KR20220069989A - 펩티드 링커를 갖는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜 - Google Patents

펩티드 링커를 갖는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜 Download PDF

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히로키 요시오카
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Abstract

세포 내의 효소에 의해 펩티드 링커가 분해되어 약물을 서방하고, 또한 약물의 소수성을 효과적으로 차폐하는 근접한 2개의 단분산 폴리에틸렌글리콜 측쇄를 갖는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜 및 이를 이용하여 항체와 약물을 결합한 항체-약물 복합체를 제공하는 것. 식 (1)로 나타내는, 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜.
Figure pct00058

(식 (1) 중, 각 기호는 명세서 중에서 정의한 것과 같다.)

Description

펩티드 링커를 갖는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜
본 발명은 펩티드 링커 및 2개의 상이한 화학 반응 가능한 작용기를 갖는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 생리 활성 단백질, 펩티드, 항체, 핵산 및 저분자 약물 등의 생체 기능성 분자, 드러그 딜리버리 시스템에 있어서의 약물 캐리어, 또는 진단용 재료나 의료용 디바이스 등의 수식에 이용되며, 특히 항체 의약의 수식에 유용한, 펩티드 링커 및 2개의 상이한 화학 반응 가능한 작용기를 갖는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜에 관한 것이다.
항체-약물 복합체(Antibody-Drug Conjugate; ADC)는, 항체에 약물을 결합시켜, 항체의 항원 특이성을 이용하여 약제를 질환 부위에 능동적으로 운반하는 것을 목적으로 한 항체 의약이며, 최근, 암 치료의 분야에서 가장 급속하게 성장하고 있는 기술의 하나이다. ADC는 항체, 약물, 그리고 항체와 약물을 결합시키는 링커의 각 부분으로 구성된다.
ADC에 이용되는 약물은 소수성의 것이 많고, 이들 소수성 약물을 항체에 복수 결합하여 ADC를 조제하면, 약물의 소수성에 기인하는 응집의 발생이나 항체의 혈중 안정성의 저하가 문제가 된다. 따라서, 항체 1개당에 탑재 가능한 약물의 수에 제약이 생기며, 결과로서 ADC의 약효가 충분히 얻어지지 않는 경우가 있다.
이 과제에 대하여 검토되어 있는 해결 방법의 하나가, 친수성 링커의 이용이다. 친수성 링커로서 폴리에틸렌글리콜, 친수성 펩티드, 당쇄 등이 이용되고 있으며, 특히 폴리에틸렌글리콜은 항원성이 낮아, 생체 적합성이 높기 때문에, 현재, 임상 시험 및 전임상 시험 단계에 있는 복수의 ADC에 채용되고 있다.
ADC 분야에서는, ADC의 균일성을 보증하며, 정제, 분석 및 의약품 승인 신청을 간편하게 하는 것을 목적으로 하여, 특정한 에틸렌글리콜쇄 길이를 갖는 성분이 90% 이상 포함되는 화합물이 사용된다. 이러한 화합물은, 단분산 폴리에틸렌글리콜이라고 호칭된다.
단분산 폴리에틸렌글리콜을 ADC의 링커로서 이용하는 경우, 항체와 약물을 구별하여 결합시킬 필요가 있기 때문에, 2개의 상이한 화학 반응 가능한 작용기를 갖는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜이 이용된다. 일반적으로, 단분산 폴리에틸렌글리콜쇄의 양 말단에 서로 상이한 화학 반응 가능한 작용기를 갖는 화합물을 이용하여 ADC가 조제된다.
그런데 최근, 단분산 폴리에틸렌글리콜을 항체와 약물을 잇는 링커 주쇄로서 이용하는 것이 아니라, 항체와 약물을 잇는 분기 링커에 측쇄로서 단분산 폴리에틸렌글리콜을 도입한 ADC가 보고되어 있다.
비특허문헌 1에서는, 항체와 약물을 잇는 링커 주쇄로서 단분산 폴리에틸렌글리콜을 이용한 ADC 및 항체와 약물을 잇는 분기 링커에 측쇄로서 단분산 폴리에틸렌글리콜을 이용한 ADC의 약물 동태 및 치료 효과를 비교하고 있으며, 후자 쪽이 약물의 소수성을 차폐하는(masking) 효과가 높아, 우수한 약물 동태 및 치료 효과를 나타내는 것이 보고되어 있다.
또한, 특허문헌 1 및 특허문헌 2에서는, 분기 링커의 측쇄로서 단분산 폴리에틸렌글리콜을 갖는 여러 가지 타입의 ADC 및 이들을 조제하기 위한 중간체가 개시되어 있다.
또한, 특허문헌 3에서는, 4분기 골격으로 4급 탄소 원자에 2개의 단분산 폴리에틸렌글리콜이 결합하여, 분기 중 2개의 말단에 2종류의 작용기를 갖는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜 및 이것을 이용한 ADC가 개시되어 있다.
특허문헌 1: 국제 공개 제2015/057699호 팸플릿 특허문헌 2: 국제 공개 제2016/063006호 팸플릿 특허문헌 3: 국제 공개 제2018/181059호 팸플릿
비특허문헌 1: Nature Biotechnology, 2015, 33, 733-735
특허문헌 1 및 특허문헌 2에서는, 분기 링커의 측쇄에 2개 이상의 단분산 폴리에틸렌글리콜을 갖는 ADC도 개시되어 있다. 그러나, 각각의 단분산 폴리에틸렌글리콜 측쇄의 결합 위치가 떨어져 있어, 폴리에틸렌글리콜쇄를 복수개 갖는 분기형 폴리에틸렌글리콜의 특징인 「엄브렐라 유사(umbrella-like)」 구조 「Biomaterials 2001, 22(5), 405-417」에 따른 소수성 약물의 차폐 효과가 작아, 단분산 폴리에틸렌글리콜 측쇄를 복수개 갖는 이점을 유효하게 활용할 수 없다.
또한, 비특허문헌 1 및 특허문헌 3에서는, 분기 링커의 측쇄에 단분산 폴리에틸렌글리콜을 갖는 분기형 단분산 폴리에틸렌글리콜 및 이것을 항체와 약물의 결합에 이용한 ADC가 개시되어 있다. 그러나, 이 ADC는 세포 내에 취입된 후, 항체는 세포 내의 효소에 의해 분해되지만, 약물에 상기 단분산 폴리에틸렌글리콜이 결합한 상태가 되어, 약물의 활성이 저하하여 버릴 우려가 있기 때문에, 바람직하지 못하다.
본 발명은 항체 및 약물이 펩티드 링커 및 단분산 폴리에틸렌글리콜 측쇄를 갖는 링커로 연결된, 항체-약물 복합체에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 과제는, 세포 내의 효소에 의해 펩티드 링커가 분해되어 약물을 서방하고, 또한 약물의 소수성을 효과적으로 차폐하는 근접한 2개의 단분산 폴리에틸렌글리콜 측쇄를 갖는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜 및 이것을 이용하여 항체와 약물을 결합한 항체-약물 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 세포 내의 효소에 의해 분해되는 펩티드 링커를 갖고, 또한 2개의 단분산 폴리에틸렌글리콜 측쇄가 근접하여 결합하는 헤테로 2작용성 화합물인 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜 및 이것을 이용하여 항체와 약물을 결합한 항체-약물 복합체를 개발하였다.
또한, 본 발명의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜은, 2개의 단분산 폴리에틸렌글리콜 측쇄가 분기 부분의 4급 탄소 원자에 안정적인 에테르 결합으로 결합하고 있기 때문에, 상기 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜의 구조의 화학 변환 프로세스에 있어서, 단일 가닥의 단분산 폴리에틸렌글리콜에 분해되기 어렵다고 하는 특징을 갖는다.
또한, 본 발명의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜은, 세포 내의 효소에 의해 분해되는 펩티드 링커를 갖고 있기 때문에, 약물을 세포 내에서 효과적으로 서방할 수 있어, 세포 내에서의 약물의 활성에 영향을 부여하지 않는다고 하는 특징을 갖는다.
즉, 본 발명은 이하의 것이다.
[1] 식 (1)로 나타내는, 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜.
Figure pct00001
(식 (1) 중,
X1 및 Y1은 각각 생체 기능성 분자에 존재하는 작용기와 반응하여 공유 결합을 형성하는 작용기를 적어도 포함하는 원자단이고, 원자단 X1이 포함하는 상기 작용기와 원자단 Y1이 포함하는 상기 작용기는 서로 상이하고;
R1은 탄소수 1∼7의 탄화수소기 또는 수소 원자이고;
n은 3∼72의 정수이고;
A1은 -L1-(CH2)m1-L2-, -L1-(CH2)m1-L2-(CH2)m2-, 아미드 결합, 우레탄 결합, 2급 아미노기 또는 단결합을 나타내고, m1 및 m2는 각각 독립적으로 1∼5의 정수를 나타내고;
B1은 -CH2-L3-, -CH2-L3-(CH2)m3-L4- 또는 -CH2-L3-(CH2)m3-L4-(CH2)m4-를 나타내고, m3 및 m4는 각각 독립적으로 1∼5의 정수를 나타내고;
W는 2∼4 잔기의 올리고펩티드이고;
Z는 펩티드의 C 말단에 결합하는 2작용성 파라-아미노벤질알코올기를 갖는 스페이서이고;
a1 및 a2는, a1=1일 때 a2=0이고, a1=0일 때 a2=1이고;
b는 0 또는 1이고;
C1은 -L5-(CH2)m5-, -L5-(CH2)m5-L6-(CH2)m6-, 아미드 결합 또는 단결합을 나타내고, m5 및 m6은 각각 독립적으로 1∼5의 정수를 나타내고;
L1∼L6은 각각 독립적으로 에테르 결합, 우레탄 결합, 아미드 결합, 2급 아미노기, 카르보닐기 또는 단결합을 나타낸다.)
[2] W가 페닐알라닌, 류신, 발린, 이소류신의 소수성의 중성 아미노산 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 그 이외의 아미노산이 시스테인을 제외한 중성 아미노산을 포함하는 2∼4 잔기의 올리고펩티드인, [1]에 기재된 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜.
[3] W가 페닐알라닌, 류신, 발린, 이소류신의 소수성의 중성 아미노산 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 그 이외의 아미노산이 알라닌, 글리신, 시트룰린, 프롤린, 세린, 아스파라긴을 적어도 하나 갖는 2∼4 잔기의 올리고펩티드인, [1]에 기재된 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜.
[4] W가 C 말단의 아미노산이 글리신인 올리고펩티드인, [1]에 기재된 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜.
[5] W가 디펩티드인, [1]에 기재된 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜.
[6] 식 (1)에 있어서의 X1 및 Y1이, 각각 독립적으로 식 (a), 식 (b1), 식 (b2), 식 (c), 식 (d1), 식 (d2), 식 (e), 식 (f), 식 (g), 식 (h), 식 (i), 식 (j), 식 (k), 식 (l), 식 (m), 식 (n) 및 식 (o)로 이루어진 군에서 선택되는, [1]∼[5] 중 어느 1 항에 기재된 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜.
Figure pct00002
(식 (d1), (d2) 중, R2는 수소 원자 또는 탄소수 1∼5의 탄화수소기이고; 식 (e) 중, R3은 염소 원자, 브롬 원자 및 요오드 원자에서 선택되는 할로겐 원자이고; 및 식 (l) 중, R4는 수소 원자 또는 탄소수 1∼5의 탄화수소기이다.)
[7] 식 (2)로 나타내는, 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜을 포함하여 이루어지는 항체-약물 복합체.
Figure pct00003
(식 (2) 중,
X2와 Y2 중 한쪽이 항체이며, 다른쪽이 약물이고;
R1은 탄소수 1∼7의 탄화수소기 또는 수소 원자이고;
n은 3∼72의 정수이고;
A2는 -L1-(CH2)m1-L7-, -L1-(CH2)m1-L8-, -L1-(CH2)m1-L2-(CH2)m2-L8- 또는 -L8-을 나타내고, m1 및 m2는 각각 독립적으로 1∼5의 정수를 나타내고;
B2는 -CH2-L9-, -CH2-L9-(CH2)m3-L10-, -CH2-L9-(CH2)m3-L10-(CH2)m4-L11-, -CH2-L12-, -CH2-L9-(CH2)m3-L12- 또는 -CH2-L9-(CH2)m3-L10-(CH2)m4-L12-를 나타내고, m3 및 m4는 각각 독립적으로 1∼5의 정수를 나타내고;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 에테르 결합, 우레탄 결합, 아미드 결합, 2급 아미노기 또는 단결합을 나타내고;
L7, L9, L10 및 L11은 각각 독립적으로 에테르 결합, 우레탄 결합, 아미드 결합, 2급 아미노기 또는 카르보닐기를 나타내고;
L8 및 L12는 아미드 결합, 우레탄 결합, 말레이미드와 티올의 결합, 티오에테르 결합, 디술피드 결합, 카보네이트 결합, 에스테르 결합, 에테르 결합, 1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일 구조, 2급 아미노기, 히드라지드기, 옥시아미드기 혹은 이들을 포함하는 탄화수소기 또는 단결합을 나타내고;
W는 2∼4 잔기의 올리고펩티드이고;
Z는 펩티드의 C 말단에 결합하는 2작용성 파라-아미노벤질알코올기를 갖는 스페이서이고;
a3 및 a4는, X2가 약물일 때, a3=1 또한 a4=0이고, Y2가 약물일 때, a3=0 또한 a4=1이고;
b는 0 또는 1이고; 및
C2는 아미드 결합, 우레탄 결합, 말레이미드와 티올의 결합, 티오에테르 결합, 디술피드 결합, 카보네이트 결합, 에스테르 결합, 에테르 결합, 1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일 구조, 2급 아미노기, 히드라지드기, 옥시아미드기 혹은 이들을 포함하는 탄화수소기를 나타낸다.)
[8] W가 페닐알라닌, 류신, 발린, 이소류신의 소수성의 중성 아미노산 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 그 이외의 아미노산이 시스테인을 제외한 중성 아미노산을 포함하는 2∼4 잔기의 올리고펩티드인, [7]에 기재된 항체-약물 복합체.
[9] W가 페닐알라닌, 류신, 발린, 이소류신의 소수성의 중성 아미노산 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 그 이외의 아미노산이 알라닌, 글리신, 시트룰린, 프롤린, 세린, 아스파라긴을 적어도 하나 갖는 2∼4 잔기의 올리고펩티드인, [7]에 기재된 항체-약물 복합체.
[10] W가 C 말단의 아미노산이 글리신인 올리고펩티드인, [7]에 기재된 항체-약물 복합체.
[11] W가 디펩티드인, [7]에 기재된 항체-약물 복합체.
본 발명에 따른 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜은, 2개의 단분산 폴리에틸렌글리콜 측쇄가 분기 부분의 4급 탄소 원자에 안정적인 에테르 결합으로 결합하고 있기 때문에, 화학 변환 프로세스에 있어서 단일 가닥의 단분산 폴리에틸렌글리콜에 분해되기 어렵다. 따라서, 상기 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜을 이용하여 항체와 약물을 결합함으로써, 균질성이 높은 항체-약물 복합체를 얻을 수 있다.
또한, 상기 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜은, 2개의 단분산 폴리에틸렌글리콜 측쇄가 근접하여 결합하고 있기 때문에, 항체-약물 복합체를 조제하였을 때에 소수성 약물의 차폐 효과가 커서, 약물의 소수성에 기인하는 응집의 발생, 항체의 혈중 안정성의 저하를 억제할 수 있다.
또한, 상기 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜은, 세포 내의 효소에 의해 분해되는 펩티드 링커를 포함하기 때문에, 세포 내에 있어서 약물로부터 링커 부위가 절단되어, 약물을 세포 내에서 효과적으로 서방할 수 있다.
도 1은 실시예 10의 식 (20)의 화합물의 실시예 37에 있어서의 분해성 시험 전후의 HPLC 측정 결과를 나타낸다.
도 2는 실시예 37의 분해성 시험 후의 식 (20)의 화합물 유래의 분해물의 매스 크로마토그램을 나타낸다.
도 3은 비교예 2의 식 (44)의 화합물의 실시예 37에 있어서의 분해성 시험 전후의 HPLC 측정 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 11의 식 (21)의 화합물의 실시예 38에 있어서의 분해성 시험 전후의 HPLC 측정 결과를 나타낸다.
도 5는 실시예 38의 분해성 시험 후의 식 (21)의 화합물 유래의 분해물의 매스 크로마토그램을 나타낸다.
도 6은 실시예 16의 식 (26)의 화합물의 실시예 38에 있어서의 분해성 시험 전후의 HPLC 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 실시예 30의 식 (40)의 화합물의 실시예 39에 있어서의 분해성 시험 전후의 HPLC 측정 결과를 나타낸다.
도 8은 실시예 39의 분해성 시험 후의 식 (40)의 화합물 유래의 분해물의 매스 크로마토그램을 나타낸다.
도 9는 비교예 4의 식 (46)의 화합물의 실시예 39에 있어서의 분해성 시험 전후의 HPLC 측정 결과를 나타낸다.
도 10은 실시예 40의 분해성 시험 후의 식 (42)의 화합물 유래의 분해물의 매스 크로마토그램을 나타낸다.
도 11은 식 (40) 및 식 (46)의 약물-링커 화합물을 이용한 실시예 41의 세포 독성 시험에 있어서의 각 샘플 농도당의 세포 생존율을 플롯한 그래프를 나타낸다.
도 12는 식 (42) 및 식 (46)의 약물-링커 화합물을 이용한 실시예 42의 세포 독성 시험에 있어서의 각 샘플 농도당의 세포 생존율을 플롯한 그래프를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 명세서에 있어서의 「헤테로 2작용성」이란, 2개의 상이한 화학 반응 가능한 작용기를 갖는 것을 의미하고, 「단분산 폴리에틸렌글리콜」이란, 특정한 에틸렌글리콜쇄 길이를 갖는 성분이 90% 이상 포함되는 화합물을 의미하고, 「링커」란, 항체와 약물을 공유 결합시키는 또는 탄소쇄를 포함하는 화학 부위를 말한다.
본 발명의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜은 식 (1)로 나타낸다.
Figure pct00004
본 발명의 식 (1)에 있어서의 R1은 탄소수 1∼7의 탄화수소기 또는 수소 원자이고, 구체적인 탄화수소기로서는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, t-부틸기, 페닐기 및 벤질기 등을 들 수 있다. R1의 바람직한 실시형태로서는 메틸기 또는 수소 원자이고, 더욱 바람직하게는 메틸기이다.
본 발명의 식 (1)에 있어서의 n은, 단분산 폴리에틸렌글리콜의 반복 단위수를 나타내는 3∼72의 정수이고, 바람직하게는 4∼48의 정수이고, 더욱 바람직하게는 6∼36의 정수이고, 특히 바람직하게는 8∼24의 정수이다.
본 명세서에 있어서, 식 (1)의 원자단 X1 및 Y1은 서로 상이하고, 상기 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜에 의한 수식의 대상이 되는 생체 기능성 분자(생리 활성 단백질, 펩티드, 항체, 핵산 및 저분자 약물 등)에 존재하는 작용기와 반응하여 공유 결합을 형성하는 작용기를 적어도 포함하는 원자단이면 특별히 제한되지 않는다. 상기 작용기의 예로서는, 「Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques, 2nd ed.; Academic Press: San Diego, CA, 2008」, 「Harris, J.M. Poly(Ethylene Glycol) Chemistry; Plenum Press: New York, 1992」 및 「PEGylated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Applications; Veronese, F.M., Ed.; Birkhauser: Basel, Switzerland, 2009」 등에 기재되어 있는 작용기를 들 수 있다.
그 중에서도, X1 및 Y1에 포함되는 작용기는 각각 독립적으로, 단백질로 대표되는 천연의 생체 기능성 분자에 존재하는 작용기(아미노기, 티올기, 알데히드기, 카르복시기 등)나 상기 생체 기능성 분자에 인공적으로 도입 가능한 작용기(말레이미드기, 케톤기, 아지드기, 알키닐기 등)에 온화한 반응 조건, 또한 높은 반응 효율로 반응 가능한 작용기인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는, 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데히드기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭시기, 말레이미드기, 비닐술폰기, 아크릴기, 술포닐옥시기, 카르복시기, 티올기, 2-피리딜디티오기, α-할로아세틸기, 히드록시기, 알키닐기, 알릴기, 비닐기, 아미노기, 옥시아미노기, 히드라지드기, 아지드기 및 디벤조시클로옥틴(DBCO)기가 바람직하고, 또한 반응 효율을 고려하면, 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 말레이미드기, α-할로아세틸기, 알키닐기, 아지드기 및 디벤조시클로옥틴(DBCO)기가 바람직하고, 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기 및 말레이미드기가 보다 바람직하다.
더욱 구체적으로는, X1 및 Y1에 포함되는 작용기는 각각 독립적으로, 수식의 대상이 되는 생체 기능성 분자에 존재하는 작용기가 아미노기인 경우에는, 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데히드기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭시기, 말레이미드기, 비닐술폰기, 아크릴기, 술포닐옥시기 또는 카르복시기이고, 수식의 대상이 되는 생체 기능성 분자에 존재하는 작용기가 티올기인 경우에는, 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데히드기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭시기, 말레이미드기, 비닐술폰기, 아크릴기, 술포닐옥시기, 카르복시기, 티올기, 2-피리딜디티오기, α-할로아세틸기, 알키닐기, 알릴기 또는 비닐기이고, 수식의 대상이 되는 생체 기능성 분자에 존재하는 작용기가 알데히드기 또는 카르복시기인 경우에는, 티올기, 히드록시기, 아미노기, 옥시아미노기 또는 히드라지드기이고, 수식의 대상이 되는 생체 기능성 분자에 존재하는 작용기가 알키닐기인 경우에는, 티올기 또는 아지드기이고, 수식의 대상이 되는 생체 기능성 분자에 존재하는 작용기가 아지드기인 경우에는, 알키닐기 및 디벤조시클로옥틴기이고, 수식의 대상이 되는 생체 기능성 분자에 존재하는 작용기가 할로겐화알킬기, 알킬술폰산에스테르 또는 아릴술폰산에스테르인 경우에는, 티올기, 히드록시기 또는 아미노기이다.
