt. En algunas formas de realización, el método además comprende administrar una cantidad efectiva de un antagonista de la vía wnt. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía wnt es un antagonista de la R-espondina (por ejemplo, antagonista de la RSP01 , RSP02, RSP03 y/o RSP04). En algunas formas de realización, el antagonista de la vía wnt es un antagonista de la translocación de la R-espondina. En algunas formas de realización, el antagonista de la R-espondina y/o antagonista de la translocación de la R-espondina es un anticuerpo aislado que une la R-espondina (por ejemplo, RSP01 , RSP02, RSP03 y/o RSP04).

En la presente se proveen métodos para predecir si un individuo con cáncer tiene más o menos posibilidades de responder de manera efectiva al tratamiento con una terapia anticáncer que comprende un antagonista de la vía wnt, donde el método comprende determinar uno o más biomarcadores, por lo cual la presencia de dichos uno o más biomarcadores indica que el individuo tiene más posibilidades de responder de manera efectiva al tratamiento con el antagonista de la vía wnt y la ausencia de dichos uno o más biomarcadores indica que el individuo tiene menos posibilidades de responder de manera efectiva al tratamiento con el antagonista de la vía wnt. Por ejemplo, en la presente se proveen métodos para predecir si un individuo con cáncer tiene más o menos posibilidades de responder de manera efectiva al tratamiento con una terapia anticáncer que comprende un antagonista de la vía wnt, donde el método comprende determinar una translocación de la R-espondina, por lo cual la presencia de la translocación de la R-espondina indica que el individuo tiene más posibilidades de responder de manera efectiva al tratamiento con el antagonista de la vía wnt y la ausencia de la translocación de la R-espondina indica que el individuo tiene menos posibilidades de responder de manera efectiva al tratamiento con el antagonista de la vía wnt. En algunas formas de realización, el método además comprende administrar una cantidad efectiva de un antagonista de la vía wnt. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía wnt es un antagonista de la R-espondina (por ejemplo, antagonista de la RSP01 , RSP02, RSP03 y/o RSP04). En algunas formas de realización, el antagonista de la vía wnt es un antagonista de la translocación de la R-espondina. En algunas formas de realización, el antagonista de la R-espondina y/o antagonista de la translocación de la R-espondina es un anticuerpo aislado que une la R-espondina (por ejemplo, RSP01 , RSP02, RSP03 y/o RSP04).

En la presente se proveen métodos para predecir la respuesta o falta de respuesta de un individuo con cáncer a una terapia anticáncer que comprende un antagonista de la vía wnt que comprende detectar en una muestra obtenida del individuo la presencia o ausencia de uno o más biomarcadores, en donde la presencia de dichos uno o más biomarcadores predice la respuesta del individuo a la terapia anticáncer que comprende el antagonista de la vía wnt y la ausencia de dichos uno o más biomarcadores predice la falta de respuesta del individuo a la terapia anticáncer que comprende el antagonista de la vía wnt. Por ejemplo, en la presente se proveen métodos para predecir la respuesta o falta de respuesta de un individuo con cáncer a una terapia anticáncer que comprende un antagonista de la vía wnt que comprende detectar en una muestra obtenida del individuo la presencia o ausencia de una translocación de la R-espondina, en donde la presencia de la translocación de la R-espondina predice la respuesta del individuo a la terapia anticáncer que comprende el antagonista de la vía wnt y la ausencia de la translocación de la R-espondina predice la falta de respuesta del individuo a la terapia anticáncer que comprende el antagonista de la vía wnt. En algunas formas de realización, el método además comprende administrar una cantidad efectiva de un antagonista de la vía wnt. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía wnt es un antagonista de la R-espondina (por ejemplo, antagonista de la RSP01, RSP02, RSP03 y/o RSP04). En algunas formas de realización, el antagonista de la vía wnt es un antagonista de la translocación de la R-espondina. En algunas formas de realización, el antagonista de la R-espondina y/o antagonista de la translocación de la R-espondina es un anticuerpo aislado que une la R-espondina (por ejemplo, RSP01 , RSP02, RSP03 y/o RSP04).

En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, dichos uno o más biomarcadores comprenden uno o más genes listados en la Tabla 2. En algunas formas de realización, la presencia de uno o más biomarcadores comprende la presencia de una variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) de uno o más genes listados en la Tabla 2 (por ejemplo, una variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) en la Tabla 2). En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, dichos uno o más biomarcadores comprenden uno o más genes listados en la Tabla 3. En algunas formas de realización, la presencia de uno o más biomarcadores comprende la presencia de una variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) de uno o más genes listados en la Tabla 3 (por ejemplo, una variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) en la Tabla 3). En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, dichos uno o más biomarcadores comprenden uno o más genes listados en la Tabla 4. En algunas formas de realización, la presencia de uno o más biomarcadores comprende la presencia de una variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) de uno o más genes listados en la Tabla 4 (por ejemplo, una variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) en la Tabla 4). En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, dichos uno o más biomarcadores comprenden uno o más genes listados en la Tabla 5. En algunas formas de realización, la presencia de uno o más biomarcadores comprende la presencia de una variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) de uno o más genes listados en la Tabla 5 (por ejemplo, una variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) en la Tabla 5). En algunas formas de realización, la variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) es una variación somática (por ejemplo, polimorfismo o mutación).

En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, dichos uno o más biomarcadores comprenden uno o más genes seleccionados entre el grupo que consiste en KRAS, TP53, APC, PIK3CA, SMAD4, FBXW7, CSMD1, NRXN1, DNAH5, MRVI1, TRPS1, DMD, KIF2B, ATM, FAM5C, EVC2, OR2W3, SIN3A, SMARCA5, NCOR1, JARID2, TCF12, TCF7L2, PHF2, SOS2, RASGRF2, ARHGAP10, ARHGEF33, Rab40c, TET2, TET3, EP400, MLL, TMPRSS11A, ERBB3, EPHB4, EFNB3, EPHA1, TYR03, TIE1, FLT, RIOK3, PRKCB, MUSK, MAP2K7, MAP4K5, PTPRN2, GPR4, GPR98, TOPORS, y SCN10A. En algunas formas de realización, dichos uno o más biomarcadores comprenden uno o más genes seleccionados entre el grupo que consiste en CSMD1, NRXN1, DNAH5, MRVI1, TRPS1, DMD, KIF2B, ATM, FAM5C, EVC2, OR2W3, TMPRSS11A, y SCN10A. En algunas formas de realización, dichos uno o más biomarcadores comprenden RAB40C, TCF12, C20orf132, GRIN3A y/o SOS2. En algunas formas de realización, dichos uno o más biomarcadores comprenden ETV4, GRIND2D, FOXQ1 y/o CLDN1. En algunas formas de realización, dichos uno o más biomarcadores comprenden MRPL33. En algunas formas de realización, dichos uno o más biomarcadores comprenden uno o más reguladores de transcripción (por ejemplo, TCF12, TCF7L2 y/o PHF2) En algunas formas de realización, dichos uno o más biomarcadores comprenden uno o más reguladores relacionados con Ras/Rho (por ejemplo, SOS1 (por ejemplo, R547W, T614M R854*, G1129V), S0S2 (por ejemplo, R225*. R854C, y Q1296H) RASGRF2, ARHGAP10, ARHGEF33 y/o Rab40c (por ejemplo, G251SJ). En algunas formas de realización, dichos uno o más biomarcadores comprenden una o más enzimas modificadoras de cromatina (por ejemplo, TET1, TET2, TET3, EP400 y/o MLL). En algunas formas de realización, dichas una o más enzimas modificadoras de cromatina son TET1 y/o TET3. En algunas formas de realización, dichas una o más enzimas modificadoras de cromatina son TET1 (por ejemplo, R81 H, E417A, K540T, K792T, S879L, S1012*, Q1322*. C1482Y, A1896V y A2129V), TET2 (por ejemplo, K108T, T118I, S289L, F373L, K1056N, Y1169*, A1497V y V1857M), y/o TET3 (por ejemplo, T165M, A874T, M977V, G1398R y R1576Q W). En algunas formas de realización, dichos uno o más biomarcadores comprenden una o más tirosina quinasas receptoras (por ejemplo, ERBB3, EPHB4, EFNB3, EPHA1, TYR03, TIE1 y FLT4). En algunas formas de realización, dichos uno o más biomarcadores comprenden una o más quinasas (por ejemplo, RIOK3, PRKCB, MUSK, MAP2K7 y MAP4K5). En algunas formas de realización, dichos uno o más biomarcadores comprenden una o más proteínas fosfatasas (por ejemplo, PTPRN2). En algunas formas de realización, dichos uno o más biomarcadores comprenden uno o más GPRCs (por ejemplo, GPR4 y/o GPR98). En algunas formas de realización, dichos uno o más biomarcadores comprenden una o más E3-ligasa (por ejemplo, TOPORS). En algunas formas de realización, la presencia de dichos uno o más biomarcadores comprende la presencia de una variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) de dichos uno o más biomarcadores listados en la Tabla 2, 3, 4 y/o 5 (por ejemplo, una variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) en la Tabla 2, 3, 4, y/o 5). En algunas formas de realización, la variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) comprende una variación somática (por ejemplo, polimorfismo o mutación).

En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, dichos uno o más biomarcadores comprenden una o más RSPO (por ejemplo, RSP01 , RSP02, RSP03 y/o RSP04). En algunas formas de realización, la presencia de dichos uno o más biomarcadores es indicada por la presencia de niveles de expresión elevados (por ejemplo, en comparación con la referencia) de una o más RSPO (por ejemplo, RSP01 , RSP02, RSP03 y/o RSP04). En algunas formas de realización, dichos uno o más biomarcadores comprenden RSP01. En algunas formas de realización, dichos uno o más biomarcadores comprenden RSP02. En algunas formas de realización, dichos uno o más biomarcadores comprenden RSP03. En algunas formas de realización, dichos uno o más biomarcadores comprenden RSP04.

En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, el uno o más biomarcadores comprenden uno o más genes indicados en la lista en la Tabla 6. En algunas formas de realización, la presencia del uno o más biomarcadores es indicada por la presencia de elevados niveles de expresión (por ejemplo, comparado con la referencia) de uno o más genes indicados en la lista en la Tabla 6. En algunas formas de realización, el uno o más biomarcadores comprenden FOXA1, CLND1, y/o IGF2. En algunas formas de realización, la presencia del uno o más biomarcadores es indicada por la presencia de elevados niveles de expresión (por ejemplo, comparado con la referencia) de FOXA1, CLND1 y/o IGF2. En algunas formas de realización, el uno o más biomarcadores comprenden una vía de señalización expresada en forma diferencial que incluye, pero sin limitación, señalización del calcio, señalización mediada por cAMP, señalización del receptor de glutamato, señalización de esclerosis lateral amiotrófica, metabolismo de nitrógeno, señalización de guía axonal, rol de IL-17A en la psoriasis, señalización del receptor de serotonina, patología de las vías aéreas en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, señalización de la proteína quinasa A, señalización del cáncer de vejiga, señalización de HIF1a, señalización ß-adrenérgica cardíaca, potenciación sináptica a largo plazo, señalización de ateroesclerosis, señalización del ritmo circadiano, señalización de CREB en neuronas, señalización del receptor acoplado a la proteína G, señalización de extravasación de leucocitos, sistema de complementos, señalización de eicosanoides, metabolismo de tirosina, metabolismo de tirosina, depresión sináptica a largo plazo, rol de IL-17A en la artritis, efectos celulares de Sildenafil (Viagra), señalización del dolor neuropático en las neuronas del cuerno dorsal, metabolismo de D-arginina y D-ornttina, rol de IL-17F en las enfermedades inflamatorias alérgicas de las vías respiratorias, señalización del cáncer de tiroides, fibrosis hepática / activación de las células estrelladas hepáticas, señalización del receptor de dopamina, rol de NANOG en la pluripotencia de las células madre embrionarias de mamíferos, biosíntesis de sulfato de condroitina, señalización de endotelina-1 , biosíntesis de sulfato de queratano, vía de fototransducción, señalización de Wnt/ß-catenina, señalización de quimioquina, metabolismo de alanina y aspartato, biosíntesis de glicoesfingolipídos - neolactoseries, biosíntesis de ácido biliar, rol de macrófagos, fibroblastos y células endoteliales en la artritis reumatoide, señalización a-adrenérgica, metabolismo de taurina e hipotaurina, inhibición mediada por LPS/IL- 1 de la función RXR, señalización de la metástasis de cáncer colorrectal, señalización de CCR3 en eosinófilos y/o biosíntesis de O-glicanos.

En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, el uno o más biomarcadores comprenden uno o más genes indicados en la lista de la Tabla 7. En algunas formas de realización, la presencia del uno o más biomarcadores es indicada por la presencia de un número elevado de copias de genes (por ejemplo, comparado con la referencia) de uno o más genes indicados en la lista de la Tabla 7. En algunas formas de realización, el uno o más biomarcadores comprenden IGF2, KRAS, y/o MYC. En algunas formas de realización, la presencia del uno o más biomarcadores es indicada por la presencia de elevado número de copia de genes (por ejemplo, comparado con la referencia) de IGF2, KRAS y/o MYC. En algunas formas de realización, la presencia del uno o más biomarcadores es indicada por la presencia de un número reducido de copias de genes (por ejemplo, comparado con la referencia) de uno o más genes indicados en la lista de la Tabla 7. En algunas formas de realización, el uno o más biomarcadores comprenden FHIT, APC y/o SMAD4. En algunas formas de realización, la presencia del uno o más biomarcadores es indicada por la presencia de un número reducido de copias de genes (por ejemplo, comparado con la referencia) de FHIT, APC y/o SMAD4. En algunas formas de realización, la presencia del uno o más biomarcadores es indicada por la presencia de un número elevado de copias (por ejemplo, comparado con la referencia) de cromosomas 20q. En algunas formas de realización, la presencia del uno o más biomarcadores es indicada por la presencia de un número reducido de copias (por ejemplo, comparado con la referencia) de cromosomas 18q.

En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, el uno o más biomarcadores comprenden uno o más genes indicados en la lista de la Tabla 9. En algunas formas de realización, la presencia del uno o más biomarcadores es indicada por la presencia de una variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) de uno o más genes indicados en la lista de la Tabla 9 (por ejemplo, una variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) en la Tabla 9) y/o corte y empalme alternativo (por ejemplo, comparado con la referencia) de uno o más genes indicados en la lista de la Tabla 9. En algunas formas de realización, el uno o más biomarcadores comprenden TP53, NOTCH2, MRPL33, y/o EIF5B. En algunas formas de realización, el uno o más biomarcadores son MRPL33. En algunas formas de realización, la presencia del uno o más biomarcadores es indicada por la presencia de una variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) de TP53, NOTCH2, MRPL33 y/o EIF5B (por ejemplo, una variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) en la Tabla 9) y/o corte y empalme alternativo (por ejemplo, comparado con la referencia) de TP53, NOTCH2, MRPL33 y/o EIF5B.

En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, el uno o más biomarcadores comprenden una translocación (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) de uno o más genes indicados en la lista de la Tabla 10. En algunas formas de realización, la presencia de uno o más biomarcadores comprende la presencia de una translocación (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) de uno o más genes indicados en la lista de la Tabla 10 (por ejemplo, una translocación (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) en la Tabla 10). En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, la translocación (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una translocación de PVT1 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión). En algunas formas de realización, la translocación de PVT1 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende PVT1 y MYC. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende PVT1 e IncDNA. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, la translocación (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión). En algunas formas de realización, la translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una translocación de RSP01 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión). En algunas formas de realización, la translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión). En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende EIF3E y RSP02. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende EIF3E exón 1 y RSP02 exón 2. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende EIF3E exón 1 y RSP02 exón 3. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende la SEQ ID NO:71. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es detectable por los cebadores que incluyen las SEQ ID NOs: 12, 41 y/o 42. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es dirigida por el promotor EIF3E. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es dirigida por el promotor RSP02. En algunas formas de realización, la translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión). En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende PTPRK y RSP03. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende PTPRK exón 1 y RSP03 exón 2. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende PTPRK exón 7 y RSP03 exón 2. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende la SEQ ID NO:72 y/o la SEQ ID N0.73. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es detectable por los cebadores que incluyen las SEQ ID NOs: 13, 14, 43 y/o 44. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es dirigida por el promotor PTPRK. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es dirigida por el promotor RSP03. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende la secuencia de señales de secreción de PTPRK (y/o no comprende la secuencia de señales de secreción de RSP03). En algunas formas de realización, la translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una translocación RSP04 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión). En algunas formas de realización, la translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) da por resultado elevados niveles de expresión de R-espondina (por ejemplo, comparado con una referencia sin la translocación de R-espondina). En algunas formas de realización, la translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) da por resultado elevada actividad y/o activación de R-espondina (por ejemplo, comparado con una referencia sin la translocación de R-espondina). En algunas formas de realización, la presencia de uno o más biomarcadores comprende una translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión), tal como una a translocación (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) en la Tabla 10, y KRAS y/o BRAF. En algunas formas de realización, la presencia de uno o más biomarcadores es la presencia de una translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión), tal como una translocación (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) en la Tabla 10, y una variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) de KRAS y/o BRAF. En algunas formas de realización, la presencia de uno o más biomarcadores es la presencia de una translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión), tal como una translocación (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) en la Tabla 10 y la ausencia de uno o más biomarcadores es la ausencia de una variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) de CTNNB1 y/o APC.

En algunas formas de realización de cualquiera de la translocación (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión), la translocación (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una translocación somática (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión). En algunas formas de realización, la translocación (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una translocación intracromosómica (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión). En algunas formas de realización, la translocación (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una translocación intercromosómica (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión). En algunas formas de realización, la translocación (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una inversión. En algunas formas de realización, la translocación (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una supresión. En algunas formas de realización, la translocación (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una translocación funcional del polinucleótido de fusión (por ejemplo, translocación de R-espondina funcional del polinucleótido de fusión) y/o translocación funcional del polipéptido de fusión (por ejemplo, translocación de R-espondina funcional del polipéptido de fusión). En algunas formas de realización, la translocación funcional del polipéptido de fusión (por ejemplo, translocación de R-espondina funcional del polipéptido de fusión) activa un camino que se sabe que es modulado por uno de los genes translocados (por ejemplo, vía de señalización de wnt). En algunas formas de realización, el camino es una vía de señalización de wnt canónica. En algunas formas de realización, el camino es una vía de señalización de wnt no canónica. En algunas formas de realización, los métodos de determinación de la vía de activación son conocidos en el arte e incluyen ensayos de luciferasa reportera como se describe en la presente.

Ejemplos de cánceres y células cancerígenas incluyen, pero no están limitados a, carcinoma, linfoma, blastema (incluyendo meduloblastoma y retinoblastoma), sarcoma (incluyendo liposarcoma y sarcoma de las células sinoviales), tumores neuroendocrinos (incluyendo tumores carcinoides, gastrinoma y cáncer de las células de los islotes), mesotelioma, schwannoma (incluyendo neuroma acústico), meningioma, adenocarcinoma, melanoma y leucemia o malignidades linfoides. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de las células escamosas (por ejemplo, cáncer de las células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de las células pequeñas (SCLC), cáncer de pulmón de las células no pequeñas (NSCLC), adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o estomacal incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer mamario (incluyendo cáncer mamario metastásico), cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer tiroideo, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma del pene, cáncer testicular, cáncer esofágico, tumores del tracto biliar, así como también cáncer de cabeza y de cuello. En algunas formas de realización, el cáncer es cáncer colorrectal. En algunas formas de realización, el cáncer es cáncer de colon. En algunas formas de realización, el cáncer es cáncer rectal.

La presencia y/o los niveles de expresión/la cantidad de un biomarcador (por ejemplo, translocación de R-espondina) pueden ser determinados cualitativamente y/o cuantitativamente en base a cualquier criterio adecuado conocido en el arte, incluyendo, pero no limitado a ADN, mARN, cADN, proteínas, fragmentos de proteínas y/o número de copias de genes. En algunas formas de realización, la presencia y/o los niveles de expresión/la cantidad de un biomarcador en una primera muestra se encuentra aumentada en comparación con la presencia/ausencia y/o los niveles de expresión/la cantidad en una segunda muestra. En algunas formas de realización, la presencia/ausencia y/o los niveles de expresión/la cantidad de un biomarcador en una primera muestra se encuentra disminuida en comparación con la presencia y/o los niveles de expresión/la cantidad en una segunda muestra. En algunas formas de realización, la segunda muestra es una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control. Se describen en la presente divulgaciones adicionales para determinar la presencia/ausencia y/o los niveles de expresión/la cantidad de un gen.

En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, expresión elevada se refiere a un aumento total de alrededor de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor, en el nivel de biomarcador (por ejemplo, proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mARN)), detectado métodos conocidos en el arte estándar tales como los descriptos en la presente, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control. En algunas formas de realización, la expresión elevada se refiere al aumento en el nivel de expresión/la cantidad de un biomarcador en la muestra en donde el aumento es de por lo menos aproximadamente cualquiera de 1 ,5X, 1 ,75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X o 100X el nivel de expresión/la cantidad del biomarcador respectivo en una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control. En algunas formas de realización, expresión elevada se refiere a un aumento total de más de aproximadamente 1 ,5 veces, aprox. 1 ,75 veces, aprox. 2 veces, aprox. 2,25 veces, aprox. 2,5 veces, aprox. 2,75 veces, aprox. 3,0 veces o aprox. 3,25 veces en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control, tejido de control o control interno (por ejemplo, gene constitutivo).

En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, expresión reducida se refiere a una reducción total de aproximadamente cualquiera de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor, en el nivel de biomarcador (por ejemplo, proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mARN)), detectado por métodos conocidos del arte previo tales como los descriptos en la presente, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control. En algunas formas de realización, expresión reducida se refiere a la disminución en el nivel de expresión/la cantidad de un biomarcador en la muestra en donde la disminución es de por lo menos aproximadamente cualquiera de 0,9X, 0,8X, 0,7X, 0,6X, 0.5X, 0,4X, 0,3X, 0,2X, 0,1X, 0.05X o 0.01X el nivel de expresión/la cantidad del biomarcador respectivo en una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control.

La presencia y/o el nivel de expresión/la cantidad de varios biomarcadores en una muestra puede ser analizado por una cantidad de metodologías, muchas de las cuales son conocidas en el arte y comprendidas por el experto, incluyendo, pero sin limitación, inmunohistoquímica ("IHC"), análisis de transferencia Western, inmunoprecipitación, ensayos de ligadura molecular, ELISA, ELIFA, clasificación celular activada por fluorescencia ("FACS"), analizador MassARRAY, proteómica, ensayos cuantitativos basados en sangre (como por ejemplo ELISA en suero), ensayos de actividad enzimática bioquímica, hibridación in situ, análisis Southern, análisis Northern, secuenciacion total del genoma, reacción en cadena de polimerasa ("PCR") incluyendo tiempo real cuantitativo PCR ("qRT-PCR") y otros métodos de detección tipo amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares), RNA-Seq, FISH, análisis de microarreglos, perfilado de la expresión génica y/o análisis serial de la expresión génica ("SAGE"), así como también cualquiera de una amplia variedad de ensayos que pueden ser realizados por análisis de arreglos de proteínas, genes y/o tejidos. Protocolos típicos para evaluar el estado de genes y productos génicos se encuentran, por ejemplo en Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) y 18 (PCR Analysis). También se pueden usar los inmunoensayos multiplexados, tales como los que se encuentran disponibles en "Rules Based Medicine" o "Meso Scale Discovery" ("MSD").

En algunas formas de realización, la presencia y/o el nivel de expresión/la cantidad de un biomarcador se determina usando un método que comprende: (a) realizar el perfilado de la expresión génica, PCR (tal como rtPCR), ARN-seq, análisis de microarreglos, SAGE, técnica de MassARRAY o FISH en una muestra (tal como una muestra de cáncer de un sujeto); y b) determinar la presencia y/o el nivel de expresión/la cantidad de un biomarcador en la muestra. En algunas formas de realización, el método de microarreglos comprende el uso de un chip de microarreglos que tiene una o más moléculas de ácido nucleico que pueden hibridar bajo condiciones rigurosas a una molécula de ácido nucleico que codifica un gen mencionado más arriba o que tiene uno o más polipéptidos (tales como péptidos o anticuerpos) que pueden unirse a una o más de las proteínas codificadas por los genes mencionados más arriba. En una forma de realización, el método PCR es qRT-PCR. En una forma de realización, el método PCR es PCR-multiplex. En algunas formas de realización, la expresión génica se mide por microarreglos. En algunas formas de realización, la expresión génica se mide por qRT-PCR. En algunas formas de realización, la expresión se mide por PCR-multiplex.

Métodos para la evaluación de los mARNs en células son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación usando sondas de ADN complementarias (tales como hibridación in situ usando ribosondas marcadas específicas para el uno o más genes, transferencia Northern y técnicas relacionadas) y varios ensayos de amplificación de ácidos nucleicos (tales como RT-PCR usando cebadores complementarios específicos para uno o más de los genes, y otros métodos de detección del tipo de amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares).