여기서 「활성 에스테르기」란, 식: -C(=O)-E로 나타내는 활성화된 카르복시기를 나타내고, E는 탈리기를 나타낸다. E로 나타내는 탈리기로서는, 숙신이미딜옥시기, 프탈이미딜옥시기, 4-니트로페녹시기, 1-이미다졸릴기, 펜타플루오로페녹시기, 벤조트리아졸-1-일옥시기 및 7-아자벤조트리아졸-1-일옥시기 등을 들 수 있고, 숙신이미딜옥시기 및 4-니트로페녹시기가 바람직하다. 「활성 카보네이트기」란, 식: -O-C(=O)-E로 나타내는 활성화된 카보네이트기를 나타내고, E는 상기와 동일한 탈리기를 나타낸다.
본 발명의 적합한 실시형태에 있어서, X1 및 Y1은 각각 독립적으로, 군 (I), 군 (II), 군 (III), 군 (IV), 군 (V) 또는 군 (VI)으로 나타내는 기이다.
군 (I): 생체 기능성 분자의 아미노기와 반응하여 공유 결합을 형성하는 것이 가능한 작용기
하기의 (a), (b1), (b2), (c), (d1), (d2), (e) 및 (f)
군 (II): 생체 기능성 분자의 티올기와 반응하여 공유 결합을 형성하는 것이 가능한 작용기
하기의 (a), (b1), (b2), (c), (d1), (d2), (e), (f), (g), (h) 및 (l)
군 (III): 생체 기능성 분자의 알데히드기 또는 카르복시기와 반응하여 공유 결합을 형성하는 것이 가능한 작용기
하기의 (g), (i), (j), (k) 및 (o)
군 (IV): 생체 기능성 분자의 알키닐기와 반응하여 공유 결합을 형성하는 것이 가능한 작용기
하기의 (g), (i), (j), (k) 및 (n)
군 (V): 생체 기능성 분자의 아지드기와 반응하여 공유 결합을 형성하는 것이 가능한 작용기
하기의 (l) 및 (m)
군 (VI): 생체 기능성 분자의 할로겐화알킬기, 알킬술폰산에스테르 또는 아릴술폰산에스테르와 반응하여 공유 결합을 형성하는 것이 가능한 작용기
하기의 (g), (i) 및 (o)
Figure pct00005
식 중, R2, R4는 수소 원자 또는 탄소수 1∼5의 탄화수소기이고, 구체적인 탄화수소기로서는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, t-부틸기 및 펜틸기 등을 들 수 있다. R3은 염소 원자, 브롬 원자 및 요오드 원자에서 선택되는 할로겐 원자이다.
식 (1)의 원자단 X1 및 Y1에 포함되는 작용기의 바람직한 조합으로서, X1에 포함되는 작용기가 활성 에스테르기 또는 활성 카보네이트기일 때는, Y1에 포함되는 작용기는 말레이미드기, 비닐술폰기, α-할로아세틸기, 알키닐기 및 아지드기에서 선택되는 기이고, X1에 포함되는 작용기가 알데히드기일 때는, Y1에 포함되는 작용기는 말레이미드기, 비닐술폰기, 알키닐기 및 아지드기에서 선택되는 기이고, X1에 포함되는 작용기가 말레이미드기, 비닐술폰기 또는 α-할로아세틸기일 때는, Y1에 포함되는 작용기는 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알키닐기, 아지드기에서 선택되는 기이고, X1에 포함되는 작용기가 알키닐기 또는 아지드기일 때는, Y1에 포함되는 작용기는 말레이미드기, 비닐술폰기, α-할로아세틸기, 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 아미노기, 옥시아미노기 및 히드록시기에서 선택되는 기이고, X1에 포함되는 작용기가 아미노기 또는 옥시아미노기일 때는, Y1에 포함되는 작용기는 알키닐기, 아지드기, 티올기, 히드록시기 또는 카르복시기이고, X1에 포함되는 작용기가 티올기, 2-피리딜디티오기 또는 히드록시기일 때는, Y1은 아미노기, 옥시아미노기, 아지드기 및 카르복시기에서 선택되는 기이다. 보다 바람직하게는, X1에 포함되는 작용기가 활성 에스테르기 또는 활성 카보네이트기일 때는, Y1에 포함되는 작용기는 말레이미드기, α-할로아세틸기, 알키닐기 및 아지드기에서 선택되는 기이고, X1에 포함되는 작용기가 알데히드기일 때는, Y1에 포함되는 작용기는 말레이미드기, α-할로아세틸기, 알키닐기 및 아지드기에서 선택되는 기이고, X1에 포함되는 작용기가 말레이미드기 또는 α-할로아세틸기일 때는, Y1에 포함되는 작용기는 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알키닐기, 아지드기에서 선택되는 기이고, X1에 포함되는 작용기가 알키닐기 또는 아지드기일 때는, Y1에 포함되는 작용기는 말레이미드기, α-할로아세틸기, 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 아미노기, 옥시아미노기 및 히드록시기에서 선택되는 기이고, X1에 포함되는 작용기가 아미노기 또는 옥시아미노기일 때는, Y1에 포함되는 작용기는 알키닐기, 아지드기, 히드록시기 또는 티올기이고, X1에 포함되는 작용기가 티올기, 2-피리딜디티오기 또는 히드록시기일 때는, Y1에 포함되는 작용기는 아미노기, 옥시아미노기 및 아지드기에서 선택되는 기이다.
식 (1) 중의 W는, 세포 내의 리소좀 효소에 의해 특이적으로 절단되는 분해성 링커이다. 이러한 링커는 예컨대, 펩티드를 베이스로 하는 구조이다. 리소좀 효소는, 세포 내의 리소좀의 저pH 환경에서만 활성화되기 때문에, 분해성 펩티드 링커는, 일반적으로 양호한 혈중 안정성을 갖는다. 항체로부터의 약물의 방출은, 리소좀 효소, 예컨대 카텝신 및 플라스민의 작용에 의해 특이적으로 발생한다. 이들 효소는, 모종의 종양 조직에 있어서 높은 레벨로 존재하는 경우가 있다. 모종의 실시형태에 있어서, 링커는 리소좀 효소에 의해 절단 가능하고, 이 리소좀 효소의 예로서는 카텝신 B 등을 들 수 있다.
식 (1) 중의 W는, 생체 내의 혈중에서 안정적이며, 또한 세포 내의 효소에 의해 분해되는 2∼4 잔기의 올리고펩티드이면 특별히 제한은 없지만, 항체-약물 복합체의 조제 시에 약물의 소수성을 최대한 차폐하여, 약물의 소수성에 기인하는 응집을 억제하기 위해서는, 보다 친수성이 높은 아미노산을 포함하는 올리고펩티드를 이용하는 것이 바람직하다. 모종의 실시형태에 있어서, 보다 긴 펩티드는 소수성이기 때문에, 보다 긴 펩티드보다 디펩티드가 보다 바람직하다.
한편으로, 리소좀 효소인 카텝신 B는, 소수성이 높은 아미노산을 갖는 올리고펩티드를 효율적으로 가수 분해하는 성질이 있다(VieiraPortaro, F.C. et al. Biochem.J. 2000, 347: 123-129, Cezari, M.H.S. et al. Biochem.J. 2002, 368: 365-369). 따라서, 식 (1) 중의 W는, 하이드로파시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산, 구체적으로는, 페닐알라닌, 류신, 발린, 이소류신을 적어도 하나 갖는 2∼4 잔기의 올리고펩티드인 것이 바람직하고, 발린 또는 페닐알라닌을 갖는 2∼4 잔기의 올리고펩티드인 것이 더욱 바람직하다. Kyte와 Doolittle에 의해 작성된, 아미노산의 소수성을 정량적으로 나타내는 하이드로파시 지표(hydropathy index)는, 값이 클수록 소수성인 아미노산인 것을 나타낸다(Kyte J & Doolittle RF, 1982, J Mol Biol, 157: 105-132.).
상기 소수성 아미노산과 조합되는 아미노산으로서, 식 (1) 중의 W는, XLogP3에 의해 산출된 LogP값이 -2.5보다 작은 중성 아미노산, 구체적으로는, 알라닌, 글리신, 시트룰린, 프롤린, 세린, 아스파라긴을 적어도 하나 갖는 2∼4 잔기의 올리고펩티드인 것이 바람직하고, 알라닌, 글리신, 시트룰린을 적어도 하나 갖는 2∼4 잔기의 올리고펩티드인 것이 더욱 바람직하다. 여기서 「LogP」란, 옥탄올/물의 분배 계수의 대수로서 정의되며, 소수성의 지표가 되는 값이고, 그 값이 작을수록 친수성인 것을 나타낸다. 또한, 「XlogP3」이란, Cheng 등에 의해 작성된, LogP값을 산출하기 위한 방법이다(Cheng, T. et al. J Chem Inf Model. 2007, 47: 2140-2148).
덧붙여, 식 (1) 중의 W는, C 말단의 아미노산으로서 글리신을 갖는 2∼4 잔기의 올리고펩티드인 것이 바람직하다. C 말단의 카르복실기를 반응시킬 때는, 기본적으로 C 말단의 카르복실기를 축합제 등으로 활성화해야 한다. 이 활성화의 공정에 있어서, 글리신 이외의 아미노산에서는 에피머화가 일어나기 쉬워, 입체 이성체가 복제되는 것이 알려져 있다. 올리고펩티드의 C 말단의 아미노산을 아키랄의 글리신으로 함으로써, 입체 이성체가 부생하지 않는, 고순도의 목적물을 얻을 수 있다.
또한, 식 (1) 중의 W는, 측쇄에 아미노기나 카르복실기를 갖는 아미노산, 구체적으로는, 리신, 아스파라긴산, 글루타민산을 포함하지 않는 아미노산으로 구성되는 2∼4 잔기의 올리고펩티드인 것이 바람직하다. 본 발명의 식 (1)에 있어서의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜의 합성에 있어서, 폴리에틸렌글리콜 부분에 올리고펩티드를 도입할 때, 올리고펩티드의 N 말단의 아미노기, 또는 C 말단의 카르복실기를 반응에 이용하고 있다. 그러나, 측쇄에 아미노기나 카르복실기를 갖는 아미노산이 올리고펩티드에 포함되면, 폴리에틸렌글리콜 부분이 목적의 N 말단의 아미노기나 C 말단의 카르복실기뿐만 아니라, 측쇄의 아미노기나 카르복실기에도 도입된 불순물이 생긴다. 이 불순물은 통상의 추출이나 정석 등의 정제 공정에서 제거하는 것이 어렵기 때문에, 순도 좋게 목적물을 얻기 위해서는, 측쇄에 아미노기나 카르복실기를 갖지 않는 아미노산을 포함하는 올리고펩티드를 이용하는 것이 바람직하다. 여기서 사용되는 아미노산은, α-아미노산이고, 또한 기본적으로는 L형이다.
또한, 중성 아미노산인 시스테인은 티올기를 갖고 있고, 다른 티올기와 디술피드 결합을 형성하기 때문에, 식 (1) 중의 W는, 시스테인을 포함하지 않는 아미노산을 포함하는 올리고펩티드인 것이 바람직하다.
식 (1) 중의 W는, 생체 내의 혈중에서 안정적이며, 또한 세포 내의 효소에 의해 분해되는 성능을 갖고, 시스테인을 제외한 중성 아미노산을 포함하는 2∼4 잔기의 올리고펩티드이면 특별히 제한은 없지만, 구체적인 예로서는, 글리신-페닐알라닌-류신-글리신, 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신, 글리신-페닐알라닌-글리신, 글리신-류신-글리신, 발린-시트룰린-글리신, 발린-알라닌-글리신, 발린-시트룰린, 발린-알라닌, 페닐알라닌-글리신 등이고, 바람직하게는 글리신-페닐알라닌-류신-글리신, 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신, 발린-시트룰린-글리신, 발린-알라닌-글리신, 발린-시트룰린, 발린-알라닌, 페닐알라닌-글리신이고, 보다 바람직하게는 발린-시트룰린, 발린-알라닌, 또는 페닐알라닌-글리신이고, 더욱 보다 바람직하게는 발린-시트룰린이다.
식 (1) 중의 Z는, W로 나타내는 펩티드 링커가 효소에 의해 절단된 부위로부터 약물을 더 분리하는 자기 분해성 스페이서이다. 약물과 펩티드 링커를 직접 결합한 경우, 펩티드 링커 절단 시에 약물에 펩티드 링커 부분이 남음으로써, 약물의 활성 저하를 가져올 우려가 있다. 자기 분해성 스페이서의 사용에 의해, 아미드 결합의 가수 분해 시에, 펩티드 링커를 포함하지 않는 약물을 방출하는 것이 가능해진다.
자기 분해성 스페이서의 하나는 2작용성의 파라-아미노벤질알코올기이고, 이 기는, 아미노기를 통해 펩티드에 연결되어 아미드 결합을 형성하는 한편, 아미노기 혹은 수산기를 갖는 약물은, 카바메이트 결합 혹은 카보네이트 결합을 통해, 그 링커의 벤질알코올기에 결합될 수 있다(파라-아미노벤질카바메이트 혹은 파라-아미노벤질카보네이트를 부여함). 얻어진 프로드러그는, 펩티드-링커 간의 아미드 결합 절단 시에 활성화되어, 1,6-탈리 반응을 가져와, 펩티드 링커를 포함하지 않는 약물, 이산화탄소 및 링커기의 나머지의 부분을 방출한다. 또한, 이 기는, 펩티드 링커의 C 말단측의 아미드 결합이 절단된 경우에만 탈리 반응을 가져오며, 펩티드 링커를 포함하지 않는 약물을 방출하기 때문에, 펩티드 링커의 C 말단이 단분산 폴리에틸렌글리콜측에 있고, 약물측에 없는 경우는 반드시 존재하지 않아도 좋다. 이하의 스킴은, 파라-아미드벤질카바메이트 혹은 파라-아미드벤질카보네이트의 단편화 및 약물의 방출을 도시하고 있다:
Figure pct00006
(식 중, X-D는, 펩티드 링커를 포함하지 않는 약물을 나타낸다.)
식 (1)의 b는, 0 또는 1이다. b가 0인 경우, 식 (1) 중의 Z로 나타내는 자기 분해성 스페이서는 포함되지 않고, b가 1인 경우, 식 (1) 중의 Z로 나타내는 자기 분해성 스페이서는 포함된다.
본 발명의 식 (1)에 있어서의 A1은, 분기 부분의 4급 탄소 원자와 W 또는 X1 사이의 2가의 스페이서이고, 식 (1)에 있어서의 B1은, 분기 부분의 4급 탄소 원자와 W 또는 Y1 사이의 2가의 스페이서이고, 식 (1)에 있어서의 C1은, Z와 X1 또는 Y1 사이의 2가의 스페이서이고, 각각 공유 결합으로 구성된다.
구체적으로는, A1은 -L1-(CH2)m1-L2-, -L1-(CH2)m1-L2-(CH2)m2-, 아미드 결합, 우레탄 결합, 2급 아미노기 또는 단결합을 나타내고, 바람직하게는 -L1-(CH2)m1-L2-, -L1-(CH2)m1-L2-(CH2)m2-, 아미드 결합, 2급 아미노기이고, 더욱 바람직하게는 -L1-(CH2)m1-L2-(CH2)m2-, 아미드 결합, 2급 아미노기이다. 식 중의 m1 및 m2는 각각 독립적으로 1∼5의 정수이다.
또한, B1은 -CH2-L3-, -CH2-L3-(CH2)m3-L4- 또는 -CH2-L3-(CH2)m3-L4-(CH2)m4-를 나타내고, 바람직하게는 -CH2-L3- 또는 -CH2-L3-(CH2)m3-L4-이다. 식 중의 m3 및 m4는 각각 독립적으로 1∼5의 정수이다.
또한, C1은 -L5-(CH2)m5-, -L5-(CH2)m5-L6-(CH2)m6-, 아미드 결합 또는 단결합을 나타내고, 바람직하게는 단결합이다. 식 중의 m5 및 m6은 각각 독립적으로 1∼5의 정수이다.
상기 식 중의 L1∼L6은 각각 독립적으로 2가의 스페이서이고, 구체적으로는, 에테르 결합, 우레탄 결합, 아미드 결합, 2급 아미노기, 카르보닐기 또는 단결합이다.
또한, L1 및 L2는 각각 독립적으로 우레탄 결합, 아미드 결합 또는 2급 아미노기가 바람직하고, L3은 에테르 결합, 우레탄 결합 또는 단결합이 바람직하고, L4는 아미드 결합, 우레탄 결합, 2급 아미노기, 카르보닐기 또는 단결합이 바람직하고, L5는 우레탄 결합이 바람직하고, L6은 아미드 결합, 우레탄 결합 또는 2급 아미노기가 바람직하다.
본 발명에 있어서의 식 (1)의 a1 및 a2는, 식 (1) 중, -W-(Z)b-C1-로 나타내는 스페이서 부위의 유무를 나타내고, 모종의 실시형태에 있어서, a1=1일 때 a2=0이고, 모종의 다른 실시형태에 있어서, a1=0일 때 a2=1이다.
본 발명의 적합한 실시형태에 있어서의 식 (1)의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜의 전형적인 합성예를 이하에 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니다.
(A) 본 발명의 적합한 실시형태에 있어서의 식 (1)의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜은, 예컨대, 이하의 공정으로 제조할 수 있다.
Figure pct00007
(식 (3) 중, P1은 아미노기의 보호기이고; 및 P2는 히드록시기의 보호기이다.)
상기 식 (3)으로 나타내는 화합물을 무수 용매 중, 강염기 존재 하에서 모노메틸 단분산 폴리에틸렌글리콜의 알킬 또는 아릴술폰산에스테르, 혹은 모노메틸 단분산 폴리에틸렌글리콜의 할로겐화물에 대하여 구핵 치환 반응시켜, 하기 식 (4)로 나타내는 화합물을 얻는다.
여기서 「보호기」란, 어떤 반응 조건 하에서 분자 중의 특정한 작용기의 반응을 방지 또는 저지하는 성분이다. 보호기는, 보호되는 작용기의 종류, 사용되는 조건 및 분자 중의 다른 작용기 혹은 보호기의 존재에 의해 변화한다. 보호기의 구체적인 예는 많은 일반적인 출판 서적에서 발견할 수 있지만, 예컨대 「Wuts, P.G.M.; Greene, T.W. Protective Groups in Organic Synthesis, 4th ed.; Wiley-Interscience: New York, 2007」에 기재되어 있다. 또한, 보호기로 보호된 작용기는, 각각의 보호기에 알맞은 반응 조건을 이용하여 탈보호, 즉 화학 반응시킴으로써, 원래의 작용기를 재생시킬 수 있다. 보호기의 대표적인 탈보호 조건은 전술한 문헌에 기재되어 있다.
보호되는 작용기와 보호기의 바람직한 조합으로서, 보호되는 작용기가 아미노기일 때는, 예컨대 아실계 보호기 및 카바메이트계 보호기를 들 수 있고, 구체적으로는 트리플루오로아세틸기, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기, t-부틸옥시카르보닐기 및 2-(트리메틸실릴)에틸옥시카르보닐기 등을 들 수 있다. 또한, 보호되는 작용기가 히드록시기일 때는, 예컨대 실릴계 보호기 및 아실계 보호기를 들 수 있고, 구체적으로는 t-부틸디페닐실릴기, t-부틸디메틸실릴기, 트리이소프로필실릴기, 아세틸기 및 피발로일기 등을 들 수 있다.
보호되는 작용기가 카르복시기일 때는, 예컨대 알킬에스테르계 보호기 및 실릴에스테르계 보호기를 들 수 있고, 구체적으로는 메틸기, 9-플루오레닐메틸기 및 t-부틸디메틸실릴기 등을 들 수 있다. 보호되는 작용기가 술파닐기일 때는, 예컨대 티오에테르계 보호기, 티오카보네이트계 보호기 및 디술피드계 보호기를 들 수 있고, 구체적으로는 S-2,4-디니트로페닐기, S-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기 및 S-t-부틸디술피드기 등을 들 수 있다. 또한, 동종 또는 이종의 2개의 작용기를 동시에 보호하는 것이 가능한 2작용성의 보호기를 이용하여도 좋다. 보호되는 작용기와 보호기의 바람직한 조합으로서, 보호되는 작용기가 2개의 히드록시기일 때는, 예컨대 환상 아세탈계 보호기 및 환상 실릴계 보호기를 들 수 있고, 구체적으로는 2,2-디메틸-1,3-디옥솔란기, 2,2-디메틸-1,3-디옥산기, 2-페닐-1,3-디옥솔란기, 2-페닐-1,3-디옥산기 및 디-t-부틸실릴렌기 등을 들 수 있다. 보호되는 작용기가 아미노기와 히드록시기일 때는, 예컨대 옥사졸린계 보호기를 들 수 있고, 구체적으로는 2-페닐옥사졸린기 등을 들 수 있다.
보호기의 대표적인 탈보호 조건은 전술한 문헌에 기재되어 있고, 각각의 보호기에 알맞은 반응 조건을 선택할 수 있다. 단, 구조 중에 포함되는 작용기가, 보호기로 보호되어 있지 않아도 다른 작용기의 화학 반응을 저해하지 않는 작용기의 경우는, 보호기를 사용할 필요는 없다.
Figure pct00008
상기 식 (4)로 나타내는 화합물의 보호기 P1을 탈보호한 후, 축합제 존재 하, N 말단의 아미노기가 보호기 P3에 의해 보호된 올리고펩티드를 반응시켜, 하기 식 (5)로 나타내는 화합물을 얻는다. 여기서, 히드록시기가 아미노기의 반응 시약과 반응하지 않는 반응 조건을 선택하면, 보호기 P1과 동시에 보호기 P2도 탈보호하여도 좋다. 또한, 하기 식 (5) 중의 Peptide는, 상기 W와 동의의 올리고펩티드이다.
Figure pct00009
상기 식 (5)로 나타내는 화합물의 보호기 P2를 탈보호한 후, 염기 존재 하, 활성 카보네이트화 시약을 이용하여 활성 카보네이트화하고, 또한 활성 카보네이트와 아미노기를 갖는 카르복실산을 반응시킴으로써, 하기 식 (6)으로 나타내는 화합물을 얻는다.
활성 카보네이트화 시약은, 특별히 제한은 없지만, 예컨대 p-니트로페닐클로로포르메이트나 탄산디(N-숙신이미딜) 등을 들 수 있다. 또한, 하기 식 (6)에 있어서의 m3은, 상기와 동의이다.
Figure pct00010
또한, 상기 식 (6)으로 나타내는 화합물의 보호기 P3을 탈보호함으로써, 하기 식 (7)로 나타내는 화합물을 얻는다.
Figure pct00011
또한, 본 공정의 적합한 다른 실시형태에 있어서는, 상기 식 (5)로 나타내는 화합물의 보호기 P2를 탈보호한 후, 강염기 존재 하, 카르복실산이 보호된 아크릴산에스테르를 반응시키고, 또한 보호기 P3 및 카르복실산의 보호기를 탈보호함으로써, 하기 식 (8)로 나타내는 화합물을 얻는다. 또한, 하기 식 (8)에 있어서의 m3은 상기와 동의이고, 반응에 이용하는 아크릴산에스테르는 탄소수가 m3을 만족하는 범위이면 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로는, t-부틸아크릴레이트 등이 이용된다.
Figure pct00012
(B) 본 발명의 적합한 다른 실시형태에 있어서는, 식 (1)의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜은, 예컨대, 이하의 공정으로 제조할 수 있다.
상기 식 (4)로 나타내는 화합물의 보호기 P2를 탈보호한 후, 축합제 존재 하, 아미노기가 보호기 P4에 의해 보호된 카르복실산을 반응시킴으로써, 하기 식 (9)로 나타내는 화합물을 얻는다. 또한, 하기 식 (9)에 있어서의 m1 및 m3은, 상기와 동의이다.
Figure pct00013
상기 식 (9)로 나타내는 화합물에 축합제 존재 하, N 말단의 아미노기가 무보호이며, 또한 C 말단에 파라-아미노벤질알코올을 축합시킨 올리고펩티드 유도체를 반응시킨 후, 보호기 P4를 탈보호함으로써, 하기 식 (10)으로 나타내는 화합물을 얻는다. 또한, 하기 식 (10)에 있어서의 Peptide는, 상기와 동의이다.
Figure pct00014
상기 식 (7), (8) 및 (10)으로 나타내는 화합물은, 모두 아미노기를 하나 갖고 있고, 이것을 이용하여 상기 X1로서 나타낸 작용기로의 변환이 가능하다.
상기 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜의 말단의 아미노기를 다른 작용기로 변환하는 공정에 대해서는, 특별히 제한은 없지만, 기본적으로는, 아미노기와 반응 가능한 활성 에스테르기를 갖는 화합물, 또는 산무수물, 산클로라이드 등의 일반적인 반응 시약을 이용함으로써, 여러 가지 작용기로 변환할 수 있다.
예컨대, 상기 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜의 말단의 아미노기를 말레이미드기로 변환하고자 하는 경우는, 이하와 같은 시약과 반응시킴으로써, 목적물을 얻을 수 있다.
Figure pct00015
예컨대, 상기 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜의 말단의 아미노기를 카르복실기로 변환하고자 하는 경우는, 무수 숙신산이나 무수 글루타르산과 반응시킴으로써, 목적물을 얻을 수 있다.
예컨대, 상기 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜의 말단의 아미노기를 수산기로 변환하고자 하는 경우는, 카프로락톤 등의 환상 에스테르의 개환물과 축합 반응시킴으로써, 목적물을 얻을 수 있다.
또한, 상기 식 (6), (7), (8) 및 (9)로 나타내는 화합물은, 모두 카르복실산을 하나 갖고 있고, 상기 식 (10)으로 나타내는 화합물은, 수산기를 하나 갖고 있기 때문에, 이것을 이용하여 상기 Y1로서 나타낸 작용기로의 변환이 가능하다.
상기 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜의 말단의 카르복실산을 다른 작용기로 변환하는 공정에 대해서는, 특별히 제한은 없지만, 예컨대, 카르복실산을 활성 에스테르기로 변환할 수 있는 화합물, 구체적으로는, N-히드록시숙신이미드 등의 시약을 축합제 존재 하에서 반응시킴으로써, 여러 가지 작용기로 변환할 수 있다.
상기 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜의 말단의 수산기를 다른 작용기로 변환하는 공정에 대해서는, 특별히 제한은 없지만, 예컨대, 수산기를 활성 카보네이트기로 변환할 수 있는 화합물, 구체적으로는, p-니트로페닐클로로포르메이트나 탄산디(N-숙신이미딜) 등의 활성 카보네이트화 시약을 이용함으로써, 여러 가지 작용기로 변환할 수 있다.
본 발명의 다른 일양태에서는, 식 (2)로 나타내는, 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜을 포함하여 이루어지는 항체-약물 복합체가 제공된다.
Figure pct00016
본 발명의 식 (2)에 있어서의 R1은 탄소수 1∼7의 탄화수소기 또는 수소 원자이고, 구체적인 탄화수소기로서는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, t-부틸기, 페닐기 및 벤질기 등을 들 수 있다. R1의 바람직한 실시형태로서는 메틸기 또는 수소 원자이고, 더욱 바람직하게는 메틸기이다. 또한, 식 (2) 중의 R1은 상기와 동의이다.
본 발명의 식 (2)에 있어서의 n은, 단분산 폴리에틸렌글리콜의 반복 단위수를 나타내는 3∼72의 정수이고, 바람직하게는 4∼48의 정수이고, 더욱 바람직하게는 6∼36의 정수이고, 특히 바람직하게는 8∼24의 정수이다. 또한, 식 (2) 중의 n은 상기와 동의이다.
본 명세서에 있어서, 식 (2)의 X2 및 Y2 중 한쪽이 항체이며, 다른쪽이 약물이다.
본 발명의 식 (2)에 있어서의 W, Z 및 b는, 상기 식 (1)에 있어서의 W, Z 및 b와 동의이다.
본 발명의 식 (2)에 있어서의 A2, B2 및 C2는, 2가의 스페이서이고, 각각 공유 결합으로 구성된다.
구체적으로는, A2는 -L1-(CH2)m1-L7-, -L1-(CH2)m1-L8-, -L1-(CH2)m1-L2-(CH2)m2-L8- 또는 -L8-을 나타내고, 바람직하게는 -L1-(CH2)m1-L8-, -L1-(CH2)m1-L2-(CH2)m2-L8- 또는 -L8-이다. 또한, 식 중의 L1, L2, m1 및 m2는 상기와 동의이다.
또한, B2는 -CH2-L9-, -CH2-L9-(CH2)m3-L10-, -CH2-L9-(CH2)m3-L10-(CH2)m4-L11-, -CH2-L12-, -CH2-L9-(CH2)m3-L12- 또는 -CH2-L9-(CH2)m3-L10-(CH2)m4-L12-를 나타내고, 바람직하게는 -CH2-L9-(CH2)m3-L10-, -CH2-L9-(CH2)m3-L12- 또는 -CH2-L9-(CH2)m3-L10-(CH2)m4-L12-이고, 더욱 바람직하게는 -CH2-L9-(CH2)m3-L10- 또는 -CH2-L9-(CH2)m3-L12-이다. 또한, 식 중의 m3 및 m4는 상기와 동의이다.
상기 식 중의 L7, L9, L10 및 L11은, 각각 독립적으로 에테르 결합, 우레탄 결합, 아미드 결합, 2급 아미노기 또는 카르보닐기이다.
또한, L7 및 L11은, 상기 식 (1)로 나타내는 W와의 사이에서 형성되는 결합이고, 각각 독립적으로 아미드 결합 또는 2급 아미노기가 바람직하고, L9는 에테르 결합 또는 우레탄 결합이 바람직하고, L10은 우레탄 결합, 아미드 결합 또는 2급 아미노기가 바람직하다.
또한, 상기 식 중의 L8 및 L12는, 각각 a3=0 또는 a4=0인 경우, 상기 식 (1)로 나타내는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜의 X1 또는 Y1에 포함되는 작용기와 X2 또는 Y2로 나타내는 항체에 존재하는 작용기 사이에서 형성되는 원자단이고, 구체적으로는 아미드 결합, 우레탄 결합, 말레이미드와 티올의 결합, 티오에테르 결합, 디술피드 결합, 카보네이트 결합, 에스테르 결합, 에테르 결합, 1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일 구조, 2급 아미노기, 히드라지드기, 옥시아미드기 혹은 이들을 포함하는 탄화수소기 또는 단결합이다.
또한, C2는, W로 나타내는 펩티드 링커 존재 하에 있어서 상기 식 (1)로 나타내는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜의 X1 또는 Y1에 포함되는 작용기와 항체 또는 약물에 존재하는 작용기 사이에서 형성되는 원자단이고, 구체적으로는 아미드 결합, 우레탄 결합, 말레이미드와 티올의 결합, 티오에테르 결합, 디술피드 결합, 카보네이트 결합, 에스테르 결합, 에테르 결합, 1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일 구조, 2급 아미노기, 히드라지드기, 옥시아미드기 혹은 이들을 포함하는 탄화수소기이다.
본 발명의 식 (2)에 있어서의 a3 및 a4는, 식 (2) 중, -W-(Z)b-C2-로 나타내는 스페이서 부위의 유무를 나타내고, X2가 약물일 때, a3=1 또한 a4=0이고, Y2가 약물일 때, a3=0 또한 a4=1이다.
본 발명의 구체적인 실시형태에 있어서, 항체-약물 복합체(ADC)는, 이하의 식 (I)에 의해 나타내는 화합물 또는 그 염이고, 식 중, Ab는 항체를 나타내고, D는 약물을 나타내고, L은 상기 식 (1)로 나타내는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 링커를 나타내고, k는 항체에 결합하는 링커-약물 콘쥬게이트(D-L) 단위의 수를 나타낸다.
Figure pct00017
본 발명에 있어서의 항체(Ab), 약물(D), 링커(L) 및 링커-약물 콘쥬게이트(D-L)의 결합 양식과, ADC에 결합하는 약물의 수의 구체적인 실시형태에 대해서, 이하에 설명한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 「항체」란, 그 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는, 모노클로널 항체, 폴리클로널 항체, 다이머, 멀티머, 다중 특이성 항체(예컨대, 이중 특이성 항체) 및 항체 프래그먼트를, 이들이 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한, 망라한다(Miller, K. et al. J. Immunol. 2003, 170, 4854-4861).
항체는, 마우스 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 다른 종 유래일 수 있다. 항체는, 특정한 항원을 인식 및 결합하는 것이 가능한, 면역계에 의해 생성되는 단백질이다(Janeway, C.; Travers, P.; Walport, M.; Shlomchik, M. Immunobiology, 5th ed.; Garlan Publishing: New York, 2001). 표적 항원은, 일반적으로는, 복수의 항체상에 있는 CDR에 의해 인식되는 다수의 결합 부위(에피토프라고도 불림)를 갖는다. 상이한 에피토프 특이적으로 결합하는 항체는, 상이한 구조를 갖는다. 따라서, 어떤 하나의 항원은, 하나보다 많은 대응하는 항체를 가질 수 있다. 항체는, 전장 면역글로불린 분자, 또는 전장 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분(즉, 대상으로 하는 항원 혹은 그 부분에 면역 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 분자)을 포함한다. 그와 같은 표적으로서는, 암 세포, 또는 자기 면역 질환에 관련된 자기 면역 항체를 생성하는 세포를 들 수 있지만, 이들에 한정은 되지 않는다. 본 명세서에 있어서 개시되는 면역글로불린은, 임의의 형(예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA), 클래스(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 면역글로불린 분자일 수 있다. 상기 면역글로불린은, 임의의 종에 유래할 수 있다. 그러나, 일양태에 있어서, 상기 면역글로불린은, 인간 기원, 마우스 기원, 또는 토끼 기원이다.
폴리클로널 항체는, 면역화 동물의 혈청 유래의 것 등의, 항체 분자의 불균일 집단이다. 당분야에 있어서 기지의 여러 가지 순서를 이용하여 대상 항원에 대한 폴리클로널 항체를 만들어 내도 좋다. 예컨대, 폴리클로널 항체를 발생시키기 위해, 대상 항원 또는 그 유도체를 주사하여, 토끼, 마우스, 래트 및 모르모트를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 여러 가지 숙주 동물을 면역화하여도 좋다. 숙주종에 의존하여, 프로인드의 (완전 및 불완전) 아쥬반트, 수산화알루미늄 등의 광물 겔, 리소레시틴 등의 표면 활성 물질, 플루로닉(pluronic) 폴리올, 폴리 음이온, 펩티드, 오일 유화물, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 및 BCG(bacille Calmett-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacteriumu parvum) 등의 잠재적으로 유용한 인간 아쥬반트를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다, 여러 가지 아쥬반트를 이용하여 면역 응답을 증가시켜도 좋다. 그와 같은 아쥬반트도, 당분야에서는 공지이다.
모노클로널 항체는, 특정한 항원 결정기(예컨대, 세포 항원(암 또는 자기 면역 세포 항원), 바이러스 항원, 미생물 항원, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 화학 물질, 핵산 또는 이들의 항원 결합 프래그먼트)에 대한 항체의 균일한 집단이다. 당분야에 있어서 기지의 임의의 기법을 이용하여 대상 항원에 대한 모노클로널 항체(mAb)를 조제하여도 좋다. 이들은, Kohler, G; Milstein, C. Nature 1975, 256, 495-497)가 최초에 기재한 하이브리도마기법, 인간 B 세포 하이브리도마 기법(Kozbor, D. et al. Immunol. Today 1983, 4, 72-79) 및 EBV-하이브리도마 기법(Cole, S.P.C. et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy; Alan R.Liss: New York, 1985, pp.77-96)을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 그와 같은 항체는, IgG, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 임의의 면역글로불린의 종류 및 이들의 임의의 아종이어도 좋다. 본 발명에 있어서 모노클로널 항체를 생산하는 하이브리도마는, 인비트로 또는 인비보로 배양하여도 좋다.
모노클로널 항체는, 인간 모노클로널 항체, 인간화 모노클로널 항체, 키메라 모노클로널 항체 및 항체 프래그먼트를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 인간 모노클로널 항체는, 당분야에서 기지의 다수의 기법 중 임의의 것(예컨대, Teng, N.N. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983, 80, 7308-7312, Kozbor, D. et al. Immunology Today 1983, 4, 72-79, Olsson, L. et al. Meth. Enzymol. 1982, 92, 3-16 및 미국 특허 제5939598호 명세서 및 제5770429호 명세서를 참조)에 의해 작성하여도 좋다. 키메라 모노클로널 항체 및 인간화 모노클로널 항체 등의 재조합 항체는, 당분야에서 기지가 표준적인 재조합 DNA 기법을 이용하여 만들 수 있다(예컨대, 미국 특허 제4816567호 명세서, 제4816397호 명세서를 참조).
항체의 표면 재구성(resurfacing) 처리에 의해서도, 항체의 면역원성을 감소시킬 수 있다(미국 특허 제5225539호 명세서, 유럽 특허 제0239400호 명세서, 제0519596호 명세서, 제0592106호 명세서를 참조).
본 발명의 일실시형태에 있어서, 항체는 이중 특이성 항체여도 좋다. 이중 특이성 항체를 만들기 위한 방법은, 당분야에서 기지이다. 종래의 완전장 이중 특이성 항체의 제작 방법은, 2개의 쇄가 상이한 특이성을 갖는 경우의 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄쌍의 동시 발현을 이용하고 있다(Milstein, Cet al. Nature 1983, 305, 537-539를 참조). 또한, 다른 방법으로서, 소망의 결합 특이성(항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 분역을 면역글로불린 불변 분역 배열과 융합시킴으로써도, 이중 특이성 항체를 제작할 수 있다.
그 외의 유용한 항체는, F(ab')2 프래그먼트, Fab' 프래그먼트, Fab 프래그먼트, Fvs, 단쇄 항체(SCA)(예컨대, 미국 특허 제4946778호 명세서, Bird, R.E. et al. Science 1988, 242, 423-442, Huston, J.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sot USA 1988, 85, 5879-5883 및 Ward, E.S. et al. Nature 1989, 334, 544-554에 기재되어 있음), scFv, sc-Fv-Fc, FvdsFv, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 CDR을 포함하며, 항체와 동일한 특이성을 갖는 임의의 다른 분자, 예컨대 도메인 항체 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는 항체의 프래그먼트를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서는, 암의 치료 또는 예방을 위한 기지의 항체를 이용하여도 좋다. 발현이 암, 세포 증식 장애 또는 종양의 세포상에서의 발현과 상관 관계에 있는 임의의 표적 단백질을 포함하는, 모든 표적 단백질을, 항체의 표적으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 항체는 암의 치료에 유용하다. 암의 치료에 이용 가능한 항체의 예는, 비호지킨 림프종을 갖는 환자의 치료를 위한 키메라 항CD20 모노클로널 항체인 리툭산(등록상표)(제넨테크사), 난소암의 치료를 위한 마우스 항체인 오바렉스(알타렉스사), 결직장암의 치료를 위한 마우스 IgG2a 항체인 파노렉스(글락소웰컴사), 두부암 및 경부암 등의 상피 세포 성장 인자 양성암의 치료를 위한 항EGFR IgG 키메라 항체인 세툭시맙 에르비툭스(임클론 시스템즈사), 육종의 치료를 위한 인간화 항체인 비탁신(메드이뮨사), 만성 림프구 백혈병(CLL)의 치료를 위한 인간화 IgG1 항체인 캠파스 I/H(류코사이트사), 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료를 위한 인간화 항CD33 IgG 항체인 스마트 M195(프로테인디자인랩스사), 비호지킨 림프종의 치료를 위한 인간화 항CD22 IgG 항체인 림포시드(이뮤노메딕스사), 비호지킨 림프종의 치료를 위한 인간화 항HLA-DR 항체인 스마트 ID10(프로테인디자인랩스사), 비호지킨 림프종의 치료를 위한 방사성 원소 표지화 마우스 항HLA-Dr10 항체인 온콜라임(테크리클론사), 호지킨씨병 또는 비호지킨 림프종의 치료를 위한 인간화 항CD2 mAb인 알로뮨(바이오트랜스플랜트사), 폐암 및 결직장암의 치료를 위한 항VEGF 인간화 항체인 아바스틴(제넨테크사), 비호지킨 림프종의 치료를 위한 항CD22 항체인 에프라투주맙(이뮤노메딕스사 및 암젠사) 및 결직장암의 치료를 위한 인간화 항CEA 항체인 시사이드(이뮤노메딕스사)를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 항체는 이하의 항원에 대한 항체이다. CA125, CA15-3, CA19-9, L6, 루이스 Y, 루이스 X, 알파 페토 단백질, CA242, 태반 알칼리 포스파타제, 전립선 특이성 막항원, EphB2, TMEFF2, 전립선 산성 포스파타제, 상피 증식 인자, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, 항트랜스페린 수용체, p97, MUC1-KLH, CEA, gp100, MART1, 전립선 특이성 항원, IL-2 수용체, CD20, CD52, CD33, CD22, 인간 융모막 고나도트로핀, CD38, CD40, 뮤신, P21, MPG 및 Neu 암 유전자 산물. 몇 가지의 특이적인 유용한 항체는, BR96 mAb(Trail, P.A. et al. Science 1993, 261, 212-215), BR64(Trail, P.A. et al. Cancer Research 1997, 57, 100-105), S2C6 mAb(Francisco, J.A. et al. Cancer Res. 2000, 60, 3225-3231) 등의 CD40 항원에 대한 mAb, 또는 미국 특허 출원 공개 제2003/0211100호 명세서 및 제2002/0142358호 명세서에 개시되어 있는 것 같은 그 외의 항CD40 항체, 1F6 mAb 및 2F2 mAb 등의 CD70 항원에 대한 mAb 및 AC10(Bowen, M.A. et al. J. Immunol. 1993, 151, 5896-5906, Wahl, A.F. et al. Cancer Res. 2002, 62(13), 3736-42) 또는 MDX-0060(미국 특허 출원 공개 제2004/0006215호 명세서) 등의 CD30 항원에 대한 mAb를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서 이용할 수 있는 약물에는, 화학 요법약이 포함된다. 화학 요법약은, 암의 처치에 있어서 유용한 화합물이다. 화학 요법약의 예에는 다음의 것이 포함된다: 알킬화제, 예컨대 티오테파(thiotepa) 및 시클로포스파미드(CYTOXAN(상표)); 알킬술포네이트류, 예컨대 부설판(busulfan), 임프로술판(improsulfan) 및 피포술판(piposulfan); 아지리딘류(aziridines), 예컨대 벤조도파(benzodopa), 카르보쿠온(carboquone), 메투레도파(meturedopa) 및 우레도파(uredopa); 에틸렌이민류 및 메틸아멜라민류(methylamelamines), 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민(triethylenemelamine), 트리에틸렌포스포르아미드(trietylenephosphoramide), 트리에틸렌티오포스포르아미드(triethylenethiophosphoramide) 및 트리메틸올로멜라민(trimethylolomelamine)을 포함한다; 아세토게닌류(acetogenins)(특히 불라타신(bullatacin) 및 불라타시논(bullatacinone)); 캄프토테신(camptothecin)(합성 유사체인 토포테칸을 포함한다); 브리오스타틴(bryostatin); 칼리스타틴(callystatin); CC-1065(그 아도젤레신(adozelesin), 카르젤레신(carzelesin) 및 비젤레신(bizelesin) 합성 유사체를 포함함); 크립토피신류(cryptophycins)(특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴(dolastatin); 듀오카르마이신(duocarmycin)(그 합성 유사체인 KW-2189 및 CBI-TMI를 포함함)); 엘레우테로빈(eleutherobin); 판크라티스타틴(pancratistatin); 사르코딕틴(sarcodictyin); 스폰지스타틴(spongistatin); 나이트로겐 머스터드류, 예컨대 클로람부실(chlorambucil), 클로르나파진(chlornaphazine), 콜로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴(estramustine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로레타민(mechlorethamine), 메클로레타민옥사이드 염산염, 멜팔란(melphalan), 노벰비킨(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 머스터드; 니트로소 요소류(nitrosureas), 예컨대 카무스틴(carmustine), 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 니무스틴(nimustine), 라니무스틴(ranimustine); 항생 물질, 예컨대 에네디인(enediyne) 항생 물질(예컨대 칼리케아마이신(calicheamicin), 특히, 칼리케아마이신 감마 1 및 칼리케아마이신 세타 I, 예컨대 Angew ChemIntl. Ed. Engl. 33: 183-186(1994)를 참조; 다이네마이신(dynemicin), 다이네마이신 A를 포함한다; 에스페라마이신(esperamicin); 및, 네오카르지노스타틴 크로모포어(neocarzinostatin chromophore) 및 관련된 색소 단백질 에네디인 항생 물질 클로모포어류), 아클라시노마이신류(aclacinomysins), 악티노마이신, 오트라마이신(authramycin), 아자세린(azaserine), 블레오마이신류(bleomycins), 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카르미노마이신(carminomycin), 카르지노필린(carzinophilin); 크로모마이신류(chromomycins), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루비신(detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함함), 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 이다루비신(idarubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 나이토마이신류(nitomycins), 미코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신류(olivomycins), 페플로마이신(peplomycin), 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신, 쿠엘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 튜베르시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin); 대사 길항제, 예컨대, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트라이메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈(fludarabine), 6-메르캅토퓨린, 티아미프린(thiamiprine), 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘(doxifluridine), 에노시타빈, 플록스우리딘, 5-FU; 안드로겐류, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신약(anti-adrenals), 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충약, 예컨대 프롤린산(frolinic acid); 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드(aldophosphamide glycoside); 아미노레불린산; 암사크린(amsacrine); 베스트라부실(bestrabucil); 비산트렌(bisantrene); 에다트락세이트(edatraxate); 데포파민(defofamine); 데메콜신(demecolcine); 디아지콘(diaziquone); 엘포미틴(elfomithine); 엘립티늄아세테이트(elliptinium acetate); 에포틸론(epothilone); 에토글루시드(etoglucid); 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난(lentinan); 로니다민(lonidamine); 마이탄시노이드류, 예컨대 마이탄신(maytansine) 및 안사미토신류(ansamitocins); 미토구아존(mitoguazone); 미톡산트론(mitoxantrone); 모피다몰(mopidamol); 니트라크린(nitracrine); 펜토스타틴(pentostatin); 페나메트(phenamet); 피라루비신(pirarubicin); 포도필린산(podophyllinic acid); 2-에틸히드라지드; 프로카바진; PSK(등록상표); 라족산; 리족신(rhizoxin); 시조피란(sizofiran); 스피로게르마늄(spirogermanium); 테누아존산(tenuazonic acid); 트리아지쿠온(triaziquone); 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센류(trichothecenes), (특히 T-2톡신, 베라쿠린(verracurin) A, 로리딘(roridin) A 및 안구이딘(anguidine)); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 맨노무스틴; 미토브로니톨(mitobronitol); 미토락톨(mitolactol); 피포브로만(pipobroman); 가시토신(gacytosine); 아라비노사이드(arabinoside)("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드류(taxoids), 예컨대 파클리탁셀(paclitaxel)(TAXOL(등록상표), Bristol-Myers Squibb Oncology) 및 독세탁셀(doxetaxel)(TAXOTERE(등록상표), Rhone-Poulenc Rorer); 클로람부실; 젬시타빈(gemcitabine); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 플래티늄 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 플래티늄; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈(vinorelbine); 나벨빈(navelbine); 노반트론(novantrone); 테니포시드(teniposide); 다우노마이신(daunomycin); 아미노프테린; 젤로다(xeloda); 이반드로네이트(ibandronate); CPT-11; 토포이소메라아제 저해제 RFS2000; 디플루오로메틸오미틴(difluoromethylomithine)(DMFO); 레티노인산; 카페시타빈(capecitabine); 및 상기 중 어느 하나의 의약적으로 허용할 수 있는 염류, 산류, 또는 유도체. 종양에 대한 호르몬의 작용을 조절 또는 저해하도록 작용하는 항호르몬제, 예컨대 다음의 것도 이 정의에 포함된다: 예컨대 타목시펜, 랄록시펜(raloxifene), 아로마타제를 저해하는 4(5)-이미다졸류, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜(trioxifene), 케옥시펜(keoxifene), LY117018, 오나프리스톤(onapristone), 및 토레미펜(toremifene)(파레스톤(Fareston))을 포함하는 항에스트로겐약; 및 항안드로겐약, 예컨대 플루타마이드(flutamide), 닐루타마이드(nilutamide), 비칼루타마이드(bicalutamide), 류프로라이드(leuprolide) 및 고세렐린(goserelin); siRNA 및 상기 중 어느 하나의 의약적으로 허용할 수 있는 염류, 산류, 또는 유도체. 본 발명과 함께 이용할 수 있는 다른 화학 요법약이, 미국 특허 출원 공개 제2008/0171040호 명세서 또는 미국 특허 출원 공개 제2008/0305044호 명세서에 있어서 개시되어 있고, 이들을 그대로 원용한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 화학 요법약은 저분자 약물이다. 저분자 약물은, 바람직하게는 100∼1500, 보다 바람직하게는 120∼1200까지, 더욱 바람직하게는 200∼1000까지의 분자량을 갖는다. 전형적으로는 약 1000 미만의 분자량을 갖는 유기, 무기, 또는 유기 금속 화합물을 가리켜 널리 이용된다. 또한, 본 발명의 저분자 약물은, 약 1000 미만의 분자량을 갖는 올리고펩티드 및 다른 생체 분자를 포함한다. 저분자 약물은 당분야에 있어서, 예컨대 특히 국제 공개 제05/058367호 팸플릿, 유럽 특허 출원 공개 제85901495호 명세서 및 제8590319호 명세서에 있어서와, 미국 특허 제4,956,303호 명세서에 있어서 잘 특성지어져 있고, 이들을 그대로 원용한다.