Las muestras de mamíferos pueden ser ensayadas convenientemente para los mARNs usando Northern, técnica de mancha de puntos ("c/of blof) o análisis PCR. Además, tales métodos pueden incluir uno o más pasos que permiten determinar los niveles de mARN objetivo en una muestra biológica (por ejemplo, examinando simultáneamente los niveles de una secuencia de mARN control comparativa de un gen constitutivo ("housekeeping") tal como un miembro de la familia de las actinas). Opcionalmente se puede determinar la secuencia del cADN objetivo amplificado.

Métodos opcionales de la invención incluyen protocolos que examinan o detectan mARNs, tales como mARNs objetivo, en una muestra de tejido o célula por tecnologías de microarreglos. Usando microarreglos de ácidos nucleicos, las muestras de mARN de test y control de muestras de tejido de test y control son transcriptas en forma inversa y marcadas para generar sondas de cADN. Las sondas son hibridadas luego a un arreglo de ácidos nucleicos inmovilizados en un soporte sólido. El arreglo está configurado de tal modo que se conoce la secuencia y la posición de cada miembro del arreglo. Por ejemplo, una selección de genes cuya expresión se correlaciona con un beneficio clínico aumentado o reducido de la terapia antiangiogénica puede ser colocada en un soporte sólido. La hibridación de una sonda marcada con un miembro del arreglo particular indica que la muestra de la cual se derivó la sonda expresa ese gen.

De acuerdo con algunas formas de realización, la presencia y/o el nivel de expresión/la cantidad se mide observando los niveles de expresión de proteínas de un gen antes mencionado. En algunas formas de realización, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con anticuerpos a un biomarcador (por ejemplo, anticuerpos de translocación anti-R-espondina) descripto en la presente bajo condiciones admisibles para la unión del biomarcador, y detectar si se forma un complejo entre los anticuerpos y el biomarcador. Un método como éste puede ser un método in vitro o ¡n vivo. En una forma de realización, se usa un anticuerpo para seleccionar sujetos elegibles para la terapia con un antagonista de la vía de wnt, en particular un antagonista de la translocación de R-espondina, por ejemplo, un biomarcador para la selección de individuos.

En algunas formas de realización, la presencia y/o el nivel de expresión/la cantidad de proteínas del biomarcador en una muestra se examina usando IHC y protocolos de tinción. La tinción IHC de secciones de tejidos ha demostrado ser un método confiable para determinar o detectar la presencia de proteínas en una muestra. En un aspecto, el nivel de expresión del biomarcador se determina usando un método que comprende: (a) realizar el análisis IHC de una muestra (tal como una muestra de cáncer de un sujeto) con un anticuerpo; y b) determinar el nivel de expresión de un biomarcador en la muestra. En algunas formas de realización, la intensidad de tinción de IHC se determina con relación a un valor de referencia.

La IHC se puede realizar en combinación con técnicas adicionales tales como tinción morfológica y/o hibridación in situ con fluorescencia. Se encuentran disponibles dos métodos generales de IHC; ensayos directos e indirectos. De acuerdo con el primer ensayo, la unión del anticuerpo con el antígeno objetivo se determina directamente. Este ensayo directo usa un reactivo marcado, tal como un marcador fluorescente o un anticuerpo primario marcado con enzimas, que puede ser visualizado sin interacción adicional del anticuerpo. En un ensayo indirecto típico, el anticuerpo primario no conjugado se une al antígeno y luego un anticuerpo secundario marcado se une al anticuerpo primario. En donde el anticuerpo secundario es conjugado a una etiqueta enzimática, se agrega un substrato cromogénico o fluorogénico para proveer la visualización del antígeno. La amplificación de la señal ocurre porque varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con diferentes epitopes en el anticuerpo primario.

El anticuerpo primario y/o secundario usado para IHC será marcado típicamente con una parte detectable. Se encuentran disponibles numerosos marcadores que pueden ser agrupados en general en las siguientes categorías: (a) radioisótopos, tales como 35S, 14C, 1251, 3H y 1311; (b) partículas de oro coloidal; (c) marcadores fluorescentes incluyendo, pero no limitados a, quelatos de las tierras raras (quelatos de europio), rojo de Texas, rodamina, fluoresceína, dansilo, lisamina, umbeliferona, ficocriterina, ficocianina o fluoróforos dispnibles comercialmente tales como SPECTRUM ORANGE7 y SPECTRUM GREEN7 y/o derivados de uno cualquiera o más de los mencionados más arriba; (d) se encuentran disponibles varios marcadores de substratos enzimáticos y la patente U.S. No. 4.275.149 provee una revisión de algunas de estos. Ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen las luciferasas (por ejemplo, la luciferasa de luciérnaga y la luciferasa bacteriana; patente U.S. No. 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinadionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como la peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa, y similares.

Ejemplos de combinaciones de enzima-substrato incluyen, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (HRPO) con hidrógeno peroxidasa como un substrato; fosfatasa alcalina (AP) con para-nitrofenil fosfato como substrato cromogénico; y ß-D-galactosidasa (ß-D-Gal) con un substrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil-ß-D-galactosidasa) o un substrato fluorogénico (por ejemplo, 4-metilumbeliferil- - D-galactosidasa). Para una revisión general de estos, ver patentes U.S. Nos. 4.275.149 y 4.318.980.

Las muestras así preparadas pueden ser colocadas y cubiertas con un cubreobjetos. Luego se realiza la evaluación del portaobjetos, por ejemplo, usando un microscopio, y se pueden emplear criterios de intensidad de tinción, usados rutinariamente en el arte. En algunas formas de realización, un resultado de patrón de tinción de alrededor de 1+ o mayor es diagnóstico y/o pronóstico. En algunas formas de realización, un resultado de patrón de tinción de alrededor de 2+ o mayor en un ensayo de IHC es diagnóstico y/o pronóstico. En otras formas de realización, un resultado de patrón de tinción de alrededor de 3 o mayor es diagnóstico y/o pronóstico. En una forma de realización, se entiende que cuando las células y/o el tejido de un tumor o un adenoma de colon son examinados usando IHC, la tinción es determinada o evaluada en general en células y/o tejido tumoral (en contraposición al tejido estromal o circundante que puede estar presente en la muestra).

En métodos alternativos, la muestra puede estar en contacto con un anticuerpo específico para dicho biomarcador (por ejemplo, anticuerpo de translocación anti-R-espondina) bajo condiciones suficientes para que se forme un complejo anticuerpo- biomarcador, y luego detectar dicho complejo. La presencia del biomarcador puede ser detectada en diversas formas, tales como por transferencia Western y procedimientos ELISA para ensayar una amplia variedad de tejidos y muestras, incluyendo plasma o suero. Se encuentran disponibles un amplio rango de técnicas de inmunoensayo usando un formato de ensayo de ese tipo, ver, por ejemplo, las patentes U.S. Nos. 4.016.043, 4.424.279 y 4.018.653. Estos incluyen tanto ensayos de un solo lado como de dos lados o "sandwich" de los tipos no competitivos, así como también en los ensayos de ligadura competitiva tradicionales. Estos ensayos también incluyen la unión directa de un anticuerpo marcado a un biomarcador objetivo.

La presencia y/o el nivel de expresión/la cantidad de un biomarcador seleccionado en una muestra de tejido o células también puede ser examinada por medio de ensayos funcionales o basados en la actividad. Por ejemplo, si el biomarcador es una enzima, se pueden realizar ensayos conocidos en el arte para determinar o detectar la presencia de la actividad enzimática dada en la muestra de tejido o de células.

En algunas formas de realización, las muestras son normalizadas para ambas diferencias en la cantidad del biomarcador ensayado y la variabilidad en la calidad de las muestras usadas, y la variabilidad entre corridas de ensayos. Tal normalización puede ser lograda detectando e incorporando la expresión de algunos biomarcadores bionormalizadores, incluyendo genes constitutivos bien conocidos, tales como ACTB. Alternativamente, la normalización puede estar basada en la señal media o mediana de todos los genes ensayados o un gran subconjunto de los mismos (propuesta de normalización global). En una base de gen por gen, la cantidad normalizada medida de una proteína o mARN de un tumor de un sujeto se compara con la cantidad hallada en un conjunto de referencia. Los niveles de expresión normalizados para cada mARN o proteína por tumor testeado por sujeto pueden ser expresados como un porcentaje del nivel de expresión medido en el conjunto de referencia. La presencia y/o el nivel de expresión/la cantidad medida en una muestra particular de un sujeto a ser analizada se encontrará a algunos percentilos dentro de este rango, que puede ser determinado por métodos bien conocidos en el arte.

En algunas formas de realización, el nivel de expresión relativo de un gen es determinado como sigue: Expresión relativa geni muestral = 2 exp (Ct gen constitutivo - Ct geni) con Ct determinado en una muestra.

Expresión relativa gen ARN de referencia = 2 exp (Ct gen constitutivo - Ct geni) con Ct determinado en la muestra de referencia.

Expresión relativa normalizada geni muestral = (expresión relativa geni muestral / expresión relativa geni ARN de referencia) x 100 Ct es el ciclo umbral. El Ct es el número de ciclos al cual la fluorescencia generada dentro de una reacción cruza la línea umbral.

Todos los experimentos son normalizados a un ARN de referencia, que es una mezcla abarcativa de ARN de varias fuentes de tejido (por ejemplo, ARN de referencia #636538 de Clontech, Mountain View, CA). Un ARN de referencia idéntico es incluido en cada corrida de qRT-PCR, permitiendo la comparación de resultados entre diferentes corridas experimentales.

En una forma de realización, la muestra es una muestra clínica. En otra forma de realización, la muestra se usa en un ensayo de diagnóstico. En algunas formas de realización, la muestra se obtiene de un tumor primario o metastásico.

Frecuentemente se usa una biopsia de tejido para obtener un trozo representativo de tejido tumoral. Alternativamente, las células tumorales se pueden obtener indirectamente en la forma de tejidos o fluidos de los que se sabe o que deberían contener las células tumorales de interés. Por ejemplo, las muestras de lesiones de cáncer de pulmón se pueden obtener por resección, broncoscopia, aspiración con aguja fina, cepillados bronquiales o del esputo, el fluido pleural o la sangre. Los genes o productos de genes pueden ser detectados de tejido cancerígeno o tumoral o de otras muestras corporales tales como orina, esputo, suero o plasma. Las mismas técnicas comentadas más arriba para la detección de genes objetivo o productos de genes en muestras cancerosas pueden aplicarse a otras muestras corporales. Las células cancerosas pueden ser desprendidas de lesiones cancerosas y aparecen en tales muestras corporales. Por medio del examen de tales muestras corporales se puede lograr un diagnóstico temprano simple para estos cánceres. Además, el progreso de la terapia puede ser monitoreado más fácilmente testeando tales muestras corporales con respecto a genes objetivo o productos de genes.

En algunas formas de realización, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control es una sola muestra o muestras múltiples combinadas del mismo sujeto o individuo que se obtienen a uno o más puntos de tiempo diferentes de aquel en el que se obtuvo la muestra de prueba. Por ejemplo, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control se obtiene a un punto de tiempo más temprano del mismo sujeto o individuo que cuando se obtuvo la muestra de prueba. Tal muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control puede ser útil si la muestra de referencia se obtiene durante el diagnóstico inicial de cáncer y la muestra de prueba se obtiene más tarde cuando el cáncer se torna metastásico.

En algunas formas de realización, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control es una muestra múltiple combinada de uno o más individuos sanos que no son el sujeto o individuo. En algunas formas de realización, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control es una muestra múltiple combinada de uno o más individuos con una enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer) que no son el sujeto o individuo. En algunas formas de realización, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control son muestras de ARN reunidas ("pooled") de tejidos normales o muestras de plasma o suero reunidas de uno o más individuos que no son el sujeto o individuo. En algunas formas de realización, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control son muestras de ARN reunidas de tejidos tumorales o muestras de plasma o suero reunidas de uno o más individuos con una enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer) que no son el sujeto o individuo.

En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, el antagonista de la vía de wnt es un antagonista de R-espondina (por ejemplo, RSP01 , RSP02, RSP03 y/o antagonista de RSP04). En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, el antagonista de R-espondina en particular el antagonista de la translocación de R-espondina es un anticuerpo, polipéptido de unión, molécula pequeña de unión o polinucleótido. En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina en particular el antagonista de la translocación de R-espondina es un anticuerpo. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y el fragmento de anticuerpo se une al polipéptido de la vía de wnt en particular el antagonista de R-espondina y/o el polipéptido de fusión de translocación de R-espondina.

En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, el individuo de acuerdo con cualquiera de las formas de realización arriba descriptas puede ser un humano.

En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, el método comprende administrar a un individuo que tiene ese cáncer una cantidad efectiva de un antagonista de la vía de wnt, en particular el antagonista de translocación de R-espondina. En una forma de realización de este tipo, el método comprende además administrar al individuo una cantidad efectiva de por lo menos un agente terapéutico adicional, como se describe más abajo. En algunas formas de realización, el individuo puede ser un humano.

El antagonista de la vía de wnt, en particular el antagonista de la translocación de R-espondina, descripto en la presente se puede usar o bien sólo o en combinación con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, un antagonista de la vía de wnt, en particular el antagonista de translocación de R-espondina, descripto en la presente puede ser coadministrado con por lo menos un agente terapéutico adicional incluyendo otro antagonista de la vía de wnt. En algunas formas de realización, un agente terapéutico adicional es un agente quimioterapéutico.

Tales terapias combinadas indicadas más arriba comprenden la administración combinada (en donde dos o más agentes terapéuticos están incluidos en la misma formulación o en formulaciones separadas), y la administración separada, en cuyo caso, la administración del antagonista de la vía de wnt, en particular el antagonista de translocación de R-espondina, puede ocurrir antes de, simultáneamente, y/o después de la administración del agente terapéutico adicional y/o el adyuvante. El antagonista de la vía de wnt, en particular el antagonista de translocación de R-espondina, también se puede usar en combinación con terapia radiante.

Un antagonista de la vía de wnt, en particular el antagonista de la translocación de R-espondina (por ejemplo, un anticuerpo, polipéptido de unión y/o molécula pequeña) descripto en la presente (y cualquier agente terapéutico adicional) puede ser administrado por cualquier medio adecuado, incluyendo parenteral, intrapulmonar e intranasal, y, si se desea para tratamiento local, administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones endovenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de que la administración sea breve o crónica. Varios esquemas de dosificación, incluyendo, pero sin limitación, administraciones simples o múltiples durante varios puntos de tiempo, la administración por bolo y la infusión por pulsos se contemplan en la presente.

El antagonista de la vía de wnt, en particular el antagonista de R-espondina (por ejemplo, un anticuerpo, polipéptido de unión y/o molécula pequeña) descripto en la presente puede ser formulado, dosificado y administrado de una manera consistente con la buena práctica médica. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, la condición clínica del individuo, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, el esquema de administración, y otros factores conocidos por los médicos que realizan el tratamiento. El antagonista de la vía de wnt, en particular el antagonista de R-espondina, no necesita ser, pero es formulado opcionalmente con uno o más agentes usado comúnmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad efectiva de tales otros agentes depende de la cantidad del antagonista de la vía de wnt, en particular el antagonista de R-espondina, presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores comentados más arriba. Estos se usan en general en las mismas dosis y con las vías de administración que se describen en la presente, o aproximadamente de 1 a 99% de las dosis descriptas en la presente, o en cualquier dosis y por cualquier vía que se haya determinado empíricamente/clínicamente que es apropiada.

Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de un antagonista de la vía de wnt, en particular el antagonista de R-espondina, descripto en la presente (cuando se usa sólo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá el tipo de enfermedad a ser tratada, la severidad y el curso de la enfermedad, si el antagonista de la vía de wnt, en particular el antagonista de R-espondina, es administrado con propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del sujeto y la respuesta al antagonista de la vía de wnt, y la discreción del médico que realiza el tratamiento. El antagonista de la vía de wnt, en particular el antagonista de R-espondina, es administrado adecuadamente al individuo en una sola vez o durante una serie de tratamientos. Una dosis diaria típica puede oscilar entre aprox. 1 pg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados más arriba. Para administraciones repetidas durante varios días o más tiempo, dependiendo de la condición, el tratamiento se mantendría en general hasta que ocurra una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Tales dosis pueden ser administradas en forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de tal modo que el individuo recibe desde aprox. dos a aprox. veinte, o por ejemplo, aprox. seis dosis del antagonista de la vía de wnt). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguida por una o más dosis menores. Un régimen de dosificación ilustrativo comprende la administración. Sin embargo, también son útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia es monitoreado fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

Se entiende que cualquiera de las formulaciones o métodos terapéuticos realizados más arriba pueden ser llevados a cabo usando un inmunoconjugado de la invención en lugar de, o además del, antagonista de la vía de wnt, en particular el antagonista de R-espondina.

///. Composiciones terapéuticas Se proveen en la presente antagonistas de la vía de wnt útiles en los métodos descriptos en la presente. En algunas formas de realización, los antagonistas de la vía de wnt son un anticuerpo, un polipéptido de unión, una molécula pequeña de unión, y/o un polinucleótido. En algunas formas de realización, los antagonistas de la vía de wnt son antagonistas canónicos de la vía de wnt. En algunas formas de realización, los antagonistas de la vía de wnt son antagonistas no canónicos de la vía de wnt.

En algunas formas de realización, los antagonistas de la vía de wnt son antagonistas de R-espondina. En algunas formas de realización, los antagonistas de R-espondina son antagonistas de R-espondina. En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina inhibe la señalización de wnt mediada por LPR6. En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina inhibe y/o bloquea la interacción de R-espondina y LRP6. En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina inhibe la señalización de wnt mediada por LGR5. En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina inhibe y/o bloquea la interacción de R-espondina y LGR5. En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina inhibe la señalización de wnt mediada por KRM. En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina inhibe y/o bloquea la interacción de R-espondina y KRM. En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina inhibe la señalización de wnt mediada por sindecano (por ejemplo, sindecano 4). En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina inhibe y/o bloquea la interacción de R-espondina y sindecano (por ejemplo, sindecano 4). Ejemplos de antagonistas de R-espondina incluyen, pero no están limitados a, aquellos descriptos en WO 2008/046649, WO 2008/020942, WO 2007/013666, WO 2005/040418, WO 2009/005809, US 8.088.374, US 7.541.431, WO 2011/076932, y/o US 2009/0074782, que se incorporan por referencia en su totalidad.

Un componente de la vía de señalización del wnt o polipéptido de la vía de wnt es un componente que transduce una señal que se origina de una interacción entre una proteína Wnt y un receptor Fz. La vía de señalización de wnt es compleja, e involucra una regulación de retroalimentación extensa. Ejemplo de componentes de la vía de señalización de wnt incluyen Wnt (por ejemplo, WNT1 , WNT2, WNT2B, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11 , WNT16), Frizzled (por ejemplo, Frz 1-10), RSPO (por ejemplo, RSPO1 , RSPO2, RSPO3, y/o RSPO4), LGR (por ejemplo, LGR5), WTX, WISP (por ejemplo, WISP1 , WISP2, y/o WISP3), ß????, STRA6, las proteínas asociadas a las membranas LRP (por ejemplo, LRP5 y/o LRP6), Axin y Dishevelled, las proteínas interactivas Wnt extracelulares sFRP, WIF-1 , las proteínas inactivantes de LRP, Dkk y Krn, la proteína citoplasmática ß-catenina, miembros del "complejo de degradación" de la ß-catenina APC, GSK3 , CKIa y PP2A, las proteínas de transporte nuclear APC, pygopus y bcl9/legless, y los factores de transcripción TCF/LEF, Groucho y varias histona acetilasas tales como CBP/p300 y Brg-1.

A. Anticuerpos En un aspecto, se proveen en la presente anticuerpos aislados que se unen al polipéptido de la vía de wnt. En cualquiera de las formas de realización mencionadas más arriba, un anticuerpo es humanizado. En un aspecto adicional de la invención, un anticuerpo vía anti-wnt de acuerdo con cualquiera de las formas de realización mencionadas más arriba es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una forma de realización, un anticuerpo vía anti-wnt es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un Fv, Fab, Fab', scFv, diacuerpo, o fragmento F(ab')2. En otra forma de realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo lgG1" intacto u otra clase de anticuerpo o isotipo como se define en la presente.

En algunas formas de realización de cualquiera de los anticuerpos, el anticuerpo vía anti-wnt es un anticuerpo anti-LRP6. Ejemplos de anticuerpos anti-LRP6 incluyen, pero no están limitados a, los anticuerpos anti-LRP6 descriptos en la solicitud de patente U.S. No. 2011/0256127, que se incorpora por referencia en su totalidad. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-LRP6 inhibe la señalización inducida por una primera isoforma Wnt y potencia la señalización inducida por una segunda isoforma de Wnt. En algunas formas de realización, la primera isoforma de Wnt es seleccionada entre el grupo que consiste en Wnt3 y Wnt3a y la segunda isoforma de Wnt es seleccionada entre el grupo que consiste en Wnt 1 , 2, 2b, 4, 6, 7a, 7b, 8a, 9a, 9b, 10a, y 10b. En algunas formas de realización, la primera isoforma de Wnt es seleccionada entre el grupo que consiste en Wnt 1 , 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b, y 10b y la segunda isoforma de Wnt es seleccionada entre el grupo que consiste en Wnt3 y Wnt3a.

En algunas formas de realización de cualquiera de los anticuerpos, el anticuerpo vía anti-wnt es un anticuerpo anti-Frizzled. Ejemplos de anticuerpos anti-Frizzled incluyen, pero no están limitados a, los anticuerpos anti-Frizzled descriptos en la patente U.S. No. 7.947.277, que se incorpora por referencia en su totalidad.

En algunas formas de realización de cualquiera de los anticuerpos, el anticuerpo vía anti-wnt es un anticuerpo anti-STRA6. Ejemplos de anticuerpos anti-STRA6 incluyen, pero no están limitados a, los anticuerpos anti-STRA6 descriptos en la patente U.S. No. 7.173.115, 7.741.439 y/o 7.855.278, que se incorporan por referencia en su totalidad.

En algunas formas de realización de cualquiera de los anticuerpos, el anticuerpo vía anti-wnt es un anticuerpo antipolipéptido de tipo citoquina S100. En algunas formas de realización, el anticuerpo antipolipéptido de tipo citoquina S100 es un anticuerpo anti-S100-A14. Ejemplos de anticuerpos antipolipéptido de tipo citoquina S100 incluyen, pero no están limitados a, los anticuerpos antipolipéptidos de tipo citoquina S100 descriptos en la patente U.S. No. 7.566.536 y/o 7.005.499, que se incorporan por referencia en su totalidad.

En algunas formas de realización de cualquiera de los anticuerpos, el anticuerpo vía anti-wnt es un anticuerpo anti-R-espondina. En algunas formas de realización, la R-espondina es RSP01. En algunas formas de realización, la R-espondina es RSP02. En algunas formas de realización, la R-espondina es RSP03. En algunas formas de realización, la R-espondina es RSP04. En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina inhibe la señalización de wnt mediada por LPR6. En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina inhibe y/o bloquea la interacción de R-espondina y LRP6. En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina inhibe la señalización de wnt mediada por LGR5. En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina inhibe y/o bloquea la interacción de R-espondina y LGR5. En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina inhibe la señalización de wnt mediada por LGR4. En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina inhibe y/o bloquea la interacción de R-espondina y LGR4. En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina inhibe la señalización de wnt mediada por ZNRF3 y/o RNF43. En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina inhibe y/o bloquea la interacción de R-espondina y ZNRF3 y/o RNF43. En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina inhibe la señalización de wnt mediada por KRM. En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina inhibe y/o bloquea la interacción de R-espondina y KRM. En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina inhibe la señalización de wnt mediada por sindecano (por ejemplo, sindecano 4). En algunas formas de realización, el antagonista de R-espondina inhibe y/o bloquea la interacción de R-espondina y sindecano (por ejemplo, sindecano 4). Ejemplos de anticuerpos de R-espondina incluyen, pero no están limitados a, cualquier anticuerpo divulgado en US 2009/0074782, US 8088374, US 8.158.757, US8.1587.58 y/o US Biological R9417-50C, que se incorporan por referencia en su totalidad.