본 발명의 바람직한 저분자 약물은, 항체에의 연결이 가능한 저분자 약물이다. 본 발명에는, 기지의 약물 및 기지가 될 가능성이 있는 약물이 포함된다. 특히 바람직한 저분자 약물에는 세포 독성 약물이 포함된다.
바람직한 세포 독성 약물은 마이탄시노이드류, CC-1065 유사체, 모르폴리노류(morpholinos), 독소루비신류, 탁산류(taxanes), 크립토피신류(cryptophycins), 에포틸론류(epothilones), 칼리케아마이신류(calicheamicins), 아우리스타틴류(auristatins) 및 피롤로벤조디아제핀(pyrrolobenzodiazepine) 2량체류이다.
본 발명의 식 (2)로 나타내는, 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜을 포함하여 이루어지는 항체-약물 복합체는, 식 (1)로 나타내는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜을 이용하여 항체와 약물을 결합시킴으로써 조제할 수 있다. 상기 식 (2)로 나타내는 항체-약물 복합체의 조제 방법은, 상기 식 (1)로 나타내는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜과 약물을 결합시킨 후에 항체를 결합시켜 조제하여도, 상기 식 (1)로 나타내는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜과 항체를 결합시킨 후에 약물을 결합시켜 조제하여도 어느 쪽이어도 좋다. 또한, 항체 또는 약물 중 어느 한쪽을 결합시킨 후에 정제를 행하여도, 항체와 약물의 양방을 결합시킨 후에 정제를 행하여도 어느 쪽이어도 좋다.
상기 식 (1)로 나타내는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜과 약물을 결합시킨 화합물은, 예컨대 칼럼 크로마토그래피, 추출, 재결정, 흡착제 처리, 재침전, 초임계 추출 등의 정제 수단으로 정제할 수 있다. 또한, 상기 식 (1)로 나타내는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜과 항체를 결합시킨 화합물 및 항체와 약물의 양방을 결합시킨 항체-약물 복합체는, 예컨대 칼럼 크로마토그래피, 추출, 흡착제 처리 등의 정제 수단으로 정제할 수 있다.
상기 식 (1)로 나타내는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜을 약물에 결합시킨 링커-약물 콘쥬게이트는, 당분야에서 기지의 표준 콘쥬게이션 기법을 이용하여 만들 수 있다(예컨대, 미국 특허 출원 공개 제8163888호 명세서, 동제7659241호 명세서, 동제7498298호 명세서 및 국제 공개 제2011/023883호 팸플릿, 동제2005/112919호 팸플릿를 참조).
상기 식 (1)로 나타내는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜 또는 그 링커와 약물을 포함하는 링커-약물 콘쥬게이트와 항체의 콘쥬게이트는, 식 (1) 중의 원자단 X1 또는 Y1에 포함되는 작용기가 항체 중의 작용기와 반응하여, 공유 결합을 형성하는 조건 하에서, 합성될 수 있다. 또한 일반적으로, 사용되는 화학 반응은, 항체의 완전성, 예컨대, 항체의 표적 결합능을 개변할 수 없다. 바람직하게는, 콘쥬게이트된 항체의 결합 특성은, 비콘쥬게이트 항체의 결합 특성과 유사하다.
상기 식 (1)로 나타내는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜 또는 그 링커와 약물을 포함하는 링커-약물 콘쥬게이트를 항체에 결합시킨 콘쥬게이트는, 당분야에 있어서 기지의 화학 반응 및 기법을 이용하여 만들 수 있다(예컨대, 「Arnon, R. et al.; Monoclonal antibodies as carriers for immunotargeting of drugs; Monoclonal antibodies for cancer detection and therapy. Academic Press; Baldwin, R.W. et al. eds.; London, 1985, 367-382」, 「Hellstrom, K.E. et al.; Antibodies for drug delivery.; Controlled Drug Delivery; Robinson, J.R. et al. eds.; Marcel Dekker, Inc.; New York; 1987, 623-653」, 「Thorpe, P.E. et al. Monoclonal antibodies, 1985, 84: 475-506」, 「Order, S.E.; Analysis, results, and future prospective of the therapeutic use of radiolabeled antibody in cancer therapy; Monoclonal antibodies for cancer detection and therapy. Academic Press; Baldwin, R.W. et al. eds.: London, 1985」, 「Thorpe, P.E et al. Immunol Rev. 1982, 62: 119-158」 및 국제 공개 제89/12624호 팸플릿를 참조).
상기 식 (1)로 나타내는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜 또는 그 링커와 약물을 포함하는 링커-약물 콘쥬게이트는, 항체의 아미노산 잔기의 측쇄와 결합될 수 있다. 예컨대, 이용 가능한 리신 잔기의 1급 아미노기, 또는 이용 가능한 시스테인 잔기의 유리 티올기이다. 본 발명의 일실시형태에 있어서, 항체와의 반응에 의해 형성되는 결합은, 항체의 아미노기와 형성되는 결합이고, 예컨대, 아미드 결합, 티오에테르 결합 및 티오우레아 결합이고, 바람직하게는 아미드 결합이다. 또한, 모종의 실시형태에 있어서, 항체와의 반응에 의해 형성되는 결합은, 항체의 티올기와 형성되는 결합이고, 예컨대, 아미드 결합, 말레이미드와 티올의 결합, 티오에테르 결합 및 티오우레아 결합이고, 바람직하게는 말레이미드와 티올의 결합 및 티오에테르 결합이다.
본 발명의 적합한 실시형태에 있어서, 본 발명의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜 또는 링커-약물 콘쥬게이트와 항체의 결합은, 항체의 쇄간 시스테인 잔기와의 반응에 의해 생기는 말레이미드와 티올의 결합 또는 티오에테르 결합이다. 보다 균일성이 높은 ADC를 얻기 위해서는, 항체의 4쌍의 쇄간 디술피드 결합을 환원함으로써 생성하는 시스테인 잔기와 반응함으로써, 1항체당 평균 8개의 약물이 결합하는 것이 바람직하다.
상기 식 (1)로 나타내는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜 또는 그 링커와 약물을 포함하는 링커-약물 콘쥬게이트를 이용 가능한 리신 잔기의 1급 아미노기에 연결시키기 위한 작용기에 대해서는 공지이고, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, NHS-에스테르기, N-숙신이미딜카보네이트기 및 p-니트로페닐카보네이트기 등을 들 수 있다.
상기 식 (1)로 나타내는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜 또는 그 링커와 약물을 포함하는 링커-약물 콘쥬게이트를 이용 가능한 시스테인 잔기의 유리 티올기에 연결시키기 위한 작용기에 대해서는 공지이고, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, α-할로아세틸기 및 말레이미드기 등을 들 수 있다.
그러나, 상기 식 (1)로 나타내는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜 또는 그 링커와 약물을 포함하는 링커-약물 콘쥬게이트와 반응하는 항체의 작용기는, 천연에 존재하는 아미노산의 측쇄기에 한정되지 않고, 항체의 아미노산 측쇄에 적절한 저분자를 반응시킴으로써 다른 유용한 작용기로 변환할 수 있다. 예컨대, 아미노기와 같은 아미노산의 측쇄는, 적절한 저분자를 아미노기에 반응시킴으로써, 히드록시기와 같은 다른 유용한 작용기로 변환할 수 있다.
또한, 콘쥬게이션을 위한 항체의 작용기에 대해서는, 유전자 공학 조작에 의해 항체의 임의의 위치에 아미노산을 도입하여도 좋고, 도입되는 아미노산은 천연형 또는 비천연형 중 어느 것이어도 좋다. 항체에 아미노산 잔기를 도입하기 위한 유전자 공학적 방법은, 예컨대, 「Axup, J.Y. et al. Proc Natl Acad Sci. 2012, 109: 16101-16106」 및 「Tian, F. et al. Proc Natl Acad Sci. 2014, 111: 1766-1771」에 기재되어 있다.
상기 식 (1)로 나타내는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜 또는 그 링커와 약물을 포함하는 링커-약물 콘쥬게이트는, 항체에 부위 비특이적으로 결합되어도, 부위 특이적으로 결합되어도 어느 쪽이어도 좋지만, 바람직하게는 부위 특이적인 콘쥬게이션이다.
본 발명의 식 (2)로 나타내는, 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜을 포함하여 이루어지는 항체-약물 복합체(ADC)는, 「Hamblett, K.J. et al. Clin. Cancer Res. 2004, 10: 7063-7070」, 「Doronina, S.O. et al. Nat Biotechnol. 2003, 21: 778-784」, 「Francisco, J.A. et al. Blood, 2003, 102: 1458-1465」, 「Chari, R.V.J. et al. Cancer Res. 1992, 52: 127-131」 및 「Tumey, L.N. et al. ACS Med. Chem. Lett. 2016, 7: 977-982」에 있어서 기재되어 있는 방법과 유사한 표준법에 의해 조제될 수 있다. 예컨대, 항체의 쇄간 시스테인 잔기에 본 발명의 링커-약물 콘쥬게이트가 결합하고, 1항체당 8개의 약물을 갖는 ADC는, 디티오트레이톨(DTT) 또는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)과 같은 환원 시약을 과잉량 이용하여, 37℃에서 1시간, 항체를 부분 환원하고, 다음에, 과잉량의 상기 식 (1)로 나타내는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜과 약물을 포함하는 링커-약물 콘쥬게이트, 예컨대 15당량을 20℃에 있어서 1시간 더한 후, 또한 과잉량의 N-아세틸-L-시스테인, 예컨대 50당량을 첨가함으로써 반응을 ??치할 수 있다. 또한, 얻어진 ADC 혼합물은, PBS로 평형화한 NAP(등록상표)-5를 이용한 겔 여과 크로마토그래피에 의해, 탈염, 미반응의 링커-약물 콘쥬게이트를 제거하여 정제할 수 있고, 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 더 정제할 수 있다. 다음에, 얻어진 ADC는, 예컨대 0.2 ㎛의 필터를 이용하여 멸균 여과하고, 보관을 위해 동결 건조하여도 좋다.
ADC에 있어서의 1항체당의 약물의 수는, 예컨대 자외/가시 분광법, 질량 분석법, ELISA법, 전기 영동, HPLC 및 이들을 조합한 방법 등, 당업자에게 공지의 방법에 의해 결정될 수 있다(예컨대, 「Chen, J. et al. Anal. Chem. 2013, 85: 1699-1704」, 「Valliere-Douglass, J.F. et al. Anal. Chem. 2012, 84: 2843-2849」, 「Birdsall, R.E. et al. mABs, 2015, 7: 1036-1044」 및 「Zhao, R.Y. et al. J. Med. Chem. 2011, 54: 3606-3623」에 기재되어 있음). 일실시형태에 있어서, ADC에 있어서의 1항체의 약물의 평균수는 자외/가시 분광법에 의해 산출할 수 있다. 구체적으로는, 항체-약물 복합체 수용액의, 상이한 2파장, 예컨대 280 ㎚ 및 495 ㎚에 있어서의 UV 흡광도를 측정한 후, 이하의 계산을 행함으로써 산출할 수 있다. 어떤 파장에 있어서의 전체 흡광도는 계 내에 존재하는 모든 흡수 화학종의 흡광도의 합과 같은[흡광도의 가성성] 것으로부터, 항체와 약물의 복합화 반응 전후에 있어서, 항체 및 약물의 몰 흡광 계수에 변화가 없다고 가정하면, 항체-약물 복합체에 있어서의 항체 농도 및 약물 농도는, 하기의 관계식으로 나타난다.
A280=εD,280CD+εA,280CA 식 (i)
A495=εD,495CD+εA,495CA 식 (ii)
DAR=CD/CA 식 (iii)
A280은 280 ㎚에 있어서의 항체-약물 복합체 수용액의 흡광도를 나타내고, A495는 495 ㎚에 있어서의 항체-약물 복합체 수용액의 흡광도를 나타내고, εA,280은 280 ㎚에 있어서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εA,495는 495 ㎚에 있어서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εD,280은 280 ㎚에 있어서의 링커-약물 콘쥬게이트의 몰 흡광 계수를 나타내고, εD,495는 495 ㎚에 있어서의 링커-약물 콘쥬게이트의 몰 흡광 계수를 나타내고, CA는 항체-약물 복합체에 있어서의 항체 농도를 나타내고, CD는 항체-약물 복합체에 있어서의 약물 농도를 나타낸다. εA,280 및 εA,495는, 추정값이 이용되며, εA,495는, 통상, 0이다. εD,280 및 εD,495는, 이용하는 링커-약물 콘쥬게이트를 임의의 몰 농도로 용해시킨 용액의 흡광도를 측정하여, 람베르트ㆍ비어의 법칙(흡광도=몰 농도×몰 흡광 계수×셀 광로 길이)을 이용함으로써 얻을 수 있다. 항체-약물 복합체 수용액의 A280 및 A495를 측정하고, 이들의 값을 식 (i) 및 (ii)에 대입하여 연립 방정식을 풂으로써, CA 및 CD를 구할 수 있다. 또한, CD를 CA로 나눔으로써 1항체당의 약물 평균 결합수를 구할 수 있다.
상기 식 (I) 중의 k로서 표시되는, 본 발명의 식 (1)로 나타내는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜을 통해 항체에 결합한 약물의 수는, 예컨대, 1항체당의 약물의 평균수에 의해 정의된다. 본 발명의 식 (1)로 나타내는 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜 또는 링커-약물 콘쥬게이트와 항체의 반응에 있어서, 그 결합수는 그 링커 또는 링커-약물 콘쥬게이트가 반응하는 항체상의 반응성 부위의 수에 의해 결정될 수 있다. 항체상의 반응성 부위는, 전부가 봉쇄되지 않아도 좋고, 조제 후의 ADC에 있어서 항체에 결합한 약물의 수가 다른 콘쥬게이트가 혼재하여도 좋다. 그러나, 반응성 부위의 제어나 정제에 의해, 항체에 결합한 약물의 수가 단일인 콘쥬게이트를 얻을 수도 있다. 따라서, 1항체에 결합하는 약물의 수는, 분포의 평균값이어도 단일의 값이어도 어느 것이어도 좋지만, 분포가 적은, 혹은 없는 쪽이 ADC의 물성이 안정화하기 때문에, 단일의 값인 것이 바람직하다. 이 때문에, 상기 식 (I) 중의 k는 정수가 아닌 분포가 있는 수 또는 정수를 나타낸다.
본 발명에 있어서의 실시형태에 있어서, 1항체당에 결합하는 약물의 수는, 바람직하게는 1∼20이고, 보다 바람직하게는 2∼16이고, 더욱 바람직하게는 3∼12이고, 특히 바람직하게는 4∼8이고, 가장 바람직하게는 8이다.
본 발명의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜은, 세포 내에서 특이적으로 분해되어, 약물을 효과적으로 서방할 수 있는 성능을 갖는 것이 요구된다. 그 성능을 적절하게 평가하기 위해, 예컨대, 이하에 나타내는 것 같은 시험을 실시하여, 상기 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜의 세포 내에 있어서의 분해성 및 그 링커를 결합시킨 약물의 세포 내에서의 활성을 평가할 수 있다.
상기 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜의 세포 내의 효소에 의한 분해성을 평가하기 위한 시험 방법에 대해서는, 특별히 제한은 없지만, 예컨대, 세포 내의 효소인 리소좀 효소를 이용하여, 그 링커를 결합시킨 모델 화합물 또는 약물의 분해를 확인하는 시험 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 리소좀 효소가 카텝신 B이면, 카텝신 B에 환원제인 DTT를 첨가하여 조제한 카텝신 B/DTT 용액에 대하여, 상기 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜을 결합시킨 모델 화합물 혹은 약물을 포함하는 용액을 첨가하여, 37℃에서 인큐베이트 후, 샘플링한 용액의 HPLC 측정을 행하여, 시험 전후의 차트를 비교함으로써 분해성을 확인할 수 있다. 또한, 신규 피크가 있으면, 매스 크로마토그램을 확인함으로써, 링커의 절단 부위 및 유리한 모델 화합물 또는 약물의 구조를 확인할 수 있다.
시험에 이용되는 모델 화합물에 대해서는, 특별히 제한은 없지만, 상기 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜이 작용기로서 말레이미드기를 갖는 경우는, 카텝신 B의 시스테인 잔기와 말레이미드기가 반응하여, 효소 반응을 저해하기 때문에, 말레이미드기와 반응하는 모델 화합물을 이용하는 것이 바람직하고, 예컨대, 티올기를 갖는 화합물, 구체적으로는 글루타치온 등을 들 수 있다.
또한, 시험에 이용되는 약물은, 상기에 나타내는 약물이면 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 아미노기를 갖는 약물, 구체적으로는, 독소루비신 등을 들 수 있다.
또한, 상기 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜을 결합시킨 약물-링커 화합물의 세포 내에서의 약리 활성을 평가하기 위한 시험 방법에 대해서, 특별히 제한은 없지만, 예컨대, 상기 약물-링커 화합물을 함유한 배지를 이용하여 세포를 배양하고, 세포 생존율을 산출하는 것에 의한 세포 독성 시험 등을 들 수 있다.
본 발명의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜에 도입된 펩티드 링커가 세포 내에서 분해되지 않는 경우, 세포 내에서 약물과의 결합이 분해되지 않아, 약물의 활성이 저하할 가능성이 생각된다. 세포 생존율이 높을수록 약물의 활성은 낮은 것으로 나타나기 때문에, 본 시험에 의해 세포 생존율을 산출하여, 펩티드 링커를 포함하지 않는 컨트롤의 약물-링커 화합물과의 세포 생존율과 비교함으로써, 본 발명의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜을 이용하는 것에 의한 세포 내에서의 약물의 활성을 평가할 수 있다.
여기서 사용하는 세포나 배지에 대해서는, 특별히 제한은 없지만, 구체적으로는, 상기 약물-링커 화합물을 배지 RPMI-1640에 용해하고, HeLa 세포를 37℃에서 배양 후, 생세포수 측정 키트를 이용하여 정색 반응을 행하고, 또한 흡광도 측정을 행함으로써, 세포 생존율을 산출할 수 있다. 세포 생존율은, 블랭크의 흡광도를 뺀 샘플의 흡광도를, 샘플을 포함하지 않는 세포만의 흡광도로 나눔으로써 산출한다.
또한, 본 발명의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜에 도입되는 올리고펩티드는, 그 링커에 의한 소수성 약물의 차폐 효과를 방해하지 않는, 보다 친수성이 높은 성질을 갖는 것이 요구된다. 그 성능을 적절하게 평가하기 위해, 예컨대, 이하에 나타내는 것 같은 시험을 실시하여, 상기 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜의 친수성을 평가할 수 있다.
상기 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜 중의 펩티드의 친수성을 평가하기 위한 시험 방법에 대해서는, 특별히 제한은 없지만, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC), 이온 교환 크로마토그래피(IEC), 역상(RP) 크로마토그래피 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC)에 의한 HPLC 등, 당업자에게 공지의 방법에 의해 평가될 수 있다(예컨대, 「Mant, C.T. et al. Methods Mol Biol. 2007, 386: 3-55」를 참조). 예시적인 실시형태에 있어서, 역상 HPLC를 이용하여 대상 화합물을 동일한 조건에서 측정하고, 피크톱의 유지 시간을 비교함으로써 펩티드의 친수성을 평가할 수 있다. 역상 HPLC의 경우, 대상 화합물의 친수성이 높을수록 유지 시간은 짧게 검출된다.
실시예
이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니다.
1H-NMR 분석에서는 니혼덴시데이텀(주) 제조 JNM-ECP400 또는 JNM-ECA600을 사용하였다. 측정에는 φ5 ㎜ 튜브를 이용하여, 중수소화 용매가 CDCl3, CD2Cl2 또는 DMSO-d6의 경우는, 내부 표준 물질로서 테트라메틸실란(TMS)을 사용하였다.
(실시예 1 화합물 11의 합성)
온도계, 질소 취입관, 교반기, Dean-stark관 및 냉각관을 장비한 500 mL의 4구 플라스크에 트리스히드록시메틸아미노메탄(30.3 g, 250 m㏖), 탄산나트륨(5.30 g, 50 m㏖), 탈수 메탄올(237 g) 및 벤조니트릴(5.15 g, 50 m㏖)을 넣고, 65℃에서 24시간 반응을 행하였다. 여과를 행하여, 용매를 감압 증류 제거한 후, 이소프로필알코올, 디클로로메탄을 더하여 용해하고, 10 wt% 식염수로 세정하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔사를 테트라히드로푸란에 용해하고, 헥산을 더하여 결정화를 행하고, 여과함으로써 식 (11)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 3.06(2H, brs, -OH), 3.65-3.81(4H, dd, >C(CH 2OH)2), 4.38(2H, s, -CNO-CH 2 -), 7.32-7.83(5H, m, arom.H)
Figure pct00018
(실시예 2 화합물 12의 합성)
온도계, 질소 취입관, 교반자, Dean-stark관 및 냉각관을 장비한 100 mL의 3구 플라스크에 도데카에틸렌글리콜모노메틸에테르(10.4 g, 18.5 m㏖), 톨루엔(52.0 g), 트리에틸아민(2.44 g, 24.1 m㏖), 염화메탄술포닐(2.34 g, 20.4 m㏖)을 넣고, 40℃에서 3시간 반응을 행하였다. 디클로로메탄을 더하여 희석한 후에 수세를 행하고, 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (12)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 3.08(3H, s, -O-SO2-CH 3 ), 3.38(3H, s, -O-CH 3 ), 3.45-3.85(46H, m, CH3-O-(CH 2 CH 2O)11-CH 2 CH2-O-SO2-CH3), 4.38(2H, m, -CH 2 -O-SO2-CH3)
Figure pct00019
(실시예 3 화합물 13의 합성)
온도계, 질소 취입관, 교반자, Dean-stark관 및 냉각관을 장비한 50 mL의 3구 플라스크에 식 (11)의 화합물(0.21 g, 1.01 m㏖), 탈수 테트라히드로푸란(7.70 g), 식 (12)의 화합물(2.46 g, 3.84 m㏖), 1M tert-부톡시칼륨/테트라히드로푸란 용액(3.72 g, 4.04 m㏖)을 넣고, 50℃에서 4시간 반응을 행하였다. 디클로로메탄, 25 wt% 식염수를 더하여 수세를 행하고, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (13)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 3.38(6H, s, -O-CH 3 ), 3.40-3.75(100H, m, >C(CH 2O)2-, -O-(CH 2 CH 2O)12-, -CNO-CH 2 -), 4.36(2H, s, -CNO-CH 2 -), 7.37-7.94(5H, m, arom.H)
Figure pct00020
(실시예 4 화합물 14의 합성)
온도계, 질소 취입관, 교반자, Dean-stark관 및 냉각관을 장비한 100 mL의 3구 플라스크에 식 (13)의 화합물(1.13 g, 0.877 m㏖), 증류수(31.1 g)를 더하여 용해시켰다. 85% 인산(0.43 ㎖)을 더하여 pH 1.5로 조정한 후, 50℃에서 3시간 반응을 행하였다. 다음에 냉각하면서 400 g/L 수산화나트륨 수용액(5.58 ㎖)을 더한 후, 50℃에서 6시간 반응을 행하였다. 계속해서, 6N 염산을 더하여 pH 2.0으로 조정한 후, 톨루엔, 클로로포름을 더하여 세정을 행하였다. 25 wt% 식염수가 되도록 수층에 식염을 더한 후, 400 g/L 수산화나트륨 수용액을 이용하여 pH 12.5로 조정하였다. 톨루엔을 이용하여 추출을 행하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (14)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 3.08(1H, brs, -OH), 3.38(6H, s, -O-CH 3 ), 3.40-3.80(102H, m, >C(CH 2O)2-, -O-(CH 2 CH 2O)12-, >CNH2-CH 2 -OH)
Figure pct00021
(실시예 5 화합물 15의 합성)
온도계, 질소 취입관, 교반자, Dean-stark관 및 냉각관을 장비한 50 mL의 3구 플라스크에 식 (14)의 화합물(1.80 g, 1.49 m㏖), N 말단을 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc기)로 보호한 L-페닐알라닌-글리신(Fmoc-Phe-Gly)(0.862 g, 1.94 m㏖, 와타나베가가쿠고교(주) 제조), 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드(DMT-MM)(0.670 g, 1.94 m㏖), 아세토니트릴(18.0 g), N,N-디이소프로필에틸아민(0.263 g, 2.04 m㏖)을 넣고, 25℃에서 7시간 반응을 행하였다. 5 wt% 인산2수소나트륨 수용액(10.8 g)을 더한 후, 아세토니트릴을 감압 증류 제거하고, 수층을 톨루엔, 헥산으로 세정하였다. 톨루엔, 클로로포름을 이용하여 추출을 행한 후, 5 wt% 인산2수소나트륨 수용액, 20 wt% 식염 함유 5 wt% 인산수소2나트륨 수용액을 이용하여 수세를 행하였다. 또한, 유기층을 20 wt% 식염수로 세정한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (15)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(CD2Cl2, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 2.99-3.26(2H, m, -CH-CH 2 -phenyl), 3.38(6H, s, -O-CH 3 ), 3.45-3.90(104H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, -CH-CH2-phenyl, >CCH2-NHCO-CH 2 -NHCO-CH-, -NH-C(O)O-CH 2-Fmoc(1H)) 3.94-4.46(6H, m, >CNH-CH 2 -OH, >CCH2-NHCO-CH2-NHCO-CH-, >CNH-CH2-OH, -NH-C(O)O-CH 2-Fmoc(1H), -NH-C(O)O-CH2-Fmoc(CH)), 5.63(1H, d, -NH-C(O)O-CH2-Fmoc), 6.74(1H, brs, >CCH2-NHCO-CH2-), 7.09-7.76(13H, m, arom.H)
Figure pct00022
(실시예 6 화합물 16의 합성)
교반자를 넣은 20 mL의 스크류관에 식 (15)의 화합물(1.80 g, 1.10 m㏖), N-페닐모르폴린(0.449 g, 3.85 m㏖), p-니트로페닐클로로포르메이트(0.621 g, 3.08 m㏖), 디클로로메탄(17.9 g)을 더하여, 25℃에서 2시간 반응을 행하였다. 또한, 6.7 wt% β알라닌 수용액(11.8 g)을 더하여 희석 후, 디클로로메탄을 감압 증류 제거하고, 400 g/L 수산화나트륨 수용액(0.869 g, 6.60 m㏖)을 더하여, 25℃에서 1시간 반응을 행하였다. 반응액을 톨루엔, 디클로로메탄으로 세정 후, 15 wt% 식염수가 되도록 수층에 식염을 용해하고, 디클로로메탄을 이용하여 추출을 행하였다. 유기층에 아세토니트릴을 첨가하고, 15 wt% 식염 함유 5 wt% 탄산나트륨 수용액을 이용하여 수세 후, 또한 20 wt% 식염 함유 0.2M 염산을 이용하여 수세를 행하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하여, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (16)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 2.47-2.52(2H, m, >CNH-CH2-OC(O)-NH-CH2-CH 2 -COOH), 2.95-3.24(2H, m, -CH-CH 2 -phenyl), 3.38(6H, s, -O-CH 3 ), 3.45-3.90(106H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, -CH-CH2-phenyl, >CCH2-NHCO-CH 2 -NHCO-CH-, -NH-C(O)O-CH 2-Fmoc(1H), >CNH-CH2-OC(O)-NH-CH 2 -CH2-COOH), 3.94-4.55(5H, m, >CNH-CH 2 -OC(O)-NH-, -NH-C(O)O-CH2-Fmoc(CH), >CCH2-NHCO-CH2-NHCO-CH-, -NH-C(O)O-CH 2-Fmoc(1H)), 5.72(1H, brs, >CNH-CH2-OC(O)-NH-CH2-CH2-COOH), 5.81(1H, d, -NH-C(O)O-CH2-Fmoc), 6.71(1H, brs, >CCH2-NHCO-CH2-), 7.10-7.80(13H, m, arom.H)
Figure pct00023
(실시예 7 화합물 17의 합성)
교반자를 넣은 50 mL의 스크류관에 식 (16)의 화합물(0.935 g, 0.535 m㏖), 피페리딘(0.846 g, 10.7 m㏖), 클로로포름(6.55 g)을 더하여, 25℃에서 2시간 반응을 행하였다. 반응액을 20 wt% 식염 함유 0.2M 염산으로 수세 후, 유기층에 톨루엔을 더하여 희석하고, 증류수를 이용하여 수층에 추출을 행하였다. 400 g/L 수산화나트륨 수용액을 이용하여 pH 10으로 조정한 수층을 톨루엔으로 세정한 후, 6N 염산을 이용하여 수층 pH를 pH 2.5로 조정하였다. 15 wt% 식염수가 되도록 수층에 식염을 용해하고, 클로로포름을 이용하여 추출을 행하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (17)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 2.58(2H, m, >CNH-CH2-OC(O)-NH-CH2-CH 2 -COOH), 3.15-3.30(1H, m, -NHCO-CH-NH2), 3.38(6H, s, -O-CH 3 ), 3.45-3.90(106H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, -CH-CH 2 -phenyl, >CCH2-NHCO-CH 2 -NHCO-CH-, -OC(O)-NH-CH 2 -CH2-COOH), 4.20-4.50(2H, m, >CNH-CH 2 -OC(O)-NH-), 4.59(1H, s, >CCH2-NHCO-CH2-NHCO-CH-NH2), 6.18(1H, brs, -OC(O)-NH-CH2-CH2-COOH), 6.65(1H, brs, >CCH2-NHCO-CH2-), 7.20-7.50(5H, m, arom.H), 8.77(2H, s, -CH-NH 2 )
Figure pct00024
(실시예 8 화합물 18의 합성)
교반자를 넣은 30 mL의 스크류관에 식 (17)의 화합물(0.703 g, 0.450 m㏖), 4-(N-말레이미드메틸)시클로헥산-1-카르복실산N-숙신이미딜(0.181 g, 0.540 m㏖), 트리에틸아민(0.105 g, 1.04 m㏖), 2,6-디-tert-부틸-p-크레졸(0.21 ㎎), 클로로포름(13.4 g)을 더하여, 차광 하, 25℃에서 13시간 반응을 행하였다. 반응액을 20 wt% 식염 함유 0.2M 시트르산인산 완충액(pH 2.4)으로 수세 후, 유기층을 농축하고, 잔사를 0.2M 시트르산인산 완충액(pH 3.0)에 용해하였다. 수층을 톨루엔으로 세정한 후, 톨루엔, 클로로포름을 이용하여 유기층에 추출을 하였다. 유기층을 20 wt% 식염수로 수세 후, 무수 황산마그네슘을 더하여 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (18)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 0.89-2.09(10H, m, -cyclohexyl-), 2.54(2H, brs, -OC(O)-NH-CH2-CH 2 -COOH), 2.93-3.20(2H, m, -cyclohexyl-CH 2 -maleimide), 3.38(6H, s, -O-CH 3 ), 3.33-3.95(106H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, -CH-CH 2 -phenyl, >CCH2-NHCO-CH 2 -NHCO-CH-, -OC(O)-NH-CH 2 -CH2-COOH), 4.28-4.45(2H, m, >CNH-CH 2 -OC(O)-NH-), 4.74-4.80(1H, m, -NHCO-CH-NHCO-cyclohexyl-), 5.63(1H, brs, -OC(O)-NH-CH2-CH2-COOH), 6.26(1H, d, >CCH2-NHCO-CH2-NHCO-CH-), 6.64(1H, brs, >CCH2-NHCO-CH2-), 6.69(2H, s, -maleimide), 7.07(1H, brs, -NHCO-cyclohexyl-), 7.16-7.26(5H, m, arom.H)
Figure pct00025
(실시예 9 화합물 19의 합성)
교반자를 넣은 4 ㎖의 스크류관에 식 (18)의 화합물(0.351 g, 0.201 m㏖), N-히드록시숙신산이미드(0.058 g, 0.503 m㏖), 디메틸아미노프로필에틸카르보디이미드염산염(0.123 g, 0.643 m㏖), 클로로포름(2.08 g)을 더하여, 차광 하, 25℃에서 4시간 반응을 행하였다. 반응액을 5 wt% 인산2수소나트륨 수용액으로 수세 후, 무수 황산마그네슘을 더하여 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (19)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 0.89-2.01(10H, m, -cyclohexyl-), 2.81-2.90(6H, m, >CNH-CH2-OC(O)-NH-CH2-CH 2 -COO-, -N-succinimidyl), 2.90-3.25(2H, m, -cyclohexyl-CH 2 -maleimide), 3.38(6H, s, -O-CH 3 ), 3.33-3.95(106H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, -CH-CH 2 -phenyl, >CCH2-NHCO-CH 2 -NHCO-, -OC(O)-NH-CH 2 -CH2-COO-), 4.28-4.45(2H, m, >CNH-CH 2 -OC(O)-NH-), 4.65-4.70(1H, m, -NHCO-CH-NHCO-cyclohexyl-), 5.84(1H, brs, -OC(O)-NH-CH2-CH2-COOH), 6.16(1H, d, >CCH2-NHCO-CH2-NHCO-CH-), 6.55(1H, brs, >CCH2-NHCO-CH2-), 6.69(2H, s, -maleimide), 6.91(1H, brs, -NHCO-cyclohexyl-), 7.15-7.28(5H, m, arom.H)
Figure pct00026
(실시예 10 화합물 18과 글루타치온의 반응)
교반자를 넣은 4 ㎖의 스크류관에 식 (18)의 화합물(1 ㎎), 초산으로 pH 5로 조정한 10 mM 글루타치온/25 mM 초산나트륨/1 mM 에틸렌디아민4초산2나트륨염2수화물(EDTA) 수용액(1 ㎖)을 넣고, 차광 하, 25℃에서 3시간 반응을 행하여, 식 (20)의 화합물을 포함하는 수용액을 얻었다.