En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-R-espondina se une a un polipéptido de fusión de translocación de R-espondina. En algunas formas de realización, los anticuerpos que se unen al polipéptido de fusión de translocación de R-espondina se unen específicamente a un polipéptido de fusión de translocación de R-espondina, pero no se unen substancialmente a R-espondina tipo salvaje y/o un segundo gen de la translocación. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de R-espondina es un polipéptido de fusión de translocación de RSP01. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión translocación de R-espondina es el polipéptido de fusión de translocación de RSP02. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de R-espondina es el polipéptido de fusión de translocación de RSP03. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de R-espondina es el polipéptido de fusión de translocación de RSP04. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP02 comprende EIF3E y RSP02. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP02 comprende EIF3E exón 1 y RSP02 exón 2. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP02 comprende EIF3E exón 1 y RSP02 exón 3. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP02 comprende la SEQ ID NO:71. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP03 comprende PTPRK y RSP03. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP03 comprende PTPRK exón 1 y RSP03 exón 2. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP03 comprende PTPRK exón 7 y RSP03 exón 2. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP03 comprende la SEQ ID NO:72 y/o la SEQ ID NO:73. 4 En un aspecto adicional, un anticuerpo vía anti-wnt, en particular, un anticuerpo antitranslocación de R-espondina, de acuerdo con cualquiera de las formas de realización mencionadas más arriba puede incorporar cualquiera de las características, solas o en combinación, como se describe en las secciones más abajo: Afinidad de anticuerpo En ciertas formas de realización, un anticuerpo provisto en la presente tiene una constante de disociación (Kd) de= 1 µ?. En una forma de realización, se mide Kd por un ensayo de unión al antígeno radiomarcado (RIA) se realiza con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno se describe con el siguiente ensayo. La afinidad de unión en solución de los Fab para el antígeno se mide al equilibrar el Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125l) en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, luego se captura el antígeno unido en una placa cubierta de anticuerpo anti-Fab (ver, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, las placas multipocillo MICROTITER® (Thermo Scientific) se recubren toda la noche con 5 g/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en 50 mM de carbonato de sodio (pH 9,6), y posteriormente se bloquea con 2% (p/v) de albúmina sérica bovina en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc N.° 269620), 100 pM o 26 pM de antígeno [125l] se mezclan con diluciones seriadas de un Fab de interés (por ejemplo, compatible con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés posteriormente se incuba toda la noche, sin embargo, la incubación puede continuar durante un período más largo (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para asegurar que se alcance el equilibrio. Luego, las mezclas se transfieren a la placa de captura para la incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). Luego la solución se elimina y la placa se lava ocho veces con 0,1% de polisorbato (TWEEN-20™ ) en PBS. Cuando las placas se han secado, se agrega 150 µ?/pocillo de centelleo (MICROSCINT-20™; Packard) y las placas se cuentan en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Se seleccionan las concentraciones de cada Fab que dan menos o igual a 20% de la unión máxima para usar en los ensayos de unión competitiva.

De acuerdo con otra forma de realización, la Kd se mide por el uso de ensayos de resonancia del plasmón superficial usando un BIACORE®-2000 o un BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips de antígeno inmovilizado de CM5 a ~10 unidades de respuesta (RU). En breves palabras, los chips del biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-A -(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y /V-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con 10 mM de acetato de sodio, pH 4,8, a 5 g/ml (~0,2 µ ) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 µ?/minuto para obtener aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de la proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyecta 1 M de etanolamina para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones de cinética, se inyectan dos diluciones seriadas dos veces de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con 0,05% de tensioactivo polisorbato 20 TWEEN-20™ (PBST) a 25 °C con una velocidad de flujo de aproximadamente 25 µ?/min. Las tasas de asociación (kon) y disociación (k0ff) se calculan usando un modelo de Langmuir simple uno a uno (programa de computación BIACORE® Evaluation versión 3.2) con ajuste simultáneo de los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la relación k0ff/kon. Ver, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Bíol. 293:865-881 (1999). Si la tasa de asociación excede 106 M"1 s"1 por el ensayo de resonancia del plasmón superficial anterior, entonces la tasa de asociación se puede determinar por el uso de una técnica de inactivación fluorescente que mide el aumento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de paso de banda) a 25°C de 20 nM de anticuerpo anti-antígeno (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medido en espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo de detención (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-A INCO™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

Fragmentos de anticuerpo En ciertas formas de realización, un anticuerpo provisto en la presente es un fragmento de anticuerpo. Los Fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, los fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, y scFv, y otros fragmentos que se describen a continuación. Para una revisión de ciertos fragmentos de anticuerpo, ver Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para una revisión de fragmentos scFv, ver, por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 1 13, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); ver también WO 93/16185; y Patentes U.S. Nros. 5.571.894 y 5.587.458. Para la discusión de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden los residuos del epitope de unión al receptor de reciclaje y que tienen vida media larga, ver Patente U.S. N.° 5.869.046.

Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión al antígeno que pueden ser bivalentes o bispecíficos. Ver, por ejemplo, EP 404,097; WO 1993/01161 ; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden el total o una porción del dominio variable de cadena pesada o el total o una porción del dominio variable de cadena liviana de un anticuerpo. En ciertas formas de realización, un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; ver, por ejemplo, Patente U.S. N.° 6.248.516 B1).

Los fragmentos de anticuerpo se pueden obtener por varias técnicas, que incluyen pero sin limitación digestión proteolítico de un anticuerpo intacto así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo E. coli o fago), como se describen en la presente.

Anticuerpos quiméricos y humanizados En ciertas formas de realización, un anticuerpo provisto en la presente es un anticuerpo quimérico. Ciertos anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en la Patente U.S. N.° 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo, o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "cambio de clase" en que la clase o subclase ha sido cambiada desde la del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen los fragmentos de unión al antígeno de esto.

En ciertas formas de realización, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Normalmente, un anticuerpo no humano es humanizado para reducir la inmunogenicidad en los seres humanos, a la vez que se retiene la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. Generalmente, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, CDR, (o porciones de estos) derivan de un anticuerpo no humano, y las FR (o porciones de estas) derivan de las secuencias del anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante humana. En algunas formas de realización, algunos residuos de la FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen con los correspondientes residuos de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados y los métodos de obtenerlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), y se describen adicionalmente, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); Patentes U.S. Nros. 5.821.337, 7.527.791 , 6.982.321 , y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25- 34 (2005) (que describen el injerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describen "revestimiento"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describe "transposición de FR"); y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J., cáncer 83:252-260 (2000) (que describe el método de "selección guiada" para la transposición de FR).

Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen pero sin limitación: regiones estructurales seleccionadas usando el método de "mejor ajuste" (ver, por ejemplo, Sims et al. J. Immunol. 151 :2296 (1993)); regiones estructurales derivadas de la secuencia de consenso de los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena liviana o pesada (ver, por ejemplo, Cárter et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta et al. J. Immunol., 151 :2623 (1993)); regiones estructurales maduras humanas (con mutación somática) o regiones estructurales de la línea germinal humana (ver, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones estructurales derivadas de la selección de bibliotecas de FR (ver, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271 :22611-22618 (1996)).

Anticuerpos humanos En ciertas formas de realización, un anticuerpo provisto en la presente es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando varias técnicas conocidas en la materia. Los anticuerpos humanos se describen en general en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).

Los anticuerpos humanos se pueden preparar por la administración de un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta al estímulo antigénico. Tales animales normalmente contienen todo o una porción de los locus de la inmunogiobulina humana, que reemplaza los locus de la inmunogiobulina endógena, o que están presentes en forma extracromosómica o integrada aleatoriamente en los cromosomas del animal. En tales ratones transgénicos, se han inactivado los locus de la inmunogiobulina endógena. Para la revisión de los métodos para obtener anticuerpos humanos de los animales transgénicos, ver Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Ver también, por ejemplo, las Patentes U.S. Nros. 6.075.181 y 6.150.584 que describe tecnología XENOMOUSE™; Patente U.S. N.° 5.770.429 que describe la tecnología HUMAB®; Patente U.S. N.° 7.041.870 que describe la tecnología K-M MOUSE®, y Publicación de la solicitud de patente U.S. N.° US 2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUSE®). Las regiones variables humanas de los anticuerpos intactos generado por tales animales se pueden modificar adicionalmente, por ejemplo, por la combinación con una región constante humana diferente.

Los anticuerpos humanos también se pueden por métodos basados en hibridoma. Se han descripto líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano para la producción de los anticuerpos humanos monoclonales. (Ver, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Los anticuerpos humanos generados por medio de tecnología de hibridoma de células B humanas también se describen en Li et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Los métodos adicionales incluyen a los que se describen, por ejemplo, en la Patente U.S. N.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales de las líneas celulares del hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que describe los hibridomas humane— humano). La tecnología del hibridoma humano (tecnología Trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods y Findings in Experimental and Clin. Pharma., 27(3):185-91 (2005).

Los anticuerpos también se pueden generar por aislamiento de las secuencias del dominio variable del clon Fv seleccionados de las bibliotecas de despliegue en fago derivadas humanas. Tales secuencias del dominio variable luego se pueden combinar con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de las bibliotecas del anticuerpo se describen a continuación.

Anticuerpos derivados de bibliotecas Los anticuerpos de la invención se pueden aislar por medio de bibliotecas combinatorias de selección de anticuerpos actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, una variedad de métodos son conocidos en la técnica para generar bibliotecas de despliegue de fagos y analizar dichas bibliotecas para hallar anticuerpos que posean las características de unión deseadas. Dichos métodos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se describen adicionalmente, por ejemplo, en McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).

En ciertos métodos de despliegue en fagos, Los repertorios de los genes VH y VL se pueden clonar separadamente por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y recombinar al azar en bibliotecas de fagos, que luego se pueden analizar para hallar clones de unión con el antígeno como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Los fagos normalmente despliegan fragmentos de anticuerpo, sea como fragmentos de cadena simple Fv (scFv) o como fragmentos Fab. Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad para el inmunógeno sin el requisito de la construcción de hibridomas. Alternativamente, el repertorio inactivo se puede clonar (por ejemplo, del ser humano) para proporcionar una fuente única de anticuerpos humanos con una amplia variedad de antígenos no propios y propios sin ninguna inmunización como se describe en Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, las bibliotecas inactivas también se pueden también preparar sintéticamente por clonación de los segmentos génicos V de las células madre, y mediante los cebadores de PCR que contienen secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para obtener el cambio de lugar in vitro como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patente que describen bibliotecas de fago de anticuerpo humano incluyen, por ejemplo: Patente US N.° 5.750.373, y Publicaciones de patente US Nros. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/01 7126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, y 2009/0002360.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de bibliotecas de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humanos en la presente. 6. Anticuerpos multiespecíficos En ciertas formas de realización, un anticuerpo provisto en la presente es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En ciertas formas de realización, una de las especificidades de unión es para el polipéptido de vía wnt como un polipéptido de fusión de translocación de R-espondina y el otro es para cualquier otro antígeno. En ciertas formas de realización, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir con dos epitopes diferentes del polipéptido de la vía wnt como un polipéptido de fusión de translocación de R-espondina. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden usar para localizar agentes citotóxicos en células que expresan el polipéptido de la vía wnt como un polipéptido de fusión de translocación de R-espondina. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.

Las técnicas para obtener anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero sin limitación, la coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada -cadena liviana de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, y Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)) y, manipulación genética "botón en ojal" (ver, por ejemplo, Patente U.S. N.° 5.731.168). Los anticuerpos multiespecíficos también se pueden obtener por manipulación genética de los efectos inductores electrostáticos para obtener anticuerpo Fc-moléculas heterodiméricas (documento WO 2009/089004A1); entrecruzamiento de dos o más anticuerpos o fragmentos (ver, por ejemplo, Patente US N.° 4.676.980, y Brennan et al, Science, 229: 81 (1985)); usando cierres de leucina para producir anticuerpos biespecíficos (ver, por ejemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); usando tecnología "diacuerpo" para obtener los fragmentos de anticuerpo biespecífico (ver, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); y por el uso de dímeros de cadena única Fv (sFv). (ver, por ejemplo Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y la preparación de anticuerpos triespecíficos como se describió, por ejemplo, en Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Los anticuerpos manipulados genéticamente con tres o más sitios de unión de unión al antígeno funcionales, que incluye "anticuerpos Octopus" también se incluyen en la presente (ver, por ejemplo, documento US 2006/0025576).

El anticuerpo o fragmento en la presente también incluye un "FAb de acción dual" o "DAF" que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a un polipéptido de la vía wnt como un polipéptido de fusión de translocación de R-espondina, así como otro antígeno diferente (ver el documento US 2008/0069820, por ejemplo). 7. Variantes de anticuerpos Variantes de glicosilación En ciertas formas de realización, un anticuerpo provisto en la presente se altera para aumentar o disminuir el grado de glicosilación del anticuerpo. La adición o supresión de sitios de glicosilación en un anticuerpo se obtiene en forma conveniente por la alteración de la secuencia de aminoácidos de modo de crear o eliminar una o más de los sitios de glicosilación.

Cuando el anticuerpo comprende una región Fe, se puede alterar el carbohidrato unido a este. Los anticuerpos nativos producidos por las células de mamífero normalmente comprenden un oligosacáridos biantenario ramificado que en general está unido por una ligadura N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fe. Ver, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Los oligosacáridos pueden incluir varios carbohidratos, por ejemplo, mañosa, N-acetilglucosamina (GIcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una mucosa unida a un GIcNAc en el "tallo" de la estructura del oligosacárido biantenario. En algunas r formas de realización, las modificaciones del oligosacárido de un anticuerpo de la invención se pueden realizar a fin de crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas.

En una forma de realización, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una estructura de carbohidrato que carece de mucosa unida (en forma directa o indirecta) a una región Fe. Por ejemplo, la cantidad de mucosa en tal anticuerpo puede ser de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% o de 20% a 40%. La cantidad de mucosa se determina por el cálculo de la cantidad promedio de mucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, con respecto a la suma de todas glicoestructuras unidas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras de mañosa híbrida y alta, complejas) que se mide por espectrometría de masa MALDI-TOF, que se describe en, por ejemplo, WO 2008/077546. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 de la región Fe (numeración de Eu de los residuos de la región de Fe); sin embargo, Asn297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos corriente arriba o corriente abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia menores en los anticuerpos. Tales variantes de fucosilación pueden tener función de ADCC mejorada. Ver, por ejemplo, Publicaciones de patente US Nros. US 2003/0157108 (Presta, L); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfucosiladas" o "deficientes en fucosa" incluyen: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621 ; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos desfucosilados incluyen células CHO Lec13 deficientes en la fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US N.° 2003/0157108, Presta, L; y WO 2004/056312, Adams et al., especialmente en el Ejemplo 11), y líneas de células inactivadas tales como el gen de alfa-1 ,6-fucosiltransferasa FUT8, células CHO inactivadas (ver, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y WO2003/085107).

También se proporcionan variantes de anticuerpos con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en el que un oligosacárido biantenario fijado a la región Fe del anticuerpo se biseca con GIcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener fucosilacion reducida y/o función de ADCC mejorada. Se describen ejemplos de dichas variantes de anticuerpo, por ejemplo, en WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); Patente US N.° 6,602,684 (Umana et al.); y US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fe. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener mejor función de CDC. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).

Variantes de la región Fe En ciertas formas de realización, se pueden introducir una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fe de un anticuerpo provisto en la presente, de este modo se genera una variante de la región Fe. La variante de la región Fe puede comprender una secuencia de la región Fe humana {por ejemplo, una región Fe de lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácido {por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos.

En ciertas formas de realización, la invención contempla una variante del anticuerpo que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, lo que la convierte en una candidata deseable que para muchas aplicaciones en las que la vida media del anticuerpo in vivo es importante, ya que ciertas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Los ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo se pueden realizar para confirmar la reducción/depleción de las actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, los ensayos de unión al receptor de Fe (FcR) se pueden realizar para asegurar que el anticuerpo carezca de la unión a FcyR (por consiguiente probablemente que carezca de actividad ADCC), pero retenga la capacidad de unión al FcRn. Las células principales para la mediación de ADCC, las células NK, expresan solo Fc(RIII, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. La expresión de FcR en las células hematopoyéticas se sintetiza en la Tabla 3 de la página 464 of Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Los ejemplos no limitantes de los ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describe en la Patente U.S. N.° 5.500.362 (ver, por ejemplo Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'IAcad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nat'I Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5.821.337 (ver Bruggemann, . et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). En forma alternativa, se pueden emplear métodos de ensayo no radiactivos (ver, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radiactiva ACTI™ por citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y ensayo de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96® (Promega, Madison, Wl). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células citolíticas naturales (NK). En forma alternativa o adicional, se puede evaluar la actividad de ADCC de la molécula de interés in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como se describió en Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Los ensayos de unión C1q también se pueden llevar a cabo para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unirse a C1q y por consiguiente carece de actividad de CDC. Ver, por ejemplo, ELISA de unión de C1q y C3c en WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del commplemento, se puede realizar un ensayo CDC (ver, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101 :1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). También se pueden realizar determinaciones de la unión de FcRn y la depuración/vida media in vivo usando métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).

Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más residuos de la región Fe 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (Patente U.S. N.° 6.737.056). Tales mutantes de Fe incluyen las mutantes de Fe con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, que incluyen la llamada muíante de Fe "DANA" con la sustitución de los residuos 265 y 297 para alanina (Patente US N.° 7.332.581).

Se describen ciertas variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida a las FcR. (Ver, por ejemplo, Patente U.S. N.° 6.737.056; WO 2004/056312, y Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001 ).) En ciertas formas de realización, una variante del anticuerpo comprende una región Fe con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333, y/o 334 de la región Fe (numeración EU de residuos).

En algunas formas de realización, las alteraciones se realizan en la región Fe que produce unión a Ciq alterada (es decir, mejorada o disminuida) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por ejemplo, como se describe en la Patente US N.° 6.194.551 , WO 99/51642, y Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178^1184 (2000).

Los anticuerpos con aumento de vida media y mejor unión al receptor neonatal receptor de Fe (FcRn), que es el responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones en ella que aumentan la unión de la región Fe a FcRn. Tales variantes de Fe incluyen aquellas con substituciones en uno o más residuos de la región Fe: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, substitución del residuo 434 de la región Fe (Patente US N.° 7.371.826).

Ver también Duncan & Winter, Nature 322:738^0 (1988); Patente U.S. N.° 5.648.260; Patente U.S. N.° 5.624.821 ; y WO 94/29351 con respecto a otros ejemplos de las variantes de la región Fe.

Variantes de anticuerpo con cistina manipulada genéticamente En ciertas formas de realización, se puede desear crear anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína, por ejemplo, "tioMAbs", en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En formas de realización particulares, los residuos sustituidos aparecen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir estos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos en consecuencia se ubican en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo con otros residuos, tales como residuos de fármaco o residuos de fármaco-ligador, para crear un inmunoconjugado, como se describe adicionalmente en la presente. En ciertas formas de realización, alguno o más de los siguientes residuos se puede sustituir con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena liviana; A118 (numeración de EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración de EU) de la cadena pesada de la región Fe. Los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína se pueden generar como se describe, por ejemplo, en la Patente U.S. N.° 7.521.541.

Inmunoconjugados También se proporcionan en la presente inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo de la vía anti-wnt como un polipéptido de fusión de translocación de R-espondina conjugado en la presente con uno o más agentes citotóxicos tales como un agentes quimioterapéuticos o fármacos, agentes inhibitorios del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, planta o animal o sus fragmentos), o isótopos radiactivos.

En una forma de realización, un inmunoconjugado es un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) en que un anticuerpo se conjuga a uno o más fármacos, que incluyen, pero sin limitación un maytansinoide (ver Patentes U.S. Nros. 5.208.020, 5.416.064 y Patente Europea EP 0 425 235 B1); una auristatina tal como restos DE y DF de monometilauristatina fármaco (MMAE y MMAF) (ver Patentes U.S. Nros. 5.635.483 y 5.780.588, y 7.498.298); una dolastatina; una calicheamicina o derivado de esta (ver Patentes U.S. Nros. 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701 , 5.770.710, 5.773.001 , y 5.877.296; Hinman et al., Cáncer Res. 53:3336-3342 (1993); y Lode et al., Cáncer Res. 58:2925-2928 (1998)); una antraciclina tal como daunomicina o doxorrubicina (ver Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); y Patente U.S. N.° 6,630.579); metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel, y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.

En otra forma de realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en la presente conjugado a una toxina enzimáticamente activa y fragmentos de estas que incluyen, pero sin limitación, cadena A de difteria, fragmentos activos de no unión de la toxina de difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteína Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricótesenos En otra forma de realización, un inmunoconjugado compren de un anticuerpo que se describe en la presente conjugado a un átomo radiactivo para formar un radioconjugado. Una variedad de isótopos radiactivos están disponibles para la producción de los radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu. Cuando el radioconjugado se usa para la detección, puede comprender un átomo radiactivo para los estudios centellográficos, por ejemplo Te" o I123, o una marca de espín para imagen de resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como imagen de resonancia magnética, mri), tales como nuevamente yodo 123, yodo 131 , indio 111 , flúor 19, carbono 13, nitrógeno 15, oxígeno 17, gadolinio, manganeso o hierro.

Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se preparan por medio una variedad de agentes de acoplamiento de la proteína bifuncional tales como propionato de N— succinimidil— 3— (2— piridilditiol) (SPDP), succinimidil- -(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imdoésteres (tal como adipimidato de dimetilo HCI), ésteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), derivados de bis-diazonio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activo (tal como 1 ,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).) Por ejemplo se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Ver WO94/11026. El ligador puede ser un "ligador escindible" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un ligador lábil al ácido, ligador sensible a peptidasa, ligador fotolábil, ligador dimetilo o ligador que contiene disulfuro (Chari et al., Cáncer Res. 52:127-131 (1992); Patente U.S. N.° 5.208.020).

Los inmunoconjugados o ADC de la presente contemplan expresamente, pero sin limitación a tales conjugados preparados con reactivos de entrecruzamiento que incluyen, pero sin limitación, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que están disponibles en el comercio (por ejemplo, en Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, Estados Unidos).

C. Polipéptidos de unión Se proveen en la presente antagonistas del polipéptido de unión a la vía de wnt para usar como un antagonista de la vía de wnt en cualquiera de los métodos descriptos en la presente. Los antagonistas de los polipéptidos de unión a la vía de wnt son polipéptidos que se unen, preferentemente en forma específica, a un polipéptido de la vía de wnt.

En algunas formas de realización de cualquiera de los antagonistas de polipéptidos de unión a la vía de wnt, el antagonista del polipéptido de unión a la vía de wnt es un polipéptido quimérico. En algunas formas de realización, el antagonista del polipéptido de unión a la vía de wnt comprende (a) un componente del dominio de Frizzled y (b) un dominio Fe. Por ejemplo, cualquier antagonista de la vía de wnt descripto en la patente U.S. No. 7.947.277, que se incorpora por referencia en su totalidad.

En algunas formas de realización de cualquiera de los antagonistas del polipéptido de unión a la vía de wnt, el antagonista del polipéptido de unión a la vía de wnt es un polipéptido que se une específicamente a Dvl PDZ, en donde dicho polipéptido comprende una región C-terminal que comprende una secuencia con Gly en la posición -2, Trp o Tyr en la posición -1 , Phe o Leu en la posición 0, y un residuo hidrófobo o aromático en la posición -3, en donde la numeración de los aminoácidos se basa en el residuo C-terminal que se encuentra en la posición 0. En algunas formas de realización, la posición -6 es Trp. En algunas formas de realización, la posición -1 es Trp. En algunas formas de realización de cualquiera de los antagonistas del polipéptido de unión a la vía de wnt, el antagonista del polipéptido de unión a la vía de wnt es un polipéptido que se une específicamente a Dvl PDZ con una afinidad de unión de IC50=1 ,5 uM o mejor. En algunas formas de realización, el polipéptido inhibe la interacción de Dvl PDZ con su asociado de unión endógeno. En algunas formas de realización, el polipéptido inhibe la señalización de Wnt mediada por Dvl endógena. En algunas formas de realización, un polipéptido comprende un C-terminus que consiste en KWYGWL (SEQ ID NO: 80). En algunas formas de realización, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos X-i-X2-W-X3-D-X4-P, y en donde ?? es L o V, X2 es L, X3 es S o T y X4 es I, F o L. En algunas formas de realización, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos GEIVLWSDIPG (SEQ ID NO:81). En algunas formas de realización, el polipéptido es cualquier polipéptido descripto en las patentes U.S. N.° 7.977.064 y/o N.° 7.695.928, que se incorporan por referencia en su totalidad.

En algunas formas de realización de cualquiera de los antagonistas del polipéptido de unión a la vía de wnt, el polipéptido de unión se une a WISP. En algunas formas de realización, WISP es WISP1 , WISP2, y/o WISP3. En algunas formas de realización, el polipéptido es cualquier polipéptido descripto en la patente U.S. No. 6.387.657, 7.455.834, 7.732.567, 7.687.460 y/o 7.101.850 y/o la solicitud de patente U.S. No. 2006/0292150, que se incorporan por referencia en su totalidad.

En algunas formas de realización de cualquiera de los antagonistas del polipéptido de unión a la vía de wnt, el polipéptido de unión se une a un polipéptido de tipo citoquina S100. En algunas formas de realización, el polipéptido de tipo citoquina S100 es un polipéptido S100-A14. En algunas formas de realización, el polipéptido es cualquier polipéptido descripto en la patente U.S. No. 7.566.536 y/o 7.005.499, que se incorporan por referencia en su totalidad.

En algunas formas de realización de cualquiera de los antagonistas del polipéptido de unión a la vía de wnt, el antagonista del polipéptido de unión a la vía de wnt es un polipéptido que se une específicamente a STRA6. En algunas formas de realización, el polipéptido es cualquier polipéptido descripto en las patentes U.S. N.° 7.173.115, N 0 7.741.439 y/o N.° 7.855.278, que se incorporan por referencia en su totalidad.

En algunas formas de realización de cualquiera de los antagonistas del polipéptido de unión a la vía de wnt, el polipéptido de unión se une al polipéptido de R-espondina. En algunas formas de realización, el polipéptido de R-espondina es el polipéptido RSP01. En algunas formas de realización, el polipéptido de R-espondina es el polipéptido RSP02. En algunas formas de realización, el polipéptido de R- espondina es el polipéptido RSP03. En algunas formas de realización, el polipéptido de R-espondina es el polipéptido RSP04.