Figure pct00027
(실시예 11 화합물 21의 합성)
교반자를 넣은 30 ㎖의 스크류관에 식 (14)의 화합물(0.350 g, 0.290 m㏖), N 말단을 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc기)로 보호한 L-발린-L-알라닌-글리신(Fmoc-Val-Ala-Gly)(0.154 g, 0.363 m㏖, GenScript 제조), DMT-MM(0.130 g, 0.508 m㏖), 아세토니트릴(3.50 g), N,N-디이소프로필에틸아민(0.073 g, 0.566 m㏖)을 넣고, 25℃에서 13시간 반응을 행하였다. 5 wt% 인산2수소나트륨 수용액(4.20 g)을 더한 후, 아세토니트릴을 감압 증류 제거하고, 수층을 톨루엔, 헥산으로 세정하였다. 톨루엔, 클로로포름을 이용하여 추출을 행한 후, 5 wt% 인산2수소나트륨 수용액, 5 wt% 인산수소2나트륨 수용액을 이용하여 수세를 행하였다. 또한, 유기층을 20 wt% 식염수로 세정한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (21)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(DMSO-d6, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 0.78-0.93(6H, m, >CH-CH(CH 3 )2), 1.22(3H, d, >CH-CH 3 ), 1.93-2.04(1H, m, >CH-CH(CH3)2), 3.24(6H, s, -O-CH 3 ), 3.38-3.76(102H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, >CNHCO-CH 2 -NHCO-), 3.83-3.94(1H, m, -CH2-Fmoc(CH)), 4.16-4.42(6H, m, >CH-CH3, >CH-CH(CH3)2, -CH 2 -Fmoc, >CNH-CH 2 -OH), 4.66(1H, t, >CNH-CH2-OH), 7.09(1H, s, -NH-C(O)O-CH2-Fmoc), 7.28-7.43(5H, m, arom.H, >CNHCO-CH2-NHCO-), 7.70-7.92(4H, m, arom.H), 8.00-8.11(2H, m, -NHCO-CH-NHCO-CH-, -NHCO-CH-NHCO-CH-)
Figure pct00028
(실시예 12 화합물 22의 합성)
교반자를 넣은 6 mL의 스크류관에 식 (21)의 화합물(0.306 g, 0.185 m㏖), N-페닐모르폴린(0.106 g, 0.648 m㏖), p-니트로페닐클로로포르메이트(0.104 g, 0.518 m㏖), 디클로로메탄(2.40 g)을 더하여, 25℃에서 9시간 반응을 행하였다. 또한, 6.7 wt% β알라닌 수용액(2.00 g)을 더하여 희석 후, 디클로로메탄을 감압 증류 제거하고, 400 g/L 수산화나트륨 수용액(0.150 g, 1.11 m㏖)을 더하여, 25℃에서 1시간 반응을 행하였다. 반응액을 톨루엔, 디클로로메탄으로 세정 후, 디클로로메탄을 이용하여 추출을 행하였다. 15 wt% 식염 함유 5 wt% 탄산나트륨 수용액을 이용하여 수세 후, 또한 20 wt% 식염 함유 0.2M 염산을 이용하여 수세를 행하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (22)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(DMSO-d6, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 0.78-0.92(6H, m, >CH-CH(CH 3 )2), 1.22(3H, d, >CH-CH 3 ), 1.92-2.03(1H, m, >CH-CH(CH3)2), 2.38(2H, t, >CCH2-OC(O)-NH-CH2-CH 2 -COOH), 3.12-3.21(2H, m, >CCH2-OC(O)-NH-CH 2 -CH2-COOH), 3.24(6H, s, -O-CH 3 ), 3.38-3.78(102H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, >CNHCO-CH 2 -NHCO-), 3.88(1H, t, -CH2-Fmoc(CH)), 4.12-4.40(6H, m, >CH-CH3, >CH-CH(CH3)2, -CH 2 -Fmoc, >CCH 2 -OC(O)-NH-), 7.09-7.28(2H, m, -NH-C(O)O-CH2-Fmoc, >CCH2-OC(O)-NH-), 7.29-7.45(5H, m, arom.H, >CNHCO-CH2-NHCO-), 7.70-7.94(4H, m, arom.H), 7.96-8.10(2H, m, -NHCO-CH-NHCO-CH-, -NHCO-CH-NHCO-CH-)
Figure pct00029
(실시예 13 화합물 23의 합성)
교반자를 넣은 9 mL의 스크류관에 식 (22)의 화합물(0.177 g, 0.100 m㏖), 피페리딘(0.158 g, 2.00 m㏖), 클로로포름(2.50 g)을 더하여, 25℃에서 2시간 반응을 행하였다. 반응액을 20 wt% 식염 함유 0.2M 염산으로 수세 후, 유기층에 톨루엔을 더하여 희석하고, 증류수를 이용하여 수층에 추출을 행하였다. 400 g/L 수산화나트륨 수용액을 이용하여 pH 10로 조정한 수층을 톨루엔, 클로로포름으로 세정한 후, 6N 염산을 이용하여 수층 pH를 pH 2.5로 조정하였다. 10 wt% 식염수가 되도록 수층에 식염을 용해하고, 클로로포름을 이용하여 추출을 행하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (23)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(DMSO-d6, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 0.71-0.92(6H, m, >CH-CH(CH 3 )2), 1.13-1.31(3H, d, >CH-CH 3 ), 1.82-2.04(3H, m, >CH-CH(CH3)2, >CCH2-OC(O)-NH-CH2-CH 2 -COOH), 2.87-3.13(3H, m, >CCH2-OC(O)-NH-CH 2 -CH2-COOH, >CH-CH(CH3)2), 3.24(6H, s, -O-CH 3 ), 3.40-3.85(102H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, >CNHCO-CH 2 -NHCO-), 4.03-4.42(3H, m, >CH-CH3, >CCH 2 -OC(O)-NH-), 6.64(1H, brs, >CCH2-OC(O)-NH-), 6.95-7.32(3H, m, >CNHCO-CH2-NHCO-, -NHCO-CH-NHCO-CH-, -NHCO-CH-NHCO-CH-)
Figure pct00030
(실시예 14 화합물 24의 합성)
교반자를 넣은 9 mL의 스크류관에 식 (23)의 화합물(0.100 g, 0.0637 m㏖), 4-(N-말레이미드메틸)시클로헥산-1-카르복실산N-숙신이미딜(0.0788 g, 0.236 m㏖), 트리에틸아민(8.4 ㎎, 0.0828 m㏖), 2,6-디-tert-부틸-p-크레졸(0.03 ㎎), 클로로포름(1.90 g)을 더하여, 차광 하, 25℃에서 17시간 반응을 행하였다. 반응액을 20 wt% 식염 함유 0.2M 시트르산인산 완충액(pH 2.4)으로 수세 후, 유기층을 농축하고, 잔사를 0.2M 시트르산인산 완충액(pH 3.0)에 용해하였다. 수층을 톨루엔, 클로로포름으로 세정한 후, 톨루엔, 클로로포름을 이용하여 유기층에 추출을 행하였다. 유기층을 20 wt% 식염수로 수세 후, 무수 황산마그네슘을 더하여 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (24)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(CD2Cl2, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 0.81-1.12(8H, m, >CH-CH(CH 3 )2, -cyclohexyl-), 1.31-1.48(5H, d, >CH-CH 3 , -cyclohexyl-), 1.71-2.18(7H, m, >CH-CH(CH3)2, -cyclohexyl-), 2.48-2.63(2H, m, >CCH2-OC(O)-NH-CH2-CH 2 -COOH), 3.34(6H, s, -O-CH 3 ), 3.38-3.95(106H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, >CNHCO-CH 2 -NHCO-, >CCH2-OC(O)-NH-CH 2 -CH2-COOH, -cyclohexyl-CH 2 -maleimide), 4.16-4.38(2H, m, >CH-CH3, >CH-CH(CH3)2), 4.42-4.52(2H, m, >CCH 2 -OC(O)-NH-), 6.17-6.32(2H, m, >CNHCO-CH2-NHCO-, >CCH2-OC(O)-NH-), 6.50(1H, brs, >CNHCO-CH2-NHCO-CH-), 6.68(2H, s, -maleimide), 7.20-7.43(2H, m, >CNHCO-CH2-NHCO-CH-NHCO-CH-, -NHCO-cyclohexyl-)
Figure pct00031
(실시예 15 화합물 25의 합성)
교반자를 넣은 4 ㎖의 스크류관에 식 (24)의 화합물(0.100 g, 0.0566 m㏖), N-히드록시숙신산이미드(9.8 ㎎, 0.0849 m㏖), 디메틸아미노프로필에틸카르보디이미드염산염(0.0228 g, 0.119 m㏖), 클로로포름(0.800 g)을 더하여, 차광 하, 25℃에서 4시간 반응을 행하였다. 반응액을 5 wt% 인산2수소나트륨 수용액으로 수세 후, 무수 황산마그네슘을 더하여 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (25)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(DMSO-d6, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 0.75-0.97(8H, m, >CH-CH(CH 3 )2, -cyclohexyl-), 1.17-1.33(5H, d, >CH-CH 3 , -cyclohexyl-), 1.48-1.75(5H, m, -cyclohexyl-), 1.93-2.02(1H, m, >CH-CH(CH3)2), 2.17-2.27(1H, m, -cyclohexyl-), 2.81(4H, s, -N-succinimidyl), 2.83-2.88(2H, m, >CCH2-OC(O)-NH-CH2-CH 2 -), 3.23(6H, s, -O-CH 3 ), 3.42-3.75(106H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, >CNHCO-CH 2 -NHCO-, >CCH2-OC(O)-NH-CH 2 -CH2-, -cyclohexyl-CH 2 -maleimide), 4.08-4.33(4H, m, >CH-CH3, >CH-CH(CH3)2, >CCH 2 -OC(O)-NH-), 7.01(2H, s, -maleimide), 7.26-7.35(2H, m, >CNHCO-CH2-NHCO-, >CCH2-OC(O)-NH-), 7.62-7.72(1H, m, -NHCO-cyclohexyl-), 7.90-8.05(2H, m, >CNHCO-CH2-NHCO-CH-, >CNHCO-CH2-NHCO-CH-NHCO-CH-)
Figure pct00032
(실시예 16 화합물 26의 합성)
교반자를 넣은 50 ㎖의 스크류관에 식 (14)의 화합물(2.00 g, 1.66 m㏖), Fmoc-β알라닌(0.568 g, 1.82 m㏖), DMT-MM(0.631 g, 1.82 m㏖), 아세토니트릴(18.0 g), N,N-디이소프로필에틸아민(0.279 g, 2.16 m㏖)을 넣고, 25℃에서 2시간 반응을 행하였다. 5 wt% 인산2수소나트륨 수용액(12.0 g)을 더한 후, 아세토니트릴을 감압 증류 제거하고, 수층을 톨루엔으로 세정하였다. 이후, 실시예 5와 동일하게 정제를 행하여, 식 (26)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 2.99-3.26(2H, m, >CCH2-NHCO-CH 2 -CH2-NHCO-), 3.38(6H, s, -O-CH 3 ), 3.45-3.90(104H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, >CNH-CH 2 -OH, >CCH2-NHCO-CH2-CH 2 -NHCO-), 4.18-4.22(1H, m, >CNH-CH2-OH), 4.34(1H, t, -NH-C(O)O-CH2-Fmoc(CH)), 4.40(2H, d, -NH-C(O)O-CH 2-Fmoc), 5.75-5.80(1H, m, -NH-C(O)O-CH2-Fmoc), 6.34(1H, brs, >CCH2-NHCO-CH2-), 7.28-7.78(8H, m, arom.H)
Figure pct00033
(실시예 17 화합물 27의 합성)
교반자를 넣은 20 mL의 스크류관에 식 (26)의 화합물(2.00 g, 1.33 m㏖), N-페닐모르폴린(0.762 g, 4.00 m㏖), p-니트로페닐클로로포르메이트(0.753 g, 3.20 m㏖), 디클로로메탄(19.3 g)을 더하여, 25℃에서 6시간 반응을 행하였다. 또한, 6.7 wt% β알라닌 수용액(14.3 g)을 더하여 희석 후, 디클로로메탄을 감압 증류 제거하여, 25℃에서 1시간 반응을 행하였다. 반응액을 톨루엔, 디클로로메탄으로 세정 후, 15 wt% 식염수가 되도록 수층에 식염을 용해하고, 디클로로메탄을 이용하여 추출을 행하였다. 유기층에 아세토니트릴을 첨가하고, 15 wt% 식염 함유 5 wt% 탄산나트륨 수용액을 이용하여 수세 후, 또한 20 wt% 식염 함유 0.2M 염산을 이용하여 수세를 행하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (27)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 2.38(2H, brs, -OC(O)-NH-CH2-CH 2 -COOH), 2.51(2H, t, >CCH2-NHCO-CH 2 -CH2-), 3.38(6H, s, -O-CH 3 ), 3.40-3.90(104H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, >CCH2-NHCO-CH2-CH 2 -NHCO-, -OC(O)-NH-CH 2 -CH2-COOH), 4.19-4.23(1H, m, -NH-C(O)O-CH2-Fmoc(CH)), 4.45-4.50(4H, m, >CNH-CH 2 -OC(O)-NH-, -NH-C(O)O-CH 2-Fmoc), 5.56(1H, brs, >CNH-CH2-OC(O)-NH-), 5.93(1H, brs, -NH-C(O)O-CH2-Fmoc), 6.33(1H, brs, >CCH2-NHCO-CH2-), 7.26-7.78(8H, m, arom.H)
Figure pct00034
(실시예 18 화합물 28의 합성)
교반자를 넣은 20 mL의 스크류관에 식 (27)의 화합물(0.500 g, 0.310 m㏖), C 말단에 p-아미노벤질알코올(pAB)을 축합시킨 L-페닐알라닌-글리신염산염(H-Phe-Gly-pAB 염산염)(0.141 g, 0.387 m㏖, 와타나베가가쿠고교(주) 제조), DMT-MM(0.134 g, 0.387 m㏖), 아세토니트릴(5.00 g), N,N-디이소프로필에틸아민(0.092 g, 0.712 m㏖)을 넣고, 25℃에서 3시간 반응을 행하였다. 5 wt% 인산2수소나트륨 수용액(3.00 g)을 더한 후, 아세토니트릴을 감압 증류 제거하고, 수층을 톨루엔, 헥산으로 세정하였다. 이후, 실시예 5와 동일하게 정제를 행하여, 식 (28)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 2.20-2.45(4H, m, >CCH2-NHCO-CH 2 -CH2-, -OC(O)-NH-CH2-CH 2 -), 3.38(6H, s, -O-CH 3 ), 2.60-3.80(108H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, -CH-CH 2 -phenyl, CNH-CH2-OC(O)-NH-CH 2 -CH2-, >CCH2-NHCO-CH2-CH 2 -NHCO-, -CONH-CH 2 -CONH-phenyl-CH2-OH), 3.80-4.57(9H, -NH-C(O)O-CH 2 -Fmoc, -CONH-phenyl-CH 2 -OH, -CH2-Fmoc(CH), -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH2-, -CH2-OH, -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH2-, -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH2-), 4.61(2H, >CNH-CH 2 -OC(O)-NH-), 6.02-6.15(2H, m, -NH-C(O)O-CH2-Fmoc, >CNH-CH2-OC(O)-NH-), 6.53(1H, brs, >CCH2-NHCO-CH2-CH2-), 7.11-7.84(17H, m, arom.H), 8.89(1H, brs, -CONH-phenyl-CH2-OH)
Figure pct00035
(실시예 19 화합물 29의 합성)
교반자를 넣은 6 mL의 스크류관에 식 (28)의 화합물(0.100 g, 0.052 m㏖), 피페리딘(0.082 g, 1.04 m㏖), 클로로포름(0.700 g)을 더하여, 25℃에서 2시간 반응을 행하였다. 반응액을 20 wt% 식염 함유 0.2M 염산으로 수세 후, 유기층에 톨루엔을 더하여 희석하고, 증류수를 이용하여 수층에 추출을 행하였다. 400 g/L 수산화나트륨 수용액을 이용하여 pH 10으로 조정한 수층을 톨루엔으로 세정한 후, 6N 염산을 이용하여 수층 pH를 pH 2.5로 조정하였다. 15 wt% 식염수가 되도록 수층에 식염을 용해하고, 클로로포름을 이용하여 추출을 행하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (29)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 2.20-2.55(6H, m, >CCH2-NHCO-CH 2 -, -OC(O)-NH-CH2-CH 2 -, -CH 2 -NH2), 3.38(6H, s, -O-CH 3 ), 2.90-3.80(106H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, -CH-CH 2 -phenyl, >CNH-CH2-OC(O)-NH-CH 2 -CH2-, -CONH-CH 2 -CONH-phenyl-CH2-OH), 3.80-4.57(6H, -CONH-phenyl-CH 2 -OH, -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH2-, -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH2-, -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH2-, -CH2-OH), 4.61(2H, >CNH-CH 2 -OC(O)-NH-), 6.01(1H, brs, >CNH-CH2-OC(O)-NH-), 6.53(1H, brs, >CCH2-NHCO-CH2-CH2-), 7.20-7.80(9H, m, arom.H), 8.70(2H, brs, -CH2-NH 2 ), 8.87(1H, brs, -CONH-phenyl-CH2-OH)
Figure pct00036
(실시예 20 화합물 30의 합성)
교반자를 넣은 6 ㎖의 스크류관에 식 (29)의 화합물(0.100 g, 0.058 m㏖), 3-말레이미드프로피온산(0.012 g, 0.072 m㏖), DMT-MM(0.020 g, 0.072 m㏖), 트리에틸아민(0.013 g, 0.132 m㏖), 아세토니트릴(1.00 g)을 더하여, 차광 하, 25℃에서 2시간 반응을 하였다. 0.2M 시트르산인산 완충액(pH 3.0)(0.600 g)을 더한 후, 아세토니트릴을 감압 증류 제거하고, 수층을 톨루엔으로 세정하였다. 톨루엔, 클로로포름을 이용하여 추출을 행한 후, 20 wt% 식염 함유 0.2M 시트르산인산 완충액(pH 2.4), 20 wt% 식염 함유 0.2M 시트르산인산 완충액(pH 6.5)을 이용하여 수세를 행하였다. 또한, 유기층을 20 wt% 식염수로 세정한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (30)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 2.13-2.57(6H, m, >CCH2-NHCO-CH 2 -, -OC(O)-NH-CH2-CH 2 -, -NHCO-CH 2 -CH2-maleimide), 3.38(6H, s, -O-CH 3 ), 2.90-3.80(111H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, -CH-CH 2 -phenyl, >CNH-CH2-OC(O)-NH-CH 2 -CH2-, -CONH-CH 2 -CONH-phenyl-CH2-OH, -CH 2 -maleimide, >CCH2-NHCO-CH2-CH 2 -NHCO-, -CH-CH2-phenyl), 3.80-4.57(6H, -CONH-phenyl-CH 2 -OH, -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH2-, -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH2-, -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH2-, -CH2-OH), 4.61(2H, >CNH-CH 2 -OC(O)-NH-), 6.01(1H, brs, >CNH-CH2-OC(O)-NH-), 6.53(1H, brs, >CCH2-NHCO-CH2-CH2-), 6.69(2H, s, -maleimide), 7.20-7.80(9H, m, arom.H), 8.87(1H, brs, -CONH-phenyl-CH2-OH)
Figure pct00037
(실시예 21 화합물 31의 합성)
교반자를 넣은 6 ㎖의 스크류관에 식 (30)의 화합물(0.100 g, 0.054 m㏖), 탄산디(N-숙신이미딜)(0.058 g, 0.227 m㏖), 트리에틸아민(0.025 g, 0.243 m㏖), 2,6-디-tert-부틸-p-크레졸(0.02 ㎎)을 넣고, 25℃에서 2시간 반응을 행하였다. 반응액을 15 wt% 식염 함유 0.2M 시트르산인산 완충액(pH 2.4)으로 수세 후, 아세토니트릴, 헥산, 0.2M 시트르산인산 완충액(pH 7.0)을 넣고 세정을 행하였다. 또한, 유기층을 15 wt% 식염 함유 0.2M 시트르산인산 완충액(pH 2.4)으로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (31)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(DMSO-d6, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 2.17-2.33(6H, m, >CNHCO-CH 2 -CH2-, -NHCO-CH 2 -CH2-maleimide, -OC(O)-NH-CH2-CH 2 -), 2.61(4H, s, -N-succinimidyl), 2.75-2.83(1H, m, >CH-CH2-phenyl), 3.04-3.18(4H, m, >CNHCO-CH2-CH 2 -, >CNH-CH2-OC(O)-NH-CH 2 -CH2-), 3.24(6H, s, -O-CH 3 ), 3.41-3.70(104H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, -CONH-CH 2 -CONH-phenyl-CH2-OC(O)-, -CH 2 -maleimide), 3.80-4.00(2H, m, >CH-CH 2 -phenyl), 4.14(2H, s, >CNH-CH 2 -OC(O)-NH-), 4.45-4.57(1H, m, >CCH2-NHCO-CH2-CH2-), 4.94(2H, s, -CONH-phenyl-CH 2 -OC(O)O-), 6.99(2H, s, -maleimide), 7.16-7.30(5H, m, arom.H), 7.32(1H, brs, >CNH-CH2-OC(O)-NH-), 7.40(2H, d, -CONH-phenyl-CH2-OC(O)O-), 7.65(2H, d, -CONH-phenyl-CH2-OC(O)O-), 7.83-7.92(1H, brs, -NHCO-CH2-CH2-maleimide), 8.20-8.45(2H, m, -CONH-CH-CONH-CH2-, -CONH-CH-CONH-CH2-), 9.91(1H, brs, -CONH-phenyl-CH2-OC(O)O-)
Figure pct00038
(실시예 22 화합물 32의 합성)
교반자를 넣은 4 ㎖의 스크류관에 식 (30)의 화합물(0.100 g, 0.054 m㏖), p-니트로페닐클로로포르메이트(0.026 g, 0.130 m㏖), N-페닐모르폴린(0.026 g, 0.227 m㏖), 디클로로메탄(0.716 g)을 넣고, 25℃에서 12시간 반응을 행하였다. 증류수(0.016 g, 0.0756 m㏖), N-페닐모르폴린(0.044 g, 0.270 m㏖)을 더하여 반응을 ??치 후, 헥산을 더하여 희석하고, 20 wt% 식염 함유 0.2M 염산으로 세정을 행하였다. 또한, 유기층을 10 wt% 식염 함유 0.15M 붕산 완충액(pH 10), 10 wt% 식염 함유 5 wt% 인산2수소나트륨 수용액으로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔사를 아세토니트릴에 용해하고, 헥산, t-부탄올로 세정 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (32)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(DMSO-d6, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 2.19-2.32(6H, m, >CNHCO-CH 2 -CH2-, -NHCO-CH 2 -CH2-maleimide, -OC(O)-NH-CH2-CH 2 -), 2.72-2.82(1H, m, >CH-CH2-phenyl), 3.03-3.22(4H, m, >CNHCO-CH2-CH 2 -, >CNH-CH2-OC(O)-NH-CH 2 -CH2-), 3.23(6H, s, -O-CH 3 ), 3.38-3.70(104H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, -CONH-CH 2 -CONH-phenyl-CH2-OC(O)-, -CH 2 -maleimide), 3.80-3.96(2H, m, >CH-CH 2 -phenyl), 4.15(2H, s, >CNH-CH 2 -OC(O)-NH-), 4.45-4.56(1H, brs, >CNHCO-CH2-CH2-), 5.25(2H, s, -CONH-phenyl-CH 2 -OC(O)O-), 6.99(2H, s, -maleimide), 7.14-7.35(6H, m, arom.H, >CNH-CH2-OC(O)-NH-), 7.42(2H, d, -CONH-phenyl-CH2-OC(O)O-), 7.54-7.60(2H, m, arom.H(p-nitrophenyl)), 7.64-7.72(2H, d, -CONH-phenyl-CH2-OC(O)O-), 7.83-7.92(1H, m, -NHCO-CH2-CH2-maleimide), 8.22-8.43(4H, m, -CONH-CH-CONH-CH2-, -CONH-CH-CONH-CH2-, arom.H(p-nitrophenyl)), 9.90(1H, brs, -CONH-phenyl-CH2-OC(O)O-)
Figure pct00039
(실시예 23 화합물 33의 합성)
교반자를 넣은 6 ㎖의 스크류관에 식 (28)의 화합물(0.100 g, 0.052 m㏖), 탄산디(N-숙신이미딜)(0.056 g, 0.218 m㏖), 트리에틸아민(0.024 g, 0.234 m㏖), 2,6-디-tert-부틸-p-크레졸(0.02 ㎎)을 넣고, 25℃에서 2시간 반응을 행하였다. 이후, 실시예 16과 동일하게 정제를 행하여, 식 (33)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 2.20-2.45(4H, m, >CCH2-NHCO-CH 2 -CH2-, -OC(O)-NH-CH2-CH 2 -), 2.82(4H, s, -N-succinimidyl), 3.38(6H, s, -O-CH 3 ), 2.90-3.80(108H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, -CH-CH 2 -phenyl, >CNH-CH2-OC(O)-NH-CH 2 -CH2-, >CCH2-NHCO-CH2-CH 2 -NHCO-, -CONH-CH 2 -CONH-phenyl-CH2-), 3.80-4.65(8H, -NH-C(O)O-CH 2 -Fmoc, >CNH-CH 2 -OC(O)-NH-, -CH2-Fmoc(CH), -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH2-, -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH2-, -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH2-), 5.26(2H, s, -CONH-phenyl-CH 2 -OC(O)O-), 6.02-6.15(2H, m, -NH-C(O)O-CH2-Fmoc, >CNH-CH2-OC(O)-NH-), 6.53(1H, brs, >CCH2-NHCO-CH2-CH2-), 7.11-7.84(17H, m, arom.H), 8.89(1H, brs, -CONH-phenyl-CH2-OC(O)O-)
Figure pct00040
(실시예 24 화합물 34의 합성)
교반자를 넣은 14 mL의 스크류관에 식 (27)의 화합물(0.300 g, 0.186 m㏖), C 말단에 p-아미노벤질알코올(pAB)을 축합시킨 L-발린-시트룰린(H-Val-Cit-pAB)(0.088 g, 0.233 m㏖, 와타나베가가쿠고교(주) 제조), DMT-MM(0.080 g, 0.233 m㏖), 아세토니트릴(3.00 g), N,N-디이소프로필에틸아민(0.031 g, 0.242 m㏖)을 넣고, 25℃에서 2시간 반응을 행하였다. 5 wt% 인산2수소나트륨 수용액(1.80 g)을 더한 후, 아세토니트릴을 감압 증류 제거하고, 수층을 톨루엔으로 세정하였다. 이후, 실시예 5와 동일하게 정제를 행하여, 식 (34)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(DMSO-d6, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 0.76-0.92(6H, m, >CH-CH(CH 3 )2), 1.30-1.48(2H, m, -CH2-CH 2 -CH2-NHCO-NH2), 1.55-1.78(2H, m, -CH 2 -CH2-CH2-NHCO-NH2), 1.92-2.04(1H, m, >CH-CH(CH3)2), 2.22-2.44(4H, m, >CNHCO-CH 2 -CH2-NHCO-, >CCH2-O-CONH-CH2-CH 2 -), 2.87-3.10(2H, m, -CH2-CH2-CH 2 -NHCO-NH2), 3.23(6H, s, -O-CH 3 ), 3.40-3.72(104H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, >CNHCO-CH2-CH 2 -NHCO-, >CCH2-O-CONH-CH 2 -CH2-), 4.15(2H, brs, >CCH 2 -O-CONH-), 4.18-4.24(2H, m, -CH2-Fmoc(CH), >CH-CH(CH3)2), 4.25-4.32(2H, m, -CH 2 -Fmoc(CH)), 4.36-4.42(1H, m, >CH-CH2-CH2-CH2-NHCO-NH2), 4.42(2H, d, -CONH-phenyl-CH 2 -OH), 5.08(1H, t, -CONH-phenyl-CH2-OH), 5.40(2H, brs, -CH2-CH2-CH2-NHCO-NH 2 ), 5.94-6.05(1H, m, -CH2-CH2-CH2-NHCO-NH2), 7.02-7.10(1H, m, >CCH2-O-CONH-CH2-CH2-), 7.16-7.28(3H, m, >CNHCO-CH2-CH2-NHCO-, -CONH-phenyl-CH2-OH), 7.31-7.47(5H, m, >CNHCO-CH2-CH2-NHCO-, arom.H(Fmoc)), 7.54(2H, d, -CONH-phenyl-CH2-OH), 7.67(2H, d, arom.H(Fmoc)), 7.83-8.16(4H, m, -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH-, -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH-, arom.H(Fmoc)), 9.88(1H, brs, -CONH-phenyl-CH2-OH)
Figure pct00041
(실시예 25 화합물 35의 합성)
교반자를 넣은 9 mL의 스크류관에 식 (34)의 화합물(0.150 g, 0.076 m㏖), 피페리딘(0.120 g, 1.52 m㏖), 클로로포름(1.34 g)을 더하여, 25℃에서 3시간 반응을 행하였다. 반응액을 20 wt% 식염 함유 0.2M 염산으로 수세 후, 유기층에 톨루엔을 더하여 희석하고, 증류수를 이용하여 수층에 추출을 행하였다. 400 g/L 수산화나트륨 수용액을 이용하여 pH 10으로 조정한 수층을 톨루엔, 클로로포름으로 세정한 후, 15 wt% 식염수가 되도록 수층에 식염을 용해하고, 클로로포름을 이용하여 추출을 행하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (35)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(DMSO-d6, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 0.76-0.92(6H, m, >CH-CH(CH 3 )2), 1.30-1.50(2H, m, -CH2-CH 2 -CH2-NHCO-NH2), 1.52-1.75(2H, m, -CH 2 -CH2-CH2-NHCO-NH2), 1.92-2.02(1H, m, >CH-CH(CH3)2), 2.13-2.43(4H, m, >CNHCO-CH 2 -CH2-NH2, >CCH2-O-CONH-CH2-CH 2 -), 2.68-2.80(2H, m, >CNHCO-CH2-CH 2 -NH2), 2.87-3.08(2H, m, -CH2-CH2-CH 2 -NHCO-NH2), 3.24(6H, s, -O-CH 3 ), 3.15-3.70(102H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, >CCH2-O-CONH-CH 2 -CH2-), 4.16(2H, brs, >CCH 2 -O-CONH-), 4.20(1H, t, >CH-CH(CH3)2), 4.36-4.41(1H, m, >CH-CH2-CH2-CH2-NHCO-NH2), 4.42(2H, d, -CONH-phenyl-CH 2 -OH), 5.08(1H, brs, -CONH-phenyl-CH2-OH), 5.41(2H, brs, -CH2-CH2-CH2-NHCO-NH 2 ), 6.00(1H, brs, -CH2-CH22-CH2-NHCO-NH2), 7.04(1H, brs, >CCH2-O-CONH-CH2-CH2-), 7.18-7.28(2H, m, -CONH-phenyl-CH2-OH), 7.48-7.63(3H, m, -CONH-phenyl-CH2-OH, >CNHCO-CH2-CH2-NH2), 7.89-8.20(2H, m, -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH-, -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH-), 9.89(1H, brs, -CONH-phenyl-CH2-OH)
Figure pct00042
(실시예 26 화합물 36의 합성)
교반자를 넣은 6 ㎖의 스크류관에 식 (35)의 화합물(0.100 g, 0.057 m㏖), 3-말레이미드프로피온산(0.011 g, 0.063 m㏖), DMT-MM(0.022 g, 0.063 m㏖), 트리에틸아민(6.9 ㎎, 0.068 m㏖), 아세토니트릴(0.900 g)을 더하여, 차광 하, 25℃에서 2시간 반응을 행하였다. 0.2M 시트르산인산 완충액(pH 3.0)(1.20 g)을 더한 후, 아세토니트릴을 감압 증류 제거하고, 수층을 톨루엔으로 세정하였다. 이후, 실시예 20과 동일하게 정제를 행하여, 식 (36)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 0.76-0.92(6H, m, >CH-CH(CH 3 )2), 1.32-1.48(2H, m, -CH2-CH 2 -CH2-NHCO-NH2), 1.52-1.77(2H, m, -CH 2 -CH2-CH2-NHCO-NH2), 1.93-2.02(1H, m, >CH-CH(CH3)2), 2.17-2.44(6H, m, >CNHCO-CH 2 -CH2-NHCO-CH2-CH2-, >CNHCO-CH2-CH2-NHCO-CH 2 -CH2-, >CCH2-O-CONH-CH2-CH 2 -), 2.87-3.08(2H, m, -CH2-CH2-CH 2 -NHCO-NH2), 3.24(6H, s, -O-CH 3 ), 3.13-3.74(106H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, >CNHCO-CH2-CH 2 -NHCO-CH2-CH2-, >CNHCO-CH2-CH2-NHCO-CH2-CH 2 -, >CCH2-O-CONH-CH 2 -CH2-), 4.15(2H, brs, >CCH 2 -O-CONH-), 4.16-4.23(1H, m, >CH-CH(CH3)2), 4.34-4.41(1H, m, >CH-CH2-CH2-CH2-NHCO-NH2), 4.42(2H, d, -CONH-phenyl-CH 2 -OH), 5.08(1H, t, -CONH-phenyl-CH2-OH), 5.40(2H, brs, -CH2-CH2-CH2-NHCO-NH 2 ), 5.99(1H, brs, -CH2-CH2-CH2-NHCO-NH2), 7.00(2H, s, -maleimide), 7.04(1H, brs, >CCH2-O-CONH-CH2-CH2-), 7.22-7.32(3H, m, -CONH-phenyl-CH2-OH, >CNHCO-CH2-CH2-), 7.54(2H, d, -CONH-phenyl-CH2-OH), 7.88-8.16(3H, m, >CNHCO-CH2-CH2-NHCO-, -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH-, -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH-), 9.88(1H, brs, -CONH-phenyl-CH2-OH)
Figure pct00043
(실시예 27 화합물 37의 합성)
교반자를 넣은 4 ㎖의 스크류관에 식 (36)의 화합물(0.100 g, 0.0483 m㏖), 탄산비스(4-니트로페닐)(0.029 g, 0.0966 m㏖), N,N-디이소프로필아민(0.0094 g, 0.0725 m㏖), 디클로로메탄(0.640 g)을 넣고, 25℃에서 3시간 반응을 행하였다. 반응액을 20 wt% 식염 함유 0.2M 염산으로 세정을 행하였다. 또한, 유기층을 10 wt% 식염 함유 0.15 M 붕산 완충액(pH 10), 20 wt% 식염 함유 5 wt% 인산2수소나트륨 수용액으로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔사를 아세토니트릴에 용해하고, 헥산, t-부탄올로 세정 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (37)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(DMSO-d6, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 0.78-0.92(6H, m, >CH-CH(CH 3 )2), 1.32-1.52(2H, m, -CH2-CH 2 -CH2-NHCO-NH2), 1.54-1.80(2H, m, -CH 2 -CH2-CH2-NHCO-NH2), 1.93-2.02(1H, m, >CH-CH(CH3)2), 2.16-2.42(6H, m, >CNHCO-CH 2 -CH2-NHCO-, >CNHCO-CH2-CH2-NHCO-CH 2 -CH2-, >CCH2-O-CONH-CH2-CH 2 -), 2.90-3.08(2H, m, -CH2-CH2-CH 2 -NHCO-NH2), 3.24(6H, s, -O-CH 3 ), 3.13-3.75(106H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, >CNHCO-CH2-CH 2 -NHCO-, >CNHCO-CH2-CH2-NHCO-CH2-CH 2 -, >CCH2-O-CONH-CH 2 -CH2-), 4.15(2H, brs, >CCH 2 -O-CONH-), 4.20(1H, t, >CH-CH(CH3)2), 4.33-4.46(1H, m, >CH-CH2-CH2-CH2-NHCO-NH2), 5.24(2H, brs, -CONH-phenyl-CH 2 -O-), 5.42(2H, brs, -CH2-CH2-CH2-NHCO-NH 2 ), 6.00(1H, brs, -CH2-CH2-CH2-NHCO-NH2), 7.00(2H, s, -maleimide), 7.05(1H, brs, >CCH2-O-CONH-CH2-CH2-), 7.32(1H, brs, >CNHCO-CH2-CH2-NHCO-), 7.37-7.47(2H, m, -CONH-phenyl-CH2-O-), 7.57(2H, d, arom.H(p-nitrophenyl)), 7.63-7.68(2H, m, -CONH-phenyl-CH2-O-), 7.80-8.18(3H, m, >CNHCO-CH2-CH2-NHCO-, -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH-, -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH-), 8.31(2H, d, arom.H(p-nitrophenyl)), 10.1(1H, brs, -CONH-phenyl-CH2-O-)
Figure pct00044
(실시예 28 화합물 38의 합성)
교반자를 넣은 4 ㎖의 스크류관에 식 (34)의 화합물(0.100 g, 0.0506 m㏖), 탄산비스(4-니트로페닐)(0.031 g, 0.101 m㏖), N,N-디이소프로필아민(0.0098 g, 0.0759 m㏖), 디클로로메탄(0.671 g)을 넣고, 25℃에서 3시간 반응을 행하였다. 반응액을 20 wt% 식염 함유 0.2M 염산으로 세정을 행하였다. 또한, 유기층을 10 wt% 식염 함유 0.15 M 붕산 완충액(pH 10), 20 wt% 식염 함유 5 wt% 인산2수소나트륨 수용액으로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔사를 아세토니트릴에 용해하고, 헥산, t-부탄올로 세정 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (38)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(DMSO-d6, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 0.77-0.90(6H, m, >CH-CH(CH 3 )2), 1.33-1.51(2H, m, -CH2-CH 2 -CH2-NHCO-NH2), 1.53-1.78(2H, m, -CH 2 -CH2-CH2-NHCO-NH2), 1.93-2.03(1H, m, >CH-CH(CH3)2), 2.22-2.43(4H, m, >CNHCO-CH 2 -CH2-NHCO-, >CCH2-O-CONH-CH2-CH 2 -), 2.87-3.15(2H, m, -CH2-CH2-CH 2 -NHCO-NH2), 3.23(6H, s, -O-CH 3 ), 3.13-3.70(104H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, >CNHCO-CH2-CH 2 -NHCO-, >CCH2-O-CONH-CH 2 -CH2-), 4.13-4.23(4H, m, >CCH 2 -O-CONH-, -CH2-Fmoc(CH), >CH-CH(CH3)2), 4.24-4.29(2H, m, -CH 2 -Fmoc(CH)), 4.36-4.42(1H, m, >CH-CH2-CH2-CH2-NHCO-NH2), 5.24(2H, brs, -CONH-phenyl-CH 2 -OH), 5.41(2H, brs, -CH2-CH2-CH2-NHCO-NH 2 ), 6.00(1H, brs, -CH2-CH2-CH2-NHCO-NH2), 7.04(1H, brs, >CCH2-O-CONH-CH2-CH2-), 7.19(1H, brs, >CNHCO-CH2-CH2-NHCO-), 7.31-7.38(3H, m, >CNHCO-CH2-CH2-NHCO-, arom.H(Fmoc)), 7.38-7.46(4H, m, -CONH-phenyl-CH2-OH, arom.H(Fmoc)), 7.56-7.71(6H, m, -CONH-phenyl-CH2-OH, arom.H(Fmoc, p-nitrophenyl)), 7.87-8.20(4H, m, -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH-, -(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH-, arom.H(Fmoc)), 8.28-8.33(2H, m, arom.H(p-nitrophenyl)), 10.1(1H, brs, -CONH-phenyl-CH2-OH)
Figure pct00045
(실시예 29 화합물 31과 독소루비신의 콘쥬게이트)
교반자를 넣은 4 ㎖의 스크류관에 독소루비신염산염(2.62 ㎎, 4.51 ㎛ol), N,N-디이소프로필아민(1.55 ㎎, 11.5 ㎛ol), N,N-디메틸포름아미드 및 식 (31)의 화합물(10.0 ㎎, 5.01 ㎛ol)을 넣고, 25℃에서 4시간 반응을 행하였다. 반응액을 디클로로메탄으로 희석 후, 5 wt% 인산2수소나트륨 수용액, 이온 교환 물을 이용하여 수세를 행하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (39)의 약물-링커 화합물을 얻었다.
Figure pct00046
(실시예 30 화합물 33과 독소루비신의 콘쥬게이트)
교반자를 넣은 4 ㎖의 스크류관에 독소루비신염산염(2.53 ㎎, 4.36 ㎛ol), N,N-디이소프로필아민(1.50 ㎎, 11.1 ㎛ol), N,N-디메틸포름아미드 및 식 (33)의 화합물(10.0 ㎎, 4.84 ㎛ol)을 넣고, 25℃에서 4시간 반응을 행하였다. 이후, 실시예 29와 동일하게 정제를 행하여, 식 (40)의 약물-링커 화합물을 얻었다.
Figure pct00047
(실시예 31 화합물 37과 독소루비신의 콘쥬게이트)
교반자를 넣은 4 ㎖의 스크류관에 독소루비신염산염(2.62 ㎎, 4.51 ㎛ol), N,N-디이소프로필아민(1.55 ㎎, 11.5 ㎛ol), N,N-디메틸포름아미드 및 식 (37)의 화합물(10.4 ㎎, 5.01 ㎛ol)을 넣고, 25℃에서 4시간 반응을 행하였다. 반응액을 디클로로메탄으로 희석 후, 5 wt% 인산2수소나트륨 수용액, 5 wt% 인산수소2나트륨 수용액, 이온 교환 물을 이용하여 수세를 행하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (41)의 약물-링커 화합물을 얻었다.
Figure pct00048
(실시예 32 화합물 38과 독소루비신의 콘쥬게이트)
교반자를 넣은 4 ㎖의 스크류관에 독소루비신염산염(2.53 ㎎, 4.36 ㎛ol), N,N-디이소프로필아민(1.50 ㎎, 11.1 ㎛ol), N,N-디메틸포름아미드 및 식 (38)의 화합물(10.4 ㎎, 4.84 ㎛ol)을 넣고, 25℃에서 4시간 반응을 행하였다. 이후, 실시예 31과 동일하게 정제를 행하여, 식 (42)의 약물-링커 화합물을 얻었다.
Figure pct00049
(실시예 33 화합물 39을 이용한 ADC의 조제)
마우스로 생산된 모노클로널 항인터류킨-1β 항체(0.500 ㎎, Sigma-Aldrich)를 인산 완충 식염수(PBS, 0.500 mL)에 용해하였다. 이 용액 0.048 mL를 0.5 mL의 폴리프로필렌제 튜브에 넣고, 여기에 50.0 mM의 에틸렌디아민4초산(EDTA, 0.006 mL), 0.800 mM의 트리스(2-카르복시메틸)포스핀염산염(TCEP) 수용액(0.006 mL; 항체에 대하여 15당량)을 더하고, 혼합물을 37℃에서 1시간 진탕하였다. 상기 용액에, 식 (39)의 화합물의 2.50 mM N,N-디메틸아세트아미드 용액(0.007 mL; 항체에 대하여 53당량)을 첨가하고, 혼합물을 20℃에서 1시간 더 진탕하였다. N-아세틸시스테인의 2.50 mM 수용액(0.007 mL; 항체에 대하여 53당량)을 첨가하고, 얻어진 혼합물을 20℃에서 1시간 더 진탕하였다. PBS(10 mL)를 이용하여 평형화한 NAP-5컬럼(GE Healthcare Life Science)에 상기에서 얻어진 용액을 충전하고, PBS로 용출시킴으로써, 항체 획분을 분취하였다.
(실시예 34 화합물 41을 이용한 ADC의 조제)
마우스로 생산된 모노클로널 항인터류킨-1β 항체(0.500 ㎎, Sigma-Aldrich)를 인산 완충 식염수(PBS, 0.500 mL)에 용해하였다. 이 용액 0.048 mL를 0.5 mL의 폴리프로필렌제 튜브에 넣고, 여기에 50.0 mM의 에틸렌디아민4초산(EDTA, 0.006 mL), 0.800 mM의 트리스(2-카르복시메틸)포스핀염산염(TCEP) 수용액(0.006 mL; 항체에 대하여 15당량)을 더하고, 혼합물을 37℃에서 1시간 진탕하였다. 상기 용액에, 식 (41)의 화합물의 2.50 mM N,N-디메틸아세트아미드 용액(0.007 mL; 항체에 대하여 53당량)을 첨가하고, 혼합물을 20℃에서 1시간 더 진탕하였다. N-아세틸시스테인의 2.50 mM 수용액(0.007 mL; 항체에 대하여 53당량)을 첨가하고, 얻어진 혼합물을 20℃에서 1시간 더 진탕하였다. PBS(10 mL)를 이용하여 평형화한 NAP-5컬럼(GE Healthcare Life Science)에 상기에서 얻어진 용액을 충전하고, PBS로 용출시킴으로써, 항체 획분을 분취하였다.
(실시예 35 화합물 39을 이용한 ADC의 1항체당의 약물 평균 결합수의 산출)
항체-약물 복합체에 있어서의 1항체당의 평균 결합수는, 항체-약물 복합체 수용액의 280 ㎚ 및 495 ㎚의 2파장에 있어서의 UV 흡광도를 측정한 후에 하기의 계산을 행함으로써, 산출할 수 있다.
어떤 파장에 있어서의 전체 흡광도는 계 내에 존재하는 모든 흡수 화학종의 흡광도의 합과 같은[흡광도의 가성성] 것으로부터, 항체와 약물의 복합화 반응 전후에 있어서, 항체 및 약물의 몰 흡광 계수에 변화가 없다고 가정하면, 항체-약물 복합체에 있어서의 항체 농도 및 약물 농도는, 하기의 관계식으로 나타낸다.
A280=AD,280+AA,280=εD,280CD+εA,280CA 식 (i)
A495=AD,495+AA,495=εD,495CD+εA,495CA 식 (ii)
여기서, A280은 280 ㎚에 있어서의 항체-약물 복합체 수용액의 흡광도를 나타내고, A495는 495 ㎚에 있어서의 항체-약물 복합체 수용액의 흡광도를 나타내고, AA,280은 280 ㎚에 있어서의 항체의 흡광도를 나타내고, AA,495는 495 ㎚에 있어서의 항체의 흡광도를 나타내고, AD,280은 280 ㎚에 있어서의 약물-링커 화합물의 흡광도를 나타내고, AD,495는 495 ㎚에 있어서의 약물-링커 화합물의 흡광도를 나타내고, εA,280은 280 ㎚에 있어서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εA,495는 495 ㎚에 있어서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εD,280은 280 ㎚에 있어서의 약물-링커 화합물의 몰 흡광 계수를 나타내고, εD,495는 495 ㎚에 있어서의 약물-링커 화합물의 몰 흡광 계수를 나타내고, CA는 항체-약물 복합체에 있어서의 항체 농도를 나타내고, CD는 항체-약물 복합체에 있어서의 약물 농도를 나타낸다.
여기서, εA,280, εA,495, εD,280, εD,495는, 사전에 준비한 값(추정값 혹은 화합물의 UV 측정으로 얻어진 실측값)이 이용된다. εA,495는, 통상, 제로이다. εD,280 및 εD,495는, 이용하는 약물-링커 화합물을 어떤 몰 농도로 용해시킨 용액의 흡광도를 측정함으로써, 람베르트ㆍ비어의 법칙(흡광도=몰 농도×몰 흡광 계수×셀 광로 길이)에 의해, 얻을 수 있다. 항체-약물 복합체 수용액의 A280 및 A495를 측정하고, 이들 값을 식 (i) 및 (ii)에 대입하여 연립 방정식을 풂으로써, CA 및 CD를 구할 수 있다. 또한 CD를 CA로 나눔으로써 1항체당의 약물 평균 결합수를 구할 수 있다.
몰 흡광 계수 εA,280=206,999(추정값), εA,495=0, εD,280=10426(실측값), εD,495=10339(실측값)를 이용하여 상기 연립 방정식을 풀어, 1항체당의 약물 평균 결합수 7.8이었다.
(실시예 36 화합물 41을 이용한 ADC의 1항체당의 약물 평균 결합수의 산출)
실시예 35와 동일한 방법으로, 몰 흡광 계수 εA,280=206,999(추정값), εA,495=0, εD,280=9837(실측값), εD,495=9785(실측값)를 이용하여 계산을 행하여, 1항체당의 약물 평균 결합수 8.1이었다.
(비교예 1 화합물 43의 합성)
온도계, 질소 취입관, 교반자, Dean-stark관 및 냉각관을 장비한 50 mL의 3구 플라스크에 식 (14)의 화합물(0.800 g, 0.663 m㏖), 6-말레이미드헥산산(0.161 g, 0.762 m㏖), DMT-MM(0.263 g, 0.762 m㏖), 아세토니트릴(8.00 g), 트리에틸아민(0.081 g, 0.796 m㏖)을 넣고, 25℃에서 7시간 반응을 행하였다. pH 3.0 시트르산인산 완충액(pH 3.0)을 더한 후, 톨루엔을 이용하여 세정을 행하였다. 클로로포름을 이용하여 추출을 행한 후, 유기층을 10% 식염수로 세정하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하여 식 (43)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 1.31(2H, m, -CH 2 CH2CH2-CONH-), 1.62(4H, m, -CH 2 CH2CH 2 CH2-CONH-), 2.18(2H, t, -CH 2 -CONH-), 3.38(6H, s, -O-CH 3 ), 3.40-3.85(104H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, >CNH-CH 2 -OH, -CH 2 -maleimide), 4.62(1H, t, -OH), 6.23(1H, s, -CH2-CONH-), 6.69(2H, s, -maleimide)
Figure pct00050
(비교예 2 화합물 43과 글루타치온의 반응)
교반자를 넣은 4 ㎖의 스크류관에 식 (43)의 화합물(1 ㎎), 초산으로 pH 5로 조정한 10 mM 글루타치온/25 mM 초산나트륨/1 mM 에틸렌디아민4초산2나트륨염2수화물(EDTA) 수용액(1 ㎖)을 넣고, 차광 하, 25℃에서 3시간 반응을 행하여, 식 (44)의 화합물을 포함하는 수용액을 얻었다.