En algunas formas de realización de cualquiera de los polipéptidos de unión, los antagonistas del polipéptido de unión a la vía de wnt se une a un polipéptido de fusión de translocación de R-espondina. En algunas formas de realización, el polipéptido de unión se une específicamente a un polipéptido de fusión de translocación de R-espondina, pero no se une substancialmente a la R-espondina tipo salvaje y/o a un segundo gen de la translocación. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de R-espondina es el polipéptido de fusión de translocación de RSP01. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de R-espondina es el polipéptido de fusión de translocación de RSP02. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de R-espondina es el polipéptido de fusión de translocación de RSP03. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de R-espondina es el polipéptido de fusión de translocación de RSP04. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP02 comprende EIF3E y RSP02. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP02 comprende EIF3E exón 1 y RSP02 exón 2. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP02 comprende EIF3E exón 1 y RSP02 exón 3. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP02 comprende la SEQ ID NO:71. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP03 comprende PTPRK y RSP03. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP03 comprende PTPRK exón 1 y RSP03 exón 2. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP03 comprende PTPRK exón 7 y RSP03 exón 2. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP03 comprende la SEQ ID NO:72 y/o la SEQ ID NO:73.

Los polipéptidos de unión pueden ser sintetizados químicamente usando una metodología de síntesis de polipéptidos conocida o pueden ser preparados y purificados usando tecnología recombinante. Los polipéptidos de unión tienen usualmente por lo menos alrededor de 5 aminoácidos de longitud, alternativamente por lo menos alrededor de 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100 aminoácidos de longitud o más, en donde tales polipéptidos de unión son capaces de unirse, preferentemente en forma específica, a un objetivo, el polipéptido de la vía de wnt, como se describe en la presente. Los polipéptidos de unión pueden ser identificados sin excesiva experimentación usando técnicas bien conocidas. A este respecto, se señala que las técnicas para rastrear las bibliotecas de polipéptidos con respecto a polipéptidos de unión que son capaces de unirse específicamente a un polipéptido objetivo son bien conocidas en el arte (ver, por ejemplo, las patentes U.S. Nos. 5.556.762, 5.750.373, 4.708.871, 4.833.092, 5.223.409, 5.403.484, 5.571.689, 5.663.143; Publicaciones PCT Nros. WO 84/03506 y WO 84/03564; Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci.

U.S.A., 81 :3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., ¡n Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Met , 102:259-274 (1987); Schodes et al., J. ImmunoL, 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al., (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al., (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al., (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al., (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. eí al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363, y Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668).

A este respecto, el display de bacteriófagos (fagos) es una técnica bien conocida que permite rastrear grandes bibliotecas de polipéptidos para identificar a los miembros de tales bibliotecas que son capaces de unirse específicamente a un polipéptido objetivo, el polipéptido de la vía de wnt. El display de fagos es una técnica por la cual variantes de polipéptidos son desplegadas como proteínas de fusión a la proteína de recubrimiento en la superficie de las partículas de bacteriófagos (Scott, J.K. y Smith, G. P. (1990) Science, 249: 386). La utilidad del display de fagos se basa en el hecho de que grandes bibliotecas de variantes de proteínas aleatorizadas selectivamente (o cADNs clonados aleatoriamente) pueden ser clasificadas en forma rápida y eficiente con respecto a aquellas secuencias que se unen a una molécula objetivo con alta afinidad. El display de bibliotecas de péptidos (Cwirla, S. E. et al., (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378) o proteínas (Lowman, H.B. et al., (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al., (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al., (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363) en fagos se han usado para rastrear millones de polipéptidos u oligopéptidos por unos con propiedades de unión específicas (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668). La clasificación de bibliotecas de fagos de mutantes aleatorios requiere una estrategia para construir y propagar un gran número de variantes, un procedimiento para la purificación por afinidad usando el receptor objetivo, y un medio de evaluar los resultados de enriquecimientos de unión. Las patentes U.S. Nros. 5.223.409, 5.403.484, 5.571.689 y 5.663.143.

Aunque la mayoría de los métodos de display de fagos han usado fagos filamentosos, también se conocen sistemas de display de fagos lambdoides (WO 95/34683; U.S. 5.627.024), sistemas de display de fagos T4 (Ren et al., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Cáncer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-^*777 (1997); Ren et al., Gene, 195(2): 303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)) y sistemas de display de fagos T7 (Smith y Scott, Métodos in Enzymology, 217: 228-257 (1993); U.S. 5.766.905).

Mejoras adicionales aumentan la capacidad de los sistemas de display para rastrear bibliotecas de péptidos para unirse con moléculas objetivo seleccionadas y para desplegar proteínas funcionales con el potencial de rastrear estas proteínas con respecto a las propiedades deseadas. Se han desarrollado dispositivos de reacción combinatoria para las reacciones de display de fagos (WO 98/14277) y se han usado bibliotecas de display de fagos para analizar y controlar interacciones bimoleculares (WO 98/20169; WO 98/20159) y propiedades de péptidos helicoidales restringidos (WO 98/20036). El documento WO 97/35196 describe un método para aislar un ligando de afinidad en el cual una biblioteca de display de fagos se pone en contacto con una solución en la cual el ligando se unirá a una molécula objetivo y una segunda solución en la cual el ligando de afinidad no se unirá a la molécula objetivo, para aislar selectivamente los ligandos de unión. El documento WO 97/46251 describe un método de biopanning una biblioteca de display de fagos aleatoria con un anticuerpo purificado por afinidad y luego aislando el fago de unión, seguido por un procedimiento de micropanning usando cavidades de microplacas para aislar el fago de unión de alta afinidad. El uso de la proteína A de Staphylococcus aureus como una etiqueta de afinidad también ha sido reportado (Li et al., (1998) Mol Biotech., 9:187). La WO 97/47314 describe el uso de bibliotecas de substracción de substratos para distinguir las especificidades enzimáticas usando una biblioteca combinatoria que puede ser una biblioteca de display de fagos. Un método para seleccionar enzimas adecuadas para el uso en detergentes usando display de fagos se describe en la WO 97/09446. Métodos adicionales para seleccionar proteínas de unión específicas se describen en las patentes U.S. Nros. 5.498.538, 5.432.018 y WO 98/15833.

Métodos para generar bibliotecas de péptidos y rastrear estas bibliotecas también se divulgan en las patentes U.S. Nros. 5.723.286, 5.432.018, 5.580.717, 5.427.908, 5.498.530, 5.770.434, 5.734.018, 5.698.426, 5.763.192 y 5.723.323.

D. Unión de moléculas pequeñas Se proveen en la presente antagonistas de moléculas pequeñas de la vía de wnt para usar como un antagonista de la vía de wnt en cualquiera de los métodos descriptos en la presente. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía de wnt es un antagonista canónico de la vía de wnt. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía de wnt es un antagonista no canónico de la vía de wnt.

En algunas formas de realización de cualquiera de las moléculas pequeñas, el antagonista de moléculas pequeñas de la vía de wnt es un antagonista de moléculas pequeñas de R-espondina (por ejemplo, antagonista de moléculas pequeñas RSP01 , 2, 3 y/o 4). En algunas formas de realización, el antagonista de moléculas pequeñas de R-espondina es el antagonista de moléculas pequeñas de translocación de RSP01. En algunas formas de realización, el antagonista de moléculas pequeñas de R-espondina es el antagonista de moléculas pequeñas de translocación de RSP02. En algunas formas de realización, el antagonista de moléculas pequeñas de R-espondina es el antagonista de translocación de RSP03. En algunas formas de realización, el antagonista de moléculas pequeñas de R-espondina es el antagonista de moléculas pequeñas de translocación de RSP04.

En algunas formas de realización de cualquiera de las moléculas pequeñas, la molécula pequeña se une a un polipéptido de fusión de translocación de R-espondina. En algunas formas de realización, la molécula pequeña se une específicamente a un polipéptido de fusión de translocación de R-espondina, pero no se une substancialmente a una R-espondina de tipo salvaje y/o a un segundo gen de la translocación. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de R-espondina es el polipéptido de fusión de translocación de RSP01. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de R-espondina es el polipéptido de fusión de translocación de RSP02. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de R-espondina es el polipéptido de fusión de translocación de RSP03. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de R-espondina es el polipéptido de fusión de translocación de RSP04. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP02 comprende EIF3E y RSP02. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP02 comprende EIF3E exón 1 y RSP02 exón 2. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP02 comprende EIF3E exón 1 y RSP02 exón 3. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP02 comprende la SEQ ID NO:71. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP03 comprende PTPRK y RSP03. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP03 comprende PTPRK exón 1 y RSP03 exón 2. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP03 comprende PTPRK exón 7 y RSP03 exón 2. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión de translocación de RSP03 comprende la SEQ ID NO:72 y/o la SEQ ID NO:73.

Las moléculas pequeñas son preferentemente moléculas orgánicas distintas de los polipéptidos de unión o anticuerpos como se definen en la presente que se unen, preferentemente en forma específica, al polipéptido de la vía de wnt como se describe en la presente. Las moléculas pequeñas orgánicas pueden ser identificadas y sintetizadas químicamente usando metodología conocida (ver, por ejemplo, las publicaciones PCT Nros. WO 00/00823 y WO 00/39585). Las moléculas pequeñas orgánicas tiene un tamaño usualmente menor que aproximadamente 2000 Daltons, alternativamente un tamaño menor que aprox. 1500, 750, 500, 250 ó 200 Daltons, en donde tales moléculas pequeñas orgánicas que son capaces de unirse, preferentemente en forma específica, a un polipéptido como se describe en la presente pueden ser identificadas sin excesiva experimentación usando técnicas bien conocidas. A este respecto, se señala que las técnicas para rastrear bibliotecas de moléculas pequeñas orgánicas con respecto a moléculas que son capaces de unirse a un polipéptido objetivo son bien conocidas en el arte (ver, por ejemplo, publicaciones PCT Nos. WO 00/00823 y WO 00/39585). Las moléculas pequeñas orgánicas pueden ser, por ejemplo, aldehidos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas, carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, hidrazinas N-substituidas, hidrazidas, alcoholes, éteres, tioles, tioéteres, disulfuros, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas, ureas, carbamatos, carbonates, cetales, tiocetales, acétales, tioacetales, haluros de arilo, sulfonatos de arilo, haluros de alquilo, sulfonatos de alquilo, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, anilinas, alquenos, alquinos, dioles, amino alcoholes, oxazolidinas, oxazolinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas, epóxidos, aziridinas, isocianatos, cloruros de sulfonilo, compuestos diazo, cloruros ácidos, o similares.

E. Polinucleótidos antagonistas Se proveen en la presente antagonistas de polinucléotidos de la vía de wnt para usar como un antagonista de la vía de wnt en cualquiera de los métodos descriptos en la presente. El polinucleótido puede ser un ácido nucleico antisentido y/o una ribozima. Los ácidos nucleicos antisentido comprenden una secuencia complementaria a por lo menos una porción de un transcripto de ARN de un gen de la vía de wnt. Sin embargo, la complementariedad absoluta, si bien se prefiere, no se requiere. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía de wnt es un antagonista canónico de la vía de wnt. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía de wnt es un antagonista no canónico de la vía de wnt. En algunas formas de realización, el polinucleótido de la vía de wnt es R-espondina. En algunas formas de realización, la R-espondina es RSP01. en algunas formas de realización, la R-espondina es RSP02. En algunas formas de realización, la R-espondina es RSP03. En algunas formas de realización, la R-espondina es RSP04. Ejemplos de antagonistas de polinucleótidos incluyen aquellos descriptos en el documento WO 2005/040418 tales como TCCCATTTGCAAGGGTTGT (SEQ ID NO: 82) y/o AGCTGACTGTGATACCTGT(SEQ ID NO: 83).

En algunas formas de realización de cualquiera de los polinucleótidos, el polinucleótido se une a un polinucleótido de fusión de translocación de R-espondina. En algunas formas de realización, el polinucleótido se une específicamente a un polinucleótido de fusión de translocación de R-espondina, pero no se une substancialmente a R-espondina de tipo salvaje y/o un segundo gen de la translocación. En algunas formas de realización, el polinucleótido de fusión de translocación de R-espondina es el polinucleótido de fusión de translocación de RSPO1. En algunas formas de realización, el polinucleótido de fusión de translocación de R-espondina es el polinucleótido de fusión de translocación de RSPO2. En algunas formas de realización, el polinucleótido de fusión de translocación de R-espondina es el polinucleótido de fusión de translocación de RSPO3. En algunas formas de realización, el polinucleótido de fusión de translocación de R-espondina es el polinucleótido de fusión de translocación de RSP04. En algunas formas de realización, el polinucleótido de fusión de translocación de RSP02 comprende EIF3E y RSP02. En algunas formas de realización, el polinucleótido de fusión de translocación de RSP02 comprende EIF3E exón 1 y RSP02 exón 2. En algunas formas de realización, el polinucleótido de fusión de translocación de RSP02 comprende EIF3E exón 1 y RSP02 exón 3. En algunas formas de realización, el polinucleótido de fusión de translocación de RSP02 comprende la SEQ ID NO:71. En algunas formas de realización, el polinucleótido de fusión de translocación de RSP03 comprende PTPRK y RSP03. En algunas formas de realización, el polinucleótido de fusión de translocación de RSP03 comprende PTPRK exón 1 y RSP03 exón 2. En algunas formas de realización, el polinucleótido de fusión de translocación de RSP03 comprende PTPRK exón 7 y RSP03 exón 2. En algunas formas de realización, el polinucleótido de fusión de translocación de RSP03 comprende la SEQ ID NO:72 y/o la SEQ ID NO:73.

Una secuencia "complementaria a por lo menos una porción de un ARN," mencionada en la presente, significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad para ser capaz de hibridarse con el ARN, formando un dúplex estable; en el caso de ácidos nucleicos antisentido de la vía de wnt de doble hebra, se puede testear así una sola hebra del ADN dúplex, o se pueden ensayar una formación triplex. La capacidad para hibridarse dependerá del grado de complementariedad y de la longitud del ácido nucleico antisentido. En general, cuanto más grande es el ácido nucleico hibridante, tanto más mal apareamientos de bases con un ARN de la vía de wnt contendrá y aún formará un dúplex estable (o triplex, según sea el caso). Un experto en el arte puede determinar un grado de mal apareamiento tolerable mediante el uso de procedimientos estándar para determinar el punto de fusión del complejo hibridado.

Los polinucleótidos que son complementarios al extremo 5' del mensaje, por ejemplo, la secuencia no traducida 5' hasta, e incluyendo, el codón de iniciación AUG, deberían actuar más eficientemente en la inhibición de la traducción. Sin embargo, las secuencias complementarias a las secuencias no traducidas 3' de los mARNs han demostrado también ser efectivas para inhibir la traducción de mARNs. Ver en general, Wagner, R., 1994, Nature 372:333-335. Así, los oligonucleótidos complementarios a o bien las regiones no codificadoras, no traducidas, 5' o 3' del gen de la vía de wnt, se podrían usar en una propuesta antisentido para inhibir la traducción de mARN endógeno de la vía de wnt. Los polinucleótidos complementarios a la región no traducida 5' del mARN deberían incluir el complemento del codón de partida AUG. Los polinucleótidos antisentido complementarios a las regiones codificadoras de mARN son inhibidores de traducción menos eficientes, pero podrían ser usados de acuerdo con la invención. Ya sea designados para hibridarse a la región 5', 3' o codificadora del mARN de la vía de wnt, los ácidos nucleicos antisentido deberían tener por lo menos seis nucleótidos de longitud, y son preferentemente oligonucleótidos que oscilan entre 6 y aprox. 50 nucleótidos de longitud. En aspectos específicos, el oligonucleótido tiene por lo menos 10 nucleótidos, por lo menos 17 nucleótidos, por lo menos 25 nucleótidos o por lo menos 50 nucleótidos.

En una forma de realización, el ácido nucleico antisentido de la vía de wnt de la invención es producido intracelularmente por transcripción de una secuencia exógena. Por ejemplo, un vector o una parte del mismo, es transcripta, produciendo un ácido nucleico antisentido (ARN) del gen de la vía de wnt. Un vector como éste contendría una secuencia que codifica el ácido nucleico antisentido de la vía de wnt. Un vector como éste puede permanecer episomal o tornarse cromosómicamente integrado, siempre que pueda ser transcripto para producir el ARN antisentido deseado. Tales vectores pueden ser construidos por métodos de tecnología de ADN recombinante estándar en el arte. Los vectores pueden ser plásmidos, virales u otros conocidos en el arte, usados para la replicación y la expresión en células de vertebrados. La expresión de la secuencia que codifica la vía de wnt, o fragmentos de los mismos, puede ser cualquier promotor conocido en el arte que actúe en vertebrados, preferentemente células humanas. Tales promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Tales promotores incluyen, pero no están limitados a, la región promotora temprana de SV40 (Bernoist y Chambón, Nature 29:304-310 (1981) , el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., Cell 22:787-797 (1980), el promotor de timidina del herpes (Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445 (1981), las secuencias reguladoras del gen metalotioneína (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982) ), etc.

F. Variantes de anticuerpos y polipéptidos de unión En algunas formas de realización, se consideran las variantes de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos y/o de los polipéptidos de unión provistos en la presente. Por ejemplo, puede ser conveniente mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo y/o del polipéptido de unión.

Las variantes de secuencias de aminoácidos de un anticuerpo y/o polipéptidos de unión pueden ser preparadas introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo y/o el polipéptido de unión, o por síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones de, y/o inserciones en, y/o substituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo y/o polipéptido de unión. Se puede realizar cualquier combinación de supresión, inserción y substitución para llegar al constructo final, siempre que el constructo final posea las características deseadas, por ejemplo, unión al objetivo.

En ciertas formas de realización, se proporcionan variantes de anticuerpo y/o variantes de polipéptidos de unión que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las HVR y FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el título de "sustituciones preferidas". Los cambios más sustanciales, se proporcionan en la Tabla 1, bajo el título de "ejemplos de sustituciones" o como también se describe más adelante con referencia a las clases de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos se pueden introducir en un anticuerpo de interés y los productos se analizan, para determinar una actividad deseada, por ejemplo, unión al antígeno retenido/mejorado, reducción de la inmunogenicidad, mejora de ADCC o CDC.

TABLA 1 Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con las propiedades de las cadenas laterales: (1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, He; (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu; (4) ácido: His, Lys, Arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras supondrán el intercambio un miembro de uno de estas clases por otra clase.

Un tipo de variante de sustitución involucra sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, las variantes resultantes seleccionadas para posterior desarrollo tendrán modificaciones (por ejemplo, mejoradas) en ciertas propiedades biológicas (por ejemplo, aumento de afinidad, reducción de inmunogenicidad) con respecto al anticuerpo original y/o tendrán ciertas propiedades biológicas sustancialmente retenidas. Un ejemplo de variante de sustitución es un anticuerpo de afinidad madura, que se puede generar en forma conveniente, por ejemplo, usando técnicas de maduración de afinidad basadas en despliegue de fagos tales como los que se describen en la presente. En breves palabras, uno o más residuos HVR se mutan y las variantes desplegadas en el fago y se analizan para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).

Las alteraciones (por ejemplo, sustituciones) se pueden realizar en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Tales alteraciones se pueden realizar en "puntos calientes" de la HVR es decir, residuos codificados por codones que experimentan mutación en alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (ver, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o SDR (a-CDR), con la variantes VH o VL resultante que se analiza para determinar la afinidad de unión. La maduración de afinidad por la construcción y reselección de bibliotecas secundarias se ha descripto, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) En algunas formas de realización de maduración de afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos por maduración por alguno de una variedad de métodos (por ejemplo, PCR predispuesta a error, transposición de cadena, o mutagénesis dirigida a oligonucleótidos). Luego se crea una biblioteca secundaria. La biblioteca luego se analiza para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad involucra los abordajes dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de la HVR (por ejemplo, 4-6 residuos de una vez). Los residuos de HVR involucrados en la unión al antígeno se pueden identificar específicamente, por ejemplo, usando mutagénesis por barrido de alanina o modelado. A menudo se localiza selectivamente en particular CDR-H3 y CDR-L3.

En ciertas formas de realización, las sustituciones, inserciones, o supresiones ocurren dentro de una o más HVR siempre que tales alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden realizar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras provistas en la presente) que no reducen sustancialmente la afinidad de unión en las HVR. Tales alteraciones pueden ser externas de los "puntos calientes" de HVR o SDR. En ciertas formas de realización de las secuencias de la variante de VH y VL provistas anteriormente, cada HVR están no alterada, o contiene no más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.

Un método útil para la identificación de residuos o regiones del anticuerpo que son localizaciones preferidas para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" descripto por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, se identifican un residuo o un grupo de residuos blanco (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y se reemplaza con un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si se afecta la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional para las sustituciones adicionales. En forma alternativa o adicional, se puede analizar la estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos vecinos pueden ser localizados selectivamente o eliminados como candidatos para la substitución. Las variantes se pueden analizar para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen las fusiones de amino- y/o carboxilo-terminal que varían de extensión desde un residuo a los polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como las inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen la molécula de anticuerpo con un residuo metionilo N-terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión a los extremos N- o C terminales del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la vida media sérica del anticuerpo.

G. Derivados de anticuerpos y polipéptidos de unión En ciertas formas de realización, un anticuerpo y/o polipéptido de unión provistos en la presente también se puede modificar para contener residuos no proteináceos adicionales que son conocidos en la técnica y fácilmente disponibles. Los residuos adecuados para la derivación del anticuerpo y/o polipéptido de unión incluyen, pero sin limitación polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen pero sin limitación, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli— 1 ,3-dioxolano, pol¡-1 ,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios), y dextrano o poli(n-v¡nil pirrolidona)pol¡et¡lenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico y sus mezclas. El polietilenglicol propionaldehído puede tener ventajas para la fabricación debida a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y si más de un polímero se une, estos pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, se puede determinar el número y/o el tipo de los polímeros usados para la derivación sobre la base de las consideraciones que incluyen pero sin limitación, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo mejorado, si el derivado del anticuerpo se usará en una terapia en condiciones patológicas definidas, etc.

En otra forma de realización, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y/o polipéptido de unión con residuo no proteináceo que se pueden calentar selectivamente por la exposición a la radiación. En una forma de realización, el residuo no proteináceo es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye pero sin limitación, longitudes de onda que no dañan las células comunes, pero que se calientan el residuo no proteináceo a una temperatura en la que se destruyen las células próximas al anticuerpo y/o polipéptido de unión-residuo no proteináceo.

H. Métodos y composiciones recombinantes Los anticuerpos y/o polipéptidos de unión se pueden producir usando métodos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en la Patente U.S. N.° 4.816.567. En una forma de realización, se proporciona el ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-FGFR1 descripto en la presente. Tal ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende la VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas liviana y/o pesada del anticuerpo). En una forma de realización adicional, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden tal ácido nucleico.que codifica el anticuerpo y/o el polipéptido de unión. En una forma de realización adicional, se proporciona una célula huésped que comprende tal ácido nucleico. En tal forma de realización, una célula huésped comprende (por ejemplo, ha sido transformada con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. En una forma de realización, la célula huésped es eucariótica, por ejemplo una célula de ovario de hámster chino (CHO) o célula linfoide (por ejemplo, células YO, NSO, Sp20). En una forma de realización, se proporciona un método de obtener un anticuerpo como un anticuerpo de vía anti-wnt y/o polipéptido de unión, donde el método comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo y/o polipéptido de unión, provistos antes, en las condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y/o polipéptido de unión, y opcionalmente recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de la célula huésped).

Para la producción recombinante de anticuerpo de la vía anti-wnt y/o polipéptido de unión, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo y/o polipéptido de unión, por ejemplo, como se describió anteriormente, se aisla e inserta en uno más vectores para la clonación adicional y/o para expresión en una célula huésped. Tal ácido nucleico se puede aislar fácilmente y secuenciar mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, por medio de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y livianas del anticuerpo).

Las células huésped adecuadas para la clonación o la expresión de los vectores que codifican el anticuerpo incluyen células procarióticas o eucarióticas que se describen en la presente. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden producir en las bacterias, en particular cuando no se necesitan la glicosilación y función efectora del Fe. Para la expresión de los fragmentos de anticuerpos y polipéptidos en las bacterias, ver, por ejemplo, Patentes U.S. Nros. 5.648.237, 5.789.199, y 5.840.523. (Ver también Charlton, Methods in Mol. Biol., Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, que describe la expresión de los fragmentos de anticuerpo en E. coli.) Después de la expresión, el anticuerpo se puede aislar de la pasta celular bacteriana en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente Además de procariotas, los microbios eucariótico tales como los hongos filamentosos o levaduras son huésped de clonación o expresión adecuados para los vectores que codifican anticuerpos, que incluyen cepas de hongos y levaduras cuyas vías de glicosilacion han sido "humanizadas", lo que origina la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilacion parcial o completamente humano. Ver Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).

Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpos y/o polipéptidos de unión glicosilados también derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovirales que se pueden usar en conjunto con las células de insecto, en particular para la transfección de las células de Spodoptera frugiperda.

Los cultivos celulares también se pueden utilizar como huéspedes. Ver, por ejemplo, Patentes U.S. Nros. 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978, y 6.417.429 (que describe la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

Las células de vertebrados se pueden usar como huéspedes. Por ejemplo, las líneas celulares de mamífero que se adaptan a crecer en suspensión pueden ser útiles. Otros ejemplos de las líneas de células huésped de mamíferos útiles son la línea CV1 del riñon de mono transformadas por SV40 (COS-7), línea de riñon embrionario humano (293 o células 293 como se describió, por ejemplo, en Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK,), células de sertoli de ratón (células TM4, como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1), células de riñon de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma cervical humano (HELA), células de riñon canino (MDCK), células de hígado de rata búfalo (BRL 3A,), células de pulmón humano (W138 ), células de hígado humano (Hep G2); tumor mamario de ratón (MMT 060562), células TRI como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982), células MRC 5, células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) que incluyen las células DFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)), y líneas celulares de mieloma tales como YO, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de ciertas líneas celulares huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos y/o polipéptidos de unión, ver, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).

Si bien la descripción se refiere principalmente a la producción de anticuerpos y/o polipéptidos de unión mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico que codifica anticuerpos y polipéptidos de unión, se considera, por supuesto que se pueden emplear métodos alternativos, que son bien conocidos en el arte, para preparar anticuerpos y/o polipéptidos de unión. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos apropiada, o partes de ésta, pueden ser producidas por síntesis directa de péptidos usando técnicas de fase sólida [ver, por ejemplo, Stewart ef al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149- 2154 (1963)]. La síntesis de proteínas in vitro se puede realizar usando técnicas manuales o por automatización. La síntesis automatizada puede realizarse, por ejemplo, usando un Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) usando las instrucciones del fabricante. Varias partes del anticuerpo y/o del polipéptido de unión pueden ser sintetizadas químicamente en forma separada y combinadas usando métodos químicos o enzimáticos para producir el anticuerpo y/o el polipéptido de unión deseado.

IV. Métodos de rastreo y/o identificación de los antagonistas de la vía de wnt con la función deseada Las técnicas para generar los antagonistas de la vía de wnt tales como anticuerpos, polipéptidos de unión y/o moléculas pequeñas han sido descriptos más arriba. Antagonistas adicionales de la vía de wnt, tales como anticuerpos vía anti-wnt, polipéptidos de unión, moléculas pequeñas y/o polinucleótidos provistos en la presente pueden ser identificados, rastreados o caracterizados con respecto a sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por varios ensayos conocidos en el arte.

Se proveen en la presente métodos para rastrear y/o identificar un antagonista de la vía de wnt que inhibe la señalización de la vía de wnt, induce la detención del ciclo celular del cáncer, inhibe la proliferación celular del cáncer y/o promueve la muerte celular en el cáncer, dicho método comprende: (a) poner en contacto (i) una célula cancerosa, tejido canceroso y/o una muestra del cáncer, en donde la célula cancerosa, el tejido canceroso y/o el cáncer comprende uno o más biomarcadores, y (¡i) una célula cancerosa de referencia, un tejido canceroso de referencia y/o una muestra del cáncer de referencia con un antagonista candidato de la vía de wnt, (b) determinar el nivel de señalización de la vía de wnt, la distribución del estadio del ciclo celular, el nivel de la proliferación celular y/o el nivel de la muerte celular del cáncer, por el cual el nivel disminuido de la señalización de la vía de wnt, una diferencia en la distribución del estadio del ciclo celular, un nivel disminuido de proliferación celular y/o un nivel aumentado de muerte de células cancerosas entre la célula cancerosa, el tejido canceroso y/o la muestra de cáncer, en donde la célula cancerosa, el tejido canceroso y/o el cáncer comprende uno o más biomarcadores, y la célula cancerosa de referencia, el tejido canceroso de referencia y/o la muestra de cáncer de referencia identifica el antagonista candidato de la vía de wnt como un antagonista de la vía de wnt que inhibe la señalización de la vía de wnt, induce la detención del ciclo celular del cáncer, inhibe la proliferación celular del cáncer y/o promueve la muerte de las células cancerosas del cáncer. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía de wnt es un antagonista de R-espondina.

Se proveen además en la presente métodos para rastrear y/o identificar un antagonista de la vía de wnt que inhibe la señalización de la vía de wnt, induce la detención del ciclo celular del cáncer, inhibe la proliferación celular del cáncer y/o promueve la muerte de las células del cáncer, dicho método comprende: (a) poner en contacto una célula cancerosa, un tejido canceroso y/o una muestra del cáncer, en donde la célula cancerosa, el tejido canceroso y/o el cáncer comprende uno o más biomarcadores con un antagonista candidato de la vía de wnt, (b) determinar el nivel de señalización de la vía de wnt, la distribución del estadio del ciclo celular, el nivel de proliferación celular y/o el nivel de muerte de las células cancerosas en la célula cancerosa, el tejido canceroso y/o la muestra de cáncer en la ausencia del antagonista candidato de la vía de wnt, por el cual el nivel disminuido de señalización de la vía de wnt, una diferencia en la distribución del estadio del ciclo celular, el nivel disminuido de proliferación celular y/o el nivel aumentado de muerte de células cancerosas entre la célula cancerosa, el tejido canceroso y/o la muestra de cáncer en presencia del antagonista candidato de la vía de wnt y la célula cancerosa, el tejido canceroso, y/o la muestra de cáncer en ausencia del antagonista candidato de la vía de wnt identifica el antagonista candidato de la vía de wnt como un antagonista de la vía de wnt que inhibe la señalización de la vía de wnt, induce la detención del ciclo celular del cáncer, inhibe la proliferación celular del cáncer y/o promueve la muerte celular en el cáncer. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía de wnt es un antagonista de R-espondina.

En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, el uno o más biomarcadores son una translocación (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) de uno o más genes indicados en la lista de la Tabla 9. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos, la translocación (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión). En algunas formas de realización, la translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una translocación de RSP01 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión). En algunas formas de realización, la translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión). En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende EIF3E y RSP02. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamíento y/o fusión) comprende EIF3E exón 1 y RSP02 exón 2. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende EIF3E exón 1 y RSP02 exón 3. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende la SEQ ID NO:71 En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es detectable por cebadores que incluyen las SEQ ID NOs: 12, 41 y/o 42. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es dirigida por el promotor EIF3E. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es dirigida por el promotor de RSP02. En algunas formas de realización, la translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión). En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende PTPRK y RSP03. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende PTPRK exón 1 y RSP03 exón 2. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende PTPRK exón 7 y RSP03 exón 2. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende la SEQ ID NO:72 y/o la SEQ ID NO:73. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es detectable por cebadores que incluyen las SEQ ID NOs: 13, 14, 43 y/o 44. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es dirigida por el promotor PTPRK. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es dirigida por el promotor RSP03r. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende la secuencia de señales de secreción de PTPRK (y/o no comprende la secuencia de señales de secreción de RSP03). En algunas formas de realización, la translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una translocación de RSPO4 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión). En algunas formas de realización, la translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) da por resultado elevados niveles de expresión de R-espondina (por ejemplo, en comparación con una referencia sin la translocación de R-espondina. En algunas formas de realización, el uno o más biomarcadores es una translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) y KRAS y/o BRAF. En algunas formas de realización, la presencia de uno o más biomarcadores es la presencia de una translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) y una variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) KRAS y/o BRAF. En algunas formas de realización, la presencia de uno o más biomarcadores es la presencia de una translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) y la ausencia de uno o más biomarcadores es la ausencia de una variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) CTNNB1 y/o APC.

Los métodos para determinar el nivel de señalización de la vía de wnt son conocidos en el arte y se describen en los Ejemplos en la presente. En algunas formas de realización, los niveles de señalización de la vía de wnt son determinados usando un ensayo reportero de luciferasa como se describe en los Ejemplos. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía de wnt inhibe la señalización de la vía de wnt reduciendo el nivel de señalización de la vía de wnt por aproximadamente cualquiera de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100%.

Los efectos inhibidores del crecimiento de un antagonista de la vía de wnt descriptos en la presente pueden ser evaluados por métodos conocidos en el arte, por ejemplo, usando células que expresan la vía de wnt o bien en forma endógena o después de transfeccion con el o los genes respectivos. Por ejemplo, líneas celulares tumorales apropiadas y células transfectadas con polipéptido de la vía de wnt pueden ser tratadas con un antagonista de la vía de wnt descripto en la presente a varias concentraciones durante algunos días (por ejemplo, 2-7) y teñidas con violeta cristal o MTT o analizadas por algún otro ensayo colorimétrico. Otro método para medir la proliferación sería comparando la captación de 3H-timidina por las células tratadas en presencia o ausencia de un anticuerpo, polipéptido de unión, molécula pequeña y/o polinucleótidos de la invención. Después del tratamiento, las células son cosechadas y la cantidad de radioactividad incorporada en el ADN es cuantificada en un contador de centelleo. Los controles positivos apropiados incluyen tratamiento de una línea celular seleccionada con un anticuerpo inhibidor del crecimiento conocido por inhibir el crecimiento de esa línea celular. La inhibición del crecimiento de las células tumorales in vivo puede ser determinada de varias maneras conocidas en el arte.

Métodos para determinar la distribución del estadio del ciclo celular, el nivel de proliferación celular y/o el nivel de muerte celular son conocidos en el arte. En algunas formas de realización, la detención del ciclo celular del cáncer es detención en G1.

En algunas formas de realización, el antagonista de la vía de wnt inhibirá la proliferación celular del cáncer de la célula cancerosa, el tejido canceroso o la muestra de cáncer in vitro o in vivo en alrededor de 25-100% en comparación con la célula cancerosa, el tejido canceroso, o la muestra de cáncer no tratados, más preferentemente, en alrededor de 30-100% y aún más preferentemente en alrededor de 50-100% o alrededor de 70-100%. Por ejemplo, la inhibición del crecimiento se puede medir a una concentración del antagonista de la vía de wnt de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 30 g/ml o aproximadamente 0,5 nM a aproximadamente 200 nM en cultivo celular, en donde la inhibición del crecimiento es determinada 1 a 10 días después de la exposición de las células tumorales al antagonista candidato de la vía de wnt. El antagonista de la vía de wnt es inhibidor del crecimiento in vivo si la administración del antagonista candidato de la vía de wnt a aprox. 1 pg/kg hasta aprox. 100 mg/kg de peso corporal da por resultado una reducción del tamaño del tumor o la reducción de la proliferación celular del tumor dentro de alrededor de 5 días a 3 meses de la primera administración del antagonista candidato de la vía de wnt, preferentemente dentro de alrededor de 5 a 30 días.

Para seleccionar un antagonista de la vía de wnt que induce la muerte celular en el cáncer, se puede evaluar la pérdida de la integridad de la membrana como se incida, por ejemplo, por yoduro de propidio (Pl), azul trípano o captación de 7AAD con relación a una referencia. Un ensayo de captación de Pl se puede realizar en ausencia de complemento y células efectoras inmunes. Las células tumorales que expresan la vía de wnt son incubadas con medio solamente o medio que contiene el antagonista de la vía de wnt apropiado. Las células son incubadas durante un período de tiempo de 3 días. Después de cada tratamiento, las células se lavan y se forman alícuotas en tubos de 12 x 75 con tapa de filtro de 35 mm (1 mi por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para la remoción de aglomeraciones de células. Los tubos reciben luego Pl (10 pg/ml). Las muestras pueden ser analizadas usando un citómetro de flujo FACSCAN® flow cytometer y software FACSCONVERT® CelIQuest (Becton Dickinson). Aquellos antagonistas de la vía de wnt que inducen niveles estadísticamente significativos de muerte celular según se determinó por la captación de Pl pueden ser seleccionados como anticuerpos, polipéptidos de unión, moléculas pequeñas y/o polinucleótidos que inducen la muerte celular.

Para rastrear los antagonistas de la vía de wnt que se unen a un epitope en, o interactúan con, un polipéptido unido por un anticuerpo de interés, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado de rutina, tal como el descripto en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988). Este ensayo se puede usar para determinar si un antagonista de la vía de wnt candidato se une al mismo sitio o epitope que un anticuerpo conocido. Alternativamente o adicionalmente, se puede realizar un mapeo de epitopes por métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, la secuencia del anticuerpo y/o polipéptido de unión puede ser mutagenizada, tal como por exploración de alanina, para identificar residuos de contacto. El anticuerpo mutante es testeado inicialmente con respecto a la unión con un anticuerpo policlonal y/o polipéptido de unión para asegurar un plegado apropiado. En un método diferente, se pueden usar los péptidos correspondientes a diferentes regiones de un polipéptido en ensayos de competencia con los anticuerpos y/o polipéptidos candidatos o con un anticuerpo y/o polipéptido de unión candidato y un anticuerpo con un epitope caracterizado o conocido.

En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos para rastrear y/o identificar, el antagonista de la vía de wnt candidato es un anticuerpo, un polipéptido de unión, una molécula pequeña o un polinucleótido. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía de wnt candidato es un anticuerpo. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía de wnt (por ejemplo, antagonista de la translocación de R-espondina) es una molécula pequeña.

En un aspecto, un antagonista de la vía de wnt es testeado con respecto a su actividad de unión de un antígeno, por ejemplo, por métodos conocidos, tales como ELISA, transferencia Western, etc.

V. Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas de un antagonista de la vía de wnt como se describe en la presente son preparadas mezclando tal anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales (REMINGTON'S PHARMA. SCI. 16A edición, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía de wnt es una molécula pequeña, un anticuerpo, un polipéptido de unión y/o un polinucleótido. Los portadores farmacéuticamente aceptables son generalmente no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas e incluyen, pero sin limitación: buffer tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos, antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, fenol, alcohol butílico o bencílico, alquil parabenos tales como metil o propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol, y m-cresol), polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos), polipéptidos, proteínas, tal como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas, polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona, aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o Usina, monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol, contraiones formadores de sales tales como sodio; contraiones formadores de sal tales como sodio, complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteínas), y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™; y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables en la presente también incluyen agentes de dispersión intersticial del fármaco tales como glicoproteínas de hialuronidasa activas neuras solubles (sHASEGP), por ejemplo, glicoproteínas de hialuronidasa PH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HILENEX , Baxter International, Inc.). Ciertos ejemplos de sHASEGPs y métodos de uso, que incluyen rHuPH20, se describen en las Publicaciones de patente US Nros. 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, un sHASEGP se combina con uno o más glicosaminoglicanasas adicionales tales como condroitinasas.

Los ejemplos de formulaciones liofilizadas se describen en la Patente US N.° 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpo acuosas incluyen las que se describen en la Patente US N.° 6.171.586 y WO2006/044908, estas últimas formulaciones incluyen un buffer de histidina-acetato.

La formulación de la presente también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, con preferencia aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Tales ingredientes activos están presentes de modo adecuado en combinación con cantidades que son efectivas para el propósito deseado.

Los ingredientes activos también se pueden preparar encerrados en microcápsulas, por ejemplo por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidal (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharma. Sci. 16th edición, Osol, A. Ed. (1980).

Las preparaciones de liberación sostenida se pueden preparar. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el antagonista de la vía wnt, cuyas matrices están en forma de artículos definidos, por ejemplo, películas o microcápsulas.

Las formulaciones que se usan para la administración in vivo son en general estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.

VI. Artículos de manufactura En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descriptos anteriormente. El artículo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo frascos, viales, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los recipientes pueden estar construidos de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente porta una composición que por sí misma o combinada con otras composiciones efectivas para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener una puerta de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o o un vial que tiene una un tapón perforable por una aguja inyectable hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es un antagonista de la vía de wnt (por ejemplo, antagonista de R-espondina, por ejemplo, antagonista de la translocación de R-espondina) descripto en la presente.

La etiqueta o el folleto en el envase indican que la composición se usa para tratar la condición de elección. Además, el artículo producido puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un antagonista de la vía de wnt (por ejemplo, antagonista de R-espondina, por ejemplo, antagonista de la translocación de R-espondina); y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un agente citotóxico adicional u otro agente terapéutico.

En algunas formas de realización, el artículo producido comprende un recipiente, una etiqueta en dicho recipiente y una composición contenida dentro de dicho recipiente; en donde la composición incluye uno o más reactivos (por ejemplo, anticuerpos primarios que se unen a uno o más biomarcadores o sondas y/o cebadores a uno o más de los biomarcadores descriptos en la presente), la etiqueta en el recipiente indica que la composición se puede usar para evaluar la presencia de uno o más biomarcadores en una muestra, e instrucciones para usar los reactivos para evaluar la presencia de uno o más biomarcadores en una muestra. El artículo producido puede comprender además un conjunto de instrucciones y materiales para preparar la muestra y utilizar los reactivos. En algunas formas de realización, el artículo producido puede incluir reactivos tales como anticuerpos primarios y secundarios, en donde el anticuerpo secundario es conjugado a un marcador, por ejemplo, un marcador enzimático. En algunas formas de realización, el artículo producido comprende una o más sondas y/o cebadores a uno o más de los biomarcadores descriptos en la presente.

En algunas formas de realización de cualquiera de los artículos producidos, el uno o más biomarcadores comprenden una translocación (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) de uno o más genes indicados en la lista de la Tabla 9. En algunas formas de realización de cualquiera de los artículos producidos, la translocación (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión). En algunas formas de realización, la translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una translocación de RSP01 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión). En algunas formas de realización, la translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión). En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende EIF3E y RSP02. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende EIF3E exón 1 y RSP02 exón 2. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende EIF3E exón 1 y RSP02 exón 3. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende la SEQ ID NO:71. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es detectable por cebadores que incluyen las SEQ ID NOs: 12, 41 y/o 42. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es dirigida por el promotor EIF3E. En algunas formas de realización, la translocación de RSP02 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es dirigida por el promotor RSP02. En algunas formas de realización, la translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión). En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende PTPRK y RSP03. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende PTPRK exón 1 y RSP03 exón 2. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende PTPRK exón 7 y RSP03 exón 2. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende la SEQ ID NO:72 y/o la SEQ ID NO:73. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es detectable por cebadores que incluyen las SEQ ID NOs: 13, 14, 43 y/o 44. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es dirigida por el promotor PTPRK. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es dirigida por el promotor RSP03. En algunas formas de realización, la translocación de RSP03 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) comprende la secuencia de señales de secreción de PTPRK (y/o no comprende la secuencia de señales de secreción de RSP03). En algunas formas de realización, la translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) es una translocación de RSP04 (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión). En algunas formas de realización, la translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) da por resultado elevados niveles de expresión de R-espondina (por ejemplo, comparado con una referencia sin la translocación de R-espondina. En algunas formas de realización, el uno o más biomarcadores es una translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) y KRAS y/o BRAF. En algunas formas de realización, la presencia de uno o más biomarcadores es presencia de una translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) y una variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) KRAS y/o BRAF. En algunas formas de realización, la presencia de uno o más biomarcadores es presencia de una translocación de R-espondina (por ejemplo, reordenamiento y/o fusión) y la ausencia de uno o más biomarcadores es ausencia de una variación (por ejemplo, polimorfismo o mutación) CTNNB1 /o APC.

En algunas formas de realización de cualquiera de los artículos producidos, los artículos producidos comprenden cebadores. En algunas formas de realización, los cebadores son cualquiera de las SEQ ID NOs:12, 13, 14, 41 , 42, 43 y/o 44.

En algunas formas de realización de cualquiera de los artículos producidos, el antagonista de la vía de wnt (por ejemplo, antagonista de translocación de R-espondina) es un anticuerpo, polipéptido de unión, molécula pequeña o polinucleótido. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía de wnt (por ejemplo, antagonista de translocación de R-espondina) es una molécula pequeña. En algunas formas de realización, el antagonista de la vía de wnt (por ejemplo, antagonista de translocación de R-espondina) es un anticuerpo. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y el fragmento de anticuerpo se une al polipéptido de la vía de wnt (por ejemplo, polipéptido de fusión de translocación de R-espondina).

El artículo de manufactura de esta forma de realización de la invención puede comprender adicionalmente un prospecto que indica que las composiciones de anticuerpos se pueden usar para tratar una afección particular. En forma alternativa o adicional, el artículo de manufactura también puede comprender un segundo recipiente (o tercero) que comprende un buffer farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina regulada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. También puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, que incluye otros buffer, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Otros componentes opcionales en el artículo producido incluyen uno o más buffers (por ejemplo, buffer de bloqueo, buffer de lavado, buffer de substrato, etc.), otros reactivos tales como un substrato (por ejemplo, cromógeno) que está alterado químicamente por un marcador enzimático, una solución de recuperación de epitope, muestras de control (controles positivos y/o negativos), portaobjetos de control, etc.

Se comprende que cualquiera de los artículos producidos puede incluir un inmunoconjugado descripto en la presente en lugar de, o además de, un antagonista de la vía de wnt.

EJEMPLOS Los siguientes son los ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden practicar diversas formas de realización, dada la descripción general provista con anterioridad.

Materiales y métodos para los Ejemplos Muestras, preparaciones de ADN y ARN y testeo de MSI Se obtuvieron muestras de tumores de colon primario congelados frescos y de tejido normal correspondientes de fuentes comerciales sometidas a análisis genómico descripto más abajo. Todos los tejidos tumorales y normales fueron sometidos a una revisión de patología. De un conjunto de 90 muestras se identificaron 74 pares de tumores para análisis ulterior. El ADN y el ARN de los tumores fueron extraídos usando el Qiagen AllPrep DNA/ARN kit (Qiagen, CA). Las muestras de tumores fueron evaluadas con respecto a la inestabilidad de microsatélites usando un kit de detección MSI (Promega, Wl).

Captura y secuenciación de exomas Setenta y dos muestras de tumores y tejidos normales correspondientes fueron analizadas por secuenciación de exomas. La captura de exomas se realizó usando la biblioteca de exomas SeqCap EZ human exome library v2.0 (Nimblegen, Wl) que consistía en 2,1 millones de oligonucleótidos largos optimizados empíricamente que tienen como objetivo ~30.000 genes codificadores (~300,000 exones, tamaño total 36,5 Mb). La biblioteca era capaz de capturar un total de 44,1 Mb del genoma, incluyendo genes y exones representados en RefSeq (enero de 2010), CCDS (Sept. 2009) y miRBase (v.14, Sept. 2009). Las bibliotecas de captura de exomas generadas fueron secuenciadas en HiSeq 2000 (lllumina, CA). Se obtuvo una banda de 2x75 bp de datos finales apareados para cada muestra.

ARN-seq Se usó ARN de 68 pares de muestras de tumores de colon y muestras normales correspondientes para generar bibliotecas de ARN-seq usando el TruSeq RNA Sample Preparation kit (lllumina, CA). Las bibliotecas de ARN-seq eran multiplex (dos por banda) y secuenciadas en HiSeq 2000 de acuerdo con la recomendación del fabricante (lllumina, CA). Se generaron ~30 millones de 2 x 75bp lecturas de secuenciación final apareadas por muestra.

Procesamiento de los datos de secuencias Se evaluaron todos los datos de lectura cortos para el control de calidad usando el paquete Bioconductor ShortRead package. Morgan, M. et al., Bioinformatics 25, 2607-2608 (2009). Para confirmar que todas las muestras eran identificadas correctamente, todos los datos de los exornas y de las variantes de ARN-seq que se superponían con los datos del arreglo de llluman 2,5 M fueron comparados y chequeados para determinar si eran consecuentes. Se realizó también una comparación de todas las variantes de la línea germinal entre todas las muestras para chequear que todos los pares tuvieran una correspondencia correcta entre el tumor y el normal y correspondientemente no se adaptaran a ningún otro par de otros pacientes en más de un corte de 90%.

Llamados ("calling") de variantes Las lecturas de secuenciación fueron mapeadas al genoma humano UCSC (GRCh37/hg 9) usando el software BWA ajustado a los parámetros por defecto. L¡, H. & Durbin, R. Bioinformatics 25, 1754-1760 (2009). El realineamíento local, el marcado por duplicado y el llamado de variantes en bruto ("raw variant calling") fueron realizados como se describió previamente. DePristo, M. A. et al., Nat. Genet. 43, 491-498 (2011). Las variaciones de la línea germinal conocidas representadas en dbSNP Build 131 (Sherry, S. T. et al., Nucleic Acids Res 29, 308-3 1 (2001)), pero no representadas en COSMIC (Forbes, S. A. et al., Nucleic Acids Res. 38, D652-657 (2010)), fueron filtradas adicionalmente. Además, las variantes que estaban presentes tanto en las muestras de tumores como en las normales fueron retiradas como variaciones de la línea germinal. Las variaciones remanentes presentes en la muestra de tumor, pero ausente en la muestra normal correspondiente se predijeron como siendo somáticas. Las variaciones somáticas predichas fueron filtradas adicionalmente para incluir sólo posiciones con un mínimo de cubrimiento de 10x tanto en la muestra de tumor como en la normal correspondiente, así como también una frecuencia de alelos variantes observadas de <3% en la muestra normal correspondiente y una diferencia significativa en los recuentos de alelos variantes usando el test exacto de Fisher. Para evaluar la performance de este algoritmo, se seleccionaron al azar 807 variantes que alteran proteínas y se validaron usando tecnología de ácidos nucleicos Sequenom (San Diego, CA) como se describió previamente. Kan, Z. et al., Nature 466, 869-873 (2010). De estos, 93% (753) se validaron como específicos de cáncer, dividiéndose las variantes no validadas igualmente entre las que no se verían en el tumor y las que también se veían en la muestra normal adyacente (línea germinal). Se discriminaron Indels usando el GATK Indel Genotyper Versión 2 que lee tanto el archivo BAM del tumor como el normal para un par dado. DePristo, M. A. et al., Nat Genet. 43, 491^98 (2011).