Figure pct00051
(비교예 3 화합물 45의 합성)
교반자를 넣은 4 ㎖의 스크류관에 식 (27)의 화합물(0.100 g, 0.062 m㏖), N-히드록시숙신산이미드(0.015 g, 0.133 m㏖), 디메틸아미노프로필에틸카르보디이미드염산염(0.023 g, 0.121 m㏖), 클로로포름(0.574 g)을 더하여, 25℃에서 4시간 반응을 행하였다. 이후, 실시예 9와 동일하게 정제를 행하여, 식 (45)의 화합물을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3, 내부 표준 TMS); δ(ppm): 2.28-2.43(2H, m, -OC(O)-NH-CH2-CH 2 -COO-), 2.75-2.92(6H, m, >CCH2-NHCO-CH 2 -CH2-, -N-succinimidyl), 3.38(6H, s, -O-CH 3 ), 3.35-3.90(104H, m, >C(CH 2 O)2-, -O-(CH 2 CH 2 O)12-, >CCH2-NHCO-CH2-CH 2 -NHCO-, -OC(O)-NH-CH 2 -CH2-COO-), 4.19-4.23(1H, m, -NH-C(O)O-CH2-Fmoc(CH)), 4.35-4.50(4H, m, >CNH-CH 2 -OC(O)-NH-, -NH-C(O)O-CH 2 -Fmoc), 5.62(1H, brs, >CNH-CH2-OC(O)-NH-), 5.88(1H, brs, -NH-C(O)O-CH2-Fmoc), 6.29(1H, brs, >CCH2-NHCO-CH2-), 7.26-7.78(8H, m, arom.H)
Figure pct00052
(비교예 4 화합물 45와 독소루비신의 콘쥬게이트)
교반자를 넣은 4 ㎖의 스크류관에 독소루비신염산염(3.05 ㎎, 4.36 ㎛ol), N,N-디이소프로필아민(1.82 ㎎, 13.4 ㎛ol), N,N-디메틸포름아미드 및 식 (45)의 화합물(10.0 ㎎, 5.84 ㎛ol)을 넣고, 25℃에서 4시간 반응을 행하였다. 이후, 실시예 29와 동일하게 정제를 행하여, 식 (46)의 약물-링커 화합물을 얻었다.
Figure pct00053
(실시예 37 카텝신 B를 이용한 화합물 20, 44의 분해성 시험)
실시예 10에서 얻은 식 (20)의 화합물 및 비교예 2에서 얻은 식 (44)의 화합물에 대해서, 리소좀 내의 단백질 분해 효소인 카텝신 B를 이용한 펩티드의 분해성 시험을 행하였다. 4 ㎖의 스크류관에 인간 간장 유래 카텝신 B 완충액(25 ㎍, ≥ 1500 units/㎎ protein, Sigma-Aldrich사 제조)에 초산으로 pH 5로 조정한 25 mM 초산나트륨/1 mM EDTA 수용액(0.500 ㎖)을 넣어, 카텝신 B 희석 용액을 얻었다. 또한, 4 ㎖ 스크류관에 카텝신 B 희석 용액(0.160 ㎖), pH 5로 조정한 30 mM DTT/25 mM 초산나트륨/15 mM EDTA 수용액(0.320 ㎖)을 넣고, 25℃에서 15분간 정치 후, 미리 37℃로 가온한 pH 5의 25 mM 초산나트륨/1 mM EDTA 수용액(1.32 ㎖), 식 (20) 또는 식 (44)의 화합물을 0.1 ㎎/㎖ 포함하는 수용액(0.200 ㎖)을 혼합하였다. 동시에, 37℃로 가온한 pH 5의 25 mM 초산나트륨/1 mM EDTA 수용액(1.80 ㎖), 식 (20) 또는 식 (44)의 화합물을 0.1 ㎎/㎖ 포함하는 수용액(0.200 ㎖)을 혼합하여, 카텝신 B 및 DTT을 포함하지 않는 컨트롤의 수용액을 조정하였다. 조정한 수용액(카텝신 B 함유/비함유)을 37℃에서 인큐베이트하여, 샘플링 후, 하기의 측정 조건으로 HPLC 측정을 행하였다. 측정 결과의 차트를 도 1∼3에 나타내었다.
결과로서, 본 발명인 식 (20)의 화합물은, 도 1의 차트에 있어서 유지 시간 12.9분에 검출되지만, 카텝신 B에 의한 시험 후는 유지 시간 10.9분 및 7.7분에 새롭게 피크가 검출되어, 도 2의 매스 크로마토그램의 결과로부터, 신규 피크의 분자량은 식 (20)의 화합물의 글리신의 C 말단에서 분해된 단편과 일치하였다. 한편, 비교예인 식 (44)의 화합물은, 도 3의 차트에 있어서 유지 시간 11.9분에 검출되어, 카텝신 B에 의한 시험 후도 새로운 피크는 검출되지 않았다. 따라서, 펩티드 링커를 갖는 식 (20)의 화합물만 카텝신 B에 의해 특이적으로 절단되었기 때문에, 본 발명의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜은, 펩티드 링커 부분이 세포 내의 효소 의존적으로 절단되는 것을 알았다.
·HPLC 장치: Alliance(Waters)
·컬럼: Sun Shell C18(3.0×150 ㎜, 2.6 ㎛; 가부시키가이샤 크로마닉테크놀로지스)
·유속: 0.6 mL/분
·분석 시간: 30분
·컬럼 온도: 40℃
·주입량: 5 μL
·검출기: 질량 분석계(이온화: ESI)
·이동상 A: 0.1M 포름산/물
·이동상 B: 0.1M 포름산/아세토니트릴
·그래디언트 프로그램: 10%-50%(0분-20분), 50%-95%(20분-25분), 95%-10%(25분-30분)
(실시예 38 카텝신 B를 이용한 화합물 21, 26의 분해성 시험)
실시예 11에서 얻은 식 (21)의 화합물 및 실시예 16에서 얻은 식 (26)의 화합물에 대해서, 리소좀 내의 단백질 분해 효소인 카텝신 B를 이용한 펩티드의 분해성 시험을 행하였다. 이후, 실시예 37과 동일한 조건에서 분해성 시험 및 HPLC 측정을 행하였다. 측정 결과의 차트를 도 4∼6에 나타내었다.
결과로서, 본 발명인 식 (21)의 화합물은, 도 4의 차트에 있어서 유지 시간 13.8분에 검출되지만, 카텝신 B에 의한 시험 후는 유지 시간 13.6분 및 7.5분에 새롭게 피크가 검출되어, 도 5의 매스 크로마토그램의 결과로부터, 신규 피크의 분자량은 식 (21)의 화합물의 글리신의 C 말단에서 분해된 단편과 일치하였다. 한편, 식 (26)의 화합물은, 도 6의 차트에 있어서 유지 시간 13.5분에 검출되어, 카텝신 B에 의한 시험 후도 새로운 피크는 검출되지 않았다. 따라서, 펩티드 링커를 갖는 식 (21)의 화합물만 카텝신 B에 의해 특이적으로 절단되었기 때문에, 본 발명의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜은, 펩티드 링커 부분이 세포 내의 효소 의존적으로 절단되는 것을 알았다.
(실시예 39 카텝신 B를 이용한 약물-링커 화합물 40, 46의 분해성 시험)
실시예 30에서 얻은 식 (40)의 약물-링커 화합물 및 비교예 4에서 얻은 식 (46)의 약물-링커 화합물에 대해서, 리소좀 내의 단백질 분해 효소인 카텝신 B를 이용한 펩티드의 분해성 시험을 행하였다. 이후, 실시예 37과 동일하게 시험을 행하여, 하기의 측정 조건으로 HPLC 측정을 행하였다. 측정 결과의 차트를 도 7∼9에 나타내었다.
결과로서, 본 발명인 식 (40)의 약물-링커 화합물은, 도 7의 차트에 있어서 유지 시간 16.8분에 검출되지만, 카텝신 B에 의한 시험 후는 유지 시간 6.8분에 새롭게 피크가 검출되었다. 도 8의 매스 크로마토그램의 결과로부터 신규 피크는 독소루비신과 일치하였다. 한편, 비교예인 식 (46)의 약물-링커 화합물은, 도 9의 차트에 있어서 유지 시간 14.7분에 검출되어, 카텝신 B에 의한 시험 후도 새로운 피크는 보이지지 않았다. 따라서, 본 발명의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜은, 펩티드의 C 말단에 파라-아미노벤질알코올기를 갖는 경우, 펩티드 링커가 절단됨으로써 파라-아미노벤질알코올기도 탈리하여, 약물을 화학적으로 미수식의 구조로 유리할 수 있는 것을 알았다.
·HPLC 장치: Alliance(Waters)
·컬럼: Sun Shell C18(3.0×150 ㎜, 2.6 ㎛; 가부시키가이샤 크로마닉테크놀로지스)
·유속: 0.6 mL/분
·분석 시간: 30분
·컬럼 온도: 40℃
·주입량: 5 μL
·검출기: 질량 분석계(이온화: ESI), 포토다이오드 어레이(PDA)(파장: 480 ㎚)
·이동상 A: 0.1M 포름산/물
·이동상 B: 0.1M 포름산/아세토니트릴
·그래디언트 프로그램: 10%-80%(0분-20분), 80%-95%(20분-25분), 95%-10%(25분-30분)
(실시예 40 카텝신 B를 이용한 약물-링커 화합물 42, 46의 분해성 시험)
실시예 32에서 얻은 식 (42)의 약물-링커 화합물 및 비교예 4에서 얻은 식 (46)의 약물-링커 화합물에 대해서, 리소좀 내의 단백질 분해 효소인 카텝신 B를 이용한 펩티드의 분해성 시험을 행하였다. 이후, 실시예 39와 동일한 조건에서 분해성 시험 및 HPLC 측정을 행하였다. 측정 결과의 차트를 도 10에 나타내었다.
결과로서, 본 발명인 식 (42)의 약물-링커 화합물에서는, 실시예 39와 마찬가지로, 카텝신 B에 의한 시험 후에 유지 시간 6.8분에 새롭게 피크가 검출되어, 매스 크로마토그램의 결과로부터 신규 피크는 독소루비신과 일치하였다. 한편, 비교예인 식 (46)의 약물-링커 화합물에서는, 카텝신 B에 의한 시험 후도 새로운 피크는 보이지 않았다. 따라서, 본 발명의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜은, 펩티드의 C 말단에 파라-아미노벤질알코올기를 갖는 경우, 펩티드 링커가 절단됨으로써 파라-아미노벤질알코올기도 탈리하여, 약물을 화학적으로 미수식의 구조로 유리할 수 있는 것을 알았다.
(실시예 41 약물-링커 화합물 40, 46을 이용한 세포 독성 시험)
배지 RPMI-1640(10% FBS Pn/St) 10 mL, HeLa 세포의 80% 컨플루언트 세포를 이용하여, 5000 cells/well이 되도록 세포 부유액을 조제하여, 96구멍 마이크로 플레이트의 각 플레이트에 세포 부유액을 분주(分注)하였다. 탄산 가스 인큐베이터 내에서 24시간 배양한 후, 배지를 교환하고, 실시예 30에서 얻은 식 (40)의 약물-링커 화합물 또는 비교예 4에서 얻은 식 (46)의 화합물을 각종 농도로 용해한 배지를 첨가하여, 37℃에서 24시간 배양하였다. 마이크로 플레이트의 각 웰에 Cell Counting Kit-8 용액((주)도진가가쿠 제조)을 첨가하여, 탄산 가스 인큐베이터 내에서 2시간 정색 반응을 행하였다. 마이크로 플레이트 리더로 450 ㎚의 흡광도를 측정하고, 하기 식에 의해 세포 생존율을 산출하여, 약물의 세포 독성을 평가하였다. 각 농도에 있어서의 세포 생존율을 도 11에 나타내었다.
세포 생존율(%)=[(Asample-Ablank)/(Acell-Ablank)]×100
Asample: 샘플의 흡광도,
Acell: 샘플을 포함하지 않는 세포만의 흡광도,
Ablank: 세포를 포함하지 않는 블랭크의 흡광도
결과로서, 본 발명인 식 (40)의 약물-링커 화합물은, 샘플 농도 의존적으로 세포 생존율이 저하한 것으로부터 세포 독성을 나타내었다. 한편으로, 비교예인 식 (46)의 화합물은 샘플 농도가 높은 조건이어도 세포 생존율이 높고, 세포 독성을 나타내지 않았다. 따라서, 본 발명의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜을 이용한 약물-링커 화합물은, 펩티드 링커를 포함하지 않는 비교예의 약물-링커 화합물과 비교하여 세포 독성이 높아, 세포 내에서 약물을 유리할 수 있는 것을 알았다.
(실시예 42 약물-링커 화합물 42, 46을 이용한 세포 독성 시험)
배지 RPMI-1640(10% FBS Pn/St) 10 mL, HeLa 세포의 80% 컨플루언트 세포를 이용하여, 5000 cells/well이 되도록 세포 부유액을 조제하여, 96구멍 마이크로 플레이트의 각 플레이트에 세포 부유액을 분주하였다. 탄산 가스 인큐베이터 내에서 24시간 배양한 후, 배지를 교환하여, 실시예 32에서 얻은 식 (42)의 약물-링커 화합물 또는 비교예 4에서 얻은 식 (46)의 화합물을 각종 농도로 용해한 배지를 첨가하여, 37℃에서 24시간 배양하였다. 마이크로 플레이트의 각 웰에 Cell Counting Kit-8 용액((주)도진가가쿠 제조)을 첨가하여, 탄산 가스 인큐베이터 내에서 2시간정색 반응을 행하였다. 마이크로 플레이트 리더로 450 ㎚의 흡광도를 측정하고, 하기 식에 의해 세포 생존율을 산출하여, 약물의 세포 독성을 평가하였다. 각 농도에 있어서의 세포 생존율을 도 12에 나타내었다.
세포 생존율(%)=[(Asample-Ablank)/(Acell-Ablank)]×100
Asample: 샘플의 흡광도,
Acell: 샘플을 포함하지 않는 세포만의 흡광도,
Ablank: 세포를 포함하지 않는 블랭크의 흡광도
결과로서, 세포 생존율의 경향은 실시예 41과 동일하며, 본 발명의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜을 이용한 약물-링커 화합물은, 펩티드 링커를 포함하지 않는 비교예의 약물-링커 화합물과 비교하여 세포 독성이 높아 세포 내에서 약물을 유리할 수 있는 것을 알았다.
(실시예 43 각종 링커의 친수성 평가)
실시예 5, 11, 18 및 24에서 얻은 식 (15), (21), (28) 및 (34)의 화합물에 대해서, 하기의 측정 조건으로 HPLC 측정을 행하여, 각종 링커의 피크의 유지 시간 을 아래 표에 나타내었다.
결과로서, 발린-시트룰린를 포함하는 링커의 유지 시간이 가장 짧고, 계속해서 발린-알라닌, 페닐알라닌-글리신을 포함하는 링커의 순으로 유지 시간이 짧았다. 따라서, 본 발명의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜 중, 발린-시트룰린를 포함하는 링커가 보다 친수성을 높일 수 있는 것을 알았다.
·HPLC 장치: Thermo Fisher Ultimate 3000
·컬럼: Sun Shell C18(3.0×150 ㎜, 2.6 ㎛; 가부시키가이샤 크로마닉테크놀로지스)
·유속: 0.6 mL/분
·분석 시간: 80분
·컬럼 온도: 40℃
·주입량: 10 μL
·검출기: 코로나 하전화 입자 검출기(CAD)
·이동상 A: 0.1M 포름산/물
·이동상 B: 0.1M 포름산/아세토니트릴
·그래디언트 프로그램: 20%-95%(0분-75분), 95%-95%(75분-80분)
Figure pct00054
본 발명의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜은, 세포 내에 있어서 효소에 의해 절단됨으로써 약물로부터 유리하여, 링커가 결합한 상태로 존재하는 것에 따른 약리 활성의 저하를 억제하였다.
본 발명의 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜은, 세포 내의 효소에 의해 펩티드 링커가 분해되어 약물을 서방하고, 또한 약물의 소수성을 효과적으로 차폐하는 근접한 2개의 단분산 폴리에틸렌글리콜 측쇄를 갖기 때문에, 생리 활성 단백질, 펩티드, 항체, 핵산 및 저분자 약물 등의 생체 기능성 분자, 드러그 딜리버리 시스템에 있어서의 약물 캐리어, 또는 진단용 재료나 의료용 디바이스 등의 수식에 유용하다.
본 출원은 일본에서 출원된 특허 출원 제2019-176066호를 기초로 하며, 그 내용은 본 명세서에 전부 포함되는 것이다.

Claims (11)

  1. 식 (1)로 나타내는, 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜.
    Figure pct00055

    (식 (1) 중,
    X1 및 Y1은 각각 생체 기능성 분자에 존재하는 작용기와 반응하여 공유 결합을 형성하는 작용기를 적어도 포함하는 원자단이며, 원자단 X1이 포함하는 상기 작용기와 원자단 Y1이 포함하는 상기 작용기는 서로 상이하고;
    R1은 탄소수 1∼7의 탄화수소기 또는 수소 원자이고;
    n은 3∼72의 정수이고;
    A1은 -L1-(CH2)m1-L2-, -L1-(CH2)m1-L2-(CH2)m2-, 아미드 결합, 우레탄 결합, 2급 아미노기 또는 단결합을 나타내고, m1 및 m2는 각각 독립적으로 1∼5의 정수를 나타내고;
    B1은 -CH2-L3-, -CH2-L3-(CH2)m3-L4- 또는 -CH2-L3-(CH2)m3-L4-(CH2)m4-를 나타내고, m3 및 m4는 각각 독립적으로 1∼5의 정수를 나타내고;
    W는 2∼4 잔기의 올리고펩티드이고;
    Z는 펩티드의 C 말단에 결합하는 2작용성 파라-아미노벤질알코올기를 갖는 스페이서이고;
    a1 및 a2는, a1=1일 때 a2=0이고, a1=0일 때 a2=1이고;
    b는 0 또는 1이고;
    C1은 -L5-(CH2)m5-, -L5-(CH2)m5-L6-(CH2)m6-, 아미드 결합 또는 단결합을 나타내고, m5 및 m6은 각각 독립적으로 1∼5의 정수를 나타내고;
    L1∼L6은 각각 독립적으로 에테르 결합, 우레탄 결합, 아미드 결합, 2급 아미노기, 카르보닐기 또는 단결합을 나타낸다.)
  2. 제1항에 있어서, W가 페닐알라닌, 류신, 발린, 이소류신의 소수성의 중성 아미노산 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 그 이외의 아미노산이 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어진 2∼4 잔기의 올리고펩티드인, 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜.
  3. 제1항에 있어서, W가 페닐알라닌, 류신, 발린, 이소류신의 소수성의 중성 아미노산 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 그 이외의 아미노산이 알라닌, 글리신, 시트룰린, 프롤린, 세린, 아스파라긴을 적어도 하나 갖는 2∼4 잔기의 올리고펩티드인, 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜.
  4. 제1항에 있어서, W가 C 말단의 아미노산이 글리신인 올리고펩티드인, 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜.
  5. 제1항에 있어서, W가 디펩티드인, 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 식 (1)에 있어서의 X1 및 Y1이, 각각 독립적으로 식 (a), 식 (b1), 식 (b2), 식 (c), 식 (d1), 식 (d2), 식 (e), 식 (f), 식 (g), 식 (h), 식 (i), 식 (j), 식 (k), 식 (l), 식 (m), 식 (n) 및 식 (o)로 이루어진 군에서 선택되는, 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜.
    Figure pct00056

    (식 (d1), (d2) 중, R2는 수소 원자 또는 탄소수 1∼5의 탄화수소기이고; 식 (e) 중, R3은 염소 원자, 브롬 원자 및 요오드 원자에서 선택되는 할로겐 원자이고; 및 식 (l) 중, R4는 수소 원자 또는 탄소수 1∼5의 탄화수소기이다.)
  7. 식 (2)로 나타내는, 헤테로 2작용성 단분산 폴리에틸렌글리콜을 포함하여 이루어지는 항체-약물 복합체.
    Figure pct00057

    (식 (2) 중,
    X2와 Y2 중 한쪽이 항체이며, 다른쪽이 약물이고;
    R1은 탄소수 1∼7의 탄화수소기 또는 수소 원자이고;
    n은 3∼72의 정수이고;
    A2는 -L1-(CH2)m1-L7-, -L1-(CH2)m1-L8-, -L1-(CH2)m1-L2-(CH2)m2-L8- 또는 -L8-을 나타내고, m1 및 m2는 각각 독립적으로 1∼5의 정수를 나타내고;
    B2는 -CH2-L9-, -CH2-L9-(CH2)m3-L10-, -CH2-L9-(CH2)m3-L10-(CH2)m4-L11-, -CH2-L12-, -CH2-L9-(CH2)m3-L12- 또는 -CH2-L9-(CH2)m3-L10-(CH2)m4-L12-를 나타내고, m3 및 m4는 각각 독립적으로 1∼5의 정수를 나타내고;
    L1 및 L2는 각각 독립적으로 에테르 결합, 우레탄 결합, 아미드 결합, 2급 아미노기 또는 단결합을 나타내고;
    L7, L9, L10 및 L11은 각각 독립적으로 에테르 결합, 우레탄 결합, 아미드 결합, 2급 아미노기 또는 카르보닐기를 나타내고;
    L8 및 L12는 아미드 결합, 우레탄 결합, 말레이미드와 티올의 결합, 티오에테르 결합, 디술피드 결합, 카보네이트 결합, 에스테르 결합, 에테르 결합, 1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일 구조, 2급 아미노기, 히드라지드기, 옥시아미드기 혹은 이들을 포함하는 탄화수소기 또는 단결합을 나타내고;
    W는 2∼4 잔기의 올리고펩티드이고;
    Z는 펩티드의 C 말단에 결합하는 2작용성 파라-아미노벤질알코올기를 갖는 스페이서이고;
    a3 및 a4는, X2가 약물일 때, a3=1 또한 a4=0이고, Y2가 약물일 때, a3=0 또한 a4=1이고;
    b는 0 또는 1이고; 및
    C2는 아미드 결합, 우레탄 결합, 말레이미드와 티올의 결합, 티오에테르 결합, 디술피드 결합, 카보네이트 결합, 에스테르 결합, 에테르 결합, 1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일 구조, 2급 아미노기, 히드라지드기, 옥시아미드기 혹은 이들을 포함하는 탄화수소기를 나타낸다.)
  8. 제7항에 있어서, W가 페닐알라닌, 류신, 발린, 이소류신의 소수성의 중성 아미노산 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 그 이외의 아미노산이 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어진 2∼4 잔기의 올리고펩티드인, 항체-약물 복합체.
  9. 제7항에 있어서, W가 페닐알라닌, 류신, 발린, 이소류신의 소수성의 중성 아미노산 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 그 이외의 아미노산이 알라닌, 글리신, 시트룰린, 프롤린, 세린, 아스파라긴을 적어도 하나 갖는 2∼4 잔기의 올리고펩티드인, 항체-약물 복합체.
  10. 제7항에 있어서, W가 C 말단의 아미노산이 글리신인 올리고펩티드인, 항체-약물 복합체.
  11. 제7항에 있어서, W가 디펩디드인, 항체-약물 복합체.
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