Para identificar variantes que violan groseramente una suposición binomial, o discriminaciones de variantes afectadas por un mapeador específico, las variantes validadas con Sequenom fueron incluidas adicionalmente usando el siguiente algoritmo. Las lecturas fueron mapeadas al genoma humano UCSC (GRCh37/hg19) usando GSNAP. Wu, T. D. & Nacu, S. Bioinformatics 26, 873-881 (2010). Se seleccionaron las variantes vistas por lo menos dos veces en una posición dada y con una frecuencia de alelos mayor que 10%. Estas variantes fueron filtradas adicionalmente con respecto a desviaciones significativas en hebra y posición usando el test exacto de Fisher. Además se excluyeron las variantes que no tenían un cubrimiento adecuado en la muestra normal adyacente según e determinó como por lo menos una posibilidad de 1% de haberse perdido usando una distribución beta-binomial a una frecuencia de alelos normal de 12,5%. Todas las nuevas variantes que alteraban proteínas incluidas en el segundo algoritmo fueron validadas por Sequenom, que dio por resultado un total de 515 variantes adicionales. El efecto de todas las mutaciones somáticas no sinónimas en la función génica se predijo usando SIFT (Ng, P. C. & Henikoff, S. Genome Res 12, 436-446 (2002)) y PoliPhen (Ramensky, V., Bork, P. & Sunyaev, S. Nucleic Acids Res 30, 3894-3900 (2002)). Todas las variantes fueron anotadas usando Ensembl (reléase 59, www.ensembl.org).

Validación de mutaciones somáticas e indels Se usó la extensión de pares de bases simples seguido por espectrometría de masas de ácidos nucleicos (Sequenom, CA) como se describió previamente para validar las mutaciones somáticas predichas. El ADN del tumor y de la muestra normal correspondiente fue amplificado por el genoma total y usando el REPLI-g Whole Genome Amplification Midi Kit (Qiagen, CA) y limpiado y usado según las recomendaciones del fabricante. Las variantes halladas como se esperaba en el tumor pero ausentes en la muestra normal fueron denominadas somáticas. Aquellas que estaban presentes tanto en el tumor como en la muestra normal fueron clasificadas como línea germinal. Las variantes que no pudieron ser validadas en el tumor o en la muestra normal fueron denominadas fracasos. Para la validación de las indel, se diseñaron cebadores para PCR que generarán un amplicón de -300 bp que contenía la región de indel. La región fue amplificada por PCR tanto en el tumor como en la muestra normal correspondiente usando Phusion (NEB, MA) según las instrucciones del fabricante. Los fragmentos de PCR fueron purificados luego en un gel y se aislaron las bandas relevantes y se secuenciaron por Sanger. Los cromatogramas de secuenciación fueron analizados usando Mutation Surveyor (SdetGenetics, PA). Los indels que estaban presentes en el tumor y ausentes en la muestra normal fueron denominados somáticos y se informan en la Tabla 3.

Significancia mutacional La significancia mutacional de genes fue evaluada usando un método descripto previamente. Brevemente este método puede identificar genes que tienen mutaciones que alteran proteínas estadísticamente más significativas que lo que se esperaría en base a una tasa de mutación de base calculada. La tasa de mutaciones de base fue calculada para seis categorías de mutación de nucleótidos diferentes (A,C,G,T,CG1 ,CG2) en donde había suficiente cubrimiento (>10x) tanto en el tumor como en la muestra normal correspondiente. Se calculó una relación entre no sinónima y sinónima, r¡ , usando una simulación de mutar todos los nucleótidos que codifican proteínas y ver si el cambio resultante daría por resultado un cambio sinónimo o no sinónimo. La tasa de mutación de base, f¡: fue determinada multiplicando el número de variantes somáticas sinónimas por r¡ y normalizando por el número total de nucleótidos que codifican proteínas. El número de mutaciones esperadas para un gen dado fue determinado como el número de bases que codifican proteínas multiplicado por f¡e integrado a través de todas las categorías de mutaciones. Se calculó un valor p usando una función de probabilidad de Poisson dado el número esperado y observado de mutaciones para cada gen. Los valores P fueron corregidos para testeo múltiple usando el método de Benjamini Hochberg y los valores q resultantes fueron convertidos en resultados q tomando el Iog10 negativo de los valores q. Dado que existían diferentes tasas de mutación para las muestras MSI y MSS, se calcularon los resultados q separadamente para cada uno, retirándose completamente las dos muestras hipermutadas. Para no subestimar las tasas de mutación de base, se excluyeron del análisis las siete muestras con menos de 50% de contenido tumoral. La significancia mutacional del camino también fue calculada como se describió previamente, con la excepción de que se usó la base de datos de BioCara Pathway que fue descargada como parte de MSigDB (Subramanian A. et al., Proc. of the Nati Acad. De Sci. USA 102, 15545-15550 (2005)).

Secuenciación y análisis del genoma completo Lecturas de DNA-Seq de extremos apareados fueron alineadas a GRCh37 usando BWA. El procesamiento ulterior de los alineamientos para obtener los llamados ("calis") de mutaciones fue similar al análisis de secuenciación de exornas usando la tubería GATK. El número de copias se calculó computando el número de lecturas en 10 kb bins no superpuestos y tomando la relación tumor/normal de estos conteos. Se predijeron los puntos de ruptura cromosómicos usando "breakdancer". Chen, K. et al., Nat. Métodos 6, 677-681 (2009). Los gráficos de los genomas fueron creados usando Circos (Krzywinski, M. et al., Genome Res. 19, 1639-1459 (2009)).

Análisis de datos de ARN-seq Las lecturas de ARN-Seq fueron alineadas con la versión del genoma humano GRCh37 usando GSNAP (Wu, T.D. &Nacu, S. Bioinformatics 26, 873-881 (2010). Se obtuvieron conteos de expresión por gen contando el número de lecturas alineando concordantes y únicamente a cada locus de gen como se definió por CCDS. Los conteos de genes fueron normalizados luego para el tamaño de la biblioteca y subsiguientemente estabilizados por variancia usando el paquete de software DESeq Bioconductor. Yers, S. & Huber, W. Genome Biology 11, R106 (2010). La expresión de genes diferencial fue computada por tests t de a pares en los conteos estabilizados por variancia seguido por corrección para testeo múltiple usando el método de Benjamini & Hochberg.

Generación de datos de matriz SNP y análisis Se usaron matrices lllumina HumanOmni2.5_4v1 para ensayar 74 tumores de colon y muestras normales correspondientes para el genotipo, copia de ADN y LOH en ~2,5 millones de posiciones SNP. Estas muestras pasaron todas nuestras métricas de control de calidad para identidad de muestra y calidad de datos (ver más abajo). Un subconjunto de 2295239 SNPs de alta calidad fue seleccionado para todos los análisis.

Después de realizar modificaciones para permitir el uso con datos de matrices lllumina, se aplicó el algoritmo PICNIC (Greenman, C. D. et al., Biostatistics 11, 164-175 (2010)) para estimar el número total de copias y el número de copias específico de los alelos / LOH. La modificación incluía el reemplazo del componente de ¡nicialización del segmento con el algoritmo CBS (Venkatraman, E. S. & Olshen, A. B. Bioinformatics 23, 657-663 (2007)), y el ajuste de la distribución previa para la señal del número de copias bruta de base (media ajustada de 0,7393 y una desviación estándar de 0,05). Para el preprocesamiento requerido por el modelo PICNIC's hidden Markov Model (HMM), un modelo Bayesiaan para estimar los centroides del clúster para cada SNP. Para el SNP k y el genotipo g, los datos observados en la muestra normal fueron modelados como siguiendo una distribución Gaussiana bivariada. Los centros clúster para los tres genotipos diploides fueron modelados conjuntamente por una distribución Gaussiana 6-dimensional con una media tratada como un hiperparámetro y un conjunto basado empíricamente en un conjunto de entrenamiento de 156 muestras normales. El centro de clúster y las matrices de covariancia dentro del genotipo fueron modelados como Wishart inverso con hiperparámetros de matriz de escala también ajustados empíricamente y con grados de libertad ajustados manualmente para proveer resultados satisfactorios para un amplio rango de comportamiento de sondas y frecuencias de alelos menores. Finalmente, la señal para SNP k (para los alelos A y B separadamente) fue — y ffk ?. ß transformada con una función no lineal: ' k k con parámetros seleccionados basados en las distribuciones posteriores computadas más arriba.

La identidad de muestras fue verificada usando concordancia de genotipos entre todas las muestras. Se esperaba que pares de tumores del mismo paciente tuvieran > 90% de concordancia y que todos los otros pares tuvieran < 80% de concordancia. Las muestras que no cumplen con estos criterios fueron excluidos de todos los análisis. Siguiendo el PICNIC modificado, la calidad del ajuste total al HMM fue evaluada midiendo el error cuadrático medio (RMSE) entre el valor en bruto y el valor ajustado a HMM para cada SNP. Las muestras con y RMSE >1 ,5 fueron excluidas de todos los análisis. Finalmente para considerar dos hechos observados comúnmente, los valores de número de copias ajustados fueron fijados a "NA" para singletons con número de copias ajustados a 0 o cuando las medias observadas y ajustadas diferían más de 2 para regiones de ganancia de copia inferida.

Ganancia y pérdida del número de copias de ADN recurrente Las regiones genómicas con ganancia y pérdida de copias de ADN recurrentes fueron identificadas usando GISTIC, versión 2.0. Mermel, C. H. et al., Genome Biology 12, R41 (2011). Los valores de números de copias totales de enteros segmentados obtenidos de PICNIC, c, fueron convertidos en valores de relación log2, y, como y = log2(c + 0,1) - 1. Los cortes de +/- 0,2 fueron usados para categorizar los valores de la relación log2 como ganancia o pérdida, respectivamente. Se usaron una longitud de segmento mínimo de 20 SNPs y un valor "cap" de relación log2 de 3.

Detección de fusión y validación Las fusiones putativas fueron identificadas usando una tubería computacional desarrollada denominada fusiones GSTRUCT. La tubería se basó en una estrategia de generar y testear, que es fundamentalmente similar a la metodología informada previamente para hallar fusiones de lectura completa {"readthrough)". Nacu, S. et al., BMC Med Genomics 4, 11 (2011). Las lecturas de extremos apareados fueron alineadas usando nuestro programa de alineamiento GSNAP. Nacu, S. et al., BMC Med Genomics 4, 11 (2011). GSNAP tiene la capacidad de detectar cortes y empalmes que representan translocaciones, inversiones y otras fusiones distantes dentro de un sólo extremo de lectura.

Estos cortes y empalmes distantes proporcionaron un conjunto de fusiones candidato para la etapa de testeo subsiguiente. El otro conjunto de fusiones candidato derivadas de alineamientos únicos no apareados, en donde cada extremo de la lectura de extremo apareado se alineaba únicamente con un cromosoma diferente, y también de alineamientos únicos apareados, pero discordantes, en donde cada extremo se alineaba únicamente con los mismos cromosomas, pero con una distancia genómica aparente que excedía 200.000 bp o con orientaciones genómicas que sugerían un evento de inversión o "scrambling" .

Las fusiones candidato fueron filtradas luego contra transcriptos conocidos de RefSeq, alineados con el genoma usando GMAP. Wu, T. D. & Watanabe, C. K. Bioínformatics 21, 1859-1875 (2005). Ambos fragmentos flanqueando un corte y empalme distante, o ambos extremos de un alineamiento no apareado o apareado discordante, se requerían para mapear a regiones de exones conocidas. Este paso de filtrado eliminaba aproximadamente 90% de los candidatos. Se eliminaron además las inversiones y supresiones candidatas que sugerían reordenamientos del mismo gen, así como también eventos de fusión readthrough aparentes que involucraban genes adyacentes en el genoma, que nuestra investigación previa indicaba que probablemente tuvieran un origen transcripcional en lugar de genómico.

Para los eventos de fusión candidatos remanentes, se construyeron uniones artificiales exón-exón que consistían en los exones distales al exón dador soportado y los exones proximales al exón aceptor soportado. Los exones incluidos en las computaciones proximal y distal fueron limitados de modo que la longitud acumulativa a lo largo de cada gen se encontraba dentro de una longitud de inserto máxima estimada de 200 bp. Como un control, se construyeron todas las uniones exón-exón que consistían en combinaciones de exones dentro del mismo gen para todos los genes que contribuyen a un evento de fusión candidato.

En la etapa de testeo de nuestra tubería, construimos un índice genómico de las uniones artificiales exón-exón y controles usando el programa GMAP BUILD incluido como parte del paquete GMAP y GSNAP. Este índice genómico y el programa GSNAP con detección de corte y empalme se usaron para realinear los extremos de lectura originales que no eran concordantes con el genoma. Se extrayeron las lecturas que se alineaban a una unión intergenica correspondiente a una fusión candidata, pero no a una unión ¡ntragénica control.

Los resultados del realineamiento fueron filtrados para requerir que cada fusión candidata tenga por lo menos una lectura con un overhang de 20 bp. También se requirió que cada fusión candidata tuviera por lo menos 10 lecturas de soporte. Para cada fusión candidata remanente, los dos genes componentes fueron alineados uno contra el otro usando GMAP y eliminaban la fusión si el alineamiento tenía cualquier región que contuviera 60 coincidencias en una ventana de 75 bp. La unión exón-exón también fue alineada una contra la otra de los genes componentes usando GMAP y eliminaba la fusión si el alineamiento tenía un cubrimiento mayor que 90% de la unión y una identidad mayor que 95%.

La validación de fusiones de genes se realizó usando una propuesta de (RT)-PCR de transcripción inversa usando muestras de tumor de colon y muestras normales correspondientes. Se realizó la transcripción inversa de 500 ng de ARN total a cADN con un High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Life Technologies, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se amplificaron 50 ng de cADN en un tubo de reacción de 25 µ? que contenía 400 pM de cada cebador, 300 µ? de cada desoxinucleósido trifosfatos y 2,5 unidades de LongAmp Taq ADN polimerasa (New England Biolabs, MA). Se realizó la PCR con una desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 minutos seguido por 35 ciclos de 95 °C durante 10 segundos, 56 °C durante 1 minuto y 68 °C durante 30 segundos y un paso de extensión final a 68 °C durante 10 minutos. Se corrieron 3 µ? de producto de PCR en 1 ,2% de gel de agarosa para identificar muestras que contenían fusión de genes. Los productos de PCR específicos fueron purificados con o bien un QIAquick PCR Purification kit o un Gel Extraction kit (Qiagen, CA). El ADN purificado fue o bien secuenciado directamente con cebadores de PCR específicos para cada fusión o clonados en un vector de clonación TOPO pCR2.1 (Life Technologies, CA) antes de la secuenciación de Sanger. Los clones fueron secuenciados usando secuenciación de Sanger en un ABI3730xl (Life Technologies, CA) según las instrucciones del fabricante. Los cromatogramas de secuenciación de Sanger fueron analizados usando Sequencher (Gene Cordes Corp., MI).

Testeo de la actividad de fusión RSPO Se generó el plásmido de expresión eucariótica pRK5E dirigiendo la expresión de c-terminal FLAG tag EIF3E, PTPKR (aminoácidos 1-387), RSP02, RSP03, EIF3E(e1)-RSPO2(e2), PTPRK(e1)-RSPO3(e2), PTPRK(e7)-RSPO3(e2) usando PCR estándar y estrategias de clonación.

Células, medios acondicionados, inmunoprecipitación y transferencia Western HEK 293T, células de riñon embrionario humano, se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de FBS. Para el análisis de expresión y la generación de medios acondicionados, se colocaron en placas 3 x 105 HEK29T células en placas de 6 cavidades en 1 ,5 mi de DMEM que contenía 10% de FBS. Las células fueron transfectadas con 1 µg de ADN usando la Figura 6A-B (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El medio fue acondicionado durante 48 horas, recogido, centrifugado y usado para estimular el ensayo reportero de luciferasa (concentración final 0,1-0,4X). Para el análisis de expresión, se recogió el medio, se centrifugó para eliminar los desechos y se usó para inmunoprecipitación.

Ensayos reporteros de luciferasa Células HEK 293T fueron colocadas en placas a una densidad de 50.000 células/ml en 90 µ? de medio que contenía 2,5% de FBS por cavidad de una placa de 96 cavidades. Después de 24 horas, las células fueron transfectadas usando la Figura 6A-B de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche, CA) con el siguiente ADN por cavidad: 0,04 ig de TOPbrite Firefly repórter (Nature Chem. Biol. 5, 217 - 219 (2009)), 0,02 gg de pRL SV40-Renilla (Promega, Wl) y 0,01 ig de la R-espondina apropiada o los constructos control. Las células fueron estimuladas con 25 µ? de o bien medio fresco o acondicionado que contenía 10% de FBS con o sin rmWnt3a (20-100 ng/ml (final), R&D Systems, MN). Después de 24 horas de estimulación, se retiraron 50 µ? de medio y se reemplazaron con reactivos de detección de luciferasa Dual-Glo (Promega, Wl) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó un Envision Luminometer (Perkin-Elmer, MA) para detectar la luminiscencia. Para controlar la eficiencia de transfección, se normalizaron los niveles de luciferasa de luciérnaga a niveles de luciferasa de Renilla para generar la medida de unidades de luciferasa relativas (RLU). Los datos experimentales fueron presentados como media ± SD de tres cavidades independientes.

Inmunoprecipitación y transferencia Western Para confirmar que se segregaron las proteínas de tipo salvaje RSPO y las proteínas de fusión RSPO, se realizó la inmunoprecipitación de proteínas marcadas con FLAG del medio usando perlas acopladas con anticuerpo anti-FLAG-M2 (Sigma, MO), que se hicieron ebullir en buffer de carga SDS-PAGE, se resolvieron en un SDS-PAGE al 4-20% (Invitrogen, Carisbad, CA) y se transfirieron en una membrana de nitrocelulosa. Las proteínas RSPO y otras proteínas marcadas con FLAG expresadas en células fueron detectadas de lisados de células usando transferencia western como se describió más arriba (Bijay p85 paper). Brevemente, las proteínas inmunoprecipitadas y las proteínas de lisados de células fueron detectadas por transferencia Western usando anticuerpo conjugado FLAG-HRP y quimioluminiscencias con el substrato de detección de quimioluminiscencia Super signal West Dura (Thermo Fisher Scientific, IL).

Ejemplo 1 - Perfil de mutación de CRC La identificación y comprensión de los cambios en los genomas de cáncer es esencial para el desarrollo de terapéuticas direccionadas. En estos ejemplos, se realizó un análisis sistemático de más de 70 pares de cánceres de colon humano primario aplicando la secuenciación de generación siguiente para caracterizar sus exornas, transcriptomas y alteraciones de números de copias. Se identificaron 36.303 cambios somáticos de alteración de proteínas que incluyen varias mutaciones recurrentes nuevas en los genes de la vía de Wnt como TCF12 y TCF7L2, proteínas remodeladoras de cromatina tales como TET2 y TET3 y tirosina quinasas de receptores incluyendo ERBB3. El análisis para genes de cáncer significativos identificó 18 candidatos, incluyendo la quinasa de ATM de\ punto de control del ciclo celular. El número de copias y el análisis de los datos de ARN-seq identificaron amplificaciones y sobreexpresión correspondiente de IGF2 en un subconjunto de tumores de colon. Además, usando transcriptos de fusión se identificaron múltiples datos de ARN-seq incluyendo fusiones de genes recurrentes de los genes de R-espondina RSP02 y RSP03, ocurriendo en el 10% de las muestras. Se demostró que las proteínas de fusión RSPO eran biológicamente activas y potencian la señalización de Wnt. Las fusiones de RSPO son mutuamente exclusivas, indicando las mutaciones de APC que éstas tienen probablemente un rol en la activación de la señalización de Wnt y la tumorigénesis. Las fusiones de genes de R-espondina y varias otras mutaciones de genes identificadas en estos ejemplos proveen nuevas oportunidades para la intervención terapéutica en el cáncer de colon.

Se caracterizaron 74 tumores de colon primarios y sus muestras normales adyacentes correspondientes. Se realizó la secuenciación exornas completos para 72 (15 MSI y 57 MSS) de los 74 pares de tumores de colon y muestras normales adyacentes para evaluar los espectros mutacionales. Estos 74 pares de muestras tumorales/normales también fueron analizados en matrices lllumina 2,5M para evaluar los cambios de números de copias cromosómicas. También se obtuvieron los datos de ARN-seq para 68 pares de muestras tumorales/normales. Finalmente, se secuenció y analizó el genoma de un par de muestras tumorales/normales MSI y MSS a 30x de cubrimiento de este conjunto de muestras.

O 15 10 10 20 10 10 15 20 10 10 10 10 10 10 15 10 10 10 15 10 10 20 10 15 20 5 10 15 5 15 5 10 20 5 10 5 10 5 10 15 5 5 10 15 5 20 5 20 5 20 5 15 20 10 15 20 10 15 20 15 15 15 15 20 15 5 10 10 15 10 20 10 15 15 15 15 15 20 15 15 10 15 5 10 10 15 5 10 15 15 20 10 15 20 5 15 20 5 20 20 15 10 5 10 15 20 15 15 5 15 20 15 15 20 20 5 5 20 15 5 20 15 15 15 20 15 10 15 10 15 20 15 20 10 15 20 15 5 15 15 15 20 20 5 10 15 20 15 10 10 15 10 5 10 10 5 10 15 20 15 5 5 10 20 5 20 5 20 5 15 20 5 20 10 15 15 10 5 10 15 5 10 15 20 15 5 10 15 10 15 5 15 20 15 20 10 5 10 20 15 20 5 10 15 15 15 15 15 15 5 15 20 15 20 10 5 10 10 15 20 5 20 15 20 15 5 20 15 20 15 20 5 15 15 20 15 20 15 20 10 15 20 5 10 20 15 20 15 5 15 20 10 10 20 15 15 5 10 10 20 20 5 10 5 10 15 10 5 10 10 10 10 15 20 15 20 Se capturaron los exones usando Nimblegen SeqCap EZ human exorne library v2.0 y se secuenciaron en HiSeq 2000 (lllumina, CA) para generar lecturas de secuenciación de extremos apareados de 75 bp. Las regiones objetivo tenían un cubrimiento medio de 179x con 97,4% de bases cubiertas a >10 veces. Se identificaron 95.075 mutaciones somáticas en las 72 muestras de tumores de colon analizadas, de las cuales 36.303 eran alteradoras de proteínas. Dos muestras MSS mostraron un número de mutaciones inusualmente grande (24.830 y 5.780 mutaciones de las cuales 9.479 y 2.332 eran mutaciones alteradoras de proteínas, respectivamente). Éstas fueron designadas como muestras hipermutadas y no fueron consideradas para calcular la tasa de mutación de base. Se hallaron 52.312 mutaciones somáticas en las 15 muestras MSI (18.436 de sentido erróneo, 929 sin sentido, 22 stop lost, 436 de sitio de corte y empalme esencial, 363 indels alteradoras de proteínas, 8.065 sinónimas, 16.675 intrónicas y 7.386 otras) y 12.153 mutaciones somáticas en las 55 muestras MSS (3.922 de sentido erróneo, 289 sin sentido, 6 stop lost, 69 de sitio de corte y empalme esencial, 20 indels alteradoras de proteínas, 1.584 sinónimas, 4.375 intrónicas y 1.888 otras) estudiadas (Tablas 2 y 3). Aproximadamente 98% (35.524/36.303) de las variantes de nucleótidos simples alteradoras de proteínas informadas en estos ejemplos son nuevas y no han sido informadas en COSMIC v54 (Forbes, S. A. et al., Nucleic Acids Res. 38:D652-657 (2010)). Treinta y siete por ciento de las mutaciones somáticas reportadas fueron validadas usando los datos de ARN-seq o determinación del genotipo por espectrometría de masa con una tasa de validación de 93% (Tabla 2). Todas las indels reportadas fueron somáticas confirmadas usando la secuenciación de Sanger (Tabla 3-lndels somáticas). Se observó una tasa de mutación no sinónima media de 2,8/Mb (31-149 mutaciones de región codificadora en las 55 muestras) en las muestras MSS y 40/Mb (764-3113 mutaciones de región codificadora en las 15 muestras) en las muestras MSI, consistente con el defecto MMR en estas últimas.

Tabla 3 -Indels somáticas El análisis de las transiciones y transversiones de nivel de base en sitios mutados reveló que en las CRCs, eran predominantes las transiciones C a T, independientemente del estado de MMR, tanto en el genoma completo como en el análisis del genoma completo. Esto concordaba con los reportes de mutaciones previos (Wood, L. D. et al., Science 318:1108-11 3 (2007); Sjoblom, T. et al., Science 314:268-274 (2006); Bass, A. J. et al., Nat. Genet. 43:964-968 (2011)). Las dos muestras de tumores hipermutados examinadas también mostraron una mayor proporción de transversiones C a A y T a G, consecuente con la tasa de mutaciones muchos mayor observada para estas muestras.

Consecuente con los datos de mutaciones de exornas, el genoma completo de MSS analizado mostró 17.651 mutaciones comparadas con las 97.968 mutaciones observadas en el genoma completo de MSI. La tasa de mutaciones del genoma completo promedio era de 6,2/Mb y 34,5/Mb para el genoma de MSS y de MSI respectivamente. Una tasa de mutación de 4,0-9,8/Mb fue reportada previamente para los genomas de MSS CRC genomes (Bass, A. J. et al., Nat. Genet. 43:964-968 (2011)).

Ejemplo 2 - Análisis de genes mutados El análisis de mutaciones identificó variantes de nucleótidos simples somáticas alteradoras de proteínas en 12.956 genes, incluyendo 3.257 en las muestras de MSS, 9.851 en las muestras de MSI y 6.891 en las dos muestras hipermutadas. Entre las clases de proteínas mutadas frecuentemente se encuentran las quinasas humanas, incluyendo RTKs, receptores acoplados a la proteína G y receptores de hormonas nucleares. En un esfuerzo por comprender el impacto de las mutaciones en la función génica se aplicó SIFT (Ng, P. C. & Henikoff, S., Genome Res 12:436-446 (2002)), Poliphen (Ramensky, V. et al., Nucleic Acids Res 30:3894-3900 (2002)) y mCluster (Yue, P. et al., Hum. Mutat. 31 :264-271 (2010)) y se halló que 36,7% de las mutaciones tenían probablemente una consecuencia funcional, por contraste con el 12% para las variantes de línea germinal de las muestras normales, en base a por lo menos dos de los tres métodos (Tabla 2).

Para comprender además la relevancia de los genes mutados, se aplicó una métrica de resultados q descripta previamente para clasificar los genes de cáncer mutados significativamente (Kan, Z. et al., Nature 466:869-873 (2010)). En las muestras de MSS, se identificaron 18 genes de cáncer significativos (resultado q >=1 ; <10% de tasa de descubrimiento falsa) (KRAS, TP53, APC, PIK3CA, SMAD4, FBXW7, CSMD1, NRXN1, DNAH5, MRVI1, TRPS1, DMD, KIF2B, ATM, FAM5C, EVC2, OR2W3, TMPRSS11A, y SCN10A). Los genes de cáncer de colon MSS mutados significativamente incluían genes reportados previamente, incluyendo KRAS, APC, TP53, SMAD4, FBXW7, y PIK3CA y varios genes nuevos, incluyendo el gen ATM del punto de control del ciclo celular. Los genes como KRAS y TP53 se encontraban entre los genes de cáncer de colon MSI más mutados, sin embargo, ninguno de los genes alcanzó una significancia estadística debido al número limitado de muestras de MSI analizadas.

En un esfuerzo por establecer la relevancia de los genes mutados, los genes mutados fueron comparados contra 399 genes de cáncer de colon candidatos identificados en rastreos que involucraban modelos de cáncer del ratón (Starr, T. K. er a/., Science 323, 1747-1750 (2009); March, H. N. et al., Nat. Genet. 43, 1202-1209 (2011)). De las 399 mutaciones de genes se hallaron en 327. Cuando se analizaron los conjuntos de datos por medio de un método alternativo, de los 432 genes, se hallaron mutaciones en 356. Los genes mutados frecuentemente en los conjuntos de datos que se superponían con los hits del modelo o de cáncer de colon del ratón incluían KRAS, APC, SMAD4, FBXW7 y EP400. Adicionalmente, los genes involucrados en la remodelación de cromatina como SIN3A, SMARCA5 y NCOR1 y la enzima modificadora de histona JARID2 hallada en el rastreo de CRD de ratón (Starr, T. K. et al., Science 323, 1747-1750 (2009); March, H. N. et al., Nat. Genet. 43, 1202-1209 (2011)) también estaban mutados en nuestro rastreo de exornas. Además, el TCF12, identificado en el rastreo del modelo de cáncer de colon del ratón, estaba mutado en 5 (Q179*, G444* y R603W/Q) de nuestras muestras (7%) y contenía una mutación de punto caliente ("hotspof) en R603 (3 de 5 mutaciones; R603W/Q). Esta mutación de punto caliente dentro del dominio de hélice-bucle-hélice TCF12 suprimirá probablemente su capacidad para unirse al ADN, sugiriendo una mutación de pérdida de función. Es de destacar que todas las mutaciones de TCF12 fueron identificadas en las muestras de MSI. El factor de transcripción TCF12 ha sido implicado previamente en metástasis de cáncer de colon (Lee, C. C. et al., J. de Biol. Chem. 287:2798-2809 (2011)). La presencia de puntos calientes en este gen y su identificación en el rastreo del modelo de CRD del ratón indica que funciona probablemente como un gen director de CRC.

Los puntos calientes mutacionales, en donde la misma posición en un gen estaba mutada en muestras independientes, son indicativos de gen del cáncer director funcionalmente relevante. En este estudio, se identificaron 270 con mutación de puntos calientes (Tabla 4). Setenta de estos genes no fueron reportados previamente en COSMIC. La comparación de nuestras mutaciones con aquellas reportadas en COSMIC identificó 245 mutaciones de puntos calientes adicionales en 166 genes (Tabla 5). Utilizando un método de análisis de datos alternativo, se identificaron 274 genes con mutaciones de puntos calientes, con cuarenta de estos genes no reportados previamente en COSMI y 435 mutaciones de puntos calientes adicionales en 361 genes. Los genes con nuevas mutaciones de puntos calientes incluyen reguladores transcripcionales (TCF12, TCF7L2 y PHF2), reguladores relacionados Ras/Rho (SOS1 (por ejemplo, R547W, T614M R854*, G1129V), SOS2 (por ejemplo, R225*, R854C,y Q1296H), RASGRF2, ARHGAP10, ARHGEF33 y Rab40c (por ejemplo, G251S ), enzimas modificadoras de cromatina (TET2, TET3, EP400 y MLL), receptores de glutamato (GRIN3A y GRM8), tirosina quinasas receptoras (ERBB3, EPHB4, EFNB3, EPHA1, TYR03, TIE1 y FLT4), otras quinasas (RIOK3, PRKCB, MUSK, MAP2K7 y MAP4K5), fosfatasa de proteínas (PTPRN2), GPRCs (GPR4 y GPR98) y E3-ligasa (TOPORS). De interés adicional en este conjunto de genes son TET2 y TET3, los cuales codifican la metilcitosina dioxigenasa involucrada en la metilación de ADN (Mohr, F. et al., Exp. Hematol. 39:272-281 (2011)). Si bien se informado mutaciones en TET2 en cánceres mieloides, hasta ahora no se han informado mutaciones en TET3 o TET1 en tumores sólidos, especialmente, en CRC (Mohr, F. et al., Exp. Hematol. 39:272-281 (201 1)). Los tres miembros de la familia TET1 (por ejemplo, R81 H, E417A, K540T, K792T, S879L, S1012*, Q1322*, C1482Y, A1896V, y A2129V), TET2 (por ejemplo, K108T, T1 18I, S289L, F373L, K1056N, Y1 169*, A1497V, y V1857M), y TET3 (por ejemplo, T165M, A874T, M977V, G1398R, y R1576Q/W) están mutados en estos ejemplos.

Tabla 4 - Mutaciones de puntos calientes Tabla 5 - Mutaciones de puntos calientes identificadas a través de metanalisis usando datos de mutación COSMIC Ejemplo 3 - Expresión y alteración del número de copias Los datos de ARN-seq fueron usados para computar genes expresados en forma diferencial entre las muestras tumorales y normales (Tabla 6). Los principales genes sobreexpresados en forma diferencial incluyen FOXQ1 y CLND1 que han estado implicados en la tumorigénesis (Kaneda, H. et al., Cáncer Res. 70:2053-2063 (2010)). Es importante destacar que al analizar los datos de ARN-seq, se identificó una regulación hacia arriba de IGF2 en el 12% (8/68) de los tumores de colon examinados. Una mayoría (7/8) de los tumores con sobreexpresión de IGF2 también mostró amplificación focal del locus IGF2 según se midió por las matrices lllumina 2.5M. En general los genes expresados en forma diferencial afectan a múltiples caminos de señalización, incluyendo señalización de calcio, señalización mediada por cAMP, señalización del receptor de glutamato, señalización de la esclerosis lateral amiotrófica, metabolismo de nitrógeno, señalización de la guía axonal, rol de IL-17A en la psoriasis, señalización del receptor de serotonina, patología de las vías aéreas en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, señalización de la proteína quinasa A, señalización del cáncer de vejiga, señalización de HIF1a, señalización ß-adrenérgica cardíaca, potenciación sináptica de largo plazo, señalización de la ateroesclerosis, señalización del ritmo circadiano, señalización de CREB en neuronas, señalización del receptor acoplado a la proteína G, señalización de la extravasación de leucocitos, sistema de complementos, señalización de eicosanoides, metabolismo de tirosina, metabolismo de cisteína, depresión sináptica de largo plazo, rol de IL-17A en la artritis, efectos celulares de Sildenafil (Viagra), señalización del dolor neuropático en las neuronas del cuerno dorsal, metabolismo de D-arginina y D-ornitina, rol de IL-17F en enfermedades alérgicas inflamatorias de las vías aéreas, señalización del cáncer de tiroides, fibrosis hepática / activación celular estrellada hepática, señalización del receptor de dopamina, rol de NANOG en la pluripotencia de células madres embrionarias de mamíferos, biosíntesis de sulfato de condroitina, señalización de endotelina-1 , biosíntesis de sulfato de queratano, vía de fototransducción, señalización de Wnt p-catenina, señalización de quimioquina, metabolismo de alanina y aspartato, biosíntesis de glicoesfingolípidos - neolactoseries, biosíntesis del ácido biliar, rol de macrófagos, fibroblastos y células endoteliales en la artritis reumatoide, señalización a-adrenérgica, metabolismo de taurina e hipotaurina, inhibición mediada por LPS/IL-1 de la función RXR, señalización de la metástasis del cáncer colorrectal, señalización de CCR3 en eosinófilos y biosíntesis de O-glicanos.

Tabla 6 - Genes expresados en forma diferencial 470 Se evaluaron alteraciones de los números de copias en 74 pares de muestras tumorales/normales aplicando GISTIC a los datos de números de copias segmentados PICNIC. Además de las amplificaciones de IGF2, se hallaron amplificaciones conocidas que involucraban KRAS (13%; 10/74) y MYC (31%; 23/74) ubicadas en un amplicón amplio en cromosomas 8q (Tabla 7). Deleción focal que involucra FHIT, se observó un supresor de tumor en 21% (16/74) de las muestras (Tabla 8). FHIT, que codifica una diadenosina S'^'-Pi S-trifosfato hidrolasa involucrada en el metabolismo de purina, ha sido reportada previamente como perdida en otros cánceres (Pichiorri, F. et al., Future Oncol. 4:815-824 (2008)). También se observó la supresión de APC (18%; 14/74) y SMAD4 (29%; 22/74). Finalmente, se halló que se ganaron frecuentemente cromosomas 20q y por contraste, se perdieron 18q.

Cuando se analizaron las alteraciones del número de copias usando llamados del número de copias determinadas por el nivel de la sonda PICNIC, segmentación de CBS del número de copias de las relaciones de muestras tumorales/normales y GISTIC en estas relaciones de muestras tumorales/normales, el conjunto más importante de genes con alteraciones del número de copias era similar aunque los porcentajes variaron levemente. Las amplificaciones conocidas involucrando KRAS (13%; 10/74) y MYC (23%; 17/74) estaban localizadas en un amplicón amplio en los cromosomas 8q. Deleción que involucra FHIT, se observó un supresor de tumor en 30% (22/74) de las muestras. Deleción de APC (8%; 6/74), PTEN (4%, 3/74) y SMAD3 (9%, 10/74). SMAD4 y SMAD2 están alterados ambos en 27% (20/74) de las muestras y están localizados dentro de 3 Mb uno de otro en 18q que frecuentemente se ha perdido. Tabla 7 - Genes con ganancia de número de copias significativa Tabla 8 - Genes con pérdida de número de copias significativa Además de evaluar la expresión, los datos de ARN-seq pueden ser explotados para examinar los modelos de corte y empalme. Entre los genes mutados hay varios que llevan mutaciones somáticas en sitios de corte y empalme canónicos que afectarán probablemente su corte y empalme. Se hallaron112 genes con mutaciones del sitio de corte y empalme canónico que muestran evidencia de defectos de corte y empalme basados en los datos de ARN-seq. Los genes afectados incluyen TP53, NOTCH2 y EIF5B (Tabla 9). Los datos de ARN- seq también se usaron para analizar la expresión específica tumoral de algunos exones en regiones codificadoras de genes. Se identificaron dos nuevos exones específicos de tumores corriente arriba del primer exón anotado 5' de una subunidad grande mitocondrial del gen MRPL33 (Figura 1A-C). El análisis de esta región genómica identificó los sitios de unión del factor de transcripción 5' de estos nuevos exones, lo que sostiene adicionalmente nuestra observación.

Tabla 9 - Efectos de mutación del sitio de corte y empalme Ejemplo 4- Fusiones de R-espondina recurrentes activan la señalización de la vía de Wnt Los datos de ARN-seq fueron usados a continuación para identificar los reordenamientos intra- e inter-cromosómicos, tales como fusiones de genes que ocurren en genomas de cáncer (Ozsolak, F. & Milos, P. M. Nature Rev Genet. 12:87-98 (2011)). En el mapeo de los datos de ARN-seq de extremos apareados, se identificaron 36 fusiones de genes somáticas, incluyendo dos recurrentes, en los transcriptomas de CRC analizados. La naturaleza somática de las fusiones fue establecida confirmando su presencia en los tumores y la ausencia en las muestras normales correspondientes usando RT-PCR. Además, todas las fusiones informadas en estos ejemplos fueron secuenciadas según Sanger y validadas (Tabla 10). La mayoría de las fusiones somáticas predichas identificadas eran intra-cromosómicas (89%; 32/36)..

Tabla 10 - Fusiones énicas 5 10 20 5 10 5 10 15 20 20:47601266 NO:34) NO:65) 4:73956384- GGAAAATCCTCATATTTGCCA (SEQ ID AGCAGGGAAGCCTCCTAGTC (SEQ ID ANKRD17 HS3ST1 supresión 4:11401737 NO:35) NO:66) 158 intracrom. 4:40517884- AGACCCAGGAGGAGTGAGGT (SEQ ID GGTCAGCCAGTGAGGTCTTC (SEQ ID 5 RB 47 ATP8A1 4:42629126 NO:36) NO:67) 151 intracrom. 12:69924740- AGATGCCCAGATGCAAAAGT (SEQ ID CAAAGCAGA CTTTCCAACGC (SEQ ID 161 FRS2 RAP1B 12:69042479 NO:37) NO:68) 22:29137757- GGCTGAGGGTGGAGTTTGTA (SEQ ID CTTCTGATCGAAGCTTTCCG (SEQ ID 10 CHEK2 PARVB inversión 22:44553862 NO:38) NO:69) 191 22:51904362- CCCCAGTTAGAAGGGGAAGA (SEQ ID CACTCTCATCTCTGGGCTCC (SEQ ID SFI1 TPST2 inversión 22:26940641 NO:39) NO:70) 190 20 Las fusiones recurrentes identificadas en estos ejemplos involucran a los miembros de la familia de R-espondina, RSP02 (3%; 2/68) y RSP03 (8%; 5/68; Figura 2A) halladas en las muestras MSS CRC. Las R-espondinas son proteínas segregadas de las que se sabe que potencian la señalización de Wnt canónica (Yoon, J. K. & Lee, J. S. Cell Signal. 24(2):369-77 (2012)), potencialmente por la unión a la familia LGR de GPCRs (Carmon, K. S. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108:11452-11457 (2011); de Lau, W. ef ai, Nature 476:293-297 (2011); Glinka, A. ef ai, EMBO Reports 12:1055-1061 (2011)). La fusión RSP02 recurrente identificada en dos muestras tumorales involucra el EIF3E (factor de iniciación de traducción eucariótico 3) exón 1 y RSP02 exón 2 (Figura 2B). Se esperaba que este transcripto de fusión produjera una proteína RSP02 funcional dirigida por el promotor EIF3E (Figura 2D). Una segunda fusión RSP02 detectada en las mismas muestras involucra EIF3E exón 1 y RSP02 exón 3 (Tabla 10). Sin embargo, no se esperaba que esta EIF3E(e1)-RSP02(e3) produjera una proteína funcional. Para confirmar la naturaleza de la alteración a nivel del genoma, se realizó la secuenciación del genoma completo (WGS) de los tumores que contenían fusiones RSP02. El análisis de lecturas abarcadoras de uniones, lecturas de extremos apareados y datos del número de copias derivados de los datos WGS, identificaron una supresión de 158kb en una muestra y una supresión de 113kb en la segunda muestra, las cuales colocan al exón 1 de EIF3E en la proximidad del extremo 5' de RSP02.

Se observaron translocaciones de RSP03 en 5 de 68 tumores y estos involucran a PTPRK (receptor de la proteína tirosina quinasa kappa) como su asociado 5'. Las lecturas WGS de los 5 tumores que expresan las fusiones de RSP03 mostraron reordenamientos que involucran una inversión simple (3 muestras) o una compleja (2 muestras) que coloca a la RSP03 en la proximidad de la PTPRK en la misma hebra que PTPRK en cromosomas 6q. Se identificaron dos diferentes variantes de fusión RSP03 que consistían o bien en el exón 1 (e1) o el exón 7 (e7) de PTPRK y el exón 2 (e2) de RSP03 (Figura 3A-C y Figura 4A-C). Las fusiones RSP03 probablemente se origen en un evento de supresión-inversión a nivel cromosómico ya que normalmente PTPRK y RSP03 se encuentran separados por 850 Kb en hebras opuestas en cromosomas 6q. La PTPRK(e^-RSP03(e2), hallada en cuatro muestras, era una fusión en marco que preserva toda la secuencia codificadora de RSP03 y reemplaza su secuencia de señales de secreción con la de PTPRK (Figura 3C). La PTPRK{e7)-RSP03{e2), detectada en una muestra, también era una fusión en marco que codifica una proteína de -70 KDa que consiste en los primeros 387 aminoácidos de PTPRK, incluyendo su secuencia de señales de secreción, y los aminoácidos de RSP03 34-272 no tenían su péptido señal nativo (Figure 4C). Es interesante destacar que PTPRK contiene una secuencia de señales de secreción mucho más fuerte comparada con RSP03 y potencialmente conduce a una secreción más eficiente de las variantes de fusión identificadas. Adicionalmente, los datos de ARN-seq mostraron que la expresión de mARN de RSP02 y RSP03 en muestras de tumores de colon que contenían las fusiones era elevada en comparación con sus muestras normales correspondientes y las muestras de tumores que no tenían las fusiones de R-espondina (Figura 2E). Además, todos los tumores de fusión positiva de RSPO expresaron los receptores de R-espondinas potenciales LGR4/5/623-25, aunque la expresión de LGR6 era menor comparada con LGR4/5.

Para determinar si las proteínas de fusión de R-espondina predichas eran funcionales, se generaron constructos de expresión que contenían una etiqueta "flag" C-terminal y se testeó su expresión después de la transfección en células 293T de mamíferos. El análisis Western del medio acondicionado mostró que las proteínas de fusión fueron expresadas y segregadas (Figura 5A). Los productos de fusión de R-espondina eran biológicamente activos según se determinó por su capacidad para potenciar la señalización de Wnt usando un reportero de luciferasa Wnt. Como se observó con la RSP02/3 de tipo salvaje, la estimulación con medio acondicionado de células transfectadas con constructos de expresión de fusión de RSPO condujo a la activación del reportero de luciferasa Wnt (Figura 5B) comparado con la de las células transfectadas de control. La activación observada, si bien aparente en la ausencia de WNT exógeno, fue potenciada adicionalmente en la presencia de WNT recombinante, lo que concuerda con el rol conocido de las R-espondinas en la señalización de Wnt (Carmon, K. S. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108:11452-11457 (2011); de Lau, W. er a/., Nature 476:293-297 (2011); Glinka, A. et al., EMBO Reports 12:1055-1061 (2011)).

Para caracterizar adicionalmente las fusiones de genes RSPO, se analizaron las fusiones de genes RSPO en el contexto de mutaciones y otras alteraciones que ocurren en componentes de los caminos de señalización celular, incluyendo la cascada de señalización de Wnt (Figura 6B). Las fusiones de RSP02 y RSP03 eran mutuamente exclusivas entre sí, además de ser mutuamente exclusivas con las mutaciones de APC (Figura 5E), excepto una muestra que tenía una sola supresión de copia en la región codificadora APC (Figura 5E). Además, las fusiones de genes RSPO eran mutuamente exclusivas con CTNNB1, otro gen de la vía de Wnt que estaba mutado en la CRC. Además, todas las muestras con fusiones de genes RSPO también llevaban la mutación en KRAS o BRAF (Figura 6A). La mayoría de las muestras de mutantes APC tenían mutaciones de genes del camino RAS, indicando que las fusiones de genes RSPO probablemente tengan el mismo rol que las mutaciones APC promoviendo la señalización de Wnt durante el desarrollo del tumo de colon. En los datos no mostrados, se demostró que los tumores con fusiones de genes RSPO exhibían una firma de expresión de WNT similar a la de los tumores mutantes de APC indicando que las R-espondinas pueden activar la vía de WNT en tumores de colon en ausencia de mutaciones de WNT corriente abajo. Estos hallazgos indican que las R-espondinas funcionan probablemente como directoras en las CRCs humanas.

En estos ejemplos, se informó un análisis genómico extenso en profundidad de los tumores de colon primarios humanos. En la secuenciación y el análisis de exornas y transcriptomas de CRC humanos, se hallaron múltiples mutaciones somáticas recurrentes nuevas. Muchos de los genes mutados significativamente en estos ejemplos (APC, KRAS, PIK3CA, SMAD4, FBXW7, TP53, TCF7L2) concuerdan con los hallazgos previos. Además, se informaron múltiples mutaciones en 111 de los 140 genes que resaltaron en su estudio. Además, se identificaron 11 genes de cáncer de colon significativos adicionales, incluyendo ATM y TMPRSS11A, que no habían sido informados previamente. Los ejemplos identificaron múltiples genes que contienen puntos calientes, incluyendo TCF12 y ERBB3. Las mutantes oncogénicas ERBB3 identificadas aquí proveen potencialmente nuevas oportunidades para la intervención terapéutica en CRC. El análisis combinado de expresión y datos de números de copias identificó la sobreexpresión IGF2 en un subconjunto de nuestras muestras de CRC humanas.

Finalmente, usando los datos de ARN-seq, se identificaron nuevas fusiones recurrentes que involucran R-espondinas que ocurren a una frecuencia de aproximadamente 10%. Los resultados de las fusiones en las proteínas de R-espondina funcionales que potencian la señalización de Wnt. Las R-espondinas proveen objetivos atractivos para la terapia basada en anticuerpos en pacientes con cáncer de colon que los albergan. Además del direccionamiento directo a las R-espondinas, otras estrategias terapéuticas que bloquean la señalización de Wnt serán probablemente efectivas contra los tumores positivos con respecto a las fusiones de R-espondina.

Secuencia de ácidos nucleicos de RSP01 (SEQ ID NO:1) ATGCGGCTTGGGCTGTGTGTGGTGGCCCTGGTTCTGAGCTGGACGCACCTCA CCATCAGCAGCCGGGGGATCAAGGGGAAAAGGCAGAGGCGGATCAGTGCCG AGGGGAGCCAGGCCTGTGCCAAAGGCTGTGAGCTCTGCTCTGAAGTCAACG GCTGCCTCAAGTGCTCACCCAAGCTGTTCATCCTGCTGGAGAGGAACGACAT CCGCCAGGTGGGCGTCTGCTTGCCGTCCTGCCCACCTGGATACTTCGACGC CCGCAACCCCGACATGAACAAGTGCATCAAATGCAAGATCGAGCACTGTGAG GCCTGCTTCAGCCATAACTTCTGCACCAAGTGTAAGGAGGGCTTGTACCTGC ACAAGGGCCGCTGCTATCCAGCTTGTCCCGAGGGCTCCTCAGCTGCCAATGG CACCATGGAGTGCAGTAGTCCTGCGCAATGTGAAATGAGCGAGTGGTCTCCG TGGGGGCCCTGCTCCAAGAAGCAGCAGCTCTGTGGTTTCCGGAGGGGCTCC GAGGAGCGGACACGCAGGGTGCTACATGCCCCTGTGGGGGACCATGCTGCC TGCTCTGACACCAAGGAGACCCGGAGGTGCACAGTGAGGAGAGTGCCGTGT CCTGAGGGGCAGAAGAGGAGGAAGGGAGGCCAGGGCCGGCGGGAGAATGC CAACAGGAACCTGGCCAGGAAGGAGAGCAAGGAGGCGGGTGCTGGCTCTCG AAGACGCAAGGGGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAAGGGACAGTGGGGCCACT CACATCTGCAGGGCCTGCCTAG Secuencia de aminoácidos de RSP01 (SEQ ID NO:2) MRLGLCWALVLSWTHLTISSRGIKGKRQRRISAEGSQACAKGCELCSEVNGCLK CSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFC TKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQ QLCGFRRGSEERTRRVLHAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCPEGQKRRKGG QGRRENANRNLARKESKEAGAGSRRRKGQQQQQQQGTVGPLTSAGPA Secuencia de ácidos nucleicos de RSP02 (SEQ ID NO:3) ATGCAGTTTCGCCTTTTCTCCTTTGCCCTCATCATTCTGAACTGCATGGATTAC AGCCACTGCCAAGGCAACCGATGGAGACGCAGTAAGCGAGCTAGTTATGTAT CAAATCCCATTTGCAAGGGTTGTTTGTCTTGTTCAAAGGACAATGGGTGTAGC CGATGTCAACAGAAGTTGTTCTTCTTCCTTCGAAGAGAAGGGATGCGCCAGTA TGGAGAGTGCCTGCATTCCTGCCCATCCGGGTACTATGGACACCGAGCCCCA GATATGAACAGATGTGCAAGATGCAGAATAGAAAACTGTGATTCTTGCTTTAG CAAAGACTTTTGTACCAAGTGCAAAGTAGGCTTTTATTTGCATAGAGGCCGTT GCTTTGATGAATGTCCAGATGGTTTTGCACCATTAGAAGAAACCATGGAATGT GTGGAAGGATGTGAAGTTGGTCATTGGAGCGAATGGGGAACTTGTAGCAGAA ATAATCGCACATGTGGATTTAAATGGGGTCTGGAAACCAGAACACGGCAAATT GTTAAAAAGCCAGTGAAAGACACAATACTGTGTCCAACCATTGCTGAATCCAG GAGATGCAAGATGACAATGAGGCATTGTCCAGGAGGGAAGAGAACACCAAAG GCGAAGGAGAAGAGGAACAAGAAAAAGAAAAGGAAGCTGATAGAAAGGGCC CAGGAGCAACACAGCGTCTTCCTAGCTACAGACAGAGCTAACCAATAA Secuencia de aminoácidos de RSP02 (SEQ ID NO:4) MQFRLFSFALIILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSR CQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSK DFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRN NRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKDTILCPTIAESRRCKMTMRHCPGGKRTPKAKE KRNKKKKRKLIERAQEQHSVFLATDRANQ Secuencia de ácidos nucleicos de RSP03 (SEQ ID NO:5) ATGCACTTGCGACTGATTTCTTGGC I I I I I ATCATTTTGAACTTTATGGAATACA TCGGCAGCCAAAACGCCTCCCGGGGAAGGCGCCAGCGAAGAATGCATCCTA ACGTTAGTCAAGGCTGCCAAGGAGGCTGTGCAACATGCTCAGATTACAATGG ATGTTTGTCATGTAAGCCCAGACTA I I I I I I GCTCTGGAAAGAATTGGCATGAA GCAGATTGGAGTATGTCTCTCTTCATGTCCAAGTGGATATTATGGAACTCGAT ATCCAGATATAAATAAGTGTACAAAATGCAAAGCTGACTGTGATACCTGTTTCA ACAAAAATTTCTGCACAAAATGTAAAAGTGGATTTTACTTACACCTTGGAAAGT GCCTTGACAATTGCCCAGAAGGGTTGGAAGCCAACAACCATACTATGGAGTG TGTCAGTATTGTGCACTGTGAGGTCAGTGAATGGAATCCTTGGAGTCCATGCA CGAAGAAGGGAAAAACATGTGGCTTCAAAAGAGGGACTGAAACACGGGTCCG AGAAATAATACAGCATCCTTCAGCAAAGGGTAACCTGTGTCCCCCAACAAATG AGACAAGAAAGTGTACAGTGCAAAGGAAGAAGTGTCAGAAGGGAGAACGAGG AAAAAAAGGAAGGGAGAGGAAAAGAAAAAAACCTAATAAAGGAGAAAGTAAA GAAGCAATACCTGACAGCAAAAGTCTGGAATCCAGCAAAGAAATCCCAGAGC AACGAGAAAACAAACAGCAGCAG AAGAAGCGAAAAGTCCAAGATAAACAGAA ATCGGTATCAGTCAGCACTGTACACTAG Secuencia de aminoácidos de RSP03 (SEQ ID NO:6) MHLRLISWLFIILNFMEYIGSQNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCATCSDYNGC LSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKN FCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKK G KTC G F KRGTETRVR EIIQHPSAKG LCPPTNETR KCTVQ R KKC Q KG E RG KKG R ERK Secuencia de ácidos nucleicos de RSPO4 (SEQ ID NO:7) ATGCGGGCGCCACTCTGCCTGCTCCTGCTCGTCGCCCACGCCGTGGACATG CTCGCCCTGAACCGAAGGAAGAAGCAAGTGGGCACTGGCCTGGGGGGCAAC TGCACAGGCTGTATCATCTGCTCAGAGGAGAACGGCTGTTCCACCTGCCAGC AGAGGCTCTTCCTGTTCATCCGCCGGGAAGGCATCCGCCAGTACGGCAAGTG CCTGCACGACTGTCCCCCTGGGTACTTCGGCATCCGCGGCCAGGAGGTCAA CAGGTGCAAAAAATGTGGGGCCACTTGTGAGAGCTGCTTCAGCCAGGACTTC TGCATCCGGTGCAAGAGGCAGTTTTACTTGTACAAGGGGAAGTGTCTGCCCA CCTGCCCGCCGGGCACTTTGGCCCACCAGAACACACGGGAGTGCCAGGGGG AGTGTGAACTGGGTCCCTGGGGCGGCTGGAGCCCCTGCACACACAATGGAA AGACCTGCGGCTCGGCTTGGGGCCTGGAGAGCCGGGTACGAGAGGCTGGC CGGGCTGGGCATGAGGAGGCAGCCACCTGCCAGGTGCTTTCTGAGTCAAGG AAATGTCCCATCCAGAGGCCCTGCCCAGGAGAGAGGAGCCCCGGCCAGAAG AAGGGCAGGAAGGACCGGCGCCCACGCAAGGACAGGAAGCTGGACCGCAG GCTGGACGTGAGGCCGCGCCAGCCCGGCCTGCAGCCCTGA Secuencia de aminoácidos de RSP04 (SEQ ID NO:8) MRAPLCLLLLVAHAVDMLALNRRKKQVGTGLGGNCTGCIICSEENGCSTCQQRL FLFIRREGIRQYGKCLHDCPPGYFGIRGQEVNRCKKCGATCESCFSQDFCIRCKR QFYLYKGKCLPTCPPGTLAHQNTRECQGECELGPWGGWSPCTHNGKTCGSAW GLESRVREAGRAGHEEAATCQVLSESRKCPIQRPCPGERSPGQKKGRKDRRPR KDRKLDRRLDVRPRQPGLQP Polinucleótido de fusión de translocación de EIF3E(e1)-RSP02(e2) (SEQ ID NO:74) GAGCACAGACTCCCTTTTCTTTGGCAAGATGGCGGAGTACGACTTGACTACTC GCATCGCGCACTTTTTGGATCGGCATCTAGTCTTTCCGCTTCTTGAATTTCTCT CTGTAAAGGAGGTTCGTGGCGGAGAGATGCTGATCGCGCTGAACTGACCGG TGCGGCCCGGGGGTGAGTGGCGAGTCTCCCTCTGAGTCCTCCCCAGCAGCG CGGCCGGCGCCGGCTCTTTGGGCGAACCCTCCAGTTCCTAGACTTTGAGAG GCGTCTCTCCCCCGCCCGACCGCCCAGATGCAGTTTCGCCTTTTCTCCTTTG CCCTCATCATTCTGAACTGCATGGATTACAGCCACTGCCAAGGCAACCGATG GAGACGCAGTAAGCGAGCTAGTTATGTATCAAATCCCATTTGCAAGGGTTGTT TGTCTTGTTCAAAGGACAATGGGTGTAGCCGATGTCAACAGAAGTTGTTCTTC TTCCTTCGAAGAGAAGGGATGCGCCAGTATGGAGAGTGCCTGCATTCCTGCC CATCCGGGTACTATGGACACCGAGCCCCAGATATGAACAGATGTGCAAGATG CAGAATAGAAAACTGTGATTCTTGCTTTAGCAAAGACTTTTGTACCAAGTGCAA AGTAGGCTTTTATTTGCATAGAGGCCGTTGCTTTGATGAATGTCCAGATGGTT TTGCACCATTAGAAGAAACCATGGAATGTGTGGAAGGATGTGAAGTTGGTCAT TGGAGCGAATGGGGAACTTGTAGCAGAAATAATCGCACATGTGGATTTAAATG GGGTCTGGAAACCAGAACACGGCAAATTGTTAAAAAGCCAGTGAAAGACACA ATACTGTGTCCAACCATTGCTGAATCCAGGAGATGCAAGATGACAATGAGGCA TTGTCCAGGAGGGAAGAGAACACCAAAGGCGAAGGAGAAGAGGAACAAGAA AAAGAAAAGGAAGCTGATAGAAAGGGCCCAGGAGCAACACAGCGTCTTCCTA GCTACAGACAGAGCTAACCAATAA Secuencia del polipéptido de fusión de translocación de EIF3E(e1)-RSP02(e2) (SEQ ID NO:75) MAEYDLTTRIAHFLDRHLVFPLLEFLSVKEVRGGEMLIALNMQFRLFSFALIILNCM DYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLFFFLRREGMR QYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRG RCFDECPDGFAPLEET ECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTR QIVKKPVKDTILCPTIAESRRCKMTMRHCPGGKRTPKAKEKRNKKKKRKLIERAQ EQHSVFLATDRANQ Secuencia del polinucleótido de fusión de translocación de PTPRK(el)-RSP03(e2) (SEQ ID NO:76) ATGGATACGACTGCGGCGGCGGCGCTGCCTGCTTTTGTGGCGCTCTTGCTCC TCTCTCCTTGGCCTCTCCTGGGATCGGCCCAAGGCCAGTTCTCCGCAGTGCA TCCTAACGTTAGTCAAGGCTGCCAAGGAGGCTGTGCAACATGCTCAGATTAC AATGGATGTTTGTCATGTAAGCCCAGACTA I I I I I I GCTCTGGAAAGAATTGGC ATGAAGCAGATTGGAGTATGTCTCTCTTCATGTCCAAGTGGATATTATGGAAC TCGATATCCAGATATAAATAAGTGTACAAAATGCAAAGCTGACTGTGATACCT GTTTCAACAAAAATTTCTGCACAAAATGTAAAAGTGGATTTTACTTACACCTTG GAAAGTGCCTTGACAATTGCCCAGAAGGGTTGGAAGCCAACAACCATACTAT GGAGTGTGTCAGTATTGTGCACTGTGAGGTCAGTGAATGGAATCCTTGGAGT CCATGCACGAAGAAGGGAAAAACATGTGGCTTCAAAAGAGGGACTGAAACAC GGGTCCGAGAAATAATACAGCATCCTTCAGCAAAGGGTAACCTGTGTCCCCC AACAAATGAGACAAGAAAGTGTACAGTGCAAAGGAAGAAGTGTCAGAAGGGA GAACGAGGAAAAAAAGGAAGGGAGAGGAAAAGAAAAAAACCTAATAAAGGAG AAAGTAAAGAAGCAATACCTGACAGCAAAAGTCTGGAATCCAGCAAAGAAATC CCAGAGCAACGAGAAAACAAACAGCAGCAGAAGAAGCGAAAAGTCCAAGATA AACAGAAATCGGTATCAGTCAGCACTGTACACTAG Secuencia del polipéptido de fusión de translocación de PTPRK(e1)-RSP03(e2) (SEQ ID NO:77) MDTTAAAALPAFVALLLLSPWPLLGSAQGQFSAVHPNVSQGCQGGCATCSDYN GCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFN KNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCT KKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKK GR Secuencia del polinucleótido de fusión de translocación de PTPRK(e7)-RSP03(e2) (SEQ ID NO:78) ATGGATACGACTGCGGCGGCGGCGCTGCCTGCTTTTGTGGCGCTCTTGCTCC TCTCTCCTTGGCCTCTCCTGGGATCGGCCCAAGGCCAGTTCTCCGCAGGTGG CTGTACTTTTGATGATGGTCCAGGGGCCTGTGATTACCACCAGGATCTGTATG ATGACTTTGAATGGGTGCATGTTAGTGCTCAAGAGCCTCATTATCTACCACCC GAGATGCCCCAAGGTTCCTATATGATAGTGGACTCTTCAGATCACGACCCTG GAGAAAAAGCCAGACTTCAGCTGCCTACAATGAAGGAGAACGACACTCACTG CATTGATTTCAGTTACCTATTATATAGCCAGAAAGGACTGAATCCTGGCACTTT GAACATATTAGTTAGGGTGAATAAAGGACCTCTTGCCAATCCAATTTGGAATG TGACTGGATTCACGGGTAGAGATTGGCTTCGGGCTGAGCTAGCAGTGAGCAC CTTTTGGCCCAATGAATATCAGGTAATATTTGAAGCTGAAGTCTCAGGAGGGA GAAGTGGTTATATTGCCATTGATGACATCCAAGTACTGAGTTATCCTTGTGATA AATCTCCTCATTTCCTCCGTCTAGGGGATGTAGAGGTGAATGCAGGGCAAAA CGCTACATTTCAGTGCATTGCCACAGGGAGAGATGCTGTGCATAACAAGTTAT GGCTCCAGAGACGAAATGGAGAAGATATACCAGTAGCCCAGACTAAGAACAT CAATCATAGAAGGTTTGCCGCTTCCTTCAGATTGCAAGAAGTGACAAAAACTG ACCAGGATTTGTATCGCTGTGTAACTCAGTCAGAACGAGGTTCCGGTGTGTCC AATTTTGCTCAACTTATTGTGAGAGAACCGCCAAGACCCATTGCTCCTCCTCA GCTTCTTGGTGTTGGGCCTACATATTTGCTGATCCAACTAAATGCCAACTCGA TCATTGGCGATGGTCCTATCATCCTGAAAGAAGTAGAGTACCGAATGACATCA GGATCCTGGACAGAAACCCATGCAGTCAATGCTCCAACTTACAAATTATGGCA TTTAGATCCAGATACCGAATATGAGATCCGAGTTCTACTTACAAGACCTGGTG AAGGTGGAACGGGGCTCCCAGGACCTCCACTAATCACCAGAACAAAATGTGC AGTGCATCCTAACGTTAGTCAAGGCTGCCAAGGAGGCTGTGCAACATGCTCA GATTACAATGGATGTTTGTCATGTAAGCCCAGACTATTTTTTGCTCTGGAAAGA ATTGGCATGAAGCAGATTGGAGTATGTCTCTCTTCATGTCCAAGTGGATATTAT GGAACTCGATATCCAGATATAAATAAGTGTACAAAATGCAAAGCTGACTGTGA TACCTGTTTCAACAAAAATTTCTGCACAAAATGTAAAAGTGGATTTTACTTACA CCTTGGAAAGTGCCTTGACAATTGCCCAGAAGGGTTGGAAGCCAACAACCAT ACTATGGAGTGTGTCAGTATTGTGCACTGTGAGGTCAGTGAATGGAATCCTTG GAGTCCATGCACGAAGAAGGGAAAAACATGTGGCTTCAAAAGAGGGACTGAA ACACGGGTCCGAGAAATAATACAGCATCCTTCAGCAAAGGGTAACCTGTGTC CCCCAACAAATGAGACAAGAAAGTGTACAGTGCAAAGGAAGAAGTGTCAGAA GGGAGAACGAGGAAAAAAAGGAAGGGAGAGGAAAAGAAAAAAACCTAATAAA GGAGAAAGTAAAGAAGCAATACCTGACAGCAAAAGTCTGGAATCCAGCAAAG AAATCCCAGAGCAACGAGAAAACAAACAGCAGCAGAAGAAGCGAAAAGTCCA AGATAAACAGAAATCGGTATCAGTCAGCACTGTACACTAG Secuencia del polipéptido de fusión de translocación de PTPRK(e7)-RSP03(e2) (SEQ ID NO-.79) MDTTAAAALPAFVALLLLSPWPLLGSAQGQFSAGGCTFDDGPGACDYHQDLYDD FEWVHVSAQEPHYLPPEMPQGSYMIVDSSDHDPGEKARLQLPTMKENDTHCIDF SYLLYSQ KG LN PGTLN I LVRVN KG PLAN P I WNVTGFTGRDWLRAELAVSTFWPN E YQVIFEAEVSGGRSGYIAIDDIQVLSYPCDKSPHFLRLGDVEVNAGQNATFQCIAT GRDAVHNKLWLQRRNGEDIPVAQTKNINHRRFAASFRLQEVTKTDQDLYRCVTQ SERGSGVSNFAQLIVREPPRPIAPPQLLGVGPTYLLIQLNANSIIGDGPIILKEVEYR MTSGSWTETHAVNAPTYKLWHLDPDTEYEIRVLLTRPGEGGTGLPGPPLITRTKC AVHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYY GTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHT MECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPT NETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERKRKKPNKGESKEAIPDSKSLESSKEIPEQ RENKQQQKKRKVQDKQKSVSVSTVH Aunque la invención precedente ha sido descripta con algunos detalles a modo de ilustración y ejemplo con el objeto de mejorar su comprensión, las descripciones y ejemplos no deberían interpretarse como limitando el alcance de la invención. Las divulgaciones de todas las patentes y literatura científica mencionadas en la presente se incorporan expresamente en su totalidad por referencia.

Claims (44)

REIVINDICACIONES Habiendo así especialmente descrito y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma como la misma ha de ser llevada a la práctica, se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo:

1. Un método de tratamiento del cáncer en un individuo que comprende la administración al individuo de una cantidad efectiva de un antagonista de la vía de wnt, en donde el tratamiento se basa en que el individuo tenga un cáncer que comprenda una translocación de R-espondina.

2. Un método de tratamiento de una célula cancerosa, en donde la célula cancerosa comprende una translocación de R-espondina, el método comprende proveer una cantidad efectiva de un antagonista de la vía de wnt.

3. Un método de tratamiento del cáncer en un individuo siempre que se haya determinado que el individuo tiene un cáncer que comprende una translocación de R-espondina, el método comprende la administración al individuo de una cantidad efectiva de un antagonista de la vía de wnt.

4. Un método para el tratamiento del cáncer en un individuo, el método comprende: determinar que una muestra obtenida del individuo comprende una translocación de R-espondina, y administrar una cantidad efectiva de una terapia anticáncer que comprende un antagonista de la vía de wnt al individuo, por medio de la cual se trata el cáncer.

5. Un método de tratamiento del cáncer, que comprende: (a) seleccionar un individuo que tiene cáncer, en donde el cáncer comprende una translocación de R-espondina; y (b) administrar al individuo así seleccionado una cantidad efectiva de un antagonista de la vía de wnt, por medio de la cual se trata el cáncer.

6. Un método de identificación de un individuo que tiene cáncer que es más o menos probable que se beneficie del tratamiento con una terapia anticáncer que comprende un antagonista de la vía de wnt, el método comprende: determinar la presencia o ausencia de una translocación de R-espondina en una muestra obtenida del individuo, en donde la presencia de la translocación de R-espondina en la muestra indica que es más probable que el individuo se beneficie del tratamiento con la terapia anticáncer que comprende el antagonista de la vía de wnt o la ausencia de la translocación de R-espondina indica que es menos probable que el individuo se beneficie del tratamiento con la terapia anticáncer que comprende el antagonista de la vía de wnt.

7. Un método para predecir si un individuo que tiene cáncer es más o menos probable que responda efectivamente al tratamiento con una terapia anticáncer que comprende un antagonista de la vía de wnt, el método comprende la determinación de una translocación de R-espondina, por la cual la presencia de la translocación de R-espondina indica que es más probable que el individuo responda efectivamente al tratamiento con el antagonista de la vía de wnt y la ausencia de la translocación de R-espondina indica que es menos probable que el individuo responda efectivamente al tratamiento con el antagonista de la vía de wnt.

8. Un método para predecir la respuesta o falta de respuesta de un individuo que tiene cáncer o una terapia anticáncer que comprende un antagonista de la vía de wnt que comprende detectar en una muestra obtenida del individuo la presencia o ausencia de una translocación de R-espondina, en donde la presencia de la translocación de R-espondina es predictiva de la respuesta del individuo a la terapia anticáncer que comprende el antagonista de la vía de wnt y la ausencia de la translocación de R-espondina es predictiva de falta de respuesta del individuo a la terapia anticáncer que comprende el antagonista de la vía de wnt.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde el método comprende además administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de la vía de wnt.

10. Un método para inhibir la proliferación de una célula cancerosa que comprende poner en contacto la célula cancerosa con una cantidad efectiva de un antagonista de la translocación de R-espondina.

11. Un método de tratamiento del cáncer en un individuo que comprende la administración al individuo de una cantidad efectiva de un antagonista de la translocación de R-espondina.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11 , en donde el cáncer o la célula cancerosa comprende una translocación de R-espondina.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 12, en donde la translocación de R-espondina es una translocación de RSP01 , una translocación de RSP02, una translocación de RSP03 y/o una translocación de RSP04.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la translocación de R-espondina es una translocación de RSP02.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la translocación de RSP02 comprende EIF3E y RSP02.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la translocación de RSP02 comprende EIF3E exón 1 y RSP02 exón 2.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la translocación de RSP02 comprende EIF3E exón 1 y RSP02 exón 3.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la translocación de RSP02 comprende la SEQ ID NO:71.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la translocación de R-espondina es una translocación de RSP03.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la translocación de RSP03 comprende PTPRK y RSP03.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la translocación de RSP03 comprende PTPRK exón 1 y RSP03 exón 2.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la translocación de RSP03 comprende PTPRK exón 7 y RSP03 exón 2.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la translocación de RSP03 comprende la SEQ ID NO:72 y/o la SEQ ID NO:73.

24. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 12 a 23, en donde la translocación de R-espondina es detectada al nivel cromosómico (por ejemplo, FISH), al nivel de ADN, al nivel de ARN (por ejemplo, transcripto de fusión de translocación de RSP01), y/o al nivel de proteína (por ejemplo, polipéptido de fusión de translocación de RSP01).

25. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde el cáncer o la célula cancerosa es de cáncer colorrectal.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el cáncer o la célula cancerosa es de un cáncer de colon o cáncer rectal.

27. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 13 a 26, en donde el antagonista de la vía de wnt es un anticuerpo, un polipéptido de unión, una molécula pequeña o un polinucleótido.

28. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 13 a 27, en donde el antagonista de la vía de wnt es un antagonista de R-espondina.

29. El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el antagonista de la vía de wnt es un anticuerpo monoclonal aislado que se une a R-espondina.

30. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde la R-espondina es RSP02 y/o RSP03.

31. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, en donde el antagonista de R-espondina es un antagonista de la translocación de R-espondina.

32. Un antagonista de la translocación de R-espondina aislado, en donde el antagonista de la translocación de R-espondina es un anticuerpo, un polipéptido de unión, una molécula pequeña o un polinucleótido.

33. El método de acuerdo con la reivindicación 31 o el antagonista de acuerdo con la reivindicación 32, en donde el antagonista de translocación de R-espondina se une a un polinucleótido y/o polipéptido de fusión de translocación de RSP01, un polinucleótido y/o polipéptido de fusión de translocación de RSP02, un polinucleótido y/o polipéptido de fusión de translocación de RSP03 y/o un polinucleótido y/o polipéptido de fusión de translocación de RSP04.

34. El método o el antagonista de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el antagonista de translocación de R-espondina se une a un polinucleótido y/o polipéptido de fusión de translocación de RSP02.

35. El método o el antagonista de acuerdo con la reivindicación 34, en donde el polinucleótido y/o polipéptido de fusión de translocación de RSP02 comprende EIF3E y RSP02.

36. El método o el antagonista de acuerdo con la reivindicación 34, en donde el polinucleótido y/o polipéptido de fusión de translocación de RSP02 comprende EIF3E exón 1 y RSP02 exón 2.

37. El método o el antagonista de acuerdo con la reivindicación 34, en donde el polinucleótido y/o el polipéptido de fusión de translocación de RSP02 comprende EIF3E exón 1 y RSP02 exón 3.

38. El método o el antagonista de acuerdo con la reivindicación 34, en donde el polinucleótido y/o el polipéptido de fusión de translocación de RSP02 comprende la SEQ ID NO:71.

39. El método o el antagonista de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el polinucleótido y/o el polipéptido de fusión de translocación de R- espondina es un polinucleótido y/o polipéptido de fusión de translocación de RSP03.

40. El método o el antagonista de acuerdo con la reivindicación 39, en donde el polinucleótido y/o el polipéptido de fusión de translocación de RSP03 comprende PTPRK y RSP03.

41. El método o el antagonista de acuerdo con la reivindicación 39, en donde el polinucleótido y/o el polipéptido de fusión de translocación de RSP03 comprende PTPRK exón 1 y RSP03 exón 2.

42. El método o el antagonista de acuerdo con la reivindicación 39, en donde el polinucleótido y/o el polipéptido de fusión de translocación de RSP03 comprende PTPRK exón 7 y RSP03 exón 2.

43. El método o el antagonista de acuerdo con la reivindicación 39, en donde el polinucleótido y/o el polipéptido de fusión de translocación de RSP03 comprende la SEQ ID NO:72 y/o la SEQ ID NO:73.

44. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, en donde el método comprende además administrar un agente terapéutico adicional.